JP2010172284A - Method for introducing intracellularly introduceable material into cell by electrospraying and device therefor - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an electrospraying method for rapidly and conveniently introducing intracellularly introduceable materials into cells: and an electrospraying device therefor. <P>SOLUTION: The intracellular introduction rate of intracellularly introduceable materials can be rapidly improved by using an electolytic solution having a high electric conductivity such as 25-200 mS/cm as an electrospraying solution. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、導入率に優れたエレクトロスプレーによる細胞内導入物質の細胞内導入方法およびそのための装置に関するもので、特に、細胞と細胞内導入物質を接触させた後、細胞内導入物質を含まないスプレー液を細胞にエレクトロスプレーすることによって、細胞内に物質を導入する際に使用する、導入率に優れたスプレー液組成およびそのための装置に関する。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質等を無傷な形で効率よく細胞内に導入できる方法およびそのための装置は、医療、農業等に関連した研究、応用分野で大変有用な技術的手段となる。   TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for introducing an intracellularly introduced substance into cells by electrospray with an excellent introduction rate and an apparatus therefor, and particularly does not contain an intracellularly introduced substance after contacting the cell and the introduced substance. The present invention relates to a spray liquid composition excellent in introduction rate and an apparatus therefor, which is used when a substance is introduced into cells by electrospraying the spray liquid onto the cells. A method and apparatus for efficiently introducing DNA, RNA, protein, and the like into a cell in an intact form are very useful technical means in research and application fields related to medicine, agriculture, and the like.

通常、エレクトロスプレー法は、スプレー用のノズルに高電圧を印加することでノズル先端に電荷を集め、その電荷が集まったノズル先端部分に液体を通すことにより、スプレー液を高圧に帯電した微細な液滴となし、対向電極に向かって高速でスプレーする方法である。
このエレクトロスプレー法を利用した遺伝子等の物質導入法の一つとして、パーティクルガン法がある。この方法は、キャピラリーの先端を通過させる際に、パーティクルを含む懸濁液に高電圧を印加し、細胞にスプレーする方法である（例えば、特許文献１参照）。また、細胞と遺伝子等の細胞内導入物質を接触させた後、細胞内導入物質を含まない液体を細胞と細胞内導入物質に向けてエレクトロスプレーすることにより、多種類の細胞内導入物質を、順次、連続的かつ簡便に細胞内に導入する方法および装置も開発されている（例えば、特許文献２、３参照）。 Usually, the electrospray method collects electric charges at the nozzle tip by applying a high voltage to the nozzle for spraying, and passes the liquid through the nozzle tip where the electric charge is collected, thereby finely charging the spray liquid to high pressure. It is a method of spraying at high speed toward the counter electrode without forming droplets.
One of methods for introducing substances such as genes using this electrospray method is a particle gun method. This method is a method in which a high voltage is applied to a suspension containing particles and the cells are sprayed when passing through the tip of a capillary (see, for example, Patent Document 1). In addition, after contacting cells and intracellular introduction substances such as genes, a variety of intracellular introduction substances can be obtained by electrospraying a liquid that does not contain intracellular introduction substances toward the cells and intracellular introduction substances. Methods and devices for sequentially and conveniently introducing cells into cells have also been developed (see, for example, Patent Documents 2 and 3).

このように、エレクトロスプレーを利用した物質の細胞内導入方法は、スプレー液に高電圧を印加しスプレーするという物理的手段で遺伝子等を細胞内に導入できるという簡便性において大変優れた特徴を有するが、反面、細胞内への導入率の面で必ずしも充分ではなく、改善の余地を残すという問題があった。   As described above, the method of introducing a substance into a cell using electrospray has a very excellent feature in that a gene or the like can be introduced into a cell by a physical means of applying a high voltage to a spray liquid and spraying. However, in terms of the rate of introduction into cells, it is not always sufficient, and there is a problem of leaving room for improvement.

エレクトロスプレーは微細噴霧する特徴のため、質量分析でのイオン化や微粒子作製に使用されることが多く、通常、使用される液体は微細化させるために表面張力を下げ帯電しやすいよう伝導度の低い溶液の使用が推奨されてきた。例えば、電気伝導度に関して、１ｍＳ／ｃｍ以上である場合、スプレーされないという報告（例えば、非特許文献１参照）がある。   Electrospray is often used for ionization and fine particle preparation in mass spectrometry due to the characteristics of fine spraying. Usually, the liquid used has low conductivity so that the surface tension can be lowered and charged easily to make it finer. The use of solutions has been recommended. For example, there is a report that the electrical conductivity is not sprayed when the electrical conductivity is 1 mS / cm or more (for example, see Non-Patent Document 1).

