JP2010514728A - 環状ペプチドの合成方法 - Google Patents

Abstract

環状ペプチドおよび新規なジペプチド化合物の合成方法が提供される。これらの方法は、ジペプチドの固相合成を含み、そのジペプチドは、固相反応において第２のペプチドにカップリングされる。次いで、このペプチドはカップリング反応の後に環化される。本方法およびジペプチドは、ＭＣ−４レセプターアゴニストペプチドの合成に特に有用である。

Description

本発明は、環状ペプチドの合成に関する。

多数のペプチド合成方法が、文献に記載されている（例えば、米国特許第６，０１５，８８１号；Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4005-4008；Mergler et al. (1988) Tetrahedron Letters 29:4009-4012；Kamber et al. (eds), Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden (1992) 525-526；Riniker et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:9307-9320；Lloyd-Williams et al. (1993) Tetrahedron Letters 49:11065-11133；Andersson et al. (2000) Biopolymers 55:227-250；およびBray, B.L. (2003) Nature Reviews 2:587-593を参照されたい）。様々な合成方法は、その合成が起こる相の、すなわち液相または固相の物理的状態により区別される。

一部の例では、合成工程は、環状ペプチドを提供する反応を含む。ペプチドの構造を強固にしてそのインビボ安定性を改善するために、ペプチドを環化することができる（Camarero and Muir, (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:5597 5598を参照されたい）。環状ペプチドの方が、生体の酵素に分解されにくいことがあり、また、体内のレセプターに対してさらに高い親和性を有することもある。

環状ペプチドを調製するための様々な合成工程は、従来技術に記載されている。一部の例では、これらは、線状ポリペプチドの環化を含む。例えば、主鎖環化版のウシ膵臓トリプシンインヒビターを調製するために、化学的架橋アプローチが使用された（Goldenburg and Creighton (1983) J. Mol. Biol., 165:407 413）。他のアプローチには、線状合成ペプチドを水性条件で効率的に環化させる化学的（Camarero, et al., (1998) Angew. Chem. Int. Ed., 37:347 349；Tam and Lu (1998) Prot. Sci., 7:1583 1592；Camarero and Muir (1997) Chem. Commun., 1997:1369 1370；およびZhang and Tam (1997) J. Am. Chem. Soc. 119:2363 2370）および酵素的（Jackson et al., (1995) J. Am. Chem. Soc., 117:819 820）分子内連結法が挙げられる。

非リコンビナント環状ペプチドの合成は、典型的には、固相または液相の化学合成工程を含む。これらの合成工程では、アミノ酸またはペプチドが反応性側鎖および反応性末端を有することから、一般に保護基を有するアミノ酸またはペプチドが使用される。反応物の側鎖または誤った末端での望まれない反応は、望ましくない副生成物をときに著しい量で生成するおそれがある。これらの副生成物および反応は、実用の見地から収率をひどく減少させるおそれがあるし、合成途中の生成物を損ないさえする。副反応を最小限にするために、反応物の反応性側鎖および（α−アミノ）末端を適切にマスクして所望の反応の発生を確実にすることを助けることが、従来の常法である。

α−アミノ基の保護のためにＦｍｏｃ化学反応を使用することが、大部分の最新の固相および液相ペプチド合成工程のために好ましい方法となった。Ｆｍｏｃ化学反応はまた、Ｂｏｃ化学反応よりも信頼でき、高品質のペプチドを生成することが示された。Ｆｍｏｃ合成では、反応性アミノ末端を提供するためのＦｍｏｃ保護基の除去は、典型的にはピペリジンなどの弱塩基の存在下で行われる。塩基処理の後に、新生ペプチドを典型的には洗浄し、次いで、次のアミノ酸をカップリングするために、活性化アミノ酸およびカップリング共試薬 （co-reagent）を含む混合物を、新生ペプチドと接触させる。カップリング後に、カップリングされていない試薬を洗浄除去することができ、次いで新生ペプチドのＮ−末端上の保護基を除去することができ、追加のアミノ酸またはペプチド物質を同様に新生ペプチドに付加させる。

Ｆｍｏｃ化学反応では、樹脂に結合したペプチド物質および成長中の鎖に付加すべき追加の物質を含む、アミノ酸およびペプチド反応物の反応性側鎖基は、典型的には合成の間ずっと側鎖保護基でマスクしたままにする。一般に、側鎖保護基は、合成の間のα−アミノ保護基の脱保護（すなわちピペリジン処理）の間に除去されない側鎖保護基が使用される。Ｆｍｏｃ化学反応で一般に使用される側鎖保護基は、酸加水分解（例えばＴＦＡを使用したもの）により除去することができ、それらには、Ａｃｍ、Ｂｏｃ、Ｍｔｒ、ＯｔＢｕ、Ｐｂｆ、Ｐｍｃ、ｔＢｕ、およびＴｒｔが挙げられる。Ｆｍｏｃ化学反応では、これらの保護基は、側鎖の化学構造により許されるようなある種のアミノ酸上に利用することができる。

Ｆｍｏｃなどの固相化学反応が現在広く使用されているが、これらの化学反応の使用が問題となりうる状況がある。例えば、一部の例では、Ｆｍｏｃの除去後にペプチド中間体が望まれない副反応を受けて袋小路の生成物（dead-end product）に至るおそれがある。他の例では、合成工程の工程で、低く、許容されない再現性が示されるおそれがある。

選択されたアミノ酸側鎖の間のカップリングを促進するために、典型的には困難なカップリング反応を必要とする環状ペプチドの合成工程では、これらの問題は悪化するおそれがある。

本発明は、これらの問題に取り組み、環状ペプチドの合成の分野に進歩と改善を提供する。

本発明は、環状ペプチドの新規な生産方法を提供する。本発明はまた、アスパラギン酸残基および非天然アミノ酸を含む新規なペプチド化合物を提供する。これらのペプチド化合物は、環状メラノコルチン−４レセプターアゴニストペプチドなどの環状ペプチドの合成のための中間体として使用することができる。

一局面では、本発明は、環状ペプチドを調製するための、特に有効で効率的な方法を提供する。この方法は、袋小路の中間体ペプチドの形成などの、環状ペプチドの合成における困難を克服するための手段を提供する。この方法は、好都合には、環状ペプチドの合成に典型的に使用される試薬の量の削減またはある種の処理法の排除などの、環状ペプチドの生産に関連する加工上の利益を提供する。全般的に、本発明の方法は、環状ペプチドのさらに高い生産収率および環状ペプチドの純度の改善を提供する。

一般に、本発明の方法は、一つがジペプチドである少なくとも二つのペプチド中間体フラグメントの固相合成を伴う。この工程は、ジペプチド法を使用しなければ形成するおそれがある袋小路の中間体フラグメントの形成を回避する。

本発明によると、環状ペプチドを形成させるための方法が提供される。この方法は、以下の工程を含む。まず、ジペプチドフラグメントを樹脂上で合成するが、この合成は、第１の側鎖を有するアミノ酸残基を含むジペプチドフラグメントを提供する。次いで、このジペプチドを樹脂から切断する。樹脂にカップリングされた第２のペプチドフラグメントを提供するが、この第２のペプチドは、第２の側鎖を有するアミノ酸残基を含む。次いで、切断されたジペプチドフラグメントのカルボキシル末端を第２のペプチドフラグメントのアミノ末端にカップリングすることにより、樹脂に結合した第３のペプチドを形成させる。この方法はまた、ジペプチド部分の第１の側鎖を第２のペプチド部分の第２の側鎖と共有結合させることにより第３のペプチドを環化する工程を含む。

一部の例では、環化の工程は、酸性（第１の）側鎖を塩基性（第２の）側鎖にカップリングすることを含む。例として、ペプチドは、アスパラギン酸残基の側鎖およびリシン残基の側鎖を介して環化される。

本方法は、非天然アミノ酸を含む環状ペプチドの合成のために使用することができる。このような非天然アミノ酸には、天然Ｌ−アミノ酸のＤ−立体異性体形態および合成アミノ酸（非天然側鎖を有するもの）が含まれる。一実施形態では、この環状ペプチドは、Ｄ−フェニルアラニンなどのＤ−アミノ酸および隣接する合成アミノ酸を含む。カップリングの工程では、Ｎ末端酸性アミノ酸残基およびＣ末端合成アミノ酸を含むジペプチドが、第２のペプチドフラグメントのＮ末端Ｄ−アミノ酸にカップリングされ、第３のペプチドフラグメントを形成する。

本発明の方法は、ＭＣ−４レセプター活性を選択的に刺激する環状メラノコルチン−４（ＭＣ−４）レセプターアゴニストペプチドの合成に例示される。ＭＣ−４レセプターアゴニストペプチドは、肥満（Huzar, D., et al. (1997) Cell 88:131-41）および男性***不全（ＭＥＤ）（Sebhat, I.K., et al. (2002) J Med Chem. 45:4589-93）の治療または予防に有用であると考えられている。非天然アミノ酸を含み、ＭＣ−４レセプターに対して高い選択性を有する短鎖環状ＭＣ−４ペプチドの合成は、米国特許第７，０４５，５９１号に記載されている。これらのペプチドは、式：シクロ（Ａｓｐ−Ｌｙｓ）ペンタノイル−Ａｓｐ−（ＡＡ_ｎｎ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２（配列番号１）で表され、式中、ＡＡ_ｎｎは、米国特許第７，０４５，５９１号に記載されたような非天然アミノ酸を表す。好ましいＭＣ−４アゴニストペプチドは、４−アミノ−１−フェニルピペリジン−４−カルボン酸および４−アミノ−１−（２−メチルフェニル）ピペリジン−４−カルボン酸より選択される非天然アミノ酸を有する。

