JP2010110272A - Cancer cell behavior-assessing model, and application thereof - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an assessing model useful for assessing cancer cells behaviors (proliferativity, infiltrativeness), to provide a method for constructing the same, and to provide applications thereof (assessment systems). <P>SOLUTION: The method for constructing the model for assessing cancer cells behaviors includes the following steps (1) to (5): the step (1) of magnetically labeling a cell population including to-be-tested cancer cells; the step (2) of preparing a culturing vessel having a culture surface coated with a first matrix material containing extracellular matrix components; the step (3) of inoculating the culturing vessel with the cell population with the magnetic label followed by subjecting the population to magnetic force to arrange the cell population in an array-like pattern where one or more cells are present in one spot; the step (4) of adding to the culturing vessel a second liquid matrix material containing the extracellular matrix components and a medium while maintaining the state of keeping the magnetic force in action to embed the cell population arranged in the step (3) in the second matrix material; and the step (5) of gelatinizing the second matrix material. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明はがん細胞挙動評価モデル及びその構築法、並びにその用途に関する。   The present invention relates to a cancer cell behavior evaluation model, its construction method, and its use.

現在、日本人の死因第一位は「がん(悪性新生物)」である。実に３人に１人ががんで死亡している。がんによる死亡原因の多くは遠隔臓器への浸潤・転移である。浸潤・転移は、がん細胞の細胞マトリックス環境下における運動能の高さに起因する。抗がん剤の開発やがん治療法の確立に向け、生体内の環境に近い状態でがん細胞の運動性を評価可能な細胞評価系の提供が切望される。   Currently, the first cause of death among Japanese is “cancer (malignant neoplasm)”. One in three people have died of cancer. Many causes of cancer death are invasion and metastasis to distant organs. Invasion / metastasis is caused by the high motility of cancer cells in the cell matrix environment. For the development of anticancer drugs and the establishment of cancer treatment methods, it is highly desired to provide a cell evaluation system that can evaluate the motility of cancer cells in a state close to the in vivo environment.

これまでに様々な細胞評価系が開発されている。その代表は、培養皿などの培養容器内で２次元的に培養、増殖させた細胞を用いる評価系である。このような二次元培養を発展させた技術として、細胞を培養面に所望のパターンで配列する（パターニング）方法が開発されている。２次元細胞アレイとも呼ばれる当該技術によれば、細胞を所定の間隔で規則的に配置することによって細胞の観察や評価が容易となる。その一方で、生体内の環境とは大きく異なる環境下に細胞がおかれることになることから、生体内における細胞の挙動を評価できるとは言い難い。   Various cell evaluation systems have been developed so far. A typical example is an evaluation system that uses cells that are two-dimensionally cultured and grown in a culture vessel such as a culture dish. As a technique developed from such two-dimensional culture, a method of arranging cells in a desired pattern on the culture surface (patterning) has been developed. According to this technique, which is also called a two-dimensional cell array, cells can be easily observed and evaluated by regularly arranging the cells at a predetermined interval. On the other hand, it is difficult to say that the behavior of the cells in the living body can be evaluated because the cells are placed in an environment that is significantly different from the environment in the living body.

２次元培養の問題点を克服するために開発されたのが３次元培養である。３次元培養では３次元マトリックス内に細胞が包埋された状態を形成する。３次元培養の場合、細胞の周囲をマトリックスが囲み、生体内の環境により近い環境が作り出される。しかしながら、細胞が３次元的に分散した状態となるため、細胞の観察や評価は困難である。３次元培養を応用した評価系も開発されている（例えば特許文献１）。特許文献１に開示された評価系は、細胞の集合体であるスフェロイドの評価に特化したものであり、個々の細胞の挙動を観察、評価することには適さない。   Three-dimensional culture has been developed to overcome the problems of two-dimensional culture. In three-dimensional culture, a state in which cells are embedded in a three-dimensional matrix is formed. In the case of three-dimensional culture, the matrix surrounds the cells, creating an environment that is closer to the in vivo environment. However, since the cells are three-dimensionally dispersed, it is difficult to observe and evaluate the cells. An evaluation system using three-dimensional culture has also been developed (for example, Patent Document 1). The evaluation system disclosed in Patent Document 1 is specialized for evaluating spheroids, which are aggregates of cells, and is not suitable for observing and evaluating the behavior of individual cells.

フィーダー細胞上に上皮細胞等を重層化することによって構築した再生組織を利用した評価系も開発されている（特許文献２）。当該評価系ではフィーダー細胞が重なるように観察されるため、上皮細胞等の挙動を解析し難い。また、細胞をパターニングしていないことから、細胞の微小環境が整った均一な状態での解析はできない。   An evaluation system using a regenerative tissue constructed by layering epithelial cells on feeder cells has also been developed (Patent Document 2). In this evaluation system, since feeder cells are observed to overlap, it is difficult to analyze the behavior of epithelial cells and the like. Moreover, since the cells are not patterned, analysis in a uniform state where the microenvironment of the cells is in place is not possible.

尚、磁力を利用して細胞をパターニングすることによって三次元組織を構築する方法が開発されている（特許文献３）。
特表２００７−５０１６３３号公報 国際公開第２００３／０３９６１１号パンフレット 国際公開第２００７／１１６５９４号パンフレット Ino K, Okochi M, Konishi N, Imai R, Shikida M, Ito A, and Honda H. 2008. Cell culture arrays using magnetic force-based cell patterning for dynamic single cell analysis. Lab Chip 8:134-142. Ino K, Okochi M, and Honda H. Application of Magnetic Force-Based Cell Patterning for Controlling Cell-Cell Interactions in Angiogenesis. Biotechnol. Bioeng. 2008;9999:1-9 A method for constructing a three-dimensional tissue by patterning cells using magnetic force has been developed (Patent Document 3).
Special table 2007-501633 International Publication No. 2003/039611 Pamphlet International Publication No. 2007/116594 Pamphlet Ino K, Okochi M, Konishi N, Imai R, Shikida M, Ito A, and Honda H. 2008. Cell culture arrays using magnetic force-based cell patterning for dynamic single cell analysis.Lab Chip 8: 134-142. Ino K, Okochi M, and Honda H. Application of Magnetic Force-Based Cell Patterning for Controlling Cell-Cell Interactions in Angiogenesis. Biotechnol. Bioeng. 2008; 9999: 1-9

本発明は、以上の背景の下、２次元培養の利点（細胞の観察及び評価が容易であること）と３次元培養の利点（生体内に近い環境下でがん細胞の挙動を評価可能であること）を併せ持ち、がん細胞の薬剤に対す応答性の評価や、生体における、がん細胞の挙動の解析に有用ながん細胞挙動評価モデル及びその構築方法、並びにその用途（評価系）を提供することを課題とする。   In the present invention, based on the above background, the advantages of two-dimensional culture (the ability to observe and evaluate cells is easy) and the advantages of three-dimensional culture (the behavior of cancer cells can be evaluated in an environment close to the living body). Cancer cell behavior evaluation model and its construction method, and its use (evaluation system) useful for evaluating responsiveness of drugs to cancer cells and analyzing cancer cell behavior in vivo It is an issue to provide.

細胞を目的の位置に配置する細胞パターニング技術は、細胞挙動解析に有効な技術である。本発明者らの研究グループは、磁性ナノ粒子であるマグネタイトをリポソームで包埋した磁性粒子封入正電荷リポソーム（MCL:Magnetite cationic liposome）と剣山状鉄製デバイスを使用し、磁気ラベルした細胞をアレイ状にパターニングする磁気細胞パターニング法を開発した（非特許文献１、２）。磁気細胞パターニング法は、どんな培養面にも細胞をパターニングできる手法であり、通常の培養皿表面ばかりでなく、細胞外マトリックス表面、細胞単層表面への細胞パターニングにも適用可能である。また、この磁気細胞パターニング法は、パターニング後の細胞に運動制約を生じさせないことから、細胞挙動解析に有用な点も大きな特徴である。本発明者らはこれらの特徴に着目し、細胞外マトリックス成分を含む３次元（3D）ゲル中に２次元（2D）磁気細胞アレイパターニングを行うという新たな手法を着想した。当該手法では、マトリックス材料でコートした培養面に磁気ラベルした細胞を播種した後、磁気パターニングによって細胞をアレイ状に配置させ、その後マトリックス材料で細胞を包埋する。当該手法によって構築した評価モデル（２次元パターニングされた細胞がマトリックス材料に包埋されたもの）を用いてがん化細胞の挙動を観察した結果、当該評価モデルが3次元環境下でがん細胞の挙動を評価するツールとして有用であることが示された。また、スフェロイド形成性の細胞の挙動評価にも有用であることが示された。さらには、薬剤の評価にも有用であることが確認された。以上の成果に基づき、次の発明を提供する。
［１］(1)被験がん細胞を含む細胞集団を磁気ラベルするステップ、
(2)細胞外マトリックス成分を含有する第１マトリックス材料で培養面がコートされた培養容器を用意するステップ、
(3)磁気ラベルした前記細胞集団を前記培養容器に播種した後、磁力を作用させることによって、１スポットに１個又は複数個の細胞が存在するアレイ状パターンに前記細胞集団を配列させるステップ、
(4)磁力を作用させた状態を維持しつつ、細胞外マトリックス成分及び培地を含有する液状の第２マトリックス材料を前記培養容器に添加することによって、ステップ(3)で配列した前記細胞集団を該第２マトリックス材料に包埋するステップ、
(5)前記第２マトリックス材料をゲル化させるステップ、
を含む、がん細胞挙動評価モデルの構築法。
［２］前記細胞外マトリックス成分がコラーゲンである、［１］に記載の構築法。
［３］前記コラーゲンがI型コラーゲンである、［２］に記載の構築法。
［４］前記第１マトリックス材料と前記第２マトリックス材料が同一の組成である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の構築法。
［５］前記第２マトリックス材料が細胞を含有する、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の構築法。
［６］前記培養面が平坦面である、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の構築法。
［７］前記被験がん細胞が、遺伝子操作によってがん化させた細胞である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の構築法。
［８］前記アレイ状パターンにおけるスポットの間隔が均一である、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の構築法。
［９］前記アレイ状パターンが２次元ドットマトリックス状パターンである、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の構築法。
［１０］前記アレイ状パターンにおいて、スフェロイドの形成に必要な数の細胞が各スポットに存在する、［１］〜［９］のいずれか一項に記載の構築法。
［１１］(i)被験がん細胞を含む細胞集団を磁気ラベルするステップ、
(ii)培養面に細胞層が形成された培養容器を用意するステップ、
(iii)磁気ラベルした前記細胞集団を前記培養容器に播種した後、磁力を作用させることによって、１スポットに１個又は複数個の細胞が存在するアレイ状パターンに前記細胞集団を配列させるステップ、
(iv)磁力を作用させた状態を維持しつつ、細胞外マトリックス成分及び培地を含有する液状のマトリックス材料を前記培養容器に添加することによって、ステップ(iii)で配列した前記細胞集団を該マトリックス材料に包埋するステップ、
(v)前記マトリックス材料をゲル化させるステップ、
を含む、がん細胞挙動評価モデルの構築法。
［１２］第２マトリックス材料が被験物質を含有する、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の構築法。
［１３］［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の構築法で構築した、がん細胞挙動評価モデル。
［１４］［１２］に記載の構築法で構築した、がん細胞挙動評価モデル。
［１５］１スポットに１個又は複数個の細胞が存在する２次元アレイ状パターンに配置された、被験がん細胞を含む細胞集団が、細胞外マトリックス成分を含むマトリックス材料に包埋されていることを特徴とする、がん細胞挙動評価モデル。
［１６］［１３］〜［１５］のいずれか一項に記載のがん細胞挙動評価モデルを用い、被験がん細胞に対する被験物質の有効性を調べることを特徴とする、被験がん細胞に対する物質の有効性を評価する方法。
［１７］(a)［１３］に記載のがん細胞挙動評価モデルに被験物質を添加した後、培養するステップ、
(b)細胞の挙動を観察し、被験がん細胞に対する被験物質の有効性を判定するステップ、
を含む、被験がん細胞に対する物質の有効性を評価する方法。
［１８］(A)［１４］に記載のがん細胞挙動評価モデルを培養するステップ、
(B)細胞の挙動を観察し、被験物質の被験がん細胞に対する有効性を判定するステップ、
を含む、被験がん細胞に対する物質の有効性を評価する方法。 A cell patterning technique for placing cells at a target position is an effective technique for analyzing cell behavior. Our research group uses magnetic particle-encapsulated positively charged liposomes (MCL) with magnetic nanoparticles encapsulated in liposomes and a sword-shaped iron device, and magnetically labeled cells are arrayed. A magnetic cell patterning method for patterning was developed (Non-Patent Documents 1 and 2). The magnetic cell patterning method is a technique capable of patterning cells on any culture surface, and can be applied not only to the surface of a normal culture dish but also to cell patterning on the surface of an extracellular matrix or cell monolayer. In addition, this magnetic cell patterning method has a great feature that it is useful for cell behavior analysis because it does not cause movement restrictions on the patterned cells. The inventors of the present invention have focused on these features and have conceived a new method of performing two-dimensional (2D) magnetic cell array patterning in a three-dimensional (3D) gel containing an extracellular matrix component. In this technique, cells that are magnetically labeled are seeded on a culture surface coated with a matrix material, then the cells are arranged in an array by magnetic patterning, and then the cells are embedded with the matrix material. As a result of observing the behavior of cancerous cells using an evaluation model (two-dimensionally patterned cells embedded in a matrix material) constructed by this method, the evaluation model is a cancer cell in a three-dimensional environment. It was shown to be useful as a tool to evaluate the behavior of It was also shown to be useful for evaluating the behavior of spheroid-forming cells. Furthermore, it was confirmed that it is useful for evaluation of drugs. Based on the above results, the following invention is provided.
[1] (1) Magnetically labeling a cell population containing a test cancer cell;
(2) preparing a culture vessel whose culture surface is coated with a first matrix material containing an extracellular matrix component;
(3) arranging the cell population in an array pattern in which one or more cells are present in one spot by applying a magnetic force after seeding the magnetically labeled cell population in the culture vessel;
(4) adding the liquid second matrix material containing the extracellular matrix component and the culture medium to the culture vessel while maintaining the state in which the magnetic force is applied, thereby allowing the cell population arranged in step (3) to Embedding in the second matrix material;
(5) gelling the second matrix material;
Of cancer cell behavior evaluation model, including
[2] The construction method according to [1], wherein the extracellular matrix component is collagen.
[3] The construction method according to [2], wherein the collagen is type I collagen.
[4] The construction method according to any one of [1] to [3], wherein the first matrix material and the second matrix material have the same composition.
[5] The construction method according to any one of [1] to [3], wherein the second matrix material contains cells.
[6] The construction method according to any one of [1] to [5], wherein the culture surface is a flat surface.
[7] The construction method according to any one of [1] to [6], wherein the test cancer cell is a cell that has been transformed into cancer by genetic manipulation.
[8] The construction method according to any one of [1] to [7], wherein spot intervals in the array pattern are uniform.
[9] The construction method according to any one of [1] to [7], wherein the array pattern is a two-dimensional dot matrix pattern.
[10] The construction method according to any one of [1] to [9], wherein the number of cells required for spheroid formation is present in each spot in the array pattern.
[11] (i) magnetically labeling a cell population containing a test cancer cell;
(ii) preparing a culture vessel having a cell layer formed on the culture surface;
(iii) arranging the cell population in an array pattern in which one or a plurality of cells are present in one spot by applying a magnetic force after seeding the magnetically labeled cell population in the culture vessel;
(iv) adding the liquid matrix material containing an extracellular matrix component and a medium to the culture vessel while maintaining a state in which a magnetic force is applied, whereby the cell population arranged in step (iii) is added to the matrix Embedding in material,
(v) gelling the matrix material;
Of cancer cell behavior evaluation model, including
[12] The construction method according to any one of [1] to [10], wherein the second matrix material contains a test substance.
[13] A cancer cell behavior evaluation model constructed by the construction method according to any one of [1] to [11].
[14] A cancer cell behavior evaluation model constructed by the construction method according to [12].
[15] A cell population containing test cancer cells arranged in a two-dimensional array pattern in which one or more cells exist in one spot is embedded in a matrix material containing an extracellular matrix component A cancer cell behavior evaluation model characterized by that.
[16] Using the cancer cell behavior evaluation model according to any one of [13] to [15], the effectiveness of the test substance against the test cancer cell is examined. A method of assessing the effectiveness of a substance.
[17] (a) A step of culturing after adding a test substance to the cancer cell behavior evaluation model according to [13],
(b) observing cell behavior and determining the effectiveness of the test substance against the test cancer cell;
A method for evaluating the effectiveness of a substance against test cancer cells.
[18] (A) culturing the cancer cell behavior evaluation model according to [14],
(B) observing cell behavior and determining the effectiveness of the test substance against the test cancer cells,
A method for evaluating the effectiveness of a substance against test cancer cells.

