JP2010521689A - タンパク質複合体をターゲティングする薬物候補の直接質量分析 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、化学的架橋と組み合わせたMALDI質量分析法を使用して、タンパク質複合体をターゲティングする薬物候補の効果を分析する方法に関する。この効果は定量することができ、ターゲティングされたタンパク質複合体に対するIC50値として与えることができる。
タンパク質−タンパク質相互作用は、生理機能に中心的な役割を果たす。細胞において、タンパク質は、ほぼ全ての細胞過程を保証するように調節することができる、複雑で柔軟なネットワークに組織される。薬物がタンパク質をターゲティングしている場合、それらは、実際に、タンパク質−タンパク質相互作用に効果を有して、ターゲティングされたタンパク質が属するネットワーク全体に影響する。数百の潜在的「リード化合物」を検討しなければならない創薬の前臨床段階の間に、タンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質複合体に及ぼす薬物候補の効果の直接分析は、極めて重要である。
精製された多成分試料または不均一な生物学的マトリックスのいずれかにおけるタンパク質複合体と共に薬物候補をインキュベーションし、続いて、相互作用するパートナーを架橋して、共有結合的に安定化されたタンパク質複合体を形成させ、最終的に、試料の消化またはフラグメンテーションを行わずに、安定化されたタンパク質複合体を高質量検出用に装備されたMALDI ToF質量分析で分析することによって、タンパク質複合体に薬物候補が及ぼす効果の検出および判定する方法を提供することが本発明の目的である。
(a)ターゲティングされたタンパク質複合体を、薬物候補と共にインキュベーションする工程;
(b)ターゲティングされたタンパク質複合体を、薬物候補の存在下で架橋試薬と接触させ、共有結合的に安定化されたタンパク質複合体を形成させる工程;
(c)高質量検出器を備える高質量MALDI ToF質量分析により形成したインタクトなイオンを分析する工程;
(d)薬物候補の存在下で、ターゲティングされたタンパク質複合体について得られた質量ピークを、陰性対照分子の存在下で得られた質量ピークと比較することによって、ターゲティングされたタンパク質複合体に薬物候補が及ぼす効果を直接決定する工程
を含む。
本発明は、精製された多成分混合物または不均一な生物学的マトリックスのいずれかにおけるタンパク質複合体に、小分子化合物(MW<1000Da)、抗体、抗体フラグメントならびに他の治療用タンパク質およびペプチドなどの薬物候補が及ぼす効果を、頑健で日常的な分析のための高質量MALDI ToF質量分析および架橋化学反応の組み合わせを使用して高感度および高精度で分析する方法に関する。
(a)ターゲティングされたタンパク質複合体を含有するタンパク質試料の一部と共に薬物候補をインキュベーションし、ターゲティングされたタンパク質複合体を含有するタンパク質試料の別の一部と共に陰性対照分子をインキュベーションする工程;
(b)それぞれ薬物候補および陰性対照分子と、ターゲティングされたタンパク質複合体とを含有する工程(a)からの試料を、架橋試薬または架橋試薬の混合物と接触させて、共有結合的に安定化されたタンパク質複合体を形成させる工程;
(c)高質量検出器を備える高質量MALDI ToF質量分析により、工程(b)のタンパク質複合体から形成したインタクトなイオンを分析する工程;
(d)薬物候補を含む試料および陰性対照分子を含む試料から、ターゲティングされたタンパク質複合体についての質量ピークを比較することにより、薬物候補の効果を直接決定する工程。
(a)ターゲティングされたタンパク質複合体試料を陰性対照分子または薬物候補と共にインキュベーションする工程;
(b)工程(a)からの該第1の試料を架橋試薬または架橋試薬混合物と接触させて、共有結合的に安定化されたタンパク質複合体を含有する第2の試料を得る工程;
(c)工程(b)からの該第2の試料をマトリックス溶液と混合して、試料/マトリックス混合物を得る工程;
(d)該試料/マトリックス混合物を支持体に沈着させることにより、均一な薄層を形成させる工程;
(e)試料/マトリックス混合物にレーザ線を照射することにより、共有結合的に安定化された該タンパク質複合体を脱着し、インタクトなイオンを発生させる工程;
(f)質量分離および高質量検出システムを使用して、未消化で、フラグメンテーションされていない共有結合的に安定化されたタンパク質複合体の該インタクトなイオンを質量分離および検出する工程;
(g)検出されたタンパク質複合体について測定されたピークの質量ピーク面積を決定する工程;
(h)薬物候補と共にタンパク質複合体をインキュベーション後に得られた、タンパク質複合体に対応するピークの質量ピーク面積についての値を、陰性対照分子と共にインキュベーション後に得られたタンパク質複合体に対応するピークの質量ピーク面積についての値と比較する工程;
