JP2010505831A - 安定化した、治療用の小型のヘリックス性抗ウイルスペプチド - Google Patents

Abstract

ＨＩＶ構築を阻害する制約されたペプチドが提供される。また、上記のペプチドを含む薬剤組成物も提供される。さらに、細胞におけるカプシド含有ウイルスの複製を阻害する方法も提供される。また、カプシド含有ウイルスに感染した哺乳動物を治療する方法も提供される。さらに、カプシド含有ウイルスに感染するリスクがある哺乳動物を処置する方法も提供される。上記のペプチドおよび薬剤組成物の使用と同様に、上記のペプチドを作製する方法もさらに提供される。

Description

本発明は、一般に、ＨＩＶ感染の治療に関する。より具体的には、本発明は、カプシド含有ウイルスの構築を阻害するペプチド、およびそれらのペプチドを使用して、ＨＩＶを含むカプシド含有ウイルスを処理するための方法を提供する。

構築は、ＨＩＶ−１生活環において決定に重要なステップであり（Ｍｏｒｉｋａｗａ、２００３年、Ｈｕｓｅｂら、２００５年、Ｇｏｔｔｌｉｇｅｒ、２００１年、Ｆｒｅｅｄ、１９９８年）、一般に、ｇａｇポリタンパク質の制御された重合を介して生じると考えられている。ｇａｇポリタンパク質は、形質膜まで輸送され、そこで構築が起こり、ウイルス粒子が形成され、かつ球形の未成熟非感染性粒子として出芽する。最近のデータから、ｇａｇポリタンパク質はまた、特にマクロファージにおいて、多小胞体（ＭＶＢ）としばしば呼ばれる後期エンドソーム中で蓄積し、かつ集合してウイルス粒子を構築し得ることが示されている（Ｐｅｌｃｈｅｎ−Ｍａｔｔｈｅｗｓら、２００３年、Ｇｒｉｇｏｒｏｖら、２００６年、Ｋｒａｍｅｒら、２００５年、Ｎｙｄｅｇｇｅｒら、２００３年、ＯｎｏおよびＦｒｅｅｄ、２００４年、Ｓｈｅｒｅｒら、２００３年）。これらのウイルス粒子は、ＭＶＢが形質膜と融合した場合に放出される。

細胞タンパク質のＡＰ−３が、ＭＶＢへのｇａｇの細胞内輸送を指示することが最近示された（Ｄｏｎｇら、２００５年）。出芽の直後に、これらの粒子は、ウイルスが感染性になるために不可欠である、成熟と呼ばれるプロセスを経、その際、ｇａｇポリタンパク質は、ウイルスプロテアーゼによって、マトリックス（ＭＡ）、カプシド（ＣＡ）、ヌクレオカプシド（ＮＣ）、およびｐ６ドメイン、ならびに２種のスペーサータンパク質、すなわちＳＰ１およびＳＰ２に順次切断される。このプロセスは、これらの粒子の形態の劇的な変化を誘発し、また、円錐形のカプシドに取り囲まれた高電子密度のコアが形成される。成熟したカプシド（ＣＡ）の形成は、ウイルスの感染性において不可欠な役割を果たす。ＣＡの変異は、ウイルス構築において有害な影響を有することが示されている（Ａｂｄｕｒａｈｍａｎら、２００４年、Ｃｈｉｅｎら、２００６年、Ｃｈｕら、２００６年、Ｄｏｕｇｌａｓら、２００４年、Ｆｏｒｓｈｅｙら、２００２年、Ｇａｎｓｅｒ−Ｐｏｒｎｉｌｌｏｓら、２００４年、Ｇｕｏら、２００５年、Ｊｏｓｈｉら、２００６年）。したがって、カプシドは、ＨＩＶ−１生活環において不可欠であるウイルス構築において重要な役割を果たし、ＨＩＶ−１に対抗する新しい世代の薬物を開発するための潜在的な標的とみなされている。

構築に対抗する薬物を開発する際の主要な障害は、効果的なスクリーニングシステムが無いことであったが、いくつかの新しいアッセイ法が最近報告されている（Ｄｅｒｄｏｗｓｋｉら、２００４年）。この困難にもかかわらず、ＨＩＶ−１構築を妨害するペプチドまたは低分子化合物の同定に関する報告がある（Ｎｉｅｄｒｉｇら、１９９４年、Ｈｏｇｌｕｎｄら、２００２年、Ｇａｒｚｏｎら、２００４年、Ｔａｎｇら、２００３年、Ｓａｋａｌｉａｎら、２００６年、Ｌｉら、２００３年）。カプシドの低分子阻害物質（ＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２）の同定における最初のブレークスルーは、Ｓｕｍｍｅｒｓのグループによって報告された（Ｔａｎｇら、２００３年）。Ｎ末端ＣＡ（Ｎ−ＣＡ）に対するＣＡＰ−１の親和力（Ｋ_ｄ）は約８００μＭにすぎなかったが、その同定が、この標的に対抗する潜在的な阻害物質を探すための起爆薬（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）であった。ｇａｇプロセシングを標的とする別の強力な低分子阻害物質であるＰＡ−４５７が、最近報告された（Ｌｉら、２００３年）。これらの低分子阻害物質は、ＨＩＶ−１の成熟を妨げる。後者の化合物は、現在、第ＩＩ相臨床試験に供されている。

最近、カプシドのＣ末端ＣＡ（Ｃ−ＣＡ）を標的とすることによってｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＩＶ−１構築を阻害する直鎖状小ペプチド（ＣＡＩ）が、ファージディスプレイ技術によって同定された（非特許文献１）。Ｘ線結晶解析により、ＣＡＩがヘリックスを形成し、かつＣ−ＣＡのヘリックス１、２、および４によって形成される疎水性の溝に結合することが明らかにされたが（非特許文献２）、溶液中でのその立体配座は報告されていない。解離定数（Ｋ_ｄ）は約１５μＭであると推定された。ＣＡＩは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで未成熟ＨＩＶ−１粒子と成熟ＨＩＶ−１粒子の両方に対して阻害を示すことが報告された最初の化合物であった。しかし、ＣＡＩの重要な欠点は、細胞に侵入することができず、そのため、生細胞において構築阻害物質として使用され得ないということである。

Ｓｔｉｃｈｔ，Ｊ．ら、Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＨＩＶ−１ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００５）１２， ６７１−６７７ Ｔｅｒｎｏｉｓ， Ｆ．， Ｓｔｉｃｈｔ， Ｊ．， Ｄｕｑｕｅｒｒｏｙ， Ｓ．， Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈ， Ｈ．Ｇ．およびＲｅｙ， Ｆ．Ａ．Ｔｈｅ ＨＩＶ−１ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａ ｖｉｒｕｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００５）１２， ６７８−６８２

感染細胞に侵入できるＨＩＶ構築阻害物質を有することが望ましいはずである。本発明は、このニーズに取り組むものである。

本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗ウイルス性であるが、細胞に侵入できないαヘリックスペプチドが、溶液中のペプチドのαらせん性を増大させる架橋手順を用いてそのペプチドを安定化した場合には、細胞に侵入し、かつｉｎ ｖｉｖｏで活性になるようにされ得るという発見に基づいている。

本発明は、長さ１０〜２３アミノ酸のペプチドを対象とし、これらのアミノ酸のうち２つは、α炭素においてＲ型またはＳ型の立体化学配置を有する非天然アミノ酸であり、
これらの非天然アミノ酸のα炭素は、メチル基およびオレフィン基（ｏｌｅｆｉｎｉｃ ｇｒｏｕｐ）を含み、これらの非天然アミノ酸の２つのオレフィン基はαヘリックスの同じ側にあり、結合してこれら２つの非天然アミノ酸間の架橋を形成し、
ペプチドのアミノ酸配列は、（Ｉ／Ｌ／Ｖ）（Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｖ／Ｃ）（Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｙ／Ｍ／Ｗ）（Ｄ／Ｅ／Ｓ）（Ｄ／Ｅ）（Ｌ／Ｆ／Ｉ／Ｖ／Ｙ／Ｍ／Ｗ）（Ｌ／Ｄ／Ｔ／Ｆ／Ｉ／Ｖ／Ｙ／Ｍ／Ｗ）（Ｄ／Ｅ／Ａ／Ｓ）（Ｙ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｍ／Ｗ）（Ｙ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｍ／Ｔ）またはその模倣体を含み、
これらの２つの非天然アミノ酸は、３アミノ酸離れた任意の位置（ｉおよびｉ＋３）、４アミノ酸離れた任意の位置（ｉおよびｉ＋４）、または７アミノ酸離れた任意の位置（ｉおよびｉ＋７）の２つのアミノ酸を置換し、
これら２つの非天然アミノ酸間の架橋は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、（Ｒ１−Ｋ−Ｒ１）_ｎであり、それぞれ０〜６個のＲ２で置換されており、
Ｒ１は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯＮＲ４、または

であり、
Ｒ２は、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＯＲ３、Ｎ（Ｒ３）_２、ＳＲ３、ＳＯＲ３、ＳＯ_２Ｒ３、ＣＯ_２Ｒ３、Ｒ３、蛍光性部分、または放射性同位体であり、
Ｒ３は、ＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、または治療用作用物質であり、
ｎは１〜４の整数である。

本発明はまた、カプシド含有ウイルスの構築を阻害できる前述のペプチドを、製薬上許容される担体中に含む薬剤組成物も対象とする。

さらに、本発明は、細胞におけるカプシド含有ウイルスの複製を阻害する方法も対象とする。これらの方法は、細胞におけるカプシド含有ウイルスの複製を阻害するのに十分な様式で、細胞を、カプシド含有ウイルスの構築を阻害できる前述のペプチドと接触させるステップを含む。

本発明は、カプシド含有ウイルスに感染した哺乳動物を治療する方法もさらに対象とする。これらの方法は、哺乳動物を治療するのに十分な様式で、前述の薬剤組成物を哺乳動物に投与するステップを含む。

本発明は、カプシド含有ウイルスに感染するリスクがある哺乳動物を処置する方法もさらに対象とする。これらの方法は、哺乳動物を処置するのに十分な様式で、前述の薬剤組成物を哺乳動物に投与するステップを含む。

