JP2010500566A - 非アルコール性脂肪肝疾患（ｎａｆｌｄ）および非アルコール性脂肪性肝炎（ｎａｓｈ）のマーカーおよびその使用方法 - Google Patents

Abstract

被験体の体液からの試料中の脂質代謝物の量を決定することを含む、被験体の肝臓中のトリグリセリドのレベルを評価するための新規方法を記載する。例えば脂肪症、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨのようは肝障害の診断およびモニタリングにおいてその方法を用いることができる。１つの態様では、本発明は被験体の体液からの１つ以上の試料中の１つ以上の脂質代謝物の量を決定し、１つ以上の脂質代謝物の量を肝障害の存在と相関させることを含む、被験体における肝障害を診断またはモニタリングする方法を提供する。

Description

（関連出願の引用）
本願は、２００６年８月８日に出願された、米国仮特許出願番号６０／８３６，５５５の優先権の利益を主張し、この米国仮特許出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

（発明の背景）
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は米国で最も一般的な慢性肝臓疾患である。ＮＡＳＨは肝臓の脂肪炎症ならびに硬変、線維症および肝不全の主要原因である。疾患は進行性であり、脂肪症または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）として出発し、炎症性脂肪肝（ＮＡＳＨ）に進行し、ついには硬変および線維症に至る。疾患は一般的に重篤な肝臓機能不全を生じるまで無症候性である。ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨの診断には、これらの疾患のいずれかに関する臨床検査が存在しないので肝臓生検が必要とされる。ＮＡＳＨの診断には脂肪、炎症および細胞周囲線維症またはマロリ小体のいずれかを伴う小葉中心性（ゾーン３）バルーニング変性の存在が必要とされる。ＮＡＳＨは硬変および肝細胞性癌腫にさえ至り得る進行性の肝臓疾患であると考えられるので、この区別は重要である。

米国人口におけるＮＡＦＬＤの罹患率は２０〜２３％であり、３３％ほどに高くなり得て、米国人口におけるＮＡＳＨの罹患率は２〜３％である。後期疾患にまで進行するＮＡＳＨ患者もいる。およそ１５〜５０％のＮＡＳＨ患者は重篤な線維症まで進行し、およそ７〜１６％は硬変まで進行する。ＮＡＳＨ硬変における肝臓特異的死亡率の比率は１０年でおよそ１０％である。

血清アミノトランスフェラーゼ上昇および脂肪肝を示唆する変化を示す肝臓撮像研究は単独でまたは組み合わせでＮＡＦＬＤをＮＡＳＨと区別するためには不十分である。ＮＡＦＬＤの自然の病歴および経過を評価すること、または治療もしくは介入に関するその必要性をより明確にすることは困難である。ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの原因はあまり明確にされていないが、典型的にはそれらは肥満、インスリン抵抗性またはＩＩ型糖尿病および高脂質血症に関連して生じ、脂肪肝およびＮＡＳＨは代謝不全症候群の肝臓所見であり、代謝性脂肪性肝炎（ＭＥＳＨ）と称されるのがよりよいかもしれないことを示唆する。

肝臓は全ての脂質代謝経路に関する主な代謝器官である。正常な条件下で、肝臓は血中脂質レベルを調節し、身体のエネルギー均衡に合致して複合脂質生合成および輸送を管理する。故に肝臓損傷および機能障害は生物レベルで重篤な結果に至り得る。ＮＡＦＬＤは伝統的に良性疾患であるとみなされているが、患者の一部はＮＡＳＨおよび、肝臓移植を必要とする末期肝臓疾患まで進行する。ＮＡＦＬＤは無症状疾患であるので、現在の診断は針生検によってのみ行うことができる。認識された場合、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨに関する処置方法により、特に初期疾患段階において多少の個体で疾患を遅延または逆行させることができる。

必要なことは、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨを診断し、疾患の進行をモニタリングし、処置の有効性を決定するためのより良好な検査方法である。加えて必要なことは、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨを有する患者間で分類および識別し、ＮＡＦＬＤからＮＡＳＨへの移行の危険性を有する患者を同定するために使用できるより良好な検査方法である。

各個々の出版物、特許、特許出願、インターネットサイトまたは受託番号／データベース配列が具体的におよび個別にそのように出典明示により本明細書の一部とすることが示され場合と同一の程度に、本明細書に引用された全ての出版物、特許、特許出願、インターネットサイトおよび受託番号／データベース配列（ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の双方を含む）を全目的に関してその全てを出典明示により本明細書の一部とする。

（発明の要旨）
いくつかの態様では、本発明は被験体（例えばヒト）の肝臓中のトリグリセリドの蓄積のレベルを評価する、および／または被験体における肝障害の重篤度をモニタリング、診断、分類、評価する、および／またはその進行もしくは退行を評価する方法を提供する。いくつかの実施形態では、肝障害は肝性機能不全、肝性脂肪症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪性肝炎または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。いくつかの実施形態では、その方法は被験体からの体液中の１つ以上の脂質代謝物（例えば脂肪酸および／またはエイコサノイド）の量を決定することを含む。

１つの態様では、本発明は被験体の体液からの１つ以上の試料中の１つ以上の脂質代謝物の量を決定し、１つ以上の脂質代謝物の量を肝障害の存在と相関させることを含む、被験体における肝障害を診断またはモニタリングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、脂質代謝物は脂肪酸および／またはエイコサノイドを含む。いくつかの実施形態では、肝障害は肝性機能不全、肝性脂肪症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪性肝炎または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂質代謝物は、

からなる群から選択される。１つ以上の脂質代謝物が１つ以上の脂肪酸を含むいくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸の量は、１つ以上の試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量である。いくつかの実施形態では、その方法は１つ以上の脂質代謝物の量を１つ以上の参照（例えば正常対照）と比較することをさらに含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、または６つ以上の脂質代謝物の量を決定する。いくつかの実施形態では、試料は血液、血漿、血清、単離されたリポタンパク質画分、唾液、尿、リンパ液および脳脊髄液からなる群から選択される。

本発明の別の態様では、被験体の体液からの試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を決定すること、およびその相対量を肝障害の存在と相関させることを含む、被験体における肝障害を診断またはモニタリングする方法を提供し、ここで肝障害は肝性機能不全、肝性脂肪症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪性肝炎または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸は、

からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、その方法は１つ以上の脂肪酸の相対量を参照と比較する工程を含む。いくつかの実施形態では、肝障害はＮＡＳＨであり、その方法は体液中のエイコサノイドのレベルを決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、または６つ以上の脂肪酸の相対量を決定する。いくつかの実施形態では、試料は血液、血漿、血清、単離されたリポタンパク質画分、唾液、尿、リンパ液および脳脊髄液からなる群から選択される。

さらに別の態様では、本発明は、被験体の体液からの試料中の脂質代謝物の量を決定することを含む被験体の肝臓中のトリグリセリドのレベルを評価する方法を提供し、ここで脂質代謝物は脂質クラスに存在する脂肪酸であり、ここで脂質クラスは遊離脂肪酸、全脂肪酸、トリグリセリド、コレステロールエステル、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、代謝物の量は、試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量である。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、

からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、その方法は１つ以上の脂肪酸の相対量を参照と比較する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、試料は血液、血漿、血清、単離されたリポタンパク質画分、唾液、尿、リンパ液および脳脊髄液からなる群から選択される。

本発明のなおさらなる態様では、被験体の体液からの試料中の脂質代謝物の量を決定することを含む、被験体の肝臓中のトリグリセリドのレベルを評価する方法が提供される。いくつかの実施形態では、その方法は少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５または少なくとも２０の脂質代謝物の量を決定することを含む。いくつかの実施形態では、脂質代謝物は脂質クラスに存在する脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂質クラスは、遊離脂肪酸、全脂肪酸、トリグリセリド、コレステロールエステル、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、脂質クラスは、中性脂質、遊離脂肪酸、全脂肪酸、トリグリセリド、コレステロールエステル、リン脂質、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、脂質クラスは、中性脂質、全脂肪酸、コレステロールエステルおよびリン脂質からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、代謝物の量は試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量である。いくつかの実施形態では、相対量は、（ａ）試料中のトリグリセリド中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量、（ｂ）試料中の遊離脂肪酸中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量、（ｃ）試料中のホスファチジルコリン中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量、（ｄ）試料中のホスファチジルエタノールアミン中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量、（ｅ）試料中のコレステロールエステル中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量および（ｆ）試料中の全脂質中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、脂肪酸は、

からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、脂肪酸はＴＧ２０：４ｎ６である。いくつかの実施形態では、試料は血液、血漿、血清、単離されたリポタンパク質画分、唾液、尿、リンパ液および脳脊髄液からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、試料は血液、血漿、血清、または単離されたリポタンパク質画分からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、試料はリンパ液および脳脊髄液である。

いくつかの実施形態では、被験体の体液からの試料中のトリグリセリド中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を決定することを含む、被験体の肝臓中のトリグリセリドの蓄積のレベルを評価する。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸はＴＧ１４：０、ＴＧ１４：１ｎ５、ＴＧ１６：０、ＴＧ１８：１ｎ７、ＴＧＭＵＦＡ、ＴＧｎ７、ＴＧＳＦＡおよびＴＧ１６：１ｎ７からなる群から選択される。その方法は相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも多い場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸は、

からなる群から選択される。その方法は相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも少ない場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、参照は以前に被験体から得られた体液からの試料中のトリグリセリド中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量である。いくつかの実施形態では参照は、正常な肝臓を有する１以上の被験体の体液からの１つ以上の試料中に見出されるトリグリセリド中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を表す。

いくつかの実施形態では、被験体の体液からの試料中の遊離脂肪酸中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量を決定することを含む、被験体の肝臓中のトリグリセリドの蓄積のレベルを評価する。いくつかの実施形態では、脂肪酸はＦＡ１６：１ｎ７である。その方法は相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも少ない場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、参照は、以前に被験体から得られた体液からの試料中の遊離脂肪酸中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量である。いくつかの実施形態では、参照は、正常な肝臓を有する１以上の被験体の体液からの１つ以上の試料中に見出される遊離脂肪酸中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を表す。

いくつかの実施形態では、被験体の体液からの試料中のホスファチジルコリン中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を決定することを含む、被験体の肝臓中のトリグリセリドの蓄積のレベルを評価する。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸は、

からなる群から選択される。その方法は、相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも多い場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸は、ＰＣ１８：１ｎ７、ＰＣ２０：４ｎ６、ＰＣ２２：５ｎ６、ＰＣｎ６、ＰＣＰＵＦＡおよびＰＣ２２：５ｎ３からなる群から選択される。その方法は相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも少ない場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、参照は、以前に被験体から得られた体液からの試料中のホスファチジルコリン中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量である。いくつかの実施形態では、参照は、正常な肝臓を有する１以上の被験体の体液からの１つ以上の試料中に見出されるホスファチジルコリン中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を表す。

いくつかの実施形態では、被験体の体液からの試料中のホスファチジルエタノールアミン中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量を決定することを含む、被験体の肝臓中のトリグリセリドの蓄積のレベルを評価する。いくつかの実施形態では、脂肪酸はＰＥ２０：４ｎ６である。その方法は、相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも少ない場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、参照は、以前に被験体から得られた体液からの試料中のホスファチジルエタノールアミン中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量である。いくつかの実施形態では、参照は、正常な肝臓を有する１以上の被験体の体液からの１つ以上の試料中に見出されるホスファチジルエタノールアミン中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を表す。