本発明の手法によれば、がん細胞（単独の細胞又は細胞集団）が２次元アレイ状に配列し、且つマトリックス材料で囲まれた状態が形成される。即ち、がん細胞の挙動（増殖能、浸潤能）を生体環境に近い３次元培養下で、且つ多数の細胞又は細胞集団を同時に２次元で評価できる、がん細胞挙動評価モデルが構築される。当該がん細胞挙動評価モデルは、がん細胞の薬剤に対す応答性の評価や、生体における、がん細胞の挙動の解析に有用である。また、細胞間相互作用の解析にも有用である。   According to the technique of the present invention, a state in which cancer cells (single cells or cell populations) are arranged in a two-dimensional array and surrounded by a matrix material is formed. That is, a cancer cell behavior evaluation model is constructed that can evaluate the behavior of cancer cells (proliferation ability, invasion ability) in a three-dimensional culture close to a living environment and simultaneously evaluate a large number of cells or cell populations in two dimensions. . The cancer cell behavior evaluation model is useful for evaluating the responsiveness of cancer cells to drugs and analyzing the behavior of cancer cells in a living body. It is also useful for analyzing cell-cell interactions.

（がん細胞挙動評価モデルの構築法及びがん細胞挙動評価モデル）
本発明の第１の局面は、がん細胞挙動評価モデルの構築法及びがん細胞挙動評価モデルに関する。「がん細胞挙動評価モデル」とは、がん細胞の挙動を評価するために利用される実験ないし試験ツールのことをいう。一般に、生体内における細胞等の特性を評価するために生体内の環境を再現又は模倣したものを「モデル」と呼ぶ。このような「モデル」は、特定の環境を形成している要素と、当該環境下にある細胞等とを含むことになる。本発明において「挙動」とは、増殖能又は浸潤能、或いはこれら両者のことをいう。本発明の細胞挙動評価モデルによれば、被験がん細胞の増殖能及び浸潤能を同時に評価することも可能である。 (Construction method of cancer cell behavior evaluation model and cancer cell behavior evaluation model)
The first aspect of the present invention relates to a cancer cell behavior evaluation model construction method and a cancer cell behavior evaluation model. The “cancer cell behavior evaluation model” refers to an experiment or test tool used to evaluate the behavior of cancer cells. In general, a model that reproduces or mimics the environment in a living body in order to evaluate the characteristics of cells or the like in the living body is called a “model”. Such a “model” includes elements forming a specific environment and cells in the environment. In the present invention, “behavior” refers to proliferation ability, infiltration ability, or both. According to the cell behavior evaluation model of the present invention, it is also possible to simultaneously evaluate the proliferation ability and invasion ability of a test cancer cell.

本発明のがん細胞挙動評価モデルの構築法は、次のステップ、即ち、(1)被験がん細胞を含む細胞集団を磁気ラベルするステップ；(2)細胞外マトリックス成分を含有する第１マトリックス材料で培養面がコートされた培養容器を用意するステップ；(3)磁気ラベルした前記細胞集団を前記培養容器に播種した後、磁力を作用させることによって、１スポットに１個又は複数個の細胞が存在するアレイ状パターンに前記細胞集団を配列させるステップ；(4)磁力を作用させた状態を維持しつつ、細胞外マトリックス成分及び培地を含有する液状の第２マトリックス材料を前記培養容器に添加することによって、ステップ(3)で配列した前記細胞集団を該第２マトリックス材料に包埋するステップ；(5)前記第２マトリックス材料をゲル化させるステップ、を含む。以下、各ステップを詳細に説明する。   The method for constructing a cancer cell behavior evaluation model of the present invention comprises the following steps: (1) magnetically labeling a cell population containing a test cancer cell; (2) a first matrix containing an extracellular matrix component A step of preparing a culture vessel coated with a culture surface with a material; (3) one or a plurality of cells per spot by seeding the magnetically labeled cell population in the culture vessel and then applying a magnetic force (4) adding a liquid second matrix material containing an extracellular matrix component and a medium to the culture vessel while maintaining a state in which a magnetic force is applied; Embedding the cell population arranged in step (3) in the second matrix material; (5) gelling the second matrix material; Including. Hereinafter, each step will be described in detail.

ステップ(1)（細胞集団の磁気ラベル）
このステップでは、被験がん細胞を含む細胞集団を用意し、当該細胞集団を磁気ラベルする。「磁気ラベル」とは、「磁性化」と同義であり、細胞に磁性粒子を導入したり、付着したりすること等によって、細胞を磁力で操作可能な状態にすることをいう。磁気ラベルの詳細については後述する。 Step (1) (magnetic label of cell population)
In this step, a cell population containing the test cancer cells is prepared, and the cell population is magnetically labeled. “Magnetic label” is synonymous with “magnetization” and refers to making a cell operable by magnetic force by introducing or adhering magnetic particles to the cell. Details of the magnetic label will be described later.

細胞集団は、被験がん細胞のみから構成されていても、被験がん細胞に加えて他の細胞を含んでいてもよい。また、被験がん細胞として２種類以上のがん細胞を含んでいてもよい。被験がん細胞として、遺伝子操作によってがん化させた細胞、生体から分離したがん細胞、又は培養がん細胞（細胞株）を用いることができる。「遺伝子操作によってがん化させた細胞」の典型例は、適当な細胞に活性化がん遺伝子を導入することによって得られる細胞である。このようながん化の誘導に利用される遺伝子として、v-src遺伝子、AKT1遺伝子、ras遺伝子を例示することができる。一方、「生体から分離したがん細胞」は、例えば、採取したがん組織から常法で調製することができる。「培養がん細胞（細胞株）」の例はHeLa細胞、HepG2細胞である。   The cell population may be composed of only the test cancer cells or may contain other cells in addition to the test cancer cells. Moreover, two or more types of cancer cells may be included as test cancer cells. As the test cancer cell, a cell that has been transformed into cancer by genetic manipulation, a cancer cell isolated from a living body, or a cultured cancer cell (cell line) can be used. A typical example of “cells transformed into cancer by genetic manipulation” is a cell obtained by introducing an activated oncogene into an appropriate cell. Examples of genes used for inducing canceration include v-src gene, AKT1 gene, and ras gene. On the other hand, “cancer cells isolated from a living body” can be prepared from collected cancer tissues by a conventional method, for example. Examples of “cultured cancer cells (cell lines)” are HeLa cells and HepG2 cells.

本明細書では、慣例に従い、癌腫と肉腫を総称する用語として「がん」を用いる。がんはその発生の母体となった臓器の名、もしくは発生母組織の名で呼ばれ、主なものを列記すると、舌癌、歯肉癌、咽頭癌、上顎癌、喉頭癌、唾液腺癌、食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、胆嚢癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、甲状腺癌、副腎癌、脳下垂体腫瘍、松果体腫瘍、子宮癌、卵巣癌、膣癌、膀胱癌、腎臓癌、前立腺癌、尿道癌、網膜芽細胞腫、結膜癌、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、皮膚癌、白血病、悪性リンパ腫、睾丸腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫などである。   In the present specification, “cancer” is used as a general term for carcinoma and sarcoma in accordance with common practice. Cancer is called the name of the organ that caused the cancer, or the name of the mother tissue, and the main cancers are listed: tongue cancer, gingival cancer, pharyngeal cancer, maxillary cancer, laryngeal cancer, salivary gland cancer, esophagus Cancer, stomach cancer, small intestine cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, biliary tract cancer, gallbladder cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, thyroid cancer, adrenal cancer, pituitary tumor, pineal tumor, uterine cancer, ovarian cancer , Vaginal cancer, bladder cancer, kidney cancer, prostate cancer, urethral cancer, retinoblastoma, conjunctival cancer, glioma, glioblastoma, skin cancer, leukemia, malignant lymphoma, testicular tumor, osteosarcoma, rhabdomitis Examples include sarcomas, leiomyosarcoma, angiosarcoma, liposarcoma, chondrosarcoma, and Ewing sarcoma.

被験がん細胞の動物種は特に限定されない。被験がん細胞として典型的にはヒトのがん細胞を用いるが、他の動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタなど）のがん細胞を用いることも可能である。   The animal species of the test cancer cell is not particularly limited. Although human cancer cells are typically used as test cancer cells, cancer cells of other animals (mouse, rat, rabbit, goat, sheep, pig, etc.) can also be used.

細胞集団の磁気ラベルは、好ましくは磁性粒子の導入又は付着によって行う。磁性粒子は、細胞が保持可能であり且つ細胞が保持した際に細胞に磁性を付加するものであればどのようなものでもよい。例えば、フェライトやマグネタイトなどの酸化鉄、酸化クロム、コバルトなどの磁性材料の粒子を磁性粒子として用いることができる。二種類以上の磁性粒子を組み合わせて用いてもよい。磁性粒子の粒径は特に限定しないが、例えば粒径が5nm〜100μmの磁性粒子を用いることができる。後述するリポソーム封入型の磁性粒子の場合は特に粒径が5nm〜25nmの磁性粒子を用いることが好ましい。この範囲の粒径の磁性粒子を用いることにより、リポソームの分散安定性を高めることができる。   Magnetic labeling of cell populations is preferably done by introduction or attachment of magnetic particles. The magnetic particles may be any particles as long as they can be held by the cell and add magnetism to the cell when held by the cell. For example, particles of a magnetic material such as iron oxide such as ferrite and magnetite, chromium oxide, and cobalt can be used as the magnetic particles. Two or more kinds of magnetic particles may be used in combination. The particle size of the magnetic particles is not particularly limited. For example, magnetic particles having a particle size of 5 nm to 100 μm can be used. In the case of liposome-encapsulated magnetic particles described later, it is particularly preferable to use magnetic particles having a particle size of 5 nm to 25 nm. By using magnetic particles with a particle size in this range, the dispersion stability of the liposome can be enhanced.