米国特許第６０９３５５７号明細書US Pat. No. 6,093,557 国際公開第２００７／１３２８９１パンフレットInternational Publication No. 2007/132891 Pamphlet 特開２００８−２２０２９８号公報JP 2008-220298 A

静電気学会編「静電気ハンドブック」ｐ７３９，オーム社２００６年The Electrostatics Society "Static Handbook" p739, Ohmsha 2006

本発明の課題は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質のような細胞内導入物質を高い導入率でしかも迅速かつ簡便に細胞内に導入できるエレクトロスプレー方法およびエレクトロスプレー装置を提供することにある。   An object of the present invention is to provide an electrospray method and an electrospray apparatus that can introduce intracellularly introduced substances such as DNA, RNA, and protein into cells at a high introduction rate and quickly and easily.

本発明者は、高い導入率で細胞内導入物質を細胞内に導入できるエレクトロスプレー法について鋭意検討を検討し、従来エレクトロスプレーに不適とされて来た高い電気伝導度を有する溶液がエレクトロスプレー液として有効であり、これに依って細胞内導入率が飛躍的に向上することを見出し、以下の（１）〜（５）に示す本発明を完成させるに至った。
（１）エレクトロスプレーを用いて細胞内導入物質を細胞内に導入するに際して、エレクトロスプレー液として、電気伝導度が２５ｍＳ／ｃｍから２００ｍＳ／ｃｍの電解質溶液を用いることを特徴とする、エレクトロスプレーによる細胞内導入物質の細胞内導入方法。
（２）細胞と細胞内導入物質を接触させた後、エレクトロスプレー液として、細胞内導入物質を含まない、電気伝導度が２５ｍＳ／ｃｍから２００ｍＳ／ｃｍの電解質溶液を用いる、（１）に記載のエレクトロスプレーによる細胞内導入物質の細胞内導入方法。
（３）エレクトロスプレー液として用いる電解質溶液中の電解質が、アルカリ金属から選ばれる一種以上のカチオンと、鉱酸および有機酸から選ばれる一種以上のアニオンからなる、（１）または（２）に記載のエレクトロスプレーによる細胞内導入物質の細胞内導入方法。
（４）細胞内導入物質がＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質から選ばれる一種以上の物質である、（１）記載の細胞内導入物質の細胞内導入方法。
（５）（１）から（４）の何れか一項に記載の細胞内導入物質の細胞内導入方法を用いるための、エレクトロスプレー装置。 The present inventor has studied diligently about an electrospray method that can introduce an intracellularly introduced substance into cells at a high introduction rate, and a solution having high electrical conductivity that has been conventionally unsuitable for electrospray is an electrospray solution. As a result, it has been found that the rate of introduction into cells is dramatically improved, and the present invention shown in the following (1) to (5) has been completed.
(1) When an intracellularly introduced substance is introduced into cells using electrospray, an electrospray having an electric conductivity of 25 mS / cm to 200 mS / cm is used as an electrospray liquid. Intracellular introduction method of intracellular introduction substance.
(2) The method according to (1), wherein an electrolyte solution containing no intracellular introduction substance and having an electric conductivity of 25 mS / cm to 200 mS / cm is used as the electrospray liquid after contacting the cell and the intracellular introduction substance. Intracellular introduction method of intracellular introduction substance by electrospray.
(3) The electrolyte in the electrolyte solution used as the electrospray solution is composed of one or more cations selected from alkali metals and one or more anions selected from mineral acids and organic acids, according to (1) or (2) Intracellular introduction method of intracellular introduction substance by electrospray.
(4) The method for intracellularly introducing an intracellularly introduced substance according to (1), wherein the intracellularly introduced substance is one or more substances selected from DNA, RNA, and protein.
(5) An electrospray apparatus for using the method for introducing an intracellularly introduced substance into a cell according to any one of (1) to (4).

このような高い電気電導度を有するエレクトロスプレー液を用いる方法およびそのための装置を使用することによって、細胞内導入物質を細胞内に高い導入率で導入することが可能となる。   By using a method using an electrospray liquid having such a high electric conductivity and an apparatus therefor, it is possible to introduce a substance to be introduced into cells at a high introduction rate.

