JP2010524445A - ワイン安定剤としてのペプチド混合物 - Google Patents

Abstract

本発明は、乾燥重量を基準にして少なくとも２．５％のペプチド混合物を含み、このペプチドが３ｋＤａから１０ｋＤａの間の分子量を有することを特徴とする、ワイン用に適した組成物について記載している。この組成物またはその溶液は、有利にはワインを安定化するために、具体的にはワイン中での酒石酸塩の形成を防ぎまたは遅らせるために使用することができる。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明

［技術分野］
本発明は、乾燥重量を基準にして少なくとも２．５％のペプチド混合物を含み、そのペプチドが≧３ｋＤａかつ≦１０ｋＤａの分子量を有することを特徴とする組成物、前記組成物を生成するための方法、およびワイン安定化のためのその使用法に関する。この組成物またはその溶液は、ワインを安定化するために、具体的にはワイン中での酒石酸塩の形成を防ぎまたは遅らせるために有利に用いることができる。

［背景技術］
ワインの生産は、当業者に周知の方法、すなわち、ａ）ブドウからワインマストを抽出するステップ、ｂ）ワインマストを酵母の作用下で発酵を受けさせてワインを生成し、続いて固形残渣から分離するステップ、ｃ）任意選択でそのワインを熟成にかけるステップ、およびｄ）そのワインを瓶詰めまたは容器に詰めるステップを特徴とする。発酵後に存在する固形残渣からワインを分離した後、その生産の後続のステップにおいてワイン中に他の不溶分が一般に形成される（例えば、ワインが冷却固定（ｃｏｌｄ ｓｔａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ）を受ける場合、例えば酒石酸塩の沈殿に起因する固形物）。したがってワイン生産は、特に大規模に行われる場合、形成された前述の不溶性化合物を除去するために、きわめてしばしばワインの瓶詰めまたは容器に詰める直前にワインを濾過するステップを含む。その生産されるワインによってはワインの製造は、前述のステップに対して追加のステップを含むことができる。これらのすべてのステップは当業者に知られている。

酒石酸塩、酒石酸水素カリウム（ＫＨＴ）、または酒石酸カルシウム（ＣａＴ）の存在は、ワインの不安定性の主要な原因の一つである。酒石酸は、ブドウ果実によってその成長の間に生成される主要な有機酸である。それは、果実の加工の間にカリウムおよびカルシウム塩の形態でブドウマスト中へ溶解する。発酵の間に酒石酸の塩の可溶度は、エタノール濃度の増加とともに低下する（糖の発酵のため）。若いワインでは酒石酸水素カリウム（ＫＨＴ）が、常に過飽和状態の濃度で存在し、自然に結晶化する。ワインの瓶詰めの後、ＫＨＴの不安定性は、結晶化の予測できない性質のために商業的な問題になる恐れがある。その上、瓶の中の結晶の存在を消費者は、しばしばワインの低品質の徴候と考える。瓶詰めの前に物理的処理を用いて酒石酸塩の結晶化を防ぐことができる。それらの処理は、ワインを−４℃に冷却することにより結晶化を促進させるか、あるいは電気透析によるか、またはイオン交換樹脂の使用によりカリウムおよび酒石酸イオンを除去することにある。しかし、これらの時間およびエネルギーを要する方法は、ワインのコロイド平衡を変えると考えられる。

ワインの物理的処理の代替案は、ＫＨＴ結晶の核形成および／または成長を防ぐ添加剤を使用することである。ワイン安定剤（例えばマンノプロテイン）の添加によってワインを安定化するためのステップを含む（工業的な）ワイン製造法では、前記ワイン安定剤をワインマストまたはワインのどちらかに加えることができる。一般にはそれは、普通は熟成の間に、また濾過および瓶詰めの前にワインに加えられることになる。ワイン安定剤の添加が熟成の間に、また濾過および瓶詰めの前に行われる場合、酒石酸塩の沈殿に対する安定剤としてのワイン安定剤（例えばマンノプロテイン）の活性は、ワインの濾過後には低下することが分かっている。したがって瓶詰めされたワインにおいて望ましい安定化を達成するには、より高用量のワイン安定剤が加えられるはずである。したがってこの問題に対する解決策は、ワインが瓶詰めの前に受ける最後の濾過ステップの後に溶液としてワイン安定剤を加えることである。

カルボキシメチルセルロースおよびメタ酒石酸は、ＫＨＴ結晶の成長を抑制する添加剤のグループに属する。しかしカルボキシメチルセルロースは、現在の規制ではワイン添加剤として認可されていない。一方、メタ酒石酸はワインのｐＨにおいて、またワインが貯蔵される温度において不安定である。時間が経つにつれてメタ酒石酸は加水分解することになり、その保護効果が消滅することになる。したがってその使用は、短時間で消費される低品質ワインに限定される。好ましくは添加剤はワインの天然成分であるので、カルボキシメチルセルロースまたはメタ酒石酸に関してはこれに全く当てはまらないことが別の欠点である。ＫＨＴ結晶の核形成および成長速度の両方に対して働く天然の添加剤が、化学的添加剤に対して好ましい。天然の添加剤の例は、マンノプロテインである。マンノプロテインは、グルカンと共に酵母における細胞壁の主要成分である（Ｌｉｐｋｅ Ｐ．Ｎ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）１８０（１５）：３７３５〜３７４０）。マンノプロテインは、２種類の方法、すなわち物理的方法および酵素的方法によって主に酵母細胞から得られる。マンノプロテインを得るための最も一般的な物理的方法は、Ｐｅａｔ Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ（１９６１）２８〜３５に記載されているものであり、これはマンノプロテインを、中性ｐＨにおいて酵母細胞を熱抽出することによって得る。酵母からマンノプロテインを得る酵素的方法は、例えば国際公開第９６／１３５７１号パンフレットに記載されており、単離された酵母細胞壁のβ−グルカナーゼ調製物による処理と、限外濾過によるその生成物の単離とを本質的に含む。酒石酸塩の沈殿に対する、熱またはβ−グルカナーゼ調製物のどちらかによって抽出されるマンノプロテインの活性度は測定されている。酒石酸の安定化に対して活性な画分は、β−グルカナーゼ調製物を用いて酵母細胞壁から抽出される、約３０〜５０ｋＤａの分子量を有し、高度にグリコシル化されたマンノプロテインである（Ｄｕｂｏｕｒｄｉｅｕ Ｄ．ら、Ｊ．Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．Ｖｉｇｎｅ Ｖｉｎ．（１９９７）ｖｏｌ．３１（１）ｐｐ．２３〜３１）。

マンノプロテインは、いったんワインに加えられると、望ましくない混濁を引き起こし、また場合によっては副生物の沈殿を引き起こすという欠点を有する可能性がある。さらにＫＨＴ結晶の核形成および／または成長を防止するマンノプロテインの有効性は、常に満足のいくものとは限らない。欧州特許出願公開第１０９４１１７Ａ号明細書は、マンノプロテイン調製物中に存在する副生物によって引き起こされる混濁の問題を低減する、マンノプロテインの可溶性固形物の生成方法について述べている。この方法では自己消化後に酵母細胞壁を単離し、続いて９５〜１００℃で１５〜３０時間またはβ−グルカナーゼの作用下のいずれかにおいて選択的加水分解にかける。両方のケースにおいてマンノプロテインおよび他の不純物は可溶化される。可溶化されたマンノプロテインを精製するには幾つかのステップが必要である。ワイン中で完全に可溶であり、かつワイン中の酒石酸の塩の沈殿に対してきわめて有効なマンノプロテインが、国際公開第２００６／０６７１４５号パンフレット中に記載されている。

