JP2010513363A - ナノエマルジョン - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１つの水性成分と担体とを含むナノエマルジョンであって、担体は少なくとも１つの親油性成分と、少なくとも１つの界面活性剤と、少なくとも１つのアルコールとを含み、少なくとも１つのアルコールは少なくとも３つの炭素原子を有することを特徴とする、ナノエマルジョンに関する。本発明は、さらに、前記ナノエマルジョンと活性剤とを含む組成物に関する。具体的には、組成物はゲルとして存在し、活性剤は５−アミノレブリン酸、その誘導体、前駆体、および／または代謝生成物である。本発明は、さらに、前記ナノエマルジョンおよび／または組成物の製造、および皮膚疾患、ウイルス関連疾患、ならびに細胞増殖関連疾患、具体的には腫瘍疾患および／または乾癬の処置のためのそれらの使用に関する。本発明は、さらに、前記ナノエマルジョンの化粧品における使用も対象とする。

Description

本発明は、少なくとも１つの水性成分と担体とを含むナノエマルジョンであって、担体は少なくとも１つの親油性成分と、少なくとも１つの界面活性剤と、少なくとも１つのアルコールとを含むナノエマルジョンに関する。本発明は、さらに、前記ナノエマルジョンと活性剤とを含む組成物に関する。具体的には、組成物はゲルとして存在し、活性剤は５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）、その誘導体、前駆体、および／または代謝生成物である。本発明は、さらに、前記ナノエマルジョンおよび／または組成物の製造、および皮膚疾患、ウイルス関連疾患、ならびに細胞増殖関連疾患、具体的には腫瘍疾患および／または乾癬の処置のためのそれらの使用に関する。本発明は、さらに、前記ナノエマルジョンの化粧品における使用も対象とする。

ナノエマルジョンは、コロイド系を構成する。コロイド系には、ミセル、リポソーム、ビロソーム、ナノ懸濁液、マイクロエマルジョン、およびポリマー溶液が含まれる。ナノエマルジョンは、その物理学的および化学的特徴に基づき、マイクロエマルジョンのグループに属する。マイクロエマルジョンは、界面活性剤および共界面活性剤の単層で包囲された脂質コアから構成される均質なマイクロサイズ粒子の水性分散液である。ナノエマルジョンは、２００ｎｍ未満であり、しばしば１００ｎｍ未満の平均粒径（平均直径）と、狭い単分散粒径分布とを特徴とする。さらに、ナノエマルジョンは透明であり、わずかに乳白光を放つ。これらは一般的に、界面活性剤の存在下、水相中で油相を機械的に断片化することによって製造される。非常に小さいサイズの油性小球は、多くの場合、高圧ホモジナイザーまたはソニケーターを少なくとも１回通過させることによって得られる。本明細書に記載されるナノエマルジョンの製造は、かかる高せん断装置を必要としない。小球の小さいサイズおよびその高い均質性は、それらを従来の乳剤と区別する美容に有利な特性を与える。それらは透明であって、新規の質感を示す。さらに、それらは活性剤をより効率的に運搬することができ、したがって医療および薬学の分野においてますます重要となっている。

ナノ分散液と称されるマイクロエマルジョンは、当該技術分野で公知であり、ａ）膜形成分子、例えば大豆レシチン、ｂ）共乳化剤、ｃ）親油性成分、例えばカプリルおよび／またはカプリントリグリセリド（ミグリオール ８１２またはＭｙｒｉｔｏｌ ３１８）、および場合によっては、ｄ）アルコール、具体的にはエタノール（ＥＰ ０ ９５６ ８５３）を含む。これらのナノ分散液は、薬学的活性剤の輸送媒体として、医薬製剤に使用される。

しかしながら、ナノエマルジョン中にエタノールを使用すると、いくつかの不利益を被る。

第１に、共界面活性剤としてのエタノールの使用は、より長い炭素鎖を有するアルコールの使用よりも大きいナノ粒子をもたらす。より大きい粒子は、皮膚とナノエマルジョンとの間の接触面を減少させ、浸透率の低下を引き起こす。第２に、エタノールは、比較的低い１．１０ｃｐの粘度を有し、これはマイクロエマルジョンの安定性に最適ではない。さらに、エタノールの比較的低い疎水性により、皮膚の親油性生理膜を通してのナノエマルジョンの浸透が損なわれうる。結果として、ナノエマルジョンの安定性、ならびにその生物学的利用能、すなわち組織内への浸透が低下する。さらに、エタノールは、イソプロピルアルコールなどの他の種類のアルコールと比較して、高価なアルコールである。さらに、エタノールは、複数の国において、一定の条件下で特別なアルコール税の対象となる。

したがって、本発明の目的は、従来技術において言及した不利点を克服し、また具体的には、安定性ならびに細胞および組織内への浸透を向上させうる最適な物理学的特性を示し、同時に最新技術のナノエマルジョンよりも安価なナノエマルジョンを提供することであった。

この目的は、ａ）少なくとも１つの水性成分と、ｂ）ｉ）少なくとも１つの親油性成分、ｉｉ）少なくとも１つの界面活性剤、およびｉｉｉ）少なくとも１つのアルコールを含む担体であって、少なくとも１つのアルコールは少なくとも３つの炭素原子を有する担体と、を含むナノエマルジョンを提供することにより、本発明によって達成される。

発明者は、本発明によるナノエマルジョンは、最適に低い平均粒径と狭い粒径分布を有することを発見した。粒径の減少は、ナノエマルジョンの安定性の増加と、細胞および組織内への浸透の向上に寄与する。

担体の成分ｉ）、すなわち親油性成分の量は、ナノエマルジョンの総質量に対して、好ましくは０．１質量％〜１５質量％、より好ましくは１質量％〜８質量％、また最も好ましくは３質量％〜４質量％の量で存在する。担体の成分ｉｉ）、すなわち界面活性剤量は、ナノエマルジョンの総質量に対して、好ましくは１質量％〜３０質量％、より好ましくは２質量％〜１５質量％、また最も好ましくは４質量％〜６質量％の量で存在する。担体の成分ｉｉｉ）、すなわちアルコールは、ナノエマルジョンの総質量に対して、好ましくは０．１質量％〜１０質量％、より好ましくは０．５質量％〜５質量％、また最も好ましくは１質量％〜２質量％の量で存在する。

水性成分は、ナノエマルジョンの総質量に対して、好ましくは５０質量％〜９８質量％、より好ましくは７０質量％〜９５質量％、また最も好ましくは８８質量％〜９２質量％の量でナノエマルジョン中に存在する。有利には、ナノエマルジョンのこの特定の構成は、皮膚に対して極めて許容可能であり、皮膚への塗布時にべたついた感触を生じないナノエマルジョンをもたらすが、これはとりわけ、界面活性剤と親油性成分の比較的低い比率による。

本発明の好適な実施形態では、ナノエマルジョンは、界面活性として、膜形成界面活性剤およびＯ／Ｗ乳剤形成共界面活性剤を含む。膜形成界面活性剤：Ｏ／Ｗ乳剤形成共界面活性剤の量の質量比は、０．１：１〜１０：１、好ましくは０．２：１〜０．８：１、より好ましくは０．４：１〜０．６：１の範囲である。

本発明の適用範囲内の少なくとも３個の炭素原子を有する好適なアルコールは、３〜１０個、好ましくは３〜７個、より好ましくは３〜５個、また最も好ましくは３個の炭素原子を有するアルコールである。炭素原子５個を有する特に適切なアルコールは、１−ペンタノールおよび／または４−メチル−２−ペンタノールである。炭素原子４個を有する適切なアルコールは、１−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（２−メチル−２−プロパノール）、および／またはｓｅｃ−ブチルアルコール（２−ブタノール）である。最も好適なものは、炭素原子３個を有するアルコール、すなわち１−プロピルアルコールおよびイソプロピルアルコールであり、イソプロピルアルコールが好ましい。本発明のナノエマルジョンに、Ｃ₃−アルコール、具体的にはイソプロピルアルコールを使用することにより、本発明者らは、このナノエマルジョンが、アルコールとしてエタノールを使用する最新技術のナノエマルジョンと比較して、減少した粒径およびより狭い粒径分布、ならびに安定性の改善および組織内への浸透の促進を示すことを発見した。イソプロパノールとエタノールとは、その生理学的および化学的特性が非常に類似していることから、これは意外なことであった。

本発明のナノエマルジョンにアルコールとしてイソプロパノールを使用する場合、エタノールの使用と比較して、乳化粒子のサイズが小さい。結果として得られるナノエマルジョンの皮膚との接触面の増加により、浸透特性が向上する。また粒径の減少も、最終的に相分離につながる粒子凝集の速度は粒径に伴って増加することが知られていることから、ナノエマルジョンの安定性の改善には決定的に重要である。イソプロパノールの有利な効果は、そのわずかに高い疎水性による可能性があり、これは親油性生理膜を通して浸透するより優れた能力をもたらしうる。さらに、イソプロパノールは、エタノール（粘度／ｃｐ、２５℃、１．１０）と比較してより高い粘度（２５℃でｃｐ２．３２）を有する。前記のイソプロパノールのより高い粘度は、粘度が分子の移動度を低下させるため、ナノエマルジョンにおけるより優れた安定化機構に役立ちうる。エタノールと比較したイソプロパノールのさらなる利点には、エタノールの価格の約１／３という比較的低価格で入手でき、付加的なアルコール税が免除されることがある。

