JP2010210308A - Substrate for microarray and microarray - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a substrate for a microarray of each kind, ensuring visualization sensitivity not achieved in a conventional substrate for the microarray, and also ensuring sufficient sensitivity in simple inspection even if an expensive fluorescent reagent or an expensive reader is not used. <P>SOLUTION: The substrate for the microarray is a plastic substrate used for preparing the microarray constituted by forming a specimen capturing part wherein a substance for capturing the substance originating from a living thing or the substance originating from the living thing is spotted and fixed on the predetermined range of the surface of a substrate, and by bringing a solution becoming a specimen into contact with the specimen capturing part to capture the substance originating from the living thing being a detection target or the substance having specific bonding properties with respect to the substance originating from the living thing, and to thereby determine the presence thereof by color development. The substrate is characterized in that the specimen capturing part has a rough surface coated with a polymer having the properties of a hydrophilic gel. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、生化学分野にて用いられる、DNAマイクロアレイ等のマイクロアレイに用いられるマイクロアレイ用基板に関するものである。   The present invention relates to a microarray substrate used in a microarray such as a DNA microarray used in the biochemical field.

遺伝子の発現状況や、菌やウィルスの同定等遺伝子を用いた検出や診断が生化学の分野では、日常に行なわれている。従来遺伝子の検出には、電気泳動による方法が行なわれてきたが、近年になってＤＮＡマイクロアレイにより複数の遺伝子を同時にみることが行なわれている。従来からの電気泳動による方法では、ＰＣＲによる増幅反応や電気泳動時間等検出までに時間を要し、また電気泳動の操作に煩わしさがある。
また、マイクロアレイによる遺伝子検出においては、検出に高価な蛍光試薬を使用しなければならず、また検出にマイクロアレイ専用の高価な検出機を必要とし、使用も研究分野の一部の研究機関に限られ、臨床の検査分野や、食品検査等の分野ではなかなか使用されるまでいたっていない。 Detection and diagnosis using genes such as gene expression status and identification of bacteria and viruses are routinely performed in the field of biochemistry. Conventionally, gene detection has been performed by electrophoresis, but in recent years, a plurality of genes have been simultaneously observed using a DNA microarray. In the conventional electrophoresis method, it takes time to detect amplification reaction by PCR, electrophoresis time and the like, and the operation of electrophoresis is troublesome.
In addition, in gene detection using microarrays, expensive fluorescent reagents must be used for detection, and expensive detectors dedicated to microarrays are required for detection, and their use is limited to some research institutions in the research field. However, it has not been used until recently in the field of clinical inspection and food inspection.

上記、問題を解決するために、可視による遺伝子の検出方法が、特許文献１に開示されている。本特許文献に記載されている方法は、ＬＡＭＰ法により遺伝子の増幅を行い、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｉなどインターカレーターを用いて可視化を行うものであるが、乾燥した状態ではＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｉの蛍光は減弱し検出は不可能である。 In order to solve the above problem, Patent Document 1 discloses a visual gene detection method. In the method described in this patent document, gene amplification is performed by the LAMP method and visualization is performed using an intercalator such as SYBRGreen I. However, in a dry state, the fluorescence of SYBRGreen I is attenuated and detection is not possible. Is possible.

特許文献２には、遺伝子の検出において、基板表面にプライマーDNA鎖を固定し、検体のDNAを鋳型としてプライマーを伸長させ、その際酵素を導入し、酵素反応により発色を行い可視化により検出を行う方法が開示されている。しかし、本方法は基板上でのDNAポリメラーゼによる伸長反応が必要である。この反応では伸長反応により酵素が多く入ることにより、ある程度の感度の確保ができるが、伸長反応を行わない、一般のハイブリダイゼーションによる遺伝子の検出や抗原抗体反応のような検出では、可視化による検出感度は低いものとなる。 In Patent Document 2, in detection of a gene, a primer DNA strand is immobilized on the surface of a substrate, a primer is extended using a sample DNA as a template, an enzyme is introduced, color is developed by an enzyme reaction, and detection is performed by visualization. A method is disclosed. However, this method requires an extension reaction with a DNA polymerase on the substrate. In this reaction, a certain amount of enzyme can be secured by the extension reaction, so that a certain degree of sensitivity can be secured. However, in the detection such as gene detection by general hybridization or antigen-antibody reaction without extension reaction, detection sensitivity by visualization is used. Is low.

