JP2010066239A - レーザ顕微鏡装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】標本A中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を有する2つの異なる周波数を有するパルスレーザ光を導光する2つの光路13,14と、2つの光路13,14を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波装置9と、合波されたパルスレーザ光を標本Aに照射する集光レンズ105と、2つの光路13,14を導光される各パルスレーザ光のチャープレートを検出する周波数特性検出装置10と、検出された各パルスレーザ光のチャープレートが略同等となるように、少なくとも一方の光路を導光されるパルスレーザ光のチャープレートを調節可能な周波数分散量調節装置6とを備えるレーザ顕微鏡装置1を採用する。
【選択図】図1
Description
本発明は、標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を有する2つの異なる周波数を有するパルスレーザ光を導光する2つの光路と、該2つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、該合波手段により合波されたパルスレーザ光を標本に照射する照射手段と、前記2つの光路を導光される各パルスレーザ光のチャープレートを検出する周波数特性検出手段と、該周波数特性検出手段により検出された各パルスレーザ光のチャープレートが略同等となるように、少なくとも一方の光路を導光されるパルスレーザ光のチャープレートを調節可能な周波数分散量調節手段とを備えるレーザ顕微鏡装置を採用する。
以上のように、本発明に係るレーザ顕微鏡装置によれば、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光および多光子蛍光を効率的に発生させ、鮮明なコヒーレントアンチストークスラマン散乱光画像および多光子蛍光画像を取得することが可能となる。
このようにすることで、周波数分散量調節手段により、少なくとも一方の光路を導光されるパルスレーザ光のチャープレートを調節し、標本面上において略フーリエ限界パルスに近づけることができる。これにより、多光子励起光効果を効率的に発生させて、より鮮明な多光子蛍光観察を行うことができる。
周波数差調節手段は、一方のパルスレーザ光に対して、他方のパルスレーザ光の時間的な重なりを調節することで、2つのパルスレーザ光の周波数差を2つのパルスレーザ光の周波数帯域内において任意に調節することが可能である。これにより、時間軸上で一定に保った2つのパルスレーザ光の周波数差を確認し、所定の周波数差と一致させることが可能となり、所望のコヒーレントアンチストークスラマン散乱光を、より正確に得ることが可能となる。
このようにすることで、表示手段に各パルスレーザ光の周波数特性を表示させつつ、周波数分散量調節手段によりパルスレーザ光のチャープレートを調節、確認することができる。これにより、容易かつ確実に、2つのパルスレーザ光の周波数差を常に一定に保つように調節することが可能となる。
このようにすることで、周波数特性を求めるのに必要な種々の演算が容易に実現できるようになるほか、周波数特性値を種々装置へ出力したり、後工程で確認したりすることも容易となる。
このようにすることで、検出すべき周波数特性の演算が比較的容易に実現できるようになるほか、表示手段にて該周波数特性を確認する際に、その確認も容易になる。
このようにすることで、より簡便な構成で、安価に周波数特性を検出することができるようになる。
周波数変換手段としてフォトニッククリスタルファイバを用いることにより、簡易かつ安価に、周波数分散が与えられた広い周波数スペクトル帯域を有するパルスレーザ光を得ることが可能となる。また、用いるフォトニッククリスタルファイバの種類を選定することで、さまざまな周波数スペクトル成分および帯域を有するパルスレーザ光を得ることができる。このため、標本中の分子のさまざまな振動周波数に一致させるように、2つのパルスレーザ光の周波数差を調節することが可能となる。
本発明の第1の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置1について、図1から図5を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置1は、図1に示されるように、レーザ光源装置2と、レーザ光源装置2からのレーザ光を標本Aに照射して標本Aを観察するための顕微鏡本体3とを備えている。
周波数分散量調節装置6は、例えば、相互の間隔を調節可能な一対のプリズム(図示略)と、ミラー(図示略)とを備えている。一対のプリズムを通過したフェムト秒パルスレーザ光L1は、ミラーによって折り返された後に再度プリズム対を通過し同一の光路13上に戻されるようになっている。この場合に、プリズムの間隔を調節することにより、周波数分散量調節装置6を通過するパルスレーザ光L1に与える周波数分散量を調節することでそのパルスレーザ光のチャープレートが調節できるようになっている(例えば、特許文献2参照)。また、上記プリズム対の代わりに回折格子対(図示略)を用いてもよい。
なお、周波数分散量調節装置6は、後述する周波数特性検出装置(周波数特性検出手段)10により検出された各パルスレーザ光のチャープレートに基づいて制御される。