好ましくは、本発明のナノエマルジョンの担体の少なくとも１つの親油性成分は、脂質、植物油、および／または動物油である。本発明による適切な脂質は、生理学的に許容される脂質、例えばセラミド、モノ−、ジ−、およびトリアシルグリセリン（トリグリセリド）、特にカプリルおよび／またはカプリントリグリセリド、および／またはそれらの混合物、特に好ましくはミグリオール（例えばＨｅｎｋｅｌから入手可能な、ミグリオール ８１２またはＭｙｒｉｔｏｌ ３１８など）である。適切な植物油および動物油は、例えば、ひまわり油、大豆油、落花生油、菜種油、魚油、および／または鯨蝋である。

適切な膜形成界面活性剤は、リン脂質、リゾリン脂質、セラミド、および／またはそれらの混合物である。好ましくは、リン脂質は大豆または鶏卵由来のレシチンまたはセファリン、より好ましくは、レシチンは大豆レシチンである。

好ましくは、レシチンは、ホスファチジルコリン含有量少なくとも８０質量％、より好ましくは少なくとも９０質量％、また最も好ましくは少なくとも９４質量％を有する。発明者らは、レシチンの質、すなわちそのホスファチジルコリン含有量は、ナノエマルジョンの粒径に重大な影響を与えることを見いだした。レシチンのホスファチジルコリン含有量が高いほど、ナノエマルジョンの粒径は小さくなる。

Ｏ／Ｗ乳剤形成共界面活性剤としては、アニオン性、非イオン性、カチオン性、および／または両性の界面活性剤が、ブロックコポリマーに加えて適している。適切なアニオン性界面活性剤は、石けん、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、および／またはアルキルエーテル硫酸塩である。適切なカチオン性界面活性剤は、４級アンモニウム化合物、好ましくは１個または２個の疎水性基を有するもの（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウムおよび塩化セチルトリメチルアンモニウム）、および／または長鎖１級アミンの塩である。適切な両性界面活性剤は、Ｎ−（アシルアミドアルキル）ベタイン、Ｎ−アルキル−β−アミノプロピオン酸塩、および／またはアミン−Ｎ−オキシドである。適切なブロックコポリマーは、例えばプロピレンオキシドである。本発明の適用範囲において、非イオン性界面活性剤は、Ｏ／Ｗ乳剤形成共界面活性剤として特に好適である。適切な非イオン性界面活性剤は、脂肪アルコールポリグリコールエーテル、アルキルフェノールポリグリコールエーテル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸グルカミド、脂肪酸ポリグリコールエーテル、エチレンオキシド−プロピレンオキシド−ブロックポリマー、ポリグリセロール脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、および（エトキシル化）ソルビタン脂肪酸エステル（ソルビタン）からなる群から選択される。特に好適なエトキシル化ソルビタン脂肪酸エステルは、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、最も好ましくはポリソルベート８０である。

本発明のナノエマルジョンの水性成分は、好ましくは塩含有量の少ない弱い緩衝系、より好ましくは５ｍＭ〜３０ｍＭのリン酸緩衝液、また最も好ましくは１０ｍＭのリン酸緩衝液を含む。リン酸緩衝液のｐＨ値は、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ８、より好ましくはｐＨ５〜ｐＨ７、また最も好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ６．５の範囲である。リン酸緩衝液を製造するための水は、好ましくは滅菌脱イオン水および／または注射用水、より好ましくは注射用水である。

ナノエマルジョン中の乳化粒子（ナノソーム）の平均直径は、５ｎｍ〜５００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜２００ｎｍ、より好ましくは１００ｎｍ未満、特に９０ｎｍまで、好ましくは７０ｎｍまで、さらに好ましくは１０ｎｍ〜５０ｎｍ、また最も好ましくは１５ｎｍ〜３５ｎｍである。ナノ粒子のサイズ分布は、好ましくは単分散であり、ガウス分布に従う。本発明の乳化粒子の直径は、粒径分布を用いて判断されるが、これは動的光散乱（ＤＬＳ）（光子相関分光法（ＰＣＳ）とも称される）の方法によって測定される。粒子分布の統計的解析は、本発明に従って、粒子数加重分布と称される方法によって実施される。

本発明のさらなる主題は、本発明によるナノエマルジョンの製造のための方法であって、ａ）水性成分を提供するステップと、ｂ）少なくとも１つの親油性成分と、少なくとも１つの界面活性剤と、少なくとも１つのアルコールとを含む担体であって、少なくとも１つのアルコールは少なくとも３つの炭素原子を有する担体を提供するステップと、ｃ）ステップａ）の水性成分をステップｂ）の担体と混合するステップとを含む方法である。ナノエマルジョンを製造することによって、担体の成分が水性成分中に提供され、その混合物は、激しいあるいは穏やかな均質化によってナノエマルジョンに変換される。均質化は、例えば市販のホモジナイザーによって実施してもよい。ナノエマルジョンの製造後、均質化中に存在することが適当ではないさらなる添加物および賦形剤を添加してもよい。

ナノエマルジョンの製造のための方法は、好ましくは無菌状態下で、例えば層流フードを用いて実施する。

発明者らは、組成以外に、製造方法のいくつかのステップも、ナノエマルジョン中の乳化粒子の最終的なサイズおよび粒径分布にとって決定的に重要であることを見いだした。特に、ステップｃ時の温度および均質化の条件は、重要な役割を果たす。ステップｃは、５０〜６０℃の温度で実施する。全ての原料は、あらかじめこの温度まで加熱する。また、容器およびミキサーは、非常に迅速に（数秒内に）成分の均質な混合物を得るために最適化して、泡の形成を回避するべきである。かかる手順の説明は、実施例１を参照されたい。あるいは、均質化は、ソニケーターまたは高圧ホモジナイザーなどの高せん断装置を必要としない。

本発明の別の態様は、本発明のナノエマルジョンを含む医療用および／または美容用組成物である。本発明のナノエマルジョンは、多様な製品タイプに使用することができる上品な半透明および透明の媒体を提供するため、化粧品の分野において、例えば抗老化剤として適している。このナノエマルジョンは、非常に精巧なバランスの系を提供するが、これは刺激性であると考えられる乳化剤を比較的低レベルで有する。本発明のナノエマルジョンは、望ましい透明性または半透明性を保持し、適当な量の添加剤、例えば香料または保湿剤を受け入れることができるが、低レベルの乳化剤により、使用者の皮膚上では安定し、刺激が少なく、かつ穏やかな状態を保つ。化粧品の場合の最終製品の使用目的で、非治療剤または非活性剤、例えば皮膚軟化剤、香味料、着色剤、香料、ゲル化剤、増粘剤、日焼け止めなどを添加することが可能であり、これらは製品の最終的な使用を特に局所美容目的の場合に向上させるが、ただし製品の澄明度を妨げる成分を選択することを避けるように注意する。最終製品は、とりわけ、乳液、クリーム、ローション、ゲル、セラム、または液体スプレーの形態をとることができる。日焼け止めの場合、本発明のナノエマルジョンは、１つ以上の日焼け止め剤、例えばベンゾフェノン、アヴォベンゾン、桂皮酸エステル、サリチル酸エステルなどを組み込むことができる。

ナノエマルジョンは、医薬組成物にも使用することができるが、具体的には、これらは皮膚疾患、例えば神経皮膚炎、乾癬、角化症、特に光線角化症、および細胞増殖関連疾患、例えば腫瘍疾患処置用の局所用薬物の製造に用いることができる。好ましくは、腫瘍疾患は、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、ボーエン病、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、または結節性もしくは皮下癌疾患からなる群から選択される。さらに、ナノエマルジョンは、尖圭コンジロームなどのヒトパピローマウイルスに起因するウイルス関連疾患の処置に適している。ナノエマルジョンの親油性成分を取り込むことにより、経皮水分喪失に有利な影響を与えることができる。すなわち、皮膚のバリア機能を向上させ、それによって神経皮膚炎などの皮膚疾患に有利に作用しうる。