エレクトロスプレー装置の図面である。It is drawing of an electrospray apparatus. 実施例で用いたエレクトロスプレー装置の図面である。It is drawing of the electrospray apparatus used in the Example. 蛍光顕微鏡写真である（ＮＩＫＯＮ製顕微鏡 ＴＥ−２０００Ｓを使用し、光源を高圧水銀ランプに蛍光フィルターＮＩＫＯＮ製ＧＦＰブロックを使用して対物レンズ１０倍で撮影した蛍光蛋白を発現している細胞の写真）。It is a fluorescence micrograph (photograph of cells expressing fluorescent protein taken using a NIKON microscope TE-2000S with a high-pressure mercury lamp as a light source and a fluorescence filter NIKON GFP block taken at 10x objective lens) .

以下本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
本発明は、エレクトロスプレーを行う際、高率に細胞内導入物質、例えば遺伝子を細胞内に導入するためのエレクトロスプレー方法および装置に関する。
本発明における細胞内導入物質としては、ＤＮＡやＲＮＡまたはそれらの類似化合物や誘導体等の核酸塩基類が挙げられる。これらはプラスミド、ファージ、ウイルス、ウイロイド、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ等の形態で提供される。核酸塩基の配列の大きさは特に断りがない。核酸塩基は二本鎖、一本鎖どちらでも構わない。また、主鎖の異なる核酸類似物や人工塩基をつけた核酸でも構わない。また、遺伝子以外の、酵素、アミロイド、プリオンといったタンパク質やペプチドを細胞内に導入する際にも使用できる。なお、糖、脂質、農薬、抗菌剤、金属イオン、蛍光標識試薬、または同位体標識試薬等の比較的低分子の物質を細胞内に導入する際にも当然ながら使用できる。 Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described in detail.
The present invention relates to an electrospray method and apparatus for introducing an intracellular introduction substance such as a gene into cells at a high rate when electrospraying is performed.
Examples of the substance to be introduced into cells in the present invention include nucleobases such as DNA, RNA, and similar compounds and derivatives thereof. These are provided in the form of a plasmid, phage, virus, viroid, oligo DNA, oligo RNA, or microRNA. There is no particular limitation on the size of the nucleobase sequence. The nucleobase may be either double-stranded or single-stranded. Further, nucleic acid analogs having different main chains or nucleic acids with artificial bases may be used. It can also be used when introducing proteins or peptides other than genes, such as enzymes, amyloid, and prions, into cells. Of course, it can also be used when introducing relatively low molecular weight substances such as sugars, lipids, agricultural chemicals, antibacterial agents, metal ions, fluorescent labeling reagents, or isotope labeling reagents into cells.

本発明の対象となる細胞、組織、生体は動物、植物、微生物等特に制限はない。なお、そのうち特に有効に使用できるのは動物細胞で、付着性細胞、浮遊性細胞ともに使用することが可能である。   There are no particular restrictions on the cells, tissues, and living bodies that are the subject of the present invention, such as animals, plants, and microorganisms. Of these, animal cells can be used particularly effectively, and both adherent cells and suspension cells can be used.

本発明のスプレー液は、細胞と細胞内導入物質を接触させた後、細胞内導入物質を含まない溶液をエレクトロスプレーすることによって、細胞内導入物質を細胞内に導入する際に非常に有効である。なお、細胞内導入物質を含むスプレー液を細胞にエレクトロスプレーする場合にも当然ながら有効である。   The spray solution of the present invention is very effective in introducing an intracellularly introduced substance into a cell by electrospraying a solution containing no intracellularly introduced substance after contacting the cell with the intracellularly introduced substance. is there. Of course, this is also effective when electrospraying cells with a spray solution containing an intracellularly introduced substance.

本発明ではエレクトロスプレーする装置の構造については特に断りがない。模式的な構造を示す（図１）。スプレー液１が、高圧電源２により高電圧に印加された高電圧印加部３で高電圧になり、次いで、絶縁性チューブ４の先端から、細胞と細胞内導入物質が入った容器５に対してエレクトロスプレーされる構造である。絶縁性チューブ４の先端から容器５は電荷が貯まらないようにグランド電位になるように接続されている。なお、スプレー液１がチューブ４内部を満たし高電圧になってもチューブ先端部分が絶縁体となっているため、チューブ４が導電性材料のみからなる場合より対象の細胞等に対する放電量は減少する。また、絶縁体からなるチューブ先端部分の穴の内径は１μｍ〜１０ｍｍ、スプレー用チューブの導電性材料からなる部分との距離は５ｍｍ〜５００ｍｍで、最短でも５ｍｍ以上隔てられた構造となっている。   In the present invention, the structure of the electrospraying device is not particularly specified. A schematic structure is shown (FIG. 1). The spray liquid 1 becomes a high voltage at the high voltage application unit 3 applied with a high voltage by the high voltage power source 2, and then from the tip of the insulating tube 4 to the container 5 containing the cells and the substance introduced into the cell. Electrosprayed structure. The container 5 is connected from the front end of the insulating tube 4 so as to have a ground potential so as not to store electric charges. In addition, even if the spray liquid 1 fills the inside of the tube 4 and becomes a high voltage, the tube tip portion is an insulator. Therefore, the discharge amount to the target cells and the like is reduced compared to the case where the tube 4 is made of only a conductive material. . Further, the inner diameter of the hole at the distal end portion of the tube made of an insulator is 1 μm to 10 mm, and the distance from the portion made of the conductive material of the spray tube is 5 mm to 500 mm, which is at least 5 mm apart.