特に述べない限り、明細書および特許請求の範囲を含む本出願に使用される以下の用語は、下記の定義を有する：
「アルキル」には、１〜８個の炭素原子を有する分岐および直鎖の一価飽和脂肪族炭化水素基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、異性体性ペンチルおよび異性体性ヘキシルが挙げられる。好ましくは、Ｒ^１２を定義する場合に、「アルキル」は、１〜５個の炭素原子を有する直鎖、最も好ましくはブチルである。好ましくは、Ｒ^１を定義する場合に、「アルキル」は、４〜８個の炭素原子を有する分岐の一価飽和脂肪族炭化水素基、最も好ましくはｔ−ブチルである。

「アルケニル」には、オレフィン結合および最大５個の炭素原子を含む直鎖または分岐の炭化水素残基、例えばエテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニルおよびイソブテニルが挙げられる。

「アルコキシ」には、式−ＯＲ（式中、Ｒは本明細書において同義のアルキルである）で示される部分が含まれる。「アルコキシ」部分の例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｔ−ブトキシ、ブトキシおよびペンチルオキシが含まれるが、それに限定されるわけではない。好ましくは、「アルコキシ」は、１〜４個の炭素原子を有する。最も好ましくは、Ｒ^３を定義する場合の「アルコキシ」はメトキシである。

一局面では、本発明は、新規なジペプチドを提供する。このジペプチドは、本明細書に記載されたような環状ＭＣ−４ペプチドを合成するための中間体ペプチドとして使用することができる。この局面では、このジペプチドには、式：

［式中、Ｒ^１はアルキル保護基であり；
Ｘは：

であり、
Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、独立して、水素、または１〜４個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐のアルコキシであり、但し、Ｒ^３がアルコキシである場合に、Ｒ^２およびＲ^４は共に水素であり；Ｒ^９は、水素、１〜３個の炭素を有する直鎖もしくは分岐のアルキル、１〜３個の炭素を有する直鎖もしくは分岐のアルコキシ、または非置換フェノキシであり；Ｒ^１１は、シクロヘキシル、シクロヘプチル、または３〜８個の炭素原子を有する分岐のアルキルであり；
Ｒ^１２は、１〜５個の炭素原子を有するアルキル、２〜５個の炭素原子を有するアルケニル、または２〜５個の炭素原子を有するアルキニルであり；そして
Ｒ^１０は、Ｈまたはハロゲンである］
で示されるアスパラギン酸ジペプチドが含まれうる。

いくつかの局面では、これらのジペプチドは、環状メラノコルチン−４レセプターアゴニストペプチドを形成させる方法に使用される。この方法は、請求項１記載の式Ｉで示されるアスパラギン酸ジペプチドを樹脂上に合成する工程を含む。次に、このアスパラギン酸ジペプチドを樹脂から切断する。次いで、樹脂に結合した配列：Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓを含む第２のペプチドフラグメントを提供する。次に、このジペプチドのカルボキシル末端を第２のペプチドフラグメントのアミノ末端にカップリングすることにより、配列［式Ｉ］−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓを有するペプチドを形成させる。次いで、アスパラギン酸残基の側鎖をリシン残基の側鎖と共有結合させることにより、このペプチドを環化する。他の場合では（ジペプチドの）合成アミノ酸をモノマー形態でカップリングすることにより形成される袋小路の尿素中間体の形成を、このアプローチは回避する。

本発明の方法により生成する化合物は、対象における体重増加を処置するための薬学的組成物中に使用することができる。

本明細書に言及された全ての刊行物および特許は、それら各々の全体が参照により本明細書により組み入れられる。本明細書に開示された刊行物および特許は、それらの開示のためだけに提供される。本発明者が本明細書に引用された任意の刊行物および／または特許を含む任意の刊行物および／または特許に先行して権利化されないことを認めるものとして解釈されるべきではない。

下に記載された本発明の態様は、網羅的であること、または以下の詳細な説明に開示された正確な形態に本発明を限定することを意図しない。それどころか、これらの態様は、他の当業者が本発明の原理と実践を認識および理解できるように選択および記載される。

本発明の方法は、環状ペプチドを製造するための一般アプローチに従う。これには、（ａ）第１の側鎖を有するアミノ酸残基を含む第１のジペプチドを固相合成により調製する工程、（ｂ）樹脂からジペプチドを切断する工程、（ｃ）第２の側鎖を有するアミノ酸残基を含む、固相合成によりカップリングされた第２のペプチドフラグメントを調製する工程、および（ｄ）樹脂上にある間に第２のペプチドフラグメントのアミノ末端に、切断されたジペプチドフラグメントのカルボキシル末端をカップリングすることにより、第３ペプチドを形成させる工程が含まれる。次いで、第３のペプチドは、（ｅ）ジペプチド部分の第１の側鎖を第２のペプチド部分の第２の側鎖と共有結合させることにより環化する。典型的には、第３のペプチドを、樹脂から切断し、次いで環化する。

第１および第２のアミノ酸側鎖を含むアミノ酸側鎖（環化工程の間に共有結合されたもの）は、ジペプチドが第２のペプチドにカップリングした後の時点になるまで除去されない保護基を含む。多くの実施形態では、側鎖の保護基は、樹脂から第３のペプチドを切断する工程の間に除去される。例えば、樹脂に結合した第３のペプチドは、酸に不安定な側鎖保護基を除去するために、および樹脂に第３のペプチドを連結する酸不安定基を切断するためにトリフルオロ酢酸で処理することができる。

本発明によると、「環状ペプチド」は、共有結合している少なくとも一対のアミノ酸側鎖を有するペプチドを表す。例えば、カップリングされた側鎖の対は、（例えば、ペプチドのジペプチド部分の）一つのアミノ酸の反応性側鎖と別のアミノ酸の反応性側鎖の間に形成された共有結合を含むことがある。反応性アミノ酸のアミノ酸側鎖は、酸性基、塩基性基、または硫黄含有基を含みうる。例示的な環状ペプチドは、酸性アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸など）の側鎖と塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、トリプトファン、またはヒスチジン）の側鎖の間のアミド結合の形成を含む。

環状ペプチドはまた、ジスルフィドの形成により調製することができる。ジスルフィド結合は、ペプチド中の二つのシステイン残基が適切に酸化的カップリングすることにより形成する。

本発明の方法は、関連するアミノ酸が第３のペプチド中で適所にあるように実施されるので、それらの側鎖が所望の場合に分子内アミド結合またはジスルフィド結合形成を受けるように誘導することができる。一部の例では、この結合は、相互に約６個のアミノ酸のうち２個のアミノ酸の間で結合が形成する。一部の例では、ペプチドのＮ末端とＣ末端アミノ酸の間に結合が形成する。

一般的な事柄として、本発明の方法は、任意の所望の長さの環状ペプチドを調製する工程に使用することができる。例えば、第３のペプチドは、アミノ酸２〜１０個の範囲のアミノ酸数を有するペプチドなどの、２個以上のアミノ酸を有する第２のペプチドにジペプチドをカップリングすることにより形成することができる。第２のペプチドは、トリペプチドまたはテトラペプチドでありうる。一実施形態では、ジペプチドは、テトラペプチドにカップリングし、ヘキサペプチドを形成する。

第３のペプチドは、完全長ペプチド（追加のアミノ酸またはペプチドフラグメントがカップリングしていないペプチドを表す）として合成することができるし、中間体ペプチドとして合成することもできる。中間体ペプチドは、長さのより大きいペプチドを生成させるために、追加のアミノ酸またはペプチド中間体フラグメントを用いた一つまたは複数のカップリング工程に供することができる。例えば、形成および環化した場合の第３のペプチドは、他の化学部分にカップリングしている点で中間体化合物でありうる。これらの他の化学部分は、他のペプチドまたはポリマーの種類でありうる。例えば、第３のポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーとカップリングしていることがある。