磁性粒子の導入により細胞集団を磁気ラベルする場合は、細胞への導入に適した形態に調製した磁性粒子を使用する。このような形態の磁性粒子の具体例は、リポソーム等の脂質膜に封入（内包）された磁性粒子である。例えば、磁性粒子をリポソームに封入した磁性粒子封入リポソーム（ML: MagnetoliposomeあるいはMagnetite liposome）や磁性粒子を正電荷リポソームに封入した磁性粒子封入正電荷リポソーム（MCL: Magnetite cationic liposome）を用いることができる。これらのリポソーム封入型の磁性粒子では、リポソームの有する細胞親和性によって、細胞への付着及び取り込みが可能となる。特に、磁性粒子封入正電荷リポソームは、細胞表面との疎水性相互作用や電気的相互作用によって効率的に細胞内へと取り込まれる。尚、細胞に磁性粒子を取り込ませることによって、より確実に細胞を磁気ラベルすることができ、また多くの磁性粒子を細胞に保持させることができるため磁力の作用による細胞のコントロールが容易になる。   When magnetically labeling a cell population by introducing magnetic particles, magnetic particles prepared in a form suitable for introduction into cells are used. A specific example of such a magnetic particle is a magnetic particle encapsulated (encapsulated) in a lipid membrane such as a liposome. For example, magnetic particle-encapsulated liposomes (ML: Magnetoliposome or Magnetite liposome) in which magnetic particles are encapsulated in liposomes or magnetic particle-encapsulated positively charged liposomes (MCL: Magnetite immobilized liposome) in which magnetic particles are encapsulated in positively charged liposomes can be used. These liposome-encapsulated magnetic particles can be attached to and taken up by cells due to the cell affinity of the liposome. In particular, magnetic particle-encapsulated positively charged liposomes are efficiently taken into cells by hydrophobic interaction and electrical interaction with the cell surface. In addition, by incorporating magnetic particles into the cells, the cells can be more reliably magnetically labeled, and many magnetic particles can be retained in the cells, so that the cells can be easily controlled by the action of magnetic force.

MCLの一例を図１に示す。図１に示したMCLは、マグネタイト等の磁性粒子が、正電荷脂質を含有するリポソームに封入された構造を備える。MCLは表面に正電荷を帯びているために細胞への接着性に優れるとともに、リポソームを構成成分とするために細胞内へと取り込まれやすい。このような特性を備えるMCLは様々な細胞の磁気ラベルに適する。MCLは、例えばJpn.J. Cancer Res.第87巻第1179〜1183頁（1996年）に記載された磁性粒子封入正電荷リポソームの製造方法を参照して調製することができる。   An example of MCL is shown in FIG. The MCL shown in FIG. 1 has a structure in which magnetic particles such as magnetite are encapsulated in liposomes containing positively charged lipids. Since MCL has a positive charge on the surface, it has excellent adhesion to cells and is easily taken into cells because liposome is a constituent. MCL with such characteristics is suitable for magnetic labeling of various cells. MCL can be prepared with reference to the method for producing magnetic particle-encapsulated positively charged liposomes described in, for example, Jpn. J. Cancer Res. Vol. 87, pages 1179 to 1183 (1996).

一方、磁性粒子を付着することで細胞を磁気ラベルする場合には、細胞接着性物質と複合体を形成した磁性粒子を使用するとよい。例えば、細胞接着性物質が直接又は間接的に磁性粒子に結合して構成される複合体や、細胞接着性物質を含有する材料（多糖類や脂質など）で磁性粒子を被覆ないし封入して構成される複合体を使用することによって細胞に磁性粒子を付着することができる。尚、上記のリポソーム封入型の磁性粒子も細胞接着性であり、これを磁性粒子の付着による磁気ラベルに使用することもできる。   On the other hand, when magnetically labeling cells by adhering magnetic particles, magnetic particles formed in a complex with a cell adhesive substance may be used. For example, a structure in which a cell adhesive substance is directly or indirectly bonded to a magnetic particle, or a structure in which magnetic particles are coated or enclosed with a material (polysaccharide, lipid, etc.) containing a cell adhesive substance. The magnetic particles can be attached to the cells by using the complex. The liposome-encapsulated magnetic particles are also cell-adhesive, and can be used for magnetic labels by attaching magnetic particles.

本発明で使用される細胞接着性物質は、幅広い細胞に対して接着性を有する物質と、特定の細胞に対して選択的な接着性を示す物質とに分類することができる。前者の例として細胞膜の構成成分に結合性又は接着性を有する化合物を挙げることができる。このような化合物として、フィブロネクチン、フィブロネクチンの一部であって例えばアミノ酸配列RGD（Arg-Gly-Asp、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）、KQAGDV（Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val、リシン−グルタミン−アラニン−グリシン−アスパラギン酸−バリン）、若しくはＲＥＤＶ（Arg-Glu-Asp-Val、アルギニン−グルタミン酸−アスパラギン酸−バリン）を含むペプチド、同じく細胞接着性タンパク質であるラミニン、又はラミニンの一部であって例えばアミノ酸配列YIGSR（Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）、若しくはIKVAV（Ile-Lys-Val-Ala-Val、イソロイシン−リシン−バリン−アラニン−バリン）を含むペプチドなどを例示することができる。このような細胞接着性ペプチドの長さは、特に限定されるものではないが、好ましくはアミノ酸数個〜１０数個程度、さらに好ましくは１０個以下程度である。例えば、アミノ酸配列RGDを有するペプチドあるいはアミノ酸配列YIGSRを有するペプチドであってアミノ酸残基数が１０個以下のペプチドを好適に用いることができる。このような細胞接着性ペプチドは、好ましくは、ペプチドの末端側にこれらの特定アミノ酸配列を有し、より好ましくはそのN末端側にこれらのアミノ酸配列を有する状態でそのC末端で磁性粒子等の表面に結合されており、さらに好ましくは、そのN末端にこれらのアミノ酸配列のN末端残基が位置する。   The cell adhesive substance used in the present invention can be classified into a substance having adhesiveness to a wide range of cells and a substance showing selective adhesiveness to specific cells. As an example of the former, a compound having a binding property or adhesiveness to a constituent component of a cell membrane can be mentioned. Examples of such compounds include fibronectin, a part of fibronectin, such as the amino acid sequence RGD (Arg-Gly-Asp, arginine-glycine-aspartic acid), KQAGDV (Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val, lysine- A peptide containing glutamine-alanine-glycine-aspartic acid-valine), or REDV (Arg-Glu-Asp-Val, arginine-glutamic acid-aspartic acid-valine), laminin, which is also a cell adhesion protein, or part of laminin For example, the amino acid sequence YIGSR (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, tyrosine-isoleucine-glycine-serine-arginine) or IKVAV (Ile-Lys-Val-Ala-Val, isoleucine-lysine-valine-alanine- Peptides containing valine) can be exemplified. The length of such a cell adhesion peptide is not particularly limited, but is preferably about several to ten or more amino acids, more preferably about 10 or less. For example, a peptide having the amino acid sequence RGD or a peptide having the amino acid sequence YIGSR and having 10 or less amino acid residues can be preferably used. Such a cell adhesion peptide preferably has these specific amino acid sequences on the terminal side of the peptide, and more preferably has such amino acid sequences on the N-terminal side, such as magnetic particles at the C-terminal. More preferably, the N-terminal residue of these amino acid sequences is located at the N-terminus thereof.

一方、特定の細胞に対して選択的な接着性を示す物質の例として、特定の細胞がその表面に発現する分子（マーカー分子）に対する抗体を挙げることができる。例えば、がん細胞の細胞表面マーカーを標的とすれば、がん細胞特異的に磁気ラベルすることが可能である。ここでの抗体としてFab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFvなどの抗体断片を用いることもできる。低分子化合物やタンパク質、標識物質などを融合又は結合させて構成される融合抗体又は標識化抗体を使用してもよい。標識物質としては125I等の放射性物質、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミンイソチオシアネート（RITC）、アルカリホスファターゼ、ビオチンなどを用いることができる。 On the other hand, as an example of a substance exhibiting selective adhesion to a specific cell, an antibody against a molecule (marker molecule) expressed on the surface of the specific cell can be mentioned. For example, by targeting a cell surface marker of cancer cells, it is possible to magnetically label cancer cells specifically. Antibody fragments such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , scFv, and dsFv can also be used as the antibody here. A fusion antibody or a labeled antibody constituted by fusing or binding a low molecular weight compound, protein, labeling substance or the like may be used. As the labeling substance, radioactive substances such as 125 I, peroxidase, β-D-galactosidase, microperoxidase, horseradish peroxidase (HRP), fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC), alkaline phosphatase, biotin, etc. are used. be able to.

細胞接着性物質を直接又は間接的に磁性粒子に結合することによって、細胞接着性磁性粒子を構築することができる。例えば、市販の磁性粒子Dynabeads（登録商標）に対して、ビオチンとストレプトアビジンの結合反応を利用して抗体を結合することによって、細胞接着性磁性粒子を得ることができる。その他、市販の磁性粒子リゾビスト（登録商標）、フェリデックス等をアミノシランカップリングして、細胞接着性物質が結合した磁性粒子を調製することができる。また、表面に細胞接着性物質を有するリポソーム（即ち、細胞接着性物質を含有したリポソーム又は細胞接着性物質が表面に付着ないし結合したリポソーム）に磁性粒子を封入することによっても細胞接着性磁性粒子を構築することができる。細胞接着性物質の種類に応じた各種の結合形成反応を利用することによって、このような磁性粒子封入リポソームを作製することが可能である。必要に応じて適切なリンカーを用いることもできる。例えば、リポソームへRGDペプチドを結合させるためには、ジスルフィド結合の形成による方法が好適である。この方法では、RGD配列のC末端側にシステインが付加されたRGDC配列からなるペプチドを用いることが好ましい。かかるペプチドを使用することによって、SH基を有するリポソーム側との間に容易にジスルフィド結合を形成させることができる。尚、細胞接着性ペプチドをリポソームに結合させるためのリンカーはシステインに限られるものではなく、他のアミノ酸やペプチドを用いてもよい。   Cell-adhesive magnetic particles can be constructed by binding cell-adhesive substances directly or indirectly to magnetic particles. For example, cell-adhesive magnetic particles can be obtained by binding an antibody to commercially available magnetic particles Dynabeads (registered trademark) using a binding reaction between biotin and streptavidin. In addition, commercially available magnetic particle Rhizovist (registered trademark), ferridex and the like can be aminosilane coupled to prepare a magnetic particle to which a cell adhesive substance is bound. Cell-adhesive magnetic particles can also be obtained by encapsulating magnetic particles in liposomes having cell-adhesive substances on their surfaces (that is, liposomes containing cell-adhesive substances or liposomes having cell-adhesive substances attached or bound to the surface). Can be built. Such magnetic particle-encapsulated liposomes can be prepared by utilizing various bond forming reactions depending on the type of cell adhesive substance. An appropriate linker can also be used as necessary. For example, in order to bind the RGD peptide to the liposome, a method by forming a disulfide bond is suitable. In this method, it is preferable to use a peptide consisting of an RGDC sequence in which cysteine is added to the C-terminal side of the RGD sequence. By using such a peptide, a disulfide bond can be easily formed between the liposome side having an SH group. The linker for binding the cell adhesive peptide to the liposome is not limited to cysteine, and other amino acids and peptides may be used.

細胞接着性物質との複合体を形成した磁性粒子（細胞接着性磁性粒子）の具体例として、MCLのリポソーム表面にアミノ酸配列RGDCからなるペプチドを結合した磁性粒子封入リポソームを挙げることができる。   Specific examples of magnetic particles (cell-adhesive magnetic particles) that form a complex with a cell-adhesive substance include magnetic particle-encapsulated liposomes in which a peptide consisting of the amino acid sequence RGDC is bound to the MCL liposome surface.

細胞接着性磁性粒子の他の具体例として、MCLのリポソーム表面に抗体を結合して得られる抗体固定化磁性粒子封入リポソーム（AML: Antibody-immobilized magnetite liposome）を挙げることができる。AMLは、マグネタイト等の磁性粒子がリポソームで封入されるとともに、リポソームに抗体が固定化された構造を備える。抗体としては磁性ラベルの対象の細胞に特異的に結合するものが選択される。これによって、細胞特異的に磁気ラベルすることが可能となる。AMLは、例えばJ. Chem. Eng. Jpn.第34巻第66〜72頁（2001年）に記載された方法を参照して調製すればよい。   Other specific examples of cell-adhesive magnetic particles include antibody-immobilized magnetite liposomes (AML) obtained by binding an antibody to the MCL liposome surface. AML has a structure in which magnetic particles such as magnetite are encapsulated in liposomes, and an antibody is immobilized on the liposomes. An antibody that specifically binds to the target cell of the magnetic label is selected. This makes it possible to perform magnetic labeling in a cell-specific manner. AML may be prepared with reference to the method described in, for example, J. Chem. Eng. Jpn. 34, 66-72 (2001).