いくつかの実施形態では、被験体の体液からの試料中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を決定することを含む、被験体の肝臓中のトリグリセリドの蓄積のレベルを評価する。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸は、１４：０、１６：０、１８：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ７、１８：１ｎ９、１８：３ｎ６および１８：４ｎ３からなる群から選択される。その方法は、相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも多い場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸は１５：０、２０：０、２２：０、１８：２ｎ６、２０：２ｎ６、２０：３ｎ９、２０：４ｎ３、２０：４ｎ６、２２：４ｎ６および２２：５ｎ６からなる群から選択される。その方法は相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも少ない場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、参照は、以前に被験体から得られた体液からの試料中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量である。いくつかの実施形態では、参照は、正常な肝臓を有する１以上の被験体の体液からの１つ以上の試料中に見出される全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を表す。

いくつかの実施形態では、被験体の体液からの試料中のコレステロールエステル中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を決定することを含む、被験体の肝臓中のトリグリセリドの蓄積のレベルを評価する。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸はＣＥ１６：１ｎ７、ＣＥ１８：１ｎ７、ＣＥ１８：１ｎ９、ＣＥ１８：２ｎ６、ＣＥ１８：３ｎ６、ＣＥ２２：５ｎ３、ＣＥ２２：６ｎ３、ＣＥＭＵＦＡ、ＣＥｎ６、ＣＥｎ７、ＣＥＰＵＦＡ、ＣＥ１４：０からなる群から選択される。その方法は相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも多い場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸はＣＥ１４：１ｎ５、ＣＥ１８：０、ＣＥ２０：０、ＣＥ２０：１ｎ９、ＣＥ２０：２ｎ６、ＣＥ２０：３ｎ９、ＣＥ２０：４ｎ３、ＣＥ２０：４ｎ６、ＣＥ２２：０、ＣＥ２２：２ｎ６、ＣＥ２４：０およびＣＥＳＦＡからなる群から選択される。その方法は相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも少ない場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、参照は、以前に被験体から得られた体液からの試料中のコレステロールエステル中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量である。いくつかの実施形態では、参照は、正常な肝臓を有する１以上の被験体の体液からの１つ以上の試料中に見出されるコレステロールエステル中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を表す。

いくつかの実施形態では、被験体の体液からの試料中の中性脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を決定することを含む、被験体の肝臓中のトリグリセリドの蓄積のレベルを評価する。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸はＴＧ１４：０、ＴＧ１４：１ｎ５、ＴＧ１６：０、ＴＧ１８：１ｎ７、ＴＧＭＵＦＡ、ＴＧｎ７、ＴＧＳＦＡおよびＴＧ１６：１ｎ７からなる群から選択される。その方法は相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも多い場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸は、

からなる群から選択される。その方法は相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも少ない場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、参照は、以前に被験体から得られた体液からの試料中の中性脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量である。いくつかの実施形態では、参照は、正常な肝臓を有する１以上の被験体の体液からの１つ以上の試料中に見出される中性脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を表す。

いくつかの実施形態では、被験体の体液からの試料中のリン脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を決定することを含む、被験体の肝臓中のトリグリセリドの蓄積のレベルを評価する。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸は、

からなる群から選択される。その方法は相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも多い場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸はＰＣ１８：１ｎ７、ＰＣ２０：４ｎ６、ＰＣ２２：５ｎ６、ＰＣｎ６、ＰＣＰＵＦＡ、ＰＣ２２：５ｎ３およびＰＥ２０：４ｎ６からなる群から選択される。その方法は相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも少ない場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、参照は、以前に被験体から得られた体液からの試料中のリン脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量である。いくつかの実施形態では、参照は、正常な肝臓を有する１以上の被験体の体液からの１つ以上の試料中に見出されるリン脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を表す。

いくつかの実施形態では、その方法は少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０または少なくとも２０のさらなる相対量を決定することを含み、ここで相対量は試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量である。いくつかの実施形態では、その方法はさらなる相対量を決定することを含み、ここでさらなる相対量は、（ａ）試料中のトリグリセリド中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量、（ｂ）試料中の遊離脂肪酸中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量、（ｃ）試料中のホスファチジルコリン中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量、（ｄ）試料中のホスファチジルエタノールアミン中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量、（ｅ）試料中のコレステロールエステル中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量および（ｆ）試料中の全脂質中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、さらなる相対量は、（ａ）被験体の体液からの試料中のトリグリセリド中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量、ここで１つ以上の脂肪酸はＴＧ１４：０、ＴＧ１４：１ｎ５、ＴＧ１６：０、ＴＧ１８：１ｎ７、ＴＧＭＵＦＡ、ＴＧｎ７、ＴＧＳＦＡおよびＴＧ１６：１ｎ７からなる群から選択される、（ｂ）被験体の体液からの試料中のホスファチジルコリン中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量、ここで１つ以上の脂肪酸は、

からなる群から選択される、（ｃ）被験体の体液からの試料中のコレステロールエステル中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量、ここで１つ以上の脂肪酸はＣＥ１６：１ｎ７、ＣＥ１８：１ｎ７、ＣＥ１８：１ｎ９、ＣＥ１８：２ｎ６、ＣＥＩ８：３ｎ６、ＣＥ２２：５ｎ３、ＣＥ２２：６ｎ３、ＣＥＭＵＦＡ、ＣＥｎ６、ＣＥｎ７、ＣＥＰＵＦＡ、ＣＥ１４：０からなる群から選択される、ならびに（ｄ）被験体の体液からの試料中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量、ここで１つ以上の脂肪酸は１４：０、１６：０、１８：０、１６：１ｎ７、１８：１ｎ７、１８：１ｎ９、１８：３ｎ６および１８：４ｎ３からなる群から選択される、からなる群から選択される。その方法はさらなる相対量をさらなる参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここでさらなる相対量がさらなる参照よりも多い場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、さらなる相対量は、（ａ）被験体の体液からの試料中のトリグリセリド中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量、ここで１つ以上の脂肪酸は、

からなる群から選択される、（ｂ）被験体の体液からの試料中の遊離脂肪酸中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量、ここで脂肪酸はＦＡ１６：１ｎ７である、（ｃ）被験体の体液からの試料中のホスファチジルコリン中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量、ここで１つ以上の脂肪酸はＰＣ１８：１ｎ７、ＰＣ２０：４ｎ６、ＰＣ２２：５ｎ６、ＰＣｎ６、ＰＣＰＵＦＡおよびＰＣ２２：５ｎ３からなる群から選択される、（ｄ）被験体の体液からの試料中のホスファチジルエタノールアミン中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量、ここで脂肪酸はＰＥ２０：４ｎ６である、ならびに（ｅ）被験体の体液からの試料中のコレステロールエステル中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量、ここで１つ以上の脂肪酸はＣＥ１４：１ｎ５、ＣＥ１８：０、ＣＥ２０：０、ＣＥ２０：１ｎ９、ＣＥ２０：２ｎ６、ＣＥ２０：３ｎ９、ＣＥ２０：４ｎ３、ＣＥ２０：４ｎ６、ＣＥ２２：０、ＣＥ２２：２ｎ６、ＣＥ２４：０、ＣＥＳＦＡ、ならびに（ｆ）被験体の体液からの試料中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量、ここで１つ以上の脂肪酸は１５：０、２０：０、２２：０、１８：２ｎ６、２０：２ｎ６、２０：３ｎ９、２０：４ｎ３、２０：４ｎ６、２２：４ｎ６および２２：５ｎ６からなる群から選択される、からなる群から選択される。その方法はさらなる相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも少ない場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。

肝障害の重篤度の診断、モニタリング、評価、および／またはその進行もしくは退行の評価において、被験体の肝臓中のトリグリセリドのレベルを評価する方法を用いることができ、ここで肝障害は、肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎およびＮＡＳＨからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、被験体における肝障害を診断する方法は、（ａ）被験体の体液からの試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を決定すること、（ｂ）その相対量を肝障害の存在と相関させることを含み、ここで肝障害は肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎またはＮＡＳＨである。いくつかの実施形態では、被験体における肝障害の重篤度を評価する方法は、（ａ）被験体の体液からの試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を決定すること、（ｂ）その相対量を肝障害の重篤度と相関させることを含み、ここで肝障害は肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎またはＮＡＳＨである。いくつかの実施形態では、被験体における肝障害をモニタリングする方法は、（ａ）被験体の体液からの試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を決定すること、（ｂ）その相対量を肝障害の状態と相関させることを含み、ここで肝障害は肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎またはＮＡＳＨである。いくつかの実施形態では、被験体における肝障害の進行または退行を評価する方法は、（ａ）被験体の体液からの試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を決定すること、（ｂ）その相対量を肝障害の状態と相関させることを含み、ここで肝障害は肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎またはＮＡＳＨである。いくつかの実施形態では、２つ以上の時点で相対量を測定する。いくつかの実施形態では、肝障害の重篤度をモニタリング、評価、またはその進行もしくは退行を評価する方法を用いて被験体の処置に対する応答を決定する。いくつかの実施形態では、その方法は相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも多い場合、肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎またはＮＡＳＨが示される。いくつかの実施形態では、その方法は相対量を参照と比較する工程を含むことができ、ここで相対量が参照よりも少ない場合、肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎またはＮＡＳＨが示される。いくつかの実施形態では、被験体の体液からの試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸のさらなる相対量を決定する工程をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、肝障害は、肝炎、ＨＩＶ感染、ＨＢＶ感染、ＨＣＶ感染、ウイルス誘起脂肪症、および非ウイルス性感染性作用物質により誘起される脂肪症からなる群から選択される１つ以上の状態に関連する。いくつかの実施形態では、肝障害は薬物誘起脂肪症に関連する。いくつかの実施形態では、薬物誘起脂肪症はタモキシフェン、脱共役タンパク質阻害剤、イソニアジド、リファンピシン、フィブラートまたはペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニストにより誘起される。いくつかの実施形態では、肝障害は、肥満、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、糖尿病、インスリン抵抗性、および代謝障害からなる群から選択される１つ以上の状態に関連する。いくつかの実施形態では、肝障害は、アルコール性脂肪肝疾患およびアルコール性脂肪性肝炎からなる群から選択される１つ以上の状態に関連する。いくつかの実施形態では、肝障害は先天性代謝異常または遺伝子変化に関連する。いくつかの実施形態では、先天性代謝異常または遺伝子変化はシトリン欠損、ヘモクロマトーシスおよび高フェリチン血症からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、肝障害は毒素誘起脂肪症または毒素誘起脂肪性肝炎に関連する。いくつかの実施形態では、毒素誘起脂肪症または毒素誘起脂肪性肝炎は、四塩化炭素により誘起される。いくつかの実施形態では、肝障害は、栄養障害、栄養吸収障害、セリアック病およびリポジストロフィーからなる群から選択される１つ以上の状態に関連する。いくつかの実施形態では、肝障害は肥満外科手術または肝臓移植に関連する。

