JP2010521419A - イムノフィリンおよびカルシウムチャネル活性を調整するためのイムノフィリンリガンドおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、少なくとも一部が、イムノフィリンリガンド(例えば、mTOR結合領域を改変したラパマイシンアナログ)が、イムノフィリンFKBP52および/または電位開口型L型カルシウムチャネルβ1サブユニットと相互作用する(例えば、結合する)という発見に基づく。これらの化合物によるFKBP52および/またはCACNB1の阻害は、神経突起伸長および/またはニューロンの生存を刺激する。したがって、これらの化合物の間の相互作用(および複合体形成)は、β1サブユニットの活性を阻害し、イムノフィリンリガンド(本明細書中に記載のラパマイシンアナログまたはメリダマイシンアナログなど)によって阻害されるいくつかの神経栄養活性および/または神経保護活性における電位開口型L型カルシウムチャネルに関与する神経突起伸長を刺激すると考えられる。
イムノフィリンリガンド
イムノフィリンリガンドは、主に免疫系および神経系で、イムノフィリンに結合して他の細胞標的を活性化する。いくつかのイムノフィリンは、免疫抑制性(例えば、シクロスポリンA、FK506、およびラパマイシン)であるのに対して、他のより低い免疫抑制性を示すイムノフィリンは神経栄養活性を示す。例えば、メリダマイシンは、実質的に非免疫抑制性を示し、in vitroで有意な神経保護活性を示す(2005年12月8日公開のHe,M.らの米国特許出願公開第2005/0272133号および2005年9月8日公開のGraziani,E.らの米国特許出願公開第2005/0197356号)。好ましくは、本発明の方法によって同定されるか、本発明の方法で使用されるイムノフィリンリガンドは、実質的に非免疫抑制性を示すが、望ましい活性(例えば、神経栄養活性)を保持する。好ましいイムノフィリンリガンドは、本明細書中に記載の複合体の形成を増加させ、そして/またはFKBPおよび/またはカルシウムチャネル活性を減少させる。
R1およびR2は単結合を介して連結し、R1はOであり、R2はNR3であり、R4はOHであり、R5〜R7はOCH3であり、R8およびR9はHC=CHであり、R3は、以下:
R1およびR2は単結合を介して連結し、R1はOであり、R2はNR3であり、R3はフェニルであり、R5〜R7はOCH3であり、R8およびR9はHC=CHであり、R4は、以下:
R1およびR2は単結合を介して連結し、R1はOであり、R2はNR3であり、R4はOHであり、R5〜R7はOCH3であり、R8およびR9はH2C−CH2であり、R3は、以下:
ラパマイシンアナログを、薬学的または生理学的に許容可能な酸または塩基由来の薬学的に許容可能な塩、プロドラッグ、または代謝産物の形態で使用することができる。これらの塩には、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの鉱酸または無機酸および酢酸、シュウ酸、コハク酸、およびマレイン酸などの有機酸との以下の塩が含まれるが、これらに限定されない。他の塩には、エステル形態、カルバミン酸塩形態、および他の従来の「プロドラッグ」の形態のアルカリ金属またはアルカリ土類金属(ナトリウム、カリウム、カルシウム、またはマグネシウムなど)との塩が含まれ、かかる形態で投与した場合にin vivoで活性部分に変換される。
1つの態様では、本発明は、イムノフィリン複合体の発見に関する。いくつかの実施形態では、複合体には、イムノフィリンリガンド(例えば、本明細書中に記載のラパマイシンまたはメリダマイシンアナログ)、イムノフィリン(例えば、FKBP52)またはその機能的バリアント、およびカルシウムチャネルサブユニット(例えば、電位開口型L型カルシウムチャネルのβ1サブユニット)またはその機能的バリアントが含まれる。
別の態様では、本発明は、本明細書中に開示の複合体の1つ以上のポリペプチド構成要素をコードする1つ以上の核酸を含む宿主細胞を特徴とする。1つの実施形態では、宿主細胞は、イムノフィリン、(例えば、FKBP52(例えば、本明細書中に記載の哺乳動物FKBP52))またはその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む第1の核酸;および/または電位開口型L型カルシウムチャネルのサブユニット(例えば、β1サブユニット)(例えば、本明細書中に記載の哺乳動物β1サブユニット)またはその機能的バリアントをコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸を含む。1つの実施形態では、第1の核酸は、図13A〜13Bに示すアミノ酸配列(配列番号6〜7)またはこれに実質的に同一の配列をコードするヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、第2の核酸は、図12A〜12Eに示すアミノ酸配列(配列番号1〜5)またはこれに実質的に同一の配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書中に開示の複合体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを特徴とする。一定の実施形態では、抗体は、本明細書中に開示の複合体の形成および/または安定性を増加させる。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書中に開示の複合体の形成および/または安定性を減少または阻害する。例示的抗体分子には、完全な免疫グロブリン分子または、例えば、抗原結合部位を含むその一部(F(ab)、F(ab’)、F(ab’)2、ヒト化キメラ抗体、およびF(v)のような当該分野で公知の免疫グロブリン分子の一部が含まれる)が含まれる。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を、当該分野で公知の方法によって産生することができる(Kohler and Milstein(1975)Nature 256,495−497;Campbell “Monoclonal Antibody Technology,the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas” in Burdonら(eds.)(1985)“Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”,Vol.13,Elsevier Science Publishers,Amsterdam);Harlow and Lane(eds)(1988)In “Antibodies A Laboratory Manual”,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y(その全ての内容が、本明細書中で参照により援用される)。
別の態様では、本発明は、試験化合物、イムノフィリン、およびカルシウムチャネルサブユニットを含む複合体の形成および/または安定性を調整(例えば、阻害または増加)する試験化合物を同定するための方法またはアッセイを提供する。方法またはアッセイは、複合体を形成させる条件下で、イムノフィリンまたはその機能的バリアントおよびβサブユニットまたはその機能的バリアントを含むサンプルを試験化合物と接触させる工程、基準サンプル(例えば、試験薬に暴露していないコントロールサンプルまたはラパマイシンに暴露しているコントロールサンプル)と比較して試験化合物と接触したサンプル中の複合体の存在を検出する工程を含む。基準サンプル中の複合体のレベルと比較した試験化合物の存在下での複合体のレベルの変化(例えば、増加または減少)は、試験化合物が複合体の形成および/または安定性に影響を及ぼす(例えば、増加または減少する)ことを示す。複合体形成を、基準サンプルと比較して、例えば、約1.5、2、5、10倍、またはそれを超えて増加させる試験化合物が好ましい。