ステップ(2)（培養容器の用意）
このステップでは、細胞外マトリックス成分を含有する第１マトリックス材料で培養面がコート（被覆）された培養容器を用意する。細胞外マトリックス成分の例としてコラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニンを挙げることができるが、好ましくはコラーゲンを採用する。コラーゲンの中でも、間質の主要構成成分であるＩ型コラーゲンを採用することが特に好ましい。Ｉ型コラーゲンを採用すれば、生体の間質を模倣したマトリックス材料となり、がん細胞の挙動評価に特に適したモデルを構築できる。また、生体から分離した細胞外マトリックスを細胞外マトリックス成分として用いることもできる。尚、市販のマトリックス材料（例えばマトリゲル（Becton Dickinsonの登録商標））を用いて第１マトリックス材料を調製してもよい。 Step (2) (preparation of culture vessel)
In this step, a culture vessel whose culture surface is coated (coated) with a first matrix material containing an extracellular matrix component is prepared. Examples of extracellular matrix components include collagen, proteoglycan, fibronectin, and laminin, but preferably collagen is employed. Among collagens, it is particularly preferable to employ type I collagen, which is a main constituent of the stroma. If type I collagen is employed, it becomes a matrix material that mimics the interstitium of the living body, and a model particularly suitable for evaluating the behavior of cancer cells can be constructed. Moreover, the extracellular matrix isolate | separated from the biological body can also be used as an extracellular matrix component. The first matrix material may be prepared using a commercially available matrix material (for example, Matrigel (registered trademark of Becton Dickinson)).

２種類以上の細胞外マトリックス成分を併用することもできる。例えば、Ｉ型コラーゲンとプロテオグリカンやフィブロネクチンなどを併用すれば、生体内の間質に一層近似したマトリックス材料を構成できる。   Two or more types of extracellular matrix components can be used in combination. For example, if type I collagen is used in combination with proteoglycan, fibronectin, or the like, a matrix material that more closely resembles the interstitium in the living body can be constructed.

好ましい一態様では、第１マトリックス材料が、ステップ(1)で磁気ラベルした細胞集団の生存、維持に必要な培地を含有する。培地は、細胞集団に応じて適宜選択又は調製すればよい。培地の例を挙げると、ダルベッコ変法イーグル（DMEM）培地（ナカライテスク株式会社、シグマ社、ギブコ社等）、RPMI 1640培地（ナカライテスク株式会社、シグマ社、ギブコ社等）、SmGM培地（CAMBREX社）、SmGM-2培地（CAMBREX社）である。血清、ビタミン、無機塩、抗生物質、成長因子などを培地に添加してもよい。尚、第１マトリックス材料内で適切な濃度になるよう、濃縮した培地を用いるとよい。   In a preferred embodiment, the first matrix material contains a medium necessary for the survival and maintenance of the cell population magnetically labeled in step (1). The medium may be appropriately selected or prepared according to the cell population. Examples of the medium include Dulbecco's modified Eagle (DMEM) medium (Nacalai Tesque, Sigma, Gibco, etc.), RPMI 1640 medium (Nacalai Tesque, Sigma, Gibco, etc.), SmGM medium (CAMBREX SmGM-2 medium (CAMBREX). Serum, vitamins, inorganic salts, antibiotics, growth factors and the like may be added to the medium. In addition, it is good to use the concentrated culture medium so that it may become a suitable density | concentration within 1st matrix material.

培養面の形態は特に限定されない。但し、培養面が平坦であることが好ましい。後続のステップ(3)において細胞集団が２次元アレイ状パターンで配列し、その結果、細胞集団の挙動を二次元的観察（例えば光学顕微鏡下での観察）によって評価することが可能な評価モデルが構築されるからである。   The form of the culture surface is not particularly limited. However, the culture surface is preferably flat. In the subsequent step (3), the cell population is arranged in a two-dimensional array pattern, and as a result, there is an evaluation model that can evaluate the behavior of the cell population by two-dimensional observation (for example, observation under an optical microscope). Because it is built.

第１マトリックス材料による培養面のコートは、典型的には次の方法で行う。即ち、液状の第１マトリックス材料を培養面に滴下、塗布等した後、ゲル化させる。ゲル化の条件は使用する材料に合わせて設定すればよい。例えば、コラーゲンを含む第１マトリックス材料を用いた場合には、通常、昇温によってゲル化させる。   The culture surface is typically coated with the first matrix material in the following manner. That is, after a liquid first matrix material is dropped and applied on the culture surface, it is gelled. The gelation conditions may be set according to the material to be used. For example, when a first matrix material containing collagen is used, it is usually gelled by increasing the temperature.

培養面に形成する第１マトリックス材料の層の厚さは、後続のステップ(3)における細胞集団のパターニングに支障のない限り特に限定されない。換言すれば、パターニングに必要な磁力が細胞集団に印加される状態を形成できる限り、当該層の厚さは任意である。例えば、当該層の厚さを50μm〜150μmとする。   The thickness of the layer of the first matrix material formed on the culture surface is not particularly limited as long as it does not hinder the patterning of the cell population in the subsequent step (3). In other words, the thickness of the layer is arbitrary as long as a magnetic force necessary for patterning can be applied to the cell population. For example, the thickness of the layer is 50 μm to 150 μm.

様々な培養容器を利用可能である。培養容器の一例は培養皿（ペトリ皿）である。複数の培養容器を用い、同時に二つ以上の評価モデルを構築することにしてもよい。このようにして構築した複数の評価モデルは、例えば、がん細胞の挙動を複数の条件で同時に評価することを可能にする。   Various culture vessels can be used. An example of the culture container is a culture dish (petri dish). Two or more evaluation models may be constructed at the same time using a plurality of culture vessels. The plurality of evaluation models constructed in this way enables, for example, the behavior of cancer cells to be evaluated simultaneously under a plurality of conditions.

ステップ(3)（細胞集団のパターニング）
このステップではまず、磁気ラベルした細胞集団を培養容器に播種する。続いて、播種した細胞に磁力を作用させることによって細胞を所定のパターンに配列させる。本発明において「パターンに配列させる」と「パターンニングする」とは同義であって、細胞を所定の配置態様で並べることをいう。本発明では、「所定のパターン」としてアレイ状パターンを採用する。従って、このステップを実行すると、細胞集団がアレイ状パターンに配列することになる。アレイ状パターンの各スポットに存在する細胞の数は特に限定されない。即ち、１スポットに１個又は複数個の細胞が存在する。ここでの複数個とは例えば２〜１００個である。スフェロイドを形成して増殖するがん細胞を被験がん細胞とした場合には、スフェロイドの形成に必要な数の細胞が各スポットに存在するようにパターニングするとよい。ここでの「必要な数」は、使用するがん細胞によって相違するものの、例えば１０個〜５０個である。尚、播種する細胞数が異なる複数の試験区を設けた予備実験を行えば、特定の被験がん細胞についてスフェロイドの形成に必要な細胞数を容易に決定できる。 Step (3) (Pattern patterning)
In this step, first, a magnetically labeled cell population is seeded in a culture vessel. Subsequently, the cells are arranged in a predetermined pattern by applying a magnetic force to the seeded cells. In the present invention, “arranging in a pattern” and “patterning” are synonymous and refer to arranging cells in a predetermined arrangement. In the present invention, an array pattern is adopted as the “predetermined pattern”. Therefore, when this step is executed, the cell population is arranged in an array pattern. The number of cells present in each spot of the array pattern is not particularly limited. That is, one or more cells exist in one spot. Here, the plurality is, for example, 2 to 100. When cancer cells that form spheroids and proliferate are used as test cancer cells, patterning may be performed so that the number of cells necessary for spheroid formation is present in each spot. The “necessary number” here is, for example, 10 to 50, although it varies depending on the cancer cells to be used. In addition, if the preliminary experiment which provided the some test plot from which the cell number to seed | inoculate differs is performed, the cell number required for formation of a spheroid about a specific test cancer cell can be determined easily.

「アレイ状パターン」とは、多数のスポットが規則的に配列する配列態様のことをいう。スポットの間隔は任意に設定可能である。但し、生体内の環境に近づけるため、また多数の細胞（細胞群）の挙動を同時に把握できるようにするため、好ましくはスポットの間隔を５０μm〜１０００μmにするとよい。このように微細なアレイ状パターンに細胞（細胞群）を配列させると、細胞間相互作用も評価可能なモデルとなる。   An “array pattern” refers to an arrangement in which a large number of spots are regularly arranged. The spot interval can be arbitrarily set. However, the distance between spots is preferably set to 50 μm to 1000 μm in order to approximate the environment in the living body and to be able to grasp the behavior of a large number of cells (cell group) at the same time. When cells (cell groups) are arranged in such a fine array pattern, a model in which cell-cell interaction can also be evaluated.

好ましくは、全体に亘ってスポットの間隔が均一なアレイ状パターンとする。各スポットの細胞（細胞群）を同一の環境下におくためである。このようなアレイ状パターンの具体例は２次元ドットマトリックス状パターンである。２次元ドットマトリックス状パターンでは２次元平面上に多数のスポットがドットマトリックス状に配置される。   Preferably, an array pattern is used in which the interval between spots is uniform throughout. This is because the cells (cell groups) in each spot are placed in the same environment. A specific example of such an array pattern is a two-dimensional dot matrix pattern. In the two-dimensional dot matrix pattern, a large number of spots are arranged in a dot matrix on a two-dimensional plane.

一方、間隔の相違に起因する効果（影響）を調べる目的など、特定の目的に使用する場合には、部分的にスポットの間隔を長く（又は短く）したり、スポットの間隔が特定の方向性で連続的又は段階的に増大（減少）したりするなど、スポットの間隔に変化を付与してもよい。   On the other hand, when used for specific purposes such as the purpose of investigating the effects (effects) caused by the difference in spacing, the spot spacing is partially increased (or shortened), or the spot spacing has a specific directionality. A change may be given to the interval between spots, such as increasing (decreasing) continuously or stepwise.

磁力によるパターニングは例えば次のように行う。即ち、磁気ラベルした細胞集団を播種する培養面の後方に（即ち、培養面の裏面側に）、所定のパターンで磁石を配置することで培養面の一部領域（磁石の配置パターンに対応するパターンとなる領域）を通って二次元的なパターンの磁力を細胞に作用させる。容器として培養皿を使用する場合、典型的には、所定のパターンで配置された磁石の上に培養皿を設置することになる。培養皿の場合は通常、内底面が培養面となるが、容器の種類や形態の如何によっては容器の内底面以外の内壁面が培養面に設定される場合がある。   Patterning by magnetic force is performed as follows, for example. That is, by arranging magnets in a predetermined pattern behind the culture surface on which the magnetically labeled cell population is seeded (that is, on the back side of the culture surface), it corresponds to a partial area of the culture surface (corresponding to the magnet arrangement pattern). A two-dimensional magnetic force is applied to the cell through the pattern area. When using a culture dish as a container, the culture dish is typically installed on a magnet arranged in a predetermined pattern. In the case of a culture dish, the inner bottom surface is usually the culture surface, but depending on the type and form of the container, the inner wall surface other than the inner bottom surface may be set as the culture surface.

パターニングに使用する磁石の種類は特に限定されない。例えば、永久磁石又は電磁石を用いることができる。電磁石を使用すれば、通電状態の操作によって磁力を制御可能である。永久磁石として、鋳造磁石（アルニコ磁石、鉄・クロム・コバルト磁石を含む）、塑性加工磁石（Fe-Mn系、Fe-Cr-Co系を含む）、フェライト磁石（Ba系、Sr系を含む）、希土類磁石（Sm-Co系、Nd-Fe-B系を含む）、ボンド磁石（Sm-Co系、Nd-Fe-B系、Sm-Fe-N系を含む）などを使用することができる。   The type of magnet used for patterning is not particularly limited. For example, a permanent magnet or an electromagnet can be used. If an electromagnet is used, the magnetic force can be controlled by an operation in an energized state. Permanent magnets include cast magnets (including Alnico magnets, iron / chromium / cobalt magnets), plastic working magnets (including Fe-Mn and Fe-Cr-Co systems), ferrite magnets (including Ba and Sr systems) , Rare earth magnets (including Sm-Co system, Nd-Fe-B system), bond magnets (including Sm-Co system, Nd-Fe-B system, Sm-Fe-N system), etc. can be used .

磁力を作用させる時間は、使用する磁石の種類、磁気ラベルに使用する磁性粒子の種類などを考慮して定めればよく、例えば１分〜２時間である。   The time for applying the magnetic force may be determined in consideration of the type of magnet used, the type of magnetic particles used for the magnetic label, and the like, for example, 1 minute to 2 hours.