しかしながらワイン中の酒石酸塩の形成を防止しかつ／または遅らせる改良された効果を示し、また副生物によって引き起こされる混濁および／または副生物の沈殿が非常に少ないか、または存在しないワイン添加剤が依然として必要とされている。

意外なことに特定の分子量のペプチドが、酒石酸の塩の結晶化に対してワインを安定化させるのに特に効果があることをここに見出した。

［発明の詳細な説明］
［定義］
本明細書中では「ペプチド混合物」は、そのペプチド中のアミノ酸の数に関して様々な長さを有し、かつアミノ酸の種類に関して異なる組成を有するペプチドの混合物として定義される。

本明細書中で「ペプチド」は、ペプチド結合により結合した２個以上のアミノ酸残基を含む化合物として定義される。

本明細書中では「食品用成分」は、食品に使用される安全な成分として定義される。

本明細書中では「タンパク質水解物」は、加水分解の度合および／または使用される酵素の種類によって決まる様々な比率のアミノ酸とペプチドの混合物を含有する酸または酵素で処理されたタンパク質の基質として定義される。

本明細書中では「酵母抽出物」は、酵母細胞から抽出された水溶性成分を含む組成物として定義される。一般に酵母抽出物は、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ビタミン、炭水化物、およびリン酸塩などの塩を含む。酵母抽出物は、その上に５’−リボヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドを含むことができる。

本明細書中では「マンノプロテイン」は、物理化学的または酵素的方法によってワイン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞および／または酵母細胞壁から抽出することができる生成物として、ＯＩＶ（Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ ｌａ Ｖｉｇｎｅ ｅｔ ｄｕ Ｖｉｎ）のＲＥＳＯＬＵＴＩＯＮ ＯＥＮＯ ２６／２００４に従って定義される。マンノプロテインは、それらの分子量、それらのグリコシル化の度合と種類、および負荷の大きさ（ｌｏａｄ ｓｉｚｅ）に応じて様々な構造である。

本明細書中では「プロテアーゼ活性」は、エキソプロテアーゼおよびエンドプロテアーゼが原因の全タンパク質分解酵素活性として定義される。

本明細書中で「プロテアーゼ活性のない」は、その液状配合物中のプロテアーゼ活性が、プロテアーゼ活性を測定するために用いられる方法で検出できる最低活性度よりも低いものと定義される。その液状配合物中に存在することが予想されるプロテアーゼの種類に応じてプロテアーゼを測定するために特定の方法を用いることができ、また特定のプロテアーゼ単位を明確にすることができる。これらの方法は当業者に既知である。

本明細書中では「生存微生物の総量」は、その溶液中に存在する好気および嫌気好冷性微生物＋好気および嫌気中温性微生物＋好気および嫌気好熱性微生物の総量として定義される。

第一の態様において本発明は、ペプチド混合物をその組成物の乾燥分量を基準にして少なくとも２．５％含み、それらペプチドが好ましくは分子量≧３かつ≦１０ｋＤａを有することを特徴とする酒石酸の塩の結晶化に対するワインの安定化に適した組成物を提供する。

本明細書中で使用される「分子量」、例えばペプチドまたは生体分子の分子量は、その分子量を測定するための実験方法によって規定される。そのような方法の一つは、当業界で非常によく知られている限外濾過である。分子量≧３ｋＤａを有する分子は、そのような分子が３ｋＤａのカットオフを有する限外濾過膜によって留められることを意味する。分子量≦１０ｋＤａを有する分子は、そのような分子が１０ｋＤａのカットオフを有する限外濾過膜を透過することを意味する。このような膜は、再生セルロースまたはポリエーテルスルホンの型のものであることができる。

好ましい実施形態では本発明の組成物は、組成物の乾燥分量を基準にして、そのペプチドが本明細書中で上述したような分子量を有するペプチド混合物を少なくとも４％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも６％、より好ましくは少なくとも８％、より好ましくは少なくとも１０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも２０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも２５％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも３０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも４０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも５０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも６０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも７０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも８０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも９０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも９５％ｗ／ｗ、最も好ましくは少なくとも９９％含む。

本発明の組成物は、そのペプチド混合物の製造に使用される供給源によっては炭水化物および／またはオリゴヌクレオチドなどの１種または複数種の生体分子をさらに含むことができる。このような炭水化物の例はマンナンである。好ましくはこれらの生体分子は、本発明の組成物中のペプチドに関して上記で規定した分子量と同じ分子量を有する。

意外なことに本発明の組成物は、有効量をワインに加えた場合、酒石酸の塩の結晶化を防ぎまたは遅らせることによってワインを安定化することができることが分かった。

本発明の組成物は、固体の形態あるいは液体または溶液の形態であることができる。固形配合物の形態の本発明の組成物は、そのような配合物がすぐれた貯蔵安定性を有する、具体的には微生物学的に安定であるという利点を有する。欠点は、その固形物がゆっくりとしか、かつ／または不完全にしか溶解しないことである。これは、本発明の組成物が加えられるワインまたはワインマストが、低い貯蔵温度、例えば１５℃未満、または一層低い、例えば１０℃未満に保たれる場合である。固形配合物の形態の本発明の組成物の別の欠点は、例えば混合の問題が原因で、ワインまたはワインマスト中で本発明の組成物の均一な濃度を得ることが難しいことである。

したがって本発明の組成物を液体または溶液の形態でワインまたはワインマストに加えることが好ましい。これは、（好ましくはすぐ使える）液状配合物の形態で直接に本発明の組成物を、好ましくはその製造業者が生成することによって、あるいは本発明のワイン安定化用組成物の固形配合物の溶液を、好ましくはワイン生産者が作製することによって達成することができる。このような溶液は水に溶かして、あるいは適切な量のワインまたはワインマストに溶かして作製することができる。酒石酸塩の結晶化に対してそのワインを安定化するのに必要な本発明の組成物の有効量に応じて本発明の組成物の溶液は、その有効量、およびそのワインまたはワインマストに対するこの溶液の所望のまた実際の用量に基づいて、適切な量の固形配合物を溶解することによって調製することができる。例えば、この溶液を１００倍または１０００倍に希釈してワインまたはワインマスト中へ入れることが好ましい。固形配合物の有効量およびその溶液の用量は、不必要な負担なしに当業者が簡単に求めることができ、またワインそれぞれがそれ自体の酒石酸塩の結晶化挙動を有するはずであるので各ワインで異なる可能性がある。

好ましい実施形態では、好ましくはすぐ使える液状配合物の形態で直接に生成されるか、あるいは本明細書中で上述した固形配合物からの溶液として作製される本発明の組成物は、５０〜５００ｇ／Ｌの間の、より好ましくは１００〜４００ｇ／Ｌの間の、最も好ましくは２００〜３００ｇ／Ｌの間の乾燥分含量を有する。液状配合物または溶液の乾燥分含量は、本明細書中で上述したペプチド混合物の任意の含量と組み合わせることができる。例えば、溶液が５０〜５００ｇ／Ｌの間の乾燥分含量および２．５％ペプチド混合物（総乾燥分含量を基準にして）を有する場合、これは、その溶液中のペプチド混合物の濃度が１．２５から１２．５ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）であることを意味する。本発明が、乾燥分含量（単位ｇ／Ｌ）のすべての好ましい範囲をペプチド混合物の含量のすべての好ましい範囲と組み合わせることができる本発明の組成物の液状配合物または溶液を可能にすることを当業者は理解するはずである。