印加する電圧は細胞との距離、チューブの大きさ、エレクトロスプレーする液体の流量や性状等から最適値を求めて決めれば良く、チューブ先端の液体と細胞との電位差で０．１ｋＶ〜１００ｋＶが好ましく、１ｋＶ〜２０ｋＶの範囲がより好ましい。チューブに印加する電圧の極性は正負どちらでも良い。また、スプレーする際には、チューブノズルを手動または自動で、細胞が存在する場所に均一に散布されるように駆動させることが望ましい。   The voltage to be applied may be determined by determining the optimum value based on the distance from the cell, the size of the tube, the flow rate and properties of the liquid to be electrosprayed, and is preferably 0.1 kV to 100 kV in terms of the potential difference between the liquid at the tip of the tube and the cell. The range of 1 kV to 20 kV is more preferable. The polarity of the voltage applied to the tube may be positive or negative. Further, when spraying, it is desirable to drive the tube nozzle manually or automatically so that the cells are uniformly sprayed on the place where the cells exist.

このような装置を使用してエレクトロスプレーする際に有効な、高い導入率が得られるスプレー液の伝導度は、２５ｍS／ｃｍ〜２００ｍS／ｃｍであり、より好ましくは４０ｍS／ｃｍ〜１５０ｍS／ｃｍである。伝導度が２００ｍS／ｃｍを上回る場合にはスプレー液の帯電量が著しく減少し、液滴化が阻まれるため安定的にエレクトロスプレーされなくなる。さらに、チューブ先端部分に絶縁性のノズルを使用してノズル自身からの放電を抑えても、内部の液体が導電性電極として働くために放電電流が増え、絶縁破壊による放電によって、細胞に対するダメージや細胞内導入物質に対する変性作用が起こりやすくなる。また、伝導度が極度に高い場合、スプレー液中の電解質濃度も高くなるため、それによる細胞障害の危険性も増す。一方、伝導度が２５ｍS／ｃｍを下回る場合は、細胞への物質導入率が現象として小さくなる。   The conductivity of the spray liquid, which is effective when electrospraying using such an apparatus and can obtain a high introduction rate, is 25 mS / cm to 200 mS / cm, more preferably 40 mS / cm to 150 mS / cm. is there. When the conductivity exceeds 200 mS / cm, the charge amount of the spray liquid is remarkably reduced, and droplet formation is prevented, so that stable electrospraying is not possible. Furthermore, even if an insulating nozzle is used at the tip of the tube and the discharge from the nozzle itself is suppressed, the internal liquid acts as a conductive electrode, so the discharge current increases, and the discharge due to dielectric breakdown causes damage to cells. Denatured action on intracellularly introduced substances is likely to occur. In addition, when the conductivity is extremely high, the electrolyte concentration in the spray liquid is also increased, thereby increasing the risk of cell damage. On the other hand, when the conductivity is less than 25 mS / cm, the substance introduction rate into the cell is reduced as a phenomenon.

スプレー液中の電解質は、細胞に対して使用することから毒性を示さないものを用いることが望ましい。本発明で使用するカチオンとしては、アルカリ金属から選ばれる一種以上のカチオン、例えばナトリウムイオンやカリウムイオンが、アニオンとしては、鉱酸および有機酸から選ばれる一種以上のアニオン、例えば塩素イオン、臭素イオン、リン酸イオン等の鉱酸イオンや酢酸イオン、アスコルビン酸イオン等の有機酸イオンが挙げられる。これら電解質を含むスプレー液は、例えば、蒸留水に食塩、リン酸のナトリウム塩類、リン酸のカリウム塩類、臭化ナトリウム、臭化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム等を加え溶解させることによって調製できる。   As the electrolyte in the spray solution, it is desirable to use an electrolyte that does not show toxicity because it is used for cells. As the cation used in the present invention, one or more cations selected from alkali metals, for example, sodium ions and potassium ions, and as the anion, one or more anions selected from mineral acids and organic acids, for example, chlorine ions, bromine ions And mineral acid ions such as phosphate ions, and organic acid ions such as acetate ions and ascorbate ions. Spray solutions containing these electrolytes include, for example, salt, sodium phosphate, potassium phosphate, sodium bromide, potassium bromide, sodium acetate, potassium acetate, sodium ascorbate, and potassium ascorbate in distilled water. It can be prepared by adding and dissolving.