肝障害の重篤度を診断、モニタリング、評価する方法において、およびその進行もしくは退行を評価するためにさらなるバイオマーカーおよび試験を用いることができる。いくつかの実施形態では、その方法は、（ｃ）被験体からの体液もしくは細胞試料中のマロニル−ＣｏＡもしくはマロニルカルニチンのレベルを決定すること、ここで正常レベルよりも高いことは脂肪症、ＮＡＦＬＤもしくはＮＡＳＨを示す、（ｄ）被験体からの体液もしくは細胞試料中のアシルカルニチン、遊離カルニチンもしくはブチロベタインのレベルを決定すること、ここで正常レベルよりも低いことは肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎もしくはＮＡＳＨを示す、および／または（ｅ）被験体からの体液もしくは細胞試料中のステロールもしくは胆汁酸のレベルを決定すること、ここで正常レベルよりも高いことは肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎もしくはＮＡＳＨを示す、をさらに含む。いくつかの実施形態では、アシルカルニチンは表３のアシルカルニチンである。いくつかの実施形態では、ステロールまたは胆汁酸は表４のステロールまたは胆汁酸である。いくつかの実施形態では、その方法は被験体からの体液または細胞試料中のエイコサノイドのレベルを決定する工程を含み、ここで正常レベルよりも高いことはＮＡＳＨを示す。いくつかの実施形態では、エイコサノイドは表２のエイコサノイドである。いくつかの実施形態では、その方法は被験体からの体液または細胞試料中のサイトカイン、サイトケラチン、ケモカイン、アディポカインまたはレプチンのレベルを決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン、サイトケラチン、ケモカイン、アディポカインまたはレプチンはＴＮＦ、ＩＬ−６、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１またはＣＣＬ１９であり、正常レベルよりも高いことはＮＡＳＨを示す。いくつかの実施形態では、サイトカインまたはサイトケラチンはＩＬ−８、ＩＬ−１８、サイトケラチン８またはサイトケラチン１８であり、正常レベルよりも低いことはＮＡＳＨを示す。いくつかの実施形態では、その方法は（ａ）被験体の身体検査を実施すること、（ｂ）被験体の血液中のアミノトランスフェラーゼのレベルを測定すること、または（ｃ）被験体の肝臓の画像を得ることの工程をさらに含む。

上記した態様の各々、および本明細書に記載されるその他の態様のいくつかの実施形態では、被験体はヒトのような哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は霊長類である。

上記した態様の各々、および本明細書に記載されるその他の態様のいくつかの実施形態では、被験体は肝臓移植片ドナー候補であるか、肥満外科手術のために評価されているか、肥満外科手術を行ったことがあるか、または体重減少に関してモニタリングされている。

本発明のいくつかのさらなる態様では、本発明の方法において使用するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは（ａ）マーカー（例えば脂肪酸またはエイコサノイド）に対する抗体および（ｂ）使用のための説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、（ｃ）第２のマーカー（例えば脂肪酸またはエイコサノイド）に対する第２の抗体をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、（ｄ）第３のマーカー（例えば脂肪酸またはエイコサノイド）に対する第３の抗体をさらに含む。

本発明の態様または実施形態が本明細書にてマーカッシュ群またはその他の代替の群に関して記載される場合、本発明は全体として列挙される群全体のみならず、その群の各メンバーを個別に、および主群の全ての可能な小群、１つ以上のその群メンバーを欠く主群をも包含する。本発明はまた、主張される発明における１つ以上のいずれかの群メンバーの明示的な除外をも認識する。

図１は、トリグリセリド（または任意のその他の脂質クラス）の相対比率（濃灰色で示す）である脂質代謝物を、例えば血清または血漿中で、肝性トリグリセリド中のその脂質代謝物の相対比率の定量的測定値として測定できること示す。 図２は、正常被験体からの一致した血漿および肝臓脂質クラスの脂肪酸組成物の相関性を示す。 図３は、肝性トリグリセリド濃度（ナノモル／ｇ）と肝性トリグリセリド中の２０：４ｎ６の相対比率との間の関係（全トリグリセリド脂肪酸のモルパーセンテージとして表現）を示す。 図４は、肝臓ＴＧ２０：４ｎ６に関する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。

（発明の詳細な説明）
いくつかの態様では、本発明は肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎およびＮＡＳＨのような肝臓トリグリセリドレベルの上昇に関連する肝障害を有する患者を診断、分類および／またはモニタリングし、脂肪症またはＮＡＦＬＤから脂肪性肝炎またはＮＡＳＨに移行する危険性を有する患者を同定するために用いることができる検査方法を提供する。

肝性トリグリセリドレベルは脂肪症の重篤度を決定する。肝臓内のトリグリセリドの蓄積（脂肪症）は超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）分泌を介する肝臓からのトリグリセリドの不十分な排出の結果であるので、血漿中のトリグリセリドの絶対量は脂肪症の規模の一貫した測定ではない。本発明は、体液中の脂質代謝物の特定の量が、肝臓から血漿へのトリグリセリドの絶対流出量とは独立して肝臓トリグリセリドレベルと相関することを見出した。

１つの態様では、本発明は被験体の体液からの１つ以上の試料中の１つ以上の脂質代謝物の量を決定すること、および１つ以上の脂質代謝物の量を肝障害の存在と相関させることを含む、被験体における肝障害を診断またはモニタリングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、脂質代謝物は脂肪酸および／またはエイコサノイドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂質代謝物は、

からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、肝障害は肝性機能不全、肝性脂肪症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪性肝炎または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。

本明細書にて用いられる脂肪酸脂質代謝物の命名法に関して、接頭辞「ＣＥ」、「ＤＧ」、「ＦＡ」、「ＬＹ」、「ＰＣ」、「ＰＥ」、「ＳＭ」、「ＴＧ」または「ＴＬ」で標識された脂肪酸は、各々試料中のコレステロールエステル、ジグリセリド、遊離脂肪酸、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、トリグリセリドおよび全脂質内に存在する、指示された脂肪酸を指す。いくつかの実施形態では、指示された脂肪酸構成成分を接頭辞により指示される脂質クラス内の全脂肪酸の比率として定量化する。接頭辞「ＳＰ」は、本明細書では試料中のスフィンゴミエリン中の脂肪酸に関する「ＳＭ」と互換的に使用される。接頭辞または特定の脂質クラスのその他の指示のない脂肪酸に対する言及は、試料中の全脂質内に存在する脂肪酸を示す。接頭辞「ＣＥ」、「ＤＧ」、「ＦＡ」、「ＬＹ」、「ＰＣ」、「ＰＥ」、「ＳＭ」、「ＴＧ」または「ＴＬ」に続く「ＬＣ」なる用語は、試料中の接頭辞により指示される全脂質クラスの量（例えば血清または血漿のグラムあたりのナノモルとして表現されるクラスの脂質の濃度）を指す。いくつかの実施形態では、例えば血漿または血清からの測定値に関して、略語「ＰＣ１８：２ｎ６」は、リノール酸（１８：２ｎ６）からなる血漿または血清ホスファチジルコリンのパーセンテージを示し、「ＴＧＬＣ」なる用語は、血漿または血清中に存在するトリグリセリドの絶対量（例えばグラムあたりのナノモル）を示す。

いくつかの実施形態では、肝障害は脂肪症および／またはＮＡＦＬＤであり、１つ以上の脂質代謝物は、

からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、（ａ）脂質代謝物：

は脂肪症および／またはＮＡＦＬＤと正に関連し、（ｂ）脂質代謝物：

は脂肪症および／またはＮＡＦＬＤと負に関連する。いくつかの実施形態では、測定される脂質代謝物は１つ以上の脂肪酸を含み、各々の脂肪酸の量は（脂肪酸に先行する接頭辞により指示されるような）脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量である。

本明細書で使用される際には、障害と「正に関連する」または「正に相関する」代謝物には、正常対照被験体または正常対照参照に相対してその濃度が障害と共に一般的に上昇するこれらの代謝物が含まれる。障害と「負に関連する」または「負に相関する」代謝物には一般的に、正常対照被験体または正常対照参照に相対して、その濃度が障害と共に低下するこれらの代謝物が含まれる。

いくつかの代替の実施形態では、肝障害はＮＡＳＨであり、１つ以上の脂質代謝物は、

からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、（ａ）脂質代謝物：

はＮＡＳＨと正に関連し、（ｂ）脂質代謝物：

はＮＡＳＨと負に関連する。いくつかの実施形態では、測定される脂質代謝物は１つ以上の脂肪酸を含み、各々の脂肪酸の量は（脂肪酸に先行する接頭辞により指示されるような）脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量である。

重ねて、本発明の態様または実施形態が本明細書にてマーカッシュ群またはその他の代替の群に関して記載される場合、本発明は全体として列挙される群全体のみならず、その群の各メンバーを個別に、および主群の全ての可能な小群、１つ以上のその群メンバーを欠く主群をも包含する。本発明はまた、主張される発明における１つ以上のいずれかの群メンバーの明示的な除外をも認識する。

実施形態が「含む」なる言語と共に記載される場合はいつも、「からなる」および／または「本質的に〜からなる」のことばで記載される別のように類似する実施形態もまた提供されると理解される。

「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、局面が明確に別のように規定しなければ複数の言及を含む。

化学的用語は、特記しない場合、当分野において公知として用いられる。

図１に示されるように、トリグリセリド（または任意のその他の脂質クラス）の相対比率（濃灰色で示す）である脂質代謝物を、血清または血漿のような体液中で、肝性トリグリセリド（またはその他の脂質）中のその脂質代謝物の相対比率の定量的測定値として測定できる。脂質代謝物（または脂質代謝物の集合）のこの相対比率が肝性トリグリセリド濃度と相関する場合、それはＶＬＤＬ中の肝臓からのトリグリセリドの流出量とは独立して、肝性脂肪症の定量的サロゲートとして提供される。故に、特定の脂質クラス内の特定の脂肪酸のモルパーセンテージまたはその他の相対量を、脂肪症に関する定量的サロゲートとして用いることができる。

いくつかの実施形態では、単一の脂質代謝物の相対量（例えばモルパーセンテージまたは重量パーセント）を本発明の方法において用いることができる。その他の実施形態では、２つ以上の脂質代謝物、例えば２、３、４、５、１０、１５、２０以上の脂質代謝物の相対量（例えばモルパーセンテージまたは重量パーセンテージ）を本発明の方法において用いることができる。いくつかの実施形態では、相対量はモルパーセンテージである。いくつかの実施形態では、相対量は重量パーセンテージである。１つ以上の脂質代謝物の量に加えて、被験体からの試料中の以下で定義されるような１つ以上のバイオマーカーの量を本発明の方法において用いることができる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの量は試料中のバイオマーカーの絶対量である。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの量は試料中のバイオマーカーの濃度である。

本発明にしたがって、２つ以上の脂質代謝物により付与される影響を分析する場合、これらの脂質代謝物の影響を個別に評価するか、または例えば各脂質代謝物の影響を定量するための種々の数式もしくはモデルを用いることにより、これらの脂質代謝物の正味の影響を得るかのいずれかを行うことができる。変数として１つ以上の脂質代謝物のレベルを含有する式には、変数として１つ以上の脂質代謝物の値を用いる任意の数式、モデル、等式、または数学的もしくは統計学的原理もしくは方法に基づいて確立された表現が含まれる。

一般的に任意の適当な数学的分析を用いて、被験体の肝臓の状態の投影に関して２つ以上の脂質代謝物の正味の影響を分析することができる。例えば、分散の多変量解析、多変量回帰、重回帰のような方法を用いて従属変数と独立変数の間の関係を決定することができる。階層的および非階層的方法の双方を含むクラスタリングならびに非計量的二次元尺度法を用いて、変数の間およびこれらの変数の変化の間の関連性を決定することができる。

加えて、主成分分析は研究の次元を低下させる一般的な方式であり、データセットの分散−共分散構造を解釈するために用いることができる。重回帰およびクラスター分析のような適用において主成分分析を用いることができる。因子分析を用いて観察された変数から「隠れた」変数を構築することにより共分散を記載する。因子分析を主成分分析の延長と考えることができ、ここで主成分分析は最尤法と共にパラメーター推定として用いられる。さらに、２つのベクトルの平均の均等性のような単純仮説は、ホテリングのＴ二乗統計量を用いて検定することができる。