(i)その比較から、ターゲティングされたタンパク質複合体に薬物候補が及ぼす効果を決定する工程。
(a)いくつかの異なる濃度の薬物候補および陰性対照分子と共に、ターゲティングされたタンパク質複合体試料をインキュベーションする工程;
(b)工程(a)からの該第1シリーズの試料を、架橋試薬または架橋試薬混合物と接触させて、共有結合的に安定化されたタンパク質複合体を含有する第2シリーズの試料を得る工程;
(c)工程(b)からの該第2シリーズの試料をマトリックス溶液と混合して、試料/マトリックス混合物を得る工程;
(d)該試料/マトリックス混合物を支持体に沈着させることにより、均一な薄層を形成させる工程;
(e)試料/マトリックス混合物にレーザ線を照射することにより、共有結合的に安定化された該タンパク質複合体を脱着し、インタクトなイオンを発生させる工程;
(f)質量分離および高質量検出システムを使用して、未消化で、フラグメンテーションされていない共有結合的に安定化されたタンパク質複合体の該インタクトなイオンを質量分離および検出する工程;
(g)検出されたタンパク質複合体について測定されたピークの質量ピーク面積を決定する工程;
(h)異なる濃度の薬物候補と共にタンパク質複合体をインキュベーション後に得られたタンパク質複合体に対応するピークの質量ピーク面積についての値を、陰性対照分子と共にインキュベーション後に得られたタンパク質複合体に対応するピークの質量ピーク面積についての値と比較する工程;
(i)その比較から、工程(a)におけるインキュベーション後に存在したタンパク質複合体のパーセンテージを決定する工程;
(j)工程(i)で決定されたパーセンテージを薬物候補の濃度の関数としてプロットすることにより、ターゲットに対する薬物候補のIC50値を決定する工程。
質量分析:全ての質量測定は、高質量レトロフィット検出器システム(HM1, CovalX, Zurich, Switzerland)を備えるMALDI ToF質量分析装置Reflex IV(Bruker, Bremen)で行った。CovalX HM1高質量レトロフィットシステムは、5〜1500kDa範囲で高分子量分子イオンの検出を最適化するように設計されている。CovalX HM1高質量レトロフィットシステムは、あらゆる標準的なMALDI−TOF質量分析装置にインストールすることができる。
AG32は、酵素チミジンキナーゼ(TK)をターゲティングする薬物候補である。この薬物候補は、約400DaのMWを有するラモトリギン化合物ファミリーに属する。この酵素は、いわゆるピリミジンサルベージ経路におけるDNA合成のための前駆体であるチミジン一リン酸を得る、チミジンの5’OH基へのATP由来γ−リン酸の転移を触媒する。この酵素は、多数のウイルスの病原性に、特に潜伏期からのウイルスの再活性化に不可欠である。TKの精製試料を調製し、ジスクシンイミジル3,3’−ジチオプロピオネート、ジスクシンイミジルグルタレート、およびオクタン二酸ビス(3−スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド)エステルの1:1:1混合物(100μg/ml)を用いて架橋する。架橋試薬と共に25℃で45分間インキュベーションする前(図2A)および後(図2B)に、高質量MALDI ToF質量分析を使用して試料を直接分析する。チミジンキナーゼの精製試料を、陰性対照分子(10μM、AG0、薬物候補と類似の分子量を有する)と共に(図2C)、または薬物候補(AG32、10μM)と共に(図2D)1時間インキュベーションする。インキュベーション後に、試料に上記の架橋試薬を25℃で45分間作用させる。次に、試料を高質量MALDI ToF質量分析により直接分析する。質量分析の後に、陰性対照およびAG32実験についてTK複合体に対応するピークの質量ピーク面積を推定する。陰性対照分子に関して、TK複合体に対応するピークの質量ピーク面積に差は検出されない。AG32と共にインキュベーション後は、TKに対応するピークの質量ピーク面積が小さくなり、AG32がTK複合体に破壊的な効果を有することが示される。各試料についてのタンパク質濃度は1μMであり、体積は10μLである。薬物候補溶液(100μM)1μLをタンパク質試料と共に25℃で1時間のインキュベーション時間で混合する。1mg/mLの架橋混合物1μLを使用してタンパク質複合体を安定化してから、高質量MALDI ToF分析を行う。タンパク質複合体溶液1μLをシナピン酸(70%アセトニトリル:30%水:0.1%トリフルオロ酢酸中に10mg/mL)1μLと共に混合し、液滴乾燥法(dried droplet technique)を使用して1μLをスポットすることにより、試料を調製する。