さらに別の態様では、本発明は、イムノフィリン(例えば、FKBP52)またはその機能的バリアントおよび電位開口型L型カルシウムチャネルのサブユニット(例えば、β1サブユニット)またはその機能的バリアントを発現する細胞(例えば、哺乳動物細胞)中の機能(例えば、カルシウムチャネル活性(例えば、電位開口型カルシウムチャネル活性))を調整する方法を提供する。1つの実施形態では、カルシウムチャネルまたはFKBP52の活性または発現を阻害する。カルシウムチャネル活性が阻害される実施形態では、神経突起の伸長および/または生存を刺激することが好ましい。典型的には、本発明の方法で使用される細胞は、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)(例えば、神経細胞または心血管細胞)である。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書中に記載の複合体を形成させる条件下で、細胞をイムノフィリンリガンド(例えば、本明細書中に記載のラパマイシンアナログまたはメリダマイシンアナログ)と接触させ、それにより、カルシウムチャネル活性を阻害する工程を含む。
1つの態様では、本発明は、1つ以上のイムノフィリンリガンドを含む薬学的組成物の調製方法を含む。他の実施形態では、本明細書中に記載の複合体を含む薬学的組成物を開示する。本明細書中で使用する場合、「イムノフィリンリガンド」または「イムノフィリンリガンド」を含む組成物は、1つ以上のイムノフィリンリガンドを含む組成物を含むことを意図する。組成物を、いくつかの異なる経路によって哺乳動物対象に投与することができ、固体または液体の形態で経口投与することが望ましい。
FK506およびラパマイシンとその各タンパク質標的との複合体により、免疫抑制活性が得られ、これは慢性神経変性の治療状況で望ましくないかもしれない(Lamら,J.Biol.Chem.270,26511−22(1995))。したがって、非免疫抑制性イムノフィリンリガンドを構築するために、以下により詳細に記載するように、FKBP結合部分がインタクトなままでmTORとの相互作用を破壊する(図1A)ために、ラパマイシンアナログIおよびIIを、C1,C3ジエンでのニトロソベンゼンとの[4+2]付加環化反応を介してラパマイシンから調製した。
化学物質を、Sigma−Aldrich(St.Louis,MO)から購入した。
ラパマイシンアナログI(0.29g、0.284mmol)を、18mm試験管中の7mLメタノールに溶解し、Pd/C触媒(Aldrich)のスパチュラチップを添加した。混合物を、Parr装置にて2.0気圧のH2で15分間水素化した。生成物を、逆相HPLC(カラム:250×20mm YMC ODS−A(50×20ガードカラム付)、移動相:80% メタノール:水で15分間、その後に85%で5分間、次いで85%で20分間保持、流速=20mL/分)によってクロマトグラフィ分析して、0.089gの生成物を得た(収率31%、tR=12.6分、HPLCの分析条件:カラム=YMC ODS−A S−3 120Å、移動相/勾配:95%水(+0.025%ギ酸)/アセトニトリル(+0.025%ギ酸)から5%水で6分間、5%で9分間保持、流速=0.30mL/分)。1H−NMR(500MHz,CD3CN):δ7.25(m,2H,H57),6.91(m,2H,H56),6.79(m,1H,H58),5.44(m,1H,H29),5.35(m,1H,H5),5.24(m,1H,H25),5.11(m,1H,H22),4.50(m,1H,H4),4.42(m,1H,13−OH),4.00(m,1H,H31),3.80(m,1H,H9),3.77(m,1H,H32),3.67(m,1H,H7),3.57(m,1H,31−OH),3.43(m,1H,H28),3.35(m,1H,H18),3.35(s,3H,Me54),3.34(m,1H,H1),3.32(m,1H,H18’),3.32(s,3H,Me53),3.27(m,1H,H42),3.16(m,1H,H34),3.08(s,3H,Me52),3.00(m,1H,42−OH),2.87(m,1H,H41),2.79(m,1H,H26),2.71(m,1H,H26’),2.29(m,1H,H21),2.18(m,1H,H36),2.10(m,1H,H40),1.95(m,1H,H35),1.95(m,1H,H37),1.86(m,1H,H43),1.85(m,1H,H2),1.85(m,1H,H3),1.82(m,1H,H12),1.79(m,1H,H2’),1.77(m,1H,H20),1.71(m,1H,H8),1.69(m,1H,H19),1.68(m,1H,H21’),1.66(s,3H,Me48),1.64(m,1H,H44),1.63(m,1H,H8’),1.61(m,1H,H10),1.60(m,2H,H11),1.50(m,1H,Me45),1.46(m,1H,H3’),1.43(m,1H,H19’),1.39(m,1H,H20),1.39(m,1H,H39),1.35(m,1H,H10’),1.29(m,1H,H38),1.26(m,1H,H43’),1.13(d,3H,Me47),1.12(m,1H,H38’),1.07(d,3H,Me49),1.03(m,1H,H35’),1.03(d,3H,Me46),1.00(m,1H,H44’),0.97(d,3H,Me50),0.91(d,3H,Me51),0.66(m,1H,H40’);13C−NMR(125MHz,CD3CN):δ216.1(s,C33),210.3(s,C27),198.3(s,C15),170.3(s,C23),168.3(s,C16),149.9(s,C55),139.9(s,C30),139.4(s,C6),130.2(d,C57),129.4(d,C5),128.1(d,C29),119.7(d,C58),114.2(d,C56),98.4(s,C13),88.5(d,C32),85.4(d,C41),85.0(d,C7),77.7(d,C31),76.3(d,C25),74.8(d,C42),72.3(d,C4),68.5(d,C9),60.0(d,C1),59.2(q,C53),57.1(q,C54),56.0(q,C52),52.0(d,C22),46.5(d,C28),45.1(t,C18),42.7(d,C34),42.1(t,C26),40.8(t,C35),39.1(t,C38),38.3(t,C8),35.7(t,C40),35.0(d,C12),34.3(d,C37),34.1(d,C39),33.1(t,C43),32.5(t,C44),32.1(t,C10),32.0(d,C36),29.1(t,C11),28.0(t,C21),26.8(t,C3),25.9(t,C19),21.7(t,C20),20.6(t,C2),19.0(q,C49),17.5(q,C47),17.4(q,C50),16.8(q,C46),16.4(q,C51),13.1(q,C48),10.4(q,C45);FT−ICRMS(m/z):C57H87N2O14の[M+H]+計算値1023.61519;実測値1023.61722。
方法
神経突起伸長の測定