本発明の高度に好ましいすぐ使える液状組成物は、約２００ｇ／Ｌの乾燥重量含量と、約２０ｇ／Ｌのペプチドに等しい乾燥重量を基準にして１０％のペプチド混合物含量とを有する。

本明細書中で上述した本発明の組成物の液状配合物または溶液は、好ましくはワインまたはマストの安定化に使用される。このような理由で、この溶液はいかなる有害な微生物も存在しないことが重要である。さらに、どのような生存微生物の存在もその溶液の貯蔵安定性、およびそのワイン安定剤としての活性の維持に影響を及ぼす。これらの理由で、本発明の一実施形態では溶液は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬで測定される１０未満、好ましくは５未満の生存微生物総量を有する。より好ましくは「溶液」は無菌である。コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬで測定される本明細書中で上述した溶液中に存在する生存微生物の総量は、材料および方法の中で規定され、総生菌数（ＴＰＣ）を求めることによって確認される。その方法は当業者には周知であり、それについては材料および方法の中で簡単に述べる。

本明細書中で上述した本発明の組成物の液状配合物または溶液は、輸送および貯蔵の間、密閉した状態に閉鎖することができる滅菌容器に詰められることが好ましい。

本明細書中で上述した本発明の組成物の液状配合物または溶液は、好ましくは水溶液である。

本明細書中で上述した本発明の組成物の液状配合物または溶液のｐＨは、その組成物の安定性が時間内で保存されるようなものであり、またその溶液の混濁を避けるようなものであることが好ましい。したがってこの溶液のｐＨは、３から８の間、より好ましくは４から７の間、最も好ましくは５から６の間に含まれることが好ましい。

本明細書中で上述した本発明の組成物の液状配合物またはその溶液は、時間内で好ましくは微生物学的に安定である。したがって好ましい実施形態では、少なくとも安定化添加剤が溶液に加えられる。より好ましくはこの安定化添加剤は二酸化硫黄である。より好ましくは二酸化硫黄は、重亜硫酸塩の形態で、より好ましくは重亜硫酸ナトリウムまたは重亜硫酸カリウム（Ｋ_２Ｓ_２Ｏ_５）として溶液に加えることができる。二酸化硫黄の添加は、マンノプロテイン溶液を微生物学的に安定な状態に保つことに次いで別の利点を有する。マンノプロテイン溶液は、淡黄色から茶色がかった色まで変わる可能性のある色を有する。しかしワインの安定化のために茶色がかった溶液を使用することは、ワイン生産者にあまり受けないはずである。したがってワインまたはマストに使用されるマンノプロテイン溶液の着色は、好ましくはごくわずかであるべきである。マンノプロテイン溶液への二酸化硫黄の添加は、その色を茶色がかった色から黄白色に薄くすることができる。したがって溶液に加えられる二酸化硫黄の量は、好ましくは１から２０ｇ／Ｌ（加えられるＫ_２Ｓ_２Ｏ_５の量として測定される）の範囲である。

第一の態様の組成物は、好ましくは食品用の１種または複数種の成分を含むことができる。この成分は、好ましくは上記で規定したようにワイン用に適したものである。好適な成分の例は、タンパク質基質、タンパク質水解物、酵母抽出物、カルボキシメチルセルロース、ワイン添加剤、またはこれら成分の２種類以上の混合物である。ワイン添加剤の例は、メタ酒石酸塩、アラビアガム、またはマンノプロテインである。特に好ましいワイン添加剤はマンノプロテインである。別の特に好ましい成分はタンパク質水解物である。タンパク質水解物調製用の一般的なタンパク質基質は、コムギグルテン、コーングルテン、ダイズタンパク質、ナタネタンパク質、エンドウマメタンパク質、アルファルファのタンパク質、ヒマワリタンパク質、マメ科の実のタンパク質、綿またはゴマの実のタンパク質、トウモロコシタンパク質、オオムギタンパク質、サトウモロコシタンパク質、ジャガイモタンパク質、イネタンパク質、コーヒータンパク質などの植物タンパク質である。他のあり得るタンパク質基質は、乳タンパク質（例えば、カゼインまたは乳清タンパク質）と、卵白と、魚肉タンパク質と、ゼラチン、コラーゲンを含めた食肉タンパク質と、血液タンパク質（例えば、ヘモグロビン）と、体毛と、羽毛と、魚粉などの動物タンパク質である。

本発明の組成物がタンパク質水解物を含む場合、それは、好ましくは動物、植物、または微生物起源のタンパク質水解物から選択され、より好ましくはカゼイン水解物、卵アルブミン水解物、ゼラチン水解物、ウシ血清アルブミン水解物、リゾチーム水解物、コムギタンパク質水解物、ダイズタンパク質水解物、エンドウマメタンパク質水解物、またはこれら成分の２種類以上の混合物から選択される。

好ましくは本明細書中で上述した本発明の組成物の液状配合物またはその溶液は、上記濃度において半透明である。その半透明性は、標準的方法に従って比濁分析により測定される総乾燥分量２００ｇ／Ｌの濃度におけるその溶液の濁度の逆数として定量化することができる。本明細書中で上述した本発明の組成物の液状配合物またはその溶液は、濁度が、好ましくは２００ｇ／Ｌの乾燥分含量において、
・ｐＨ４で、≦５００ＮＴＵ、好ましくは≦２５０ＮＴＵ、より好ましくは≦２００ＮＴＵ、より好ましくは≦１５０ＮＴＵ、より好ましくは≦１００ＮＴＵ、より好ましくは≦５０ＮＴＵ、最も好ましくは≦３５ＮＴＵ、および／または
・ｐＨ８．０で、≦２５０ＮＴＵ、好ましくは≦２００ＮＴＵ、より好ましくは≦１５０ＮＴＵ、より好ましくは≦１００ＮＴＵ、より好ましくは≦５０ＮＴＵ、より好ましくは≦２５ＮＴＵ、より好ましくは≦２０ＮＴＵ、最も好ましくは≦１５ＮＴＵ
である。

本発明の組成物は、ワインまたはワインマスト中に溶解した場合、半透明で安定なワインをもたらすべきである。したがって好ましい実施形態では本発明の組成物は、水中に溶解して１ｇ／Ｌの乾燥分含量を有する溶液を生成する場合、≦４ＮＴＵの、好ましくは≦２ＮＴＵの、より好ましくは≦１ＮＴＵの濁度を有し、かつ／または水に溶かした１２％エタノール（ｖ／ｖ）中に溶解して１ｇ／Ｌの乾燥分含量を有するｐＨ３．５の溶液を生成する場合、≦２０ＮＴＵの、好ましくは≦１０ＮＴＵの、より一層好ましくは≦５ＮＴＵの、最も好ましくは≦１ＮＴＵの濁度を有し、かつ／または白ワイン中に溶解して０．２ｇ／Ｌの乾燥分含量を有する溶液を生成する場合、≦１０ＮＴＵの、好ましくは≦５ＮＴＵの、より一層好ましくは≦２ＮＴＵの、最も好ましくは≦１ＮＴＵの濁度を有する。

本発明の第一の態様による組成物は、幾つかの方法により調製することができる。例えばペプチド混合物は、液相または固相ペプチド合成を用いることによって生成することもでき、またはペプチド源の加水分解によって調製することもできる。好ましくは第一の態様の組成物は、ペプチド源、好ましくはタンパク質基質、タンパク質水解物、酵母抽出物などの天然源由来のペプチド源の酵素的加水分解によって調製される。

