JP2010018627A - 血管の形成ならびに血管新生および栄養因子の生産に使用するための骨髄間質細胞に由来する物質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】治療薬は幹細胞から単離した血管新生および脈管形成誘導因子を製薬学的に許容され得る細胞治療と一緒に含む。血管新生および脈管形成誘導因子の生産を増加させるために、幹細胞を暴露し、そして幹細胞と化合物を共培養することにより分泌される血管新生および脈管形成誘導因子の生産増幅法。治療に使用するために幹細胞から単離そして精製された血管新生および脈管形成誘導因子。上に説明した血管新生および脈管形成誘導因子を得る方法、その工程はヒトの間葉系幹細胞を分化前の組織から単離そして精製し、そして次いで間葉系幹細胞を培養拡大して神経学的および筋骨格治療用の道具を生産する工程を含む。組織修復に必要な所望の細胞表現型に分化し、そして生産することができる、単離され、そして必要な化合物の影響下で培養拡大した間葉系幹細胞。
【選択図】図1
Description
技術分野
本発明は治療薬として使用するための方法および組成物に関する。より詳細には本発明は血管新生(angiogenesis)の治療的生成の使用および血管新生および栄養(trophic)因子の生産に関する。
発作は米国の成人人口において3番目に多い死因であり、そして障害の主要因である。発作は脳の一部が梗塞するようになった時に起こり、大脳の血液供給の妨害から脳組織の死をもたらす。急性発作に伴う脳梗塞は急激な、しかも劇的な神経的損傷を引き起こす。他の神経性疾患も組織の死および神経的損傷をもたらす。
本発明に従い、血管新生および脈管形成の誘導に使用する治療薬が提供される。治療薬は幹細胞から単離された血管新生および脈管形成誘導因子を、血管新生および脈管形成を誘導するための製薬学的に許容され得る細胞治療薬と一緒に含むことができる。また間質細胞を血管新生および脈管形成誘導因子の生産を増すための化合物に暴露し、そして共培養することにより分泌される血管新生および脈管形成誘導因子の生産を増幅させる方法も提供する。幹細胞から単離され、そして精製された治療に使用するための血管新生および脈管形成誘導因子も提供する。上に説明した血管新生および脈管形成誘導因子を得る方法を提供し、この方法は分化前の組織からヒト間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell)を単離し、そして精製し、そして次いで神経学的および筋骨格治療用の道具を生産するために間葉系幹細胞を培養拡大する工程を含む。組織修復に必要な所望する細胞表現型に分化し、そして生産することができる、単離され、そして必要な化合物の影響下で培養拡大された間葉系幹細胞も提供する。
一般に本発明は血管新生および脈管形成を誘導するための細胞治療の一部として、骨髄間質細胞または他の幹細胞に由来する血管新生および脈管形成誘導因子の使用を提供する
。より詳細には本発明は、治療に使用するための間質細胞または他の幹細胞により分泌される血管新生および脈管形成誘導因子(例えば血管新生、栄養および増殖因子)の生産を増幅させる方法を提供し、この因子は投与されると血管新生または他の有益な増殖を誘導する。増幅は細胞を脳抽出物および/またはカルシウムに暴露し、そして共培養することにより起こる。
および選択的分離に必要なタンパク質結合部位、および/または該間葉系幹細胞に特異的なモノクローナル抗体の生産に必要なタンパク質部位に細胞傷害を生じ得る点であると考えられる。次いで単一細胞懸濁液(これは約50〜100×106の有核細胞からなる)が、続いて懸濁液中に見いだされる残りの細胞から間葉系幹細胞を選択的に分離し、かつ/または単離する目的で100mmの皿にまかれた。
たは排除するために効果的となることができる。
の不存在および幹細胞により生成される栄養因子を増加させる能力を含む。
分子生物学の一般法:当該技術分野で知られており、そして具体的には記載しない標準的な分子生物学技術は、一般にSambrook et al.,モレキュラークローニング:ア ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク(1989)、およびAusubel et al.,分子生物学の現在の手法(Current Protocols in Molecular Biology)、ジョン ウィリー アンド サンズ(Jone Wiley and Sons)、バルチモア、メリーランド(1989)およびPerbal、分子クローニングの実践的手引き(A Practical Guide to Molecular Cloning)、ジョン ウィリー アンド サンズ、ニューヨーク(1988)、およびWatson et al.,組換えDNA(Recombinant DNA)、サイエンティフィック アメリカン ブックス(Scientific American Books)、ニューヨーク、およびBirren et al(編集)、ゲノム分析:ア ラボラトリーマニュアルシリーズ(Genome Analysis:A Laboratory Manual Series),第1〜4巻、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、ニューヨーク(1998)、および米国特許第4,666,828号;同第4,683,202号;同第4,801,531号;同第5,192,659号および同第5,272,057号明細書および引用により編入されている参考文献に説明されている方法論に従った。