ペプチドを得ることができるアミノ酸は、天然アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、またはその組み合わせでありうる。２０種の一般的な天然アミノ酸残基は、以下の通りである：Ａ（Ａｌａ、アラニン）、Ｒ（Ａｒｇ、アルギニン）；Ｎ（Ａｓｎ、アスパラギン）；Ｄ（Ａｓｐ、アスパラギン酸）；Ｃ（Ｃｙｓ、システイン）；Ｑ（Ｇｌｎ、グルタミン）；Ｅ（Ｇｌｕ、グルタミン酸）；Ｇ（Ｇｌｙ、グリシン）；Ｈ（Ｈｉｓ、ヒスチジン）；Ｉ（Ｉｌｅ、イソロイシン）；Ｌ（Ｌｅｕ、ロイシン）；Ｋ（Ｌｙｓ、リシン）；Ｍ（Ｍｅｔ、メチオニン）；Ｆ（Ｐｈｅ、フェニルアラニン）；Ｐ（Ｐｒｏ、プロリン）；Ｓ（Ｓｅｒ、セリン）；Ｔ（Ｔｈｒ、トレオニン）；Ｗ（Ｔｒｐ、トリプトファン）；Ｙ（Ｔｙｒ、チロシン）；およびＶ（Ｖａｌ、バリン）。天然の希少アミノ酸もまた意図され、それらには、例えば、セレノシステインおよびピロリシンが含まれる。

いくつか部の局面では、非天然アミノ酸が環状ペプチドに含まれる。非天然アミノ酸には、天然アミノ酸と類似の構造および反応性を有する有機化合物が含まれ、例えば、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、ω−アミノ酸（３−アミノプロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸など）、γ−アミノ酸、環状アミノ酸アナログ、プロパルギルグリシン誘導体、２−アミノ−４−シアノ酪酸誘導体、α−アミノ酸のWeinrebアミド、およびアミノアルコールが含まれる。本発明の一局面では、そして本明細書に記載されたように、米国特許第６，６００，０１５号に記載された非天然アミノ酸は、アルギニン含有ペプチドの合成における本方法に使用される。

一つまたは複数の他のモノマー、オリゴマー、および／またはポリマー構成要素の残基は、場合により環状ペプチドに組み入れることができる。非ペプチド結合もまた、存在しうる。これらの非ペプチド結合は、アミノ酸残基の間、アミノ酸と非アミノ酸残基の間、または二つの非アミノ酸残基の間でありうる。これらの代替非ペプチド結合は、当業者に周知の反応を利用することにより形成することがあり、これらの結合には、非限定的に、イミノ、エステル、ヒドラジド、セミカルバジド、アゾ結合などが含まれうる。

本発明はまた、アミノ酸残基以外に一つまたは複数の化学基を有するように化学的に変更された、時に改変ペプチドと呼ばれる環状ペプチドを調製する方法を考えている。このような化学基は、ペプチドのアミノ末端に、カルボキシ末端に、および／またはそのペプチドの全長に沿った一つもしくは複数のアミノ酸残基に含まれることがある。なおさらなる態様では、このペプチドは、アミノ末端および／またはカルボキシ末端に存在する追加的な化学基を含むことがあり、それにより、例えばペプチドの安定性、反応性および／または溶解性が高まる。このような改変を導入するための技法は、当技術分野において周知である。

第２のペプチドの固相合成のための工程は、典型的には側鎖を保護されたアミノ酸を、樹脂に結合している新生ペプチド鎖にカップリングすることを伴う。

本発明によると、このジペプチドおよび第２のペプチドは、固相樹脂上に合成される。いくつかの実施形態では、このジペプチドおよび第２のペプチドは、標準的なＦＭＯＣプロトコールを使用して合成される。例えば、Carpin et al. (1970), J. Am. Chem. Soc. 92(19):5748-5749；Carpin et al. (1972), J. Org. Chem. 37(22):3404-3409, "Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis," Weng C. Chan and Peter D. White Eds. (2000) Oxford University Press Oxford Engを参照されたい。

固相ペプチド合成の実施に適した任意の種類の支持体を使用することができる。好ましい態様では、支持体は、ポリアミド、ポリスルファミド、置換ポリエチレン、ポリエチレングリコール、フェノール樹脂、多糖、またはポリスチレンなどの、一つまたは複数のポリマー、コポリマー、またはポリマーの組み合わせから製造することができる樹脂を含む。ポリマー性支持体はまた、ペプチド合成に使用される溶媒に十分に不溶性で不活性な任意の固体でありうる。固体支持体は、典型的には、成長中のペプチドが合成の間にカップリングされる連結部分であって、その支持体からそのペプチドを放出するために所望の条件で切断することができる連結部分を含む。適切な固体支持体は、光切断可能な、ＴＦＡで切断可能な、ＨＦで切断可能な、フッ素イオンで切断可能な、還元的に切断可能な、Ｐｄ（Ｏ）で切断可能な、求核的に切断可能な、またはラジカルで切断可能なリンカーを有しうる。好ましい連結部分は、切断されたペプチドがまだ実質的に全体的に保護されているような条件で切断可能である。

好ましい一合成法では、このジペプチドは、トリチル基を含む酸感受性固体支持体上で、さらに好ましくはペンダント型塩素基を有するトリチル基を含む樹脂、例えば２−クロロトリチルクロリド（２−ＣＴＣ）樹脂上で合成される（Barlos et al. (1989) Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946）。例には、トリチルクロリド樹脂、４−メチルトリチルクロリド樹脂、４−メトキシトリチルクロリド樹脂、４−アミノブタン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、４−アミノメチルベンゾイル２−クロロトリチル樹脂、３−アミノプロパン−１−オール２−クロロトリチル樹脂、ブロモ酢酸２−クロロトリチル樹脂、シアノ酢酸２−クロロトリチル樹脂、４−シアノ安息香酸２−クロロトリチル樹脂、グリチノール２−クロロトリチル樹脂、プロピオン酸２−クロロトリチル樹脂、エチレングリコール２−クロロトリチル樹脂、Ｎ−Ｆｍｏｃヒドロキシルアミン２−クロロトリチル樹脂、ヒドラジン２−クロロトリチル樹脂も含まれる。いくつかの好ましい固体支持体には、反応基がアンカーされる指示物質を形成するためにジビニルベンゼンとコポリマー化することができるポリスチレンが含まれる。

ペプチド物質は、典型的には樹脂ビーズに、ビーズ表面およびビーズ内部の両方で結合している。ＦＭＯＣおよび側鎖を保護されたペプチドは、保護された状態で、ＤＣＭ中の希ＴＦＡまたは酢酸などの弱酸性試薬を用いて、この樹脂から容易に切断される。

いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、樹脂の切断後にＣ末端アミド基を形成させる樹脂上に合成される。好ましい一実施形態では、第２のペプチドは、Ｆｍｏｃ化ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上に調製される。この種の樹脂は、Ｆｍｏｃ化学反応を使用してペプチド性アミドを合成するために使用することができ、カルボン酸を結合させるように設計され、そのカルボン酸はアミドとしてその後切断される。

本発明の説明をさらに容易にするために、以下の説明の文脈中の「樹脂」という用語は、別に示さない限り、一般に新生ペプチドがカップリングした樹脂を表す。したがって、樹脂を試薬と接触させる工程は、一般に新生ペプチドに作用するように行われる。

固相合成については、合成される環状ペプチドの所望の量に応じて、適切な反応容器を選択することができる。ペプチドのスケールアップ合成は、フィルター、スターラー、温度計、加熱および／または冷却エレメント、試薬注入口および生成物取出し口および導管、不活性ガス導入部／バブラー機構を含む特徴を有する反応容器で継続することができる。

試薬が反応容器の内壁に非特異的に接着することを防止するために、樹脂を添加する前に反応容器を前処理することができる。例えば、樹脂と適合性で、ジクロロメタン（ＤＣＭ）のように固相合成の間に使用されるであろう溶媒に加えて、ジクロロジメチルシランなどのシラン化試薬を容器に加えることができる。前処理の後に、残ったシラン化試薬を除去するために容器を洗浄することができる。

第１のカップリングしたアミノ酸を有する支持体を提供するために、例えば洗浄し、次いで活性化した保護されたアミノ酸を含有する溶液と共にインキュベーションすることにより、樹脂を調製することができる。樹脂にカップリングされた第１のアミノ酸およびそれに続くアミノ酸は、典型的には、Ｎ末端保護基、側鎖保護基（特定のアミノ酸に依存）、およびその樹脂からのペンダント型基と反応する基またはペンダント型アミノ酸と反応する基を含む。

好ましい局面では、第１のアミノ酸は、カルボキシ末端で支持体に結合しているが、Ｎ末端および側鎖基は、必要に応じて保護基により保護されている。例示的な説明として、ＦＲＷＫ（配列番号１）の第２のペプチド（テトラペプチド）の固相合成は、Ｋｎｏｒｒ（Ｆｍｏｃ化ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ）樹脂上に保護されたリシン酸残基を最初にロードすることにより、カルボキシ末端からアミノ末端方向に行われる。

保護基の性質および使用は、当技術分野において周知である。一般に、適切な保護基は、加工および合成の間に、それが結合している原子または部分、例えば酸素または窒素が望まれない反応に関与することを防止するのを助けることができる任意の種類の基である。保護基には、側鎖保護基およびアミノ末端またはＮ末端保護基が含まれる。保護基はまた、カルボン酸、チオールなどの反応または結合を防止することができる。

