JP2010227907A - Affinity magnetic bead - Google Patents
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Abstract
Description
近年、最先端バイオ医療技術が相次ぎ実用化されようとしている。とくに、ヒト免疫機能を使う抗体医薬は高い効能が期待できるうえ、副作用も比較的少ないため、今後の医療の中心とみられている。抗体医薬は今後の医薬の主流に成るとされ、我が国の製薬会社各社は開発・実用化を急いでいる。 In recent years, state-of-the-art biomedical technologies are being put into practical use one after another. In particular, antibody drugs that use human immune function are expected to be highly effective and have relatively few side effects. Antibody drugs are said to become the mainstream of future drugs, and pharmaceutical companies in Japan are rushing to develop and put to practical use.
この抗体医薬やワクチンの開発・実用化に欠かせないのがダウンストリーム技術の抗体の連続・大量・高速の分離・精製技術である。近年、バイオ・創薬の分野において、アフィニティー・マイクロ／ナノビーズを用いた細胞・分子の分離（スクリーニング）技術が進歩し、多くの細胞・分子のタンパク質をビーズを用いて分離可能に成った。 Indispensable for the development and commercialization of antibody drugs and vaccines is downstream, continuous, large-volume, and high-speed separation / purification technology for antibodies. In recent years, in the field of biotechnology and drug discovery, cell / molecule separation (screening) technology using affinity micro / nano beads has progressed, and many cell / molecule proteins can be separated using beads.
しかし、現在、先行する非磁性ナノビーズは、分離にはアフィ二ティー・クロマトグラフィーを用いるため、数十倍から百倍にも希釈する必要がある。これに対し磁気ビーズで分離する場合は、希釈する必要はなく、高濃度のまま分離可能である。このため、処理速度は格段に向上する。 However, since the preceding nonmagnetic nanobeads currently use affinity chromatography for separation, it is necessary to dilute tens to hundred times. On the other hand, when separating with magnetic beads, it is not necessary to dilute and separation is possible with a high concentration. For this reason, the processing speed is remarkably improved.
また、アフィ二ティー磁気ビーズと抗体が会合し結合する確率は、同じ質量のアフィ二ティー磁気ビーズを拡散させるとすると、アフィ二ティー磁気ビーズの直径をN分の一に小さくすると、同じ質量ではNの３乗倍の多数のアフィ二ティー磁気ビーズがコロイド状に分散して含まれることになり、この磁気ビーズの全表面積はN倍になり、したがって、結合する確率は少なく見積もってもN倍と格段に高くなり、処理時間の大幅な短縮が可能になり実用的に大変有利である。したがって、可能な限りアフィ二ティー磁気ビーズの直径は小さいほうが良いと考えられる。 Also, the probability that affinity magnetic beads and antibodies will associate and bind is that if the affinity magnetic beads of the same mass are diffused, if the diameter of the affinity magnetic beads is reduced by a factor of N, at the same mass A large number of affinity magnetic beads of N times the power of N will be contained in a colloidal form, and the total surface area of this magnetic bead will be N times, and therefore the probability of binding will be N times even if estimated at a low rate. The processing time is significantly reduced, and the processing time can be greatly shortened, which is very advantageous in practice. Therefore, it is considered that the diameter of the affinity magnetic beads should be as small as possible.
しかし、この磁気ビーズの直径が小さいと、磁気ビーズに作用する磁気力が小さくなる為、既存技術では、永久磁石を使用していることもあり、分離できる磁気ビーズの大きさは直径が約１．５ミクロン程度以上に制限され、これ以下の直径の小さな磁気ビーズは捕捉することが出来なかった。 However, if the diameter of the magnetic beads is small, the magnetic force acting on the magnetic beads becomes small. Therefore, in the existing technology, a permanent magnet may be used, and the size of the magnetic beads that can be separated is about 1 in diameter. It was limited to about 5 microns or more, and small magnetic beads with a diameter smaller than this could not be captured.
しかし、超伝導マグネットを用いることにより、永久磁石の数十倍から数百倍もの強力な磁場を発生させ、さらに、高勾配磁気分離の原理（局所的に大きな磁場勾配）を用いることで磁気ナノビーズを効率よく分離・精製（捕捉）出来ることを本発明者等が実験で示した。 However, by using a superconducting magnet, a magnetic field several tens to several hundred times that of a permanent magnet can be generated, and the magnetic nanobeads can be generated by using the principle of high gradient magnetic separation (locally large magnetic field gradient). The present inventors have shown through experiments that can be efficiently separated and purified (captured).