使用するスプレー液のpHに関しては特に制限はないが、細胞に対する阻害作用が軽微と考えられるｐH４〜ｐH１１が好ましく、ｐH５〜ｐH９がより好ましい。   Although there is no restriction | limiting in particular regarding the pH of the spray liquid to be used, pH4-pH11 considered that the inhibitory effect with respect to a cell is slight is preferable, and pH5-pH9 is more preferable.

次に、遺伝子を用いた場合の細胞内導入方法について操作手順に従って説明する。細胞は培地を除き、細胞を露出する。そこに細胞内導入遺伝子を含んだ水溶液を入れ細胞と接触させる。次いで、エレクトロスプレー装置を使用して、スプレー液が細胞全体に当たるようにチューブを動かす。これで細胞内導入遺伝子の細胞内への導入作業が終了する。終了後、培地を加え遺伝子導入処理を行った細胞の培養を行う。   Next, an intracellular introduction method using a gene will be described according to an operation procedure. The cells remove the medium and expose the cells. An aqueous solution containing an intracellular transgene is added to the cells and brought into contact with the cells. The tube is then moved using an electrospray device so that the spray solution hits the entire cell. This completes the introduction of the intracellular transgene into the cell. After completion, the medium is added and the cells subjected to gene transfer treatment are cultured.

本発明の伝導度の高いスプレー液を用いてエレクトロスプレーする方法を用いた場合、伝導度の低い例えば純水をスプレー液として用いた場合と比較すると、細胞内への遺伝子導入率は同じ電圧で５０倍以上にもおよぶ。また、本発明では伝導度を上げるのに食塩のような安全な物質を使用し、かつ遺伝子等の細胞内導入物質を含まないスプレー液を用いることができることから、導入する遺伝子等を含んだエアロゾルが形成され難く、実験者がミストに曝される危険性は著しく減少する。このように、本発明のエレクトロスプレー方法および装置を用いることにより、細胞内導入物質を、安全かつ迅速に、高い導入率で細胞内に導入することが可能となる。   When the method of electrospraying using the spray solution with high conductivity of the present invention is used, the gene transfer rate into the cell is the same voltage as compared with the case where pure water having low conductivity is used as the spray solution. More than 50 times. Also, in the present invention, a safe substance such as sodium chloride can be used to increase the conductivity, and a spray solution that does not contain an intracellular introduction substance such as a gene can be used. Are less likely to form and the risk of the experimenter being exposed to the mist is significantly reduced. As described above, by using the electrospray method and apparatus of the present invention, it is possible to introduce the intracellularly introduced substance into the cell safely and rapidly at a high introduction rate.

本発明の高い伝導度のエレクトロスプレー液を使用する手段が、細胞に対して有効である理由について以下のように予想している。エレクトロスプレーにおいてノズルの先端に高電界がかかることで液滴が帯電するが、伝導度の高い溶液を使用すると電荷が逃げやすくなり帯電しにくくなる。エレクトロスプレーでは表面張力と電荷の反発で液滴の大きさが決定するが、伝導度の高い溶液では液滴サイズが大きくなる。大きな液滴は小さな液滴に比べ、質量に比例した大きな運動エネルギーを有するので、飛翔中の空気抵抗に負けることなく高速度を維持しながら、細胞に大きな運動量で衝突することができる。その衝撃で細胞膜に大きな亀裂が生じ、細胞内に細胞内導入物質が高率で取り込まれるものと考えられる。実際、本発明の場合、細胞より大きな０．２から２ｍｍ程度の大きさの液滴が生じている。このことはパーティクルガンのような細胞径より小さな粒子が細胞を貫通して穴を開ける機構とは異なる機序で、遺伝子等の高分子量の物質を細胞内に高率に取り込ませることができることを示している。   The reason why the high conductivity electrospray solution of the present invention is effective for the cells is expected as follows. In electrospray, a droplet is charged by applying a high electric field to the tip of the nozzle. However, if a solution having high conductivity is used, the charge easily escapes and is difficult to be charged. In electrospray, the droplet size is determined by the repulsion of surface tension and electric charge, but in a solution with high conductivity, the droplet size increases. A large droplet has a large kinetic energy proportional to the mass compared to a small droplet, and therefore can collide with a cell with a large momentum while maintaining a high velocity without losing air resistance during flight. It is considered that a large crack is generated in the cell membrane by the impact, and the substance introduced into the cell is taken into the cell at a high rate. In fact, in the case of the present invention, a droplet having a size of about 0.2 to 2 mm larger than the cell is generated. This means that a high molecular weight substance such as a gene can be incorporated into cells at a high rate by a mechanism different from the mechanism in which particles smaller than the cell diameter, such as a particle gun, penetrate through the cell and make a hole. Show.