皮質ニューロンを、2%パラホルムアルデヒドを使用して5分間固定し、その後に4%パラホルムアルデヒドで5分間固定した。細胞を、ブロッキング液(0.2%Triton−X+1.5%正常ヤギ血清を含むPBS)中でインキュベートし、その後に一次抗体(抗神経クラスIII β−チューブリン(TUJ1)(Covance Innovative Antibodies,Berkeley,CA)および二次抗体(Alexa Fluor 488ヤギ抗マウス)(Molecular Probes,Carlsbad,CA)とインキュベートした。各工程を、室温で1時間行った。各条件についての総神経突起伸長を、ArrayScan HCS Reader(Cellomics,Pittsburgh,PA)によるNeuronal Profiling Bioapplicationを使用して分析した。
培養物を、4%パラホルムアルデヒドにて37℃で30分間固定した。非特異的結合を、0.3% Triton X−100および5%ウシ胎児血清(FBS)を含むPBSとの45分間のインキュベーションによってブロッキングした。次いで、培養物を、抗神経フィラメント(200kD)モノクローナル抗体(1:1000,クローンRT−97,Chemicon,Temecula,CA)と4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ抱合二次抗体(1:1000,Vector Labs,Burlingame,CA)を、2時間適用した。3回の洗浄後、ペルオキシダーゼ基質K−BlueMax(Neogen,Lexington,KY;Youngら,1999)を培養物に添加し、オービタルシェーカーにて10分間インキュベートした。ペルオキシダーゼ基質は、K−BlueMax液中で高い溶解性を示す。次いで、光学密度を、Molecular Devices Spectramax Plus比色分析プレートリーダーを使用して、650nmで容易に測定する。
ヒトCD4+T細胞を、製造者の説明書どおりにRosetteSep(StemCell Technologies,Inc.Vancouver,British Columbia)を使用した末梢血リンパ球からの負の選択によって精製した。Blairら、J.Immunol.,160:12,1998に記載のように、Tosyl活性化磁性ミクロスフィア(Dynal,Great Neck,NY)を、抗CD3 Ab(1μg/107ミクロスフィア)および抗CD28Ab(0.5μg/107ミクロスフィア)でコーティングした。マウスIgGを使用して、ミクロスフィアの結合能力を飽和した(総タンパク質=5μg/107ミクロスフィア)。タンパク質コーティングミクロスフィアを、精製CD4+T細胞(2×106細胞/mL、比1ビーズ:1細胞)に添加し、RPMI、10%ウシ胎児血清、2mMグルタミン培地中にて72時間活性化した。Bennettら,J.Immunol.170:711,2003に記載のように、細胞を回収し、洗浄し、新鮮な培地中で一晩培養し、IL−2で再刺激した。簡潔にのべれば、一晩静置した細胞を再計数し、平底96ウェルマイクロタイタープレート中にプレートし(105細胞/ウェル)、漸増濃度の化合物の存在下にて1ng/mLヒトIL−2(R&D Systems,Minneapolis,MN)で刺激した。再刺激物の培養72時間後、プレートを1μCi/ウェルのトリチウム化チミジンをパルスし、6〜16時間インキュベートした。
上記のように、化合物のFKBP結合部分がインタクトなままでmTORとの相互作用を破壊するために、ラパマイシンアナログIおよびIIを、C1,C3ジエンでのニトロソベンゼンとの[4+2]付加環化反応を介してラパマイシンから調製した(図1A)。化合物IIは、1μMまでのIL−2刺激CD4+T細胞増殖の検出可能な阻害は認められなかった。これは、ラパマイシン(IC50=0.005μM)と対照的であった。さらに、神経フィラメントELISAによって測定したところ、化合物Iは、培養ラット皮質ニューロン(図1B)においてニューロンの生存を促進し、皮質ニューロン(図1C)およびF−11細胞(図1D)の両方において神経突起伸長を促進することが見出された。重要なことには、10および30mg/kgの化合物2は、虚血性卒中の一過性中心大脳(transient mid−cerebral)動脈閉塞モデルにおける梗塞体積をそれぞれ24%および23%有意に減少させた(米国特許出願公開第06/0135549号の実施例9を参照のこと)。これらの化合物の治療潜在性を考慮すると、これらの化合物の細胞標的を同定して、ニューロンの生存および神経突起伸長の促進におけるその役割を評価した。
化学合成およびアフィニティマトリックスの調製
標的タンパク質を同定するために、ラパマイシンアナログI、ラパマイシンアナログII、およびメリダマイシンアナログを含むアフィニティマトリックスを、Fretzら(前出)によって公開された方法にしたがって、アミノ−フェニル−酪酸を介したAffi−Gel10樹脂への化合物の結合(図2)によって調製した。簡潔にのべれば、ジアリルジカーボナート(1200μM)を含むジオキサン:水(3:1;50ml)での室温で3時間の処理によって、アミノ−フェニル−酪酸のアミノ基(1200mg)を、アリルオキシカルボニル基で保護した。得られた4−(パラ−N−Alloc−アミノフェニル)ブタニルエステル(80mg)の酸基を、PhOP(O)Cl2・DMF複合体を含むCH2Cl2(1ml)によって4℃で活性化し、ピリジン(90μM)の存在下にてラパマイシンアナログI(80mg)の42−ヒドロキシル基と室温で30分間反応させた。メタノールで反応を停止させ、エステル生成物を、HPLCによって純度99%に精製し、MSおよびNMRによって特徴づけた。Pd(PPh3)4(2mg)およびジメドン(dimedone)(7mg)を含むTHF(1.2ml)での処理によるエステル生成物(40mg)のアリルオキシカルボニル基の除去後、生成物のアミノ基を、2%ピリジンを含むTHFの存在下で、Affigel−10マトリックス(4ml)に結合した。得られたAffi−Gel−ラパマイシンアナログIアフィニティマトリックスを、エタノール、水、およびエタノールアミン・50mM Hepes(pH8.0)緩衝液で洗浄し、40%エタノール中に保存した。
標的タンパク質のアフィニティ沈殿
実施例2で調製したマトリックスを使用して、F−11(ラット脊髄後根神経節ニューロン(DRG)とマウス神経芽細胞腫とのハイブリッド)細胞(Platika,D.ら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci USA 82:3499−3503)の溶解物から標的タンパク質を沈殿させた。
F11細胞を、75cm2の通気フラスコ中の培養培地(10%FBSおよび1%pen/Strepを補足したDMEM)中にて、5%CO2を含む37℃インキュベーター中で成長させた。細胞を80%コンフルエンスで回収し、PBS緩衝液で洗浄した。溶解緩衝液(6ml;50mM Tris(pH7.4)、250mM NaCl、5mM EDTA、50mM NaF、1mM Na3VO4、1%Nonidet P40(NP40)、0.1%メルカプトエタノール、および2%プロテアーゼインヒビターカクテル)を109細胞に添加した。26ゲージニードルを強制的に通過させることによって細胞を破壊し、4℃で15分間の遠心分離後にS−100上清を回収した。アリコート(2ml)をアフィニティビーズ(100〜150μl;Affigel10、Affigel10−FK506、およびAffigel10−ラパマイシンアナログIなど)と4℃で一晩混合した。溶解緩衝液(2ml)およびその後のPBS(2ml)での洗浄後、ビーズを4〜20% SDS−PAGEゲルで分析した。図2は、以下のレーンを示す:F11細胞の溶解物、ブランク(タンパク質は、Affigel−10ビーズに結合する)、FK506(タンパク質は、Affigel−10−FK506ビーズに結合する)、ラパマイシンアナログII(タンパク質は、Affigel−10−ラパマイシンアナログIビーズに結合する)、マーカー(タンパク質標準)。