この技術のシステム原理図を図３に示す。このシステムに基づく実験においては、小型冷凍機を採用した伝導冷却式である卓上型の小型超伝導電磁石３１を用いて、永久磁石の数十〜数百倍もの強力な磁場である、最大５Tの磁場を発生させる。小型超伝導電磁石３１の中心部分３２には直径約２６ｍｍの円筒状の室温の空間を持たせ、この空間に内径２０ｍｍ、外形２４ｍｍのガラス管３３を通し、この管３３の中に直径数〜数十ミクロン程度の磁性細線のステンレスウール３４からなるフィルター３５を挿入する。この直径数ミクロン程度のステンレス細線の周辺に高勾配磁場を作り出す。
A system principle diagram of this technique is shown in FIG. In an experiment based on this system, a desktop type
このような装置において、所望の抗体のほか種々のタンパク質や他の物質が混入した溶液中に更に前記磁気ビーズを混合し、磁気ビーズに所望の抗体を結合した状態となっている溶液３６を、管３３の上方から注ぎ込む。この溶液３６は前記のような高勾配磁場を周囲に作り出すステンレスウール３４からなるフィルター３５内を通過するとき、磁気ビーズは超伝導電磁石によって得られる高磁界により磁気を帯びたビーズとなり、且つ４Ｔ程度の高磁界により局所的に磁化した磁性細線であるフィルター３５の周りに作られた非常に大きな磁場勾配によって所望の抗体を結合した磁気ビーズをフィルター３５に吸着する。
In such an apparatus, the magnetic beads are further mixed in a solution in which various proteins and other substances are mixed in addition to the desired antibody, and the solution 36 in a state where the desired antibody is bound to the magnetic beads, Pour from above the
その後磁場を４Ｔから０Ｔに下げた後、磁性微粒子を含まないエタノールを前記と同様にフィルター３５に流し、それを更に濾紙で濾過して、濾紙上に磁性微粒子を捕捉することによって分離する。このように、固定したい目的物質を含む原液に磁性ナノビーズを混合し、この管に流すだけで、大容量の溶液から短時間に高効率で微量含有の貴重な目的物質を捕獲・分離できるようになった。
Thereafter, after the magnetic field is lowered from 4T to 0T, ethanol containing no magnetic fine particles is passed through the
上記のような装置を用いて実際に免疫グロブリンを分離・精製する実験を行いその性能を確かめた。免疫グロフリンは糖を２％含むポリペプチドで、約１０〜１５ｎｍのＹ字形の分子で、図４（ａ）に示すようにＹ端部のＬ鎖（Light Chain)先端には抗体に特異的に結合する部位をもつ。したがってこの部位と特異的に結合する物質を磁性ナノ粒子の表面に付けることにより、免疫グロブリンの連続・高速の分離・精製が可能となる。このときに用いる表面活性剤は、既に酸化鉄等に対して開発されており、直径数ミクロンの磁性マイクロビーズは市販されている。 An experiment was conducted to actually separate and purify immunoglobulin using the apparatus as described above, and its performance was confirmed. Immunoglobulin is a polypeptide containing 2% sugar and is a Y-shaped molecule of about 10 to 15 nm. As shown in FIG. 4 (a), the end of the L chain (Light Chain) at the Y end is specific to the antibody. Has a binding site. Therefore, by attaching a substance that specifically binds to this site to the surface of the magnetic nanoparticle, immunoglobulin can be separated and purified at high speed continuously. The surfactant used at this time has already been developed for iron oxide and the like, and magnetic microbeads having a diameter of several microns are commercially available.
実験においては約１５０ｃｃのエタノールに、平均粒径約１００ｎｍのナノ磁性微粒子を０．０５ｇ加え、良く攪拌した後、強加工されて磁性を持った磁気分離用のＳＵＳ３０４細線フィルターとほぼ同一のフィルターで濾過した。次に濾過した磁性微粒子を含むエタノールを、４Ｔの磁場中にセットしたフィルターの中を約７〜２５ｃｃ／ｍｉｎの速度で流し、それを更に濾紙で濾過して磁性微粒子を捕捉した。その結果は、濾過後の液体について微粒子は検出できなかったのに対して、磁場をゼロにして同様の処理を行ったところ、０．０４ｇの微粒子が検出された。このことからこのシステムは極めて効率よく平均粒径約１００ｎｍの磁性微粒子を捕捉できることがわかった。このことから、医療用タンパク質のうち特に血清中に微量存在する免疫グロブリンの分離／精製に超伝導マグネットを用いた高勾配磁気分離システムが有効であることを確認した。 In the experiment, 0.05 g of nano-magnetic fine particles with an average particle size of about 100 nm were added to about 150 cc of ethanol, and after stirring well, the filter was almost the same as a SUS304 fine wire filter for magnetic separation that was strongly processed and had magnetism. Filtered. Next, ethanol containing filtered magnetic fine particles was passed through a filter set in a magnetic field of 4T at a speed of about 7 to 25 cc / min, and was further filtered with a filter paper to capture the magnetic fine particles. As a result, fine particles could not be detected in the filtered liquid, but 0.04 g of fine particles were detected when the same treatment was performed with the magnetic field set to zero. This indicates that this system can trap magnetic fine particles having an average particle diameter of about 100 nm very efficiently. From this, it was confirmed that a high gradient magnetic separation system using a superconducting magnet is effective for the separation / purification of immunoglobulins present in trace amounts in serum among medical proteins.