さらに、本発明は、前述のペプチドのいずれかを作製する方法も対象とする。これらの方法は、アミノ酸を順次結合させ、次いで、オレフィンメタセシスを用いて、非天然アミノ酸の２つのオレフィン基を連結するステップを含む。

本発明はまた、カプシド含有ウイルスに感染した哺乳動物を治療するための医薬品を製造するための、カプシド含有ウイルスの構築を阻害できる前述のペプチドのいずれかの使用も対象とする。

さらに、本発明は、哺乳動物がカプシド含有ウイルスに感染するようになるリスクを低下させるための哺乳動物を処置するための医薬品を製造するための、カプシド含有ウイルスの構築を阻害できる前述のペプチドのいずれかの使用も対象とする。

また、本発明は、カプシド含有ウイルスに感染した哺乳動物を治療するための前述の薬剤組成物の使用も対象とする。

本発明はさらに、カプシド含有ウイルスに感染するリスクがある哺乳動物を処置するための前述の薬剤組成物の使用も対象とする。

直鎖状ペプチド（配列番号１；ＣＡＩ）および制約されたペプチド（ＮＹＡＤ−１）の細胞侵入および／または会合を示す実験結果のグラフである。これらのグラフは、ＦＩＴＣを結合させたペプチドと共に３７℃で４時間インキュベートした２９３Ｔ細胞およびＭＴ２細胞のＦＡＣＳ解析である。ＰＢＳで細胞を３回洗浄した後、解析した。上側のパネル：左は、ＦＩＴＣ−ペプチドを用いなかった場合の２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析である。中央は、ＦＩＴＣ−ＣＡＩを用いた場合の２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析である。右は、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＮＹＡＤ−１を用いた場合の２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ解析である。下側のパネル：左は、ＦＩＴＣ−ペプチドを用いなかった場合のＭＴ−２細胞のＦＡＣＳ解析である。中央は、ＦＩＴＣ−ＣＡＩを用いた場合のＭＴ−２細胞のＦＡＣＳ解析である。右は、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＮＹＡＤ−１を用いた場合のＭＴ−２細胞のＦＡＣＳ解析である。 ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＮＹＡＤ−１が２９３Ｔ細胞に侵入することを示す、細胞の顕微鏡写真である。ＦＩＴＣを結合させたペプチドと共に３７℃で２０時間インキュベートした２９３Ｔ細胞の共焦点顕微鏡画像である。ＰＢＳで細胞を３回洗浄した後、検査した。上側のパネル：左は、ＦＩＴＣ−ＣＡＩを用いた場合の細胞の微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像である。中央は、ＦＩＴＣ−ＣＡＩを用いた場合の同じ細胞のＦＩＴＣ蛍光画像である。右は、ＤＩＣ画像およびＦＩＴＣ蛍光画像のオーバーレイである。下側のパネル：左は、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＮＹＡＤ−１を用いた場合の細胞のＤＩＣ画像である。中央は、ＦＩＴＣ−β−Ａｌａ−ＮＹＡＤ−１を用いた場合の同じ細胞のＦＩＴＣ蛍光画像である。右は、ＤＩＣ画像およびＦＩＴＣ蛍光画像のオーバーレイである。 共焦点顕微鏡検査によるＮＹＡＤ−１およびＧａｇの直接的な共局在研究を示す写真である。異なる角度の画像を示した。（ａおよびｄ）ＦＩＴＣを結合させたＮＹＡＤ−１。（ｂおよびｅ）Ｇａｇ−ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ。（ｃ、ｆ）合体した写真により、ＦＩＴＣ−ＮＹＡＤ−１とＧａｇ−ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙの共局在が実証された。試料はすべて生細胞であり、トランスフェクション後２４時間目に採取した。 未成熟様粒子および成熟様粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの構築の阻害を示す、電子顕微鏡写真である。これらの画像は、何も加えない場合（ａおよびｄ）（対照）、５倍モル過剰のＣＡ１の存在下（ｂおよびｅ）、ならびに５倍モル過剰のＮＹＡＤ−１の存在下（ｃおよびｆ）における、Ｇａｇタンパク質およびＣＡタンパク質それぞれのｉｎ ｖｉｔｒｏでの構築に起因する粒子の陰性に染色されたＥＭ画像である。 ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の放出に対するＮＹＡＤ−１の影響を示す図である。Ｇａｇ（未成熟様粒子の場合）またはＧａｇ−ｐｏｌ（成熟様粒子の場合）をコードするベクターによるトランスフェクション後４時間目に、様々な濃度のＮＹＡＤ−１で２９３Ｔ細胞を処理した。トランスフェクション後４８時間目に、ＶＬＰを含む上清を回収した。ＥＬＩＳＡ（上側のパネルＡ、Ｂ）およびウェスタンブロット（下側のパネルＣ、Ｄ）によってｐ２４を測定することによって、未成熟様粒子および成熟様粒子の放出を測定した。ブロットの下の数値は、濃度測定によって得られたシグナル強度を示す。 ６．２５μＭ ＮＹＡＤ−１および５０μＭ ＮＹＡＤ−１の存在下で産生されるＨＩＶ−１ウイルス様粒子の電子顕微鏡的解析を示す写真である。ＧａｇまたはＧａｇ−ｐｏｌをコードするベクターによるトランスフェクション後４時間目に、Ｇａｇ（上側のパネル）またはＧａｇ−ｐｏｌ（下側のパネル）を発現する２９３Ｔ細胞を、何も含まない培地または６．２５μＭのＮＹＡＤ−１を含む培地および５０μＭのＮＹＡＤ−１を含む培地２ｍｌと共にインキュベートした。トランスフェクション後２４時間目に、細胞をペレット状にし、固定し、包埋し、切片化し、透過電子顕微鏡で検査した。（スケールバー＝５００ｎｍ）。

本発明は、長さ１０〜２３アミノ酸のペプチドを対象とし、これらのアミノ酸のうち２つは、α炭素においてＲ型またはＳ型の立体化学配置を有する非天然アミノ酸であり、
これらの非天然アミノ酸のα炭素は、メチル基およびオレフィン基を含み、これらの非天然アミノ酸の２つのオレフィン基はαヘリックスの同じ側にあり、結合してこれら２つの非天然アミノ酸間の架橋を形成し、
ペプチドのアミノ酸配列は、（Ｉ／Ｌ／Ｖ）（Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｖ／Ｃ）（Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｙ／Ｍ／Ｗ）（Ｄ／Ｅ／Ｓ）（Ｄ／Ｅ）（Ｌ／Ｆ／Ｉ／Ｖ／Ｙ／Ｍ／Ｗ）（Ｌ／Ｄ／Ｔ／Ｆ／Ｉ／Ｖ／Ｙ／Ｍ／Ｗ）（Ｄ／Ｅ／Ａ／Ｓ）（Ｙ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｍ／Ｗ）（Ｙ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｍ／Ｔ）またはその模倣体を含み、
これらの２つの非天然アミノ酸は、３アミノ酸離れた任意の位置（ｉおよびｉ＋３）、４アミノ酸離れた任意の位置（ｉおよびｉ＋４）、または７アミノ酸離れた任意の位置（ｉおよびｉ＋７）の２つのアミノ酸を置換し、
これら２つの非天然アミノ酸間の架橋は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、（Ｒ１−Ｋ−Ｒ１）_ｎであり、それぞれ０〜６個のＲ２で置換されており、
Ｒ１は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、
Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯＮＲ４、または

であり、
Ｒ２は、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＯＲ３、Ｎ（Ｒ３）_２、ＳＲ３、ＳＯＲ３、ＳＯ_２Ｒ３、ＣＯ_２Ｒ３、Ｒ３、蛍光性部分、または放射性同位体であり、
Ｒ３は、ＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、または治療用作用物質であり、
ｎは１〜４の整数である。

上記の式において、アミノ酸は、「ｗｈｅｒｅｉｎ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（ペプチドのアミノ酸配列は、含む）」の前の括弧内の文字によって表されるものだけであることを理解すべきである。これらの括弧の外側のＲ（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４）ならびに「Ｒ１−Ｋ−Ｒ１」中のＫは、次に定義する変動要素を表すことが理解され、また、これらの括弧の外側のＨ、Ｃ、Ｓは、水素原子、炭素原子、および硫黄原子をそれぞれ表すことが理解されるであろう。

本発明のペプチドはまた、αヘリックスを安定化させるための、公知の手順によるその後の変形も含むことが企図される。例えば、非天然アミノ酸のメチル基は、ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでの活性にも、ペプチドを安定化させ、かつそのαらせん性を高める架橋の能力にも影響を及ぼさずに、別の小型の（例えば、Ｃ１〜Ｃ５）アルキル、アルケニル、またはアルキニルで置換され得ると考えられている。

本明細書において使用される場合、アミノ酸間に斜線を引き括弧中に入れた、（一般的な一文字アミノ酸記号による）複数のアミノ酸としての本発明のペプチド中のアミノ酸残基の記号表示は、指定されたアミノ酸またはそれらの模倣体（特に除外しない限り）のいずれかがその残基を占め得ることを意味する。例えば、（Ｉ／Ｌ／Ｖ）（Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｖ／Ｃ）は、第１の残基が、イソロイシン、ロイシン、またはバリンのいずれか１つでよく、第２の残基が、トレオニン、セリン、アラニン、バリン、もしくはシステイン、または模倣体のいずれか１つでよいことを意味する。

本明細書において使用される場合、模倣体またはペプチド模倣体とは、天然のアミノ酸をペプチド模倣体で置換しても、そのタンパク質の活性が影響を受けないという点で、タンパク質中の天然の親アミノ酸を模倣することができる化合物である。ペプチド模倣体を含むタンパク質は、一般に、プロテアーゼの基質ではなく、天然タンパク質と比べて、より長い期間、ｉｎ ｖｉｖｏで活性である可能性が高い。さらに、それらは抗原性がより低い場合があり、全般的により高いバイオアベイラビリティを示す。当業者なら、任意の特定のペプチド（本発明のペプチドなど）のアミノ酸を置換し得るペプチド模倣体の設計および合成は、過度の実験を必要としないことを理解するであろう。例えば、Ｒｉｐｋａら、１９９８年、Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓら、１９９７年、Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ、１９９９年を参照されたい。本発明のために有用な模倣体の非限定的な例としては、Ｄアミノ酸、およびノルロイシンなどの制約されたアミノ酸、または２−アミノイソ酪酸が挙げられる。また、ペプチド配列中のアミノ酸が、αヘリックスを形成する傾向を有するアミノ酸で置換され得ることも、本発明の範囲内である。