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は一般に、PCRプロトコール:方法および応用の手引き(PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications)、アカデミック出版、サンディエゴ、カリフォルニア州(1990)のように行った。フローサイトメトリーと組み合わせたIn−situ(In−cell)PCRは、特異的DNAおよびmRNA配列を含む細胞を検出するために使用することができる(Testoni et al,1996,Blood 87:3822)。
本発明の細胞は個々の患者の臨床的状態、投与の部位および方法、投与計画、患者の年齢、性別、体重および医療専従者に知られている他の因子を考慮して良好な医学的プラクティスに従い投与そして投薬される。本発明の目的について製薬学的な「有効量」は、このように当該技術分野で知られているような考察に従い決定される。この量は限定するわけではないが改善された生存率またはより早い回復、あるいは当業者により適切な基準として選択されるような症状および他の兆候の改善または排除を含む改善を達成するために効果的でなければならない。
細胞は、モノクローナル抗体、媒介型送達、イオン導入的、ポリマーマトリックス、リポソームおよび微小球のような緩効性の皮下インプラントまたは標的化送達系の状態で患者に非経口的に投与することができる。本発明に有用な送達系の例には:5,225,182;5,169,383;5,167,616;4,959,217;4,925,678;4,487,603;4,486,194;4,447,233;4,447,224;4,439,196;および4,475,196を含む。多くの他のそのようなインプラント送達系およびモジュールが当業者には周知である。
骨髄間質細胞(MSCs)を用いた外傷性の脳損傷(TBI)の処置は、ラットの機能的成果を改善する。組織交換は細胞移植治療の単なる代償的手段ではない。種々の増殖因子が傷害を受けた組織の修復および交換を媒介することが示されたので、MSCsは傷害を受けた組織の処置に役割を果たす栄養的支援を提供する。TBIに由来する大脳組織抽出物に対するヒトMSCs(hMSCs)の応答を調査し、そしてTBI環境がhMSCsの分化および増殖因子の分泌を誘導するかどうかを決定するために実験した。hMSCsはTBI抽出物とインビトロで培養し、そして免疫細胞化学および定量的サンドイッチ酵素−連結免疫吸着アッセイ(ELISA)を行った。結果はTBIでコンディショニングしたhMSCsが特異的な細胞性タンパク質マーカー:神経細胞核用のNeuN(全hMSCsの0.2〜0.5%)、初期ニューロンの分化および神経突起の伸長用のTuj−1(6〜10%)、星状膠細胞用のGFAP(4〜7%)および小突起膠細胞用のMBP(3〜5%)を発現したことを示す。加えて、TBI抽出物で処置したhMSCsは脳由来神経栄養因子(BDNF)、神経成長因子(NGF)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)および肝細胞増殖因子(HGF)の分泌を時間依存的様式でアップ−レギュレーションすることにより応答する。これらのデータはTBI抽出物が、hMSCsが脳組織の神経形態およびタンパク質表現型を発現するようにさせていることを示している。さらにELISAデータは移植したhMSCsが、神経保護および血管新生を助長することができる多くの増殖因子の反応性分泌を介して治療的利益を提供することを示す。
ままである。
al.,1993;Bullock et al.,1999;Gage,2000)。前臨床実験で広く実験された増殖因子は塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)(Ay
et al.,1999)である。虚血の発生から数時間内にbFGFを静脈内に投与すると、恐らく脳梗塞の境界(周縁部)で細胞を直接的に保護することにより梗塞のサイズを低減させる(Ay et al.,1999)。血管内皮増殖因子(VEGF)発現も血管新生および神経修復を促進する(Papavassiliou et al.,1997)。VEGFによる発作の処置は、機能的成果を向上させる(Zhang et al.,2000b)。肝細胞増殖因子(HGF)の発現は、損傷後の脳内で自然にアップ−レギュレーションされ、そしてインビトロで脳のニューロンに対して抗−アポトーシス効果を示す(Zhang et al.,2000a)。