タンパク質バンド(図3)を切り出し、トリプシン(0.3μg)を含む消化緩衝液(30μl;0.2% NH4HCO3)にて30℃で一晩消化した。得られたペプチドを、C18樹脂で精製し、FT−ICR−MS分析に供した。FT−ICR−MSデータを手作業で編集し、これを使用して、タンパク質データベースを検索した。結果を図4に示し、以下のスコアを有する。FK506結合タンパク質(FKBP52)(P30416,スコア:94,予測:9.6e−05);59kDaバンドのMSデータ:2753.35;1710.94;2215.13;2363.15;1298.71;1215.59;1000.51;1000.46;1790.93;1381.70;2746.36;1316.71;および1171.60。電位依存性L型カルシウムチャネルβ1サブユニット(Q8R3Z5−03−00−00,スコア:133,予測:1e−09);52kDaバンドのMSデータ:651.38;663.39;779.54;853.55;1014.50;1347.75;1217.78;1346.67;1297.75;1231.77;877.52;853.47;919.48;1014.56;1041.63;1217.74;1231.74;1296.84;869.58(主要)。
別の実験では、F11細胞を、75cm2の通気フラスコ中の培養培地(10%FBSおよび1%pen/Strepを補足したDMEM)中にて、5%CO2を含む37℃インキュベーター中で成長させた。細胞を80%コンフルエンスで回収し、PBS緩衝液で洗浄した。3×108細胞に、溶解緩衝液(2ml;50mM Tris(pH7.4)、250mM NaCl、5mM EDTA、50mM NaF、1mM Na3VO4、1%Nonidet P40、0.1%メルカプトエタノール、および2%プロテアーゼインヒビターカクテル)を添加し、4℃で15分間の遠心分離後にそのS−100上清を回収した。アリコート(2ml)をアフィニティビーズ(100〜150μl)と4℃でインキュベートした。溶解緩衝液(2ml)およびその後のPBS緩衝液(2ml)での洗浄後、ビーズをSDS−PAGEによって分析した。タンパク質バンドを切り出し、トリプシン(0.3μg)を含む消化緩衝液(30μl;0.2% NH4HCO3)にて30℃で消化した。得られたペプチド(2μl)を、FT−ICR−MSのナノエレクトロスプレーのチップにロードし、1%ギ酸を含むメタノール(2μl)と混合した。約−800Vの高電位を、ナノエレクトロスプレーのチップとガラス製毛細管との間に印加した。得られた質量スペクトルデータを、HPチューニングミックスを使用して外部較正し、NCBIタンパク質データベースにおけるMascot検索のために使用した。妥当なタンパク質候補を、信頼スコア(p値)に基づいて選択した。ウェスタン分析のために、沈殿したタンパク質を、SDS−PAGEによって分離し、エレクトロブロッティング(100V、1時間)によってPVDF膜に移し、抗CACNB1抗体または抗FKBP4抗体で免疫ブロッティングし、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)染色によって視覚化した。
図5Aに示すように、3つの強いバンド(220kDa、60kDa、および50kDa)および2つの非常に弱いバンド(25kDaおよび12kDa)が、ラパマイシンアナログIおよびII両方のプルダウン画分中に見出された。各バンドのFT−ICR−MSスペクトルを、NCBIデータベースでのMascot検索のために使用した(以下の表1を参照のこと)。FKBP52(Gold,B.G.Drug Metab.Rev.31,649−663(1999))および電位開口型L型カルシウムチャネル(VGCC)のβ1サブユニット(CACNB1)(Opatowsky,Y.ら、Neuron 42,387−399(2004)。電位依存性カルシウムチャネルβサブユニットの機能的コアおよびα1相互作用ドメインとのその複合体の構造分析をラパマイシンアナログIおよびIIの主な標的として同定し、その存在を、ウェスタン分析(図5B)によって確認した。FKBP25およびFKBP12が弱いバンド中で同定されたのに対して、ミオシンおよびアクチンが全ての画分で見出された。これは、樹脂への非特異的結合を示す。
ウェスタン分析および動態解析による沈殿標識の特徴づけ
方法
組換え遺伝子のクローニングおよび発現ならびに結合アッセイ
Invitrogen(Carlsbad,CA)が開発したGatewayクローニング法を使用して、cacnb1/CACNB1遺伝子、cacnb4/CACNB4遺伝子、fkbp3/FKBP25遺伝子、fkbp4/FKBP52遺伝子、ppid遺伝子、ppif遺伝子、およびfkbp8/FKBP38遺伝子を、pDEST17(N−His6タグ)ベクターにクローン化した。QuikChange部位特異的変異誘発キット(Stratagene,LaJolla,CA)を使用して、His6−CACNB1:TGG548TAAをpDEST17−CACNB1から生成した。His6タグ化タンパク質を、Ni−NTAカラム(Qiagen,Valencia,CA)で精製した。SDS−PAGE分析によってタンパク質は95%を超える純度を示し、これをそのまま使用した。2mM Ca2+および5μM CaMの存在下でFKBP38を試験した(Edlich,F.ら、J.Biol.Chem.281,14961−14970(2006)。ラパマイシンアナログIIへの結合を、ブランクAffi−Gel 10ビーズと比較したラパマイシンアナログIIマトリックス上に保持したタンパク質量に基づいて、SDS−PAGEによって測定した。37℃での各精製タンパク質(10μM)の[14C]−ラパマイシンアナログI(10μM、241Ci/mol)との反応後、ラパマイシンアナログIの結合を、TopTip P−4カラムによってタンパク質と同時溶離した14C放射能の定量によって測定した。ラパマイシンアナログIによって誘導されたタンパク質蛍光消光を、ラパマイシンアナログI(1μM)でのHis6−CACNB1:TGG548TAAタンパク質(0〜8μM)の滴定によって測定した。
His6タグ化されたFKBP12タンパク質およびFKBP52タンパク質へのイムノフィリンリガンドの結合を、50mM Hepes(pH7.4)、0.1% Tween−20、(0〜10μM)イムノフィリンリガンド、3nM[3H]−FK506(87Ci/mmol)、および(5nM)酵素を含む0.1ml反応混合物中のNiキレート化FLASHプレート上に保持された3H FK506の定量によって測定した。反応を、三連で25℃にて30分間行った。Kdを、Carreras(Anal.Biochem.298、57−61(2001))に記載の方法を使用して計算した。
表2は、FK506およびラパマイシンの両方が類似の親和性(それぞれ、Kd(FKBP12)/Kd(FKBP52)=0.46および0.23)でFKBP12およびFKBP52に結合することを示す。対照的に、化合物2は、FKBP12と比較してFKBP52結合に顕著な優先性を示した(Kd(FKBP12)/Kd(FKBP52)=229)。化合物2はラパマイシンと同一のFKBP結合のためのピペコリン酸部分を有し、修飾部位が離れているので、これは予想外である。X線構造は、FKBP52およびFKBP12のイソメラーゼドメインが非常に類似しており(Wuら,Proc Natl Acad Sci U S A.101,8348−53(2004)、その活性部位残基の配列アラインメントがたった1つのアミノ酸の相違しか示さなかった(FKBP12中のHis87対FKBP52中のSer118)(Dornanら,Curr.Top.Med.Chem.3,1392−1409(2003))ことを示した。ラパマイシンおよびそのアナログは、アミド結合についての回転のために主要なおよび微量の溶液配座異性体(solution conformer)の組として存在することが公知である(Kesslerら,Helv.Chim.Acta 76,117−130(1993))。さらなるNO−フェニル部分は、マクロラクトン配座異性体の大域的集団全体に影響を及ぼし、それにより、イムノフィリン選択性に影響を及ぼす。この所見は、化合物2に対する結合親和性の劇的相違と一致するようであり、それに対して(towards)、異なるが依然として相同なイムノフィリンがFKBP25について報告されたラパマイシンとFK506との間の結合親和性の劇的相違と一致するようである(Galatら,Biochemistry 31,2427−2434(1992))。これは、特定のFKBPへの結合を増強するラパマイシンに対する非足場修飾を示す。