本発明の各ペプチドは、ペプチドの安定性、反応性、および／または溶解性を高めるために、特定のアミノ酸ならびに／またはアミノ末端および／もしくはカルボキシ末端に、１つまたは複数の化学基の付加を含んでよい。例えば、カルボベンゾキシル、ダンシル、アセチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、または９−フルオレニルメトキシ−カルボニル基などの疎水基が、ペプチドのアミノ末端に付加されてよい。別の例では、疎水基、ｔ−ブチルオキシカルボニル、またはアミド基、もしくはｐａｒａ−ニトロベンジルエステル基が、ペプチドのカルボキシ末端に付加されてよい。このような修飾を導入するための技術は、当業者に周知である。

本発明のペプチドは、任意の薬剤として許容される塩の形態であってもよい。本発明の化合物の酸付加塩は、適切な溶媒中で、ペプチドおよび過剰の酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、コハク酸、またはメタンスルホン酸から調製される。本発明のペプチドが酸性部分を含む場合、適切な薬剤として許容される塩としては、ナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩、またはカルシウム塩やマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩を挙げることができる。アミノ末端がＨであり、カルボキシ末端がＮＨ_２であるペプチドの塩が好ましい。また、本発明は、遊離酸型のペプチドも含む。

本発明のペプチドのアミノ酸残基は、Ｓｔｉｃｈｔら（２００５年）によって同定された、アミノ酸配列ＩＴＦＥＤＬＬＤＹＹＧＰを有する特定のペプチド（配列番号１；ＣＡＩ）と、その研究において使用されたＣ−ＣＡＮＣタンパク質に最も頻繁に結合したペプチドにおいてＳｔｉｃｈｔら（２００５年）によって同定された、その配列中の置換物の組合せである（Ｓｔｉｃｈｔら、２００５年の表１を参照されたい）。また、Ｓｔｉｃｈｔらのペプチドの保存的置換物であるアミノ酸も含まれる。提供された配列の代替のアミノ酸または模倣体の任意の組合せからなるペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ（すなわち、細胞外で）カプシド含有ウイルスの構築を阻害すると考えられている。このような構築阻害は、例えば、以下の実施例において、またはＳｔｉｃｈｔら、２００５年において説明される方法によって、過度に実験をすることなく試験することができる。

好ましくは、このペプチドのアミノ酸配列は、（Ｉ／Ｖ）（Ｔ／Ｓ）（Ｆ／Ｗ／Ｙ）（Ｅ／Ｓ）（Ｄ／Ｅ）Ｌ（Ｌ／Ｄ／Ｔ）（Ｄ／Ａ／Ｓ）（Ｙ／Ｆ）（Ｙ／Ｍ）を含み、これは、Ｓｔｉｃｈｔらによって同定された特定のペプチド（配列番号１；ＣＡＩ）と、その研究において使用されたＣ−ＣＡＮＣタンパク質に最も頻繁に結合したペプチドにおいてＳｔｉｃｈｔらによって同定された、その配列中の置換物の組合せである（Ｓｔｉｃｈｔら、２００５年の表１を参照されたい）。

また、ペプチドは１１〜２３アミノ酸を含むことも好ましく、その場合、（Ｙ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｍ／Ｔ）に続くアミノ酸は（Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｈ／Ｃ／Ｌ／Ｒ／Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｍ／Ｋ）である。１１番目のペプチドに対するアミノ酸選択肢（Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｈ／Ｃ／Ｌ／Ｒ／Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｍ／Ｋ）は、Ｓｔｉｃｈｔら（２００５年）によって同定され、前述の保存的置換を有する。より好ましくは、（Ｙ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｍ／Ｔ）に続くアミノ酸はＧである。

ペプチドが１２〜２３アミノ酸を含むことはなおさら好ましく、その場合、（Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｈ／Ｃ／Ｌ／Ｒ／Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｍ／Ｋ）に続くアミノ酸は（Ｐ／Ｍ／Ｒ／Ｋ）、好ましくはＰである。最も好ましい実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は、ＩＴＦＥＤＬＬＤＹＹＧＰ（配列番号１）を含む。

２つの非天然アミノ酸間の好ましい架橋は、

（式中、（Ｃ）は非天然アミノ酸のα炭素である）
である。

好ましくは、非天然アミノ酸は、ｉ番目およびｉ＋４番目に存在する。最も好ましくは、これらは、ペプチドの４番目のアミノ酸［（Ｄ／Ｅ／Ｓ）］および８番目のアミノ酸［（Ｄ／Ｅ／Ｓ）］、ペプチドの７番目のアミノ酸［（Ｌ／Ｄ／Ｔ／Ｆ／Ｉ／Ｖ／Ｙ／Ｍ／Ｗ）］および１１番目のアミノ酸［（Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｈ／Ｃ／Ｌ／Ｒ／Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｍ）］、またはペプチドの８番目のアミノ酸［（Ｄ／Ｅ／Ｓ）］および１２番目のアミノ酸［（Ｐ／Ｍ／Ｒ／Ｋ）］を置換する。

最も好ましくは、ペプチドは、

を含むか、またはそれからなる。

本発明のペプチドは細胞に入ることができるため、細胞中に任意の付加的な有用部分、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、金属などを送達するための送達系としてそれらを使用することができる。これらのペプチドが、細胞中に送達すべき付加的な部分を含む場合、この付加的な部分は、好ましくは、検出可能な部分、治療用化合物、または抗原である。好ましい検出可能な部分としては、蛍光性部分および放射性部分が挙げられる。ペプチドが抗原をさらに含む場合、抗原は、有用な免疫学的応答を誘発することができる任意のものでよい。非限定的な例としては、ウイルスに対する免疫性を誘導することができるウイルス抗原、および細菌、例えば結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対する免疫性を誘導する抗原、または寄生虫に対する免疫性を誘導する抗原、例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原が挙げられる。好ましいウイルス抗原はＨＩＶ抗原である。

その部分が治療用化合物である場合、化合物は、現在公知であるか、または後に発見される任意の治療用化合物でよく、例えば、長さ２０アミノ酸未満、または長さ１０アミノ酸未満のオリゴペプチドが挙げられる。好ましい治療用化合物は、分子量２０００未満の有機化合物、例えば、抗ウイルス化合物である。このような治療用化合物は、例えば、細胞内エステラーゼに感受性であるエステル結合によりペプチドの残部に結合して、ペプチドが細胞に入るまで治療用化合物が確実に放出されないようにしているプロドラッグの形態でよい。このようなプロドラッグを作製する方法は、当技術分野において公知である。

実施例で明らかにするように、このペプチド

は細胞に入り、かつＨＩＶ繁殖を阻害することができる。いかなる特定の機序にも拘泥するものではないが、このペプチドはＨＩＶ ｇａｇタンパク質のカプシドドメインに結合して、ウイルス構築、したがって複製を妨害すると考えられている。したがって、本発明のペプチドは、任意のカプシド含有ウイルスに結合し、かつその複製を阻害すると予想される。このようにして、好ましいペプチドは、細胞におけるカプシド含有ウイルスの複製を阻害することができる。カプシド含有ウイルスの例としては、ＨＩＶなどのレンチウイルスを含むレトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）；風疹ウイルスを含むトガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）；エンテロウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、およびＡ型肝炎ウイルスなどのピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；インフルエンザウイルスなどのオルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）；パラミクソウイルスなどのパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）；ヘルペスウイルスやサイトメガロウイルスなどのヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）；Ｂ型肝炎ウイルスなどのヘプナウイルス科（Ｈｅｐｎａｖｉｒｉｄａｅ）；フラビウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、およびデング熱ウイルスなどのフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）；ＳＡＲＳウイルスおよびトロウイルスを含むコロナウイルスなどのコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）；エボラウイルスやマルブルグウイルスなどのフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）；ハンタウイルスやアレナウイルスなどのブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）が挙げられる。

カプシド含有ウイルスは、好ましくは、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ、ネコ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ肉腫ウイルスもしくはネコ白血病ウイルス、またはウシ白血病ウイルスである。

より好ましくは、ペプチドは、レンチウイルスの複製を阻害する。最も好ましい実施形態では、ペプチドは、ＨＩＶの複製を阻害することができる。実施例では、前述のペプチドが多様なＨＩＶ分離株を阻害することを示すため（表１）、これらのペプチドは、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含む任意のＨＩＶ株を阻害できることが予想される。

本発明はまた、カプシド含有ウイルスの構築を阻害できる前述のペプチドを、製薬上許容される担体中に含む薬剤組成物も対象とする。

前述の化合物は、個々の用途に応じて適宜、ヒトを含む哺乳動物に投与するために、過度に実験をすることなく製剤化することができる。さらに、これらの組成物の適切な投与量も、標準的な用量反応プロトコルを用いて、過度に実験をすることなく決定することができる。

したがって、経口投与、経鼻投与、舌投与、舌下投与、頬側投与、および口腔内投与のために設計される組成物は、過度に実験をすることなく、当技術分野において周知の手段によって、例えば、不活性な希釈剤または可食性の担体を用いて、作製することができる。これらの組成物は、ゼラチンカプセル剤中に封入してもよく、または圧縮して錠剤にしてもよい。経口的な治療的投与をするために、本発明の薬剤組成物を賦形剤と混合し、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラート剤、およびチューインガムなどの形態で使用することができる。

錠剤、丸剤、カプセル剤、およびトローチ剤などは、結合剤、レシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、および矯味剤も含んでよい。結合剤のいくつかの例としては、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンが挙げられる。賦形剤の例としては、デンプンまたはラクトースが挙げられる。崩壊剤のいくつかの例としては、アルギン酸およびトウモロコシデンプンなどが挙げられる。滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カリウムが挙げられる。流動促進剤の例は、コロイド状二酸化ケイ素である。甘味剤のいくつかの例としては、スクロースおよびサッカリンなどが挙げられる。矯味剤の例としては、ペパーミント、サリチル酸メチル、およびオレンジ香料などが挙げられる。これらの様々な組成物を調製する際に使用される材料は、薬学的に純粋であり、かつ、使用される量で非毒性であるべきである。