試薬
ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)、ダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)、ノックアウトDMEM、ノックアウト血清代替、ウシ胎児血清(FBS)、トリプシンおよびエチレンジアミン−四酢酸(EDTA)は、ギブコ(GIBCO)(グランドアイランド、ニューヨーク州)から購入した。Ficollはファルマシア(Pharmacia)(ピスカタウェイ、ニュージャージー州)から購入した。モノクローナル神経核抗原(NeuN)、ポリクローナルβ−チューブリンアイソタイプ1(Tuj−1)、グリア繊維酸性タンパク質(GFAP)およびミエリン塩基性タンパク質(MBP)に対する抗体は、ケミコン(CHEMICON)(テメクーラ、カリフォルニア州)から購入した。BDNF、bFGF、VEGFおよびHGF用のサンドイッチ酵素−連結免疫吸着アッセイ(ELISA)のキットは、R&Dシステムズ(ミネアポリス、ミネソタ州)から得た。NGF ELISAキットは、研究室で作成した。抗−β(2.5S、7S)NGFモノクローナル抗体、抗−β(2.5S、7S)NGF−β−gal、NGF−β標準は、ロッシュ モレキュラー バイオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals)(インディアナポリス、イリノイ州)から購入した。特に示さない限り、試薬はシグマケミカルズ社(セントルイス、ミズーリ州)から得た。
初代骨髄は3名の正常なヒトドナーの腸骨稜に由来する15〜16mlの吸引物から得た。各吸引物はHBSSで1:1に希釈し、そして約10mlのFicollに重層した。2,500×gで30分間遠心した後、単核細胞層を界面から取り出し、そしてHBSSに懸濁した。細胞は1,000×gで10分間遠心し、そして5×106細胞を各100mmの組織培養皿(ファルコン(Falcon)、ベクトン−デッキンソン(Becton−Dickinson)、ニュージャージー州)で完全DMEM(10%FBSを含有する)に再懸濁した。細胞を5%CO2のフラスコ中、37℃で3日間インキューベーションし、そして非付着細胞は培地を交換することにより除去した。培養がコンフルエントに達した時(通常は2〜3週間で)、細胞はリン酸緩衝化生理食塩水(PBS、pH7.4)中の0.05重量/容量%トリプシンおよび0.02重量/容量%EDTAを用いて37℃で5分間回収し、もう一度まき、そして再度2週間培養し、そして回収した。次
いで細胞を後で使用するために凍結した。これらの実験に使用した細胞は、3〜5継代で回収した。
実験は体重が250〜350gのオスのウィスター(Wistar)ラットで行った(n=21)。麻酔はラットに抱水クローラル(35mg/100g体重)を腹腔内注射することにより誘導した。直腸温度はフィードバック−調節された水加熱システムを使用して外科的手順の間、37℃に維持した。ラットを定位枠に配置した。損傷は左皮質(同側皮質)に、直径6mmのチップを有する気体ピストンで4m/秒の速度および2.5mmの圧縮で衝撃を与えることにより誘導した(Dixon et al.,1991)。対照動物には開頭術を行ったが損傷は与えなかった。ラットは術後1、4および7日に屠殺した(各時期あたりn=6)。脳組織抽出物は実験および正常対照(n=3)ラットから直ちに得た。両実験ラットおよび対照ラットの左半球のセグメントを氷上に置き、そして湿潤重量をグラムで迅速に測定した。続いて組織片はDMEM(150mg組織/mlDMEM)を加えることにより均一化し、そして氷上で10分間、インキューベーションした。ホモジネートは4℃で10,000×gにて10分間遠心した。上清を集め、そしてhMSCsの処置のために−80℃で保存した。
タンパク質の表現型実験は、1.0×106細胞を35mm皿に播種し、そしてそれらを新鮮なノックアウトDMEM(10%、20%または40%のTBI組織抽出上清を含む20%ノックアウト血清代替を含む)で処理することにより行った。すべての細胞を7日間インキューベーションした。免疫反応性神経−様細胞の予測は、細胞を3枚の培養皿中、10の無作為視野(10×対物)で、最少3つの異なる実験で計数することに基づいた。神経細胞の表現型の割合は、細胞総数から算出した。
hMSCsは、上記の異なる処理を使用して1.0×106の密度で35mm皿中のガラスカバースリップ(18×18mm2)にまいた。ガラスカバースリップ上の細胞を免疫細胞化学に使用した。培養基の上清は、以下に記載するように定量的ELISA測定に使用した。細胞をPBS(pH7.4)で洗浄し、そして4%パラホルムアルデヒドで10分間固定した。非特異的結合部位は、4%正常ウマ血清、2%ウシ血清アルブミンおよび0.1%Triton X−100で1時間ブロックした。カバースリップをPBSで洗浄し、そしてTuj−1、GFAPまたはMBPに対する1次抗体と1時間インキューベーションした。それらを再度PBSで洗浄し、そしてフルオレセイン−イソチオシアネート(FITC)結合ヤギ抗−マウスまたは抗−ウサギIgG2次抗体と1時間インキューベーションした。Tuj−1染色したhMSCカバースリップをもう一度洗浄し、そして第2の1次抗体NeuNと一晩インキューベーションし、次いでPBSで洗浄し、そしてシアニン−5.18(Cy5)結合抗−マウスIgG2次抗体と1時間インキューベーションした。4’b−ジアミジン−2−フェニルインドールジヒドロクロライド(DAPI)色素を使用して、視野の核を計数することにより細胞数を決定した。次いでカバースリップにグリセルゲル上層媒質(glycergel mounting medium)をのせた。