以下、実施例および比較例を以て本発明の内容をさらに詳しく示すが、これらの例のみに本発明は限定されない。
実施例１
１）実験装置
実験に使用したエレクトロスプレー装置の構造を示す（図２）。
スプレー液１はシリンジポンプ７によりスプレー用のノズル上部にある金属製部３を通過する。この金属は高圧電源２につながっていてスプレー液に高電圧を印加する。さらに、この金属製チューブはポリエーテルエーテルケトン製外径１/16インチ、内径0.25mmからなるスプレー用のノズル４につながり供給される。二次元的にスプレー用ノズルを可動できるロボット９に高電圧を印加したノズルを付けた。シャーレ５の乗るステージ６はステンレス製でグランド電位になっている。シャーレ５内部には細胞と細胞内導入物質があり、テフロン(登録商標)コートされた幅５ｍｍのステンレスリボンで電気的にステージ6とつながりグランド電位になるようにした。ノズルは上下と横方向に移動することができる。ステージは金属製で縦方向に可動することができる。ノズルの先端から約2cmの位置に高電圧印加部がある。高電圧電源は最大電流１００μAに制限して使用した。スプレー装置はヘパフィルタを通過したクリーンエアの環境下１０で使用した。
２）実験条件
付着性細胞であるチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）の場合
使用培地はα-MEM＋10%牛胎児血清を使用した。CHO細胞を100×10⁴cell/mL濃度で100μLを3.5cmポリ-L-リジンコートされたポリスチレンシャーレ(イワキ社製)に培地2mLと共に加えた。2日後、培地を抜き、緑色蛍光蛋白質の遺伝子をコードした4.7kbpの大きさのプラスミドDNA（10μg）を水100μLに溶かしたものを加えた。5分後、40mmの直線を６ｍｍ間隔で8本スキャンするようにノズルを５ｍｍ/secで移動させながら6ml/hrの流量でエレクトロスプレーを行った。エレクトロスプレー後、すぐに培地を加え、培養した。1日後、ＮＩＫＯＮ製顕微鏡ＴＥ−２０００Ｓを使用し、光源を高圧水銀ランプに蛍光フィルターＮＩＫＯＮ製ＧＦＰブロックを使用して対物レンズ10倍で撮影し、蛍光蛋白を発現している細胞の数と全細胞数を計測した。エレクトロスプレー液の組成はKH2PO4 0.63g/L, NaCl 27g/L,NaH2PO4・7H2O 2.385g/Lで伝導度47mS/cmであった。印加電圧は-12kVで行った。その結果、遺伝子導入率は６２％であった。
蛍光顕微鏡写真を示す（図３）。 Hereinafter, the contents of the present invention will be described in more detail with reference to examples and comparative examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1
1) Experimental apparatus The structure of the electrospray apparatus used in the experiment is shown (FIG. 2).
The spray liquid 1 passes through the metal part 3 above the nozzle for spraying by the syringe pump 7. This metal is connected to the high voltage power source 2 and applies a high voltage to the spray liquid. Further, this metal tube is connected to a spray nozzle 4 having an outer diameter of 1/16 inch and an inner diameter of 0.25 mm made of polyetheretherketone and supplied. A nozzle to which a high voltage was applied was attached to a robot 9 that can move the spray nozzle in two dimensions. The stage 6 on which the petri dish 5 is placed is made of stainless steel and has a ground potential. The petri dish 5 had cells and substances introduced into the cell, and was electrically connected to the stage 6 with a 5 mm wide stainless steel ribbon coated with Teflon (registered trademark) so as to be at the ground potential. The nozzle can move vertically and laterally. The stage is made of metal and can be moved vertically. There is a high voltage application part at a position about 2cm from the tip of the nozzle. The high voltage power supply was used by limiting the maximum current to 100 μA. The spray device was used under clean air environment 10 that passed through a hepa filter.
2) Experimental conditions In the case of Chinese hamster ovary cells (CHO cells), which are adherent cells, α-MEM + 10% fetal bovine serum was used as the medium. CHO cells were added at a concentration of 100 × 10 ⁴ cells / mL to 100 μL of polystyrene dishes (manufactured by Iwaki) coated with 3.5 cm poly-L-lysine together with 2 mL of medium. Two days later, the medium was removed, and a 4.7 kbp plasmid DNA (10 μg) encoding the green fluorescent protein gene in 100 μL of water was added. After 5 minutes, electrospraying was performed at a flow rate of 6 ml / hr while moving the nozzle at 5 mm / sec so that eight 40 mm straight lines were scanned at 6 mm intervals. Immediately after electrospray, the medium was added and cultured. One day later, using a NIKON microscope TE-2000S, photographing with a high-pressure mercury lamp and a fluorescent filter NIKON GFP block at a magnification of 10x, the number of cells expressing fluorescent protein and total cells The number was measured. The composition of the electrospray solution was KH2PO4 0.63g / L, NaCl 27g / L, NaH2PO4 · 7H2O 2.385g / L and conductivity 47mS / cm. The applied voltage was -12 kV. As a result, the gene transfer rate was 62%.
A fluorescence micrograph is shown (FIG. 3).