上記のような技術の開発によって、磁性ナノビーズの表面に抗体と特異的に結合するアフィ二ティー物質（リガンド）を付けることにより、抗体の連続・大量・高速の分離・精製技術が完成したものであり、現在はアフィ二ティー物質として、主にタンパク質系リガンドのプロテインAが用いられている。 Through the development of the technology described above, continuous, large-volume, high-speed separation / purification technology for antibodies has been completed by attaching affinity substances (ligands) that specifically bind to antibodies to the surface of magnetic nanobeads. Yes, at present, protein A, a protein ligand, is mainly used as an affinity substance.
なお、粒子状物質の表面に特定の抗体に特異的結合性を有する性状を持たせ、液体中から所望の抗体等を分離する技術は特開２００２−１１６３号公報（特許文献１）に開示されている。 A technique for separating the desired antibody from the liquid by giving the surface of the particulate material a property having specific binding property to a specific antibody is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-1163 (Patent Document 1). ing.
前記のように、本発明者等が提案している図３に示すような超電導マグネットを利用した高勾配磁気分離システムの採用により、磁性ナノビーズの表面に抗体と特異的に結合するアフィ二ティー物質を付けることによって、抗体の連続・大量・高速の分離・精製技術が開発されたものであるが、ここではアフィ二ティー物質として、主にタンパク質系リガンドのプロテインＡが用いられている。 As described above, the affinity substance that specifically binds to the antibody on the surface of the magnetic nanobead by adopting the high gradient magnetic separation system using the superconducting magnet as shown in FIG. 3 proposed by the present inventors. In this case, a continuous, large-volume, high-speed separation / purification technique for antibodies has been developed. In this case, protein A, a protein-based ligand, is mainly used as an affinity substance.
しかし、このプロテインＡの価格は、１００万円／ｋｇ程度と、非常に高価で、しかも、抗体のIgMやIgAには結合せず、IgGのFc部とのみ特異的に強く結合するという特性を備えている。 However, the price of this protein A is about 1 million yen / kg, which is very expensive, and it does not bind to IgM or IgA of the antibody, and it binds specifically and strongly only to the Fc part of IgG. I have.
一方、従来より抗体を捕捉・分離する手法としてアフィニティー・クロマトグラフィー法を用いて行われており、その際にマンノシル・エリスリトールリピッド（Mannosyl Erythritol Lipid ：MEL）を用いて抗体を捕捉・分離することが行われている。このアフィニティー・クロマトグラフィー法を用いるときには、分離用のカラムの表面にマンノシル・エリスリトールリピッドを固定して、免疫グロブリンG（IgG）を分離しようとすると、その分離効率はプロテインＡの約７分の１に低下してしまう。これはカラム担体にマンノシル・エリスリトールリピッドを固定しても、分離効率はカラム担体の表面の細孔などの物性に依存するため低下すると考えられる。 On the other hand, affinity chromatography has been used as a conventional method for capturing and separating antibodies, in which case it is possible to capture and separate antibodies using Mannosyl Erythritol Lipid (MEL). Has been done. When this affinity chromatography method is used, when an attempt is made to separate immunoglobulin G (IgG) by fixing mannosyl erythritol lipid to the surface of the separation column, the separation efficiency is about 1/7 that of protein A. It will drop to. It is considered that even when mannosyl erythritol lipid is fixed to the column carrier, the separation efficiency depends on the physical properties such as the pores on the surface of the column carrier and thus decreases.
したがって本発明は、従来、アフィニティー・クロマトグラフィー法において、比較的安価なマンノシル・エリスリトールリピッド（MEL）を用いて抗体を捕捉・分離する際の分離効率の低下を解消し、また、本発明者等が提案している、極めて高効率に抗体を捕捉・分離することができる超電導マグネットを利用した高勾配磁気分離システムにおいて、磁性ナノビーズの表面に付けるアフィ二ティー物質として用いているプロテインＡが極めて高価であるという両問題点を解決することができる技術の提供を主たる目的とする。 Therefore, the present invention eliminates a decrease in separation efficiency when an antibody is captured and separated using a relatively inexpensive mannosyl erythritol lipid (MEL) in the affinity chromatography method. Is a high-gradient magnetic separation system using a superconducting magnet that can capture and separate antibodies with extremely high efficiency, and protein A used as an affinity substance attached to the surface of magnetic nanobeads is extremely expensive. The main purpose is to provide a technology that can solve both problems.