新規の複合体であるFKBP52−ラパマイシンアナログ1−Ca2+チャネルβ1サブユニットの形成
共免疫沈降を使用して、FKBP52、ラパマイシンアナログI、および電位開口型カルシウムチャネルβ1サブユニットの間の複合体形成を調査した。簡潔にのべれば、F11細胞溶解物のアリコート(1.8ml)を、0、5、および50μMのラパマイシンアナログIとそれぞれ4℃で5時間混合した。抗FKBP52抗体を、200倍希釈で各アリコートに添加し、4℃で5時間インキュベートした。次いで、プロテインAビーズ(50〜100μM)を添加して、抗FKBP52抗体会合複合体を沈殿させた。ビーズ上に免疫沈降したタンパク質をPBS緩衝液で洗浄し、4〜20% SDS−PAGEゲルで分離し、PVDFに移し、抗Ca2+チャネルβ1サブユニット抗体(500倍希釈)で免疫ブロットしてβ1サブユニットを検出した。
結果を図7に示す。Ca2+チャネルβ1サブユニットは、ラパマイシンアナログIの非存在下でFKBP52と共に沈降しなかった。これは、Ca2+チャネルβ1サブユニットがFKBP52と会合しないことを示す。ラパマイシンアナログI(5μM)の存在下で、大量のCa2+チャネルβ1サブユニットはFKBP52と共免疫沈降し、複合体形成を示す。しかし、過剰量のラパマイシンアナログI(50μM)はβ1サブユニットの沈降量を減少させ、より少量の複合体形成を示す。これは、限られた量の溶解物中のFKBP52およびβ1サブユニットの両方の化合物結合部位の飽和に起因し得る。
複合体形成は神経突起伸長と相関する
神経フィラメントELISAを使用して、ラパマイシンアナログIの非存在下または存在下で成長したF11細胞の神経突起伸長を測定した。簡潔にのべれば、F11細胞を、10% FBS、1% pen/Strep、およびラパマイシンアナログI(0、5、または50μM)を補足したDMEM中で96時間成長させた。細胞を、4%パラホルムアルデヒドにて37℃で30分間固定した。非特異的結合を、0.3% Triton X−100および5%ウシ胎児血清(FBS)を含むPBSとの45分間のインキュベーションによってブロッキングした。次いで、培養物を、抗神経フィラメント(200kD)モノクローナル抗体(1000倍)と4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ抱合抗マウス二次抗体(1000倍)を2時間適用した。3回の洗浄後、ペルオキシダーゼ基質K−BlueMaxを培養物に添加し、10分間インキュベートした。650nmの光学密度を測定した。
結果を図8に示す。5μMラパマイシンアナログIで処置した細胞は、50μMラパマイシンアナログIまたは無化合物コントロールで処置した細胞より神経フィラメント含有量が4〜5倍であり、5μMラパマイシンアナログIでの強い神経突起伸長を示す。これは、同一濃度のラパマイシンアナログIの存在下での複合体形成と直接相関した。
ラパマイシンアナログでの処置後のF−11細胞中のカルシウムチャネルの電気生理学的性質の評価
方法。ホールセルのパッチクランプ記録
パッチクランプ技術のホールセル記録を使用し、HEKA(Lambrecht,Germany)の取得および分析プログラムPulse−PulseFitを備えたEPC−9増幅器(HEKA,Instrutech Corp.)を使用して、室温で細胞からカルシウム電流を記録した。電極を、P−87プラー(Sutter Instrument)を使用して組み立てた。電極は、記録液(140mM CsCl、10mM EGTA、10mM HEPES、5mM MgCl2、2M ATP、1mM cAMP、pH7.2)を充填した場合に、2〜5MΩの抵抗を示した。標準的なバス記録液は、10mM HEPES、10mMデキストロース、および4mM BaCl2を含む無Ca2+およびMg2+ HBSS(pH 7.4)である。電流を3kHzでフィルタリングし、内向きCa2+電流を、−80mV〜60mVで50msの10mV脱分極工程を使用して、−90mVに保持した細胞から記録した。
CACNB1は、一次ニューロン中のL型Ca2+チャネルに会合するβサブユニットの1つである(Pichlerら,J.Biol.Chem.272,13877−13882(1997))。β1b、β3、およびβ4サブユニットはL型Ca2+チャネル流を増強することが公知であるのに対して、β2サブユニットは負の役割を果たす(Opatowskyら,Neuron 42,387−399(2004);Schjottら,J.Biol.Chem.278,33936−33942(2003))。本発明者らのラパログのβ1bサブユニットへの結合がこのサブユニットの機能を阻害する場合、L型Ca2+流が減少すると予想される。したがって、ラパマイシンアナログ1での処置後のF−11細胞中のCa2+チャネルの電気生理学的性質を測定した。
ラパマイシンアナログでの処置後の転写プロファイリング
方法
転写プロファイリング
皮質ニューロン培養物を、E16ラット胚から調製した。プレーティング24時間後、培養物を、10μMイムノフィリンリガンドおよび対応するビヒクルで処置した。処置4時間後、12時間後、24時間後、および48時間後、細胞を溶解した。各サンプル由来の総RNAを、RNEASY(登録商標)ミニキット(QIAGEN(登録商標))で抽出した。二本鎖cDNAを、SUPERSCRIPT(登録商標)システム(INVITROGEN(登録商標))を使用して2μgの各RNAサンプルから合成し、精製し、in vitroで転写して、ビオチン標識UTPおよびCTPの存在下でT7 RNAポリメラーゼを使用してビオチン化cRNAを調製した。製造者が推奨するように、断片化cRNAを、ラットゲノム230 2.0 GENECHIP(登録商標)(AFFYMETRIX(登録商標)、Santa Clara、CA)とハイブリッド形成した。ハイブリッド形成したアレイを、製造者のプロトコールにしたがってFluidics Station 450で染色し、その後にAFFYMETRIX(登録商標)スキャナ3000でスキャンした。AFFYMETRIX(登録商標)MAS 5.0ソフトウェアを使用して、生データを作成した。転写プロファイリングデータを、Ingenuityで分析した。
ラパマイシンアナログ結合の下流の結果をさらに分析するために、10μMのラパマイシンアナログIまたはIIで処置したラット皮質ニューロン培養物の転写プロファイリングデータを得た。
電位開口型L型カルシウムチャネルのβ1サブユニットの減少が神経突起伸長を刺激する。
ニューロン培養物