アミノ末端保護基には、アミノ酸のα−アミノ基にカップリングされた化学部分が含まれる。典型的には、アミノ末端保護基は、成長中のペプチド鎖に付加される次のアミノ酸を添加する前に、脱保護反応で除去されるが、ペプチドを支持体から切断するときには維持することができる。アミノ末端保護基の選択は、様々な要因、例えば、行われる合成の種類および所望の中間体生成物または最終生成物に依存しうる。本発明の形態に記載したように、Ｆｍｏｃアミノ末端保護基は、ジペプチドおよび第２のペプチドの合成のために使用される。

側鎖保護基は、側鎖の部分がペプチド合成、加工などの工程に使用される化学物質と反応することを防止するのを助けるアミノ酸側鎖（アミノ酸の一般式Ｈ_２Ｎ−Ｃ（Ｒ）（Ｈ）−ＣＯＯＨにおけるＲ基）にカップリングされた化学部分を表す。側鎖保護基の選択は、様々な要因、例えば行われる合成の種類、ペプチドが供されるであろう加工、および所望の中間体生成物または最終生成物に依存しうる。側鎖保護基の性質もまた、アミノ酸自体の性質に依存する。一般に、固相合成の間のα−アミノ基の脱保護の間に除去されない側鎖保護基が選択される。したがって、α-アミノ保護基および側鎖保護基は、典型的には同じではない。

一部の例では、そして固相合成および他のペプチド加工に使用される試薬の種類に応じて、アミノ酸は、側鎖保護基の存在を必要としないことがある。これは、典型的には側鎖が標準合成条件で非反応性の場合である。このようなアミノ酸は、典型的には側鎖に反応性の酸素、窒素、または硫黄を含まない。側鎖に反応性の酸素、窒素、または硫黄を含まないアミノ酸は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、およびバリンである。

側鎖保護基の例には、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ｔｅｒｔ−ブチル、トリフェニルメチル（トリチル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルエーテル（Ｂｚｌ）および２，６−ジクロロベンジル（ＤＣＢ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、アダマンチルオキシカルボニル、キサンチル（Ｘａｎ）、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチルおよびｔ−ブチルエステル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、２−クロロベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、Ｔｏｓ、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、および芳香族または脂肪族ウレタン型保護基、ニトロベリトリルオキシカルボニル（nitro veritryl oxycarbonyl）（ＮＶＯＣ）などの感光性基、ならびにトリメチルシリルオキシカルボニル（ＴＥＯＣ）などのフッ素不安定基が含まれる。

好ましい側鎖保護基には、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）およびＡｓｐ（Ｄ）アミノ酸残基のためのｔ−Ｂｕ基；Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｎ（Ｑ）およびＡｓｎ（Ｎ）アミノ酸残基のためのｔｒｔ基；ならびにＬｙｓ（Ｋ）およびＴｒｐ（Ｗ）アミノ酸残基のためのＢｏｃ基が含まれる。ペプチドのアミノ酸残基の任意の一つまたは複数の側鎖は、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、トリチル（ｔｒｔ）およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）などの標準的な保護基で保護してもよい。

本発明の他の局面では、第２のペプチドを合成するための方法は、酸で除去可能なα−アミノ保護基を有する、側鎖保護されたアミノ酸をカップリングする一つまたは複数の工程を含む。これらの局面では、側鎖保護基は、酸で除去可能なα−アミノ保護基を除去するために使用される条件で除去することができない。例えば、側鎖保護基は、α−アミノが保護されたＢｏｃアミノ酸の化学反応と適合性であるべきである。

本発明によると、側鎖保護基は、典型的には、固相合成の間にわたり、そして第２のペプチドへのジペプチドの固相カップリングに進むときにも、ジペプチドおよび第２のペプチド上に保持される。（一般に、固相カップリング工程が完了後に、ペプチドから一つまたは複数の保護基を除去し、そして樹脂からペプチドを切断するために、脱保護工程が行われる。）

固相合成のための樹脂を準備するために、この樹脂は溶媒中で予備洗浄することができる。例えば、Ｋｎｏｒｒ樹脂などの固相樹脂をペプチドチャンバーに加え、適切な溶媒で予備洗浄する。樹脂にカップリングされる第１のアミノ酸と接触するための準備をその樹脂に行うために、洗浄を行うことができる。本質的に、樹脂への第１のアミノ酸の効率的なカップリングを促進するために予備洗浄を行うことができる。予備洗浄溶媒は、カップリング反応またはその逆に使用される溶媒（または溶媒の混合物）の種類に基づいて選択することができる。

アミノ酸をカップリングするその後の工程の前に除去されるＮ末端保護基を含む樹脂については、樹脂から保護基を切断する化合物の存在下で洗浄を行うことができる。例えば、Ｆｍｏｃで保護されたＫｎｏｒｒ樹脂は、ピペリジン／ＤＭＦ混合物で脱保護することができる。

洗浄およびその後のカップリング反応に適した溶媒には、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジクロロエタン（ＤＣＥ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メチレンクロリドなど、およびこれらの試薬の混合物が挙げられる。他の有用な溶媒には、ＤＭＳＯ、ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、およびその混合物が挙げられる。一部の例では、カップリングは、ＤＭＦとＤＣＭの混合物などの二溶媒系で行うことができる。

いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、樹脂または新生ペプチド鎖に、保護されたアミノ酸を、樹脂１モルあたり約１．５当量のアミノ酸の量でロードすることにより調製される。

カップリング反応は、カップリング反応を増強または改善する一つまたは複数の化合物の存在下で行うことができる。反応速度を上げて副反応の速度を低下させることができる化合物には、第３級塩基、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下で、保護されたアミノ酸を活性化種に変換することができるホスホニウム塩およびウロニウム塩が挙げられる（例えば、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰＯ、ＨＢＴＵ、およびＴＢＴＵは全てＨＯＢｔエステルを生成する）。他の試薬は、保護試薬を提供することによりラセミ化の防止を助ける。これらの試薬には、求核助剤（auxiliary nucleophile）（例えば、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、またはＨＯＳｕ）が添加されたカルボジイミド（例えば、ＤＣＣまたはＷＳＣＤＩ）が挙げられる。

カップリングの完了は、定量ニンヒドリン試験でモニターすることができる。カップリングが完了したと判定された後に、溶媒でカップリング反応混合物を洗浄し、ペプチド物質のその後の各アミノ酸残基についてカップリングサイクルを繰り返す。最後のカップリングサイクルの後で、ＤＭＦなどの溶媒で樹脂を洗浄する。

次のアミノ酸をカップリングするために、Ｎ末端保護基（例えば、Ｆｍｏｃ基）の除去は、典型的にはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの溶媒中に２０〜５０％（体積に基づく）のピペリジンを含む試薬で処理することにより達成される。Ｆｍｏｃ保護基の除去後に、典型的には残ったピペリジンおよびＦｍｏｃ副生成物（ジベンゾフルベンおよびそのピペリジン付加物など）を除去するために数回の洗浄が行われる。

第１のアミノ酸が所望のローディング係数で樹脂にカップリングし、Ｎ末端保護基が除去された後で、ペプチド中間体フラグメントを調製するためにその後のアミノ酸を付加することができる。その後のアミノ酸は、ローディング係数に関して化学量論的に過剰のアミノ酸で利用することができる。好ましくは、カップリング工程で使用されるアミノ酸の量は、１．３当量（０．３過剰）またはさらに、そして最も好ましくは約１．５当量（０．５過剰）である。この過剰はまた、反応が脱保護試薬からの過剰の塩基に耐えることを助けることができる。

ＦＲＷＫ（配列番号１）などの所望の第２のペプチドが形成するまで、カップリング、洗浄、Ｎ末端基脱保護、および洗浄の工程を繰り返すことができる。固相合成に続いて、第２のペプチドがジペプチドとの固相反応でカップリングすることができるように、そのペプチドは樹脂上に維持される。

本発明のジペプチドは、続いて（第３のペプチドが形成した後で）第２のペプチドのアミノ酸残基の側鎖に続いてカップリングされる側鎖を有するアミノ酸残基を含む。

本発明のいくつかの局面では、このジペプチドは非天然アミノ酸を含む。例示的なジペプチドは、アスパラギン酸残基および米国特許第６，６００，０１５号に記載された非天然アミノ酸を含む。ジペプチドは、ＭＣ−４レセプターペプチドを提供するために、樹脂に結合した第２のＦＲＷＫペプチドにカップリングすることができ、これは、次いで環化することができる。

好ましくは、ジペプチドＸは、

である［式中、Ｒ^３はアルコキシであり、Ｒ^２およびＲ^４は共に水素である］。Ｒ^３がＯＣＨ_３であるならば、非天然アミノ酸は１−アミノ−４−（４−メトキシフェニル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（４ＭｅＯＡＰＣ）である。