実施例２
エレクトロスプレー液の組成をKH2PO4 1.05g/L, NaCl 45g/L, NaH2PO4・7H2O 3.63g/Lで伝導度74mS/cmとした以外は実施例1と同様にして行った。その結果、遺伝子導入率は７２％であった。 Example 2
The electrospray liquid composition was KH2PO4 1.05 g / L, NaCl 45 g / L, NaH2PO4 · 7H2O 3.63 g / L, and the conductivity was 74 mS / cm. As a result, the gene transfer rate was 72%.

実施例３
印加電圧-11kVとした以外は実施例２と同様にして行った。その結果、遺伝子導入率は５４％であった。 Example 3
The same operation as in Example 2 was performed except that the applied voltage was −11 kV. As a result, the gene transfer rate was 54%.

実施例４
エレクトロスプレー液の組成をKH2PO4 2.10g/L, NaCl 90g/L, NaH2PO4・7H2O 7.26g/Lで伝導度132mS/cmとした以外は実施例３と同様にして行った。その結果、遺伝子導入率は６４％であった。 Example 4
The composition of the electrospray liquid was KH2PO4 2.10 g / L, NaCl 90 g / L, NaH2PO4 · 7H2O 7.26 g / L, and the conductivity was 132 mS / cm. As a result, the gene transfer rate was 64%.

実施例５
浮遊性細胞である人リンパ球細胞（Jurkat細胞）の場合
培地はRPMI1640に牛胎児血清10％加えたものを使用した。Jurkat細胞70×10⁴cell/mL液100μLを3.5cmポリエチレンイミンコートされたポリスチレンシャーレ(イワキ社製)に培地2mLと共に加えた。3日後、310x10⁴cell/dishになる。ゆっくりと培地を抜き、緑色蛍光タンパク質の遺伝子をコードした4.7kbpの大きさのプラスミドDNA（10μg）を水100μLに溶かしたものを加えた。5分後、実施例２で使用したスプレー液と同じ組成を使用して印加電圧-12kVで同様の操作を行った。その後、培地を加え、1日培養した。培養後、培地をリン酸バッファーに入れ替え、蛍光顕微鏡観察を行った。遺伝子導入率は４５％であった。 Example 5
In the case of human lymphocyte cells (Jurkat cells) which are suspension cells The culture medium used was RPMI1640 plus 10% fetal bovine serum. 100 μL of a Jurkat cell 70 × 10 ⁴ cell / mL solution was added to a polystyrene petri dish (manufactured by Iwaki) coated with 3.5 cm polyethylene imine together with 2 mL of the medium. After 3 days, it becomes 310x10 ⁴ cell / dish. The medium was slowly removed, and a 4.7 kbp plasmid DNA (10 μg) encoding a green fluorescent protein gene dissolved in 100 μL of water was added. After 5 minutes, using the same composition as the spray liquid used in Example 2, the same operation was performed at an applied voltage of -12 kV. Thereafter, the medium was added and cultured for 1 day. After culturing, the medium was replaced with a phosphate buffer and observed with a fluorescence microscope. The gene transfer rate was 45%.