いくつかの実施形態では、１つ以上の脂質代謝物を変数として含有する式は、回帰分析、例えば多重線形回帰を用いることにより確立される。展開される式の例には、限定するものではないが、以下のものが含まれる。

式は１、２、３、４、５、１０、１５、２０以上の脂質代謝物のような１つ以上の脂質代謝物を変数として用いることができる。公知の肝臓の状態から得られた一連のデータを用いることにより、これらの式の定数を確立することができる。通常、これらの式で用いられる脂質代謝物のレベルはある時点でのレベルまたはある期間にわたるレベルの変化のいずれかあり得る。

本発明によれば、脂質代謝物を用いて確立された数式を用いて、ある期間にわたる被験体の肝臓の状態を定性的または定量的のいずれかで評価することができる。例えば、変数として１つ以上の脂質代謝物を有する式を用いて被験体の肝臓の状態を直接計算することができる。加えて、１つ以上の脂質代謝物を含有する式の正味の値を、肝臓の状態のパターン、例えば脂肪肝疾患の進行または退行に対応するかかる式の標準値と比較することができ、かかる比較の結果を用いて肝臓の状態の発達を投影することができる。具体的には、肝臓の状態の進行に割り当てられるか、もしくは関連するかかる式の標準値に類似するか、またはその範囲内の式の正味の値を有する被験体は、ある期間にわたって進行を経験する可能性がある。同様に、退行に割り当てられるか、もしくは関連するかかる式の標準値に類似するか、またはその範囲内の式の正味の値を有する被験体は、ある期間にわたってその肝臓の状態の退行を経験する可能性がある。

同様に、１つ以上の脂質代謝物および１つ以上のバイオマーカーにより付与される正味の影響を分析する場合にも、これらの数学的モデリング方法および式を用いることができる。

体液中の脂質代謝物を測定することができる。体液の非限定例には、例えば血液、血漿、血清、単離されたリポタンパク質画分、唾液、尿、リンパ液、脳脊髄液および胆汁酸が含まれる。いくつかの実施形態では、脂質代謝物は血液、血漿、血清または単離されたリポタンパク質画分のような血液基盤の体液中で測定される。いくつかの実施形態では、脂質代謝物は血漿中で測定される。いくつかの実施形態では、脂質代謝物は血清中で測定される。

いくつかの実施形態では、本発明は１つ以上の、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、５つ以上の、または６つ以上の脂質代謝物の量を決定する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、測定される脂質代謝物は、（ａ）１５−ＨＥＴＥおよび１５−ケト−ＰＧＦ２α、（ｂ）ＴＧ１８：１ｎ７およびＰＣ２０：３ｎ６、（ｃ）１１−ＨＥＴＥおよびＣＥ２２．６ｎ３、（ｄ）１１−ＨＥＴＥおよびＰＣＴＬ、ならびに（ｅ）ＰＣ２２：６ｎ３およびＰＣ１８：３ｎ３からなる群から選択される一対の脂質代謝物を含む、１つ以上の脂質代謝物からなる群から選択される一対の脂質代謝物を含む。いくつかの実施形態では、その方法は肝障害をＮＡＦＬＤに対してＮＡＳＨとして分類する方法である。

脂肪症、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨおよび／またはその他の肝障害に関する脂肪酸マーカー
いくつかの実施形態では、脂質代謝物は特定の脂質クラス内に存在する脂肪酸である。脂質代謝物は、限定するものではないが、以下の表１に列挙される代謝物の各々、および以下の実施例４の表７および８に列挙される代謝物の各々を包含する。いくつかの実施形態では、脂質代謝物はＴＧ２０：４ｎ６である。その方法は２、３、４、５、１０、１５、２０以上の脂質代謝物のような１を超える脂質代謝物の量を測定することを伴うことができる。いくつかの実施形態では、表１の２つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表１の３つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表１の５つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表７および／または８の２つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表７および／または８の３つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表７および／または８の５つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、脂質代謝物は肝臓トリグリセリドレベルと正に相関する。いくつかの実施形態では、脂質代謝物は肝臓トリグリセリドレベルと負に相関する。いくつかの実施形態では、脂質代謝物をその特定の脂質クラス内の相対量として測定する。いくつかの実施形態では、脂質代謝物をその特定の脂質クラス内のモルパーセンテージとして測定する。いくつかの実施形態では、脂質代謝物をその特定の脂質クラス内の重量パーセンテージとして測定する。

（表１．肝性脂肪症の血液基盤の脂質代謝物マーカー（モルパーセンテージに基づく））

表１では、接頭辞「ＴＧ」、「ＦＡ」、「ＰＣ」、「ＰＥ」および「ＣＥ」は各々トリグリセリド、遊離脂肪酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびコレステロールエステル内に存在する脂肪酸に対応する。故に「ＴＧ１４：０」はトリグリセリド内に存在する脂肪酸１４：０を示す。表１では、「１４：０」（接頭辞を何ら伴わない）は、全脂肪酸内に存在する脂肪酸１４：０を示す。

脂質クラスは例えば中性脂質、リン脂質、遊離脂肪酸、全脂肪酸、トリグリセリド、コレステロールエステル、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジグリセリドまたはリゾホスファチジルコリンでよい。いくつかの実施形態では、脂質クラスは中性脂質、リン脂質、遊離脂肪酸、全脂肪酸、トリグリセリド、コレステロールエステル、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、脂質クラスは中性脂質、リン脂質、全脂肪酸およびコレステロールエステルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、脂質クラスは遊離脂肪酸、全脂肪酸、トリグリセリド、コレステロールエステル、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、脂質クラスは遊離脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂質クラスは全脂肪酸である。いくつかの実施形態では、脂質クラスはトリグリセリドである。いくつかの実施形態では、脂質クラスはコレステロールエステルである。いくつかの実施形態では、脂質クラスはホスファチジルコリンである。いくつかの実施形態では、脂質クラスはホスファチジルエタノールアミンである。いくつかの実施形態では、脂質クラスはリン脂質である。いくつかの実施形態では、脂質クラスは中性脂質である。いくつかの実施形態では、脂質クラスはジグリセリドである。いくつかの実施形態では、脂質クラスはスフィンゴミエリンである。

いくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸を含む１つ以上の脂質代謝物が測定される。いくつかの実施形態では、１つ以上の脂質代謝物は、

からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、各々の脂肪酸の量は（脂肪酸に先行する接頭辞により指示されるような）脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量である。

例えばいくつかの実施形態では、１つ以上の脂肪酸は、

からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、肝障害は脂肪症および／またはＮＡＦＬＤであり、１つ以上の脂質代謝物は、

からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、脂質代謝物：

は脂肪症および／またはＮＡＦＬＤと正に関連する。いくつかの実施形態では、脂質代謝物：

は脂肪症および／またはＮＡＦＬＤと負に関連する。

いくつかの代替の実施形態では、肝障害はＮＡＳＨであり、１つ以上の脂質代謝物は、

からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、脂質代謝物：

はＮＡＳＨと正に関連する。いくつかの実施形態では、脂質代謝物：

はＮＡＳＨと負に関連する。

いくつかの実施形態では、

の相対量が参照（例えば正常対照）よりも多い場合、次いで肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨが示される。

いくつかの実施形態では、

の相対量が参照（例えば正常対照）よりも少ない場合、次いで肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される。いくつかの実施形態では、肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨが示される。

いくつかの実施形態では、脂肪酸の量（例えば特定の脂質クラス内の脂肪酸の相対量）は血液、血清、血漿または単離されたリポタンパク質画分試料から決定される。

脂肪症、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨおよび／またはその他の肝障害に関するエイコサノイド マーカー
本発明は試料中で測定される１つの、いくつかのまたは全ての脂質代謝物がエイコサノイドであり得る方法を提供する。エイコサノイドの非限定例を表２、実施例５の表９、および実施例５の表１０にて提供する。エイコサノイドに関する略語の例を表９に示す。

（表２．エイコサノイドの一覧表）

いくつかの実施形態では、その方法は２、３、４、５、１０、１５、２０以上の脂質代謝物のような１を超える脂質代謝物の量を測定することを伴うことができ、それは本明細書に記載される２、３、４、５、１０、１５、２０以上の脂肪酸マーカーおよび／または本明細書に記載される２、３、４、５、１０、１５、２０以上のエイコサノイドマーカーを含むことができる。いくつかの実施形態では、表２の２つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表２の３つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表２の５つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表９および／または１０（以下の実施例５を参照）の２つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表９および／または１０の３つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表９および／または１０の５つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表１、表２、表７（以下の実施例４を参照）、表８（以下の実施例４を参照）、表９および／または表１０の２つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表１、表２、表７、表８、表９および／または表１０の３つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表１、表２、表７、表８、表９および／または表１０の５つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表７、表８および／または表１０の２つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表７、表８および／または表１０の３つ以上の脂質代謝物を測定する。いくつかの実施形態では、表７、表８および／または表１０の５つ以上の脂質代謝物を測定する。

いくつかの実施形態では、１つ以上の脂質代謝物は、

からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、以下のエイコサノイドはＮＡＳＨと正に関連する：ＰＧＢ２；ＰＧＥ２；ＰＧＦ２α；１５−ケト−ＰＧＦ２α；５−ＨＥＴＥ；８−ＨＥＴＥ；９−ＨＥＴＥ；１１−ＨＥＴＥ；１２−ＨＥＴＥ；１２−ＨＥＰＥ；１１，１２−ＥｐＥＴｒＥ；８，９−ＤｉＨＥＴｒＥ；および１５−ＨＥＴＥ。いくつかの実施形態では、１５−ＨＥＴＥは脂肪症および／またはＮＡＦＬＤと正に関連する。いくつかの実施形態では、以下のエイコサノイドは脂肪症および／またはＮＡＦＬＤと負に関連する：ＰＧＡ２Ｍ；６−ケト−ＰＧＦ１α；１１−ＤＴＸＢ２；１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ；９，１０−ＥｐＯＭＥ；１２，１３−ＥｐＯＭＥ；および１９，２０−ＤｉＨＤＰＡ。いくつかの実施形態では、エイコサノイド１９，２０−ＤｉＨＤＰＡはＮＡＳＨと負に関連する。

ある特定の実施形態では、その方法は、被験体の体液からの試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を決定することのみならず、被験体からの体液中のエイコサノイドのレベルを決定する工程をも含む、被験体におけるＮＡＳＨを診断する方法である。いくつかの実施形態では、エイコサノイドの正常なレベルよりも高いことはＮＡＳＨを示す。いくつかの実施形態では、エイコサノイドは１５−ＨＥＴＥ；ＰＧＢ２；ＰＧＥ２；ＰＧＦ２α；１５−ケト−ＰＧＦ２α；５−ＨＥＴＥ；８−ＨＥＴＥ；９−ＨＥＴＥ；１１−ＨＥＴＥ；１２−ＨＥＴＥ；１２−ＨＥＰＥ；１１，１２−ＥｐＥＴｒＥ；および８，９−ＤｉＨＥＴｒＥからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、エイコサノイドの量を血液、血清、血漿または単離されたリポタンパク質画分から決定する。

脂肪症、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨおよび／またはその他の肝障害に関するその他のマーカー
いくつかの実施形態では、本発明は、さらに本明細書にて提供されるいずれかの１つ以上の脂肪酸および／またはエイコサノイドのような１つ以上の脂質代謝物の量を試料中で決定するのみならず、１つ以上のさらなるバイオマーカーをも決定する。