本発明の別の態様は、本発明のナノエマルジョンと活性剤とを含む組成物に関する。この点において、組成物は、医療用および／または美容用組成物として、例えば皮膚または毛髪への適用に特に有用である。前記の組成物に含まれる本発明のナノエマルジョンは、多様な活性剤の非常に効率的な送達系を提供する。有用でありうる活性剤の例には、染み、角化症、およびしわの根絶のための物質、鎮痛薬、麻酔薬、抗ざ瘡剤、抗菌薬、抗酵母菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗フケ剤、抗皮膚炎剤、鎮痒薬、制吐薬、抗動揺病薬、抗炎症薬、抗高角質溶解薬、抗乾燥肌剤、制汗剤、乾癬治療薬、抗脂漏剤、ヘアコンディショナーおよびヘアトリートメント剤、抗老化剤、抗しわ剤、抗ぜんそく薬および気管支拡張薬、日焼け止め剤、抗ヒスタミン剤、皮膚美白剤、脱色剤、ビタミン、コルチコステロイド、ホルモン、レチノイン酸およびレチノールなどのレチノイド、局所心血管剤、クロトリマゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、グリセオフルビン、ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、プラモキシン、リドカイン、プロカイン、メピバカイン、モノベンゾン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、カナマイシン、メクロサイクリン、ハイドロキノン、ミノサイクリン、ナプロキセン、イブプロフェン、テオフィリン、クロモリン、アルブテロール、局所ステロイド類、例えばヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン２１−アセテート、ヒドロコルチゾン１７−バレエート、およびヒドロコルチゾン１７−ブチレート、吉草酸ベタメタゾン、ジプロプリオン酸ベタメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノニド、プロプリオン酸クロベタゾール、過酸化ベンゾイル、クロタミトン、プロプラノロール、プロメタジン、ビタミンＡパルミテート、ビタミンＥアセテート、ならびにそれらの混合物が含まれる。

本発明の好適な実施形態では、活性剤は、５−アミノレブリン酸、その誘導体、前駆体、および／または代謝生成物からなる群から選択される。「誘導体」は、１個または２個のアルキル基、特に好ましくは１個のメチル基で置換された５−アミノレブリン酸のアミノ基のエステル化として理解される。最も好適な誘導体は、メチルアミノレブリン酸である。誘導体化は、塩錯体および付加化合物、ならびにアルキル化化合物としても理解することができる。「前駆体」および「代謝生成物」は、細胞中でプロトポルフィリンＩＸに変換された物質として理解される。活性剤の５−アミノレブリン酸またはその誘導体は、特に好ましい。

５−アミノレブリン酸は、光線力学療法におけるプロドラッグとして使用される。光線力学療法は、細胞増殖に関連する様々な前悪性および悪性疾患の処置のための有望な方法である（Ｔａｙｌｏｒ ＥＬ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ ＳＢ， ２００２， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， １３， Ｓｕｐｐｌ． １， Ｓ３−１１、およびＰｅｎｇ Ｑ． ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃａｎｃｅｒ， ７９， Ｓ２２８２−２３０８）。光線力学療法の原理は、いわゆる光感作薬の病変組織内に導入し、その後適切な波長の光線を放射することによって、その薬剤を細胞傷害活性を有する薬剤に転換し、それによって細胞破壊を生じることに基づく。本方法の選択性は、高速増殖細胞または病変細胞では、正常組織と比較して、感作薬の濃度が高いことによる。さらに、光感受性物質の照射は特徴的な蛍光放射を生じさせ、これは診断目的で、例えば増殖細胞を検出するために使用できる。

５−アミノレブリン酸は、細胞内でグリシンとスクシニルＣｏＡとから合成される内因性物質である。ヘム生合成の範囲内で、高い光活性を有するプロトポルフィリンＩＸが５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）から形成され、その後ヘムに変換される。この抑制機構は、合成によって製造した５−アミノレブリン酸を外部から投与することによって回避され、それによってプロトポルフィリンＩＸの生成の増加を引き起こす。プロトポルフィリンＩＸの分解は天然の抑制機構によってさらに阻害されるため、この化合物は細胞内に集積する。光線を照射すると、プロトポルフィリンＩＸは、光化学酸化反応を起こし、その結果、光線力学療法の光感受性物質として作用する。

５−アミノレブリン酸の全身適用は、複数の副作用に関連するが、この薬品を局所適用することによって回避できる。局所適用可能な５−アミノレブリン酸組成物を用いた複数の研究は、従来技術から公知である。これらの研究は、使用する５−アミノレブリン酸が水中油型乳剤の形態であるという共通の特徴を有するが、その他のパラメータ、例えば浸透時間、処置時間、使用する光線の種類、および使用する光線の線量などに関しては相違する。

Ｂ． Ｔｈｉｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｈ＋Ｇ， Ｖｏｌ． ６９， Ｎｏ． ３， ｐｐ １６１−１６４ （１９９４））は、水中油型乳剤の形態で２０％のδ−アミノレブリン酸を浸透時間５〜６時間で用い、その後アルゴンイオン−ポンプ色素レーザー（発光ピーク６３０ｎｍ）で照射し、累積総線量５０〜１００Ｊ／ｃｍ²を付与することを含む研究を記載している。

Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２８， ｐｐ． １７−２１， １９９３）は、水中油型乳剤の形態で２０％の５−アミノレブリン酸を浸透時間４、６、または８時間で用い、フィルターをかけていない光線または赤色光で照射し、３０Ｊ／ｃｍ²〜１００Ｊ／ｃｍ²の光線量を付与することを含む研究を記載している。

従来技術において開示されている研究は、５−アミノレブリン酸を用いた光線力学療法の有望な可能性を明らかに示しているが、これまでに知られている水中油型乳剤は、複数の不利点を有する。

例えば、Ｍ． Ｎｏｖｏ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．（ＳＰＩＥ， Ｖｏｌ． ２３７１， ｐｐ． ２０４−２０９）は、臨床適用に要求される高濃度では、アミノレブリン酸は、中性から塩基性のｐＨ領域の水性溶液中で不安定であることを示している。２５時間の研究時間中、満足のいく結果は、濃度３％およびｐＨ５においてのみ得られ、これらは５−アミノレブリン酸の水性溶液に対する最適条件として明記されている。しかし臨床使用では、一般的に、より高い濃度範囲の組成物を提供することも必要となるであろう。さらに、市販で使用するためには、５−ＡＬＡ溶液は、数週間または数ヶ月の規模の期間安定でなければならない。

Ｖ． ｖｏｎ Ａｒｘ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４９： ６５２−６５６， １９９７）は、５−アミノレブリン酸の様々なゲルでの局所適用に関する研究を記載している。この出版物は、５−アミノレブリン酸の安定性を維持するための最高の処方は、ｐＨ＜６における、Ｎｏｖｅｏｎ ＡＡ−１（ポリアクリル酸）との組み合わせであると記載している。

Ｈｕｅｒｌｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １９７， Ｎｏ．３， １９９８， ｐｐ． ２４８−２５４）は、５−アミノレブリン酸を含むナノコロイドローション、ならびに光線力学療法におけるその使用を、さらに乳剤を特定せずに開示している。

国際特許出願公開第００／２８９７１号は、ナノエマルジョンおよび５−アミノレブリン酸を含む組成物を記載している。ここではナノエマルジョンは、卵レシチン（８３％ホスファチジルコリン）、ミグリオール ８１２（トリグリセリド）、およびポリソルベート８０を含む２０ｍＭのリン酸緩衝液からなるが（国際特許出願公開第００／２８９７１号の実施例１を参照）、溶媒としてアルコールは使用されていない。しかし、乳化剤として卵レシチンを含有するナノコロイド処方物は、乳化剤として大豆レシチンを含有する５−アミノレブリン酸ナノエマルジョンよりも著しく強く着色されるという不利点を有する。この処方物における色の変化は、活性剤５−アミノレブリン酸の分解生成物の形成と相関する。このことから、卵レシチンを含有するナノエマルジョン処方物は、乳化剤として大豆レシチンを含有する処方物と比較して、５−アミノレブリン酸の安定化の大幅な低下を伴うことが判断されるべきである。

５−アミノレブリン酸と組み合わせた公知の水中油型乳剤の別の不利点は、光感受性物質の損傷組織内への浸透深度が最適でないことである。結果として、その光感受性物質を活性化させるために使用する光線の浸透深度は、より深部に位置する層の処置も可能にするであろうにもかかわらず、罹患組織はその上層においてのみ光線力学療法に反応する。

したがって、本発明のさらなる目的は、少なくとも部分的に最新技術の公知の不利点を克服する、５−アミノレブリン酸を含む組成物を提供することであった。

本発明により、この目的は、本発明のナノエマルジョンと、活性剤としての５−アミノレブリン酸、その誘導体、前駆体、および／または代謝生成物とを含む組成物を提供することによって達成される。これらの組成物において、本発明のナノエマルジョンの安定性、組織内への浸透、ならびに低費用に関する上述の有利な特性を活用して、５−アミノレブリン酸を組織の標的部位に輸送することができる。

アミノレブリン酸と乳剤のナノ粒子との間には、特異的相互作用が発見されている。具体的には、５−アミノレブリン酸、その誘導体、前駆体、および／または代謝生成物は、ナノエマルジョンのナノ粒子の単層外側に付着している。したがって、アミノレブリン酸は、それらの粒子によって輸送されるが、粒子のコア内には含有されない。逆に、アミノレブリン酸は、アミノレブリン酸と外側単層との間の相互作用により、粒子のコアの外側に位置する。従来のナノエマルジョンでは、それとは対照的に、薬品はナノエマルジョンの粒子の脂質コア内に含有される。

