JP2010503379A - 変異ilv5遺伝子及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
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(1)以下の(a)〜(c)からなる群より選択されるポリヌクレオチド
(a)配列番号:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;及び
(c)付加及び/又は欠失がN末端に起こらないという条件で、1〜15個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加した配列番号:2のアミノ酸配列からなり、かつアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(2)以下の(d)からなる群より選択される上記(1)に記載のポリヌクレオチド:
(d)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするか、又は1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加した配列番号:2のアミノ酸配列をコードし、かつアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)配列番号:1からなる上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(4)配列番号:2からなるタンパク質をコードする上記(1)に記載のポリヌクレオチド。
(5)DNAである、上記(1)〜(4)のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(6)上記(1)〜(5)のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
(7)上記(1)〜(5)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
(7a)以下の(x)〜(z)の構成要素を含む発現カセットを含む上記(7)に記載のベクター:
(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター;
(y)該プロモーターにセンス方向又はアンチセンス方向で結合した、上記(1)〜(5)のいずれかに記載のポリヌクレオチド;及び
(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関して酵母内で機能できるシグナル。
(8)上記(7)に記載のベクターが導入された酵母。
(9)全ビシナルジケトン生成能又は全ジアセチル生成能が上記(7)に記載のベクターを導入することによって低減した上記(8)に記載の酵母。
(10)全ビシナルジケトン生成能又は全ジアセチル生成能が、上記(6)に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって低減した上記(8)に記載の酵母。
(11)上記(8)〜(10)のいずれかに記載の酵母を用いた酒類の製造方法。
(12)醸造する酒類が麦芽飲料である上記(11)に記載の酒類の製造方法。
(13)醸造する酒類がワインである上記(11)に記載の酒類の製造方法。
(14)上記(11)〜(13)のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
(15)配列番号:1のヌクレオチド配列を有するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の全ビシナルジケトン生成能又は全ジアセチル生成能について評価する方法。
(15a)上記(15)に記載の方法によって、全ビシナルジケトン生成能又は全ジアセチル生成能の低減した酵母を選別する方法。
(15b)上記(15a)に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類(例えば、ビール)を製造する方法。
(16)被検酵母を培養し、配列番号:1のヌクレオチド配列を有するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の発現量を測定することによって、被検酵母の全ビシナルジケトン生成能又は全ジアセチル生成能を評価する方法。
(16a)上記(16)に記載の方法で、被検酵母を評価し、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の発現量が高い酵母を選別する、全ビシナルジケトン生成能又は全ジアセチル生成能の低減した酵母の選択方法。
(16b)上記(16a)に記載の方法によって選別された酵母を用いて酒類(例えば、ビール)を製造する方法。
(17)被検酵母を培養して、上記(6)に記載のタンパク質を定量又は配列番号:1のヌクレオチド配列を有するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の発現量を測定し、ターゲットとする全ビシナルジケトン生成能又は全ジアセチル生成能に応じた前記タンパク質量又は前記遺伝子発現量の被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
(17a)被検酵母を培養して、全ビシナルジケトン生成能又は全ジアセチル生成能又はアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性を定量し、ターゲットとする全ビシナルジケトン生成能又は全ジアセチル生成能又はアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性を有する被検酵母を選択する、酵母の選択方法。
(18)基準酵母及び被検酵母を培養して各酵母における配列番号:1のヌクレオチド配列を有するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の発現量を測定し、基準酵母よりも該遺伝子が高発現である被検酵母を選択する、上記(17)に記載の酵母の選択方法。
(19)基準酵母及び被検酵母を培養して各酵母における上記(6)に記載のタンパク質を定量し、基準酵母よりも該タンパク質量の多い被検酵母を選択する、上記(17)に記載の酵母の選択方法。
(20)上記(8)〜(10)に記載の酵母又は上記(17)〜(19)に記載の方法により選択された酵母のいずれかの酵母を用いて酒類製造のための発酵を行い、全ビシナルジケトン生成量又は全ジアセチル生成量を低減させることを特徴とする、酒類の製造方法。
まず、本発明は、(a)配列番号:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを提供する。配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質は、N末端の46アミノ酸残基が欠失した変異Ilv5pタンパク質である(Ilv5pΔ46と称することもある)。配列番号:1のヌクレオチド配列はIlv5pΔ46のアミノ酸配列をコードする。ポリヌクレオチドはDNAであってもRNAであってもよい。