特開２００４−１５４００８号公報JP 2004-154008 A 特開２００６−３２２７３９号公報JP 2006-322739 A

本発明の目的は、従来のマイクロアレイ用基板では達成できない可視化での感度を確保し、高価な蛍光試薬や高価な読み取り機を用いなくとも、簡易的な検査においては十分な感度を確保できる各種マイクロアレイ用基板を提供することにある。 The object of the present invention is to ensure sensitivity in visualization that cannot be achieved with conventional microarray substrates, and various microarrays that can ensure sufficient sensitivity in simple inspections without using expensive fluorescent reagents or expensive readers. It is to provide a substrate.

発明者らは、鋭意検討の結果、マイクロアレイにおける検体捕獲部を粗面化することにより、可視化によるマイクロアレイを用いた検出において高い検出感度を得ることが出来ることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の通りである。
（１）生物由来物又を捕獲する物質又は生物由来物を基板表面の所定範囲に点着固定した検体捕獲部を形成し、検体捕獲部に検体となる溶液を接触させ、検出目的とする生物由来物又は生体由来物と特異的結合性を有する物質を捕獲してその有無を発色により判定するマイクロアレイの作製に用いるプラスチック製の基板であって、検体捕獲部表面は粗面であり、かつ親水性ゲルの性質を有するポリマーがコートされていることを特徴とするマイクロアレイ用基板。
（２）前記検体捕獲部表面の粗面が、凹凸の高低差で０．５〜５μｍ、凹凸の間隔が０．５〜５μｍである（１）記載のマイクロアレイ用基板。
（３）前記ポリマーの厚みが、１０〜１００ｎｍである（１）又は（２）記載のマイクロアレイ用基板。
（４）前記ポリマーが、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、及びアルデヒド基の内、少なくとも１つの基と反応結合性を有する（１）〜（３）いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
（５）前記ポリマーが、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含むポリマーである（１）〜（４）いずれか記載のマイクロアレイ用基板
（６）前記ポリマーが、ポリエチレングリコール残基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含むポリマーである（１）〜（４）いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
（７）発色の方法が、発色基質を含有する溶液を添加し酵素の反応により発色基質を発色させものである（１）〜（６）いずれか記載のマイクロアレイ用基板。
（８）前記酵素がペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼである（７）記載のマイクロアレイ用基板。
（９）（１）〜（８）のいずれか記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の検体捕獲部に、生体由来物又は生体由来物と親和性を有する化合物を固定化したマイクロアレイ。 As a result of intensive studies, the inventors have found that by roughening the specimen capturing part in the microarray, high detection sensitivity can be obtained in the detection using the microarray by visualization, and the present invention has been completed. It was.
That is, the present invention is as follows.
(1) A specimen capturing part in which a biological substance or a substance for capturing a biological substance or a biological substance is spot-fixed on a predetermined range of the substrate surface is formed, and a specimen solution is brought into contact with the specimen capturing part to detect the target organism. A substrate made of plastic used to produce a microarray that captures a substance having a specific binding property to a derived substance or a biological substance and determines the presence or absence of the substance by color development, and the surface of the specimen capturing part is rough and hydrophilic A microarray substrate, which is coated with a polymer having a property of a conductive gel.
(2) The microarray substrate as set forth in (1), wherein the rough surface of the specimen capturing part has a height difference of 0.5 to 5 μm and a space between the unevenness of 0.5 to 5 μm.
(3) The microarray substrate according to (1) or (2), wherein the polymer has a thickness of 10 to 100 nm.
(4) The microarray substrate according to any one of (1) to (3), wherein the polymer has a reactive binding property to at least one of an amino group, a carboxyl group, a thiol group, and an aldehyde group.
(5) The polymer is a polymer including a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid derivative group in which an electron-withdrawing substituent is bonded to a carbonyl group. 4) The microarray substrate according to any one of (6), wherein the polymer has a first unit having a polyethylene glycol residue and a second unit having a carboxylic acid derivative group in which an electron-withdrawing substituent is bonded to a carbonyl group. The microarray substrate according to any one of (1) to (4), which is a polymer comprising:
(7) The microarray substrate according to any one of (1) to (6), wherein the color development method is such that a solution containing a color development substrate is added and the color development substrate is colored by an enzyme reaction.
(8) The microarray substrate according to (7), wherein the enzyme is peroxidase or alkaline phosphatase.
(9) A microarray in which a biological material or a compound having an affinity for a biological material is immobilized on the specimen capturing portion of the plastic substrate for microarray according to any one of (1) to (8).