驚くべきことに、５−アミノレブリン酸の安定性は、５−アミノレブリン酸が少なくとも３個の炭素原子を有する少なくとも１つのアルコールを含む本発明のナノエマルジョンとともに処方された場合に、大幅に向上しうることが見いだされた。この理由は分かっていないが、ナノソームによって作り出される微小環境は、５−アミノレブリン酸の安定性に対する特に有益な効果を有すると考えられる。

また、驚くべきことに、本発明によるナノエマルジョンによって細胞および組織浸透を改善することができ、その結果より深部に位置する疾患、および／またはより高い層厚を有する疾患も処置を受けやすくなることも判明した。このより高い浸透深度は、特にこれまで５−アミノレブリン酸は、サイズの小ささにより、どのような場合にも、例えば炎症、前癌状態、および腫瘍を伴う組織中に存在する損傷表皮を通して容易に浸透することができるであろうと推測されていたため、意外なことであった。

３番目の驚くべき利点は、本発明によるナノソームとともに処方したときに、５−アミノレブリン酸が、細胞から明らかに非常に効率的に取り込まれることである。これは第一に標的化を向上させ、第二に浸透時間、すなわち組成物の適用と罹患組織の光線での照射との間の時間を減少させることができることを意味し、これにより患者は明らかに楽になる。実施例４の図５から推測できるように、培養細胞内への５−アミノレブリン酸の取り込み、および細胞内でのアミノレブリン酸のＰｐＩＸへの変換は、一定濃度のアミノレブリン酸を有する本発明のナノエマルジョンの濃度の増加に伴って促進される。

また、保存安定性も、担体中に溶媒として少なくとも３個の炭素原子を有するアルコールを含む本発明のナノエマルジョンを用いて改善することができる。

本発明によると、組成物は、好ましくは５−アミノレブリン酸、あるいはその誘導体、前駆体、および／または代謝生成物から選択された活性剤を含む。「誘導体」は、１個または２個のアルキル基、特に好ましくは１個のメチル基で置換された５−アミノレブリン酸のアミノ基のエステル化として理解される。最も好適なものは、５−アミノレブリン酸または５−メチルアミノレブリン酸である。誘導体化は、塩錯体および付加化合物、ならびにアルキル化化合物としても理解してもよい。「前駆体」および「代謝生成物」は、細胞中でプロトポルフィリンＩＸに変換された物質として理解される。活性剤の５−アミノレブリン酸またはその誘導体は、特に好ましい。

ナノエマルジョン中の乳化粒子（ナノソーム）のサイズは、上述の通りである。各場合に最適な粒径は、さらなるパラメータ、例えば組成物の粘度などに依存する。例えば、粘度１〜１０ｍＰａｓを有するナノエマルジョンを用いて、平均粒径１００ｎｍ未満で良好な結果が得られた。

組成物中の活性剤、好ましくは５−アミノレブリン酸の量は、本質的に、適用目的に依存する。好適な実施形態では、組成物の総質量に対して、活性剤約１〜３０質量％が存在する。ただし、より高いまたは低い用量も適している。好ましくは３〜１５質量％の量が、光線力学療法と関連した適用例に適していることが証明されている。

本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも１つの保存剤と少なくとも１つの溶媒とをさらに含んでもよい。

特に好適な実施形態では、組成物はゲルとして処方される。含有されるゲル形成剤は、マトリックス形成剤、好ましくはキサンタンである。ゲル形態でのナノエマルジョンの粒径も好ましくは１００ｎｍ未満であるが、粘度は大幅に高く、例えば５００〜２０００ｍＰａｓである。

本発明の別の態様は、本発明の組成物を含む、医薬用、美容用、および／または診断用組成物である。この場合、組成物は美容的および／または薬学的に許容される添加剤および／または賦形剤、具体的には化粧品または薬品に一般に使用されている物質をさらに含むことができる。かかる物質の例には、緩衝剤、安定剤、さらなる乳化剤、増粘剤などがある。さらに、組成物は、薬学的または診断的に許容できない構成要素を含まず、また好ましくは、例えば刺激を誘発するおよび／または診断を誤らせる構成要素を含まない。すでに言及した担体物質に加え、医薬用および／または診断用製剤は、許容でき、好ましくは耐容性が良好なさらなる補助薬または／および添加剤を含有していてもよい。

好ましくは、組成物は、液体または半固体として存在する。本発明の適用範囲内の適切な液体は、溶液、好ましくは液滴、スプレー、エアロゾル、乳剤、またはローションからなる群から選択される。本発明の適用範囲内の適切な半固体は、軟膏、クリーム（Ｏ／Ｗ乳剤）、脂性クリーム（Ｗ／Ｏ乳剤）、ゲル、ローション、フォーム、ペースト、および／または懸濁液からなる群から選択される。

皮膚科および婦人科の適用例の場合、製剤は、好ましくは局所投与に適切な形態、特にゲル形態である。製剤は、製剤の投与後に、５−アミノレブリン酸を詰めたナノソームが適当な程度まで標的組織内に浸透することを確実にするために望まれる、適用形態それぞれに適した特性、例えば粘度およびレオロジーなどを有する。前記の粘度およびレオロジー特性は、増粘剤、例えばポリエチレングリコールステアリルエーテル、ポリエチレングリコールステアレート、および／または多糖類、例えば多糖Ｂ−１４５９などを添加することによって調整することができる。

特に好適な実施形態では、本発明の組成物はゲルである。ゲルは、上述の処方物と比較して、改善された生薬特性を示す。本発明のゲル製剤は、より優れた付着性、安定性、活性剤の放出、ならびに皮膚上および粘膜上での耐性を示す。本発明のゲルは、組成物の総質量に対して、好ましくは０．０１質量％〜５０質量％、より好ましくは０．５質量％〜３０質量％、また最も好ましくは１質量％〜２０質量％の活性剤と、１質量％〜６０質量％、より好ましくは１５質量％〜５０質量％、最も好ましくは１０質量％〜３０質量％のナノエマルジョンと、０．０１質量％〜４質量％、より好ましくは１質量％〜３質量％の少なくとも１つの充填剤と、１質量％〜３質量％の少なくとも１つの保存剤とを含み、残りは少なくとも１つの溶媒である。

本発明の別の態様は、本発明の組成物の製造のための方法であって、
ａ）水性成分を提供するステップと、
ｂ）少なくとも１つの親油性成分と、少なくとも１つの界面活性剤と、少なくとも１つのアルコールとを含む担体であって、少なくとも１つのアルコールは少なくとも３つの炭素原子を有する担体を提供するステップと、
ｃ）ナノエマルジョンを形成するために、ステップａ）の水性成分をステップｂ）の担体と混合するステップと、
ｄ）前記のステップｃ）のナノエマルジョンの形成前および／または後に、活性剤を添加するステップと、
ｅ）場合によっては、ステップｄ）にさらなる添加剤および／または賦形剤を添加するステップと、を含む方法である。

特に好ましくは、ステップｄ）の活性剤は、前記のステップｃ）のナノエマルジョン形成後に添加する。

方法は、好ましくは無菌状態下で、例えば層流フードを使用して実施する。上述の方法で使用する水性成分、担体、および活性剤は、上記と同様の好適かつ適切な意味を有する。水性成分と担体との混合は、好ましくは激しい均質化によって実施する。５−アミノレブリン酸、および場合によっては存在する添加物および／または賦形剤は、均質化前および／または後、好ましくは均質化後に添加してよい。

好ましくは、方法を実施する間、例えば真空および／または保護ガス雰囲気を適用することによって、空気を排除する。さらに、方法を行なう間、光を排除することも好ましい。

方法は、所望のナノエマルジョンが上述のように形成でき、またその後のステップのために、構成要素、具体的には活性物質が十分に安定である温度で実施する。一般的に、約５〜３０℃の温度範囲が適当であることがわかっている。しかしながら、例えば、別の混合物中でまず混合し、適切な場合には均質化し、その後はじめて組成物に添加する添加剤および／または賦形剤の処理は、より高い温度、例えば約７０℃までの温度で実施してもよい。特に医薬適用の場合、結果として得られる生成物が、例えば滅菌出発物質を用い、滅菌方法条件を維持し、または／および製造後に滅菌ステップを用いることによって、確実に無菌であるよう注意する。

化粧品の分野においては、本発明の組成物は、好ましくは、例えば染み、しわを根絶するための、および／または乾燥肌に対する抗老化剤として使用される。

本発明による組成物の重要な使用領域は、光線力学療法の分野にあり、ナノエマルジョンの局所適用が特に好ましい。本発明によるナノエマルジョンは、その抑制が、５−アミノレブリン酸から形成された感受性物質を光活性化することによる細胞または組織の増殖の阻害あるいは細それらの破壊を含む、全ての疾患の場合に使用できる。これらの疾患には、具体的にはウイルス関連疾患が含まれ、ウイルスは好ましくはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の群から選択される。最も好ましくは、ウイルス関連疾患は尖圭コンジロームである。尖圭コンジロームは、ほぼ性器肛門のみに限局し、その病原体はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）６、１１、および４２型である、ウイルス由来の両性上皮腫として定義される。疾患の過程において、ピン先大の丘疹が、カリフラワー様および鶏のトサカ様の乳頭状増殖を生じる。