結腸直腸ガンおよび他のガンにおける主要な分子傷害は、T細胞因子(Tcf)依存性遺伝子のβ−カテニン依存性トランス活性化を引き起こす。このシグナルの破壊は、合理的なガン治療のための機会を示す。PK115、PK117およびPKF118は、相互作用Tcf4/β−カテニンをターゲティングしている、500Da範囲のMWを有する天然化合物ライブラリー由来の薬物候補である。Tcf4/β−カテニン複合体の精製試料は、陰性対照分子(NC)(薬物候補と類似のMWおよび化学構造を有する)と共に、または薬物候補PKF115、PK117またはPK118と共にインキュベーション(1時間、25℃)される。インキュベーション後に、ジスクシンイミジル3,3’−ジチオプロピオネート、ジスクシンイミジルグルタレート、およびオクタン二酸ビス(3−スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド)エステル(100μg/ml)の1:1:1混合物を使用して試料を架橋する。架橋試薬と共に25℃で45分間インキュベーション後に、高質量MALDI ToF質量分析を使用して試料を直接分析する。質量分析後に、Tcf4/β−カテニン複合体に対応するピークの質量ピーク面積を、陰性対照実験から(図3 NC)、PK115(図3 PK115)、PK117(図3 PK117)およびPK118(図3 PK117)の実験から推定する。PK115、PK117およびPK118と共にインキュベーション後に、Tcf4/β−カテニンに対応するピークの質量ピーク面積は、陰性対照よりも低く、これらの薬物候補がTcf4/β−カテニン複合体に破壊的な効果を有することが示される。各試料についてのタンパク質濃度は1μMであり、体積は10μlである。薬物候補溶液(100μM)1μLをタンパク質試料と共に25℃で1時間のインキュベーション時間で混合する。1mg/mLの架橋混合物1μlを使用してタンパク質複合体を安定化してから、高質量MALDI ToF分析を行う。タンパク質複合体溶液1μLをシナピン酸(70%アセトニトリル:30%水:0.1%トリフルオロ酢酸中に10mg/mL)1μLと混合し、液滴乾燥法を使用して1μLをスポットすることにより、試料を調製する。
MDM2およびp53は、悪性トランスフォーメーションから細胞を防御する主経路に関与する二つのタンパク質である。ストレスに応答して、p53の細胞レベルは翻訳後メカニズムにより上昇し、細胞周期の停止またはアポトーシスを導く。ストレスのかからない条件では、p53はMDM2タンパク質と緊密に相互作用する。MDM2は、p53が細胞周期の停止を誘導する能力を遮断することから、相互作用MDM2−p53は、ガン治療の潜在的ターゲットとしてみなされる。ヌトリン−3aおよびヌトリン−3bは、処置される細胞におけるアポトーシスを活性化させる、相互作用の阻害剤として同定された。これらの二つの阻害剤のIC50は、表面プラズモン共鳴を使用してヌトリン−3aについて0.09μMおよびヌトリン−3bについて13.6μMという値でそれぞれ測定された(Vassilev, L.T. et al., Science 403:844-846, 2004)。以下において、MDM2−p53相互作用のヌトリン−3aおよびヌトリン−3bの阻害のIC50値が高い精度でどのように決定されるかを実証する。
Claims (13)
- タンパク質複合体に薬物候補が及ぼす効果を決定するための方法であって、以下の工程:
(a)ターゲティングされた該タンパク質複合体と共に該薬物候補をインキュベーションする工程;
(b)該ターゲティングされたタンパク質複合体および該薬物候補を含有する試料を架橋試薬または架橋試薬混合物と接触させて、共有結合的に安定化されたタンパク質複合体を形成させる工程;
(c)工程(b)の該タンパク質複合体から形成したインタクトなイオンを、高質量検出器を備えるMALDI ToF質量分析により分析する工程;
(d)該薬物候補と共にインキュベーション後の該タンパク質複合体に対応する質量ピーク面積を、陰性対照分子と共にインキュベーション後の同じタンパク質複合体の質量ピーク面積と比較することにより、該タンパク質複合体に該薬物候補が及ぼす効果を直接決定する工程
を含む方法。 - 工程(a)から(d)が、工程(a)において異なる濃度の薬物候補を用いて平行して行われ、効果が、工程(d)で定量され、かつ薬物候補の濃度の関数として表される、請求項1記載の方法。
- 工程(d)で定量された効果が、ターゲティングされたタンパク質複合体についての薬物候補のIC50値として表される、請求項2記載の方法。
- 以下の工程:
(a)ターゲティングされたタンパク質複合体と共に薬物候補または陰性対照分子をインキュベーションすることにより第1の試料を得る工程;
(b)該第1の試料を架橋試薬または架橋試薬混合物と接触させて、共有結合的に安定化されたタンパク質複合体を含む第2の試料を得る工程;
(c)該第2の試料をマトリックス溶液と混合して、試料/マトリックス混合物を得る工程;
(d)該試料/マトリックス混合物を支持体に沈着させることにより、均一な薄層を形成させる工程;
(e)該試料/マトリックス混合物にレーザ線を照射する工程であって、該共有結合的に安定化されたタンパク質複合体が脱着され、インタクトなイオンが発生する工程;
(f)質量分離および高質量検出システムを使用して、未消化で、フラグメンテーションされていない該共有結合的に安定化されたタンパク質複合体の該インタクトなイオンを質量分離および検出する工程;