本発明によるマイクロアレイ用プラスチック基板により、食品検査をはじめとする検査用途に適用できる、可視化で感度良く検出が可能な身近なマイクロアレイの供給が可能となる。 The plastic substrate for microarray according to the present invention makes it possible to supply a familiar microarray that can be applied to inspection applications such as food inspection and can be detected with high sensitivity.

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明に使用するプラスチック製の基板の材質は、各種のプラスチックが適用できるが、特にポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、アクリル樹脂などの汎用性樹脂がコスト面から好適である。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Various plastics can be used as the material of the plastic substrate used in the present invention, and general-purpose resins such as polystyrene, polycarbonate, polypropylene, and acrylic resin are particularly preferable from the viewpoint of cost.

基板の全体の形状としては、特に制限はないが、従来からマイクロアレイ基板と使用されているスライドガラス形状が、反応操作等の際、従来のスライドガラス用の器具類の使用がそのまま可能となることから好適である。具体的には最大厚みは１ｍｍ程度、縦２５ｍｍ程度、横７５ｍｍ程度の寸法である。 The overall shape of the substrate is not particularly limited, but the conventional slide glass shape used with the microarray substrate can be used as is for conventional slide glass instruments during reaction operations. To preferred. Specifically, the maximum thickness is about 1 mm, about 25 mm in length, and about 75 mm in width.

基板表面には、基板表面全体或いは一部に検体捕獲部が設けられる。検体捕獲部表面は粗面となっており、粗面の度合いが、凹凸の高低差で０．５〜５μｍ、凹凸の間隔が０．５〜５μｍであることが好適である。下限値未満では、可視化検出におけるシグナルの感度向上への効果が得にくく、上限値を超えると、ＤＮＡ等の検体捕獲物を点着する際、スポット形状がにじむなどの不都合が生じる恐れがある。
プラスチック基板表面の検体捕獲部を粗面にする方法としては、成形する金型作製時に金型のキャビティの検体捕獲部分を化学的処理あるいはサンドブラスト処理により表面を粗して粗面化し、該金型でプラスチックを射出成形することで粗面をもった基板が得られる。又は、通常の金型で成形したプラスチック基板にサンドブラスト法等により成形品表面を粗して粗面化することも可能である。 On the substrate surface, a specimen capturing part is provided on the entire substrate surface or a part thereof. It is preferable that the surface of the specimen capturing portion is a rough surface, and the degree of the rough surface is 0.5 to 5 μm in terms of the height difference of the unevenness, and the interval between the unevenness is 0.5 to 5 μm. If it is less than the lower limit, it is difficult to obtain the effect of improving the sensitivity of the signal in the visualization detection.
As a method for roughening the specimen capturing part on the surface of the plastic substrate, the specimen capturing part of the cavity of the mold is roughened by chemical treatment or sand blasting to prepare the mold to be molded, and the mold is roughened. A substrate having a rough surface can be obtained by injection molding plastic. Alternatively, it is possible to roughen the surface of a molded product by sandblasting or the like on a plastic substrate molded with a normal mold.

、
検体捕獲部表面は親水性を有することが、検体の水溶液を検体捕獲部上に供給する上で必要であり、発色による可視化反応においては、親水性ゲルの性質を有するポリマーをコートすることが有効である。親水性ゲルの性質を有するポリマーとは、該ポリマーをキャスティングなとにより製膜した場合、その膜が含水性や膨潤性を有し、さらに物質透過性を有するポリマーのことをいう。この親水性ゲルの性質を有するポリマーにより、発色した基質が、スポットの周りのゲル内にとどまり、発色したスポットがより鮮明に可視化認識を可能にすることができる。 ,
The surface of the specimen capture part must be hydrophilic in order to supply an aqueous solution of the specimen onto the specimen capture part, and it is effective to coat a polymer that has the properties of a hydrophilic gel in the visualization reaction by color development. It is. The polymer having the property of a hydrophilic gel refers to a polymer having a water permeability and a swelling property when the polymer is formed into a film by casting, and further having a material permeability. By the polymer having the property of this hydrophilic gel, the colored substrate stays in the gel around the spot, and the colored spot can be visualized and recognized more clearly.