本発明は、本発明者等が提案している、極めて高効率に抗体を捕捉・分離することができる超電導マグネットを利用した高勾配磁気分離システムにおいて、磁性ナノビーズの表面に付けるアフィ二ティー物質として、極めて安価なマンノシル・エリスリトールリピッド（MEL）を用いことにより、前記両問題点を一挙に解決したものである。 The present invention proposes as an affinity substance to be attached to the surface of magnetic nanobeads in a high gradient magnetic separation system using a superconducting magnet capable of capturing and separating antibodies with extremely high efficiency proposed by the present inventors. Both of these problems are solved at once by using extremely inexpensive mannosyl erythritol lipid (MEL).
即ち、本発明に係るアフィニティー磁気ビーズは、前記課題を解決するため、表面に抗体と結合するアフィニティー物質を付けた磁性材からなるアフィニティー磁気ビーズにおいて、前記アフィニティー物質としてマンノシル・エリスリトールリピッドを用いたことを特徴とする。 That is, the affinity magnetic bead according to the present invention uses a mannosyl erythritol lipid as the affinity substance in the affinity magnetic bead made of a magnetic material with an affinity substance that binds to an antibody on the surface, in order to solve the above problems. It is characterized by.
また、本発明に係る他のアフィニティー磁気ビーズは、超伝導コイルを用いて発生させた磁界内に磁性フィルターを設け、該磁性フィルターにより、抗体と結合するアフィニティー物質を表面に付けた磁気ビーズを吸着して捕捉し、磁界を消磁することにより捕捉した磁気ビーズをフィルターから分離する高勾配磁気分離装置に用いるアフィニティー磁気ビーズにおいて、前記磁気ビーズ表面のアフィニティー物質としてマンノシル・エリスリトールリピッドを用いたことを特徴とする。 In addition, another affinity magnetic bead according to the present invention is provided with a magnetic filter in a magnetic field generated by using a superconducting coil, and adsorbs the magnetic bead with an affinity substance that binds to an antibody on the surface by the magnetic filter. In the affinity magnetic beads used in the high-gradient magnetic separation device that separates the captured magnetic beads from the filter by capturing and demagnetizing the magnetic field, mannosyl erythritol lipid is used as the affinity substance on the surface of the magnetic beads. And
また、本発明に係る他のアフィニティー磁気ビーズは、前記アフィニティー磁気ビーズを、前記超伝導コイルＬの電源回路切断時に、該超伝導コイルＬに対して抵抗Ｒ及びコンデンサＣを直列接続し、該超伝導コイルに磁場を発生させた状態から、該ＬＲＣの直列共振回路を形成して交流磁場を発生させ、該交流磁場によりコイルを減衰させて消磁する消磁回路を備えた高勾配磁気分離装置に用いることを特徴とする。 Another affinity magnetic bead according to the present invention is the above-described affinity magnetic bead, wherein when the power supply circuit of the superconducting coil L is cut off, a resistor R and a capacitor C are connected in series to the superconducting coil L. From a state in which a magnetic field is generated in a conductive coil, the LRC series resonance circuit is formed to generate an alternating magnetic field, and the high gradient magnetic separation apparatus having a demagnetizing circuit that demagnetizes the coil by the alternating magnetic field is used. It is characterized by that.
本発明は、従来、アフィニティー・クロマトグラフィー法において、比較的安価なマンノシル・エリスリトールリピッド（MEL）を用いて抗体を捕捉・分離する際の分離効率の低下を解消し、また、本発明者等が提案している、極めて高効率に抗体を捕捉・分離することができる超電導マグネットを利用した高勾配磁気分離システムにおいて、磁性ナノビーズの表面に付けるアフィ二ティー物質として用いているプロテインＡが極めて高価であるという両問題点を一挙に解決することができる。 The present invention eliminates a decrease in separation efficiency when an antibody is captured and separated using a relatively inexpensive mannosyl erythritol lipid (MEL) in a conventional affinity chromatography method. In the proposed high gradient magnetic separation system using a superconducting magnet that can capture and separate antibodies with extremely high efficiency, protein A used as an affinity substance to be attached to the surface of magnetic nanobeads is extremely expensive. Both problems can be solved at once.