これらの化合物は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、くも膜下腔内注射、または皮下注射によってなど、非経口的に容易に投与することができる。非経口投与は、これらの化合物を液剤または懸濁剤中に混合することによって遂行することができる。このような液剤または懸濁剤は、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤などの無菌希釈剤も含んでよい。非経口製剤はまた、例えば、ベンジルアルコールやメチルパラベンなどの抗菌剤、例えばアスコルビン酸や重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、およびＥＤＴＡなどのキレート剤も含んでよい。また、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムやデキストロースなど張性を調整するための作用物質も、添加してよい。非経口製剤は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用バイアル中に入れることができる。

直腸投与は、薬剤組成物中の化合物を直腸または大腸中に投与するステップを含む。これは、坐剤または浣腸を用いて遂行することができる。坐剤製剤は、当技術分野において公知の方法によって容易に作製することができる。例えば、坐剤製剤は、グリセリンを約１２０℃まで加熱し、組成物をグリセリン中に溶解し、加熱したグリセリンを混合し（この後、精製水を添加してもよい）、熱い混合物を坐剤の鋳型中に流し込むことによって、調製することができる。

経皮投与は、皮膚を経由した組成物の経皮的吸収を含む。経皮製剤としては、パッチ（周知のニコチンパッチなど）、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、および膏薬などが挙げられる。

本発明はさらに、細胞におけるカプシド含有ウイルスの複製を阻害する方法も対象とする。これらの方法は、細胞におけるカプシド含有ウイルスの複製を阻害するのに十分な様式で、細胞を、カプシド含有ウイルスを阻害できる前述のペプチドと接触させるステップを含む。

これらの方法は、任意のカプシド含有ウイルスに対して有用である。好ましくは、ウイルスはレトロウイルス、より好ましくはレンチウイルス、最も好ましくはＨＩＶである。

カプシド含有ウイルスに感染した任意の原核細胞、真核細胞、または古細菌細胞を、本発明のペプチドで処置することができる。この方法では、（例えば、実施例におけるもののように）培養状態の細胞、または好ましくは、任意の植物もしくは動物を含めて、生きた多細胞生物の細胞を利用することができる。より好ましくは、細胞は、カプシド含有ウイルスに感染した生きた脊椎動物の一部分である。さらにより好ましくは、細胞は、カプシド含有ウイルスに感染した哺乳動物中に存在する。さらにより好ましくは、哺乳動物はヒト、最も好ましくは、ＨＩＶに感染したヒトである。

ウイルスが生きた哺乳動物中に存在する場合、本発明の方法は、少なくとも１種の他の抗ウイルス治療、例えば、ＨＩＶに対して使用される任意の抗ウイルス治療またはその組合せと併用して使用され得ることが企図される。

本発明は、カプシド含有ウイルスに感染した哺乳動物を治療する方法もさらに対象とする。これらの方法は、哺乳動物を治療するのに十分な様式で、前述の薬剤組成物を哺乳動物に投与するステップを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

これらの方法は、任意のカプシド含有ウイルスに対して有用である。好ましくは、ウイルスはレトロウイルス、より好ましくはレンチウイルス、最も好ましくはＨＩＶである。

これらの方法のためのペプチドは、好ましくは、

を含む。

これらの方法のいくつかの応用は、ウイルスに感染した妊娠した雌を処置して、子宮内の胎仔に、または分娩中の仔に、ウイルスを渡すリスクを低下させることを含む。

本発明の方法は、少なくとも１種の他の抗ウイルス治療、例えば、ＨＩＶに対して使用される任意の抗ウイルス治療またはその組合せと併用して使用され得ることが企図される。

これらの方法はまた、カプシド含有ウイルスの感染に対抗する予防法として使用することもできる。したがって、本発明は、カプシド含有ウイルスに感染するリスクがある哺乳動物を処置する方法もさらに対象とする。これらの方法は、哺乳動物を処置するのに十分な様式で、前述の薬剤組成物を哺乳動物に投与するステップを含む。

これらの方法は、任意のカプシド含有ウイルスに対して有用である。好ましくは、ウイルスはレトロウイルス、より好ましくはレンチウイルス、最も好ましくはＨＩＶである。

これらの方法のためのペプチドは、好ましくは、

を含む。

これらの方法のいくつかの応用は、ウイルスに感染した母親の子宮内の胎仔を処置して、子宮内の胎仔に、または分娩中の仔に、ウイルスを渡すリスクを低下させることを含む。

また、本発明の方法は、少なくとも１種の他の抗ウイルス治療、例えば、ＨＩＶに対して使用される任意の抗ウイルス治療もしくはその組合せ、またはワクチン接種を含む任意の予防的抗ウイルス治療と併用して使用され得ることも企図される。

さらに、本発明は、前述のペプチドのいずれかを作製する方法も対象とする。これらの方法は、アミノ酸を順次結合させ、次いで、オレフィンメタセシスを用いて、非天然アミノ酸の２つのオレフィン基を連結するステップを含む。これらの方法は、例えば、Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒら、２０００年、Ｗａｌｅｎｓｋｙら、２００４年、米国特許出願公開第２００６／０００８８４８Ａ１号、およびＰＣＴ特許出願国際公開第２００５／０４４８３９Ａ２号パンフレットに記載されている。好ましくは、固相合成を用いてアミノ酸を結合する。

本発明はまた、カプシド含有ウイルスに感染した哺乳動物を治療するための医薬品を製造するための、カプシド含有ウイルスの構築を阻害できる前述のペプチドのいずれかの使用も対象とする。

さらに、本発明は、哺乳動物がカプシド含有ウイルスに感染するようになるリスクを低下させるための哺乳動物を処置するための医薬品を製造するための、カプシド含有ウイルスの構築を阻害できる前述のペプチドのいずれかの使用も対象とする。

また、本発明は、カプシド含有ウイルスに感染した哺乳動物を治療するための前述の薬剤組成物の使用も対象とする。

本発明はさらに、カプシド含有ウイルスに感染するリスクがある哺乳動物を処置するための前述の薬剤組成物の使用も対象とする。

本発明の好ましい実施形態は、以下の実施例において記述される。本明細書における特許請求の範囲内の他の実施形態は、本明細書において開示する本発明の明細書および実施を考慮することにより、当業者には明らかであろう。明細書は、実施例と共に、例示にすぎないとみなされ、本発明の範囲および精神は、実施例に続く特許請求の範囲によって示されることが意図される。

実施例への導入
Ｃ−ＣＡに結合したＣＡＩ（配列番号１）のＸ線結晶構造を、構造に基づいたアプローチによるＣＡＩの合理的修飾において使用して、らせん状で代謝的に安定であり、かつ細胞に侵入する制約されたペプチド（ＣＰＣＰ）を形成させた。Ｃ−ＣＡの疎水性間隙に結合するＣＡＩ中の不可欠なアミノ酸が保存され、かつ直鎖状ペプチドをタンパク質分解に対して安定な細胞侵入ペプチドに変換する場合には、制約されたペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの抗ウイルス効力が実現され得ると推論した。

細胞透過性は、標的部位が細胞内部に位置している場合には、任意の薬物がｉｎ ｖｉｖｏ活性を有するための必要条件である。ペプチドベースの阻害物質は細胞透過性を欠いているため、ｉｎ ｖｉｖｏでの用途での有用性が限定される。ペプチドのらせん構造および代謝安定性を向上させる多くの技術が報告されている。いくつかの場合では、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて改善した結合親和力が報告されている。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏまたは細胞ベースのアッセイにおける阻害効力はめったに報告されなかったことから、これらの修飾によっては、これらのペプチドは細胞に対して透過性になり得ないことが示唆された（Ｐｈｅｌａｎら、１９９７年、Ｌｅｄｕｃら、２００３年、Ｙａｎｇら、２００４年、Ｗａｎｇら、２００５年）。したがって、本発明者らは、Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒらによって報告されている（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒら、２０００年）、直鎖状ペプチドのαらせん性を安定化させる、新しくかつ実験で確認された技術に頼った。この方法は、全炭化水素の架橋系に基づいており、ヘリックスのｉおよびｉ＋４またはｉ＋７位のアミノ酸が、オレフィン側鎖を有する合成によって制約されたアミノ酸で置換され、次いで、オレフィンメタセシスによってこれらが架橋された。この技術は「炭化水素ステープリング」と呼ばれ、Ｗａｌｅｎｓｋｙらによって、ｉｎ ｖｉｖｏでアポトーシスを活性化する際にＢＣＬ−２ホモロジー（ＢＨ）タンパク質ＢＨ３に最近成功裡に適用された（Ｗａｌｅｎｓｋｙら、２００４年）。らせん安定性および代謝安定性を有する制約されたＢＨ３ペプチドは、実質的にそれが増加しただけでなく、より効率的に細胞に侵入し、また、マルチドメインＢＣＬ−２に対する結合親和力の増大も示した。

（実施例１）
ペプチド合成
（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−（２’−ペンテニル）アラニンの不斉合成物を、Ｑｉｕら（２０００年）の方法により、Ａｌａ−Ｎｉ（ＩＩ）−ＢＰＢ−複合体を用いて調製した。構造

を有する制約されたペプチドを、Ｆｍｏｃ固相合成法により、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（０．３３ｍｍｏｌ／ｇ）を用いて手作業で合成した。通常のアミノ酸の場合、連結は、４倍過剰の活性化アミノ酸を用いて実施した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸：ＨＢＴＵ：ＨＯＢｔ：ＤＩＥＡを１：１：１：２の比率で用いて、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を活性化した。（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−（２’−ペンテニル）アラニンの場合、２倍過剰のアミノ酸を用いて連結を実施し、また、ＤＩＣ：ＨＯＡｔ（１：１）を用いて活性化した。ペプチドオレフィンメタセシス（Ｓｈａｆｍｅｉｓｔｅｒら、２０００年）のために、Ｆｍｏｃ基で保護されたＮ末端を有するペプチド樹脂を、室温で２時間、ビス（トリシクロヘキシルホスフィン）ベンジリジンルテニウム（ＩＶ）ジクロリド（１０ｍＭ）を含む脱気した１，２ジクロロエタンで処理し、また、完了させるために、反応を一度繰り返した。脱Ｆｍｏｃ後、標準プロトコルを用いて（９５％ＴＦＡ、２．５％水、２．５％ＴＩＳ）、樹脂に結合したペプチドを切断した。切断したペプチドを、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／水および０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ／アセトニトリルを用いたＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、エレクトロスプレー質量分析を用いて、それらの同一性を確認した。