さらに親水性ゲルの性質を有するポリマーが、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、及びアルデヒド基の内、少なくとも１つと反応結合性を有することが好ましい。これにより、検体捕獲物質を共有結合させることが可能となり、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸鎖、タンパク質、ペプチド、抗体や酵素、糖鎖などの生体由来物や、種々の合成薬物などの検体捕獲物を確実にポリマー上に固定化することが可能となる。 Furthermore, it is preferable that the polymer having the property of hydrophilic gel has a reactive bonding property with at least one of an amino group, a carboxyl group, a thiol group, and an aldehyde group. This makes it possible to covalently bind a sample capture substance, such as nucleic acid chains such as DNA and RNA, proteins, peptides, antibodies, enzymes, sugar chains, and other biologically derived substances, and various sample captures such as synthetic drugs. The immobilization on the polymer can be ensured.

ポリマーとしては、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含むポリマー、又はポリエチレングリコール残基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含むポリマーであることが好ましい。
このようなポリマーの例としては、ＭＰＣ（メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）等の親水性基を有する化合物と活性エステル基を有する化合物との共重合ポリマーなどが挙げられる。 Examples of the polymer include a polymer containing a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid derivative group in which an electron-withdrawing substituent is bonded to a carbonyl group, or a first unit having a polyethylene glycol residue. A polymer containing a unit and a second unit having a carboxylic acid derivative group in which an electron-withdrawing substituent is bonded to a carbonyl group is preferable.
Examples of such a polymer include a copolymer of a compound having a hydrophilic group such as MPC (methacryloyloxyethyl phosphorylcholine) and a compound having an active ester group.

また、これらのポリマーは、ＤＮＡやタンパク質などの生体由来物の非特異的な吸着が少なく、検体捕獲部のコートに用いるポリマーとして好適である。検体捕獲部平面の親水性ゲルの性質を有するポリマーの厚みは、１０ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましい。下限値未満では、ポリマーをコートする効果が認められなくり、上限値を超えると、コート厚みの制御が難しく、コート厚みのバラつきが大きくなり、発色による可視化シグナルのばらつきが大きくなる恐れがある。また、ゲル内の洗浄が不十分となり、検出の際の非特異シグナルの上昇につながることになり、感度を下げる恐れがある。 In addition, these polymers are suitable as polymers used for coating the specimen capturing part because they have less non-specific adsorption of biological substances such as DNA and proteins. The thickness of the polymer having the property of hydrophilic gel on the plane of the specimen capturing part is preferably 10 nm to 100 nm. If it is less than the lower limit, the effect of coating the polymer is not recognized, and if it exceeds the upper limit, it is difficult to control the coat thickness, the coating thickness varies greatly, and there is a possibility that the variation in the visualization signal due to color development will increase. In addition, washing in the gel becomes insufficient, leading to an increase in non-specific signal at the time of detection, which may reduce the sensitivity.

マイクロアレイ用プラスチック基板の検体捕獲部表面に、生体由来物又は生体由来物と親和性を有する化合物を固定化してマイクロアレイを作製する。検体捕獲部に検体となる溶液を接触させ、検出目的とする生物由来物又は生体由来物と特異的結合性を有する物質を捕獲してその有無を発色により判定することができる。   A microarray is prepared by immobilizing a biological substance or a compound having an affinity for the biological substance on the surface of the specimen capturing part of the plastic substrate for microarray. A solution serving as a sample is brought into contact with the sample capturing unit, and a biological substance to be detected or a substance having a specific binding property with the biological substance can be captured and the presence or absence can be determined by color development.

検体捕獲部における、検出対象物の捕獲の状況は、検出対象物に酵素標識を施しておき、この酵素の発色基質を含有する溶液を添加し、酵素の反応により発色基質を発色させる。
酵素としては、生物化学の分野で検出に広く使用されている、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼを用いることができる。発色基質としては、ウェスタンブロット等において、使用されるOPDやBCIP/NBTを用いることが出来る。 In the state of capturing the detection target in the sample capturing unit, an enzyme label is applied to the detection target, a solution containing a chromogenic substrate for this enzyme is added, and the chromogenic substrate is colored by the reaction of the enzyme.
As the enzyme, peroxidase or alkaline phosphatase widely used for detection in the field of biochemistry can be used. As the chromogenic substrate, OPD and BCIP / NBT used in Western blotting and the like can be used.