また、本発明の組成物は、角化症に関連する疾患などの皮膚疾患の処置に適しており、光線角化症が特に好適である。光線角化症は、表皮内扁平上皮細胞癌である。光線角化症は、表皮に限定される形質転換したケラチノサイトの増殖である。光線角化症は、主として紫外線、特に日光への慢性曝露により誘発される（日光角化症とも称される）。光線角化症は、直径約１ｍｍ〜約２ｃｍの凹凸のある落屑性の斑点、丘疹、または斑として現れる。

さらに、本発明の組成物は、好ましくは、細胞増殖の増加に関連する疾患の処置を対象とするが、これはこの場合に、光感受性物質が、細胞代謝の増加によって、特に高い度合いで罹患細胞に集積するためである。

したがって本発明による組成物は、腫瘍疾患、例えば基底細胞腺腫、扁平上皮細胞癌、ボーエン病、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、および／または結節性および／または皮下癌疾患の治療に適している。乾癬は、細胞増殖の増加に関連する非腫瘍性疾患の一例である。

本発明の組成物は、基底細胞腺腫の処置に特に好適である。基底細胞腺腫は、局所侵襲的および破壊的に成長するが、非常にまれにしか転移せず、そのためやや悪性であるとみなされる上皮性腫瘍を特徴とする。これは主に頭部および頸部（８０％）、特に前頭部、眼角部、および鼻部に位置する。進行が好ましくない場合には、例えばそれに伴う骨および血管の侵食および出血によって、またＣＮＳ浸潤によって、組織の破壊あるいは死に至ることさえある。基底細胞腺腫は、表皮および／または毛包の外毛根鞘の胚葉（基底細胞層）の変性細胞に由来する。通常は表皮通過時にその***能を喪失し、角質層を崩壊し、再形成する正常な基底細胞とは対照的に、基底細胞腫の細胞は、その***能を維持し、もはや角質層を形成することができない。

本発明は、さらに、光線力学療法における薬物の製造のための、本発明によるナノエマルジョンの使用に関する。

したがって、上述の疾患の処置は、例えば、活性剤、例えば５−アミノレブリン酸を含有するナノエマルジョンを局所的に適用し、その後十分な量の５−アミノレブリン酸を処置を行なう組織内に浸透させるために放置することによって実施することができる。放置時、光線による処置部の照射は、好ましくは、例えば処置部を被覆することで回避して、望ましくない早すぎる活性化を避ける。一般的に約１〜８時間であり、通常は約４時間の放置期間終了後、光源を用いて、適当な線量の放射線で組織を照射する。適切な光源には、白色光を発するランプ、また単色光源が含まれる。放射線量は、普通は１回の適用当たり約２０Ｊ／ｃｍ²〜数１００Ｊ／ｃｍ²の範囲である。

本発明による５−アミノレブリン酸ゲルの別の適用分野は、試料中、例えば組織試料中の増殖細胞の存在の検出に関する。検出は、活性剤の代謝によって生成される光感受性物質を正常細胞と比較して増殖細胞に選択的に集積させることに基づく。好ましくは、活性剤は５−アミノレブリン酸であり、光感受性物質はプロトポルフィリンＩＸである。光感受性物質が集積した程度は、光診断法を用いて、例えば波長４０５ｎｍを有する光線を照射して、光感受性物質によって生じた蛍光放射を測定することによって判断できる。本発明によるナノエマルジョンは、腫瘍診断における使用に特に適している。

さらに、本発明は、局所的適用に適した、本発明のナノエマルジョンと５−アミノレブリン酸、その誘導体、前駆体、および／または代謝生成物とを含む本発明による組成物と、１つ以上の補助物質とを含むキットに関する。これらの補助物質の例には、光線による早すぎる活性化を避けるために、処置部位へのナノエマルジョンの適用後にその部位に適用する必須のフォトレジスト被覆材料、例えばプラスチックフィルム、およびその被覆材料を付着するための手段、あるいはナノエマルジョンを処置部位に適用するための手段がある。

さらに、本発明は、ウイルス関連疾患、皮膚疾患、および／または細胞増殖関連疾患を処置する方法であって、薬学有効量の本発明の組成物を、それらを必要とする被験体に投与するステップを含む方法に関する。好ましくは、被験体は哺乳動物、より好ましくはヒトである。

本発明の別の態様は、５−アミノレブリン酸、その誘導体、前駆体、および／または代謝生成物からなる群から選択された活性剤と、ナノエマルジョンとを含み、ナノエマルジョンはアルコールを含む組成物に関する。

好ましくは、組成物、および特にナノエマルジョンは、少なくとも１つの水性成分、好ましくは水、少なくとも１つの親油性成分、および／または少なくとも１つの界面活性剤をさらに含む。

局所的適用に適した、５−アミノレブリン酸、その誘導体、前駆体、および／または代謝生成物を使用する。「誘導体」は、１個または２個のアルキル基、特に好ましくは１個のメチル基で置換された５−アミノレブリン酸のアミノ基のエステル化として理解されるべきである。最も好適なものは、５−アミノレブリン酸または５−メチルアミノレブリン酸である。誘導体化は、塩錯体および付加化合物、ならびにアルキル化化合物としても理解することができる。「前駆体」および「代謝生成物」は、細胞中でプロトポルフィリンＩＸに変換された物質として理解されるべきである。活性剤の５−アミノレブリン酸またはその誘導体は、特に好適である。

アルコールとしては、Ｃ₂〜Ｃ₈アルコール、特にＣ₃〜Ｃ₈アルコールが好適であり、またイソプロパノールおよび／または１−プロピルアルコールは、上記の理由からさらに好適である。

好ましくは、アミノレブリン酸、その誘導体、前駆体、および／または代謝生成物は、ナノエマルジョンの粒子の外側単層に付着している。したがって、アミノレブリン酸は粒子のコアの外側に位置するが、これはアミノレブリン酸と外側単層との間の相互作用による。

好ましくは、少なくとも１つの親油性成分はミグリオールであり、少なくとも１つの界面活性剤はレシチン、好ましくは大豆レシチン、および／またはポリオキシエチレン型界面活性剤、好ましくはポリソルベート８０である。

本発明の別の態様は、上述の組成物を含む医薬用および／または診断用組成物に関する。

本発明の別の態様は、前記のナノエマルジョンの医薬組成物における使用、具体的には皮膚疾患、例えば乾癬、角化症、また特に光線角化症処置用の薬物の製造のための使用に関する。さらに、組成物は、細胞増殖に関連する、腫瘍疾患などの疾患、例えば、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、ボーエン病、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、あるいは結節性および／または皮下癌疾患にも適している。さらに、組成物は、ウイルス関連疾患、例えば尖圭コンジロームの処置にも適している。

本発明の別の態様は、ナノエマルジョンと活性剤とを含む組成物であって、活性剤はナノエマルジョンの粒子の外側単層に付着している組成物に関する。これは、活性剤の化学的特性（例えば、安定性）および薬学的特性（例えば、皮膚内への浸透深度および生物学的利用能）を向上させるために特に有用である。

好ましくは、ナノエマルジョンおよび／または活性剤は、上記に記載の組成物に関してと同様に定義される（９ページ以下の記載を参照）。

さらなる態様は、活性剤がナノエマルジョンの粒子の外側単層に付着している組成物を含む医療用および／または美容用組成物に関する。

また、ナノエマルジョンと活性剤とを含む組成物であって、活性剤がナノエマルジョンの粒子の外側単層に付着している組成物の、ウイルス関連疾患、皮膚疾患、細胞増殖関連疾患処置用の薬物の製造、および／または光線力学療法における薬物の製造のための使用も本発明に包含される。前記の疾患および光線力学療法の好適な実施形態は、上述の通りである。

図およびそれに続く実施例は、本発明をさらに説明することを目的とする。

ナノエマルジョンＢＦ−２００の代表バッチの光子相関分光法で測定した粒径分布を示す図である。 ナノエマルジョンＢＦ−２００のフリーズフラクチャー電子顕微鏡写真（Ａ）拡大率１，２００，０００倍、（Ｂ）拡大率２５０，０００倍を示す図である。 ナノエマルジョンＢＦ−２００のネガティブ染色電子顕微鏡写真（Ａ）拡大率１，２００，０００倍、（Ｂ）拡大率２５０，０００倍を示す図である。 ＡＬＡおよび異なる濃度のＢＦ−２００とともに３時間インキュベートしたＨｅｌａ細胞で測定した、ＵＶ誘発ＰｐＩＸ蛍光を示す図である。蛍光は、培地の洗い流し２時間後に測定した。 アミノレブリン酸ゲルのフリーズフラクチャー電子顕微鏡写真を拡大率５０，０００倍で示す図である。 アミノレブリン酸ゲルのフリーズフラクチャー電子顕微鏡写真を示す図である。（Ａ）拡大率２５０，０００倍 （Ｂ）拡大率１，２００，０００倍