簡潔にのべれば、皮質ニューロン培養物を、胎生期15日目(E15)のラット胚(Sprague−Dawley,Charles River Laboratories,Wilmington,MA)から調製した。胚を回収し、その脳を取り出し、皮質を、Ca2+およびMg2+を含まない氷冷リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中で解剖した。解剖した皮質組織片を共にプールし、20IU/mlパパインを含むEarle平衡塩類溶液(Worthington Biochemical,Freehold,NJ)を含む酵素解離培地に移し、37℃で30分間インキュベートした。酵素解離後、パパイン溶液を吸引し、先端熱加工したパスツールピペットを使用して、2,000IU/ml DNアーゼおよび10−mg/mlオボムコイドプロテアーゼインヒビターを含む完全培地(B−27サプリメント(Gibco,Grand Island,NY)、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、3.3μg/mlアフィディコリン、0.5mMグルタミン酸塩を含むNeurobasal培地)で組織を機械的に砕いた(triturate)。
各条件について、5×105個の皮質ニューロンを、96ウェルシャトル(amaxa biosystems,Gaithersburg,MD)上にてプログラムDC−104を使用して、200ngのsiGLOラミンA/C siRNA(Dharmacon RNA Technologies,Boulder,CO)、L型カルシウムチャネルβ1サブユニットsiRNA(GGAGAAGUACAAUAAUGACTT(配列番号15)(センス)、およびGUCAUUAUUGUACUUCUCCTT(配列番号16)(アンチセンス))、またはFKBP4 siRNA(CCUAGCUAUGCUUUUGGCATT(配列番号17)(センス)およびUGCCAAAGCAUAGCUAGGTT(配列番号18)(アンチセンス)(Ambion,Inc.,Austin,TX)でトランスフェクトした。各トランスフェクション反応由来の25μlを、ポリ−D−リジンコーティング96ウェル(実験あたり4ウェル)に添加した。トランスフェクトした皮質ニューロンを、培養物中で24時間維持した。
スクランブルしたsiRNA、ラミンA/C、CACNB1、またはFKBP52 siRNAで処置した皮質ニューロンを、プロテアーゼインヒビターカクテルおよびホスファターゼインヒビターを含むRIPA緩衝液中で溶解し、タンパク質濃度を、Bradfordアッセイ(Bio−Rad Laboratories,Hercules,CA)を使用して測定した。条件あたり2μgのタンパク質を各ウェルにロードし、SDS−PAGEで分離した。タンパク質をニトロセルロースに移し、ラミンA/C(Upstate)、CACNB1(abcam,Cambridge,MA)、またはFKBP52(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)に対する抗体およびローディングコントロールとしてのアクチン(Sigma)とインキュベートした。バンドを発色させ、Odyssey赤外線画像化システムおよびOdysseyソフトウェア(Li−Cor Biosciences,Lincoln,NE)を使用して定量した。タンパク質発現ノックダウンを、スクランブルしたsiRNA発現の比率としてのアクチンに対する比として計算した。
ラパマイシンアナログIまたはIIによるFKBP52およびCACNB1の両方の阻害が神経突起伸長およびニューロンの生存に寄与することをさらに証明するために、本発明者らは、ラット皮質ニューロンを、ラミンA/C(コントロールとしての機能を果たすため)、FKBP52、CACNB1、またはFKBP52+CACNB1に対するsiRNAでトランスフェクトし、24時間後に総神経突起伸長を測定した。コントロールと比較した総神経突起伸長は、CACNB1 siRNA処置ニューロンで本質的に不変であったが、FKBP52 siRNA−(コントロールの125±12%)およびFKBP52+CACNB1 siRNA処置(コントロールの126±14%)ニューロンで有意に増加し(図10A)、FKBP52の阻害が神経突起伸長を刺激することを示した。並行して、本発明者らは、ELISAアッセイによってニューロンの生存に及ぼすsiRNAの影響を評価して、神経フィラメント発現を定量した。コントロールと比較したニューロンの生存の比率は、CACNB1 siRNA処置細胞で減少し(コントロールの80±3%)、FKBP52 siRNA処置細胞で中等度に増加し(コントロールの112±2%)、FKBP52+CACNB1 siRNA処置細胞で有意に増加した(コントロールの152±2%)(図10B)。これは、FKBP52およびCACNB1の両方の減少がニューロンの生存を促進することを示す。ウェスタンブロットを行い、siRNA処置が24時間後に皮質ニューロン中のラミンA/C、CACNB1、またはFKBP52のタンパク質発現を減少させることを検証した。代表的なブロットを図10Cに示す。ラミンA/C発現は79.21±13.68%に減少し、CACNB1発現は70.79±20.79%に減少し、FKBP52発現は86.83±7.03%に減少した(n=3)。
当業者は、日常的実験のみを使用して、本明細書中に記載の特定の実施形態の多数の等価物を認識するか確認することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
Claims (59)
- イムノフィリンリガンドと、(i)イムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび/または(ii)カルシウムチャネルサブユニットもしくはその機能的フラグメントの一方あるいは両方とを含む精製複合体。
- 前記イムノフィリンリガンドが、ラパマイシン骨格の1位および4位にヘテロ原子置換基を有するラパマイシンアナログである、請求項1に記載の精製複合体。
- 前記イムノフィリンリガンドが、式I:
R1およびR2は異なる独立した基であり、OR3およびN(R3’)(R3’’)からなる群より選択されるか、
R1およびR2は異なり、単結合を介して連結し、OおよびNR3からなる群より選択され、
R3、R3’、およびR3’’は、H、C1〜C6アルキル、C1〜C6置換アルキル、C3〜C8シクロアルキル、置換C3〜C8シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、
R4およびR4’は、
(a)H、OH、O(C1〜C6アルキル)、O(置換C1〜C6アルキル)、O(アシル)、O(アリール)、O(置換アリール)、およびハロゲンからなる群より独立して選択されるか、または、
(b)共にOと二重結合を形成し、
R5、R6、およびR7は、H、OH、およびOCH3からなる群より独立して選択され、
R8およびR9は、(i)単結合を介して連結し、且つCH2であるか、(ii)二重結合を介して連結し、且つCHであり、
R15は、C=O、CHOH、およびCH2からなる群より選択され、nは1または2である)を有するラパマイシンアナログまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項1に記載の精製複合体。 - 前記ラパマイシンアナログのR1がOであり、R2がNR3である、請求項3に記載の精製複合体。
- 前記ラパマイシンアナログのR1がOR3であり、R2がN(R3’)(NR3’’)である、請求項3に記載の精製複合体。
- 前記ラパマイシンアナログのR3、R3’、またはR3’’が、アリールまたは置換アリールである、請求項3に記載の精製複合体。
- 前記ラパマイシンアナログのアリールまたは置換アリールが、構造:
R10、R11、R12、R13、およびR14は、H、C1〜C6アルキル、置換C1〜C6アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ハロゲン、アシル、OH、O(アルキル)、O(置換アルキル)、O(アリール)、O(置換アリール)、O(アシル)、NH2、NH(アルキル)、NH(置換アルキル)、NH(アリール)、NH(置換アリール)、およびNH(アシル)からなる群より独立して選択される)である、請求項6に記載の精製複合体。 - 前記イムノフィリンリガンドが、