(g)検出された該タンパク質複合体について測定されたピークの質量ピーク面積を決定する工程;
(h)該薬物候補と共に該タンパク質複合体をインキュベーション後に得られた、該タンパク質複合体に対応するピークの質量ピーク面積についての値を、陰性対照分子と共にインキュベーション後に得られた、該タンパク質複合体に対応するピークの質量ピーク面積についての値と比較する工程;
(i)該比較から、該ターゲティングされたタンパク質複合体に及ぼす該薬物候補の効果を決定する工程
を含む、請求項1記載の方法。 - 以下の工程:
(a)ターゲティングされたタンパク質複合体試料を、いくつかの異なる濃度の薬物候補および陰性対照分子と共にインキュベーションする工程;
(b)工程(a)からの第1シリーズの該試料を架橋試薬または架橋試薬混合物と接触させて、共有結合的に安定化された該タンパク質複合体を含有する第2シリーズの試料を得る工程;
(c)工程(b)からの該第2シリーズの試料をマトリックス溶液と混合して、試料/マトリックス混合物を得る工程;
(d)該試料/マトリックス混合物を支持体に沈着させることにより、均一な薄層を形成させる工程;
(e)該試料/マトリックス混合物にレーザ線を照射する工程であって、該共有結合的に安定化されたタンパク質複合体が脱着され、インタクトなイオンが発生する工程;
(f)質量分離および高質量検出システムを使用して、未消化で、フラグメンテーションされていない該共有結合的に安定化されたタンパク質複合体の該インタクトなイオンを質量分離および検出する工程;
(g)検出された該タンパク質複合体について測定されたピークの質量ピーク面積を決定する工程;
(h)異なる濃度の該薬物候補と共に該タンパク質複合体をインキュベーション後に得られた、該タンパク質複合体に対応するピークの質量ピーク面積についての値を、陰性対照分子と共にインキュベーション後に得られた、該タンパク質複合体に対応するピークの質量ピーク面積についての値と比較する工程;
(i)該比較から、工程(a)でインキュベーション後に存在したタンパク質複合体のパーセンテージを決定する工程;
(j)工程(i)で決定されたパーセンテージを、該薬物候補の濃度の関数としてプロットすることにより、ターゲットに対する該薬物候補のIC50値を決定する工程
を含む、請求項3記載の方法。 - 薬物候補の質量ピーク面積の値と陰性対照分子の質量ピーク面積の値との比較が、多数の薬物候補を、ターゲティングされたタンパク質複合体に及ぼすそれらの効果について選択および順位付けするために使用される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- タンパク質複合体に薬物候補が及ぼす効果が、同じ質量分析スペクトルにおける該タンパク質複合体に対応するピークおよび該複合体のサブユニットに対応するピークの合計質量ピーク面積に基づき確立される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- タンパク質複合体に薬物候補が及ぼす効果が、精製された多成分試料または不均一な生物学的マトリックスにおいて分析される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 薬物候補が、小分子、抗体、抗体フラグメント、治療用タンパク質または治療用ペプチドである、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 架橋試薬が、ジスクシンイミジルタルトレート、オクタン二酸ビス(3−スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド)エステル、ヨード酢酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジスクシンイミジル3,3’−ジチオプロピオネート、オクタン二酸ジ−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ジスクシンイミジルグルタレートおよびエチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)より選択される一つの試薬または架橋試薬混合物である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 高質量検出器がイオン変換ダイノード(ICD)検出器である、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- リード化合物の最適化、薬物開発過程、製造過程および品質管理過程における薬物候補のキャラクタリゼーションのための、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法の使用。
- 自動化ハイスループット応用における、請求項10記載の使用。
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