実施例
実施例１：ナノエマルジョンＢＦ２００の製造
ナノエマルジョンＢＦ２００の定性的および定量的組成を下表に示す。

第１表：ナノエマルジョンＢＦ２００の組成

乳剤ＢＦ２００の製造方法は、以下のステップからなる：
ステップ１：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）（水性成分）の製造
ステップ２：親油性成分、界面活性剤、およびアルコールを含有する担体の製造
ステップ３：ステップ１の水性成分をステップ２の担体と混合することによるナノエマルジョンの製造
ステップ４：濾過滅菌、および層流フード下での滅菌ガラス瓶へのナノエマルジョンＢＦ２００の充填
典型的なバッチサイズの場合の製造方法の説明：
ステップ１：１０ｍＭリン酸緩衝液（１０００ｇ）（ｐＨ６）を製造し、そのリン酸緩衝液を０．２μｍ滅菌フィルターでの濾過によって滅菌した。
ステップ２：親油性成分、界面活性剤、およびアルコールを含有する担体の製造
第２表：担体

大豆レシチン（１７．３０ｇ）を計量して適切な容器に入れ、イソプロピルアルコール（１４．２０ｇ）を加え、アルコールの蒸発を避けるためにその容器に蓋をした。適切な撹拌機を用いた連続的攪拌下、室温で大豆レシチンを溶解した。カプリル／カプリントリグリセリド（３４．５０ｇ）およびポリソルベート８０（３４．００ｇ）を計量し、大豆レシチン溶液に加えた。室温で、適切な撹拌機を用いて、均質な澄明溶液が得られるまで混合物を攪拌した。この溶液は、ナノエマルジョンＢＦ２００の全ての乳化剤および脂質成分を含有する濃縮物である。

ステップ３：９００ｇのリン酸緩衝液（ステップ１による）と１００ｇの担体（ステップ２による）とを混合することによる乳剤の製造
まず、リン酸緩衝液を含む水性成分を適切な容器内でおよそ５５℃まで加熱した。次に、ステップ２の担体（濃縮物）をおよそ５５℃まで加熱した。続いて、プロペラミキサーを用いた連続的攪拌下（７００ｒｐｍ）、担体をリン酸緩衝液に注入した。得られたナノエマルジョンを１５分間攪拌する。手順全体を通じて、温度をおよそ５５℃に維持した。最後に、ナノエマルジョンを水浴中で室温まで冷却した。

ステップ４：ナノエマルジョンを０．２μｍ滅菌フィルターでの濾過によって滅菌し、層流フード下で１００ｍｌ滅菌ガラス瓶に充填した。

実施例２：アミノレブリン酸１％、３％、および１０％、ならびにプラセボゲルの製造
プラセボゲル、および１％、３％、１０％アミノレブリン酸ゲルの定性的および定量的組成を下表に示す。

第３表：プラセボゲルの組成

第４表：アミノレブリン酸１％ゲルの組成

第５表：アミノレブリン酸３％ゲルの組成

第６表：アミノレブリン酸１０％ゲルの組成

プラセボまたはアミノレブリン酸ゲルの製造方法は、以下のステップからなる：
− ステップ１：キサンタンガムの注射用水への添加、混合、蒸気滅菌による、ゲル基剤の製造
− ステップ２：保存剤であるパラヒドロキシ安息香酸メチルおよびパラヒドロキシ安息香酸プロピルのプロピレングリコール中濃縮溶液の製造
− ステップ３、プラセボの場合：保存剤の濃縮溶液をゲル基剤に加え、そのゲル基剤にナノエマルジョンＢＦ２００を加え、そのゲルを均質化することによる、最終ゲル製剤の製造
− ステップ３、アミノレブリン酸ゲルの場合：保存剤の濃縮溶液をゲル基剤に加えることによる、最終ゲル製剤の製造。アミノレブリン酸塩酸塩のナノエマルジョンＢＦ２００溶液中の製造。アミノレブリン酸塩酸塩のナノエマルジョンＢＦ２００溶液のゲル基剤への添加、およびゲルの均質化。

製造方法の説明：
ステップ１：キサンタンガムを用いたゲル基剤の製造
Ｓｔｅｐｈａｎボウルをイソプロパノール７０％を用いて消毒した。そのボウルに注射用水（単位量９７．５０）を入れてから、その上にキサンタン（単位量２．５）を散布した。混合物を真空内で圧力およそ１００ｍｂａｒ／分、回転数６００で９０分間分散させた。得られた基剤ゲルをあらかじめ注射用水で濯いでおいた２００ｍｌのＳｃｈｏｔｔフラスコに充填した（最大１／３充填）。次に、フラスコ内の基剤ゲルを１２１℃のオートクレーブ内で２０分間蒸気滅菌した。

ステップ２：パラベン濃縮物の製造
パラヒドロキシ安息香酸メチル（７．０部）およびパラヒドロキシ安息香酸プロピル（３．０部）を計量して、適切な容器に入れた。それにプロピレングリコール（９０部）を混ぜ、パラヒドロキシ安息香酸をプロピレングリコールに溶解させた。混合物を加熱プレート上で加熱しながら、混合物が溶解するまで磁気撹拌機を用いて攪拌し（７０℃）、澄明溶液を得る。

ステップ３、パート１：プラセボゲルの製造
第７表：基剤ゲルおよびパラベン濃縮物からのプラセボゲルの製造

以下の全ステップは、層流下、無菌状態で実施した。１単位量のパラベン濃縮物（Ｄ）および８１．５単位量の基剤ゲル（Ａ）を適切な容器に加えた。１７．５単位量のナノエマルジョン（Ｂ）を０．２μｍ滅菌フィルターで濾過し、基剤ゲルに加える。混合物を１０分間攪拌する。続いて、２単位量のゲルをそれぞれラミネートアルミニウム管に充填した。

ステップ３、パート２：アミノレブリン酸１％ゲルの製造
第８表：アミノレブリン酸１％ゲルの製造

以下の全作業は、層流下、無菌状態で実施した。１単位量のパラベン濃縮物（Ｄ）および８０．５単位量の基剤ゲル（Ａ）を適切な容器に加えた。穏やかに攪拌することによって、１単位量のＡＬＡ（Ｃ）を１７．５単位量のナノエマルジョン（Ｂ）に溶解させて、溶液を得た。前記溶液を０．２μｍ滅菌フィルターで濾過し、基剤ゲルに加える。均質なゲルを得るために、混合物を１０分間攪拌する。続いて、ゲル２ｇをそれぞれラミネートアルミニウム管に充填した。

ステップ３、パート３：アミノレブリン酸３％および１０％ゲルの製造
１％ゲルについての記載と同様であるが、ただしそれぞれ７８．５０単位量の基剤ゲルおよび３単位量のＡＬＡ、あるいは７１．５０単位量の基剤ゲルおよび１０単位量のＡＬＡ１を用いて、３％および１０％ゲルを製造した。

実施例３：ナノエマルジョンＢＦ−２００の粒径
光子相関分光法（ＰＣＳ）（動的レーザー光散乱法（ＤＬＳ）とも称される）で評価した、製造したナノエマルジョンの平均粒径は、１００ｎｍ未満である。さらに、このナノエマルジョンは、非常に狭い粒径分布を特徴とする（下記図１を参照）。

このナノエマルジョンは、広範囲の温度で安定であるが、凍結およびオートクレーブによって損なわれうる。このナノエマルジョンは、ｐＨおよびイオン強度の変化に比較的反応しにくく、またその小さいサイズのため、０．２μｍフィルターでの濾過によって殺菌することができる。ナノエマルジョンは、活性物質の皮膚内への送達を改善し、それにより局所的に適用した薬品の有効性を増幅させる可能性を有する。

ナノエマルジョンＢＦ−２００は、低エネルギー技術を用いて製造される。すなわちナノエマルジョンの製造は、高せん断装置、例えばソニケーターまたは高圧ホモジナイザーを必要としない。

ナノエマルジョンＢＦ−２００中のナノ粒子の研究は、光子相関分光法によって、また２つの電子顕微鏡法：フリーズフラクチャーＥＭおよびネガティブ染色を用いて実施した。

光子相関分光は、ＢＦ−２００が、非常に一貫性があり信頼できる粒径、および狭い粒子分布を有するナノエマルジョンであるという結果を裏付けた。これらの特徴は、長期にわたり、また異なる温度においても安定である（下記の第９表を参照）。