比較例１
エレクトロスプレー液として純水を使用した。伝導度は１μS/cm以下であった。この溶液を使用し、かつ印加電圧-11kVとした以外は実施例1と同様にして行った。その結果、遺伝子導入率は１％であった。 Comparative Example 1
Pure water was used as the electrospray liquid. The conductivity was 1 μS / cm or less. The same procedure as in Example 1 was performed except that this solution was used and the applied voltage was −11 kV. As a result, the gene transfer rate was 1%.

比較例２
エレクトロスプレー液として純水を使用した。伝導度は１μS/cm以下であった。この溶液を使用した以外は、印加電圧-12kVとしたことを含め実施例1と同様にして行った。その結果、遺伝子導入率は１％であった。 Comparative Example 2
Pure water was used as the electrospray liquid. The conductivity was 1 μS / cm or less. The same procedure as in Example 1 was performed except that the applied voltage was set to -12 kV except that this solution was used. As a result, the gene transfer rate was 1%.

比較例３
Jurkat細胞を使用し、実施例５と同様の操作を行った。ただし、スプレー液はKH2PO4 0.21g/L, NaCl 9g/L, NaH2PO4・7H2O 0.726g/Lの組成で伝導度16mS/cmを使用した。
その結果、遺伝子導入された細胞は痕跡量であった。 Comparative Example 3
The same operation as in Example 5 was performed using Jurkat cells. However, the spray liquid used was a composition of KH2PO4 0.21 g / L, NaCl 9 g / L, NaH2PO4 · 7H2O 0.726 g / L and a conductivity of 16 mS / cm.
As a result, the amount of cells into which the gene was introduced was a trace amount.

１はスプレー液を示す。
２は高圧電源を示す。
３は高電圧印加部を示す。
４は絶縁材料製チューブを示す。
５はシャーレを示す。
６はステージを示す。
７はシリンジポンプを示す。
８はステンレスリボンを示す。
９はロボットを示す。
１０はクリーンな環境を示す。 1 indicates a spray liquid.
Reference numeral 2 denotes a high voltage power source.
Reference numeral 3 denotes a high voltage application unit.
Reference numeral 4 denotes an insulating material tube.
5 indicates a petri dish.
6 indicates a stage.
Reference numeral 7 denotes a syringe pump.
Reference numeral 8 denotes a stainless steel ribbon.
Reference numeral 9 denotes a robot.
10 indicates a clean environment.

Claims (5)

エレクトロスプレーを用いて細胞内導入物質を細胞内に導入するに際して、エレクトロスプレー液として、電気伝導度が２５ｍＳ／ｃｍから２００ｍＳ／ｃｍの電解質溶液を用いることを特徴とする、エレクトロスプレーによる細胞内導入物質の細胞内導入方法。   When introducing an intracellular introduction substance into a cell using electrospray, an electrolyte solution having an electric conductivity of 25 mS / cm to 200 mS / cm is used as an electrospray liquid. Intracellular introduction of substances. 細胞と細胞内導入物質を接触させた後、エレクトロスプレー液として、細胞内導入物質を含まない、電気伝導度が２５ｍＳ／ｃｍから２００ｍＳ／ｃｍの電解質溶液を用いる、請求項１に記載のエレクトロスプレーによる細胞内導入物質の細胞内導入方法。   2. The electrospray according to claim 1, wherein an electrolyte solution containing no intracellular introduction substance and having an electric conductivity of 25 mS / cm to 200 mS / cm is used as the electrospray liquid after contacting the cell and the intracellular introduction substance. Intracellular introduction method of intracellular introduction substance by the method. エレクトロスプレー液として用いる電解質溶液中の電解質が、アルカリ金属から選ばれる一種以上のカチオンと、鉱酸および有機酸から選ばれる一種以上のアニオンからなる、請求項１または２に記載のエレクトロスプレーによる細胞内導入物質の細胞内導入方法。   The cell by electrospray according to claim 1 or 2, wherein the electrolyte in the electrolyte solution used as the electrospray liquid comprises one or more cations selected from alkali metals and one or more anions selected from mineral acids and organic acids. Intracellular introduction method of an internally introduced substance. 細胞内導入物質がＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質から選ばれる一種以上の物質である、請求項１記載の細胞内導入物質の細胞内導入方法。   The method for intracellularly introducing an intracellularly introduced substance according to claim 1, wherein the intracellularly introduced substance is one or more substances selected from DNA, RNA, and protein. 請求項１から４の何れか一項に記載の細胞内導入物質の細胞内導入方法を用いるための、エレクトロスプレー装置。   An electrospray apparatus for using the method for intracellularly introducing an intracellularly introduced substance according to any one of claims 1 to 4.