蛍光標識したペプチドの場合、樹脂上で上記の制約されたペプチドのＮ末端の基をβ−ＡｌａおよびＦＩＴＣ（ＤＭＦ／ＤＩＥＡ）でさらに誘導体化した後、切断した。他の切断、精製、および確認ステップは、上記と同じであった。

（実施例２）
直鎖状ペプチドおよび制約されたペプチドの細胞取込みの評価
制約されたペプチドが細胞に侵入することを示すための最初の実験では、２種の異なる細胞型、すなわち２９３Ｔ細胞およびＭＴ−２細胞を用いて、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）解析を実施した（図１）。しかし、ＦＡＣＳ解析における結果では、ペプチドが細胞表面と結合する場合があるため、制約されたペプチドが細胞に侵入したかどうかを決定的に示すことができないことを示す最近の報告がある（Ｒｉｃｈａｒｄら、２００３年、Ｌｕｎｄｂｅｒｇら、２００２年）。そこで、共焦点顕微鏡研究を実施して、制約されたペプチドが実際に細胞膜に侵入し、細胞によって取り込まれたのに対し、直鎖状ペプチド（ＣＡＩ）は侵入しないことを決定的に示した（図２）。

ＦＩＴＣを結合させたペプチドで処理した細胞のＦＡＣＳ解析。２９３Ｔ細胞およびＭＴ２細胞を、ＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７、および５０ｍＭ β−メルカプトエタノール中で維持した。ＦＩＴＣを結合させたペプチドで処理する前の日に、細胞を２４ウェルプレート中に播種した（２×１０^４個／ウェル）。１×ＰＢＳで２回洗浄した後、３７℃で４時間、無血清培地に溶かした５μＭのＦＩＴＣを結合させたペプチドと共に細胞をインキュベートし、次いで、１×ＰＢＳで３回洗浄し、３７℃で３０分間、０．２５％トリプシンで消化した。１×ＰＢＳでもう１回洗浄した後、再懸濁させた細胞をＦＡＣＳ解析（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）に供した。このデータから、２９３Ｔ細胞の約４０％および９６％が、それぞれ、ＦＩＴＣを結合させたＣＡＩおよびＦＩＴＣを結合させたＮＹＡＤ−１に関して陽性に染色されたことが示される。一方、ＭＴ−２細胞のどれも、ＦＩＴＣを結合させたＣＡＩに関して陽性に染色されることはなかったが、ＭＴ−２細胞の約９２％が、ＦＩＴＣを結合させたＮＹＡＤ−１に関して陽性に染色された。

共焦点顕微鏡検査。２９３Ｔ細胞およびＭＴ２細胞を４ウェルチャンバープレートに播種し、無血清培地中で４時間、または／および血清を含む完全培地中でさらに１６時間、前述したように、ＦＩＴＣを結合させたペプチドと共にインキュベートした。１×ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社）のもとで生細胞を検査し、画像化した。図２に示したように、制約されたペプチドは細胞膜に侵入し、細胞によって取り込まれたのに対し、直鎖状ペプチド（ＣＡＩ）は侵入しなかった。

（実施例３）
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの構築の阻害
無細胞の方法および細胞ベースの方法の両方を用いて、ＣＡＩおよびＮＹＡＤ−１で処理した後のウイルス様粒子の形態学的変化を観察した。

無細胞系。（Ｈｕｓｅｂｙら、Ｇａｎｓｅｒ−Ｐｏｒｎｉｌｌｏｓら）によって説明されている内容を少し修正して用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏの構築系を設定した。本発明者らは、５０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ８．０を透析緩衝液として使用した。構築研究のために使用した緩衝液は、０．１〜２ＭのＮａＣｌも含んだ。５００−Ｄａ−ＭＷＣＯ（分画分子量）の透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）をペプチド透析のために使用した。手短に言えば、ｐＨ８．０のＮａ_２ＨＰＯ_４緩衝液を用いて、ストックタンパク質を適切な濃度に調整した（Ｇａｇタンパク質の場合２５μΜ、ＣＡタンパク質の場合５０μＭ）。５％の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）全ＲＮＡ（ＲＮＡ：タンパク質＝１：２０（重量比））を添加し、５倍過剰のＣＡＩもしくはＮＹＡＤ−１と共に、またはそれらを伴わずに４℃で３０分間インキュベーションした後、１００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ８．０のＮａ_２ＨＰＯ_４緩衝液中で、４℃で一晩、試料を透析した。ＣＡ成熟様粒子の構築の場合、５％の大腸菌全ＲＮＡの添加は避けた。陰性染色を用いて構築を確認した。組み立てられた未成熟または成熟ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に対する阻害効果を試験するために、様々な濃度のＣＡＩまたはＮＹＡＤ−１をＶＬＰと共に４℃で３０分間インキュベートした。炭素でコーティングした銅製グリッド（２００メッシュサイズ；ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、２０μｌのポリ−Ｌ−リシン（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社）で２分間処理した。反応溶液２０μｌをグリッド上に２分間置いた。次いで、スポットされたグリッドを、酢酸ウラニル溶液３０μｌで２分間染色した。過剰な染色は除去し、グリッドを風乾させた。Ｐｈｉｌｉｐｓ ＥＭ４１０電子顕微鏡で標本を検査した。

ＮＹＡＤ−１が、未成熟ウイルスの構築および成熟ウイルスの構築の両方を阻害する能力を保持しているかどうかを検証するために、本発明者らは、２つのｉｎ ｖｉｔｒｏの構築系を設定した。本発明者らは、完全長Ｇａｇタンパク質を用いて、球形の未成熟様粒子を形成させた（図４ａ）。５倍モル過剰のＣＡＩまたはＮＹＡＤ−１と共にインキュベーションした後、これらの粒子を完全に粉砕した（図４ｂおよびｃ）。成熟様粒子の場合、本発明者らはＣＡタンパク質を発現させ、精製し、筒型の粒子を得た（図４ｄ）。５倍モル過剰のＣＡＩまたはＮＹＡＤ−１いずれかと共にインキュベーションした後、これら筒型の粒子を完全に粉砕した（図４ｅおよびｆ）。成熟様粒子を形成させるためにＣＡＮＣの代わりにＣＡを用いた理論的根拠は、ＮＹＡＤ−１がＣＡのみを標的とすることを確認することであった。

細胞ベースの系。ＶＬＰ放出およびＶＬＰの形態に対するＮＹＡＤ−１の影響を解析するために、ＧａｇまたはＧａｇ−ｐｏｌをコードするプラスミドによるトランスフェクション後１日目に電子顕微鏡検査を実施した。トランスフェクションの前日に、ウェル当たり４×１０^５個の２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート中に播種した。４時間のトランスフェクション後に細胞を２回洗浄し、また、様々な濃度のＮＹＡＤ−１の存在下または不在下で、さらに２０時間、完全培地と共にインキュベートした。１００ｍＭカコジル酸ナトリウム中３％グルテルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）中で１時間細胞を固定し、また、１００ｍＭカコジル酸ナトリウム中１％ＯｓＯ_４でさらに１時間、後固定した。次いで、段階的な濃度系列のエタノール溶液を通過させて標本を脱水し、ＥＰＯＮ封入剤中に包埋した。酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した後、８０ＫｖのＰｈｉｌｉｐｓ ＥＭ４１０電子顕微鏡で超薄切片を検査した。

ＮＹＡＤ−１が細胞中の未成熟様粒子および成熟様粒子を破壊することを確認するために、本発明者らは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、および電子顕微鏡検査（ＥＭ）を用いて、放出された粒子を定量的にも定性的にも評価した。ＥＬＩＳＡの結果から、Ｇａｇをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞を、段階的な濃度のＮＹＡＤ−１で処理した場合、ウイルス様粒子の放出が用量依存的に阻害されることが示された。５０μΜの用量では、未成熟様粒子の放出は、未処理の細胞と比べて約７２分の１に減少することが観察された（図５Ａ）。ＮＹＡＤ−１で処理した、Ｇａｇ−ｐｏｌをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞でも、同様の結果（６７分の１に減少）が得られる（図５Ｂ）。また、上清を用いて実施したウェスタンブロット実験によっても、ＮＹＡＤ−１で処理した、Ｇａｇをトランスフェクトされた細胞（図５Ｃ）とＧａｇ−ｐｏｌをトランスフェクトされた細胞（図５Ｄ）の双方の同様の阻害傾向が確認された。

未処理のＧａｇをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の電子顕微鏡解析により、明瞭な未成熟様粒子が示された（図６Ａ）。しかし、細胞を６．２５μＭまたは５０μＭのＮＹＡＤ−１で処理した場合、粒子の大多数は異常な形状を有している（図６ＢおよびＣ）。未処理のＧａｇ−ｐｏｌをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の場合、高電子密度のコア構造体を含む多数の成熟様粒子が存在した（図６Ｄ）。これらの細胞を６．２５μＭまたは５０μＭのＮＹＡＤ−１で処理した場合、高電子密度のコア構造体は、放出されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）において失われていた（図６ＥおよびＦ）。まとめると、これらのデータから、ＮＹＡＤ−１がＧａｇを標的とし、細胞レベルでＧａｇまたはその産生物の組織化を障害することが裏付けられる。

（実施例４）
ウイルス複製の阻害およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性の評価
ＭＴ−２細胞およびＰＢＭＣ細胞、ならびに実験室に適応させたいくつかのＨＩＶ−１株、例えば、ＡＺＴ耐性分離株を含めて、ＨＩＶ−１ ＩＩＩＢ、ＢａＬ、ＳＦ２、ＳＦ１６２、９３Ｎ１０１、９３ＵＳ６５７、９３ＭＷ９５９、９２ＲＷ００８などを、ウイルス阻害アッセイのために使用した。細胞株およびＨＩＶ−１株は、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍを通じて得ることができる。