いくつかの局面では、Ｒ^１は、ｔ−ブチル基などの、４〜８個の炭素原子を有する分岐のアルキル基である。

いくつかの局面では、Ｒ^１２は、Ｃ４アルキル基などのアルキル基である。

特定の一局面では、このジペプチドは、ペタノイル−Ａｓｐ−（ＯｔＢｕ）−４ＭｅＯ−ＡＰＣ−ＯＨを含む。

例示的な一実施形態では、このジペプチドは、固相合成により合成される。この合成は、Ｆｍｏｃ−４−ＭｅＯ−Ａｐｃ−ＯＨなどの、アミノを保護された非天然アミノ酸を、２−ＣＴＣ樹脂などのＦｍｏｃ合成に適した樹脂にカップリングすることを含む。標準的なカップリングおよび樹脂の洗浄を行い、続いてピペリジンで処理して、Ｆｍｏｃ基を除去する。次に、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨなどの、アミノおよび側鎖を保護されたアミノ酸を、非天然アミノ酸とカップリングする。もう一度、標準的なカップリングおよび樹脂の洗浄を行い、続いてピペリジンで処理してＦｍｏｃ基を除去する。

Ｆｍｏｃの除去に続いて、Ｎ末端をアルカノイル基でキャップする。例えば、Ｎ末端を脂肪酸無水物で処理する。適切な脂肪酸無水物は、吉草酸無水物であり、これは、Ｎ末端にペンタノイル基を与える。

樹脂からジペプチドを除去するために、切断されたジペプチドがまだ側鎖保護基を有するように切断処理を実施する。本来の場所に保護基を残すことは、切断後のジペプチドの望ましくないカップリングまたは他の望ましくない反応を防止することを助ける。ペプチド合成にＦＭＯＣまたは類似の化学反応が使用される場合に、保護された切断は、ＤＣＭなどの溶媒中の酢酸または希ＴＦＡなどの比較的弱酸の試薬を使用することなどによる、任意の所望の方法で達成することができる。ＤＣＭは、樹脂を膨潤させることもまたでき、切断および分離工程に有用である。ＤＣＭ中の０．５〜１０重量パーセント、好ましくは１〜３重量パーセントのＴＦＡを使用することが好ましい。

樹脂からジペプチドが切断された後で、切断されたジペプチド組成物に、切断反応をクエンチするのに十分な量の化合物を加えることができる。例えば、一実施形態では、前述の切断反応に加えられたＴＦＡ量の約２倍量のピリジン（クエンチング化合物）をその組成物に加える。次いで、ジペプチド生成物を、溶媒中で濃縮し、水性液体で抽出することができる。

第３のペプチドを提供するために、樹脂に結合した第２のペプチドにジペプチドをカップリングする。例示的な工程では、ジペプチドペタノイル−Ａｓｐ−（ＯｔＢｕ）−４ＭｅＯ−ＡＰＣ−ＯＨを第２のペプチド（Ｄ）Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−樹脂のカルボキシル末端にカップリングするが、ここで、第２のペプチドのアミノ酸の側鎖は保護されている（Ｐｈｅを除く）。例示的なカップリング工程は、ＤＭＦおよびＤＣＭなどの溶媒中のＨＯＢＴ、ＨＢＴＵ、およびＤＩＥＡを利用する。ニンヒドリン試験陰性にするために十分な時間（一晩など）、カップリングを行うことができる。

次いで、樹脂にカップリングした第３のペプチド（すなわち樹脂に結合した第２のペプチドとカップリングされたジペプチド）を、濃ＴＦＡ溶液を用いて、その樹脂から切断する。固相樹脂から第３のペプチドを切断する工程は、以下のような例示的な工程と同様に進行することができる。しかし、樹脂から第３のペプチドを効果的に切断する任意の適切な工程を使用することができる。例えば、酸切断試薬を含有する約５〜２０、好ましくは約１０容の溶媒を容器に加える。その結果として、樹脂ビーズは試薬に浸漬される。液体内容物を適切な温度で適切な時間撹拌するときに切断反応が起きる。撹拌は、ビーズの凝集防止を助ける。適切な時間および温度条件は、使用される酸試薬、ペプチドの性質、樹脂の性質などの要因に依存する。

一実施形態では、第３のペプチドは、約１５℃〜約３０℃で、好ましくは約２０℃〜約２５℃で、約２〜３時間撹拌して、樹脂から切断される。

濃縮酸性溶液を用いた切断はまた、アミノ酸側鎖保護基の喪失を招く。

切断に続いて、ペプチドを沈殿させる。いくつかの実施形態では、切断されたペプチドにメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）などの液体を加えてその沈殿を起こす。

沈殿に続いて、沈殿したペプチドを、沈殿液剤（precipitating liquid）と希塩基の組成物で洗浄することができる。一実施形態では、沈殿したペプチドをＭＴＢＥ中の２％ＤＩＥＡの組成物で洗浄する。塩基の洗浄は、リシン側鎖でのＴＦＡアミド形成を最小減にするか、または除去することによりその後の環化工程を容易にする。

次いで、沈殿したペプチド固体を乾燥することができる。

次いで、沈殿したペプチドを適切な溶媒に溶解させ、環化反応に供することができる。環化工程が、酸性アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸など）の側鎖と塩基性アミノ酸（リシン、グルタミン、またはヒスタミンなど）の側鎖の間のアミド結合形成に向けられるならば、この工程は、カップリング工程に一般的なＨＢＴＵおよびＤＩＥＡなどの試薬を用いて実施することができる。ペプチドであるペンタノイル−Ａｓｐ−（４−ＭｅＯ−Ａｐｃ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２（配列番号２）について、環化は、アスパラギン酸とリシン側鎖の共有結合を招き、シクロ（Ａｓｐ−Ｌｙｓ）ペンタノイル−Ａｓｐ−（４−ＭｅＯ−Ａｐｃ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２を提供する。

好ましい一実施形態では、環化は、濃ペプチド溶液を用いて行われる。例えば、環化反応は、約１５g/L〜約２５g/L（ペプチド／溶媒）の範囲の濃度で行われる。一実施形態では、環化反応は、約２０℃〜約２５℃の温度で約１時間実施することができる。環化に続いて、反応を水でクエンチすることができる。

環化に続いて、ペプチドは、クロマトグラフィー精製に供することができる。ペプチドはまた、１回または複数回の塩交換に供することができる。例えば、ペプチド−酢酸塩およびペプチド−乳酸塩を提供するために、ペプチドＴＦＡ塩を塩交換に供することができる。これは、カラムにペプチドを再びロードし、次いで所望の酢酸塩（例えば酢酸アンモニウム）でカラムをフラッシュしてペプチドを溶出させることにより果たすことができる。乳酸塩は、乳酸溶液をペプチド−酢酸と混合し、次いでその混合物を凍結乾燥することにより形成させることができる。

本発明の方法により調製された化合物は、インビトロで選択的ＭＣ−４レセプターアゴニスト活性を提供するために使用することができる。ＭＣ４−Ｒ活性のアゴニストは、ヒト肥満のマウスモデルにおいて食物摂取の減少を引き起こすことが知られている。したがって、これらの化合物の投与は、体重の調節に重要なＭＣ４−Ｒ活性を作動（agonize）する。本発明の化合物を含有する薬学的組成物は、望まれない体重増加を単独で、またはＩＩ型糖尿病などの有害な医学的状態または疾患の一部として経験しているヒトまたは動物の患者に様々な手段により投与するために有効な濃度（strength）で、製剤化することができる。様々な投与技法を使用することができる。活性化合物の平均量は変動することがあり、特に資格のある医師または獣医師の指示および処方に基づくべきである。

以下の略語および定義を使用する：ＡＣＮ（アセトニトリル）、Ａｒｇ（アルギニン／アルギニル）、Ａｓｐ（アスパラギン酸／アスパルチル）、Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）、２−ＣＴＣ（２−クロロトリチルクロリド）、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、ＤＩ（脱イオン）、ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾイル−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、Ｌｙｓ（リシン／リシル）、ＭＴＢＥ（メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル）、ＮＨ_４ＯＡｃ（酢酸アンモニウム）、ＯＭｅ（メトキシ）、Ｐｈｅ（フェニルアラニン／フェニルアラニル）、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル）、Ｔｆａ（トリフルオロ酢酸）、Ｔｒｐ（トリプトファン／トリプトフィル）。

実施例１
Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−樹脂の調製

Ｋｎｏｒｒ樹脂の脱保護
３０５．３８ｇのＫｎｏｒｒ樹脂および
３．６ＬのＤＭＦを６−Ｌ ＳＰＰＳにチャージした。１００RPMで３０分間撹拌し、次いでＤＭＦを排液した。
３．０Ｌ ＤＭＦ。温度を２５℃に調整した。反応器から排液し、
２×３．６Ｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦでそれぞれ６０分間脱保護した。
４×３．６ＬのＤＭＦで樹脂を洗浄した。

Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨをカップリング
１９２．８
６３．４４ｇのＨＯＢＴ水和物
６８．０ｇのＤＩＥＡ
１．７ＬのＤＭＦ。この溶液を５℃に冷却し、
１５７．０ｇのＨＢＴＵと、
１ＬのＤＭＦ中で混合し、５℃に１５分間冷却した。
活性化したエステル溶液をＳＰＰＳに加え、
０．６ＬのＤＣＭですすいだ。カップリングを３時間維持した。（反応器容量＝４．７Ｌ）。
２および３時間目に完了を調べるためにサンプリングした（Kaiser）。両試料はニンヒドリンで無色であった。反応器から排液し、
４×３．６ＬのＤＭＦで洗浄した。反応器から排液し、
２×３．６Ｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦでそれぞれ３０分間脱保護した。樹脂を
４×３．６ＬのＤＭＦで洗浄した。

Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨをカップリング
１２５．３２ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ
６３．４４ｇのＨＯＢＴ水和物
６８．０ｇのＤＩＥＡ
１．７ＬのＤＭＦ。この溶液を５℃に冷却し、
１５７．０ｇのＨＢＴＵと
１ＬのＤＭＦ中で混合し、５℃に１５分間冷却した。
活性化したエステル溶液を、
０．６ＬのＤＣＭですすいだＳＰＰＳに加えた。カップリングは９時間維持した。（反応器容量＝５Ｌ）。
３時間目に完了を調べるためにサンプリングした（Kaiser）。試料はニンヒドリンで無色であった。反応器から排液し、
４×３．６ＬのＤＭＦで洗浄した。反応器から排液し、
２×３．６Ｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦでそれぞれ３０分間脱保護した。樹脂を
４×３．６ＬのＤＭＦで洗浄した。

Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨをカップリング
２６７．５ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ
６３．４４ｇのＨＯＢＴ水和物
６８．０ｇのＤＩＥＡ
１．７ＬのＤＭＦ。この溶液を５℃に冷却し、
１５７．０ｇのＨＢＴＵと、
１ＬのＤＭＦ中で混合し、５℃に１５分間冷却した。
活性化したエステル溶液をＳＰＰＳに加え、
０．６ＬのＤＣＭですすいだ。カップリングを３時間維持した。（反応器容量＝５Ｌ）。
３時間目に完了を調べるためにサンプリングした（Kaiser）。試料はニンヒドリンで無色であった。反応器から排液し、
４×３．６ＬのＤＭＦで洗浄した。反応器から排液し、
２×３．６Ｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦでそれぞれ３０分間脱保護した。
４×３．６ＬのＤＭＦで樹脂を洗浄した。

Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨをカップリング
１５９．７ｇのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ
６３．４４ｇのＨＯＢＴ水和物
６８．０ｇのＤＩＥＡ
１．７ＬのＤＭＦ。この溶液を５℃に冷却し、
１５７．０ｇのＨＢＴＵと、
１ＬのＤＭＦ中で混合し、５℃に１５分間冷却した。
活性化したエステル溶液をＳＰＰＳに加え、
０．６ＬのＤＣＭですすいだ。カップリングを３時間維持した。（反応器容量＝５Ｌ）。
３時間目に完了を調べるためにサンプリングした（Kaiser）。試料はニンヒドリンで無色であった。反応器から排液し、
４×３．６ＬのＤＭＦで洗浄した。反応器から排液し、樹脂を
４×２Ｌのメタノールで洗浄した。ロードされた樹脂を窒素気流下で乾燥させた。試料０．３７ｇを採取した。
重量＝４９３．８１ｇ（ロット５０３−０２４）

実施例２
ペンタノイル−Ａｓｐ−（ＯｔＢｕ）−４−ＭｅＯ−Ａｐｃ−ＯＨの調製

Ｆｍｏｃ−４−ＭｅＯ−Ａｐｃ−ＯＨをロード
６−Ｌ ＳＰＰＳに
３００．０７ｇの２−ＣＴＣ樹脂および
３ＬのＤＣＭをチャージした。３０分間撹拌した。
８４．８７ｇのＦｍｏｃ−４−ＭｅＯ−Ａｐｃ−ＯＨを
２．１ＬのＤＭＦおよび
０．３ＬのＤＣＭに溶かした溶液を作製した。この溶液を３０分間撹拌し、
６９．８３ｇのＤＩＥＡを添加した。次いで、この溶液を膨潤した樹脂にチャージした。撹拌を２０時間続けた。樹脂から排液し、
３ＬのＤＭＦと共に５分間撹拌した。
０．３ＬのＤＩＥＡの
０．２７Ｌのメタノール溶液の添加により末端キャッピングを達成し、１時間撹拌した。樹脂から排液し、
３ＬのＤＭＦで、続いて追加の
１．５ＬのＤＭＦで洗浄した。次いで、樹脂を
５×３ＬのＤＣＭで洗浄した（５回目の洗浄はＵＶ陰性であった）。次いで、この樹脂を、
３×３ＬのＤＭＦで洗浄した。この樹脂から排液し、
２×２．３Ｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦでそれぞれ３０分間脱保護した。
５×２．３ＬのＤＭＦで樹脂を洗浄した。切断およびローディングの測定のために試料を採取した。
ローディング＝０．４５mmol/g
重量３５２．５ｇが得られた。

Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨをカップリング
１２９．２ｇのＦｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ
４８．２ｇのＨＯＢＴ水和物
５０．８ｇのＤＩＥＡ
１．３３ＬのＤＭＦ。この溶液を５℃に冷却し、
１１９．２ｇのＨＢＴＵと、
０．６７ＬのＤＭＦ中で混合し、５℃に１５分間冷却した。
活性化したエステル溶液を、
０．６ＬのＤＣＭですすいだＳＰＰＳに加えた。カップリングを一晩維持した。
試料はニンヒドリンで無色であった。反応器から排液し、
４×２．３ＬのＤＭＦで洗浄した。反応器から排液し、
２×２．３Ｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦでそれぞれ３０分間脱保護した。樹脂を
５×２．３ＬのＤＭＦで洗浄した。

無水吉草酸でキャッピング
１４６．３ｇの無水吉草酸、
０．２７４ＬのＤＩＥＡの
１．５ＬのＤＭＦ溶液をＳＰＰＳに加えた。この溶液を
１．２ＬのＤＭＦですすぎ、反応物を３０分間撹拌し、完了を調べるためにＨＰＬＣによりサンプリングした。反応は完了していた。反応器から排液し、
４×２．３ＬのＤＭＦで洗浄した。樹脂を
３×２．３ＬのＤＣＭで洗浄した。

切断
ＳＰＰＳに
３ＬのＤＣＭをチャージし、０℃に冷却した。冷却が完了してから反応器から排液した。
３０mLのトリフルオロ酢酸の、
３ＬのＤＣＭ（１％）溶液を加え、０〜５℃で３０分間撹拌した。
６０mLのピリジンをチャージし、５分間撹拌した。反応器から排液し、
４×２．３ＬのＤＣＭで２０〜２５℃で洗浄した。切断溶液を０〜５℃で一晩保存した。ＤＣＭは、
１５０mLのＤＩ水を供給しながら、浴温３０℃および真空２５０Torrのロータリーエバポレーター中で蒸留することにより約１Ｌの体積まで濃縮した。ＤＣＭ／水を分液漏斗に打つし、水層を除去した。有機層を
３×１００mLのＤＩ水で洗浄した。有機層を
１００mLのＤＩ水と混合し、浴温３０℃のロータリーエバポレーター中で蒸留することによりＤＣＭを除去した。ＤＣＭがそれ以上除去されなくなるまで真空を１００Torrまで強めた。フラスコの内容物を固化させた。フラスコに
４００mLのＤＣＭをチャージし、固体を溶解させた。分液漏斗に移し、水層を除去した。ストリッピング用の
３２５mLのＤＩ水を供給しながらで浴温３０℃でそれ以上ＤＣＭが１００Torrで除去されなくなるまでＤＣＭを蒸留した。固体を濾過により採集し、
１００mLのＤＩ水に続いて、追加的に
５０mLのＤＩ水で洗浄した。生成物を２０〜２５℃の真空下で乾燥させた。
重量＝５０．５ｇ
収率＝５５．６％（Ｆｍｏｃ−４−ＭｅＯ−Ａｐｃ−ＯＨから）
＝６３．５％（ローディングに基づく）
純度＝９６．１５％（ＡＮ ＨＰＬＣ）

実施例３
ペンタノイル−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−４−ＭｅＯ−Ａｐｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−樹脂の調製

Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−樹脂の脱保護
６−Ｌ ＳＰＰＳに
４５２．８ｇのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−樹脂をチャージした。
３ＬのＤＣＭで１回洗浄して樹脂を膨潤させた。反応器から排液し、
４×３ＬのＤＭＦで洗浄した。樹脂から排液し、
２×３Ｌの２０％ピペリジン／ＤＭＦでそれぞれ３０分間脱保護した。樹脂を
３×３ＬのＤＭＦで洗浄し、排液した。

ペンタノイル−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−４−ＭｅＯ−Ａｐｃ−ＯＨとカップリング
１５９．０ｇのペンタノイル−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−４−ＭｅＯ−Ａｐｃ−ＯＨ
４８．１４ｇのＨＯＢＴ水和物
４５．６６ｇのＤＩＥＡ
１．５ＬのＤＭＦ。この溶液を５℃に冷却し、
１１９．５２ｇのＨＢＴＵと、
１ＬのＤＭＦ中で混合し、５℃に１５分間冷却した。
活性化したエステル溶液を、
０．６ＬのＤＣＭですすいだＳＰＰＳに加えた。カップリングを一晩維持した。（反応器容量約５Ｌ）。
完了したかどうかサンプリングした（Kaiser）。試料はニンヒドリンで無色であった。反応器から排液し、
３×３ＬのＤＭＦで洗浄した。反応器から排液し、
７３×３ＬのＤＣＭで洗浄した。樹脂を２−Ｌ焼結ガラスフィルターに移し、窒素気流で通過させた。(注:６−Ｌ ＳＰＰＳにステンレス鋼メッシュがあることから、切断のためには樹脂を２−Ｌ ＳＰＰＳに移した）
重量＝４９９．８１ｇ