以下のさらなるバイオマーカーは脂肪症、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの診断の助けとなり得る：
（１）マロニル−ＣｏＡおよびマロニルカルニチン（肝臓中のトリグリセリドのレベルの上昇と共にレベルは上昇する）、
（２）表３（肝臓中のトリグリセリドのレベルの上昇と共にレベルは低下する）もしくは実施例６に列挙される遊離カルニチン、ブチロベタインおよびアシルカルニチン、ならびに／または
（３）表４（コレステロール合成の増大と共にレベルは上昇する）もしくは実施例６に列挙されるステロールおよび胆汁酸。

体液および細胞試料を用いて、これらのさらなるバイオマーカーを測定することができる。細胞試料の例には、限定するものではないがリンパ球およびマクロファージが含まれる。

（表３．アシルカルニチンの一覧表）

（表４．胆汁酸およびステロールの一覧表）

加えて以下のさらなるバイオマーカーは、ＮＡＦＬＤとは区別してＮＡＳＨを診断する助けとなり得る。
（１）表４（コレステロール合成の増大と共にレベルは上昇する）もしくは実施例６に列挙されるステロールおよび胆汁酸
（２）限定するものではないが表２（前記）、実施例５の表９もしくは実施例５の表１０に示されるものを含むエイコサノイド、ならびに／または
（３）限定するものではないがＴＮＦα、ＩＬ−６、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１およびＣＣＬ１９（ＮＡＳＨでレベルは上昇する）：ＩＬ−８、ＩＬ−１８、サイトケラチン８およびサイトケラチン１８（ＮＡＳＨでレベルは低下する）を含むサイトカイン、サイトケラチン、ケモカイン、アディポカインもしくはレプチン。

体液および細胞試料を用いてさらなるマーカーを測定することができる。細胞試料の例には、限定するものではないがリンパ球およびマクロファージが含まれる。

これらのバイオマーカーに関するさらなる情報を、（サイトカイン）Ｈａｕｋｅｌａｎｄ ＪＷら Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＣＣＬ２．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ．４４（６）：ｌ１６７−７４（２００６年６月）；およびＡｂｉｒｕ Ｓら Ｓｅｒｕｍ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ ｓｏｌｕｂｌｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ．２６（ｌ）：３９−４５（２００６年２月）；（マロニル−ＣｏＡ）Ｓａｖａｇｅ ＤＢら Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓ ｌ ａｎｄ ２．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１６（３）：８１７−２４（２００６年３月）；およびＨａｍｍｏｎｄ ＬＥら Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−１ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｅｘｃｅｓｓ ａｃｙｌ−ＣｏＡｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８０（２７）：２５６２９−３６（２００５年７月８日）；（ブチロベタイン）Ｈｉｇａｓｈｉ Ｙら Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇａｍｍａ−ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｅ ｏｎ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｉｎ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｖｉｓｃｅｒａｌ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５３（４）：５２７−３３（２００１年４月）に見出すことができる。

脂質代謝物の測定に加えて、１つ以上のこれらのさらなるバイオマーカーの量の測定値を、本発明の方法において用いることができる。いくつかの実施形態では、１つのバイオマーカーの量を被験体からの試料中で測定する。いくつかの実施形態では、２つのバイオマーカーの量を被験体からの試料中で測定する。その他の実施形態では、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１５、２０以上のバイオマーカーを被験体からの試料中で測定する。

診断およびモニタリングの方法
本発明の方法を用いて肝障害、例えば肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎またはＮＡＳＨを診断することができる。その方法を用いて肝障害の重篤度を評価し、肝障害をモニタリングし、および／または肝障害の進行もしくは退行を評価することもできる。いくつかの実施形態では、肝障害は肝性機能不全である。いくつかの実施形態では、肝障害は肝性脂肪症である。いくつかの実施形態では、肝障害はＮＡＦＬＤである。いくつかの実施形態では、肝障害は肝性脂肪性肝炎である。いくつかの実施形態では、肝障害はＮＡＳＨである。

いくつかの実施形態では、その方法は１つ以上の脂質代謝物の量を１つ以上の参照と比較することを含む。いくつかの実施形態では、参照は脂質代謝物の正常レベルを表す。いくつかの実施形態では、参照は同一被験体に関して以前に測定された脂質代謝物の量である。いくつかの実施形態では、参照は、以前に被験体から得られた体液からの試料中のトリグリセリド中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量である。いくつかの実施形態では、参照は、正常な肝臓を有する１以上の被験体の体液からの１つ以上の試料中に見出されるトリグリセリド中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を表す。

例えば診断の方法は被験体の体液からの試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を決定すること、およびその量を肝障害の存在と相関させることを含むことができる。いくつかの実施形態では、その方法は相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも多い場合、肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎またはＮＡＳＨが示される。いくつかの実施形態では、その方法は相対量を参照と比較する工程をさらに含むことができ、ここで相対量が参照よりも少ない場合、肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎またはＮＡＳＨが示される。

同様に、肝障害の重篤度を測定することができ、ここで相対量は肝障害の重篤度を示す。加えて、相対量は肝臓の現在の状態を示し、故に肝障害をモニタリングでき、および／または障害の進行もしくは退行を評価することができる。相対量を２つ以上の時点で測定することができる。いくつかの実施形態では、相対量を２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、１５、２０以上の時点で測定できる。各々の時点を１以上の時間、日、週または月で分けることができる。１を超える時点で相対量を測定することにより、臨床医は被験体の処置に対する応答を評価することができる。

いくつかの実施形態では、相対量を参照と比較することができる。いくつかの実施形態では、相対量が参照よりも多い場合、肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎またはＮＡＳＨが示される。いくつかの実施形態では、相対量が参照よりも少ない場合、肝性機能不全、肝性脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎またはＮＡＳＨが示される。相対量と参照との間の差異を用いて重篤度を示すこともできる。例えば、相対量が漸増的に参照よりも増えるとき、疾患の重篤度の漸増が示される。または、例えば相対量が漸減的に参照よりも少なくなるとき、疾患の重篤度の漸増が示される。参照の例は限定するものではないが、正常な肝臓を有する個体、肝性機能不全を有する個体、脂肪症を有する個体、ＮＡＦＬＤを有する個体、脂肪性肝炎を有する個体、ＮＡＳＨを有する個体、硬変を有する個体および／または線維症を有する個体からの脂質代謝物の量に基づき得る。参照はまた、特定の原因、例えば１つ以上の以下で見出されるものの結果である肝障害を有する個体にも基づき得る。参照はまた、以前に例えば肝障害を発達させる前、処置を開始する前、処置の終了後に、および／または処置の間の異なる時点で被験体から得られた試料に基づき得る。いくつかの実施形態では、参照は、以前に被験体から得られた体液の試料中の１つ以上の脂質クラス中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量である。いくつかの実施形態では、参照は、正常な肝臓を有する１以上の被験体の体液の１つ以上の試料中の１つ以上の脂質クラス中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を表す。

いくつかの実施形態では、被験体は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は霊長類である。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。

いくつかの実施形態では、その方法は、被験体の処置に対する応答を決定するために用いられる肝障害をモニタリングする方法である。

脂肪症、ＮＡＦＬＤ、脂肪性肝炎およびＮＡＳＨの原因
本発明の方法から利益を享受し得る脂肪酸肝障害は、種々の因子により引き起こされ得る。非限定例には、肝炎；黄熱、ＨＩＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶのようなウイルス性または非ウイルス性感染性作用物質により誘起される脂肪症；タモキシフェン、脱共役タンパク質阻害剤、イソニアジド、リファンピシン、フィブラートおよびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）アゴニストによるような薬物誘起脂肪症；肥満、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、糖尿病、インスリン抵抗性および代謝障害のような代謝原因；アルコール性脂肪肝疾患およびアルコール性脂肪性肝炎のようなアルコール基盤の原因；シトリン欠損、ヘモクロマトーシスおよび高フェリチン血症のような先天性代謝異常または遺伝子変化；例えば四塩化炭素による毒素誘起脂肪症または毒素誘起脂肪性肝炎のような毒素誘起原因；栄養障害；栄養吸収障害；セリアック病；リポジストロフィー；肥満外科手術；ならびに肝臓移植が含まれる。

故に、いくつかの実施形態では、肝障害は、肝炎、ＨＩＶ感染、ＨＢＶ感染、ＨＣＶ感染、ウイルス誘起脂肪症、非ウイルス性感染性作用物質により誘起される脂肪症、薬物誘起脂肪症、肥満、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、糖尿病、インスリン抵抗性、代謝障害、アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性脂肪性肝炎、先天性代謝異常、遺伝子変化、毒素誘起脂肪症、毒素誘起脂肪性肝炎、栄養障害、栄養吸収障害、セリアック病、リポジストロフィー、肥満外科手術および肝臓移植からなる群から選択される１つ以上の状態に関連する。

診断方法を肝臓移植片の評価、肝臓移植片提供のための個体の適合性、肥満外科手術の前の評価、手術に対する応答を評価するための肥満外科手術患者の評価、および体重減少患者の評価のために用いることもできる。

脂質代謝物およびバイオマーカーの測定の方法
脂質代謝物含量に関するアッセイを体液試料において実施することができる。いくつかの実施形態では、脂質代謝物の量を血液、血漿、血清、単離されたリポタンパク質画分、唾液、尿、リンパ液および脳脊髄液からなる群から選択される試料から決定する。いくつかの実施形態では、アッセイを全血、血漿、血清、単離されたリポタンパク質画分で実施することができる。いくつかの実施形態では、試料は血漿または血清である。さらなるバイオマーカーに関するアッセイを体液または細胞試料で実施することができる。

いくつかの実施形態では、複数の異なる脂質代謝物を同一試料中で測定する。その他の実施形態では、複数の脂質代謝物の各々を異なる試料から測定する。複数の試料を用いる場合、試料は被験体の同一または異なる体液からでよい。

限定するものではないが、質量分析（ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、無勾配ＨＰＬＣ、勾配ＨＰＬＣ、順相クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、微小流体工学、クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアッセイおよび／または比色アッセイを利用する方法を含む当業者に公知の方法により、脂質代謝物およびその他のバイオマーカーを容易に単離および／または定量することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は脂質代謝物含量を決定するためにＭＳを利用する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は脂質代謝物含量を決定するためにイムノアッセイを利用する。いくつかの実施形態では、本発明の方法はバイオマーカーの濃度を決定するためにＭＳを利用する。いくつかの実施形態では、本発明の方法はバイオマーカーの濃度を決定するためにイムノアッセイを利用する。

種々の分析方法が当業者に周知であり、以下の文献においてさらに記載されており、それをその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする。

ＴｒｕｅＭａｓｓ（登録商標）分析プラットフォームを本発明の方法のために用いることもできる。ＴｒｕｅＭａｓｓ（登録商標）は、トリグリセリド、コレステロールエステルおよびリン脂質代謝物のような構造およびエネルギー脂質代謝物に関与するおよそ４００の個々の代謝物に関して血清または血漿から定量的データを得るために用いることができる分析プラットフォームである。構造およびエネルギー脂質は代謝の中心的な構成成分であり、身体の事実上あらゆる生物学的過程に組み込まれるので、このプラットフォームは疾患のプロファイリングに有用である。血漿または血清試料のためのデータセットは遊離コレステロールならびに、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルコリン、トリグリセリド、ジグリセリド、遊離脂肪酸、およびコレステロールエステルからの以下の脂肪酸：