実験室に適応させたＨＩＶ−１株による感染に対する、実施例１において説明した制約されたペプチドの阻害活性を、Ｊｉａｎｇら（１９９１年）に記載されているようにして決定した。手短に言えば、１×１０^４個のＭＴ−２細胞を、段階的な濃度のペプチドの存在下または不在下で、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌ中の１００ＴＣＩＤ_５０（５０％組織培養感染量）（０．０１ＭＯＩ）のＨＩＶ−１に一晩感染させた。次いで、培養上清を除去し、新鮮な培地を添加した。感染後４日目に、培養上清１００μｌを各ウェルから採取し、等体積の５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と混合し、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ハイアリーア、フロリダ州）社製のキットを用いたＥＬＩＳＡによってｐ２４抗原に関して分析し、表１に提示した。

初代ＨＩＶ−１分離株による感染に対するこれらのペプチドの阻害活性を、Ｊｉａｎｇら（２００４年）に記載されている方法によって決定した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ社）を用いた標準的な密度勾配遠心分離によって、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒの健常なドナーの血液からＰＢＭＣを単離した。これらの細胞を３７℃で２時間培養した。非接着細胞を採取し、１０％ＦＢＳ、５μｇ／ｍｌ ＰＨＡ、および１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中に細胞５×１０^６個／ｍｌで再懸濁し、続いて、３７℃で３日間インキュベーションした。ＰＨＡで刺激した細胞（５×１０^４個）を、段階的な濃度のペプチドの不在下または存在下で、５００ＴＣＩＤ_５０の対応する初代ＨＩＶ−１分離株に感染させた。培地を３日毎に交換した。感染後７日目に上清を採取し、ＥＬＩＳＡによってｐ２４抗原について試験した。ｐ２４産生の阻害率を算出し、また、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いてＩＣ_５０値を算出し、表１に提示した。

ＭＴ−２細胞およびＰＢＭＣにおける制約されたペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性を、先行技術において報告されているように（Ｊｉａｎｇら、２００４年）、ＸＴＴ（ナトリウム３’−（１−（フェニルアミノ）−カルボニル）−３，４−テトラゾリウム−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルホン（ｂｅｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ）酸水和物）、明るい黄みがかったテトラゾリウム色素を用いた比色法によって測定した。手短に言えば、ＭＴ−２細胞の場合、段階的な濃度のペプチド１００μｌを、９６ウェルプレートのウェル中の等体積の細胞（５×１０^５個／ｍｌ）に添加し、続いて３７℃で４日間インキュベーションした。これは、ウイルスの代わりに培地を添加する点のみ異なる、ＭＴ−２における中和アッセイと並行して実施した。ＰＢＭＣの場合、５×１０^５個の細胞／ｍｌを使用し、７日後に細胞毒性を測定した。ＸＴＴ（ＰｏｌｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．社、ウォリントン、ペンシルベニア州）を添加した後、４時間後に、６２０ｎｍでの参照値を用い、４５０ｎｍで比色分析することより、可溶性の細胞内ホルマザンを定量した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．社、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて細胞毒性パーセントおよびＣＣ_５０（５０％細胞毒性を与える濃度）の値を算出し、表１に記載した。

ＮＹＡＤ−１は、無細胞の構築系ならびに細胞ベースの構築系において、未成熟様粒子および成熟様粒子の双方の阻害を示した。しかし、本発明者らの目標は、それぞれ、ＭＴ−２細胞およびＰＢＭＣにおいて、いくつかの実験室に適応させた分離株および初代分離株を用いた細胞ベースのアッセイにおけるその抗ＨＩＶ−１活性を確認することであった。ＮＹＡＤ−１によるＭＴ−２細胞におけるｐ２４産生の阻害を、ある範囲の濃度に渡って測定し、ｐ２４産生を５０％阻害するのに必要とされる濃度（ＩＣ_５０）を算出した。表１の結果から、ＮＹＡＤ−１が、Ｒ５、Ｘ４、またはＲ５Ｘ４補助受容体を使用する様々な亜型に相当する広範囲のＨＩＶ−１株を効率的に阻害したことが示される。ＮＹＡＤ−１は、低濃度（μＭ）の効力で（ＩＣ_５０約４〜１５μＭ）、実験室株を阻害し、また、Ｒ５向性ウイルスおよびＸ４向性ウイルスはどちらも同様の効力で阻害された。また、本発明者らが、ＭＴ−２において１つのＸ４向性ＲＴ耐性（ＡＺＴ）株、ＰＢＭＣにおいて１つの二重向性（Ｒ５Ｘ４）ＲＴ耐性（ＡＺＴ）株も試験したところ、ＮＹＡＤ−１は、若干高い効力で、二重向性耐性ウイルスを阻害した。

本発明者らは、補助受容体の用法が多様な、主としてグループＭ（亜型Ａ〜Ｇ）に相当するＨＩＶ−１初代分離株のパネルに対するＮＹＡＤ−１の阻害をＰＢＭＣにおいて試験した。ＮＹＡＤ−１は、グループＯに属する１種も含めて、試験したすべての初代分離株に対する阻害を示した（表１）。しかし、このウイルス（ＢＣＦ０２）ならびにクレードＥに属する１種（９３ＴＨ０５１）に対するＩＣ_５０値は、わずかに高かった。この多様な範囲の初代分離株に対する阻害活性が類似していたことから、広範囲のＨＩＶ−１分離株に対する有効性が示唆される。

ＭＴ−２細胞およびＰＢＭＣの双方において、ＸＴＴ法によってＮＹＡＤ−１の細胞毒性を評価した。ＨＩＶ−１阻害アッセイと並行して、細胞毒性アッセイを実施した。ＭＴ−２およびＰＢＭＣに対するＣＣ_５０（５０％の細胞毒性をもたらすのに必要とされる阻害物質濃度）値は、それぞれ、１３５μＭ超および３００μＭ超であった。

（実施例５）
炭化水素ステープリングによって増大させたＮＹＡＤ−１のαらせん性
本発明者らは、円偏光二色性（ＣＤ）を用いて、溶液中の複合体形成していない状態のＮＹＡＤ−１およびＣＡＩの２次構造を特徴付けた。２０℃、最終濃度１２５〜５００μＭの１〜１５％（体積／体積）アセトニトリルの存在下、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）中で、標準的な測定パラメーターを用いて、Ｊａｓｃｏ Ｊ−７１５ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ（Ｊａｓｃｏ Ｉｎｃ社、日本）によってＣＤスペクトルを得た。すべての試料において、ペプチドおよび塩の最終濃度は常に同じであり、また、適切な参照溶媒のＣＤスペクトルを引くことによってスペクトルを補正した。２２２ｎｍでのモル楕円率（［θ］）の値から、αヘリックスの比率（％）を算出した。ＣＡＩのＣＤスペクトルは、２２２ｎｍおよび２０８ｎｍで典型的なヘリックス最小値を示さず、もっと正確に言えば、溶液中でのランダムコイル構造を示す、２０５ｎｍでの強い最小値が観察された。このことは、結合により、Ｃ−ＣＡと複合体を形成したＣＡＩペプチドの立体配座の変化が誘導されたことを裏付ける。一方、ＮＹＡＤ−１のＣＤスペクトルは、２２２ｎｍおよび２０８ｎｍの双方で別個の最小値を示した。２２２ｎｍでのモル楕円率の値から算出したＮＹＡＤ−１のαらせん性は約８０％である。これらの結果は、炭化水素ステープリングによってＣＡＩのαらせん性が増大するという本発明者らの仮説を裏付ける。

（実施例６）
ＮＹＡＤ−１はＨＩＶ−１ Ｇａｇと共局在する
ＮＹＡＤ−１は細胞に侵入するが、それがＧａｇポリタンパク質と共局在し、かつ相互作用して、ウイルス構築を阻害することは確実でない。この懸念に対処するために、本発明者らは、ＨＩＶ−１ Ｇａｇ−ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ融合タンパク質およびＦＩＴＣを結合させたＮＹＡＤ−１を用いて、直接的な共局在実験を実施した。ｐＥＦ６Ａ−Ｇａｇ−ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙを２９３Ｔ細胞に４時間トランスフェクトし、次いでＰＢＳで１回細胞を洗浄することによって、直接的な共局在研究を実施した。ＦＩＴＣを結合させたペプチドを含む無血清培地または血清添加培地を添加して、さらに２０時間培養した。３回洗浄した後、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社）のもとでこれらの細胞を検査し、画像化した。Ｇａｇ−ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙをトランスフェクトさせた細胞を、ＦＩＴＣを結合させたＮＹＡＤ−１に曝露した場合、かなりの割合が形質膜の近くで共局在した（図３、２つの異なる角度で示されたデータ）。共局在のデータから、ＮＹＡＤ−１の細胞透過性がしっかりと確かめられ、また、Ｇａｇポリタンパク質との相互作用が示される。

（実施例７）
ＮＹＡＤ−１の結合部位のＮＭＲマッピング
化学シフト差のマッピングを用いて、ＮＹＡＤ−１のＣ−ＣＡ結合部位相互作用を特徴付けた。ＮＹＡＤ−１は水性緩衝液への溶解性が乏しいため（約１０μＭ）、同じプロトコルを用いて、Ｃ末端に３つのリシンを有する配列が同一の第２のペプチド（ＮＹＡＤ−１３）を合成した。ＮＹＡＤ−１３は水性緩衝液への溶解性が高く（約１０ｍＭ）、ＮＭＲ研究に使用された。