したがって第二の態様において本発明は、本発明の第一の態様による組成物を調製する方法を提供し、この方法は本明細書中でさきに規定した分子量のペプチドを含むペプチド混合物を≦２．５％含むペプチド源を加水分解するステップを含む。

ペプチド源は、分子量≧３ｋＤａかつ≦１０ｋＤａを有するペプチドの形成を狙った適切な酵素と、ｐＨ、温度、および時間の条件とを選択することによる制御されたタンパク質分解によって加水分解することができる。加水分解は、当業者に知られている化学的方法（例えば、Ｔ．Ｗ．Ｎａｇｏｄａｗｉｔｈａｎａ著「Ｓａｖｏｒｙ Ｆｌａｖｏｕｒｓ」１９９５，Ｅｓｔｅｅｋａｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）ｐ．２３３〜２３７に記載されている）または酵素的方法を用いて行うことができる。好ましくは加水分解は酵素的方法により行われる。ペプチド源を加水分解するための酵素的方法もまた、当業者に知られている（Ａｄｌｅｒ−Ｎｉｓｓｅｎ、Ｊ（１９８６）Ｅｎｚｙｍｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｏｏｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｐｐｌ．Ｓｃｉ．Ｐｕｂｌ．）。

ペプチド源として働くことができる好適なタンパク質基質は、カゼイン、卵アルブミン、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、リゾチーム、コムギタンパク質、ダイズタンパク質、エンドウマメタンパク質、酵母、またはこれら成分の２種類以上の混合物である。好ましくはタンパク質基質は酵母である。

ペプチド源として働くことができる好適なタンパク質水解物は、カゼイン水解物、卵アルブミン水解物、ゼラチン水解物、ウシ血清アルブミン水解物、リゾチーム水解物、コムギタンパク質水解物、ダイズタンパク質水解物、エンドウマメタンパク質水解物、酵母抽出物、またはこれら成分の２種類以上の混合物である。

本明細書中で上述したペプチド源の加水分解の後、前記ペプチド源は、それらペプチドが３ｋＤａから１０ｋＤａの間の分子量を有することを特徴とするペプチド混合物を、総乾燥重量を基準にして２．５％未満含むことができる。前記ペプチド混合物の濃度を増すために前記ペプチド混合物を、場合によっては富化させることができる。富化は、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル透過クロマトグラフィー、選択的沈殿などの当業界で知られている分離技術を用いて達成することができる。

第一の態様のペプチド混合物を富化させるための好ましい分離技術は、第一の態様による組成物を生ずるようにペプチド混合物の量を増加させるのに適した条件下での膜濾過、好ましくは限外濾過またはダイアフィルトレーションである。熟練者は、３から１０ｋＤａの間の分子量を有するペプチド混合物を、総乾燥分量を基準にして少なくとも２．５％ｗ／ｗ含む組成物を生ずるのに適した条件下で膜濾過、好ましくは限外濾過またはダイアフィルトレーションをいかに行うかが分かっている。膜濾過技術、具体的には限外濾過またはダイアフィルトレーションは、当業者に知られている。第三の態様の方法において使用される適切な限外濾過またはダイアフィルトレーション膜は、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜、親水性ポリエーテルスルホン膜（ＰＥＳ Ｈ）、再生セルロース膜、または適切なカットオフのセラミック膜である。

ある実施形態ではペプチド混合物の富化は、加水分解したペプチド源を３ｋＤａのカットオフを有する膜を用いた限外濾過のステップにかけ、得られる濃縮液を回収し、任意選択で前記濃縮液を１０ｋＤａのカットオフを有する膜を用いた第二の限外濾過のステップにかけ、得られる透過液を回収することによって行われる。別法では加水分解したペプチド源を、１０ｋＤａのカットオフを有する膜を用いた限外濾過のステップにかけ、得られる透過液を回収し、任意選択で前記透過液を３ｋＤａのカットオフを有する膜を用いた第二の限外濾過のステップにかけ、得られる濃縮液を回収することによって行われる。

ペプチド源の加水分解および／またはペプチド混合物の富化の後に、前記ペプチド混合物を濃縮し、任意選択で凍結乾燥または噴霧乾燥などの標準的手法により乾燥することができる。ペプチド混合物を液体として回収する場合、第二の態様の方法は、それ自体を容器に詰めることができる滅菌溶液を生成することを狙った最後の滅菌濾過のステップを含むことができる。

プロテアーゼは、ペプチド源などの天然源から出発してペプチド混合物部分またはその組成物の生成に使用することができ、ペプチド混合物部分またはその組成物中に不純物として存在する可能性のある酵素である。これらの不純物の存在は、ペプチド混合物またはその組成物を固体として単離する場合には問題にならない。その代わり、溶液中にごく僅かなプロテアーゼ活性が存在すると、ペプチド混合物またはその組成物の分解を引き起こす恐れがあり、また酒石酸塩の沈殿に対するワインの安定化に関してペプチド混合物またはその組成物の活性の低下を引き起こす恐れがある。プロテアーゼ活性のない第一の態様による組成物を生成するために第二の態様の方法は、好ましくは第一の態様による組成物の溶液を７０℃以上の温度において、好ましくは８０℃から１４０℃の間に含まれるある温度において、好ましくは２秒から６０分の間に含まれるある時間のあいだ行われる熱処理にかけることによる、プロテアーゼを不活性化するのに適した処理に第一の態様による組成物の溶液をかけるステップを含むことができる。

この点ではプロテアーゼ活性を不活性化するのに適した任意の処理を用いることができる。より好ましくは加熱のステップが酵素の活性を不活性化するために用いられる。熱処理に使用される温度は、好ましくは７０℃以上であり、好ましくはその温度は８０℃から１４０℃の間である。熱処理の持続時間は、好ましくは酵素の活性がすべて除去されるようなものである。熱処理の持続時間は、使用される温度に左右されることになる。例えば、低い温度ほど長い熱処理の持続時間を必要とすることになり、一方、高い温度ほど短い時間しか必要としないことになる。したがって８０℃で３０分間の処理および１３０℃で７秒間の処理は、本発明の特許請求の範囲の範囲に属することになる。好ましくは熱処理は、食品または飲料業界で一般に使用される条件を用いたＵＨＴ処理の使用によって行われる。ＵＨＴ処理は、一般に１３０〜１４５℃の温度で２〜１０秒の持続時間のあいだ行うことができる。１３０℃以上で十分な時間行われる加熱処理、例えば１３０℃で７秒間の加熱処理の場合、プロテアーゼ活性のない、また一般には酵素の活性の全くない溶液が得られるはずである。

加熱のステップを使用することによって、第一の態様による組成物の溶液中に存在する微生物の少なくとも一部は一般に不活性化されるか、または殺されるはずである。好ましくは加熱処理は、上記に示したようなＵＨＴ処理であり、その理由は後者の場合には溶液中に存在する可能性のあるすべての微生物または微生物の胞子が不活性化されるか、または殺されることになるためである。

第二の態様の方法は、すべての微生物を除去するために第一の態様による組成物を滅菌に、溶液の場合には好ましくは滅菌濾過にかけるステップを含む。後者は、当業者に知られている特定のフィルターを使用することによって達成することができる。好ましくは滅菌濾過は、プロテアーゼ不活性化の後に行われ、より好ましくは容器に詰める前に最後のステップとして行われる。