ならびに１６：０、１８：０、１８：１ｎ９および１８：１ｎ７のプラスマロゲン誘導体の定量的測定を含む。ＴｒｕｅＭａｓｓ（登録商標）を使用するための方法は当業者に公知であり、以下の文献にも記載されており、それはその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする。米国特許出願第１１／２９６８２９号（１２／６／０５出願）：Ｍｕｔｃｈ ＤＭら Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｓｔｅａｒｏｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎ ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｄｉｅｔ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９（６）：５９９−６０１（２００５年４月）；Ｅｐｕｂ （２００５年１月２４日）；Ｓｔｏｎｅ ＳＪら Ｌｉｐｏｐｅｎｉａ ａｎｄ ｓｋｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ＤＧＡＴ２−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７９（１２）：１１７６７−７６（２００４年３月１９日）；Ｗａｔｋｉｎｓ ＳＭら Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｄｉｅｔａｒｙ ｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｌｉｖｅｒ−ｐｌａｓｍａ ｌｉｐｉｄ ｆｌｕｘ ａｎｄ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｎｕｔｒ．１３３（１１）：３３８６−９１（２００３年１１月）；Ｗａｔｋｉｎｓ ＳＭら Ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＰＰＡＲｇａｍｍａ ａｇｏｎｉｓｔ ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４３（１１）：１８０９−１７（２００２年１１月）。

適当な方法の非限定例（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）を、Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ，Ｖｉｅｗｉｎｇ，Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ，ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ａ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓと題された米国特許出願公開第２００４／０１４３４６１号およびＰＣＴ公開第ＷＯ０３／００５６２８号；Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｂ．ら Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ２，３，７，８−ｔｅｔｒａｃｈｏｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ ｐ−ｄｉｏｘｉｎ（ＴＣＤＤ）ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｃ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｍａｌｅ ｃｈｉｃｋｅｎｓ（Ｇａｌｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｐａｒｔ Ｃ １２９：１３７−１５０（２００１）；Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｓ．Ｍ．ら Ｕｎｉｑｕｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｈｅａｒｔ ｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ｏｒ α−Ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｌｉｐｉｄｓ．３６（３）：２４７−２５４（２００１）；およびＢｅｒｎｈａｒｄｔ，Ｔ．Ｇ．ら Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒｓ ｂｙ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ．ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，６７５：１８９−１９６（１９９６）においても見出すことができる。

非限定例として、その方法は以下の工程を含み得る。抽出、脂質クラス分離、脂肪酸メチルエステルの調製ならびに脂肪酸およびステロール分離および定量。方法の非限定例には以下の工程が含まれる。（１）抽出：Ｆｏｌｃｈ抽出の変法を用いてクロロホルム：メタノール（２：１容量／容量）で血漿２００μｌから脂質を抽出する（Ｆｏｌｃｈ，Ｊ．、Ｍ．Ｌｅｅｓら、「Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２２６（１）：４９７−５０９（１９５７））。定量用の基本の内部標準のパネルの存在下で各抽出を実施する。抽出された脂質を濃縮し、ＨＰＬＣによる分離に備える。（２）脂質クラス分離：個々の脂質クラスを種々の方法を用いてＨＰＬＣにより抽出物から分離する。各々の分離された脂質クラスを収集し、トランスエステル化に備えて窒素下で乾燥させる。（３）脂肪酸メチルエステルの調製：脂質クラスを密封されたバイアル内で３Ｎ メタノール性ＨＣｌ中窒素雰囲気下１００℃で４５分間トランスエステル化する。得られた脂肪酸メチルエステルを混合物からヘキサンで抽出し、窒素下でヘキサン抽出物を密封することによりガスクロマトグラフィーのための自動注入に備える。（４）脂肪酸およびステロール分離および定量：３０ｍ ＤＢ−２２５ＭＳキャピラリーカラム（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｏｌｓｏｍ、ＣＡ）および水素炎イオン化検出器を装備したガスクロマトグラフ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ｍｏｄｅｌ６８９０、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いてキャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸メチルエステルを分離および定量する。

脂質代謝物の定量において、サロゲートまたは内部標準を用いることができる。サロゲート標準は当分野において公知である。サロゲート標準の非限定例は、とりわけ「Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ，Ｖｉｅｗｉｎｇ，Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ，ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ａ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ」と題されたＰＣＴ公開第ＷＯ０３／００５６２８号の１６−１７頁および２５−３１頁ならびに米国特許出願公開第２００４／０１４３４６１号（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に記載されている。サロゲート標準の非限定例を以下の表５においても提供する。

（表５．基本のサロゲート標準の例）

キット
本発明の方法を実行するためのキットを提供する。そのキットは（ａ）１つ以上の脂質代謝物の量を測定するための１つ以上の試薬、および（ｂ）使用のための説明書を含む。キットは１、２、３、４、５、１０、１５、２０以上の脂質代謝物の量を測定するための１、２、３、４、５、１０、１５、２０以上の試薬を提供し得る。キットはさらに、上記および表２−４にて開示されたもののような１つ以上のさらなるバイオマーカーを測定するための１つ以上の試薬を提供し得る。いくつかの実施形態では、キットは、イムノアッセイにおいて使用するための１つ以上の試薬を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＭＳアッセイにおいて使用するための１つ以上の試薬を含む。いくつかの実施形態では、試薬は抗体である。抗体を作成する方法は当業者に公知である。

いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載される方法の各々において使用するためのキットを提供し、ここでそのキットは（ａ）脂質代謝物に対する抗体、および（ｂ）使用のための説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットはさらに、（ｃ）第２の脂質代謝物に対する第２の抗体を含む。いくつかの実施形態では、キットはさらに（ｄ）第３の脂質代謝物に対する第３の抗体を含む。いくつかの実施形態では、第１、第２および／または第３の脂質代謝物は脂肪酸である。

以下の非限定的な実施例により本発明をさらに説明する。

実施例１−３に関する材料および方法
研究集団
第１のデータセットは４９個の肝臓生検試料を含み、それは肝性トリグリセリド組成および肝性トリグリセリド濃度との相関性を決定するためにプロファイリングされた。組織の病理学的試験により評価されるように、これらの試料のうち、８人の被験体がＮＡＳＨに分類され、６人の被験体がＮＡＦＬＤに分類され、３５個が正常試料であった。これらの４９個の肝臓試料は多様な人種（白色、黒色および不確定）の男性および女性から収集された。正常な肝臓を有する９人の被験体は一致する血漿試料を提供した。これらの試料を用いて肝臓トリグリセリド含量と血漿脂質代謝物との間の相関性を提供した。

第２のデータセットには肝性機能不全を有する８人の被験体および（肝臓生検により）正常な８人の個体からの血清試料が含まれた。このデータセットを用いて肝臓生検分析からの所見を確認した。

分析方法
血漿および組織からの脂質を、基本の内部標準の存在下、Ｆｏｌｃｈらの方法（Ｆｏｌｃｈ，Ｊ．ら Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄｓ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：４９７−５０９（１９５７））によりクロロホルム−メタノール（２：１、容量／容量）を用いて抽出した。各分析に関して血漿２００μｌを使用した。各抽出物内の個々の脂質クラスをＷａｔｋｉｎｓ，Ｓ．Ｍ．ら Ｕｎｉｑｕｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｈｅａｒｔ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｉｅｔａｒｙ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ｏｒ ｛ａｌｐｈａ｝−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｌｉｐｉｄｓ．３６：２４７−２５４（２００１）に記載されるように、調製用薄層クロマトグラフィーにより分離した。

基本の脂質クラス標準化合物を薄層クロマトグラフィープレートの２本の外側のレーンにスポットして、試料脂質クラスの位置確認を可能にした。各脂質画分をプレートから掻き取り、密封バイアル内で３Ｎ メタノール性ＨＣｌ中、窒素雰囲気下１００℃で４５分間トランスエステル化した。得られた脂肪酸メチルエステルを混合物から０．０５％ブチル化ヒドロキシトルエン含有ヘキサンで抽出し、窒素下でヘキサン抽出物を密封することによりガスクロマトグラフィーに備えた。

Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｓ．Ｍ．ら Ｕｎｉｑｕｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｈｅａｒｔ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｄｉｅｔａｒｙ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ｏｒ ｛ａｌｐｈａ｝−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｌｉｐｉｄｓ．３６：２４７−２５４（２００１）に記載されるように、３０ｍ ＤＢ−２２５ＭＳキャピラリーカラム（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｏｌｓｏｍ、ＣＡ）および水素炎イオン化検出器を装備したガスクロマトグラフ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ｍｏｄｅｌ６８９０、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いて、キャピラリーガスクロマトグラフィーにより脂肪酸メチルエステルを分離および定量した。

一度クロマトグラムを作成すると、分析用ソフトウェア（Ａｔｌａｓ ２００３：Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により参照標準に基づいて目的の各分析被験体脂質代謝物を同定し、未加工エリアを作成した。各分析対象に関する未加工エリア、ピーク形パラメーターおよび応答因子を情報管理システムにエクスポートし、ここで積分アルゴリズムを用いて目的の各分析対象に関する補正エリアを作成した。適切なサロゲートの面積に対する分析対象ピークの面積の比を取ることにより定量データを計算した。この比率を元来の試料におけるサロゲートの濃度に乗じて、試料形式のグラムあたりのマイクログラムでデータを作成した。次いで各分析対象をその分子量で除し、１０００を乗じて試料のグラムあたりの分析対象のナノモルを計算した。各脂肪酸の濃度をそのクラス内の脂肪酸の濃度の合計で除して、各脂質クラスに関するモルパーセンテージデータを計算した。

統計方法
被験体の３０％を超えて検出されない代謝物は統計分析には含めなかった。

データ
変換されていないモルパーセンテージデータを用いて肝性トリグリセリド含量と相関させ、肝性機能不全研究における結果の確認にも使用した。

相関性
ピアソンの相関係数を用いて各代謝物と全肝性トリグリセリドとの関係性を評価した。表６の代謝物は全肝性トリグリセリドと相関し（α＜０．２）、肝性機能不全と正常個体との間で血清中に観察された差異と比較した。肝性機能不全個体で逆の効果を有した（２群：正常および肝性機能不全に関する不対スチューデントｔ検定による）これらの代謝物は、表６に含めなかった。

実施例１
血漿および肝臓脂肪酸組成物の相関性
肝性トリグリセリド含量と相関する、脂質クラスのパーセンテージ組成物として表現される脂質代謝物は血液からアッセイできることが見出された。血液基盤の測定値に関する可能性を決定して、肝性脂質クラス脂肪酸組成物を正確に反映するために正常ヒトなヒトから（第１の被験体のセットから）の一致した血漿−肝臓試料からの個々の脂質クラスの脂肪酸組成物を相関させた。血液血漿と肝臓の組成物間の相関性は、トリグリセリドおよびホスファチジルコリンクラスに対して優れており、コレステロールエステルクラスに関して幾分良好であった（図２）。これにより、トリグリセリドおよびホスファチジルコリンの血液血漿脂肪酸組成物が、各々トリグリセリドおよびホスファチジルコリンの肝臓脂肪酸組成物の正確な指標であることが示された。故に、肝臓の組成データが脂肪症と十分に相関する場合、脂肪酸の血液血漿基盤の測定値は肝臓（脂肪症）におけるトリグリセリドの定量的な量を示し得る。

優れた分類を提供し、単一の脂質生合成経路と合致し、肝臓トリグリセリドの予測となる、１５−２０の比例的な脂肪症のマーカーがヒト肝臓生検で同定された。肝臓ＴＧ２０：４ｎ６に関する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を図４に示す。