《実施例１》
飽和環状ポリオレフィン樹脂を使用して射出成形により、縦２５ｍｍ、横７５ｍｍ、厚さ１ｍｍのスライドガラス形状の基板の成形品を得た。使用した金型面の一部にはシボ加工（粗面化）が施されており、基板表面の一部にはシボ加工（粗面化）が形成されている。シボ加工部の凹凸の度合いは顕微鏡による測定を行ったところ、凹凸の高低差及び凹凸の間隔は、１．２〜１．７μｍであった。このシボ加工部分に１５ｍｍ×１５ｍｍの大きさで検体捕獲部を設定し、この設定した検体捕獲部に、次のように表面にポリマーコート処理を施した。まず、２-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン‐ブチルメタクリレート‐ｐ‐ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（poly(MPC-co-BMA-coNPMA)(PMBN)溶液を調製し、本溶液を検体捕獲部にコートを行い、乾燥後、純水にて洗浄を行った。乾燥状態でのポリマーコートの厚みは、エリプソメーターにより測定を行ったところ、１５〜４０nmであった。以上のように作製したマイクロアレイ用基板を、発色による可視化検出評価に供した。 Example 1
A molded product of a slide glass substrate having a length of 25 mm, a width of 75 mm, and a thickness of 1 mm was obtained by injection molding using a saturated cyclic polyolefin resin. A part of the used mold surface is subjected to graining (roughening), and a part of the substrate surface is subjected to graining (roughening). When the degree of unevenness of the textured portion was measured with a microscope, the height difference of the unevenness and the interval between the unevenness were 1.2 to 1.7 μm. A sample capturing portion having a size of 15 mm × 15 mm was set in the textured portion, and the surface of the set sample capturing portion was subjected to polymer coating treatment as follows. First, prepare 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine-butyl methacrylate-p-nitrophenyloxycarbonylpolyethylene glycol methacrylate copolymer (poly (MPC-co-BMA-coNPMA) (PMBN) solution, and use this solution in the sample trap. After coating, drying and washing with pure water, the thickness of the polymer coat in the dry state was 15 to 40 nm as measured by an ellipsometer. The substrate was subjected to visualization detection evaluation by color development.

《比較例１》
実施例1と同じ射出成形基板の平滑平面部分に１５ｍｍ×１５ｍｍの検体捕獲部を設定し、上記PMBN溶液によりコートを行い、洗浄、乾燥を行い、マイクロアレイ用基板を作製し、発色による可視化検出評価に供した。 << Comparative Example 1 >>
A sample capture unit of 15 mm x 15 mm is set on the smooth flat part of the same injection molded substrate as in Example 1, coated with the above PMBN solution, washed and dried to produce a microarray substrate, and visualization detection evaluation by color development It was used for.

《比較例２》
実施例1と同じ射出成形基板に、低温酸素プラズマ処理により表面に親水化処理を施した。次に、アミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に５重量％の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後、基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後、基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをＰＢＳ（−）中に２重量％の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行なった基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後、基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、表面にアルデヒド基を有するアルデヒド基板を得た。この基板の粗面部分に１５ｍｍ×１５ｍｍの検体捕獲部を設定し、発色による可視化検出評価に供した。 << Comparative Example 2 >>
The same injection-molded substrate as in Example 1 was subjected to a hydrophilic treatment on the surface by a low-temperature oxygen plasma treatment. Next, a solution in which γ-aminopropyltriethoxysilane is dissolved as an aminoalkylsilane in methanol at a concentration of 5% by weight is prepared as an amino group introduction treatment solution, immersed in this solution for 2 hours, and then the substrate. Was taken out of the solution, immersed in ultrapure water and allowed to stand, and then the substrate was taken out and dried. Glutaraldehyde was dissolved in PBS (-) at a concentration of 2% by weight to prepare a glutaraldehyde solution. The substrate treated with aminoalkylsilane was immersed in the glutaraldehyde solution and allowed to stand for 4 hours. It was taken out, immersed in ultrapure water, washed and dried. As a result, an aldehyde substrate having an aldehyde group on the surface was obtained. A 15 mm × 15 mm specimen capturing portion was set on the rough surface portion of the substrate and subjected to visualization detection evaluation by color development.

《比較例３》
上記、比較例２のアルデヒド基板の平滑平面部分において１５ｍｍ×１５ｍｍの検体捕獲部を設定し、発色による可視化検出評価に供した。 << Comparative Example 3 >>
A 15 mm × 15 mm specimen capturing part was set in the smooth flat part of the aldehyde substrate of Comparative Example 2 and subjected to visualization detection evaluation by color development.