第９表：ナノエマルジョンＢＦ−２００の安定性試験の結果

要約すると、様々な保存条件での最大１２ヶ月間の保存後、全ての結果は規格範囲内である。

ナノエマルジョンＢＦ−２００のフリーズフラクチャー電子顕微鏡写真を拡大率１，２００，０００倍および２５０，０００倍で下記の図２に示す。顕微鏡写真における最も顕著な特徴は、多数の１５〜５０ｎｍの間の様々な直径を有する非常に小さい球状ベシクルである。これらの値は、光子相関分光法で測定したものと十分に関連している（上記の第９表を参照）。ベシクルは、ベシクル膜の厚さが３〜４ｎｍであることから、単層である可能性が非常に高い。これは、レシチンの主成分であり、ナノエマルジョン中の界面活性剤であるホスファチジルコリン分子の長さに相当する。リポソームおよびその他の二重層ベシクルは、７ｎｍ超の膜厚を有する。

ベシクルの構造は、ネガティブ染色によって作成した電子顕微鏡写真においても観察できる。ナノエマルジョンＢＦ−２００中のナノ粒子は、球状で、直径およそ２０ｎｍ、およそ３〜４ｎｍの厚さのくぼみを備え、無定形物質で満たされている（下記の図３を参照）。中空粒子は観察されなかった。

アミノレブリン酸ゲル中のナノ粒子の研究は、フリーズフラクチャーおよびネガティブ染色技法を用いて、電子顕微鏡法によって実施した。

アミノレブリン酸ゲルのフリーズフラクチャー電子顕微鏡写真により、ゲル中に存在するナノ粒子が、純ナノエマルジョンＢＦ−２００中のものと類似するサイズを有することを確認した。顕微鏡写真は、単一粒子および集合体を示している（図５）。ゲル中のナノ粒子の形態およびサイズは、保存条件に影響されない。ＢＦ−２００ ＡＬＡ（２５℃（６０％相対湿度）で４ヶ月間保存後の１０％ゲル）のフリーズフラクチャー電子顕微鏡法による検査では、新しく製造したゲル中に観察されるものと類似するサイズおよび形状の粒子が見られた。第ＩＩＩ相臨床試験で使用されるＢＦ−２００ ＡＬＡゲル（１０％アミノレブリン酸）およびＢＦ−２００ ＡＬＡゲルに対するプラセボのバッチを用いた計画されている安定性試験は、臨床試験と並行して、後の時点での電子顕微鏡法による粒径の検査を含むことになっている。

図６は、より高い拡大率で作成した、ゲルのフリーズフラクチャー電子顕微鏡写真を示している。フラクチャー面は、主に被覆された粒子の外皮を示している。粒子自体を通してのフラクチャーは、非常にまれにしか発生しない。ベシクルは、アミノレブリン酸を表わすと解釈される物質の層に囲まれているように見える。これは目玉焼き様の画像を作り出している（図６のパートＢに矢印で示す）。

１０％アミノレブリン酸ゲルのネガティブ染色によって作成された電子顕微鏡写真は、フリーズフラクチャー電子顕微鏡写真において観察されたナノ粒子上の物質の層形成を裏付けうる、曇った拡散表面構造を有するナノ粒子を示している。

実施例４：哺乳動物細胞内への吸収：ＡＬＡ取り込みについてのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養試験：細胞培養試験
培養細胞におけるＡＬＡの取り込みおよびプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）への変換は、ＵＶ誘発ＰｐＩＸ蛍光を測定することによってモニターできる。細胞培養実験は、複数の腫瘍性細胞株：ＨＥＬＡ、ＨｅｐＧ２、およびＣＣＤ １０６ ＫＥＲＴｒ（ヒト上皮ケラチノサイト細胞株）を用いて実施した。細胞は、メチル−ＡＬＡ（ＭＡＬ）、ＡＬＡ、またはＡＬＡを含むＢＦ−２００とともに、水性媒体中で最大３時間インキュベートした。選択した薬品濃度下、３つ全てのインキュベーション培地は、類似するｐＨ値を有した。インキュベーション後、細胞を穏やかに洗浄し、新しい培地を追加した。ＰｐＩＸ生成は、蛍光を定量化することにより、異なる時点で測定した。図５は、ＨＥＬＡ細胞で得られた結果を示している。

ナノエマルジョンＢＦ−２００（一定のＡＬＡ濃度）の濃度の増加によるＰｐＩＸ合成への影響を図５に示す。細胞におけるＰｐＩＸ蛍光は、ＢＦ２００濃度の増加に伴って上昇し、３％のＢＦ２００で最高点に達した。

実施例５
光線角化症の光線力学療法に対する５−ＡＬＡのナノエマルジョン処方物の有効性は、２００６年秋季に開始した、Ｂｉｏｆｒｏｎｔｅｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨを治験依頼者とする第ＩＩ相用量設定臨床試験において示されている。プラセボ対照無作為化二重盲検試験をＰｒｏｆ． Ｄｒ． Ｒｏｌｆ−Ｍａｒｋｕｓ Ｓｚｅｉｍｉｅｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏｆ Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）の医学的指示の下、ドイツ国内の１３の臨床センターにおいて実施した。３種の実薬用量（１、３、および１０％ＡＬＡ）およびプラセボを使用した。化合物の有効性を検証するために、患者１０５名を３つの異なるＡＬＡ濃度またはプラセボのうちの１つを用いた光線力学療法で一度処置した。

顔面または頭皮に３〜１０の光線角化症病変を有する患者が含まれた。各患者は、その患者の全ての病変のうちの１つの処置（１％、３％、または１０％の５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）あるいはプラセボ）を受けた。３時間の放置後、赤色光を適用した。処置セッションのあと、被験体は、臨床成果および治癒過程のモニターのために、３週間後、８週間後、および１２週間後に再来院した。各回に、治験担当医師は、処置した光線角化症（ＡＫ）病変部分のＡＫの徴候および臨床症状が残っている部分の形跡を判断した。主要有効性変数は、完全な寛解（病変が完全に排除され、目に見えるＡＫの癒着性の落屑性斑はもう存在しない）を示す病変の数として定義される、１２週目の来院時における全てのＡＫ病変の合計排除率であった。ＢＦ−２００ ＡＬＡ適用後の照射中、痛みの発現もモニターした。

結果：ＰＤＴ前の１０％ＡＬＡによる前処置は、テストした３種の濃度のうち、ＡＫ病変の排除に最も有効であることがわかった（プラセボよりも統計的に有意に優れている）。ＢＦ−２００ ＡＬＡによる単回処置１２週間後の患者の評価時、臨床センターの重み付けおよび頭部の部位により、処置した病変の少なくとも６０〜７０％は完全に治癒した。プラセボ群における排除率は、臨床センターの重み付けにより、処置した病変の約５〜１５％であった。この排除率は、類似する試験デザインを用いるが、より高濃度の活性物質５−ＡＬＡまたはメチルＡＬＡを用いたＡＬＡ−ＰＤＴ試験による公開結果と十分に一致した。美容上の結果は優良であった。患者の６％のみが、強い痛みを訴えた。関連する副作用は、試験中に発生せず、美容上の結果は優良であった。ＰＤＴ時、およびＰＤＴ後１２週間にわたり、４群のいずれに関しても、安全性に関する懸案事項は存在しなかった。

追加的な安全性対策として、この用量設定部分に薬物動力学的評価を含めた。ＡＬＡおよびその代謝生成物であるプロトポルフィリンＩＸの全身血漿中および尿中濃度を測定した。ＡＬＡ処置を受けた患者におけるこれらの化合物の血漿中および尿中濃度は、同一個人における自然に生じる生理的値と比較して増加していなかった。

Claims (63)