- 前記イムノフィリンが、図12A〜12Dに示すアミノ酸配列(配列番号11〜14)と少なくとも95%同一であるか、または同一である配列を有するFKBP52またはその機能的フラグメントである、請求項1に記載の精製複合体。
- 前記カルシウムチャネルサブユニットが、図11A〜11Jに示すアミノ酸配列(配列番号1〜10)と少なくとも95%同一であるか、または同一である配列を有する電位開口型L型カルシウムチャネルのβ1サブユニットまたはその機能的フラグメントである、請求項1に記載の精製複合体。
- 図12A〜12Dに示すアミノ酸配列(配列番号11〜14)を有するFKBP52をコードするヌクレオチド配列を含む第1の組換え核酸および/または図11A〜11Jに示すアミノ酸配列(配列番号1〜10)を有する電位開口型L型カルシウムチャネルのβ1サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む第2の組換え核酸を含む組換え宿主細胞。
- 請求項1に記載の精製複合体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 試験化合物と(i)イムノフィリンおよび/または(ii)電位開口型L型カルシウムチャネルのβ1サブユニットの一方または両方とを含む複合体の形成を増加させる試験化合物の同定方法であって、
該複合体の形成が可能な条件下でイムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび/またはβ1サブユニットまたはその機能的フラグメントを試験化合物と接触させる工程、
該試験化合物の存在下で基準と比較して該複合体の存在を検出する工程
を含み、
該基準中の該複合体のレベルと比較した、該試験化合物の存在下での該複合体のレベルの増加が、該試験化合物が複合体形成を増加させることを示す、方法。 - 前記サンプルが細胞溶解物、再構成された系であり、培養物または動物対象中の細胞を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記複合体形成の増加を、該複合体の物理的形成の増加、シグナル伝達の変化、カルシウムチャネル活性の減少、またはニューロン活性の変化の1つ以上の検出によって決定する、請求項13に記載の方法。
- 前記ニューロン活性の変化を、生存、分化、または神経突起伸長の1つ以上の増加として検出する、請求項15に記載の方法。
- 前記試験化合物が天然に存在するかまたは改変したS.hygroscopicusから得たポリケチドである、請求項13に記載の方法。
- 請求項13に記載の方法によって同定された化合物。
- イムノフィリンリガンドと、(i)イムノフィリンまたはその機能的バリアントおよび/または(ii)カルシウムチャネルサブユニットまたはその機能的バリアントの一方または両方とを含む複合体の形成を増加させる方法であって、該複合体の形成を増加させる条件下で、イムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび/または電位開口型L型カルシウムチャネルのβ1サブユニットまたはその機能的フラグメントをイムノフィリンリガンドと接触させる工程を含む、方法。
- 前記接触工程が細胞溶解物、再構成した系、または培養物もしくは動物対象中の細胞において起こる、請求項19に記載の方法。
- 細胞中の電位開口型カルシウムチャネル活性および/またはFKBP52活性を減少させる方法であって、イムノフィリンリガンドとFKBP52またはそのフラグメントおよび/またはそのサブユニットまたはそのフラグメントの一方または両方との間で結合を可能にする条件下で、FKBP52またはその機能的フラグメントおよび/または電位開口型L型カルシウムチャネルのβ1サブユニットまたはその機能的フラグメントの一方または両方を発現する細胞をイムノフィリンリガンドと接触させ、それにより、該カルシウムチャネル活性を阻害する工程を含む、方法。
- 前記接触工程が、前記イムノフィリンリガンドを培養物中の哺乳動物の神経細胞または心血管細胞に添加する工程を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記接触工程が、前記イムノフィリンリガンドと前記FKBP52またはそのフラグメントおよび/またはそのサブユニットまたはそのフラグメントの一方または両方との間に複合体を形成するのに十分な量で該イムノフィリンリガンドを対象に投与することを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記対象に投与された前記イムノフィリンの量を、in vitroで複合体形成を誘導するのに必要なイムノフィリンリガンドの量を試験することによって決定する、請求項23に記載の方法。
- L型カルシウムチャネル機能障害に関与する障害に関連する1つ以上の症状を有するリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定する工程をさらに含む、請求項23に記載の方法。
- 前記対象が、神経変性障害または心血管障害を罹患した哺乳動物である、請求項23に記載の方法。
- 前記イムノフィリンリガンドを、L型カルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせて投与する、請求項23に記載の方法。
- 前記イムノフィリンリガンドが、ラパマイシン骨格の1位および4位にヘテロ原子置換基を有するラパマイシンアナログである、請求項23に記載の方法。
- 前記ラパマイシンアナログが、式I:
R1およびR2は異なる独立した基であり、OR3およびN(R3’)(R3’’)からなる群より選択されるか、
R1およびR2は異なり、単結合を介して連結し、OおよびNR3からなる群より選択され、
R3、R3’、およびR3’’は、H、C1〜C6アルキル、C1〜C6置換アルキル、C3〜C8シクロアルキル、置換C3〜C8シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、
R4およびR4’は、
(a)H、OH、O(C1〜C6アルキル)、O(置換C1〜C6アルキル)、O(アシル)、O(アリール)、O(置換アリール)、およびハロゲンからなる群より独立して選択されるか、
(b)共にOと二重結合を形成し、
R5、R6、およびR7は、H、OH、およびOCH3からなる群より独立して選択され、
R8およびR9は、(i)単結合を介して連結し、且つCH2であるか、(ii)二重結合を介して連結し、且つCHであり、
R15は、C=O、CHOH、およびCH2からなる群より選択され、nは1または2である)またはその薬学的に許容可能な塩を有する、請求項28に記載の方法。 - 前記ラパマイシンアナログが、
- 前記FKBP52またはその機能的フラグメントが、図12A〜12Dに示すアミノ酸配列(配列番号11〜12)と少なくとも95%同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を含む、請求項21に記載の方法。
- 前記電位開口型L型カルシウムチャネルのβ1サブユニットまたはその機能的フラグメントが、図11A〜11Jに示すアミノ酸配列(配列番号1〜10)と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項21に記載の方法。