実施例２
肝性脂肪症と肝性脂肪酸組成物との間の相関性
第１のデータセットをこの実験において使用した。４９人の被験体の肝臓試料を、肝性脂肪症および炎症の程度に関して分類した。６人の被験体がＮＡＦＬＤに分類され、８人の被験体がＮＡＳＨに分類された。全てのその他の試料を正常と推定した。ＴｒｕｅＭａｓｓ（登録商標）技術を用いて試料をプロファイリングし、多くの代謝物が全肝性トリグリセリド濃度と正または負のいずれかで相関することが見出された。とりわけ、一飽和脂肪酸は一般的に脂肪症と正に相関し、必須脂肪酸は一般的に脂肪症と負に相関した。全肝性トリグリセリドと十分に相関する代謝物の一例は、トリグリセリド中に存在する全脂肪酸のパーセンテージとして表現される脂肪酸２０：４ｎ６であった（図３）
図３は肝性トリグリセリド濃度（ナノモル／ｇ）と肝性トリグリセリド中２０：４ｎ６の相対比率（全トリグリセリド脂肪酸のモルパーセンテージとして表現される）との間の関係性を示す。ＴＧ２０：４ｎ６の相対比率は、肝臓中のトリグリセリドの全濃度の優れた予測因子であった。正常に分類されたにもかかわらず、いくつかの正常試料はＮＡＦＬＤレベルのトリグリセリドを呈し、２０：４ｎ６の相対比率は全トリグリセリド濃度の優れた予測因子のままであった。

実施例３
ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨのマーカー
表６のＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの代謝物マーカーは、肝臓の全トリグリセリド含量とのその観察されたおよび／または予測された相関性に基づいて選択された。加えてこれらのマーカーは、正常肝臓機能または肝性機能不全を有する試験された１６人全ての被験体を分類するのに有用ないくつかの相関性を示した。

（表６：肝性脂肪症の血液基盤の脂質代謝物マーカー（モルパーセンテージに基づく））

実施例４
血漿中のＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの脂肪酸マーカー
研究集団
ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤおよび正常対照血漿試料のセットを収集して、血漿中の脂質組成物における差異を試験した。ＮＡＳＨの患者は３０人の、ＮＡＦＬＤの患者は７人、正常被験体は１２人であった。

分析方法
絶食時血漿、血清および肝臓試料から脂質代謝物を定量した。測定された脂質には、コレステロール、コレステロールエステル（ＣＥ）、ジグリセリド（ＤＧ）、遊離コレステロール（ＦＳ）、遊離脂肪酸（ＦＡ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＹ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびトリグリセリド（ＴＧ）が含まれた。ＣＥ、ＤＧ、ＦＡ、ＬＹ、ＰＣ、ＰＥおよびＴＧ脂質クラスに関して、以下の脂肪酸構成成分が脂質クラス内の全脂肪酸の比率として定量された。

１６：０、１８：０、１８：１ｎ７および１８：１ｎ９のプラスマロゲン誘導体、ｔ１６：１ｎ７ｔ１８：１ｎ９ｔ１８：２ｎ６。この実施例では、「ＬＣ」なる用語は、示される値が血清または血漿のグラムあたりのナノモルとして表現される脂質クラスの全濃度であることを示す。故にこの実施例では、ＰＣ１８：２ｎ６なる略語は、リノール酸（１８：２ｎ６）からなる血漿または血清ホスファチジルコリンのパーセンテージを示し、ＴＧＬＣなる用語は血漿または血清中に存在するトリグリセリドの絶対量（グラムあたりのナノモル）を示す。

試料からの脂質は、各脂質クラスに関する基本のサロゲート標準の存在下で、液体：液体抽出により抽出され、脂質抽出物を創成した。分析されている材料の量を正確に決定するために、試料およびサロゲートの質量をこの工程で記録した。試料およびサロゲート標準の質量を用いて、各脂質クラスの各脂肪酸の定量的な量を計算した。

中性およびリン脂質クラスを、Ｖａｒｉａｎ Ｖａｃ Ｅｌｕｔ ２０真空マニフォールドおよびＳｕｐｅｌｃｏ ＬＣ−ＳＩシリカ充填ＳＰＥカートリッジを用いて固相抽出により互いに分離した。これらの抽出物を一度調製すると、中性脂質クラスをシリカゲルＧ−６０ＴＬＣプレートの調製用薄層クロマトグラフィーにより分離した。リン脂質クラスを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣの高速液体クロマトグラフィーによりＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｐｅｒｅｘ ５ｕ ＯＨ Ｄｉｏｌカラム（２５０×４．６ｍｍ、５ミクロン）およびＳＥＤＥＸ７５蒸発光散乱検出器を用いて分離した。一度各クラスを単離すると、脂質クラスをメタノール中１％硫酸でトランスエステル化し、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の形成に至った。各クラスに関するＦＡＭＥ混合物をＡｇｉｌｅｎｔ ＧＣ６８９０のキャピラリーガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によりＪ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＨＰ−８８融合シリカキャピラリーカラム（３０ｍ×２５μｍ、０．２μｍフィルム）および水素炎イオン化検出器を用いて分離および定量した。

統計方法
ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨのマーカーに関して、モルパーセンテージデータおよび脂質クラス濃度を評価した。データを分析用に変換しなかった。被験体の３０％を超えて検出されない代謝物は統計分析には含めなかった。両側ｔ検定を用いて群（ＮＡＳＨ対正常、およびＮＡＦＬＤ対正常）を比較した。

結果
表７および８は、各々ＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤと有意に関連するマーカーを示す。ＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤ被験体におけるたいていの脂質クラスは、正常と有意に異ならなかった。ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンは、ＮＡＳＨにおいて正常に相対して有意に減少した（ｔ検定からのｐ値：０．００１、０．０２１）。ホスファチジルコリンおよびリゾホスファチジルコリンは、ＮＡＦＬＤにおいて正常に相対して有意に減少した（ｔ検定からのｐ値：０．０５、０．０４２）。ノンパラメトリックウィルコクソン検定から非常に類似した結果が得られた。

オメガ３脂肪酸、特にＤＨＡは、正常対照に相対してＮＡＳＨ被験体において減少した。ＤＨＡの減少はＣＥ、ＰＣおよびＰＥで定量的および組成的の双方で正常対照に相対してＮＡＳＨにおいて認められた。ＤＨＡはＦＡ、ＬＹおよびＴＧで組成的にのみ正常対照に相対してＮＡＳＨにおいて有意に減少した。１８：３ｎ３はＰＣで定量的および組成的の双方で有意に減少したが、それは遊離脂肪酸で組成的にただ有意に減少した。２２：５ｎ３は、ＰＣで正常被験体に相対してＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤにおいて組成的に有意に増加した。

１８：２ｎ６は、リン脂質で正常被験体に相対してＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤにおいて定量的に有意に減少したが、２０：３ｎ６はＣＥ、ＦＡおよびＴＧで有意に増加した。組成的には、１８：２ｎ６はＬＹでのみ有意に減少したが、２０：３ｎ６はＤＧを除いて各脂質クラスで正常対照に相対してＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤにおいて増加した。

飽和脂肪酸はＰＥ、ＰＣおよびＤＧで正常対照に相対してＮＡＳＨにおいて有意に増加した。ＮＡＦＬＤ被験体もまた正常対照よりも高い飽和脂肪酸を有する傾向があった。組成的には、１８：０のみがＣＥ、ＬＹおよびＰＣでＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤにおいて増加した。

（表７．ＮＡＳＨマーカー（ｔ検定において１で有意、ｐ値を丸括弧内に示す））

（表８．ＮＡＦＬＤマーカー（ｔ検定において１で有意、ｐ値を丸括弧内に示す））

実施例３で同定されたこととは対照的に、この特定の研究では、以下の代謝物が脂肪症と正に関連することが見出されなかった。ＰＣ２０：２ｎ６；ＰＣ１８：１ｎ７；およびＣＥ２２：６ｎ３。さらにこの研究では、実施例３で同定されたこととは対照的に、以下の代謝物が脂肪症と負に関連することが見出されなかった。ＴＧ２０：３ｎ６；ＴＧ２２：５ｎ３；およびＰＣ２２：５ｎ３。

実施例５
血漿中のＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨのエイコサノイドマーカー
研究集団
研究３で用いた研究集団の亜集団を用いてＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤおよび正常被験体の間のエイコサノイドの脂質組成物における差異を決定した。ＮＡＳＨ患者は２６人、ＮＡＦＬＤ患者は５人、および正常対照は１２人であった。

分析方法
タンパク質沈殿およびろ過、その後ＬＣ／ＭＳへの負荷を用いて、血漿または血清２５０μｌからエイコサノイドを抽出した。定量用に重水素化されたサロゲートの混合物２０μｌを各試料に加え、完全に混合した。各血漿／血清試料１０μｌに抗酸化溶液（５０：５０ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ中０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＨＴ．ＥＤＴＡ）を加え、完全に混合した。メタノール１ｍｌを各試料に加え、続いて混合することによりタンパク質沈殿を実施した。試料を−４℃および１７０００ｇで１０分間遠心した。上澄を窒素下、１０ｐｓｉで２時間乾燥させた。乾燥した試料をメタノール：脱イオン化水（５０：５０）６０μｌで再構築した。混合した後、試料をＬＣ／ＭＳＭＳ分析用にシラン処理されたオートサンプラーインサートに移した。試料をＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４０００ ＱＴＲＡＰに連結されたＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｔａｂｌｅ Ｂｏｎｄ Ｃ１８カラム（１５０×２．１ｍｍ、１．８ミクロン）に注入した。分析被験体をネガティブエレクトロスプレイによりイオン化し、タンデムＭＳモードで質量分析器を操作した。

多くのエイコサノイドに関する略語を以下の表９にて提供する。

（表９．エイコサノイド）

統計方法
定量的データ（血漿グラムあたりのピコモル）をＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨのマーカーに関して評価した。定量的データを分析用に変換しなかった。被験体の３０％を超えて検出されない代謝物は統計分析には含めなかった。両側ｔ検定を用いて群（ＮＡＳＨ対正常、およびＮＡＦＬＤ対正常）を比較した。

結果
表１０は、ＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤと有意に関連したエイコサノイド代謝物を示す。ＮＡＦＬＤ群は、有意に高い１３，１４−ジヒドロ−ｌ５−ケトプロスタグランジンＡ_２、１１−デヒドロ−トロンボキサンＢ_２および１２，１３−ジヒドロキシオクタデセン酸を有する。１９，２０−ジヒドロキシドコサペンタエン酸は、ｔ検定によると有意に減少したが、ウィルコクソン検定による有意性には到達しなかった。

ＮＡＳＨ群は、ウィルコクソン検定により評価されるように有意に高いプロスタグランジンＥ_２、１５−ケト−プロスタグランジンＦ_２□、およびロイコトリエンＤ_４を有したが、ｔ検定による有意性には到達しなかった。５−ＨＥＴＥ、８−ＨＥＴＥ、９−ＨＥＴＥ、１１−ＨＥＴＥ、１２−ＨＥＴＥおよび１５−ＨＥＴＥを含むＨＥＴＥ類は、ＮＡＳＨにおいて双方の検定で正常を超えて有意に増加した。１１−ＨＥＴＥおよび１５−ＨＥＴＥは直線的に反相関したが、対数尺度でいくらかの脂質クラスのＤＨＡとさらに強く反相関した。