1. ａ）少なくとも１つの水性成分と、ｂ）ｉ）少なくとも１つの親油性成分と、ｉｉ）少なくとも１つの界面活性剤と、ｉｉｉ）少なくとも１つのアルコールとを含む担体とを含み、前記少なくとも１つのアルコールが、少なくとも３つの炭素原子を有する、ナノエマルジョン。
2. 前記担体が水性成分中に存在する、請求項１に記載のナノエマルジョン。
3. 前記ナノエマルジョンの総質量に対して、前記親油性成分が０．１質量％〜１５質量％の量で存在し、前記界面活性剤が１質量％〜３０質量％の量で存在し、前記アルコールが０．１質量％〜１０質量％の量で存在する、請求項１または２に記載のナノエマルジョン。
4. 前記水性成分が、前記ナノエマルジョンの総質量に対して、５０質量％〜９８質量％の量で存在する、請求項１から３までのいずれか１項に記載のナノエマルジョン。
5. 前記少なくとも１つのアルコールが、イソプロピルアルコールおよび／または１−プロピルアルコールである、請求項１から４までのいずれか１項に記載のナノエマルジョン。
6. 前記少なくとも１つの親油性成分が、トリグリセリド類および／またはそれらの混合物である、請求項１から５までのいずれか１項に記載のナノエマルジョン。
7. 前記少なくとも１つの界面活性剤が、レシチンおよび／またはポリオキシエチレン型界面活性剤である、請求項１から６までのいずれか１項に記載のナノエマルジョン。
8. 前記レシチンが大豆レシチンであり、前記ポリオキシエチレン型界面活性剤がポリソルベート８０である、請求項７に記載のナノエマルジョン。
9. 前記大豆レシチンが、少なくとも８０質量％のホスファチジルコリン含有量を有する、請求項８に記載のナノエマルジョン。
10. 乳化粒子の平均直径が、５ｎｍ〜５００ｎｍ、好ましくは１００ｎｍ未満である、請求項１から９までのいずれか１項に記載のナノエマルジョン。
11. 前記乳化粒子の平均直径が、１０〜５０ｎｍの範囲である、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のナノエマルジョン。
12. 請求項１から１１までのいずれか１項に記載のナノエマルジョンの製造方法であって、
    ａ）水性成分を提供するステップと、
    ｂ）少なくとも１つの親油性成分と、少なくとも１つの界面活性剤と、少なくとも１つのアルコールとを含む担体であって、前記少なくとも１つのアルコールは少なくとも３つの炭素原子を有する担体を提供するステップと、
    ｃ）前記ステップａ）の水性成分を前記ステップｂ）の担体と混合するステップと、
    を含む方法。
13. 請求項１から１１までのいずれか１項に記載のナノエマルジョンを含む、医薬用および／または美容用組成物。
14. 請求項１３までのいずれか１項に定義されるナノエマルジョンと、活性剤とを含む組成物。
15. 前記活性剤が、５−アミノレブリン酸、その誘導体、前駆体、および／または代謝生成物からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
16. ５−アミノレブリン酸、その誘導体、前駆体、および／または代謝生成物が、前記ナノエマルジョンの粒子の外側単層に付着している、請求項１５に記載の組成物。
17. 請求項１４から１６までのいずれか１項に記載の組成物を含む、医薬用、美容用、および／または診断用組成物。
18. ゲルとして存在し、前記組成物の総質量に対して、前記活性剤０．０１質量％〜５０質量％と、前記ナノエマルジョン１質量％〜６０質量％と、前記少なくとも１つの充填剤０．０１質量％〜４質量％と、前記少なくとも１つの保存剤１質量％〜３質量％とを含み、残りは前記少なくとも１つの溶媒である、請求項１４から１７までのいずれか１項に記載の組成物。
19. 請求項１４から１８のいずれか１項に定義される組成物の製造方法であって、
    ａ）水性成分を提供するステップと、
    ｂ）少なくとも１つの親油性成分と、少なくとも１つの界面活性剤と、少なくとも１つのアルコールとを含む担体であって、前記少なくとも１つのアルコールは少なくとも３つの炭素原子を有する担体を提供するステップと、
    ｃ）ナノエマルジョンを形成するために、前記ステップａ）の水性成分を前記ステップｂ）の担体と混合するステップと、
    ｄ）前記ステップｃ）のナノエマルジョンの形成前および／または形成後に、前記活性剤を添加するステップと、
    ｅ）場合によっては、ステップｄ）にさらなる添加剤および／または賦形剤を添加するステップと、
    を含む方法。
20. 前記ステップｄ）における活性剤が、前記ステップｃ）のナノエマルジョンの形成後に添加される、請求項１９に記載の方法。
21. 抗老化剤としての、請求項１から１１までのいずれか１項に記載のナノエマルジョン、または請求項１３から１８までのいずれか１項に記載の組成物の美容用の使用。
22. ウイルス関連疾患処置用の薬物の製造のための、請求項１から１１までのいずれか１項に記載のナノエマルジョン、および／または請求項１３から１８までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
23. 前記ウイルス関連疾患がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に起因する、請求項２２に記載の使用。
24. 前記ウイルス関連疾患が尖圭コンジロームである、請求項２３に記載の使用。
25. 皮膚疾患処置用の薬物の製造のための、請求項１から１１までのいずれか１項に記載のナノエマルジョン、および／または請求項１３から１８までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
26. 前記障害が神経皮膚炎からなる群から選択される、請求項２５に記載の使用。
27. 前記皮膚疾患が、ざ瘡および／または角化症関連疾患である、請求項２６に記載の使用。
28. 前記角化症が光線角化症である、請求項２７に記載の使用。
29. 細胞増殖関連疾患の処置のための薬物を製造するための、請求項１から１１までのいずれか１項に記載のナノエマルジョン、および／または請求項１３から１８までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
30. 前記細胞増殖関連疾患が腫瘍疾患である、請求項２９に記載の使用。
31. 前記腫瘍疾患が、基底細胞腺腫、扁平上皮細胞癌、ボーエン病、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、および／または結節性および／または皮下癌疾患からなる群から選択される、請求項３０に記載の使用。
32. 前記疾患が乾癬である、請求項２５または２９に記載の使用。
33. 光線力学療法における薬物の製造のための、請求項１５から１８までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
34. 前記組成物が有効量で患者に投与されて、処置を行なう組織内に十分量の前記活性剤を提供するのに適切な時間放置され、前記組織は光線放射を受ける、請求項３３に記載の使用。
35. 増殖細胞の検出のための、請求項１５から１８までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
36. 皮膚および／または腫瘍疾患の診断のための、請求項１５から１８までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
37. 請求項１５から１８までのいずれか１項に記載の組成物と、
    ａ）フォトレジスト被覆と、
    ｂ）前記被覆を適用部位に付着する手段と、
    ｃ）前記組成物を適用部位に適用する手段と、
    から選択される少なくとも１つの成分と、
    を含むキット。
38. ウイルス関連疾患、皮膚疾患、および／または細胞増殖関連疾患を処置する方法であって、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の薬学有効量のナノエマルジョンおよび／または請求項１３から１８のいずれか１項において定義される組成物を、それらを必要とする被験体に投与するステップを含む方法。
39. ５−アミノレブリン酸、その誘導体、前駆体、および／または代謝生成物からなる群から選択さる活性剤と、ナノエマルジョンとを含む組成物であって、前記ナノエマルジョンはアルコールを含む組成物。
40. 少なくとも１つの水性成分、好ましくは水、少なくとも１つの親油性成分、および／または少なくとも１つの界面活性剤をさらに含む、請求項３９に記載の組成物。
41. 前記アルコールがＣ₂〜Ｃ₈アルコール、特にＣ₃〜Ｃ₈アルコールである、請求項３９または４０までのいずれか１項に記載の組成物。
42. 前記アルコールが、イソプロピルアルコールおよび／または１−プロピルアルコールである、請求項４１に記載の組成物。
43. ５−アミノレブリン酸、その誘導体、前駆体および／または代謝生成物が、前記ナノエマルジョンの外側単層に付着している、請求項３８から４２までのいずれか１項に記載の組成物。
44. 前記少なくとも１つの親油性成分がミグリオールであり、前記少なくとも１つの界面活性剤がレシチン、好ましくは大豆レシチン、および／またはポリオキシエチレン型界面活性剤、好ましくはポリソルベート８０である、請求項３８から４２までのいずれか１項に記載の組成物。
45. 請求項３８から４４までのいずれか１項に記載の組成物を含む、医薬用および／または診断用組成物。
46. ウイルス関連疾患処置用の薬物の製造のための、請求項３８から４４までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
47. 前記ウイルス関連疾患がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に起因する、請求項４６に記載の使用。
48. 前記ウイルス関連疾患が尖圭コンジロームである、請求項４７に記載の使用。
49. 皮膚疾患処置用の薬剤の製造のための、請求項３９から４４までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
50. 前記皮膚疾患が、ざ瘡および／または角化症に関連する疾患である、請求項４９に記載の使用。
51. 前記角化症が光線角化症である、請求項４４に記載の使用。
52. 細胞増殖関連疾患処置用の薬物を製造するための、請求項３９から４４までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
53. 前記細胞増殖関連疾患が腫瘍疾患である、請求項５２に記載の使用。
54. 前記腫瘍疾患が、基底細胞腺腫、扁平上皮細胞癌、ボーエン病、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、および／または結節性および／または皮下癌疾患からなる群から選択される、請求項５３に記載の使用。
55. 前記疾患が乾癬である、請求項４９または５２に記載の使用。
56. 光線力学療法における薬物の製造のための、請求項３９から４４までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
57. 前記組成物が、有効量で患者に投与されて、処置を行なう組織内に十分な量の前記活性剤を提供するのに適切な時間放置され、前記組織は光線放射を受ける、請求項５６に記載の使用。
58. 増殖細胞の検出ための、請求項３９から４４までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
59. 皮膚および／または腫瘍疾患の診断ための、請求項３９から４４までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
60. ナノエマルジョンと活性剤とを含む組成物であって、前記活性剤が前記ナノエマルジョンの粒子の外側単層に付着している組成物。
61. 前記ナノエマルジョンおよび／または前記活性剤が、請求項３９から４４のいずれか１項と同様に定義される、請求項６０に記載の組成物。
62. 請求項６０または６１に記載の組成物を含む、医療用および／または美容用組成物。
63. 前記ウイルス関連疾患、皮膚疾患、細胞増殖関連疾患処置用の薬物の治療、および／または前記光線力学療法における薬物の製造のための、請求項６０または６１に記載の組成物の使用。

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