ＮＭＲ試料。それぞれ唯一の窒素供給源および炭素供給源として^１５ＮＨ^４Ｃｌ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および［^１３Ｃ_６］−グルコースを含むＭ９最少培地中で培養された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において、変異体Ｃ−ＣＡ遺伝子をコードするｐＥＴ１４ｂプラスミドを発現させることによって、Ｃ−ＣＡ（Ｗ１８４Ａ／Ｍ１８５Ａ）の均等に^１５Ｎおよび^１５Ｎ／^１３Ｃを増やしたタンパク質試料を作製した。細菌から組換えタンパク質を単離し、質量分析法によって試料の完全性を確認した。１００ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．０、９５％Ｈ_２Ｏ／５％Ｄ_２Ｏおよび２〜１０ｍＭ ＤＴＴを含む緩衝液中でＮＭＲ試料を調製した。２９８０Ｍ^−１ｃｍ^−１の吸光係数を用いて、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度からタンパク質濃度を決定した。

ＮＭＲ共鳴帰属。ペプチドの不在下でのＣ−ＣＡの主鎖帰属を３８０μＭ［Ｕ−^１５Ｎ、^１３Ｃ］の試料に対して実施した。Ｚ軸勾配ＴＸＩ ＣｒｙｏＰｒｏｂｅを装備したＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ７００ＭＨｚ分光計を用いて、２９８°Ｋで、三重共鳴実験によりＨＮＣＡ、ＨＮ（ＣＯ）ＣＡ、ＨＮＣＡＣＢ、ＣＢＣＡ（ＣＯ）ＮＨ、ＨＮＣＯ、およびＨＮ（ＣＡ）ＣＯを取得した。

ＮＹＡＤ−１は溶解性が乏しいため、Ｃ−ＣＡとの複合体の三重共鳴実験は実現不可能であった。しかし、ＮＹＡＤ−１およびＮＹＡＤ−１３に結合したＣ−ＣＡの^１Ｈ−^１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルは、ほとんど同一であり、本発明者らは、Ｃ−ＣＡに結合した後者の帰属を追跡し、ＮＹＡＤ−１との複合体にそれらの帰属を転用することに決めた。非標識ＮＹＡＤ−１３ペプチドの存在下の［Ｕ−^１５Ｎ、^１３Ｃ］Ｃ−ＣＡ試料を、同一の緩衝液条件下、１：１のモル比で調製した。この試料の最終タンパク質濃度は約１．９ｍＭであった。帰属のために使用した主鎖実験は、Ｚ軸勾配ＴＸＩ ＣｒｙｏＰｒｏｂｅを装備したＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ５００ＭＨｚ分光計を用いて、２９８°Ｋで実施した。

データはすべてＴｏｐｓｐｉｎ１．３で処理し、ＣＡＲＡ１．５を用いて解析した。８４残基中７９残基（５Ｐｒｏ）の主鎖化学シフトが、遊離のＣ−ＣＡおよびＮＹＡＤ−１３と複合体を形成した状態のＣ−ＣＡに帰属した。

ＮＭＲ摂動アッセイ。ＮＭＲに基づいた滴定をＮＹＡＤ−１およびＮＹＡＤ−１３の双方に対して実施した。ＮＭＲに基づいた滴定は、Ｚ軸勾配ＴＣＩ ＣｒｙｏＰｒｏｂｅを装備したＢｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ９００ＭＨｚ分光計を用いて、２９８°Ｋで実施した。同一の緩衝液条件の３．７７ｍＭ非標識ＮＹＡＤ−１３の少量分取物５〜１０μｌを、ＮＨ_４Ａｃ緩衝液、５％Ｄ_２Ｏ、ｐＨ７．０、および１０ｍＭ ＤＴＴに溶かした２５６μＭ［Ｕ−^１５Ｎ］Ｃ−ＣＡ試料５００μｌに添加した。ペプチド：タンパク質の最終比率は１：１．８であった。各添加後に、２Ｄ ^１Ｈ^１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを取得した。データはＴｏｐｓｐｉｎ１．３で処理し、ＮＭＲＶｉｅｗＪ バージョン６．１２で解析した。

ＮＨ_４Ａｃ緩衝液、９５％Ｈ_２Ｏ／５％Ｄ_２Ｏ、ｐＨ７．０、および１０ｍＭＤＴＴに溶かした７６μＭ［Ｕ−^１５Ｎ］Ｃ−ＣＡ試料５００μｌに、１００％ＤＭＳＯに溶かした１００ｍＭ ＮＹＡＤ−１ ６μｌを添加することによって、第２の摂動アッセイを実施した。

ＮＭＲデータからのＮＹＡＤ−１３結合定数の計算。ＮＹＡＤ−１は溶解性が乏しいため、ＮＹＡＤ−１３の結合定数のみ、ＮＭＲ滴定データから算出することができる。Ｃ−ＣＡへのペプチドの結合は、ＮＭＲ時間尺度で遅く、ペプチド対タンパク質の各比率で、結合タンパク質および遊離タンパク質それぞれに対応するピークの２つのセットが観察された。結合したタンパク質の割合を、滴定を通じてのこれら２つのピークの相対強度の変化から算出し、また、標準的な式にフィッティングさせて、１．２±０．６μＭのＫ_ｄを得た。第２の方法では、結合タンパク質の半分の高さの線幅を用いて、解離（ｋ_ｏｆｆ）速度を算出した。実験によって決定されたｋ_ｏｆｆと拡散律速ｋ_ｏｎ（約１０^８Ｍ^−１ｓ^−１）の比率から、０．２±０．１μＭのＫ_ｄを算出した。

Ｃ−ＣＡを用いたＮＹＡＤ−１の滴定中に化学シフトを測定することにより、Ｃ−ＣＡの構造上にマッピングされているアミド水素および窒素の化学シフトの大きな変化が明らかになった。遊離タンパク質および複合体の帰属は、方法の箇所で説明したようにして得た。最も顕著な変化は、残基１６９〜１９０に位置し、ヘリックス−１（１６１〜１７４）およびヘリックス−２（１８０〜１９２）を含む。これらの結果は、野生型タンパク質に結合したＣＡＩのＸ線構造およびＣ−ＣＡ（Ｗ１８４Ａ／Ｍ１８５Ａ）に結合したＣＡＩのＮＲＭマッピング研究と完全に一致している。Ｃ−ＣＡに結合したＮＹＡＤ−１およびＣＡＩの化学シフトの差異のプロファイルが著しく類似していることは、非常に類似した結合形態を支持するものである。

ＣＡＩは、Ｃ−ＣＡの結合ポケット内での重要な疎水性（ヘリックス−１）およびＮ末端キャッピングの相互作用（ヘリックス−２）を生み出す両親媒性ヘリックスを形成することが示されていた。ＣＡＩペプチドのＣ末端は溶媒に完全に曝露されている。本発明者らの設計戦略によって、Ｃ−ＣＡに結合するために非常に重要なＣＡＩの残基は変化しなかったため、おそらく、ＮＹＡＤ−１は同様の様式で結合する。かさ高いオレフィン連結の役割は、いくらか心配されていたが、結合部位での相互作用を乱さないようであった。当初の設計の目標であったように、リンカーは、結合ペプチドの溶媒に曝露された表面上にある。

ＮＹＡＤ−１の低い溶解性により、ＮＭＲによるＫ_ｄの信頼性が高い推定は妨げられた。しかし、ＮＭＲによって観察された結合の緩徐な交換速度論により、Ｋ_ｄの上限が約１０μΜであることが裏付けられる。溶解性が高いＮＹＡＤ−１類似体であるＮＹＡＤ−１３の結合は、すべての点でＮＹＡＤ−１と同一であり、ＮＭＲによって約１μＭのＫ_ｄが得られる。

ＮＭＲ化学シフトマッピング研究に基づいて、本発明者らは、ＣＡＩの炭化水素ステープリングが、Ｃ−ＣＡの結合部位における主要な相互作用を変更せず、また、親和力は低マイクロモル濃度の範囲にあると結論を下す。

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Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ， Ｃ．Ｅ．， Ｐｏ ，Ｊ．， ＆ Ｖｅｒｄｉｎｅ， Ｇ．Ｌ．Ａｎ Ａｌｌ−Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｅｌｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２， ５８９１−５８９２ （２０００）．
Ｓｈｅｒｅｒ， Ｎ．Ｍ．ら、Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｂｕｄｄｉｎｇ ｉｎｔｏ ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ．Ｔｒａｆｆｉｃ．４， ７８５−８０１ （２００３）．
Ｓｔｉｃｈｔ， Ｊ．ら、Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＨＩＶ−１ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１２， ６７１−６７７ （２００５）．
Ｔａｎｇ， Ｃ．ら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ−１ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３２７， １０１３−１０２０ （２００３）．
Ｔｅｒｎｏｉｓ， Ｆ．， Ｓｔｉｃｈｔ， Ｊ．， Ｄｕｑｕｅｒｒｏｙ， Ｓ．， Ｋｒａｕｓｓｌｉｃｈ， Ｈ．Ｇ．， ＆ Ｒｅｙ， Ｆ．Ａ．Ｔｈｅ ＨＩＶ−１ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａ ｖｉｒｕｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１２， ６７８−６８２ （２００５）．
Ｗａｎｇ， Ｄ．， Ｌｉａｏ， Ｗ．， ＆ Ａｒｏｒａ， Ｐ．Ｓ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｈｅｌｉｃｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−Ｂｏｎｄ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｃｌ−ｘＬ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ４４， ６５２５−６５２９ （２００５）．
Ｗａｌｅｎｓｋｙ， Ｌ．Ｄ．ら、Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｖｉｖｏ ｂｙ ａ Ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ−Ｓｔａｐｌｅｄ ＢＨ３ Ｈｅｌｉｘ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０５， １４６６−１４７０ （２００４）．
Ｙａｎｇ， Ｂ．， Ｌｉｕ， Ｄ．， ＆ Ｈｕａｎｇ， Ｚ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｈｅｌｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｌａｃｔａｍ ｂｒｉｄｇｅｄ ＢＨ３ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｂｃｌ−２ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １４， １４０３−１４０６ （２００４）．
米国特許出願公開第２００６／０００８８４８号Ａ１
国際公開第０５／０４４８３９号Ａ２。

補遺−配列番号
配列番号１−抗ウイルス性ペプチド
ＩＴＦＥＤＬＬＤＹＹＧＰ
上記を考慮すると、本発明のいくつかの利点が実現され、また、他の利点が獲得されることが認められるであろう。