生産工程の終りに第一の態様による組成物は、当業者に知られている方法に従って無菌で容器に詰めることができる。使用することができる無菌容器は、幾種類かの材料から生産することができる。好適な容器は、段ボール箱に収めた無菌の袋であることができる。これらの袋は、ねじ式の栓によって穴をあけることができるパッキン押さえを備えることができる。

本発明の方法が、第一の態様による組成物の溶液を当業者に知られている方法により、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥により乾燥して固体の形態の、例えば粉末または顆粒の形態の組成物を生成するステップをさらに含むことができることを当業者は理解するはずである。

第三の態様において本発明は、第一の態様による組成物の使用法を提供する。好ましくは本発明は、ワインの安定化における第一の態様による組成物の使用法を提供する。より好ましくは本発明は、酒石酸の塩の結晶化に対するワインの安定化における第一の態様による組成物の使用法を提供する。第一の態様による組成物は、例えば白、ロゼー、発泡性、および赤ワインなどの任意の種類のワインに使用することができる。好ましくは第一の態様による組成物は、白ワインおよびロゼワインに使用される。

具体的には第四の態様において本発明は、第一の態様による組成物をワインまたはワインの生産に使用されるブドウマストに加える、酒石酸の塩の結晶化を防ぎ、かつ／または遅らせることによるワインの安定化方法を提供する。第一の態様による組成物は、好ましくは熟成の間に、すなわち発酵後、瓶詰め前にワインに加えられる。本発明は、白ワインおよびロゼワインに極めて適しているが、赤ワインまたは発泡性ワインにもまた適している。

第一の態様による組成物は、安定化効果を達成するのに有効な量が加えられる。一般には第一の態様において規定したペプチド混合物を、ワインまたはワインの生産のための発酵に使用されるブドウマストに、ワインまたはマスト１リットル当たり１０〜１０００ｍｇの間の濃度で加えることができる。第一の態様において規定したペプチド混合物を、ワイン１リットル当たり１０から４００ｍｇのワイン中の最終濃度まで加えることによる良好な結果はすでに得られている。好ましい実施形態では第一の態様において規定したペプチド混合物が、ワインまたはワインの生産のための発酵に使用されるブドウマストに、１リットル当たり１０〜３００ｍｇの間の、より好ましくは１リットル当たり２０から２５０ｍｇの間の、より一層好ましくは１リットル当たり２５から２００ｍｇの間の、最も好ましくは１リットル当たり３０から１５０ｍｇの間の濃度で加えられる。当業者はまた、その加えられる量がワインの種類に左右され、また例えば他のワイン安定剤の添加または存在に左右され、また添加前のワイン中のＫＨＴの過飽和の度合に左右されることになることも理解するはずである。

一般に酒石酸塩の結晶化に関して不安定なワインは、０．５から６日の間で変動する可能性のある結晶化時間（Ｔｃｒｙｓ）を有する。本発明の第五の態様による安定化ワインは、ワインに第一の態様による組成物を、酒石酸の塩の結晶化を防ぎ、かつ／または遅らせるのに適した濃度で加えることによって得ることができる。好ましくは前記ワインは、第一の態様において規定したペプチド混合物をワイン１リットル当たり１０〜１０００ｍｇ含む。より好ましくはそのワインは、第一の態様において規定したペプチド混合物をワイン１リットル当たり１０から４００ｍｇ、より好ましくは１リットル当たり１０〜３００ｍｇ、より好ましくは１リットル当たり２０から２５０ｍｇの間で、より一層好ましくは１リットル当たり２５から２００ｍｇの間で、最も好ましくは１リットル当たり３０から１５０ｍｇの間で含む。前記安定化ワインは、方法１に従って測定される結晶化時間安定化ワイン（Ｔｃｒｙｓｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｗｉｎｅ）／結晶化時間不安定ワイン（Ｔｃｒｙｓｕｎｓｔａｂｌｅ ｗｉｎｅ）比が少なくとも２、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、より一層好ましくは１０から４０の間であることを特徴とする。

したがって第六の態様において本発明は、ワインを濾過するステップと、濾過したワインを瓶詰めするまたは容器に詰めるステップとを含み、濾過後にワインに第一の態様による組成物を加える、酒石酸の塩の結晶化に対して安定なワインの生産方法を提供する。

濾過後にワインに加えられる溶液は、その組成物を水またはワインと混合することによってワイン添加の直前に調製することもでき、またはさきに詳細に述べたような第一の態様の組成物の（すぐ使える）溶液であってもよい。したがってこの溶液は、プロテアーゼ活性がなくてもかつ／または無菌でもよく、かつ／または前述の安定剤をさらに含むこともできる。

ワインへの添加は、瓶詰めするまたは容器に詰める前にワインと液状配合物を混合することによって行うことができ、あるいは瓶（または容器）をワインで満たす前にそれに直接加えることができる。

本発明の一態様の好ましい特徴は、必要に応じて別の態様にも同様に適用可能である。

次に本発明を下記の実施例により例示することにするが、これらは限定されるものではない。

［実施例］
［材料および方法］
［ＫＨＴの核形成および結晶成長］
ワイン中でのＫＨＴの核形成および結晶成長は、下記の方法により測定し、定量化することができる（Ａｃｔｕａｌｉｔｅｓ ＯＥｎｏｌｏｇｉｑｕｅｓ １９９９ Ｖｉｅｍｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄ’Ｏｅｎｏｌｏｇｉｅ ｄｅ Ｂｏｒｄｅａｕｘ（Ｌｏｎｖａｕｄ−Ｆｕｎｅｌ ｅｄ．）中のＭｏｕｔｏｕｎｅｔら）。

［方法１］
結晶の核形成を表示する第一の方法は、−４℃で貯蔵した場合のワイン中での結晶の出現の時間を測定する。目視検査を毎日行い、結晶の出現を検出するのに必要な時間（Ｔｃｒｙｓ）を日数で表す。

［方法２］
結晶の成長を表示する第二の方法は、ワインの酒石酸不安定度（Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ Ｔａｒｔａｒｉｃ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）（ＤＴＩ）を測定する。この点に関してはワインを−４℃で撹拌し、初期導電率を測定する。続いて検量されたＫＨＴの結晶を加え、次いで安定値に達した後に導電率を測定する。ＤＴＩは、初期導電率の減少比率として定義される。

［方法３］
第三の方法は、真の溶存酒石酸濃度を測定する。正確な体積のワインをガラス瓶に移し、正確に分かっている濃度のマレイン酸を含有する同じ正確な体積のＤ_２Ｏと混合する。１Ｈ ＮＭＲスペクトルを完全緩和条件で測定し、内標準（マレイン酸）の積分値を酒石酸の積分値と比較する。この方法で溶存酒石酸濃度をきわめて高い精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）および確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）で求めることができる。

［ペプチド混合物中のアミノ酸の測定］
正確に計量したペプチド混合物試料を、６Ｎ ＨＣｌを用いて１１０℃で２４時間加水分解した。ＨＣｌを除去するための標準的な検査（ｗｏｒｋｕｐ）の後、その加水分解試料を希釈酸中に溶解し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心器中で遠心分離することによって沈殿物を除去した。その透明上澄み液に関してアミノ酸分析をＡｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ Ｍａ，ＵＳＡ）の使用説明書中に指定されているＰｉｃｏＴａｇ法に従って行った。この目的のためにはその液体から適切な試料を入手し、それを希釈酸に加え、ホモジナイズした。この後者の溶液から新しい試料を採取し、乾燥し、イソチオシアン酸フェニルを用いて誘導体化した。ＨＰＬＣ法を用いて存在する様々な誘導体化アミノ酸を定量し、合計して計量試料中のアミノ酸の全レベルを計算した。