本発明で用いる超電導マグネットを利用した高勾配磁気分離システムの原理は前記図３に示すようなものであるが、この原理を用いて実際に試作した装置を図１に示している。即ち、図1に示す例においては、所望の抗体のほか種々のタンパク質や他の物質が混入した溶液の入った溶液槽Ｓ１について、バルブＶ１を開くことにより攪拌槽Ｓ２内に供給可能とし、その際前記のような目的物質捕捉用の磁性ナノビーズも攪拌槽Ｓ２に供給可能としている。攪拌槽Ｓ２においては攪拌機により攪拌可能とし、これをバルブＶ２を介して管３内に流下できるようにしている。この管３にはそのほか洗浄・回収搬送液の入った洗浄・回収液槽Ｓ３から、バルブＶ３を開放することにより内部の液を供給可能としている。
The principle of the high gradient magnetic separation system using the superconducting magnet used in the present invention is as shown in FIG. 3, and FIG. 1 shows a device actually manufactured using this principle. That is, in the example shown in FIG. 1, a solution tank S1 containing a solution mixed with various proteins and other substances in addition to a desired antibody can be supplied into the stirring tank S2 by opening the valve V1, At this time, the magnetic nano beads for capturing the target substance as described above can also be supplied to the stirring tank S2. The stirring tank S2 can be stirred by a stirrer and can flow down into the
管３は超伝導磁石１の中心に配置され、内部に前記のような磁性フィルター５を内装している。この超伝導磁石１は冷凍システム４によって冷却され、且つシステム制御装置６のコイル励磁制御回路７で内部の電磁コイルの励磁が制御されるとともに、冷凍制御回路９によって冷凍システム４も関連制御される。また、超伝導磁石１のコイルは、磁性フィルターの洗浄に際して、システム制御装置に設けた図１（ｂ）に例示し、後に詳述するような消磁回路８を用いて消磁制御される。
The
管３の下部には切替弁Ｖ４を設け、超伝導磁石による磁界発生中に管３に攪拌槽Ｓ２から攪拌溶液が供給されて、高勾配磁気分離用磁性フィルター５に磁気ビーズを捕捉し、捕捉されないものは、その他回収槽Ｓ５側に流れるように切り替えが行われる。次にバルブＶ２を閉じＶ３を開けて、管３に洗浄・回収搬送液が流れて、管３および磁性フィルター５を洗浄する。次に洗浄後は、超伝導磁石を消磁し、更に消磁回路を動作させて磁気ビーズと磁性フィルターを消磁し、Ｖ４を目的物回収糟Ｓ４側に流れるように切り替え、Ｓ３から回収搬送液を流して、目的物質回収糟に磁気ビーズを回収する。システム制御装置７にはバルブ切替制御回路１１を備えており、前記のようなバルブＶ１〜Ｖ４の制御を行い、一連の作動を自動的に行うことを可能とする。
A switching valve V4 is provided at the lower part of the
前記のように磁性フィルターに捕捉されたビーズは、磁場をゼロにしても、残留磁気によりビーズ同士が互いに引き合って大きな塊となり、残留磁気が残っているフィルターに捕捉されたままで、回収され難い。そのため図１（ｂ）に示すような消磁回路を用いる。即ち図１（ｂ）に示す消磁回路においてはスイッチＳ１〜Ｓ４の４個のスイッチを用いており、図中のＬは超伝導マグネット用のコイルであって、同図（ａ）の管の内部のフィルターを磁化し、またフィルターを通過する液体中の磁気ビーズを超伝導による高勾配の磁界の中で磁化して、磁気ビーズを磁気フィルターに効率よく吸着させる作用を行っている。 As described above, even when the magnetic field is zero, the beads captured by the magnetic filter are attracted to each other by the residual magnetism to form a large lump, and are hardly recovered while being captured by the filter in which the residual magnetism remains. Therefore, a demagnetizing circuit as shown in FIG. That is, in the degaussing circuit shown in FIG. 1B, four switches S1 to S4 are used, and L in the figure is a coil for a superconducting magnet, and the inside of the tube in FIG. The magnetic beads in the liquid passing through the filter are magnetized in a high gradient magnetic field due to superconductivity, and the magnetic beads are efficiently adsorbed to the magnetic filter.
このコイルＬに対して、直流電源Ｅ、スイッチＳ１、スイッチＳ２を順に直列に接続し、これらのスイッチＳ１及びＳ２を閉じることにより、直流電源ＥからコイルＬに電流を供給し、超伝導電磁石の駆動を行い、電磁フィルターを励磁する。この状態から電磁フィルターの作用を停止してコイルを消磁し、磁気フィルター及び磁気ビーズを消磁するときには、このまま所定の電流まで超伝導マグネットを減磁する。前記の作動は、図１（ｂ）の回路状態で行うことができる。 A direct current power supply E, a switch S1, and a switch S2 are connected in series to the coil L, and by closing these switches S1 and S2, a current is supplied from the direct current power supply E to the coil L, and the superconducting electromagnet Drives and excites the electromagnetic filter. When the action of the electromagnetic filter is stopped from this state to demagnetize the coil, and the magnetic filter and the magnetic beads are demagnetized, the superconducting magnet is demagnetized to a predetermined current as it is. The above operation can be performed in the circuit state of FIG.