磁石から放出される磁力を直接利用するのではなく、磁石から放出される磁力を他の部材に伝搬させた後に利用することにしてもよい。例えば、Fe、Co、Ni、Fe-C、Fe-Ni、Fe-Co、Fe-Ni-Co-Al、Fe-Ni-Cr、SmCo5、Nd2Fe14B、Fe3O4、γ-Fe2O3、BaFe12O19等のように磁力を伝搬する特性の部材を磁石に接触又は近接させることにすれば、当該部材の表面（端面など）から磁力を放出させることが可能である。このような構成は、より複雑なパターニング及び／又はより微細ないし精緻なパターニングを行う上で有利である。当該構成に用いられる部材の具体例（剣山状鉄製デバイス）を図２に示す。この剣山状鉄製デバイスは鉄製であり、その上面側には所定の間隔で規則的に多数のピン（支柱）が形成されている。ピンの高さ及び間隔は任意に設定できる。この例ではピンの高さは300μm、間隔は150μm（C）及び600μm（D）である。図２（A)は剣山状鉄製デバイスを利用したパターニング方法を示す。剣山状鉄製デバイスを磁石の上に載置した後（剣山状鉄製デバイスの磁性化）、剣山状鉄製デバイスの上に培養皿を載置する。この状態で所定時間（例えば３０分程度）培養する。尚、ピンの形状、大きさ、間隔、配置態様などを設定・調整することによって、様々なパターンのパターニングが可能となる。 The magnetic force emitted from the magnet may not be used directly, but may be used after propagating the magnetic force emitted from the magnet to another member. For example, Fe, Co, Ni, Fe-C, Fe-Ni, Fe-Co, Fe-Ni-Co-Al, Fe-Ni-Cr, SmCo 5 , Nd 2 Fe 14 B, Fe 3 O 4 , γ- If a member having the property of propagating magnetic force such as Fe 2 O 3 or BaFe 12 O 19 is brought into contact with or close to the magnet, it is possible to release the magnetic force from the surface (end face, etc.) of the member. . Such a configuration is advantageous in performing more complicated patterning and / or finer or more precise patterning. FIG. 2 shows a specific example of a member used for the configuration (device made of sword mountain iron). This sword mountain iron device is made of iron, and a large number of pins (supports) are regularly formed at predetermined intervals on the upper surface side thereof. The height and interval of the pins can be set arbitrarily. In this example, the height of the pins is 300 μm, and the intervals are 150 μm (C) and 600 μm (D). FIG. 2 (A) shows a patterning method using a sword-shaped iron device. After placing the sword mountain iron device on the magnet (magnetization of the sword mountain iron device), the culture dish is placed on the sword mountain iron device. In this state, the cells are cultured for a predetermined time (for example, about 30 minutes). Various patterns can be patterned by setting and adjusting the shape, size, interval, arrangement, and the like of the pins.

ステップ(4)（マトリックス材料への包埋）
ステップ(3)に続くステップ(4)では、磁力を作用させた状態を維持しつつ、細胞外マトリックス成分及び培地を含有する液状の第２マトリックス材料を培養容器に添加することによって、ステップ(3)で配列した細胞集団を当該第２マトリックス材料に包埋する。これによって、各スポットの細胞がマトリックス材料（一面側は第１マトリックス材料、その他は第２マトリックス材料）で包囲された状態となる。第２マトリックス材料に細胞集団が包埋された状態が形成される限り、第２マトリックス材料の使用量（換言すれば第２マトリックス材料が形成する層の厚さ）は特に限定されない。例えば、深さ０．１mm〜５mmの位置に細胞が包埋されるように、第２マトリックス材料の使用量を設定する。 Step (4) (embedding in matrix material)
In step (4) following step (3), a liquid second matrix material containing an extracellular matrix component and a medium is added to the culture vessel while maintaining a state in which a magnetic force is applied. ) Is embedded in the second matrix material. As a result, the cells of each spot are surrounded by the matrix material (the first side is the first matrix material and the other is the second matrix material). As long as the cell matrix is embedded in the second matrix material, the amount of the second matrix material used (in other words, the thickness of the layer formed by the second matrix material) is not particularly limited. For example, the usage amount of the second matrix material is set so that cells are embedded at a depth of 0.1 mm to 5 mm.

ステップ(3)で形成した細胞のパターンを崩さないため、第２マトリックス材料に細胞集団が完全に包埋されるまで磁力を作用させた状態を維持することが好ましい。第２マトリックス材料の流動性が高いがために細胞のパターンが崩れるおそれのある場合には、細胞集団が完全に包埋された後においても引き続き磁力を作用させておくことが好ましい（例えば、ゲル化の途中又はゲル化が完了するまで磁力を作用させる）。   In order not to destroy the cell pattern formed in step (3), it is preferable to maintain a state in which a magnetic force is applied until the cell population is completely embedded in the second matrix material. If the cell pattern is likely to collapse due to the high fluidity of the second matrix material, it is preferable to continue to apply magnetic force even after the cell population is completely embedded (eg, gel The magnetic force is applied in the middle of the formation or until the gelation is completed).

ステップ(4)には液状に調製した第２マトリックス材料を使用する。第２マトリックス材料は細胞外マトリックス成分と培地を含有する。ここでの「細胞外マトリックス成分」の例はコラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニンである。第１マトリックス材料の場合と同様の理由から、好ましくはコラーゲンを採用し、特に好ましくはＩ型コラーゲンを採用する。また、生体から分離した細胞外マトリックスを細胞外マトリックス成分として用いることもできる。市販のマトリックス材料（例えばマトリゲル（Becton Dickinsonの登録商標））を用いて第２マトリックス材料を調製してもよい。第１マトリックス材料の場合と同様に、２種類以上の細胞外マトリックス成分を併用してもよい。   In step (4), the second matrix material prepared in liquid form is used. The second matrix material contains an extracellular matrix component and a medium. Examples of “extracellular matrix components” here are collagen, proteoglycan, fibronectin and laminin. For the same reason as in the case of the first matrix material, collagen is preferably used, and type I collagen is particularly preferably used. Moreover, the extracellular matrix isolate | separated from the biological body can also be used as an extracellular matrix component. A second matrix material may be prepared using a commercially available matrix material (eg, Matrigel (registered trademark of Becton Dickinson)). As in the case of the first matrix material, two or more kinds of extracellular matrix components may be used in combination.

好ましくは第１マトリックス材料に使用した細胞外マトリックス成分と同種の細胞外マトリックス成分を用いて第２マトリックス材料を調製する。特定の細胞外マトリックスに包囲された環境でのがん細胞の挙動を評価することに適した「がん細胞挙動評価モデル」を構築できるからである。更に好ましくは、第１マトリックス材料と第２マトリックス材料を同一の組成とする。   Preferably, the second matrix material is prepared using the same kind of extracellular matrix component as that used for the first matrix material. This is because it is possible to construct a “cancer cell behavior evaluation model” suitable for evaluating the behavior of cancer cells in an environment surrounded by a specific extracellular matrix. More preferably, the first matrix material and the second matrix material have the same composition.

第２マトリックス材料は細胞集団の生存、維持に必要な培地を含有する。培地は、細胞集団に応じて適宜選択又は調製すればよい。培地の例を挙げると、ダルベッコ変法イーグル（DMEM）培地（ナカライテスク株式会社、シグマ社、ギブコ社等）、RPMI 1640培地（ナカライテスク株式会社、シグマ社、ギブコ社等）、SmGM培地（CAMBREX社）、である。血清、ビタミン、無機塩、抗生物質、成長因子などを培地に添加してもよい。尚、第２マトリックス材料内で適切な濃度になるよう、濃縮した培地を用いるとよい。   The second matrix material contains a medium necessary for the survival and maintenance of the cell population. The medium may be appropriately selected or prepared according to the cell population. Examples of the medium include Dulbecco's modified Eagle (DMEM) medium (Nacalai Tesque, Sigma, Gibco, etc.), RPMI 1640 medium (Nacalai Tesque, Sigma, Gibco, etc.), SmGM medium (CAMBREX Company). Serum, vitamins, inorganic salts, antibiotics, growth factors and the like may be added to the medium. In addition, it is good to use the concentrated culture medium so that it may become a suitable density | concentration within 2nd matrix material.

第２マトリックス材料に細胞を含有させることもできる。ここでの「細胞」は、ステップ(1)で磁気ラベルに供する細胞集団と異なる細胞である。例えば、線維芽細胞（ヒト線維芽細胞、マウス線維芽細胞など）、リンパ球、マクロファージ、上皮細胞、内皮細胞を用いることができる。好ましくは、生体内において被験がん細胞と相互作用すると考えられる細胞、例えば間質を構成する線維芽細胞、リンパ球、マクロファージ等を用いる。２種類以上の細胞を併用してもよい。   Cells can also be included in the second matrix material. The “cell” here is a cell different from the cell population subjected to the magnetic label in step (1). For example, fibroblasts (human fibroblasts, mouse fibroblasts, etc.), lymphocytes, macrophages, epithelial cells, and endothelial cells can be used. Preferably, cells that are considered to interact with the test cancer cell in vivo, for example, fibroblasts, lymphocytes, macrophages, etc. constituting the stroma are used. Two or more types of cells may be used in combination.

細胞を含有しない第２マトリックス材料（細胞非含有第２マトリックス材料）と、細胞を含有する第２マトリックス材料（細胞含有第２マトリックス材料）を併用することもできる。この場合には例えば、細胞含有第２マトリックス材料による包埋を行った後、細胞非含有第２マトリックス材料を添加、積層する。或いは、これとは逆に細胞非含有第２マトリックス材料による包埋を行った後、細胞含有第２マトリックス材料を添加、積層する。このように２種類の第２マトリックス材料を併用すると、第２マトリックス材料による層が２層形成されることになる。特定の細胞を含む第２マトリックス材料と、当該細胞と異なる細胞を含む第２マトリックス材料を併用することもできる。尚、ここでは一例として２種類の第２マトリックス材料を併用する態様を説明したが、３種類以上の第２マトリックス材料を併用することも可能である。   A second matrix material not containing cells (cell-free second matrix material) and a second matrix material containing cells (cell-containing second matrix material) can also be used in combination. In this case, for example, after embedding with the cell-containing second matrix material, the cell-free second matrix material is added and laminated. Or conversely, after embedding with the cell-free second matrix material, the cell-containing second matrix material is added and laminated. When two types of second matrix materials are used in combination, two layers of the second matrix material are formed. A second matrix material containing specific cells and a second matrix material containing cells different from the cells can be used in combination. In addition, although the aspect which uses together 2 types of 2nd matrix materials was demonstrated as an example here, it is also possible to use together 3 or more types of 2nd matrix materials.

ステップ(5)（マトリックス材料のゲル化）
ステップ(4)に続くステップ(5)では、第２マトリックス材料をゲル化させる。使用する第２マトリックス材料の特性に合わせてゲル化条件を設定すればよい。例えば、コラーゲンを含む第２マトリックス材料を用いた場合には、昇温によってゲル化させる。 Step (5) (gelation of matrix material)
In step (5) following step (4), the second matrix material is gelled. What is necessary is just to set gelling conditions according to the characteristic of the 2nd matrix material to be used. For example, when a second matrix material containing collagen is used, it is gelled by increasing the temperature.

以上の各ステップを実行して構築されるがん細胞挙動評価モデルは、被験がん細胞を含む細胞集団が第１マトリックス材料の層の上で所定のパターンで配列するとともに、第１マトリックス材料の層に接する側を除き、第２マトリックス材料で包囲された構造を備える。これに対して本発明の一態様では、以下のステップ、即ち(i)被験がん細胞を含む細胞集団を磁気ラベルするステップ；(ii)培養面に細胞層が形成された培養容器を用意するステップ；(iii)磁気ラベルした前記細胞集団を前記培養容器に播種した後、磁力を作用させることによって、１スポットに１個又は複数個の細胞が存在するアレイ状パターンに前記細胞集団を配列させるステップ；(iv)磁力を作用させた状態を維持しつつ、細胞外マトリックス成分及び培地を含有する液状のマトリックス材料を前記培養容器に添加することによって、ステップ(iii)で配列した前記細胞集団を該マトリックス材料に包埋するステップ；(v)前記マトリックス材料をゲル化させるステップ、を実行することによって、被験がん細胞を含む細胞集団が、第１マトリックス材料の層ではなく細胞層の上で所定のパターンで配列した構造を作り出す。以下、当該態様に特徴的なステップ(ii)を説明する。尚、ステップ(i)は上記ステップ(1)と、ステップ(iii)は上記ステップ(3)と、ステップ(iv)は上記ステップ(4)と、ステップ(v)は上記ステップ(5)と実質的に同一であるため、その説明を省略する。   The cancer cell behavior evaluation model constructed by executing the above steps includes a cell population containing test cancer cells arranged in a predetermined pattern on a layer of the first matrix material, A structure surrounded by a second matrix material is provided except for the side in contact with the layer. In contrast, in one embodiment of the present invention, the following steps are performed: (i) a step of magnetically labeling a cell population containing a test cancer cell; (ii) a culture container having a cell layer formed on a culture surface is prepared. Step (iii) After the magnetically labeled cell population is seeded in the culture vessel, the cell population is arranged in an array pattern in which one or a plurality of cells are present in one spot by applying a magnetic force. Step (iv) adding the liquid matrix material containing the extracellular matrix component and the medium to the culture vessel while maintaining the state in which the magnetic force is applied to the cell population arranged in step (iii) Embedding in the matrix material; (v) allowing the matrix material to gel, so that the cell population containing the test cancer cells is transformed into the first matrix. In the layer of the scan material not produce structures which are arranged in a predetermined pattern on the cell layer. Hereinafter, step (ii) characteristic of this aspect will be described. Note that step (i) is substantially the same as step (1), step (iii) is the above step (3), step (iv) is the above step (4), and step (v) is substantially the same as step (5). The description is omitted because they are identical.

ステップ(ii)は、培養面に細胞層が形成された培養容器を用意するステップである。例えば、培養容器に細胞を播種し、そして培養することによって培養面に細胞層を形成する。組織片培養（エクスプラント法）によって培養面に細胞層を形成することもできる。また、がん細胞挙動評価モデルの構築に直接用いる培養容器内で細胞層を形成するのではなく、予め用意しておいた細胞層（細胞シート）を用いることにしてもよい。この場合、細胞層（細胞シート）を培養面に移植することになる。   Step (ii) is a step of preparing a culture vessel having a cell layer formed on the culture surface. For example, a cell layer is formed on the culture surface by seeding and culturing cells in a culture vessel. A cell layer can also be formed on the culture surface by tissue piece culture (explant method). Further, instead of forming a cell layer in a culture vessel directly used for construction of a cancer cell behavior evaluation model, a cell layer (cell sheet) prepared in advance may be used. In this case, the cell layer (cell sheet) is transplanted to the culture surface.