［炭水化物の測定］
炭水化物の量は、周知のアントロン比色法に従って測定した。

［タンパク質の測定］
タンパク質は、周知のケルダール法（Ｋｊｅｌｄａｈｌ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて測定した。

［濁度の測定］
濁度は、ＨＡＣＨ ２１００ Ｎ濁度計（Ｈａｃｈ−Ｌａｎｇｅ，Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により測定した。

［総生菌数］
液状配合物の３試料を分析に先立って下記の特定の条件下で貯蔵し、総生菌数（ＴＰＣ）法を用いて、好気性および嫌気性雰囲気中で成長することができる好冷性、中温性、および好熱性微生物のあり得る出現度について分析した。ＴＰＣの測定は、ペトリ皿中に存在する１ｍＬの液状配合物上に約１５ｍＬのＰＣＡ寒天（Ｐｌａｔｅ Ｃｏｕｎｔ Ａｇａｒ，Ｏｘｏｉｄ，ＵＫ）を注ぐことによって行った。下記の６条件のうちの１条件の下でＴＰＣインキュベーションを行った。分析は各条件について２回行った。各液状配合物試料について合計で１２枚のペトリ皿を準備し、６枚を好気的にインキュベートし、その他の６枚を嫌気的にインキュベートした。

［好気性および嫌気性好冷菌の測定条件］
試料の貯蔵：８℃で３０日間
分析：ＰＣＡシャーレ上のＴＰＣ
インキュベーション：８℃で７日間の好気性または嫌気性雰囲気

［好気性および嫌気性中温菌の測定条件］
試料の貯蔵：３０℃で１０日間
分析：ＰＣＡシャーレ上のＴＰＣ
インキュベーション：３０℃で３日間の好気性または嫌気性雰囲気

［好気性および嫌気性好熱菌の測定条件］
試料の貯蔵：５５℃で１０日間
分析：ＰＣＡシャーレ上のＴＰＣ
インキュベーション：５５℃で３日間の好気性または嫌気性雰囲気

適正なインキュベーション時間の後、各ペトリ皿を分析して各皿中に形成されたコロニーの量を測定した。各皿中のコロニーの量は、特定の種類の微生物に対する液状配合物１ミリリットル当たりのコロニー形成単位（Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ）（ＣＦＵ）を与える。本願中で規定した液状配合物１ミリリットル当たりのＣＦＵとして測定される生存微生物の総量は、ＣＦＵ／ｍＬ（嫌気性好冷菌）＋ＣＦＵ／ｍＬ（好気性好冷菌）＋ＣＦＵ／ｍＬ（嫌気性中温菌）＋ＣＦＵ／ｍＬ（好気性中温菌）＋ＣＦＵ／ｍＬ（嫌気性好熱菌）＋ＣＦＵ／ｍＬ（好気性好熱菌）によって与えられる。

［プロテアーゼ活性の測定］
Ｎ，Ｎ−ジメチルカゼインに対するプロテアーゼの作用後に放出される遊離アミノ基は、トリニトロベンゼンスルホン酸と反応して、４０５ｎｍで分光光度的に測定することができる黄色を生ずる。アルカリ性プロテアーゼを含有する酵素標準を、キャリブレーション用に使用した。１０〜６０Ｕ／ｍＬの活性度を有する５種類の標準溶液を作製した（１Ｕは、スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロピル−Ｌ−フェニルアラニン−パラ−ニトロアナリン（ｎｉｔｒｏａｎａｌｉｎｅ）（２．１８ｍｇ／ｍＬ）からｐＨ８．５（０．１Ｍ ＴＲＩＳ）および３７℃において１分当たり７．５９μモルのｐ−ニトロアニリンを放出するために必要な酵素の量として定義される）。Ｎ，Ｎ−ジメチルカゼイン溶液（四ホウ酸二ナトリウム１０ｇ／Ｌを含有し、８．５％リン酸でｐＨ８．５に調整したホウ砂緩衝液中に１．６８ｇ／Ｌ溶解した）２ｍＬを、標準または試料溶液２００μＬと混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。続いてトリニトロベンゼンスルホン酸溶液（１２ｍＭ ＨＣｌに溶かした４ｍＭ）１．２ｍＬを加えた。３７℃で５分間のインキュベーション後、４０５ｎｍにおいて吸光度を測定した。検量線を使用することにより未知試料の活性度を計算することができる。この試験のマンノプロテインマトリックス中での定量限界は６００Ｕ／ｍＬである。

［ペプチド混合物の特徴づけ］
組成物中のペプチド混合物は、例えばアミノ酸分析またはＮＭＲによって特徴を明らかにすることができる。組成物中のペプチドの量は、材料および方法において示したようなＰｉｃｏＴａｇ法によって求めることができる。

［ペプチド混合物の量の測定］
組成物中のペプチド混合物の量は、次のように測定される。組成物を限外濾過にかける。３ｋＤａのカットオフを有する限外濾過膜によって留められ、かつ１０ｋＤａのカットオフを有する限外濾過膜を透過するペプチド混合物を回収、乾燥、計量し、限外濾過を受けた乾燥組成物の量に関してその重量比率を求める。

［総乾燥重量］
凍結乾燥と、それに続く計量によって総乾燥重量を求めた。

［実施例１］
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｇを水道水５０ｍＬ中に溶解した。ｐＨを８に調整した。Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のプロテアーゼを含有する）の添加後、そのＢＳＡ溶液を６０℃で４時間インキュベートした。ｐＨをｐＨ８に３度再調整し、その度に追加のＡｌｃａｌａｓｅを加えた。４時間後、もはやｐＨの降下は観察されず、タンパク質の加水分解が停止したことを示した。この溶液を限外濾過（ＵＦ）によって、まず撹拌セル中の３ｋＤａ ＹＭ−３再生セルロース膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で分画した。次に、この濃縮液を１０ｋＤａ ＰＭ−１０ポリエーテルスルホン膜（ＰＥＳ）（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で分画し、濃縮液および透過液を得た。第一限外濾過の透過液と、第二限外濾過の濃縮液および透過液とを凍結乾燥し、最初のＢＳＡ水解物に対するＵＦ画分の総乾燥重量を計算した。幾つかのペプチド画分の乾燥重量比率を表１に示す。ＢＳＡの大部分はＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）によって３ｋＤａよりも小さい断片に加水分解された。しかし、かなりの部分が３ｋＤａ膜上に留められ、またほんのわずかな部分が１０ｋＤａ膜によっても留められた。ＵＦ画分およびＢＳＡ水解物は、ＫＨＴが過飽和（飽和状態を２６％超えた酒石酸濃度）の白ワイン中で試験した。１０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、アリコートを５０、１００、および２００ｍｇ／ＬのペプチドまたはＢＳＡ水解物を得るためにワインに加えた。毎日、結晶の形成を視覚的に観察した。結果を表２に示す。