その後スイッチＳ３のみを閉じ、保護抵抗Ｒ0を介してコイルＬ内の電流をＬ-Ｒ0の閉回路に転流させ、次いでスイッチＳ１を開放し、超伝導コイルＬへの通電を完全に停止する。更にその後同スイッチＳ２を開くと共にスイッチＳ４を閉じる。このときＬＲＣ回路が形成されて、電源の接続なしに交流消磁回路を形成し、それによるコイル、及びその周囲の磁性フィルター及び磁気ビーズの消磁がなされる。 Thereafter, only the switch S3 is closed, the current in the coil L is commutated to the closed circuit of L-R0 via the protective resistor R0, then the switch S1 is opened, and the energization to the superconducting coil L is completely stopped. Thereafter, the switch S2 is opened and the switch S4 is closed. At this time, an LRC circuit is formed, an AC demagnetization circuit is formed without connection of a power source, and the coil, the surrounding magnetic filter and magnetic beads are degaussed thereby.
このような消磁回路において、コイルＬは超伝導マグネットが高い磁場を作り出す大きなインダクタンスをもち、且つ抵抗の小さな超伝導マグネットシステムが用いられているので、ここでは前記のように消磁用の磁場発生装置として利用して、交流消磁を行わせることができる。しかもこのような回路を予めシステム制御装置７に組み込んでおくことにより、これらのスイッチＳ１〜Ｓ４を所定のタイミングで前記の順序で開閉作動させることによって自動化が図れる。
In such a demagnetization circuit, since the coil L has a large inductance with which the superconducting magnet generates a high magnetic field and a superconducting magnet system with a small resistance is used, a magnetic field generator for demagnetization is used here as described above. Can be used for AC demagnetization. Moreover, by incorporating such a circuit in the
一般に、通常の消磁にはＬＲＣ直列回路を用いた交流消磁法が用いられており、Ｌは磁場を発生させるコイルでもあり、これに抵抗とコンデンサを直列接続し、交流電圧をかけてLRCの直列共振により交流磁場を発生させ減衰させる。しかし、コイルが常電導では、装置が大掛かりで高価なものになる。さらに、この交流消磁を行う装置を高勾配磁気分離装置に新たに組み込むことは、物理的空間的にも困難であり、また装置も大掛かりになり、費用もかさむことになる。それに対して前記のような超電導マグネットを用いた高勾配磁気分離装置には、高い磁場を作り出す、大きなインダクタンスをもち、かつ抵抗の殆ど無い超電導マグネットシステムが用いられているため、この超電導マグネットを消磁用の磁場発生装置として利用し、交流電源が不要な、交流消磁を行わせる上記のような付加回路を提案したものである。即ち、図１（ｂ）に示すような付加回路としての消磁回路を用意し、消磁に必要な残留磁場以上の磁場を超電導マグネットにより発生させた状態（直流通電状態）から、抵抗RとコンデンサＣを直列接続にスイッチ回路で切り替えることにより、ＬＲＣの直列共振を利用し、交流磁場を発生・減衰させて消磁を行うことが出来たものである。 In general, an AC demagnetization method using an LRC series circuit is used for normal demagnetization, and L is also a coil that generates a magnetic field. A resistor and a capacitor are connected in series to this, and an AC voltage is applied to the LRC series. An alternating magnetic field is generated and attenuated by resonance. However, if the coil is normal conducting, the device is large and expensive. In addition, it is difficult to physically incorporate a device for performing this AC demagnetization into a high gradient magnetic separation device in terms of physical space, and the device becomes large and expensive. On the other hand, the high-gradient magnetic separation device using the superconducting magnet as described above uses a superconducting magnet system that generates a high magnetic field, has a large inductance, and has almost no resistance. The above-described additional circuit is proposed that performs AC demagnetization and does not require an AC power supply. That is, a degaussing circuit as an additional circuit as shown in FIG. 1B is prepared, and the resistance R and the capacitor C are changed from a state in which a magnetic field higher than the residual magnetic field necessary for degaussing is generated by the superconducting magnet (DC energization state). Can be demagnetized by generating and attenuating an alternating magnetic field by utilizing the series resonance of LRC by switching to a serial connection with a switch circuit.
本発明においては、上記のような消磁回路を用いている高勾配磁気分離装置において、磁性ナノビーズの表面に付けるアフィ二ティー物質として、マンノシル・エリスリトールリピッド（Mannosyl Erythritol Lipid ：MEL）を用いたものである。なお、その化学構造を図２に示す。 In the present invention, in the high gradient magnetic separation apparatus using the demagnetization circuit as described above, Mannosyl Erythritol Lipid (MEL) is used as an affinity substance attached to the surface of the magnetic nanobead. is there. The chemical structure is shown in FIG.