（発色による可視化検出評価用マイクロアレイの作製）
上記で作製したマイクロアレイ用基板の検体捕獲部にＤＮＡプローブを固定した。５‘末端がアミノ基で修飾された、配列ＴＧＴＡＡＡＣＴＣＣＣＧＧＡＴＴＧＣＧＣＴＣＣＣＴ（配列番号１）のＤＮＡプローブ（２５塩基）を０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのＤＮＡプローブ溶液を調製した。この溶液をピン方式スポッター（日立ソフトウェアエンジニアリング製ＭａｒｋｓＩ）を用いて、５００μｍ径のクロスカットピンで、それぞれの基板の検体捕獲部にアレイヤーによりスポットし固定化した。検体捕獲部に３０スポット固定化をおこない、ＤＮＡプローブの固定化の後、ブロッキング処理を行い、以下評価実験に供した。 (Preparation of microarray for visualization detection evaluation by color development)
A DNA probe was fixed to the specimen capturing part of the microarray substrate prepared above. A DNA probe (25 bases) of the sequence TGTAAACTCCCGGATGTGCGCTCCCT (SEQ ID NO: 1) whose 5 ′ end was modified with an amino group was dissolved using 0.25 M carbonate buffer (pH 9.0) to prepare a 10 μM DNA probe solution. . Using a pin type spotter (Marks I manufactured by Hitachi Software Engineering Co., Ltd.), this solution was spotted and immobilized on the specimen capturing part of each substrate by an arrayer with a 500 μm diameter crosscut pin. 30 spots were immobilized on the specimen capturing part, and after the DNA probe was immobilized, a blocking treatment was performed.

（発色による可視化検出評価）
上記ＤＮＡプローブに相補配列を有し、５‘末端にビオチンが導入された、配列ＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＧＧＡＧＣＧＣＡＡＴＣＣＧＧＧＡＧＴＴＴＡＣＡＡＡ（配列番号２）の３５塩基のＤＮＡ断片溶液をDNA濃度０．２μMに調製した。上記にて作製した各マイクロアレイの検体捕獲部にＤＮＡ断片溶液を滴下し、ポリスチレン製のカバー（寸法：縦２５ｍｍ、横２５ｍｍ、厚さ０．７ｍｍ）を被せ、ＤＮＡプローブスポット部全体に溶液をいきわたらせ、ハイブリダイゼーションを行った。 (Visualization detection evaluation by color development)
A 35-base DNA fragment solution of the sequence AAGGCGGGAGGGAGCCAATCCGGGAGTTTTACAA (SEQ ID NO: 2) having a complementary sequence in the DNA probe and biotin introduced at the 5 ′ end was prepared at a DNA concentration of 0.2 μM. The DNA fragment solution is dropped onto the specimen capturing part of each microarray prepared above, and a polystyrene cover (dimensions: 25 mm long, 25 mm wide, 0.7 mm thick) is put over the solution, and the solution is applied to the entire DNA probe spot part. Hybridization was performed.

上記にてハイブリダイゼーションを行った後、アルカリホスファターゼ標識したアビジン溶液をＤＮＡプローブスポット部に供給し、上記と同様ポリスチレン製のカバーを被せてアビジン溶液をいきわたらせ３０分間放置した。次いでカバーを外し、洗浄用緩衝液で洗浄したのち、乾燥させ、次にＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を供給し、上記同様ポリスチレン製カバーで覆い２０分間放置し、発色反応を行った。各ＤＮＡプローブスポットにおける発色度合いを画像処理により数値化し、シグナル強度の比較をおこなった。
結果を、表１に示す。（Ｓ）は、３０スポットの数値化したシグナル強度の平均値であり、（Ｎ）は、検体捕獲部のＤＮＡプローブをスポットしていない部分３０点での強度の平均値であり、Ｓ／Ｎの比較によりシグナル感度の比較ができる。実施例１では、比較例１、２、３に比較し、格段に感度が高いことが確認された。 After hybridization as described above, an avidin solution labeled with alkaline phosphatase was supplied to the DNA probe spot, covered with a polystyrene cover in the same manner as described above, and the avidin solution was allowed to stir for 30 minutes. Next, the cover was removed, washed with a washing buffer, dried, then supplied with a BCIP / NBT solution, covered with a polystyrene cover as described above, and allowed to stand for 20 minutes to carry out a color reaction. The degree of color development at each DNA probe spot was digitized by image processing, and the signal intensity was compared.
The results are shown in Table 1. (S) is the average value of the signal intensity of 30 spots, and (N) is the average value of the intensity at 30 points of the sample capturing part where no DNA probe is spotted. The signal sensitivity can be compared by comparing. In Example 1, it was confirmed that the sensitivity was much higher than in Comparative Examples 1, 2, and 3.