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(d)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、付加及び/又は欠失がN末端に起こらないという条件で、配列番号:2のアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加したアミノ酸配列を含み、かつアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性を有するタンパク質である。
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(d)のいずれかに記載のポリヌクレオチド(DNAなど)を含有する。また、本発明のベクターは、通常、(x)酵母細胞内で転写可能なプロモーター;(y)該プロモーターにセンス方向又はアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド(DNAなど);及び(z)RNA分子の転写終結及びポリアデニル化に関し、酵母で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
上述した本発明のベクターを、目的とするアルコール製品の醸造に適した酵母に導入する。この酵母を使用して所望の酒類のVDK、特にDAの量を低減させることができ、風味の向上した酒類を製造することができる。また、本発明の酵母の評価方法によって選択される酵母もまた使用することができる。対象となる酒類としては、これらに限定されないが、例えば、ビール、ビールテイストドリンクなどの発泡酒、ワイン、ウイスキー、清酒等を挙げることができる。
本発明は、配列番号:1のヌクレオチド配列を有するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検酵母の全ビシナルジケトン生成能又は全ジアセチル生成能について評価する方法に関する。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、WO01/040514号公報、特開平8−205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について以下に説明する。
特定数(17、33、40、46、53、66、83又は99)のN末端アミノ酸残基が欠失した変異Ilv5p-GFP融合タンパク質を発現するためのプラスミドを以下の方法で調製した。標準的な方法を使用して制限酵素消化及びライゲーションを行った(Sambrook et al. 1989)。TOPO(商標)TAクローニングキット(インビトロジェン社、Carlsbad、CA)を使用してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物をクローニングし、配列決定した。この実施例で使用したオリゴヌクレオチドを以下に記載する。
S.セレビシエM1-2B株(Stinchcomb et al. 1980)を、pYC-ILV5-GFP(野生型融合タンパク質)及びその誘導体pYC-ILV5Δx-GFP(xは各構築物の欠失したN末端残基の数を表す)で形質転換した。この形質転換細胞を、300μg/mlのネオマイシン類似体G418を添加したYPD中で対数期まで増殖させ、蛍光顕微鏡観察に供した。蛍光顕微鏡(Eclipse E600、ニコン、東京、日本)によって細胞を視覚化し、カラーチルド3CCDカメラ(C5810、浜松ホトニクス、静岡、日本)を使用して100×で画像を撮影した。結果を図3に示す。
野生型Ilv5p又は細胞質Ilv5p(N末端の46アミノ酸残基が欠失した変異Ilv5pΔ46)を、ラガービール酵母に導入して、安定発現のための発現プラスミドを構築した。3'末端に終止コドンを有するILV5 ORFを調製するために、プライマーとしてオリゴヌクレオチド14+15及び鋳型としてプラスミドpYC-ILV5-GFPを用いてPCRを行った。得られた530-bp断片をAgeI及びSacIで消化し、組み込み発現ベクターpUP3GLP(Omura et al. 2001)のSacI-SalIギャップに、pYC-ILV5-GFP(670-bp)及びpYI-ILV5Δ46(540-bp)からそれぞれ切り出されたSacI-AgeI断片の1つと一緒に連結した。発現プラスミドをそれぞれ、pIY-ILV5及びpIY-ILV5Δ46と称し、ラガービール酵母FOY422(J株(Versuchs-und Lehranstalt fur Brauerei、Berlinから入手)由来の高VDK生成株)に導入した。これらの菌株をFOY437(野生型Ilv5p含有)及びFOY438(細胞質Ilv5pΔ46含有)と称し、以下の試醸に供した。ビール試醸は以下の条件で実施した。
試験規模: 2リットル大型発酵管
麦汁: 100%麦芽汁(ホップ添加)
初期麦汁比重: 12.9プラトー度(°P)
(1°Pは1%w/wスクロース溶液の比重に相当)
酵母投入量: 1.5×107cells/mL
麦汁エキス濃度: 11.85%
麦汁溶存酸素濃度:8.0mg/L
発酵温度: 15℃
Claims (14)
- 以下の(a)〜(c)からなる群から選択されるポリヌクレオチド:
(a)配列番号:1のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド;及び
(c)付加及び/又は欠失がN末端に起こらないという条件で、1〜15個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加した配列番号:2のアミノ酸配列からなり、かつアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 以下の(d)からなる群から選択される請求項1に記載のポリヌクレオチド:
(d)配列番号:2のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするか、又は1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加した配列番号:2のアミノ酸配列をコードし、かつアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 配列番号:1からなる請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:2からなるタンパク質をコードする請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- DNAである、請求項1〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
- 請求項7に記載のベクターを含有する酵母。
- 全ビシナルジケトン生成能又は全ジアセチル生成能が、請求項7に記載のベクターを導入することによって低減した請求項8に記載の酵母。
- 全ビシナルジケトン生成能又は全ジアセチル生成能が、請求項6に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって低減した請求項8に記載の酵母。
- 請求項8〜10のいずれかに記載の酵母を培養することを含む、酒類の製造方法。
- 醸造する酒類が麦芽飲料である請求項11に記載の酒類の製造方法。
- 醸造する酒類がワインである請求項11に記載の酒類の製造方法。
- 請求項11〜13のいずれかに記載の方法で製造された酒類。
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