なお、前述の極短パルス光測定部201は、FROG以外にGRENOUILLE、SPIDER(Spectral phase Interferometry for direct Electric field Reconstruction),Sonogramであってもよい(例えば非特許文献2〜4参照)。
Journal of optical society America B 11, 2206-2215 (1994)"Frequency-Resolved Optical Gating With the Use of Second-Harmonic Generation" Optics Express 11, 68-78 (2003)"Measuring spatial chirp in ultrashort pulses using single-shot Frequency-Resolved Optical Gating," Optics Letters 23, 792-5 (1998)"Spectral phase interferometry for direct electric-field reconstruction of ultrashort optical pulses" IEEE PHOTONICS TECHNOLOGY LETTERS, VOL. 13, NO. 5"Optical Sampling System at 1.55 _m for the Measurement of Pulse Waveform and Phase Employing Sonogram Characterization"
まず、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置1を使用して、コヒーレントアンチストークスラマン散乱光による標本Aの観察を行う場合について以下に説明する。
レーザ光源4を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、レーザ光源4から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、分波装置5により2つの光路13,14に分岐される。
また、周波数調節手段として、ミラー(リフレクタ)を有する周波数調節装置8を採用することで、装置を簡易かつ安価に構成することができる。
この場合には、周波数特性検出装置10により測定された標本Aにおけるパルスレーザ光L1’のチャープレートが大きくなるように周波数分散量調節装置6を作動させる。具体的には、図5に示すように、パルスレーザ光L1’が標本A面において略フーリエ限界パルスに近づくようにパルスレーザ光L1’の周波数分散量を設定する。すなわち、図5(a)のP3の方向に分散量調節装置6を作動させ、図5(b)のようにチャープレートを増大させる。このように設定されたパルスレーザ光L1’を集光レンズ105により標本Aに集光することで、標本Aにおける集光位置において多光子励起効果を効率よく発生させ、明るい蛍光を得ることができる。
また、多励起型の蛍光観察と同様の条件で、SHG(第二高調波)光、THG(第3高調波)光観察などの観察も行うことができる。
次に、本発明の第2の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について、図6、図7、図8を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置51が第1の実施形態と異なる点は、パルスレーザ光の周波数特性を顕微鏡本体53内の標本点において検出するのではなく、レーザ光源装置52内の光路13及び14から引き出して検出し、その結果から標本Aでのパルスレーザ光の周波数特性を演算により見積もる機能を持つ点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置51について、第1の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる上述の点について主に説明する。
極短パルス光測定部201において測定された、パルスレーザ光L1’,L2’それぞれのチャープレート値Cおよびパルスの時間幅ΔTの情報から、以下の計算式により標本Aにおけるパルスレーザ光の周波数幅Δvcalcおよびパルス時間幅ΔTcalcが計算され、チャープレートCcalcが求まる。(例えば、非特許文献5参照)
電気情報通信学会編、「超高速光技術」、第4章
チャープレート差ΔCは上記で求めたL1’のチャープレートとL2’のチャープレートの差より求めることができる。
[到達時間差ΔTdelayの演算過程]
Lは合波装置9から標本Aまでの光学系に存在する各光学素子の物質長、nは各光学素子の屈折率、λ0(i)はパルスレーザ光L1’,L2’の中心波長、cは光速である。
また、多励起型の蛍光観察と同様の条件で、SHG(第二高調波)光、THG(第3高調波)光観察などの観察も行うことができる。
次に、本発明の第3の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について、図9〜図13を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置61が第1、第2の実施形態と異なる点は、標本Aでのパルスレーザ光L1’,L2’の周波数特性の検出を、パルスレーザ光L1’,L2’の相互相関信号を計測することによって可能にする点である。以下、本実施形態のレーザ顕微鏡装置61について、第1、第2の実施形態と共通する点については説明を省略し、異なる点について主に説明する。