一般に、微生物によって菌体外に生産される両親媒性脂質であるバイオサーファクタント（BS）は、これまで十数種類生産が報告されている。代表的なものとして、１）糖型、２）アミノ酸型、３）有機酸型、４）高分子型などがある。一部のＢＳは、既に食洗機用洗剤（ソホロリピッド）、化粧品素材（サーファクチン）等として実用化されている。ＢＳは、優れた界面活性と生体・環境適合性を併せ持つため、新素材・材料として注目されている。 In general, the production of dozens of biosurfactants (BS), which are amphipathic lipids produced outside the cells by microorganisms, has been reported. Typical examples include 1) sugar type, 2) amino acid type, 3) organic acid type, and 4) polymer type. Some BSs have already been put into practical use as detergents for dishwashers (Sophorolipid), cosmetic materials (Surfactin) and the like. BS is attracting attention as a new material and material because it has both excellent surface activity and biocompatibility.
特に、酵母によって生産されるマンノシル-エリスリトール-リピッド（MEL）は、微生物生産性が高く、特に抗微生物活性に加え、ヒト白血病細胞やメラノーマ細胞等に対して抗腫瘍・分化誘導活性を示す。また、抗体やレクチン等に対して特異的に結合する（結合定数：106 M-1）。特にIgG、IgM、IgAに対しては、既存リガンドに比べて優れた結合特性を示すため、安価かつ高機能なリガンドとして用いることができる。即ち、このマンノシル・エリスリトールリピッドは図３（ｂ）に示すような抗体のFab部と特異的に結合するためIgMやIgAも分離出来、またワクチンなどに多用されるニワトリの抗体であるIgYとも結合するという特徴を持ち、表面プラズモン共鳴（SPR）や原子間力顕微鏡（AFM）などで調べると、プロテインAに比べて約4倍の親和性を示すとされ、プロテインAでは得られない高い有効性がある。 In particular, mannosyl-erythritol-lipid (MEL) produced by yeast has high microbial productivity and exhibits antitumor / differentiation-inducing activity against human leukemia cells, melanoma cells, etc. in addition to antimicrobial activity. In addition, it specifically binds to antibodies, lectins and the like (binding constant: 106 M-1). In particular, IgG, IgM, and IgA can be used as inexpensive and highly functional ligands because they exhibit binding properties superior to those of existing ligands. That is, since this mannosyl erythritol lipid specifically binds to the Fab part of the antibody as shown in FIG. 3 (b), IgM and IgA can be separated, and also binds to IgY, a chicken antibody frequently used in vaccines and the like. It is said that it has about four times the affinity compared to protein A when examined with surface plasmon resonance (SPR) or atomic force microscope (AFM), and it has high effectiveness that cannot be obtained with protein A. There is.
なお、マンノシル-エリスリトール-リピッドは上記のような特性の他、MELを含有するリポソームは、DNAに対して優れた結合・保護特性を示し、培養細胞への遺伝子導入において、非常に高い効率を示す。MELがリポソームと細胞膜との融合を誘発し、DNA導入を促進することが判っており、新しいタイプのリポフェクション手法になり得るという特性を備えている。更に、低濃度から大きな界面活性を示し、自己組織化によって様々な液晶構造（スポンジ相、キュービック相、ラメラ相）を形成する。また、液晶を形成する濃度・温度範囲が、合成界面活性剤に比べて非常に大きく、また、セラミドと同様の肌荒れ改善効果や保湿効果を示すため、スキンケア用の化粧・医薬品への応用が可能である、等の特性も備えた物質である。 In addition to the properties described above, mannosyl-erythritol-lipid has MEL-containing liposomes that exhibit excellent binding and protection properties for DNA, and very high efficiency in gene transfer into cultured cells. . MEL has been shown to induce fusion between liposomes and cell membranes and promote DNA transfer, and can be a new type of lipofection technique. Furthermore, it exhibits a large surface activity from a low concentration and forms various liquid crystal structures (sponge phase, cubic phase, lamellar phase) by self-organization. In addition, the concentration and temperature range for forming liquid crystals is much larger than that of synthetic surfactants, and the skin roughening and moisturizing effects are similar to those of ceramide, so it can be applied to skincare cosmetics and pharmaceuticals. It is a substance that also has characteristics such as
本発明においては、磁性ナノビーズの表面に付けるアフィ二ティー物質として、上記のような特性を備え、各種の用途に広く用いられて、価格が数千円〜数万円/ｋｇ程度と非常に安価であり、大豆油から作られるマンノシル・エリスリトールリピッド（MEL）を用い、その欠点である分離効率がプロテインＡの約７分の１であるという問題を、超電導により高勾配磁場を形成した管の中の磁性フィルターを通過させて磁気ビーズを捕捉すると共に、捕捉した磁気ビーズを簡単な構成で効率的に消磁可能な前記の消磁技術を用いて効率良く磁気ビーズを回収することができるようになり、全体として極めて効率良く抗体を捕捉・分離することができる。 In the present invention, the affinity substance attached to the surface of the magnetic nanobead has the above-mentioned characteristics and is widely used for various applications, and the price is very low, about several thousand yen to several tens of thousands yen / kg. The problem of using mannosyl erythritol lipid (MEL) made from soybean oil, the separation efficiency of which is about one-seventh that of protein A, is as follows. The magnetic beads can be captured by passing through the magnetic filter, and the magnetic beads can be efficiently recovered using the demagnetization technology that can efficiently demagnetize the captured magnetic beads with a simple configuration. As a whole, antibodies can be captured and separated very efficiently.