本発明の範囲から逸脱することなく、上記の方法および組成物に様々な変更を加えることができるように、上記の明細書に含まれ、また添付図面に示される事柄はすべて、例示的に解釈されるべきであり、限定的な意味で解釈されるべきではないことが意図される。

本明細書において引用される参考文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書中の参考文献の考察は、著者らによってなされた主張を要約するためのものであるにすぎず、任意の参考文献が先行技術を構成することを認めない。出願者は、引用した参考文献の正確さおよび適切さを吟味する権利を保有する。

Claims (55)

1. 長さ１０〜２３アミノ酸のペプチドであって、該アミノ酸のうち２つは、α炭素においてＲ型またはＳ型の立体化学配置を有する非天然アミノ酸であり、
   該非天然アミノ酸の該α炭素は、メチル基およびオレフィン基を含み、該非天然アミノ酸の２つのオレフィン基はαヘリックスの同じ側にあり、結合して該２つの非天然アミノ酸間の架橋を形成し、
   該ペプチドのアミノ酸配列は、（Ｉ／Ｌ／Ｖ）（Ｔ／Ｓ／Ａ／Ｖ／Ｃ）（Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｙ／Ｍ／Ｗ）（Ｄ／Ｅ／Ｓ）（Ｄ／Ｅ）（Ｌ／Ｆ／Ｉ／Ｖ／Ｙ／Ｍ／Ｗ）（Ｌ／Ｄ／Ｔ／Ｆ／Ｉ／Ｖ／Ｙ／Ｍ／Ｗ）（Ｄ／Ｅ／Ａ／Ｓ）（Ｙ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｍ／Ｗ）（Ｙ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｍ／Ｔ）またはその模倣体を含み、
   該２つの非天然アミノ酸は、３アミノ酸離れた任意の位置（ｉおよびｉ＋３）、４アミノ酸離れた任意の位置（ｉおよびｉ＋４）、または７アミノ酸離れた任意の位置（ｉおよびｉ＋７）の２つのアミノ酸を置換し、
   該２つの非天然アミノ酸間の該架橋は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニル、アルキニル、（Ｒ１−Ｋ−Ｒ１）_ｎであり、それぞれ０〜６個のＲ２で置換されており、
   Ｒ１は、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、
   Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯＮＲ４、または
   であり、
   Ｒ２は、ハロ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＯＲ３、Ｎ（Ｒ３）_２、ＳＲ３、ＳＯＲ３、ＳＯ_２Ｒ３、ＣＯ_２Ｒ３、Ｒ３、蛍光性部分、または放射性同位体であり、
   Ｒ３は、ＨまたはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、
   Ｒ４は、Ｈ、アルキル、または治療用作用物質であり、
   ｎは、１〜４の整数である、
   ペプチド。
2. 前記ペプチドのアミノ酸配列が、（Ｉ／Ｖ）（Ｔ／Ｓ）（Ｆ／Ｗ／Ｙ）（Ｅ／Ｓ）（Ｄ／Ｅ）Ｌ（Ｌ／Ｄ／Ｔ）（Ｄ／Ａ／Ｓ）（Ｙ／Ｆ）（Ｙ／Ｍ）を含む、請求項１に記載のペプチド。
3. １１〜２３アミノ酸を含み、（Ｙ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｍ／Ｔ）に続くアミノ酸が（Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｈ／Ｃ／Ｌ／Ｒ／Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｍ／Ｋ）である、請求項１に記載のペプチド。
4. （Ｙ／Ｆ／Ｉ／Ｌ／Ｖ／Ｍ／Ｔ）に続くアミノ酸がＧである、請求項３に記載のペプチド。
5. １２〜２３アミノ酸を含み、（Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｈ／Ｃ／Ｌ／Ｒ／Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｍ／Ｋ）に続くアミノ酸が（Ｐ／Ｍ／Ｒ／Ｋ）である、請求項３に記載のペプチド。
6. １２〜２３アミノ酸を含み、（Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｈ／Ｃ／Ｌ／Ｒ／Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｍ／Ｋ）に続くアミノ酸がＰである、請求項３に記載のペプチド。
7. 前記ペプチドのアミノ酸配列が、ＩＴＦＥＤＬＬＤＹＹＧＰ（配列番号１）を含む、請求項１に記載のペプチド。
8. 前記２つの非天然アミノ酸間の前記架橋が、
   （式中、（Ｃ）は非天然アミノ酸のα炭素である）
   である、請求項１に記載のペプチド。
9. 前記非天然アミノ酸が、前記ペプチドの４番目のアミノ酸［（Ｄ／Ｅ／Ｓ）］および８番目のアミノ酸［（Ｄ／Ｅ／Ｓ）］を置換する、請求項１に記載のペプチド。
10. 前記非天然アミノ酸が、前記ペプチドの７番目のアミノ酸［（Ｌ／Ｄ／Ｔ／Ｆ／Ｉ／Ｖ／Ｙ／Ｍ／Ｗ）］および１１番目のアミノ酸［（Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｈ／Ｃ／Ｌ／Ｒ／Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｍ）］を置換する、請求項１に記載のペプチド。
11. 前記非天然アミノ酸が、前記ペプチドの８番目のアミノ酸［（Ｄ／Ｅ／Ｓ）］および１２番目のアミノ酸［（Ｐ／Ｍ／Ｒ／Ｋ）］を置換する、請求項５に記載のペプチド。
12. を含む、請求項１に記載のペプチド。
13. からなる、請求項１に記載のペプチド。
14. 検出可能な部分、治療用化合物、または抗原をさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のペプチド。
15. 前記検出可能な部分、治療用化合物、または抗原が蛍光性部分である、請求項１４に記載のペプチド。
16. 前記検出可能な部分、治療用化合物、または抗原が放射性部分である、請求項１４に記載のペプチド。
17. 前記検出可能な部分、治療用化合物、または抗原が抗原である、請求項１４に記載のペプチド。
18. 前記抗原がＨＩＶ抗原である、請求項１７に記載のペプチド。
19. 前記検出可能な部分、治療用化合物、または抗原が治療用化合物である、請求項１４に記載のペプチド。
20. 前記治療用化合物が、長さ２０アミノ酸未満のオリゴペプチドを含む、請求項１９に記載のペプチド。
21. 前記治療用化合物が、長さ１０アミノ酸未満のオリゴペプチドを含む、請求項１９に記載のペプチド。
22. 前記治療用化合物が、分子量２０００未満の有機化合物である、請求項１９に記載のペプチド。
23. 前記有機化合物が抗ウイルス化合物である、請求項２２に記載のペプチド。
24. 前記治療用化合物が、細胞内エステラーゼに感受性であるエステル結合により前記ペプチドの残部に結合している、請求項１９に記載のペプチド。
25. 細胞におけるカプシド含有ウイルスの複製を阻害することができる、請求項１から２４のいずれか一項に記載のペプチド。
26. 前記カプシド含有ウイルスがレトロウイルスである、請求項２５に記載のペプチド。
27. 前記レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項２６に記載のペプチド。
28. 前記レトロウイルスがＨＩＶである、請求項２６に記載のペプチド。
29. 請求項２５に記載のペプチドを製薬上許容される担体中に含む薬剤組成物。
30. 細胞におけるカプシド含有ウイルスの複製を阻害する方法であって、該細胞におけるカプシド含有ウイルスの複製を阻害するのに十分な様式で、該細胞を請求項２５に記載のペプチドと接触させるステップを含む方法。
31. 前記カプシド含有ウイルスがレトロウイルスである、請求項３０に記載の方法。
32. 前記カプシド含有ウイルスがレンチウイルスである、請求項３０に記載の方法。
33. 前記細胞が、前記カプシド含有ウイルスに感染した哺乳動物中に存在する、請求項３０に記載の方法。
34. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３３に記載の方法。
35. 前記ヒトがＨＩＶに感染している、請求項３４に記載の方法。
36. 少なくとも１種の付加的な抗ウイルス治療で前記哺乳動物を治療するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
37. カプシド含有ウイルスに感染した哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物を治療するのに十分な様式で、請求項２９に記載の薬剤組成物を該哺乳動物に投与するステップを含む方法。
38. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３７に記載の方法。
39. 前記カプシド含有ウイルスがレトロウイルスである、請求項３７に記載の方法。
40. 前記カプシド含有ウイルスがレンチウイルスである、請求項３７に記載の方法。
41. 前記カプシド含有ウイルスがＨＩＶである、請求項３８に記載の方法。
42. 前記ペプチドが、請求項１２に記載のペプチドである、請求項３７に記載の方法。
43. 前記哺乳動物が妊娠した雌である、請求項３７に記載の方法。
44. 少なくとも１種の付加的な抗ウイルス治療で前記哺乳動物を治療するステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
45. カプシド含有ウイルスに感染するリスクがある哺乳動物を処置する方法であって、該哺乳動物を処置するのに十分な様式で、請求項２９に記載の薬剤組成物を該哺乳動物に投与するステップを含む方法。
46. 前記哺乳動物がヒトであり、前記レトロウイルスがＨＩＶである、請求項４５に記載の方法。
47. 前記哺乳動物が出生間近のヒト胎児である、請求項４５に記載の方法。
48. 前記ペプチドが、請求項１２に記載のペプチドである、請求項４５に記載の方法。
49. 少なくとも１種の付加的な抗ウイルス治療で前記哺乳動物を処置するステップをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
50. 請求項１から２８のいずれか一項に記載のペプチドを作製する方法であって、アミノ酸を順次結合させ、次いで、オレフィンメタセシスを用いて、非天然アミノ酸の２つのオレフィン基を連結するステップを含む方法。
51. 固相合成を用いて前記アミノ酸を結合する、請求項５０に記載の方法。
52. カプシド含有ウイルスに感染した哺乳動物を治療するための医薬品を製造するための、請求項２５に記載のペプチドの使用。
53. 哺乳動物がカプシド含有ウイルスに感染するようになるリスクを低下させる、該哺乳動物を処置するための医薬品を製造するための、請求項２５に記載のペプチドの使用。
54. カプシド含有ウイルスに感染した哺乳動物を治療するための、請求項２９に記載の薬剤組成物の使用。
55. カプシド含有ウイルスに感染するリスクがある哺乳動物を処置するための、請求項２９に記載の薬剤組成物の使用。