表２は、加水分解されたＢＳＡが、ワイン中のＫＨＴ結晶化の抑制剤として有効であることを示している。１０ｋＤａ限外濾過膜によって留められたＵＦ画分（ＭＷ＞１０ｋＤａ）は、ワイン中に完全には可溶でなく、ワイン中の沈殿および曇りを引き起こす。３ｋＤａ再生セルロース膜を透過するＵＦ画分（ＭＷ＜３ｋＤａ）は活性が低い。３ｋＤａ再生セルロース膜上に留められるが、１０ｋＤａポリエーテルスルホン膜を透過するＵＦ画分（３ｋＤａ＜ＭＷ＜１０ｋＤａ）が、最も活性な画分である。

［実施例２］
マンノプロテインを、酵母抽出物（Ｍａｘａｒｏｍｅ（登録商標），ＤＳＭ Ｆｏｏｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）から限外濾過（ＵＦ）と、後続の４ｋＤａ Ｎａｄｉｒ（登録商標）ポリエーテルスルホン親水膜（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上でのダイアフィルトレーション（４〜１０倍）とによって回収した。２組の独立の単離液を調製した（ＡおよびＢ）。それぞれの単離液の組について水２５ｍＬに回収マンノプロテイン１ｇが溶解された。これら溶液を、撹拌セル中の１０ｋＤａ ＰＭ−１０ ＰＥＳ膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で限外濾過した。濃縮液を凍結乾燥し計量して、＞１０ｋＤａの分子量を有する画分を得た。透過液を、撹拌セル中の３ｋＤａ ＹＭ−３再生セルロース膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で限外濾過した。濃縮液および透過液を凍結乾燥し計量して、３ｋＤａ＜ＭＷ＜１０ｋＤａを有するＵＦ画分を得た。それらＵＦ画分の収量比を表３に記録する。

これらＵＦ画分は、材料および方法において示したようなペプチドおよび炭水化物含量を特徴とし、結果を表４に記録する。

ＵＦ画分および出発マンノプロテインの活性を、上記に示した３種類の異なるワインで試験し、結果を表５に記録する。

最も活性なマンノプロテインＵＦ画分は、３ｋＤａ再生セルロース膜によって留められ、１０ｋＤａ ＰＥＳ膜を透過することが表５から分かる。このマンノプロテインＵＦ画分は、ペプチドが大幅に富化される。３から１０ｋＤａの間のペプチド混合物の活性は、それぞれのワインについて異なる可能性があることもまた分かる。

［実施例３］
２つの別々の同一実験（ＡおよびＢ）において、市販のマンノプロテイン（Ｍａｎｎｏｓｔａｂ（登録商標），Ｌａｆｆｏｒｔ，Ｆｒａｎｃｅ）２ｇを水１００ｍＬに溶解した。これら溶液を、撹拌セル中の１０ｋＤａ ＰＭ−１０ ＰＥＳ膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で限外濾過（ＵＦ）した。濃縮液を凍結乾燥し計量した。透過液を、撹拌セル中の３ｋＤａ再生セルロース膜（Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ−３）上で限外濾過した。これら濃縮液および透過液を凍結乾燥し計量した。ワイン中の活性を２種類のワインについて上記と同様に試験した。すなわち実験Ａ由来のマンノプロテインはフランスのシャルドネ（Ｆｒｅｎｃｈ Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ）を用いて試験し、また実験Ｂ由来のマンノプロテインはドイツ白ワインを用いて試験した。マンノプロテインから単離されるＵＦ画分の収量比を、表６ａ（実験Ａ）および表６ｂ（実験Ｂ）中に記録する。これらＵＦ画分は、材料および方法において示したようなペプチドおよび炭水化物含量を特徴とし、結果を表７ａおよび７ｂに記録する。これらＵＦ画分および出発マンノプロテインの活性を、上記に示したようなワインで試験し、これら結果もまた表７ａおよび７ｂに記録する。

３ｋＤａ再生セルロース膜によって留められるが、１０ｋＤａ ＰＥＳ膜によっては留められないマンノプロテインＵＦ画分はペプチドが富化され、かつこのＵＦ画分はその他のＵＦ画分よりも活性であることが表７ａおよび表７ｂから分かる。

［実施例４］
リゾチーム（Ｄｅｌｖｏｚｙｍｅ，ＤＳＭ）１ｇを水道水５０ｍＬに溶解した。ｐＨを８に調整した。Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の添加後、そのリゾチーム溶液を６０℃で５時間インキュベートした。毎時にｐＨをｐＨ８に調整した。５時間後、もはやｐＨの降下は観察されず、タンパク質の加水分解が停止したことを示した。

この溶液を限外濾過（ＵＦ）によって、まず撹拌セル中の１０ｋＤａ ＰＭ−１０ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で分画した。次に、その透過液を３ｋＤａ ＹＭ−３再生セルロース膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で分画し、濃縮液および透過液を得た。第一限外濾過の濃縮液と、第二限外濾過の濃縮液および透過液とを凍結乾燥し、最初のリゾチーム出発材料に対する３つのＵＦ画分の総乾燥重量を計算した。幾つかのＵＦ画分の重量比率を表８に示す。リゾチームの大部分はＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）によって３ｋＤａよりも小さい断片に加水分解された。しかし、かなりの部分が３ｋＤａ膜上に留められ、またほんのわずかな部分が１０ｋＤａ膜によっても留められた。リゾチーム由来のＵＦ画分を、ＫＨＴが過飽和のロゼワイン中で試験した。１０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、アリコートをワインに加えて５０、１００、および２００ｍｇ／Ｌのペプチドを得た。毎日、結晶の形成を視覚的に観察した。結果を表９に示す。

表９は、１０ｋＤａ限外濾過膜によって留められたＵＦ画分（ＭＷ＞１０ｋＤａ）が、ワイン中に完全には可溶でなく、ワイン中の沈殿および曇りを引き起こすことを示している。３ｋＤａ再生セルロース膜を透過するＵＦ画分（ＭＷ＜３ｋＤａ）は活性が低い。３ｋＤａ再生セルロース膜上には留められるが、１０ｋＤａポリエーテルスルホン膜を透過するＵＦ画分（３ｋＤａ＜ＭＷ＞１０ｋＤａ）が、最も活性な画分である。

実施例５
Ｐｅｐｔｏｎ（植物源由来の加水分解タンパク質、Ｓｉｇｍａ）１ｇを水道水２５ｍＬに溶解した。このＰｅｐｔｏｎを、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）処理なしにそれ自体で使用した。まず限外濾過（ＵＦ）により、撹拌セル中の１０ｋＤａ ＰＭ−１０ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で分画した。次に、その透過液を３ｋＤａ ＹＭ−３再生セルロース膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で分画し、濃縮液および透過液を得た。

第一限外濾過の濃縮液と、第二限外濾過の濃縮液および透過液とを凍結乾燥し、最初のｐｅｐｔｏｎ出発材料に対するこれら３つのＵＦ画分の総乾燥重量を計算した。幾つかのペプチド画分の重量比率を表１０に示す。

ｐｅｐｔｏｎ由来のこれらＵＦ画分を、ＫＨＴが過飽和の白ワイン中で試験した。１０ｍｇ／ｍＬの溶液を調製し、アリコートをワインに加えて５０、１００、および２００ｍｇ／Ｌのペプチドを得た。毎日、結晶の形成を視覚的に観察した。結果を表１１に示す。

［実施例６］
ゼラチン（ブタの皮膚からのもの、Ｓｉｇｍａ）１ｇを水道水５０ｍＬに溶解した。ｐＨを８に調整した。Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、インキュベーションを６０℃で４時間行った。毎時にｐＨをｐＨ８に再調整した。４時間後、もはやｐＨの降下は観察されず、タンパク質の加水分解が停止したことを示した。