１ 超伝導磁石
２ 中心部分
３ 管
４ 冷凍システム
５ 高勾配磁気分離用磁性フィルター
６ システム制御装置
７ コイル励磁制御回路
８ 消磁回路
９ 冷凍制御回路
１０ バルブ切替制御回路
1
Claims (3)
前記アフィニティー物質としてマンノシル・エリスリトールリピッドを用いたことを特徴とするアフィニティー磁気ビーズ。 In affinity magnetic beads consisting of a magnetic material with an affinity substance that binds to antibodies on the surface,
An affinity magnetic bead characterized in that mannosyl erythritol lipid is used as the affinity substance.
前記磁気ビーズ表面のアフィニティー物質としてマンノシル・エリスリトールリピッドを用いたことを特徴とするアフィニティー磁気ビーズ。 A magnetic filter is provided in a magnetic field generated by using a superconducting coil, and the magnetic filter adsorbs and captures a magnetic bead having an affinity substance that binds to an antibody on the surface, and demagnetizes the magnetic field. In affinity magnetic beads used in high gradient magnetic separators that separate magnetic beads from filters,
An affinity magnetic bead characterized in that mannosyl erythritol lipid is used as the affinity substance on the surface of the magnetic bead.
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|---|---|---|---|---|
| CN103450328A (en) * | 2012-09-20 | 2013-12-18 | 海狸纳米科技（苏州）有限公司 | Method for purifying antibody by using high-density protein A coated magnetic beads |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002001163A (en) * | 2000-06-21 | 2002-01-08 | Neetec:Kk | Magnetic separation device and separation method for fluid |
| JP2002357594A (en) * | 2001-03-28 | 2002-12-13 | Olympus Optical Co Ltd | Device and method for identifying magnetic particles |
| JP2005140501A (en) * | 2003-08-01 | 2005-06-02 | Kenichi Suzuki | Separating/purifying device and separating/purifying method for biological constituent substance, and separated/purified substance |
| JP2005241547A (en) * | 2004-02-27 | 2005-09-08 | Sekisui Chem Co Ltd | Magnetic substance-including particle, and particle for immunological measurement |
| JP2006219455A (en) * | 2005-02-14 | 2006-08-24 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Method for separation or concentration of protein in high efficiency |
| JP2008127409A (en) * | 2006-11-17 | 2008-06-05 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Polymer bonded with mannosylerythritol lipid, method for producing the same and analyzing instrument using the same |
| JP2008215817A (en) * | 2007-02-28 | 2008-09-18 | Jsr Corp | Protein immobilized magnetic particle and method of manufacturing the same |
-
2009
- 2009-03-30 JP JP2009081391A patent/JP2010227907A/en active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002001163A (en) * | 2000-06-21 | 2002-01-08 | Neetec:Kk | Magnetic separation device and separation method for fluid |
| JP2002357594A (en) * | 2001-03-28 | 2002-12-13 | Olympus Optical Co Ltd | Device and method for identifying magnetic particles |
| JP2005140501A (en) * | 2003-08-01 | 2005-06-02 | Kenichi Suzuki | Separating/purifying device and separating/purifying method for biological constituent substance, and separated/purified substance |
| JP2005241547A (en) * | 2004-02-27 | 2005-09-08 | Sekisui Chem Co Ltd | Magnetic substance-including particle, and particle for immunological measurement |
| JP2006219455A (en) * | 2005-02-14 | 2006-08-24 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Method for separation or concentration of protein in high efficiency |
| JP2008127409A (en) * | 2006-11-17 | 2008-06-05 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Polymer bonded with mannosylerythritol lipid, method for producing the same and analyzing instrument using the same |
| JP2008215817A (en) * | 2007-02-28 | 2008-09-18 | Jsr Corp | Protein immobilized magnetic particle and method of manufacturing the same |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103450328A (en) * | 2012-09-20 | 2013-12-18 | 海狸纳米科技（苏州）有限公司 | Method for purifying antibody by using high-density protein A coated magnetic beads |
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