- 神経突起伸長および/または神経細胞の生存を刺激する方法であって、該神経細胞をイムノフィリンリガンドと接触させる工程を含み、該イムノフィリンリガンドが、1つ以上の以下:(i)カルシウムシグナル伝達経路の少なくとも1つの成分の発現または活性の下方制御、(ii)FKBP52活性または発現の減少、(iii)L型カルシウムチャネルの活性または発現の減少または阻害、(iv)糖質コルチコイド受容体シグナル伝達の活性化、(v)イムノフィリンリガンド、FKBP52および/またはβ1サブユニットを含む複合体の形成の誘導、および/または(vi)カルシウム誘導性細胞死からのニューロンの保護、を誘発する濃度で存在する、方法。
- 前記接触工程が、前記イムノフィリンリガンド、およびFKBP52および/またはβ1サブユニットの一方または両方を含む複合体を形成するのに十分な量での前記イムノフィリンリガンドの対象への投与を含む、請求項33に記載の方法。
- 前記対象に投与された前記イムノフィリンの量を、in vitroで複合体形成を誘導するのに必要なイムノフィリンリガンドの量を試験することによって決定する、請求項34に記載の方法。
- L型カルシウムチャネル機能障害に関与する障害に関連する1つ以上の症状を有するリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定する工程をさらに含む、請求項33に記載の方法。
- L型カルシウムチャネル機能障害に関連する障害を治療する方法であって、イムノフィリンリガンドと、イムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび/またはカルシウムチャネルサブユニットもしくはその機能的フラグメントの一方または両方とを含む複合体を形成するのに十分な量で該イムノフィリンリガンドを対象に投与し、それにより、該障害を治療する工程を含む、方法。
- 前記対象に投与された前記イムノフィリンの量を、in vitroで複合体形成を誘導するのに必要なイムノフィリンリガンドの量を試験することによって決定する、請求項37に記載の方法。
- L型カルシウムチャネル機能障害に関与する障害に関連する1つ以上の症状を有するリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定する工程をさらに含む、請求項37に記載の方法。
- 前記対象が、神経変性障害または心血管障害を罹患した哺乳動物である、請求項37に記載の方法。
- 前記対象が、卒中、パーキンソン病、癲癇、アンギナ、心不整脈および虚血からなる群より選択される障害を罹患した哺乳動物である、請求項40に記載の方法。
- 前記対象が、片頭痛、神経因性疼痛、急性疼痛、気分障害、統合失調症、鬱病、不安、小脳性運動失調症、遅発性ジスキネジー、高血圧症、および尿失禁からなる群より選択される障害を罹患した哺乳動物である、請求項40に記載の方法。
- 前記イムノフィリンリガンドを、L型カルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせて投与する、請求項37に記載の方法。
- 前記イムノフィリンリガンドが、式I:
R1およびR2は異なる独立した基であり、OR3およびN(R3’)(R3’’)からなる群より選択されるか、
R1およびR2は異なり、単結合を介して連結し、OおよびNR3からなる群より選択され、
R3、R3’、およびR3’’は、H、C1〜C6アルキル、C1〜C6置換アルキル、C3〜C8シクロアルキル、置換C3〜C8シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、
R4およびR4’は、
(a)H、OH、O(C1〜C6アルキル)、O(置換C1〜C6アルキル)、O(アシル)、O(アリール)、O(置換アリール)、およびハロゲンからなる群より独立して選択されるか、
(b)共にOと二重結合を形成し、
R5、R6、およびR7は、H、OH、およびOCH3からなる群より独立して選択され、
R8およびR9は、(i)単結合を介して連結し、且つCH2であるか、(ii)二重結合を介して連結し、且つCHであり、
R15は、C=O、CHOH、およびCH2からなる群より選択され、nは1または2である)を有するラパマイシンアナログまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項33または請求項37のいずれかに記載の方法。 - 前記ラパマイシンアナログが、
- 前記イムノフィリンが、図12A〜12Dに示すアミノ酸配列(配列番号11〜14)と少なくとも95%同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を有するFKBP52またはその機能的フラグメントである、請求項44に記載の方法。
- 前記カルシウムチャネルサブユニットが、図11A〜11Jに示すアミノ酸配列(配列番号1〜10)と少なくとも95%同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を有する電位開口型L型カルシウムチャネルのβ1サブユニットまたはその機能的フラグメントである、請求項44に記載の方法。
- 神経細胞の神経突起伸長を刺激する方法であって、該神経細胞を、電位開口型L型カルシウムチャネルのβ1サブユニットのアンタゴニストおよび/またはFKBP52のアンタゴニストの一方または両方と、該β1サブユニットまたはFKBP52の活性または発現を減少させる条件下で接触させる工程を含む、方法。
- 前記神経細胞が、ドーパミン作動性細胞、コリン作動性細胞、皮質細胞、および脊髄細胞からなる群より選択される、請求項48に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが、β1サブユニットおよび/またはFKBP52と複合体を形成するイムノフィリンリガンドである、請求項48に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが、カルシウムチャネルβサブユニットまたはFKBP52の転写のインヒビターである、請求項48に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが抗体である、請求項48に記載の方法。
- L型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療のための薬物の製造におけるイムノフィリンリガンドの使用。
- 前記イムノフィリンリガンドが、ラパマイシン骨格の1位および4位にヘテロ原子置換基を有するラパマイシンアナログである、請求項53に記載の使用。
- L型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療のためのL型カルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせたイムノフィリンリガンドの使用。
- L型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療のための薬物の製造における請求項13〜請求項17のいずれか1項に記載のように同定した化合物の使用。
- L型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療で用いるイムノフィリンリガンド。
- L型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療で用いるイムノフィリンリガンドおよびL型カルシウムチャネルアンタゴニストを含む組成物。
- L型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療で用いる請求項13〜請求項17のいずれか1項に記載のように同定した化合物。
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