細胞層を構成する細胞は特に限定されない。採用可能な細胞を例示すると、線維芽細胞（ヒト線維芽細胞、マウス線維芽細胞など）、リンパ球、マクロファージ、上皮細胞、内皮細胞である。好ましくは、生体内において被験がん細胞と相互作用すると考えられる細胞、例えば間質を構成する線維芽細胞、リンパ球、マクロファージ等を用いる。２種類以上の細胞で細胞層を構成してもよい。また、細胞層を２層以上形成することにしてもよい。   The cells constituting the cell layer are not particularly limited. Examples of cells that can be employed are fibroblasts (human fibroblasts, mouse fibroblasts, etc.), lymphocytes, macrophages, epithelial cells, and endothelial cells. Preferably, cells that are considered to interact with the test cancer cell in vivo, for example, fibroblasts, lymphocytes, macrophages, etc. constituting the stroma are used. The cell layer may be composed of two or more types of cells. Further, two or more cell layers may be formed.

本発明のがん細胞挙動評価モデルは、がん細胞の挙動を評価するためのツールとして利用される。利用態様の一つでは、がん細胞挙動評価モデルを培養に供し、各スポットの細胞の挙動を評価する。別の利用態様では、被験物質の存在下でのがん細胞の挙動を評価する。当該態様の場合、がん細胞挙動評価モデルを構築した後又は構築する際に被験物質を添加する。前者の場合はゲル化した第２マトリックス材料に対して被験物質を添加する。他方、後者の場合は被験物質を含有した第２マトリックス材料を用意して上記ステップ(4)及び(5)を実行することになる（第１マトリックス材料にも被験物質を添加することにしてもよい）。   The cancer cell behavior evaluation model of the present invention is used as a tool for evaluating the behavior of cancer cells. In one of the utilization modes, the cancer cell behavior evaluation model is subjected to culture, and the behavior of cells at each spot is evaluated. In another utilization mode, the behavior of cancer cells in the presence of the test substance is evaluated. In the case of this embodiment, a test substance is added after or when the cancer cell behavior evaluation model is constructed. In the former case, the test substance is added to the gelled second matrix material. On the other hand, in the latter case, the second matrix material containing the test substance is prepared and the above steps (4) and (5) are executed (the test substance is also added to the first matrix material). Good).

被験物質には様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ホルモン、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等）等を例示できる。被験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的な評価系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清などを被験物質として用いてもよい。また、既存の薬剤を被験物質としてもよい。   As the test substance, organic compounds or inorganic compounds having various molecular sizes can be used. Examples of organic compounds include nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphoglycerides, sphingolipids, glycosylglycerides, cerebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, hormones, polyphenols, catechins, vitamins (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E, etc.) etc. The test substance may be derived from natural products or synthesized. In the latter case, an efficient evaluation system can be constructed using, for example, a combinatorial synthesis method, and cell extracts, culture supernatants, etc. may be used as test substances. These drugs may be used as test substances.

（がん細胞挙動評価モデルの用途）
以上の説明から分かるように、本発明のがん細胞挙動評価モデルを利用すれば、被験がん細胞に対する物質の有効性を評価することができる。そこで本発明の第２の局面は、本発明のがん細胞挙動評価モデルを用いて被験がん細胞に対する被験物質の有効性を調べることを特徴とする、被験がん細胞に対する物質の有効性を評価する方法（以下、「本発明の評価法」と略称する）を提供する。以下、本発明の評価法について、がん細胞挙動評価モデルを構築した後に被験物質を添加する場合と、がん細胞挙動評価モデルを構築する際に被験物質を添加する場合に分けて説明する。 (Use of cancer cell behavior evaluation model)
As can be seen from the above description, the use of the cancer cell behavior evaluation model of the present invention makes it possible to evaluate the effectiveness of substances against test cancer cells. Therefore, the second aspect of the present invention is to examine the effectiveness of a substance against a test cancer cell, characterized by examining the effectiveness of the test substance against a test cancer cell using the cancer cell behavior evaluation model of the present invention. A method of evaluation (hereinafter abbreviated as “evaluation method of the present invention”) is provided. Hereinafter, the evaluation method of the present invention will be described separately when a test substance is added after the cancer cell behavior evaluation model is constructed and when a test substance is added when the cancer cell behavior evaluation model is constructed.

（１）がん細胞挙動評価モデルを構築した後に被験物質を添加する評価法
この態様ではまず、構築したがん細胞挙動評価モデルに被験物質を添加した後、培養する（ステップ(a)）。具体的には、被験物質又は被験物質を含む溶液を用意し、これをゲル化した第２マトリックス材料の上に滴下又は塗布等した後、培養に供する。被験物質を２回以上添加することにしてもよい。その際には、各回の添加量は同一でなくてもよい。培養条件は目的に応じて適宜設定すればよい。典型的には被験がん細胞の生存、増殖に適した培養条件に設定する。具体例を示すと、37℃前後の温度条件下、5%CO2インキュベータで培養する。低酸素条件（例えば1%O2）で培養することもできる。 (1) Evaluation method of adding test substance after construction of cancer cell behavior evaluation model In this embodiment, first, a test substance is added to the constructed cancer cell behavior evaluation model and then cultured (step (a)). Specifically, a test substance or a solution containing the test substance is prepared, and this is dropped or applied onto the gelled second matrix material and then subjected to culture. The test substance may be added twice or more. In that case, the addition amount of each time does not need to be the same. Culture conditions may be set as appropriate according to the purpose. Typically, it is set to culture conditions suitable for the survival and proliferation of the test cancer cells. As a specific example, the cells are cultured in a 5% CO 2 incubator under a temperature condition of around 37 ° C. It can also be cultured under hypoxic conditions (eg 1% O 2 ).

ステップ(a)の後、細胞の挙動を観察し、被験がん細胞に対する被験物質の有効性を判定する（ステップ(b)）。例えば、培養開始から所定時間経過した後に細胞を光学顕微鏡下で観察し、細胞数や細胞の形態などを指標として被験物質の有効性を判定する。観察手段は光学顕微鏡に限られるものではなく、セルウオッチャー（Corefront Co.）、その他の顕微システム等を用いることもできる。判定のための指標についても、細胞数や細胞の形態に限られるものではない。採用可能な指標を例示すると、細胞数（スポットあたりの平均又は総数）、細胞の形態、細胞の大きさ、細胞の長さ、スフェロイドの大きさ、細胞の広がり（浸潤）の程度、移動距離である。   After step (a), the behavior of the cell is observed to determine the effectiveness of the test substance against the test cancer cell (step (b)). For example, after elapse of a predetermined time from the start of culture, the cells are observed under an optical microscope, and the effectiveness of the test substance is determined using the number of cells, cell morphology, etc. as an index. The observation means is not limited to the optical microscope, and a cell watcher (Corefront Co.), other microscopic systems, and the like can also be used. The index for determination is not limited to the number of cells or the form of cells. Examples of indexes that can be adopted include the number of cells (average or total number per spot), cell morphology, cell size, cell length, spheroid size, extent of cell spread (invasion), and movement distance. is there.

基準（対照）との比較によって被験物質の有効性を判定することが好ましい。基準として、培養開始時の観察結果、被験物質を添加しないで培養した場合の観察結果、及び被験がん細胞に有効な特定の物質を添加して培養した場合の観察結果からなる群より選択されるいずれかを用いることができる。二つ以上の基準を併用してもよい。前２者はいわゆる陰性対照（ネガティブ・コントロール）となる。このような陰性対照との比較に基づき判定すれば、判定結果の客観性、信頼性、正確性等が向上する。一方、後者（被験がん細胞に有効な特定の物質を添加して培養した場合の観察結果）は、いわゆる陽性対照（ポジティブ・コントロール）となる。陽性対照を用いることによって、特定の物質の有効性を基準に被験物質の有効性を判定することが可能となる。   It is preferable to determine the effectiveness of the test substance by comparison with a reference (control). As a reference, selected from the group consisting of observation results at the start of culture, observation results when cultured without adding the test substance, and observation results when cultured with the addition of a specific substance effective to the test cancer cells Any of these can be used. Two or more criteria may be used in combination. The former two serve as so-called negative controls. If the determination is made based on comparison with such a negative control, the objectivity, reliability, accuracy, etc. of the determination result are improved. On the other hand, the latter (observation result when a specific substance effective to the test cancer cell is added and cultured) serves as a so-called positive control (positive control). By using a positive control, it becomes possible to determine the effectiveness of a test substance based on the effectiveness of a specific substance.

被験がん細胞に有効な特定の物質についてその添加濃度（存在量）と観察結果との関係を予め求めておき、これに対して被験物質の観察結果を比較することにしてもよい。被験がん細胞に有効な特定の物質の添加濃度と観察結果との関係は検量線として、或いは表形式等で与えられる。   For a specific substance effective for the test cancer cell, the relationship between the added concentration (abundance) and the observation result may be obtained in advance, and the observation result of the test substance may be compared with this. The relationship between the addition concentration of a specific substance effective for the test cancer cell and the observation result is given as a calibration curve or in tabular form.

細胞の挙動の観察を経時的に行い、培養開始からの経過時間の異なる複数の観察結果を得ることにしてもよい。この場合には、得られた複数の観察結果に基づき被験物質の有効性を判定する。このような経時的な観察及び判定によれば、被験物質の作用に関して有益な多くの情報（例えば持続時間や、作用メカニズムの理解に役立つ情報）を得ることができる。細胞の挙動の観察をリアルタイムに行うようにしてもよい。   Cell behavior may be observed over time, and a plurality of observation results having different elapsed times from the start of culture may be obtained. In this case, the effectiveness of the test substance is determined based on the obtained observation results. According to such observation and determination over time, a lot of useful information regarding the action of the test substance (for example, information useful for understanding the duration and action mechanism) can be obtained. Observation of cell behavior may be performed in real time.

一方、被験物質の添加濃度が異なる複数の試験群を設定してステップ(a)を行うことにしてもよい。この場合、ステップ(b)では各試験群の観察結果を比較して被験物質の有効性を判定する。このようにすれば、例えば濃度依存性など、被験物質の有効性に関してより詳細な情報を得ることができる。   On the other hand, step (a) may be performed by setting a plurality of test groups having different test substance addition concentrations. In this case, in step (b), the observation results of the test groups are compared to determine the effectiveness of the test substance. In this way, more detailed information on the effectiveness of the test substance, such as concentration dependence, can be obtained.

この態様の評価法によれば１種類のがん細胞挙動評価モデルを用いて様々な被験物質の有効性を判定することができる（がん細胞挙動評価モデルに注目すると、汎用性の高いモデルであるといえる）。従って、複数の被験物質の有効性を同時に判定する場合に特に有効である。   According to the evaluation method of this aspect, the effectiveness of various test substances can be determined using one type of cancer cell behavior evaluation model. It can be said). Therefore, it is particularly effective when simultaneously determining the effectiveness of a plurality of test substances.

（２）がん細胞挙動評価モデルを構築する際に被験物質を添加する評価法
当該態様では第２マトリックス材料に被験物質が既に添加されている。従って、原則、被験物質を改めて添加することなく、構築したがん細胞挙動評価モデルを培養に供する（ステップ(A)）。続いて、細胞の挙動を観察し、被験がん細胞に対する被験物質の有効性を判定する（ステップ(B)）。このステップ（B)は上記ステップ(b)と実質的に同一であるため、その説明を省略する。尚、この態様においては、基準（対象）として、培養開始時の観察結果、被験物質を添加しない第２マトリックス材料を用いて構築したがん細胞挙動評価モデルを同一条件で培養して得た観察結果、及び被験がん細胞に有効な特定の物質を添加した第２マトリックス材料を用いて構築したがん細胞挙動評価モデルを同一条件で培養して得た観察結果からなる群より選択される一又は二以上の観察結果を用いることができる。 (2) Evaluation method for adding test substance when constructing cancer cell behavior evaluation model In this aspect, the test substance is already added to the second matrix material. Therefore, in principle, the constructed cancer cell behavior evaluation model is subjected to culture without adding a test substance anew (step (A)). Subsequently, the behavior of the cell is observed to determine the effectiveness of the test substance against the test cancer cell (step (B)). Since this step (B) is substantially the same as the above step (b), its description is omitted. In this embodiment, as a reference (subject), an observation result obtained by culturing a cancer cell behavior evaluation model constructed using the second matrix material without addition of a test substance under the same conditions as an observation result at the start of culture. One selected from the group consisting of the results and observation results obtained by culturing the cancer cell behavior evaluation model constructed using the second matrix material added with a specific substance effective for the test cancer cell under the same conditions Alternatively, two or more observation results can be used.