実施例４
ペンタノイル−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−４−ＭｅＯ−Ａｐｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）

２−Ｌ ＳＰＰＳに
１５０．０８ｇのペンタノイル−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−４−ＭｅＯ−Ａｐｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−樹脂および
１ＬのＤＣＭをチャージして樹脂を膨潤させた。
７５．０２ｇのＤＴＴ
７５mLのＤＩ水
１．４６ＬのＴＦＡから切断溶液を調製した。樹脂から排液し、反応器に切断溶液をチャージした。反応器を２時間２０分間２０〜２５℃で撹拌した。５ガロン瓶に
１２ＬのＭＴＢＥをチャージし、０〜５℃に冷却した。切断溶液を５ガロン瓶に排液し、沈殿を形成させた。反応器に
５００mLのＴＦＡをチャージし、５分間撹拌し、続いて
５００mLのＭＴＢＥを加えた。２分間撹拌し、この溶液を瓶に排液した。

瓶の内容物を十分混合し、次いで２５０mLのＦＬＰＥボトルに移した（約２３０ｍＬ／個のボトル８個）。ボトルを２６００RPMで１分間遠心分離した。上清をデカンテーションし、ボトルを再び満たした。全ての懸濁液を処理するまでこの工程を繰り返した。次いで、各ボトルにＭＴＢＥ（全量約１．８Ｌ）を満たし、蓋をし、振盪して固体を再懸濁し、次いで遠心分離した。
３５mLのＤＩＥＡの、
１．４６ＬのＭＴＢＥ溶液を調製した。約
１７５mLのＤＩＥＡ／ＭＴＢＥ溶液をボトル８個のそれぞれに加えた。ボトルに蓋をし、振盪し、冷蔵庫に５℃で一晩保存した。

冷蔵庫からボトルを取り出し、２５００RPMで遠心分離し、上清をデカンテーションした。ＭＴＢＥ中の、
２２０mLの２％ＤＩＥＡを各ボトルに加えた。ボトルに蓋をし、振盪し、遠心分離した。上清をデカンテーションし、
２２０mLのＭＴＢＥを各ボトルに加え、振盪し、デカンテーションした。３回目に
２２０mLのＭＴＢＥを用いてこの操作を繰り返した。結果として生じた湿潤固体を２００Torrの真空下で一晩乾燥させた。注:真空は徐々に適用しなければならない。さもなければペプチドの損失を伴い突沸する。
粗乾燥線状ヘキサペプチドの重量＝４７．０５g

実施例５
シクロ（Ａｓｐ−Ｌｙｓ）ペンタノイル−Ａｓｐ−（４−ＭｅＯＡｐｃ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２

装置：２Ｌジャケット付き容器、タービン撹拌装置、窒素および真空の導入部、熱電対、定量ポンプ
手順
２Ｌ容器に
４９．４６ｇのＨＢＴＵおよび
１．５ＬのＤＭＦをチャージした。溶解するまで２０〜２５℃で撹拌した。
５０．０ｇのペンタノイル−Ａｓｐ−（４−ＭｅＯＡｐｃ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２を
１．５ＬのＤＭＦに溶かした溶液であって、
５０ｍＬのＤＩＥＡを含有する溶液を調製した。撹拌を１３９RPMに調整し、速度２５mL/分で２０〜２５℃で約１時間線状ヘキサペプチド溶液中で計量した。分析のために反応物をサンプリングした。反応は完了したことが見出され、次いで、
１００mLのＤＩ水を加えて反応をクエンチさせた。２Ｌ丸底フラスコに２回に分けて溶液を移し、浴温３０℃のロータリーエバポレーターで＜９Torrの圧の真空下で溶媒を蒸留した。
粗生成物の重量＝１５４．１１ｇ
アッセイ＝１０％w/w（含有されるペプチド１５．４ｇ）

実施例６
クロマトグラフィー精製：シクロ（Ａｓｐ−Ｌｙｓ）ペンタノイル−Ａｓｐ−（４−ＭｅＯ−Ａｐｃ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２ １：１トリフルオロ酢酸塩

毒性実験のために、環状ＭＣ−４ヘキサペプチドの三つの粗バッチに精製クロマトグラフィーを行った。低ｐＨでPursuit C18（１０ミクロン、５０×２５０mm）カラムで精製を行った。含有される全体収率は８５％で、全体純度は９４％であった。三つのバッチについての最初の粗純度は１０wt％以下であった。低い粗純度はロード能を減少させ、注入溶液濾過の重大な問題を与えた。合計３５回の注入を完了した。３５回の注入のうち、２８回は粗物質の注入であり、７回はリサイクルの注入であった。クロマトグラフィーにより、含有された３９．７ｇの粗環状ＭＣ−４から３３．７ｇの精製環状ＭＣ−４が得られた。この精製のためのプールは、毒性学的物質用に９０％代半ばをターゲットとした。純度を９０％代後半に上げると、この精製での分画分析に基づき、予測される収率は５０〜６０％に減少するであろう。

調製用クロマトグラフィー：
注入溶液：粗製環状ＭＣ−４から固体不含の１．５mg/mL（環状ＭＣ−４含有）注入溶液への調製は、単離された粗製物の低いアッセイ値および高い塩含量により達成された。（表１）いくつかの異なる濾過条件を、最良の濾過を与える漸減する孔径のガラス繊維フィルターの三層で試した。直径１２５mmのフィルターを使用したこのフィルターの配置は、注入溶液５００mLを濾過するのにうまく役立った。これは、各１０００mLの注入を２回の別々の濾過に分け、注入用に濾液を混合し直すことを必要とした。

緩衝液調製物：調製用緩衝液は、移動相Ａおよび移動相Ｂの両方について２０Ｌ瓶に調製した。両移動相は、ｐＨが約２となる０．１％ＴＦＡ溶液であった。二つの移動相溶液を環状ＭＣ−４の精製に使用した。全てのパーセントは体積パーセントである。
移動相Ａは、９０／１０ Ｈ_２Ｏ／ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ
移動相Ｂは、１０／９０ Ｈ_２Ｏ／ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ

クロマトグラフィー条件：環状ＭＣ−４は、充填済みVarian Pursuit C18カラム（１０ミクロン、５０×２５０mm）で精製した。注入溶液をロードするための広孔径溶媒スイッチングバルブおよびフラクション採集のための１３ポジションバルブを備えるAgilent 1100調製用ＨＰＬＣを使用した。各注入は、粗アッセイに基づき含有される環状ＭＣ−４が１．０ｇから１．５ｇまで変動した。５個以上の画分を各注入から採集し、ＨＰＬＣの画分分析に基づき混合した。注入１回あたりのサイクル時間は約２時間であった。以下の溶出条件が最良の精製結果のために最適であることが見出された：
カラム： Pursuit C18、１０ミクロン、５０×２５０mm
検出器： ２８０nm（バンド幅８nm、参照３５０／２０nm）
カラム温度： 室温
流速： ８０ml/分
移動相： Ａ＝９０／１０ Ｈ_２Ｏ／ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ
Ｂ＝１０／９０ Ｈ_２Ｏ／ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ
試料のロード： ポンプＡのスイッチングバルブを経由して６０mL/分で手動
勾配： 初期条件２５％Ｂ
０〜４５分 ５７％Ｂに直線勾配
４５．０〜４５．１分 ７０％Ｂに工程変化
４５．１〜５５．０分 ７０％Ｂに維持（カラムのフラッシュ）
５５．０〜５２．０ ２５％Ｂに直線勾配
５２．０〜７２．０ ２５％Ｂ（カラムの再平衡化）

リサイクル注入：前部削除および後部削除のためのリサイクル注入は、プールした画分を等体積の水で希釈し、カラムに注入し戻すことにより、再注入した。リサイクルのために同じ勾配条件を使用した。

粗注入溶液の調製：３回の実験室運転から単離された粗製物を注入溶液の調製に使用した。粗製物の純度は８％〜１０％の含有純度であった。粗バッチの全ては高度に着色しており、不溶性の固体を含有した。注入溶液中の環状ＭＣ−４の望ましい最終濾過済み濃度は１．５mg/mL（含有量）であった。粗製物のｗ／ｗアッセイに依存して、最終的な実際の濃度は、単離された粗製物が約１５mg/mLであろう。

以下の手順を使用して、濾過用の注入溶液１０７２mLを調製した：ｗ／ｗアッセイに基づき、含有される環状ＭＣ−４の１．５ｇを１６０mLのＤＭＦに溶解させる。溶解した溶液を静かに撹拌しながら、０１％ＴＦＡを含有する１６０ｍＬのＡＣＮを加える。撹拌を続けながら、０．１％ＴＦＡを含有する７５２ｍＬの水を加える。次いで、この粗溶液を漸減する孔径のガラスフィルター（Whatman）の三層を通して濾過する。
上：ＧＦ／Ｄ孔径２．７μm（１８２３１２５）
中央：ＧＦ／Ｃ孔径１．２μm（１８２２１２５）
下：ＧＦ／Ｆ孔径０．７μm（１８２５１２５）