本発明のマイクロアレイ用プラスチック基板を用いて作製されたマイクロアレイは、発色での可視化によるマイクロアレイを用いた簡易的な検出を可能とし、可視化検出において高い感度を実現することが可能であり、高価な測定器を用いず低コストにてマイクロアレイによる各種検査の実現を図ることが出来る。   The microarray manufactured using the plastic substrate for microarray of the present invention enables simple detection using the microarray by visualization in color development, can realize high sensitivity in visualization detection, and is expensive. Various inspections using a microarray can be achieved at low cost without using a tester.

Claims (9)

生物由来物又を捕獲する物質又は生物由来物を基板表面の所定範囲に点着固定した検体捕獲部を形成し、検体捕獲部に検体となる溶液を接触させ、検出目的とする生物由来物又は生体由来物と特異的結合性を有する物質を捕獲してその有無を発色により判定するマイクロアレイの作製に用いるプラスチック製の基板であって、検体捕獲部表面は粗面であり、かつ親水性ゲルの性質を有するポリマーがコートされていることを特徴とするマイクロアレイ用基板。 Forming a specimen capture part in which a biological substance or a substance for capturing biological material or a biological substance is spot-fixed to a predetermined range on the surface of the substrate, bringing a specimen solution into contact with the specimen capture part, A plastic substrate used to produce a microarray that captures a substance that has specific binding properties with a biological substance and determines its presence or absence by color development. The surface of the specimen capturing part is rough, and a hydrophilic gel A substrate for microarray, which is coated with a polymer having properties. 前記検体捕獲部表面の粗面が、凹凸の高低差で０．５〜５μｍ、凹凸の間隔が０．５〜５μｍである請求項１記載のマイクロアレイ用基板。 2. The microarray substrate according to claim 1, wherein the rough surface of the surface of the specimen capturing part has a height difference of 0.5 to 5 μm and a space between the unevenness of 0.5 to 5 μm. 前記ポリマーの厚みが、１０〜１００ｎｍである請求項１又は２記載のマイクロアレイ用基板。 The microarray substrate according to claim 1 or 2, wherein the polymer has a thickness of 10 to 100 nm. 前記ポリマーが、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、及びアルデヒド基の内、少なくとも１つの基と反応結合性を有する請求項１〜３いずれか記載のマイクロアレイ用基板。 The microarray substrate according to any one of claims 1 to 3, wherein the polymer has a reactive binding property to at least one of an amino group, a carboxyl group, a thiol group, and an aldehyde group. 前記ポリマーが、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含むポリマーである請求項１〜４いずれか記載のマイクロアレイ用基板 5. The polymer according to claim 1, wherein the polymer includes a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid derivative group in which an electron-withdrawing substituent is bonded to a carbonyl group. Microarray substrate 前記ポリマーが、ポリエチレングリコール残基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含むポリマーである請求項１〜４いずれか記載のマイクロアレイ用基板。 5. The polymer according to claim 1, wherein the polymer comprises a first unit having a polyethylene glycol residue and a second unit having a carboxylic acid derivative group in which an electron-withdrawing substituent is bonded to a carbonyl group. A microarray substrate as described above. 発色の方法が、発色基質を含有する溶液を添加し酵素の反応により発色基質を発色させものである請求項１〜６いずれか記載のマイクロアレイ用基板。 The microarray substrate according to any one of claims 1 to 6, wherein a coloring method is one in which a solution containing a chromogenic substrate is added and the chromogenic substrate is colored by an enzyme reaction. 前記酵素がペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼである請求項７記載のマイクロアレイ用基板。 The microarray substrate according to claim 7, wherein the enzyme is peroxidase or alkaline phosphatase. 請求項１〜８いずれか記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の検体捕獲部に、生体由来物又は生体由来物と親和性を有する化合物を固定化したマイクロアレイ。 The microarray which fix | immobilized the biological material or the compound which has affinity with a biological material in the test substance capture part of the plastic substrate for microarrays in any one of Claims 1-8.