１．３次元（3D）磁気細胞パターニング法の開発
本発明者らの研究グループは、磁性ナノ粒子であるマグネタイトをリポソームで包埋した磁性粒子封入正電荷リポソーム（MCL）と剣山状鉄製デバイスを使用し、磁気ラベルした細胞をアレイ状にパターニングする磁気細胞パターニング法を開発したことを報告するとともに、当該方法を適用することによってマウス線維芽細胞（3T3）の細胞アレイ作製に成功したことを示した（上掲の非特許文献１）。今回、この磁気細胞パターニング法を基に、細胞外マトリックス成分を包含する3次元（3D）ゲル中に2次元（2D）細胞アレイパターニングを行うという新しい手法（「3D磁気細胞パターニング法」と呼ぶ）を開発した。3D磁気細胞パターニング法（一例）を図1に示す。3D磁気細胞パターニング法ではまず、MCLを細胞に添加し、細胞を磁気ラベル化する（例えば１分〜５時間の培養）。次に、磁気ラベルした細胞を培養皿からトリプシン処理等により剥離する。次に、剣山状鉄製デバイスをネオジ磁石（0.8テスラ）の上に配置し、磁力線をピン（支柱）の上に集中させ、その剣山状鉄製デバイスの上に、培養面を細胞外マトリックスゲル（第１マトリックス材料）でコートした培養皿を配置し、磁気ラベルした細胞を培養皿に播種する。これにより一面に2D細胞アレイパターニングを行う。その後、上から培養皿に液状のマトリックス材料（第２マトリックス材料）を加え、そしてゲル化させることにより、細胞外マトリックスゲルで3次元的に細胞を包んだ3D培養モデルを完成させる。 Development of 1.3-dimensional (3D) magnetic cell patterning method Our research group uses magnetic particle-encapsulated positively charged liposomes (MCL) in which magnetite, which is a magnetic nanoparticle, is embedded in liposomes and a sword-shaped iron device. In addition, we have reported that we have developed a magnetic cell patterning method for patterning magnetically labeled cells in an array, and demonstrated that we have succeeded in producing mouse fibroblast (3T3) cell arrays by applying this method. (Non-Patent Document 1 described above). This time, based on this magnetic cell patterning method, a new method of performing two-dimensional (2D) cell array patterning in a three-dimensional (3D) gel containing extracellular matrix components (referred to as "3D magnetic cell patterning method") Developed. A 3D magnetic cell patterning method (an example) is shown in FIG. In the 3D magnetic cell patterning method, first, MCL is added to cells, and the cells are magnetically labeled (for example, culture for 1 minute to 5 hours). Next, the magnetically labeled cells are detached from the culture dish by trypsin treatment or the like. Next, the sword-shaped iron device is placed on a neodymium magnet (0.8 Tesla), the magnetic field lines are concentrated on the pins (posts), and the culture surface is placed on the extracellular matrix gel (No. Culture dish coated with 1 matrix material) and seed the magnetically labeled cells in the culture dish. This performs 2D cell array patterning on one side. Thereafter, a liquid matrix material (second matrix material) is added to the culture dish from above and gelled to complete a 3D culture model in which cells are three-dimensionally wrapped with an extracellular matrix gel.

この例ではMCLとして、マグネタイト（粒径約10nmのFe3O4）を封入したカチオニックリポソーム（約150nm）を用いた。また、第１マトリックス材料と第２マトリックス材料を同一とし、Ｉ型コラーゲン（新田ゼラチン社）、５倍濃縮（x5）DMEM（ギブコ社）及びリン酸バッファーを重量比（w/v）で７：２：１となるように混合したものを使用した。冷却した第１マトリックス材料を培養皿の培養面に滴下、伸展させた後、昇温（３７℃）してゲル化させることによって、細胞外マトリックスゲルでコートされた培養面（コート厚100μm）を得た。 In this example, a cationic liposome (about 150 nm) encapsulating magnetite (Fe 3 O 4 having a particle size of about 10 nm) was used as MCL. In addition, the first matrix material and the second matrix material are the same, and type I collagen (Nitta Gelatin Co., Ltd.), 5-fold concentrated (x5) DMEM (Gibco Co., Ltd.) and phosphate buffer are used in a weight ratio (w / v) of 7 : A mixture of 2: 1 was used. After the cooled first matrix material is dropped on the culture surface of the culture dish and extended, the culture surface coated with the extracellular matrix gel (coat thickness 100 μm) is gelled by raising the temperature (37 ° C.). Obtained.

一方、剣山状鉄製デバイスは上面側に所定の間隔で規則的に多数のピン（支柱）が形成されたものである（図２）。特に言及しない限り、以降の実験には、ピンの高さ300μm、ピンの間隔150μmの剣山状鉄製デバイスを使用した。   On the other hand, the Kenyama iron device has a large number of pins (supports) regularly formed at predetermined intervals on the upper surface side (FIG. 2). Unless otherwise stated, the following experiments used a sword-shaped iron device with pin heights of 300 μm and pin spacing of 150 μm.

（１）マウス胚由来線維芽細胞(BALB/3T3)を用いた評価モデルの構築
マウス胚由来線維芽細胞(BALB/3T3)（理研Cell bank）を用いて3D磁気細胞パターニング法を実施した。その結果、3Dゲル中に2D細胞アレイパターニングすることに成功した（図３）。即ち、パターニング後の細胞挙動を生体環境に近い3D培養下で観察でき且つ多サンプルを同時に2Dで評価することが可能な評価モデルの構築に成功した。構築した評価モデルを培養し、経時変化を観察した。その結果、時間の経過とともに細胞が増殖、伸展する様子が確認された（図４）。 (1) Construction of evaluation model using mouse embryo-derived fibroblasts (BALB / 3T3) 3D magnetic cell patterning was performed using mouse embryo-derived fibroblasts (BALB / 3T3) (RIKEN Cell bank). As a result, 2D cell array patterning was succeeded in 3D gel (FIG. 3). That is, we succeeded in building an evaluation model that can observe the cell behavior after patterning in 3D culture close to the biological environment and can simultaneously evaluate multiple samples in 2D. The constructed evaluation model was cultured, and changes with time were observed. As a result, it was confirmed that the cells proliferated and spread over time (FIG. 4).

２．３次元（3D）がん細胞挙動評価モデルの構築及び評価
（１）がん遺伝子v-srcを導入した細胞を用いた評価モデル
がん化細胞を用いて3D磁気細胞パターニング法を実施し、3Dがん細胞挙動評価モデルを構築した。まず、がん遺伝子v-srcをpBabepuroにクローニングした後、BALB/3T3（理研Cell bank）に常法で導入した。このようにして調製したBALB/3T3/v-srcとBALB/3T3（無処理の細胞）をそれぞれ用い、3D磁気細胞パターニング法を実施した。播種細胞数は2.0×105個、取り込ませたMCL量は100pg/細胞、MCLを取り込ませるための培養時間は4時間、剣山状鉄製デバイスのピン間隔は150μm、ゲルコートの厚さは100μmとした。構築した２種類の3Dがん細胞挙動評価モデル（BALB/3T3/v-srcが2D細胞アレイパターニングされたモデル、及びBALB/3T3が2D細胞アレイパターニングされたモデル）を培養（37℃、5%CO2）に供し、細胞の挙動を経時観察した。図５に示す通り、BALB/3T3/v-src（がん細胞）において増殖能・浸潤能の亢進がみられた。このように、３次元環境においてがん細胞の挙動を評価できることが示された。即ち、3D磁気細胞パターニング法によって構築した3Dがん細胞挙動評価モデルが、3次元環境下でがん細胞の挙動を評価するツールとして有用であることが確認された。 2. Construction and evaluation of 3D (3D) cancer cell behavior evaluation model (1) Evaluation model using cells into which oncogene v-src has been introduced 3D magnetic cell patterning using cancerous cells A 3D cancer cell behavior evaluation model was constructed. First, the oncogene v-src was cloned into pBabepuro and then introduced into BALB / 3T3 (RIKEN Cell bank) by a conventional method. A 3D magnetic cell patterning method was performed using BALB / 3T3 / v-src and BALB / 3T3 (untreated cells) prepared as described above. Seeding cell number 2.0 × 10 5 cells, the MCL amount was incorporated 4 hours incubation time for incorporation 100 pg / cell, the MCL, pin spacing of frog-like iron device 150 [mu] m, the thickness of the gel coat was 100μm . Two types of 3D cancer cell behavior evaluation models (BALB / 3T3 / v-src modeled with 2D cell array pattern and BALB / 3T3 modeled with 2D cell array pattern) were cultured (37 ° C, 5% It was subjected to CO 2 ) and the cell behavior was observed over time. As shown in FIG. 5, the BALB / 3T3 / v-src (cancer cells) showed enhanced proliferation ability and invasive ability. Thus, it was shown that the behavior of cancer cells can be evaluated in a three-dimensional environment. That is, it was confirmed that the 3D cancer cell behavior evaluation model constructed by the 3D magnetic cell patterning method is useful as a tool for evaluating the behavior of cancer cells in a three-dimensional environment.

（２）活性型AKT1を導入した細胞を用いた評価モデル
別のがん細胞を用いて3Dがん細胞挙動評価モデルの有用性を確認した。まず、活性型AKT1遺伝子（myr-AKT1）をpQCXIN（クロンテック）にクローニングした後、MCF10A細胞（ヒト上皮細胞、ATCC CRL-10317）に常法で導入した。このようにして調製したMCF10AmyrAKT1とMCF10A（無処理の細胞）をそれぞれ用い、3D磁気細胞パターニング法を実施した。播種細胞数は6.0×105 個、取り込ませたMCL量は100 pg/細胞、MCLを取り込ませるための培養時間は4時間、剣山状鉄製デバイスのピン間隔は150μm、ゲルコートの厚さは100μmとした。 (2) Evaluation model using cells into which activated AKT1 has been introduced The usefulness of the 3D cancer cell behavior evaluation model was confirmed using another cancer cell. First, the active AKT1 gene (myr-AKT1) was cloned into pQCXIN (Clontech) and then introduced into MCF10A cells (human epithelial cells, ATCC CRL-10317) by a conventional method. A 3D magnetic cell patterning method was performed using MCF10AmyrAKT1 and MCF10A (untreated cells) thus prepared. The number of seeded cells was 6.0 × 10 5 , the amount of MCL incorporated was 100 pg / cell, the culture time for incorporating MCL was 4 hours, the pin spacing of the Kenzan iron device was 150 μm, and the gel coat thickness was 100 μm did.

構築した２種類の3Dがん細胞挙動評価モデル（MCF10AmyrAKT1が2D細胞アレイパターニングされたモデル、及びMCF10Aが2D細胞アレイパターニングされたモデル）を培養（37℃、5%CO2）に供し、細胞の挙動を経時観察した。図６に示す通り、いずれの評価モデルにおいても細胞がスフェロイドを形成して増殖する様子が観察された。このように、スフェロイド形成性の細胞の挙動も評価できることが示された。 Two 3D cancer cell behavior evaluation (model MCF10AmyrAKT1 is 2D cell array patterning, and MCF10A is 2D cell array patterned model) model constructed subjected to culturing (37 ° C., 5% CO 2), cells The behavior was observed over time. As shown in FIG. 6, it was observed that the cells formed spheroids and proliferated in any of the evaluation models. Thus, it was shown that the behavior of spheroid-forming cells can also be evaluated.

（３）評価モデルを用いた阻害剤濃度の検討
BALB/3T3 /v-src細胞に対する阻害剤ゲニステイン（Genistein）の作用を確認するため、予備実験としてBALB/3T3 /v-src細胞を播種した培養皿に種々の濃度でゲニステイン（CALBIOCHEM社）を添加し、増殖率を調べた。その際、MCLの毒性の有無を併せて確認するため、MCLを取り込ませた細胞及び取り込ませていない細胞を用意し、両者の増殖率を比較した。尚、ゲニステインは大豆イソフラボンの一種であり、プロテインチロシンキナーゼを阻害し、がん細胞の浸潤・転移、血管新生を抑制する効果を持つ。 (3) Examination of inhibitor concentration using evaluation model
In order to confirm the action of the inhibitor genistein (Genistein) on BALB / 3T3 / v-src cells, genistein (CALBIOCHEM) was added at various concentrations to culture dishes seeded with BALB / 3T3 / v-src cells as a preliminary experiment. Then, the growth rate was examined. At that time, in order to confirm the presence or absence of MCL toxicity, cells in which MCL was incorporated and cells in which MCL was not incorporated were prepared, and the growth rates of both were compared. Genistein is a kind of soybean isoflavone, which inhibits protein tyrosine kinase and has an effect of suppressing invasion / metastasis of cancer cells and angiogenesis.

ゲニステイン添加から２４時間後及び４８時間後に各サンプルの培養面を撮影し、画像処理により細胞の総面積を算出した。図７に示す通り、ゲニステイン濃度を100μM以上にすると細胞の増殖率が低下した。また、ゲニステインを添加しない場合（コントロール）及び添加した場合（１μM〜1000μM）のいずれにおいても、MCLを取り込ませた細胞（MCL+）とMCLを取り込ませていない細胞（MCL-）の間に有意差は認められず、MCLが細胞に毒性を示さないこと、及びMCLがゲニステインの増殖阻害作用に影響しないことがわかる。   The culture surface of each sample was photographed 24 hours and 48 hours after the addition of genistein, and the total area of the cells was calculated by image processing. As shown in FIG. 7, when the genistein concentration was 100 μM or more, the cell growth rate was reduced. In addition, when genistein is not added (control) and when it is added (1 μM to 1000 μM), there is a significant difference between cells that have taken up MCL (MCL +) and cells that have not taken up MCL (MCL−). Is not observed, indicating that MCL is not toxic to cells and that MCL does not affect the growth inhibitory action of genistein.