直径１２５mmのフィルターを使用したこのフィルターの配置は、注入溶液５００mLを減圧濾過するために使用される。これは、１０００mLの注入のそれぞれを２回の別々の濾過に分けること、注入のために濾液をもう一度混合することを必要とする。最終濾液は室温で注入直前に完成した。濾液を冷却したり、周囲温度で長時間放置すると、液の濁りを引き起こすであろう。この手順は、必要に応じて規模を拡大または縮小してもよい。

表２の時間配分を使用してフラクションコレクターによりカラムの流出液から画分を採取した。これらの時間は必要に応じて調整した。

実施例７
塩交換：シクロ（Ａｓｐ−Ｌｙｓ）ペンタノイル−Ａｓｐ−（４−ＭｅＯ−Ａｐｃ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２ １：１酢酸塩

環状ＭＣ−４のＴＦＡ塩のプールを凍結乾燥酢酸塩に変換した。

装置
５．０×２５cm Vydak C4、１ミクロン、３００Åプレパックカラム
調整可能な波長検出器を備える二ポンプ調製システム（モデル２１０ローディングポンプ、モデル２１５溶出ポンプおよびモデル３２０検出器を備えるVarian Prostarシステムと等価）。

移動相
Ａ：１０％アセトニトリル／脱イオンＨ_２Ｏ、２０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ
Ｂ：７０％アセトニトリル／脱イオンＨ_２Ｏ、２０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ

プールの調製
混合した精製プール画分を脱イオンＨ_２Ｏで（約２５％アセトニトリルに）１：１希釈する。

プールのロード
ロードは、２５mL/分でカラムに約１０ｇの環状ＭＣ−４（約１．２５g/L濃度で約８Ｌ）である。これは約５時間かかる。

溶出
カラムを約５当量のＮＨ_４ＯＡｃでフラッシュ後に、生成物を溶出させる。流速５０mL/分、検出器は２８０nm

生成物のピークを全体積５００mLについて１０分間かけて収集し、風袋を差し引いた５００mL広口ポリボトル４個に分割してから凍結乾燥した。４個のボトルからの固体生成物を採集した。
重量＝１０．４９ｇ

実施例８
塩交換：シクロ（Ａｓｐ−Ｌｙｓ）ペンタノイル−Ａｓｐ−（４−ＭｅＯ−Ａｐｃ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２ １：１乳酸塩

乳酸、ラセミ体、米国薬局方のSpectrum chemical Mfg. Corp.カタログ番号Ｌ１０１０、ＣＡＳ ５０−２１−５、アッセイ８８．０〜９２．０％

０．１Ｎ乳酸溶液を作製
５．０ｇのシクロ（Ａｓｐ−Ｌｙｓ）ペンタノイル−Ａｓｐ−（４−ＭｅＯ−Ａｐｃ）−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＮＨ_２ １：１酢酸塩を最小限の体積の１／１アセトニトリル／Ｈ_２Ｏ（ＡＣＮ／Ｈ_２Ｏ）４０〜５０mLに溶解させ、それに０．１Ｎ乳酸溶液を４５．１５４mL加える。この溶液をやや濁るまでさらに希釈して、次いで凍結し、凍結乾燥する。（いったん固体粉末になったものを真空下で放置すると、存在する酢酸の量が減少する）。凍結乾燥した粉末をＤＭＳＯ−Ｄ６中に２．０ｍｇで、ＮＭＲにより、δ１．１６（乳酸のメチル）およびδ０．８２（ペンタノイルの末端ＣＨ_３）のピークと比較して分析する。これらのピークは、１：１の比でなければならない（mmとして測定することができ、比が得られる）。比が逸脱しているならば、酢酸塩（高すぎるとき）または追加の０．１Ｎ乳酸溶液のいずれかの添加により調整することができる。（装置の大きさが原因で５．０ｇが最大実施規模である。二つの５．０ｇバッチもまた、３７５μＬの８８．０〜９２．０％乳酸で処理したが、最初のＮＭＲ後に乳酸塩が６７〜６９％であると示された。２００μＬの８８．０〜９２．０％乳酸の添加後および再凍結乾燥後に、最終比１．０〜１．０９の乳酸塩が得られた。）

Claims (13)

1. 以下の工程：
   樹脂上にジペプチドフラグメントを調製する工程であって、該ジペプチドフラグメントが、第１の側鎖を含む酸性アミノ酸残基を含む工程；
   該樹脂から第１のペプチドフラグメントを切断する工程；
   樹脂上に第２のペプチドフラグメントを調製する工程であって、該第２のペプチドが第２の側鎖を有するアミノ酸残基を含む工程；
   該第２のペプチドフラグメントのアミノ末端に該ジペプチドフラグメントのカルボキシル末端をカップリングすることによって、第３のペプチドを形成させる工程；および
   該ジペプチド部分の該第１の側鎖を該第２のペプチド部分の該第２の側鎖と共有結合させることにより該第３のペプチドを環化させる工程
   を含む、環状ペプチドの形成方法。
2. 該ジペプチドフラグメントが、カルボキシ末端の非天然アミノ酸を含む、請求項１記載の方法。
3. 該ジペプチドフラグメントが、アミノ末端のアスパラギン酸残基を含む、請求項１記載の方法。
4. 該ジペプチドフラグメントが、請求項１０記載の式Ｉで示されるアスパラギン酸ジペプチドを含む、請求項３記載の方法。
5. 該第２のペプチドが、テトラペプチドを含む、請求項１記載の方法。
6. 該第２のペプチドが、アミノ末端のＤ−アミノ酸残基を含む、請求項１記載の方法。
7. 該第２のペプチドが、アミノ末端のＤ−フェニルアラニン残基を含む、請求項６記載の方法。
8. 該第２のペプチドの塩基性アミノ酸残基が、リシン残基を含む、請求項１記載の方法。
9. 該第３のペプチドを樹脂から切断する工程を含む請求項１記載の方法であって、該工程が、環化工程の前に行われる、方法。
10. 式Ｉ：
    

    

    
    ［式中、
    Ｒ^１は、アルキル保護基であり；
    Ｘは：
    

    

    
    ［式中、
    Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、独立して水素、または１〜４個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐のアルコキシであり、ここで、Ｒ^３が、アルコキシであるとき、Ｒ^２およびＲ^４は、共に水素であり、Ｒ^９は、水素、１〜３個の炭素を有する直鎖もしくは分岐のアルキル、１〜３個の炭素を有する直鎖もしくは分岐のアルコキシ、または非置換フェノキシであり、Ｒ^１１は、シクロヘキシル、シクロヘプチル、または３〜８個の炭素原子を有する分岐のアルキルである］であり、
    Ｒ^１２は、１〜５個の炭素原子を有するアルキル、２〜５個の炭素原子を有するアルケニル、または２〜５個の炭素原子を有するアルキニルであり；そして
    Ｒ^１０は、Ｈまたはハロゲンである］で示されるアスパラギン酸ジペプチド。
11. 以下の工程：
    請求項１０記載の式Ｉで示されるアスパラギン酸ジペプチドを樹脂上に合成する工程；
    該樹脂から該アスパラギン酸ジペプチドを切断する工程；
    配列：Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓを含む第２のペプチドフラグメントを提供する工程であって、該第２のペプチドフラグメントが、樹脂に結合している工程；
    該第２のペプチドフラグメントのアミノ末端に該ジペプチドのカルボキシル末端をカップリングすることにより、配列［式Ｉ］−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓを有するペプチドを形成させる工程；
    該アスパラギン酸残基の該側鎖を該リシン残基の該側鎖と共有結合させることにより該［式Ｉ］−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓペプチドを環化する工程
    を含む、環状メラノコルチン−４レセプターアゴニストペプチドを形成させる方法。
12. 該ジペプチドフラグメントが、式Ｉ：
    

    

    
    ［式中、
    Ｒ^１は、アルキル保護基であり；
    Ｘは：
    

    

    
    ［式中、
    Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４は、独立して水素、または１〜４個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐のアルコキシであり、ここで、Ｒ^３が、アルコキシであるとき、Ｒ^２およびＲ^４は、共に水素であり、Ｒ^９は、水素、１〜３個の炭素を有する直鎖もしくは分岐のアルキル、１〜３個の炭素を有する直鎖もしくは分岐のアルコキシ、または非置換フェノキシであり、Ｒ^１１は、シクロヘキシル、シクロヘプチル、または３〜８個の炭素原子を有する分岐のアルキルである］であり、
    Ｒ^１２は、１〜５個の炭素原子を有するアルキル、２〜５個の炭素原子を有するアルケニル、または２〜５個の炭素原子を有するアルキニルであり；そして
    Ｒ^１０は、Ｈまたはハロゲンである］で示されるアスパラギン酸ジペプチドを含む、請求項３記載の方法。
13. 本明細書に前述の発明。