（表１０．ＮＡＳＨおよびＮＡＦＬＤマーカー（ｔ検定において１で有意、ｐ値を丸括弧内に示す））

実施例６
マーカーの組み合わせに基づく分類
記載されたマーカー代謝物から直接的に、またはこれらのマーカーの単純な組み合わせからのいずれかでＮＡＳＨの診断法を築くことができる。各診断適用は独特な性能特性を必要とするので、代謝物濃度を単純なアルゴリズムと組み合わせて、特定の望ましい検定に必要とされる感度および特異度を提供することができる。

実施例４および５からの結果を用いてＮＡＦＬＤおよび正常被験体からＮＡＳＨを区別するための分類指標を開発した。代謝物対の直線的な組み合わせを、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）を用いてＮＡＳＨ対ＮＡＦＬＤを分類するその能力に関して評価した。この実験において評価される性能特性には、ＲＯＣ曲線下面積（ＲＯＣ ＡＵＣ）、検定の感度および特異度が含まれた。全体的な感度および特異度を提供した組み合わせ（組み合わせ１）、低特異度で高感度（組み合わせ２および３）および低感度で高特異度（組み合わせ４および５）の例を以下の表１１に示す。

代謝物の直線的な組み合わせは、この実施例のためのアルゴリズム方法として選択されたが、任意のアルゴリズム（比率等を含む）を用いて主張される代謝物からの検定変数を作成することができる。

（表１１．ＮＡＦＬＤおよび正常被験体からのＮＡＳＨの分類における代謝物の直線的な組み合わせの性能）

望ましい検定性能は適用に依存する（例えば、被験体が検定に基づいて侵襲性の手順を行うことになっている場合、高度な特異度を確実にすることが最も有用であり得る）。アルゴリズムの個々の代謝物構成成分および分類のための閾値（臨界値）を選択することにより、検定の性能を調整することができる。アルゴリズムに含めるために選択される代謝物は、本明細書に記載されるエイコサノイドもしくは脂肪酸マーカーのいずれか、または以下のアシルカルニチン、ステロール、胆汁酸もしくはオキシステロールのいずれかでよい。カルニチン代謝物およびアシルカルニチン；Ｌ−カルニチン、ｇ−ブチロベタイン；トリメチルリジン；アセチルカルニチン；プロピオニルカルニチン；ブチリルカルニチン；バレリルカルニチン；ヘキサノイルカルニチン；オクタノイルカルニチン；デカノイルカルニチン；ドデカノイルカルニチン；ミリストイルカルニチン；パルミトイルカルニチン；ステアロイルカルニチン；オレオイルカルニチン；リノレオイルカルニチン。ステロール、胆汁酸およびオキシステロール；コレステロール；７−デヒドロコレステロール；デスモステロール；ラノステロール；ラソステロール；コレスタノール；コプロスタノール；ｂ−シトステロール；カンプエステロール；スチグマステロール；４−コレステン−７ａ−オール−３−オン；７ａ−ヒドロキシコレステロール；２７−ヒドロキシコレステロール；２５−ヒドロキシコレステロール；２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール；４ｂ−ヒドロキシコレステロール；コール酸；ケノデオキシコール酸；デオキシコール酸；リトコール酸；グリココール酸；グリコケノデオキシコール酸；グリコデオキシコール酸；グリコリトコール酸；タウロコール酸；タウロケノデオキシコール酸；タウロデオキシコール酸；タウロリトコール酸；ウルソデオキシコール酸；グリコウルソデオキシコール酸。

Claims (41)

1. 被験体における肝障害を診断またはモニタリングする方法であって、
   （Ａ）該被験体の体液からの１つ以上の試料中の１つ以上の脂質代謝物の量を決定する工程、および
   （Ｂ）該１つ以上の脂質代謝物の量を肝障害の存在と相関させる工程を含み、
   ここで該脂質代謝物は脂肪酸および／またはエイコサノイドであり、ここで該肝障害は肝性機能不全、肝性脂肪症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪性肝炎または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、方法。
2. 前記１つ以上の脂質代謝物が、
   

   

   からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記１つ以上の脂質代謝物が１つ以上の脂肪酸を含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記１つ以上の脂肪酸の量が、１つ以上の試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量である、請求項３に記載の方法。
5. 前記１つ以上の脂質代謝物が１つ以上のエイコサノイドを含む、請求項１または２に記載の方法。
6. 前記肝障害が脂肪症、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨである、請求項１または２に記載の方法。
7. 前記１つ以上の脂質代謝物の量を１つ以上の参照と比較することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
8. 前記肝障害が脂肪症またはＮＡＦＬＤであり、１つ以上の脂質代謝物が、
   

   

   からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
9. （ａ）前記脂質代謝物：
   

   

   が前記肝障害と正に関連し、
   （ｂ）前記脂質代謝物：
   

   

   が前記肝障害と負に関連する、請求項８に記載の方法。
10. 前記肝障害がＮＡＳＨであり、前記１つ以上の脂質代謝物が、
    

    

    

    からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
11. （ａ）前記脂質代謝物：
    

    

    が前記肝障害と正に関連し、
    （ｂ）前記脂質代謝物：
    

    

    が前記肝障害と負に関連する、請求項１０に記載の方法。
12. ２つ以上の前記脂質代謝物の量が決定される、請求項１または２に記載の方法。
13. 前記１つ以上の脂質代謝物が、
    （ａ）１５−ＨＥＴＥおよび１５−ケト−ＰＧＦ_２α、
    （ｂ）ＴＧ１８：１ｎ７およびＰＣ２０：３ｎ６、
    （ｃ）１１−ＨＥＴＥおよびＣＥ２２．６ｎ３、
    （ｄ）１１−ＨＥＴＥおよびＰＣＴＬ、および
    （ｅ）ＰＣ２２：６ｎ３およびＰＣ１８：３ｎ３、
    からなる群から選択される１対の脂質代謝物を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記被験体の処置に対する応答を決定するためにモニタリングの方法が用いられる、請求項１または２に記載の方法。
15. 前記肝障害が肝炎、ＨＩＶ感染、ＨＢＶ感染、ＨＣＶ感染、ウイルス誘起脂肪症、非ウイルス性感染性作用物質により誘起される脂肪症、薬物誘起脂肪症、肥満、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、糖尿病、インスリン抵抗性、代謝障害、アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性脂肪性肝炎、先天性代謝異常、遺伝子変化、毒素誘起脂肪症、毒素誘起脂肪性肝炎、栄養障害、栄養吸収障害、セリアック病、リポジストロフィー、肥満外科手術および肝臓移植からなる群から選択される１つ以上の状態に関連する、請求項１または２に記載の方法。
16. 前記試料が血液、血漿、血清、単離されたリポタンパク質画分、唾液、尿、リンパ液および脳脊髄液からなる群から選択される、請求項１、２、８、９、１０または１１に記載の方法。
17. 前記試料が血液、血漿、血清または単離されたリポタンパク質画分からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記被験体がヒトである請求項１、２、８、９、１０または１１に記載の方法。
19. 被験体における肝障害を診断またはモニタリングする方法であって、該被験体の体液からの試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する１つ以上の脂肪酸の相対量を決定する工程、および
    該相対量を肝障害の存在と相関させる工程を含み、
    ここで該肝障害は肝性機能不全、肝性脂肪症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪性肝炎または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、方法。
20. １つ以上の脂肪酸が、
    

    

    からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記１つ以上の脂肪酸の相対量を参照と比較する工程をさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
22. （ａ）
    

    

    の相対量が参照よりも多い、および／または
    （ｂ）
    

    

    の相対量が参照よりも少ない場合、肝性機能不全、肝性脂肪症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪性肝炎または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）が示される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記被験体におけるＮＡＳＨを診断する方法であって、請求項１９に記載の方法の工程を含み、さらに被験体からの体液中のエイコサノイドのレベルを決定する工程を含み、ここで正常レベルよりも高いことがＮＡＳＨを示す、方法。
24. 前記エイコサノイドがｌ５−ＨＥＴＥ；ＰＧＢ２；ＰＧＥ２；ＰＧＦ２α；１５−ケト−ＰＧＦ２α；５−ＨＥＴＥ；８−ＨＥＴＥ；９−ＨＥＴＥ；１１−ＨＥＴＥ；１２−ＨＥＴＥ；１２−ＨＥＰＥ；１１，１２−ＥｐＥＴｒＥ；および８，９−ＤｉＨＥＴｒＥからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
25. ２つ以上の脂肪酸の相対量が決定される、請求項１９または２０に記載の方法。
26. 前記被験体の処置に対する応答を決定するためにモニタリングの方法が用いられる、請求項１または１９に記載の方法。
27. 被験体の肝臓中のトリグリセリドのレベルを評価する方法であって、該被験体の体液からの試料中の脂質代謝物の量を決定する工程を含み、
    ここで該脂質代謝物は脂質クラスに存在する脂肪酸であり、
    ここで該脂質クラスは遊離脂肪酸、全脂肪酸、トリグリセリド、コレステロールエステル、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される、方法。
28. 前記代謝物の量が試料中の１つ以上の脂質クラスの脂質中の全脂肪酸含量に対する脂肪酸の相対量である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記脂肪酸が、
    

    

    からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
30. １つ以上の脂肪酸の相対量を参照と比較する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
31. （ａ）
    

    

    の相対量が参照よりも多い、および／または
    （ｂ）
    

    

    の相対量が参照よりも少ない場合、肝臓中のトリグリセリドの蓄積が示される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記被験体の体液からの試料中の第２の異なる脂質代謝物の相対量を決定する工程をさらに含み、ここで該第２の脂質代謝物が、
    

    

    からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
33. 前記肝障害が肝炎、ＨＩＶ感染、ＨＢＶ感染、ＨＣＶ感染、ウイルス誘起脂肪症、非ウイルス性感染性作用物質により誘起される脂肪症、薬物誘起脂肪症、肥満、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）、糖尿病、インスリン抵抗性、代謝障害、アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性脂肪性肝炎、先天性代謝異常、遺伝子変化、毒素誘起脂肪症、毒素誘起脂肪性肝炎、栄養障害、栄養吸収障害、セリアック病、リポジストロフィー、肥満外科手術および肝臓移植からなる群から選択される１つ以上の状態に関連する、請求項１９または２７に記載の方法。
34. 前記試料が血液、血漿、血清、単離されたリポタンパク質画分、唾液、尿、リンパ液および脳脊髄液からなる群から選択される、請求項１９、２０、２２、２７、２８、２９、３０、３１または３２に記載の方法。
35. 前記試料が血液、血漿、血清または単離されたリポタンパク質画分からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記被験体がヒトである請求項１９、２０、２２、２７、２８、２９、３０、３１または３２に記載の方法。
37. 前記被験体が肝臓移植片ドナー候補であるか、肥満外科手術のために評価されているか、肥満外科手術を行ったことがあるか、または体重減少に関してモニタリングされている、請求項１、１９または２７に記載の方法。
38. 請求項１９、２０、２７、２８または２９に記載の方法で使用するためのキットであって、該キットが、
    （ａ）脂肪酸に対する抗体および
    （ｂ）使用のための説明書、
    を含む、キット。
39. 前記キットが、
    （ｃ）第２の脂肪酸に対する第２の抗体、
    をさらに含む、請求項３８に記載のキット。
40. 請求項１または２に記載の方法で使用するためのキットであって、該キットが、
    （ａ）１つ以上の脂質代謝物に対する抗体および
    （ｂ）使用のための説明書、
    を含む、キット。
41. 前記キットが２つ以上の脂質代謝物に対する抗体を含む、請求項４０に記載のキット。

Images