次に、（１）に記載した方法でBALB/3T3 /v-src細胞を含有する評価モデルを構築し、種々の濃度でゲニステインを添加した後、細胞を経時観察した。ゲニステインを添加しない場合をコントロールとした。ゲニステイン添加後０時間、２４時間及び４８時間の細胞を図８に示す。コントロールでは時間経過とともに細胞が増殖、伸展及び浸潤していることがわかる。ゲニステインが10μMの場合、コントロールと同様の細胞の挙動が観察された。一方、阻害剤の添加濃度が100μM及び1000μMになると、明らかな増殖阻害が認められる。各サンプルについて細胞の総面積を算出し、グラフに表した（図９）。このように、生体環境に近い３次元環境下でパターニングしたがん化した細胞の挙動を、２次元観察できることが示された。また、構築した評価モデルが薬剤の評価に有用であることが確認された。３次元環境下でのパターニングは、より少ない細胞数での細胞密度の高い疑似環境下での解析を可能とし、浸潤や遊走能などの評価モデルとして有用である。   Next, an evaluation model containing BALB / 3T3 / v-src cells was constructed by the method described in (1), genistein was added at various concentrations, and the cells were observed over time. The case where genistein was not added was used as a control. The cells at 0, 24 and 48 hours after the addition of genistein are shown in FIG. In the control, it can be seen that the cells proliferate, spread and infiltrate with time. When genistein was 10 μM, cell behavior similar to the control was observed. On the other hand, when the inhibitor concentration is 100 μM and 1000 μM, obvious growth inhibition is observed. The total cell area was calculated for each sample and represented in a graph (FIG. 9). Thus, it was shown that the behavior of cancerous cells patterned in a three-dimensional environment close to the biological environment can be observed two-dimensionally. Moreover, it was confirmed that the constructed evaluation model is useful for drug evaluation. Patterning in a three-dimensional environment enables analysis in a simulated environment with a high cell density with a smaller number of cells, and is useful as an evaluation model for invasion and migration ability.

本発明が提供するがん細胞挙動評価モデルは各種がん細胞の増殖能及び／又は浸潤能の評価に有用である。がん細胞の薬剤に対する応答性の評価や、生体における、がん細胞の挙動の解析にも有用である。   The cancer cell behavior evaluation model provided by the present invention is useful for evaluating the proliferation ability and / or invasive ability of various cancer cells. It is also useful for evaluating the response of cancer cells to drugs and analyzing the behavior of cancer cells in the living body.

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。 The present invention is not limited to the description of the embodiments and examples of the invention described above. Various modifications may be included in the present invention as long as those skilled in the art can easily conceive without departing from the description of the scope of claims.
The contents of papers, published patent gazettes, patent gazettes, and the like specified in this specification are incorporated by reference in their entirety.

3D磁気細胞パターニング法の一例。An example of 3D magnetic cell patterning. 細胞のパターニングに用いる剣山状鉄製デバイス。（A)剣山状鉄製デバイスを利用したパターニングの方法、(B)剣山状鉄製デバイス（幅20mm、長さ20mm、高さ10mm）の外観、(C)剣山状鉄製デバイスが備えるピンの形態（高さ300μm、間隔150μm）、(D)剣山状鉄製デバイスが備えるピンの形態（高さ300μm、間隔600μm）。Kenzan iron device used for cell patterning. (A) Patterning method using sword mountain iron device, (B) Appearance of sword mountain iron device (width 20mm, length 20mm, height 10mm), (C) Pin configuration of sword mountain iron device (high (D) The form of the pins provided on the Kenyama iron device (height 300 μm, spacing 600 μm). BALB/3T3を用いた3D磁気細胞パターニング法の結果（光学顕微鏡像）。Results of 3D magnetic cell patterning method using BALB / 3T3 (optical microscope image). BALB/3T3を用いた3D磁気細胞パターニング法により構築した評価モデルの経時変化。培養開始後0時間(A)、12時間(B)、24時間(c)の細胞の状態（光学顕微鏡像）を示す。The time course of the evaluation model constructed by the 3D magnetic cell patterning method using BALB / 3T3. The cell states (light microscopic images) at 0 hour (A), 12 hours (B), and 24 hours (c) after the start of culture are shown. 3D磁気細胞パターニング法によって構築した二つの評価モデル（BALB/3T3を含む評価モデル（上段）と、BALB/3T3/v-srcを含む評価モデル（下段））の経時変化。Changes over time of two evaluation models (an evaluation model including BALB / 3T3 (upper) and an evaluation model including BALB / 3T3 / v-src (lower)) constructed by 3D magnetic cell patterning. 3D磁気細胞パターニング法によって構築した二つの評価モデル（MCF10Aを含む評価モデル（上段）と、MCF10AmyrAKT1を含む評価モデル（下段））の経時変化。Changes over time of two evaluation models (an evaluation model including MCF10A (upper) and an evaluation model including MCF10AmyrAKT1 (lower)) constructed by 3D magnetic cell patterning. ゲニステインの阻害作用。種々の濃度でゲニステインを添加し、BALB/3T3 /v-src細胞を培養した。２４時間後（上段）及び４８時間後（下段）に細胞の総面積を算出し、ゲニステインの増殖阻害能を評価した。MCLを取り込ませた細胞（MCL+）とMCLを取り込ませていない細胞（MCL-）の間に有意差は認められない。Inhibitory action of genistein. Genistein was added at various concentrations, and BALB / 3T3 / v-src cells were cultured. The total cell area was calculated 24 hours later (upper) and 48 hours later (lower), and the ability of genistein to inhibit growth was evaluated. There is no significant difference between cells that have taken up MCL (MCL +) and cells that have not taken up MCL (MCL-). BALB/3T3 /v-src細胞を含有する評価モデルを用いた薬剤アッセイ。BALB/3T3 /v-src細胞を含有する評価モデルに種々の濃度でゲニステインを添加した後、細胞を経時観察した。ゲニステイン添加後0時間、24時間及び48時間の細胞を示す。Drug assay using an evaluation model containing BALB / 3T3 / v-src cells. After adding genistein at various concentrations to the evaluation model containing BALB / 3T3 / v-src cells, the cells were observed over time. Cells at 0, 24 and 48 hours after genistein addition are shown. BALB/3T3 /v-src細胞を含有する評価モデルを用いた薬剤アッセイ。BALB/3T3 /v-src細胞を含有する評価モデルに種々の濃度でゲニステインを添加した後、細胞を経時観察した。ゲニステイン添加後0時間、24時間及び48時間の細胞の総面積を算出し、グラフに表した。Drug assay using an evaluation model containing BALB / 3T3 / v-src cells. After adding genistein at various concentrations to the evaluation model containing BALB / 3T3 / v-src cells, the cells were observed over time. The total area of the cells at 0, 24 and 48 hours after the addition of genistein was calculated and represented in a graph.

Claims (18)

(1)被験がん細胞を含む細胞集団を磁気ラベルするステップ、
(2)細胞外マトリックス成分を含有する第１マトリックス材料で培養面がコートされた培養容器を用意するステップ、
(3)磁気ラベルした前記細胞集団を前記培養容器に播種した後、磁力を作用させることによって、１スポットに１個又は複数個の細胞が存在するアレイ状パターンに前記細胞集団を配列させるステップ、
(4)磁力を作用させた状態を維持しつつ、細胞外マトリックス成分及び培地を含有する液状の第２マトリックス材料を前記培養容器に添加することによって、ステップ(3)で配列した前記細胞集団を該第２マトリックス材料に包埋するステップ、
(5)前記第２マトリックス材料をゲル化させるステップ、
を含む、がん細胞挙動評価モデルの構築法。 (1) magnetically labeling a cell population containing test cancer cells;
(2) preparing a culture vessel whose culture surface is coated with a first matrix material containing an extracellular matrix component;
(3) arranging the cell population in an array pattern in which one or more cells are present in one spot by applying a magnetic force after seeding the magnetically labeled cell population in the culture vessel;
(4) adding the liquid second matrix material containing the extracellular matrix component and the culture medium to the culture vessel while maintaining the state in which the magnetic force is applied, thereby allowing the cell population arranged in step (3) to Embedding in the second matrix material;
(5) gelling the second matrix material;
Of cancer cell behavior evaluation model, including 前記細胞外マトリックス成分がコラーゲンである、請求項１に記載の構築法。   The construction method according to claim 1, wherein the extracellular matrix component is collagen. 前記コラーゲンがI型コラーゲンである、請求項２に記載の構築法。   The construction method according to claim 2, wherein the collagen is type I collagen. 前記第１マトリックス材料と前記第２マトリックス材料が同一の組成である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の構築法。   The construction method according to any one of claims 1 to 3, wherein the first matrix material and the second matrix material have the same composition. 前記第２マトリックス材料が細胞を含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の構築法。   The construction method according to claim 1, wherein the second matrix material contains cells. 前記培養面が平坦面である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の構築法。   The construction method according to claim 1, wherein the culture surface is a flat surface. 前記被験がん細胞が、遺伝子操作によってがん化させた細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の構築法。   The construction method according to any one of claims 1 to 6, wherein the test cancer cell is a cell that has been transformed into cancer by genetic manipulation. 前記アレイ状パターンにおけるスポットの間隔が均一である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の構築法。   The construction method according to any one of claims 1 to 7, wherein an interval between spots in the array pattern is uniform. 前記アレイ状パターンが２次元ドットマトリックス状パターンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の構築法。   The construction method according to claim 1, wherein the array pattern is a two-dimensional dot matrix pattern. 前記アレイ状パターンにおいて、スフェロイドの形成に必要な数の細胞が各スポットに存在する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の構築法。   The construction method according to any one of claims 1 to 9, wherein in the array pattern, a number of cells necessary for spheroid formation are present in each spot. (i)被験がん細胞を含む細胞集団を磁気ラベルするステップ、
(ii)培養面に細胞層が形成された培養容器を用意するステップ、
(iii)磁気ラベルした前記細胞集団を前記培養容器に播種した後、磁力を作用させることによって、１スポットに１個又は複数個の細胞が存在するアレイ状パターンに前記細胞集団を配列させるステップ、
(iv)磁力を作用させた状態を維持しつつ、細胞外マトリックス成分及び培地を含有する液状のマトリックス材料を前記培養容器に添加することによって、ステップ(iii)で配列した前記細胞集団を該マトリックス材料に包埋するステップ、
(v)前記マトリックス材料をゲル化させるステップ、
を含む、がん細胞挙動評価モデルの構築法。 (i) magnetically labeling a cell population containing test cancer cells;
(ii) preparing a culture vessel having a cell layer formed on the culture surface;
(iii) arranging the cell population in an array pattern in which one or a plurality of cells are present in one spot by applying a magnetic force after seeding the magnetically labeled cell population in the culture vessel;
(iv) adding the liquid matrix material containing an extracellular matrix component and a medium to the culture vessel while maintaining a state in which a magnetic force is applied, whereby the cell population arranged in step (iii) is added to the matrix Embedding in material,
(v) gelling the matrix material;
Of cancer cell behavior evaluation model, including 第２マトリックス材料が被験物質を含有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の構築法。   The construction method according to any one of claims 1 to 10, wherein the second matrix material contains a test substance. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の構築法で構築した、がん細胞挙動評価モデル。   A cancer cell behavior evaluation model constructed by the construction method according to any one of claims 1 to 11. 請求項１２に記載の構築法で構築した、がん細胞挙動評価モデル。   A cancer cell behavior evaluation model constructed by the construction method according to claim 12. １スポットに１個又は複数個の細胞が存在する２次元アレイ状パターンに配置された、被験がん細胞を含む細胞集団が、細胞外マトリックス成分を含むマトリックス材料に包埋されていることを特徴とする、がん細胞挙動評価モデル。   A cell population containing test cancer cells arranged in a two-dimensional array pattern in which one or a plurality of cells exist in one spot is embedded in a matrix material containing an extracellular matrix component. A cancer cell behavior evaluation model. 請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のがん細胞挙動評価モデルを用い、被験がん細胞に対する被験物質の有効性を調べることを特徴とする、被験がん細胞に対する物質の有効性を評価する方法。   Using the cancer cell behavior evaluation model according to any one of claims 13 to 15, the effectiveness of a substance against a test cancer cell is characterized by examining the effectiveness of the test substance against the test cancer cell. How to evaluate. (a)請求項１３に記載のがん細胞挙動評価モデルに被験物質を添加した後、培養するステップ、
(b)細胞の挙動を観察し、被験がん細胞に対する被験物質の有効性を判定するステップ、
を含む、被験がん細胞に対する物質の有効性を評価する方法。 (a) a step of culturing after adding a test substance to the cancer cell behavior evaluation model according to claim 13;
(b) observing cell behavior and determining the effectiveness of the test substance against the test cancer cell;
A method for evaluating the effectiveness of a substance against test cancer cells. (A)請求項１４に記載のがん細胞挙動評価モデルを培養するステップ、
(B)細胞の挙動を観察し、被験物質の被験がん細胞に対する有効性を判定するステップ、
を含む、被験がん細胞に対する物質の有効性を評価する方法。 (A) culturing the cancer cell behavior evaluation model according to claim 14;
(B) observing the behavior of the cells, determining the effectiveness of the test substance against the test cancer cells,
A method for evaluating the effectiveness of a substance against test cancer cells.
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