この溶液を限外濾過（ＵＦ）によって、まず撹拌セル中の１０ｋＤａ ＰＭ−１０ポリエーテルスルホン膜（ＰＥＳ）（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で分画した。次に、その透過液を３ｋＤａ ＹＭ−３再生セルロース膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で分画し、濃縮液および透過液を得た。第一限外濾過の濃縮液と、第二限外濾過の濃縮液および透過液とを凍結乾燥し、最初のゼラチン出発材料に対するそれらＵＦ画分の総乾燥重量を計算した。幾つかのペプチド画分の重量比率を表１２に示す。

ゼラチンの大部分はＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）によって３ｋＤａよりも小さい断片に加水分解された。しかし、かなりの部分が３ｋＤａ膜上に留められ、またほんのわずかな部分が１０ｋＤａ膜によっても留められた。結果を表１３に示す。

［実施例７］
カゼイン（Ｓｉｇｍａ）１ｇを水道水５０ｍＬに溶解した。ｐＨを８に調整した。Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、インキュベーションを６０℃で４時間行った。毎時にｐＨをｐＨ８に再調整した。４時間後、もはやｐＨの降下は観察されず、タンパク質の加水分解が停止したことを示した。

この溶液を限外濾過によって、まず撹拌セル中の１０ｋＤａ ＰＭ−１０ポリエーテルスルホン膜（ＰＥＳ）（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で分画した。次に、その透過液を３ｋＤａ ＹＭ−３再生セルロース膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で分画し、濃縮液および透過液を得た。

第一限外濾過の濃縮液と、第二限外濾過の濃縮液および透過液とを凍結乾燥し、最初のカゼイン出発材料に対するそれらＵＦ画分の総乾燥重量を計算した。幾つかのＵＦ画分の重量比率を表１４に示す。

カゼインの大部分はＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）によって３ｋＤａよりも小さい断片に加水分解された。しかし、かなりの部分が３ｋＤａ膜上に留められ、またほんのわずかな部分が１０ｋＤａ膜によっても留められた。結果を表１５に示す。

［実施例８］
卵アルブミン（Ｓｉｇｍａ）１ｇを水道水５０ｍＬに溶解した。ｐＨを８に調整した。Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、インキュベーションを６０℃で４時間行った。毎時にｐＨをｐＨ８に再調整した。４時間後、もはやｐＨの降下は観察されず、タンパク質の加水分解が停止したことを示した。

この溶液を限外濾過によって、まず撹拌セル中の１０ｋＤａ ＰＭ−１０ポリエーテルスルホン膜（ＰＥＳ）（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で分画した。次に、その透過液を３ｋＤａ ＹＭ−３再生セルロース膜（Ａｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上で分画し、濃縮液および透過液を得た。

第一限外濾過の濃縮液と、第二限外濾過の濃縮液および透過液とを凍結乾燥し、最初の卵アルブミン出発材料に対するそれらＵＦ画分の総乾燥重量を計算した。幾つかのペプチド画分の重量比率を表１６に示す。

卵アルブミンの大部分はＡｌｃａｌａｓｅ（登録商標）によって３ｋＤａよりも小さい断片に加水分解された。しかし、かなりの部分が３ｋＤａ膜上に留められ、またほんのわずかな部分が１０ｋＤａ膜によっても留められた。結果を表１７に示す。

Claims (22)

1. 酒石酸の塩の結晶化に対するワインの安定化に適した組成物であって、
   前記組成物が乾燥重量を基準にして少なくとも２．５％のペプチドを含み、かつ前記ペプチドが≧３ｋＤａかつ≦１０ｋＤａの分子量を有することを特徴とする、組成物。
2. 炭水化物および／またはオリゴヌクレオチドから好ましくは選択される１種類または複数種類の生体分子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物が固体の形態、あるいは液体または溶液の形態である、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記組成物が液体または溶液であり、５０〜５００ｇ／Ｌの間の乾燥分含量を有する、請求項３に記載の組成物。
5. タンパク質基質、タンパク質水解物、酵母抽出物、カルボキシメチルセルロース、およびワイン添加剤からなる群から好ましくは選択される１種類または複数種類の成分をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記ワイン添加剤がマンノプロテインである、請求項５に記載の組成物。
7. 前記タンパク質水解物が動物、植物、または微生物起源のものである、請求項５に記載の組成物。
8. 前記液体または溶液が、ｐＨ＝４において≦５００ＮＴＵかつ／またはｐＨ＝８において≦２５０ＮＴＵの濁度を有し、前記濁度が前記組成物の乾燥分含量２００ｇ／Ｌにおける比濁分析によって測定されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記組成物が、水中に溶解されて１ｇ／Ｌの乾燥分含量を有する溶液を生じる場合、ｐＨ３．５において測定したときに≦４ＮＴＵの濁度を有し、かつ／または水に溶かした１２％エタノール（ｖ／ｖ）中に溶解されて１ｇ／Ｌの乾燥分含量を有するｐＨ３．５における溶液を生じる場合、≦２０ＮＴＵの濁度を有し、かつ／または白ワイン中に溶解されて０．２ｇ／Ｌの乾燥分含量を有する溶液を生じる場合、≦１０ＮＴＵの濁度を有することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 請求項１に記載のペプチド混合物を≦２．５％含むペプチド源を加水分解するステップを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物の調製方法。
11. 請求項１に記載のペプチド混合物を≦２．５％含むペプチド源を富化するステップを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物の調製方法。
12. 前記ペプチド源がタンパク質である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記組成物が、
    ａ．１ｋＤａのカットオフを有する膜を使用し、得られる濃縮液を回収する限外濾過のステップ、または
    ｂ．３０ｋＤａのカットオフを有する膜を使用し、得られる透過液を回収する限外濾過のステップ、または
    ｃ．ステップａ）と、その後に続くステップｂ）、または
    ｄ．ステップｂ）と、その後に続くステップａ）
    にかけられる、請求項１１に記載の方法。
14. 前記溶液を７０℃以上の温度、好ましくは８０℃から１４０℃の間に含まれるある温度で好ましくは熱処理にかけることによる、前記組成物をプロテアーゼの不活性化に適した処理にかけるステップをさらに含み、前記熱処理が好ましくは２秒から６０分の間に含まれるある時間のあいだ行われる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記組成物を滅菌、好ましくは滅菌濾過にかけるステップをさらに含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
16. ワインの安定化のための請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物の使用法。
17. 前記ワインが酒石酸の塩の結晶化に対して安定化される、請求項１６に記載の使用法。
18. 前記ワインが白ワインまたはロゼワインである、請求項１６または１７に記載の使用法。
19. ワインの生産に使用されるブドウマスト１リットルに、請求項１に記載の前記ペプチド混合物を１０〜１０００ｍｇの間で加えることによって酒石酸の塩の結晶化に対してワインを安定化させる方法。
20. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の前記組成物が、ワインの濾過後および瓶詰め前にワインに加えられる、請求項１９に記載の方法。
21. 前記ワインが、請求項１に記載の前記ペプチド混合物を１リットル当たり１０〜１０００ｍｇの間で含むことを特徴とする、酒石酸の塩の結晶化に対して安定化されたワイン。
22. 少なくとも２の結晶化時間安定化ワイン（Ｔｃｒｙｓｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｗｉｎｅ）／結晶化時間不安定ワイン（Ｔｃｒｙｓｕｎｓｔａｂｌｅ ｗｉｎｅ）比をさらに特徴とする、請求項２１に記載のワイン。