図9に示すように、レーザ光源4を作動させてフェムト秒パルスレーザ光を出射させると、レーザ光源4から発せられたフェムト秒パルスレーザ光は、分波装置65により3つの光路13,14および26に分岐される。光路13及び14上のフェムト秒パルスパルスレーザー光L1、L2が、レーザ光源装置62を通過し、顕微鏡本体63を通過し、さらに周波数特性検出装置60にパルスレーザ光L1’,L2’として導光されるまでの構成及び作用は第1の実施形態と同様である。
また、多励起型の蛍光観察と同様の条件で、SHG(第二高調波)光、THG(第3高調波)光観察などの観察も行うことができる。
例えば、周波数分散量調節装置6として、プリズム対とミラーとを備えて、周波数分散量を連続的に変更可能なものを例示したが、これに代えて、回折格子対、誘電体多層膜鏡等でもよい。また、ガラスや色素溶液等周波数分散量が固定のもの、それらを複数用意し、段階的に切り替える方式のものや、第1の光路13上に挿脱されてパルスレーザ光L1’に与える分散量を切り替える方式のものを採用してもよい。
また、各光路にファイバを設けて各パルスレーザ光を導光することとしてもよい。但し、この場合にはファイバにより与えられる周波数分散量を予め測定し、周波数特性検出装置10、50、60で実測または算出される周波数分散量を補正する必要がある。
L1,L2 フェムト秒パルスレーザ光
L1’,L2’,L3,L4,L6,L7,L8,L9 パルスレーザ光
Ω,Ω’ 周波数(差)
1,51,61 レーザ顕微鏡装置
2,52,62 レーザ光源装置
3,53,63 顕微鏡本体
4 レーザ光源
5 分波装置(分波手段)
6 周波数分散量調節装置(周波数分散量調節手段)
7 フォトニッククリスタルファイバ(周波数変換手段)
8 周波数差調節装置(周波数差調節手段)
9 合波装置(合波手段)
10,50,60 周波数特性検出装置(周波数特性検出手段)
13,14,15 光路
104,108 光検出器
105 集光レンズ(照射手段)
107 集光レンズ
Claims (9)
- 標本中の分子の特定の振動周波数に略等しい周波数差を有する2つの異なる周波数を有するパルスレーザ光を導光する2つの光路と、
該2つの光路を導光されてきたパルスレーザ光を合波する合波手段と、
該合波手段により合波されたパルスレーザ光を標本に照射する照射手段と、
前記2つの光路を導光される各パルスレーザ光のチャープレートを検出する周波数特性検出手段と、
該周波数特性検出手段により検出された各パルスレーザ光のチャープレートが略同等となるように、少なくとも一方の光路を導光されるパルスレーザ光のチャープレートを調節可能な周波数分散量調節手段と
を備えるレーザ顕微鏡装置。 - 前記周波数分散量調節手段が、標本面上におけるパルスレーザ光が略フーリエ限界パルスに近づくように、少なくとも一方の光路を導光されるパルスレーザ光のチャープレートを調節可能である請求項1に記載のレーザ顕微鏡装置。
- 前記周波数特性検出手段が、さらに、前記二つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数差を検出し、
該周波数特性検出手段により検出された周波数差を所定の周波数差に調節するための周波数差調節手段を備える請求項1または請求項2に記載のレーザ顕微鏡装置。 - フェムト秒パルスレーザ光を射出するレーザ光源と、
該レーザ光源から射出されたフェムト秒パルスレーザ光を少なくとも前記2つの光路に分岐する分波手段と、
該分波手段により分岐された前記2つの光路を導光されるパルスレーザ光の周波数差が標本中の分子の特定の振動周波数に略等しくなるように、一方の光路を導光されるパルスレーザ光の周波数をその周波数帯域を変更または拡大するように変換する周波数変換手段とを備える請求項1から請求項3のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。 - 前記2つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数特性を表示する表示手段を備える請求項1から請求項4のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
- 前記周波数特性検出手段が、検出された前記2つの光路を導光される各パルスレーザ光の周波数特性値、あるいは周波数特性を演算にて求めるための中間値を記憶する記憶手段を備える請求項1から請求項5のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
- 前記周波数特性検出手段が、前記2つの光路を導光される各パルスレーザ光のスペクトログラムを検出する検出手段を備える請求項1から請求項6のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
- 前記周波数特性検出手段が、前記2つの光路を導光される該パルスレーザ光の相互相関信号を検出する検出手段を備える請求項1から請求項7のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
- 前記周波数変換手段が、フォトニッククリスタルファイバである請求項1から請求項8のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
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