ELISAを使用してhMSCsによるBDNF、NGF、bFGF、VEGFおよびHGFの分泌を、TBIおよび正常脳抽出物上清によりコンディショニングした培養の1、4および7日に測定した。簡単に説明すると、すべての試薬および作業標準は製造元により指示された通りに準備し、そして50〜150μlの標準またはアッセイ希釈溶液を96ウェルプレートのウェル毎に加えた。ウェルは穏やかに混合し、そして室温で2〜4
時間インキューベーションした。各ウェルを吸引し、そして洗浄し、このプロセスを3回繰り返した。最後の洗浄後、残るいかなるバッファーもウェルを吸引、またはデカントすることにより除去し、そして200μlの種々の増殖因子結合物を各ウェルに加えた。次いでプレートを室温で2〜4時間インキューベーションした。吸引および洗浄を繰り返した。200μlの基質溶液を各ウェルに加え、そして室温で15〜30分間インキューベーションした。50μlの停止溶液を加え、そして穏やかに混合した。各ウェルの光学密度は、450〜620nmに設定したマイクロプレートリーダーを使用して、30分以内に決定した。
スチューデントt検定を使用して刺激したサンプルとそれらの各対照との間の形態学的差異を評価した。時間応答の有意さは、分散の繰り返し測定分析により評価した(ANOVA)。ELISAデータは種々の増殖因子濃度の対数 対 光学密度の対数をプロットすることにより直線化し、そして最も合う直線を回帰分析により決定した。各標準、対照およびサンプルについて二重の読み取りの平均を作成し、そしてゼロ標準光学密度の平均を引いた。すべての値は平均±SDで表す。p<0.05を統計的に有意と考えた。
hMSCsの神経様細胞への形態的分化
位相差顕微鏡は、10%FBSを補充した完全DMEM中で培養した繊維芽細胞様hMSCsの正常形態を示す。7日間の暴露後、20%ノックアウト血清代替を含むノックアウトDEME中、いくらかの屈折性(refractive)細胞が短い突起を表した。わずかな細胞(全細胞〜2〜3%、表1)が、正常脳組織抽出上清で培養したhMSCs中でニューロン様細胞の形態を表した。しかし正常脳抽出物が誘導するhMSCs増殖(1.56×104±0.2×104/ml)は、20%ノックアウト血清代替を含むノックアウトDMEM中で培養したhMSCs(1.24×104±0.5×104/ml)に匹敵した(p<0.05)。多様な形態であるが、しかし典型的には長い分枝突起(突起長>10μm)および成長円錐様末端構造を持つ屈折性細胞(全細胞の〜13〜30%のニューロン様細胞、表)、および小さく、そして多極突起(multipolar process)を持つ星状細胞が20%〜40%TBI抽出上清中で培養したhMSCs中に検出された。TBI(1.08×104±0.3×104/ml)抽出物カルチャー中の全細胞数に関しては減少する傾向があったが、これは統計的に有意には至らなかった。種々の濃度のTBI組織抽出物のすべてが、hMSCsを形態学的に似ている神経様細胞に誘導した。
20%ノックアウト血清代替を含むノックアウトDMEMおよび10%、20%または40%のTBI脳組織抽出物カルチャーを含む中で7日後、hMSCsを免疫細胞蛍光法のために処理した。このhMSCsのDAPI(核の同定には紫青色)、FITC(緑色)での二重標識、またはCY5(赤色)の三重標識により、骨髄起源の細胞がニューロン(NeuN、Tuj−1)、星状膠細胞(GFAP)および小突起膠細胞(MBP)の神経特異的マーカーを発現するかどうかの決定が可能となった。細胞核はDAPIにより染色された。免疫反応性について染色したカルチャーでは、0.2〜0.5%のhMSCsがNeuNタンパク質を発現し、そして6〜10%のhMSCsがTuj−1表現型により標識された。NeuNおよびTuj−1免疫反応性は同じ細胞に同時に局在した(ピンク色)。4〜7%のhMSCs由来細胞がGFAP免疫反応性を発現した。3〜5%のhMSCs由来細胞がMBP免疫反応性を発現した。調査した種々の濃度のTBI抽出物のすべてが、hMSCsが神経の表現型の免疫反応性を発現することを誘導した。
20%ノックアウト血清代替培地を含むノックアウトDMEMおよび20%のTBI抽出物上清を含む中で1、4および7日後、hMSCsにより分泌される増殖因子を図1に示す。正常脳およびTBI組織抽出物は、インビトロでhMSCsのBDNF(図1a)、NGF(図1b)、bFGF(図1c)、VEGF(図1d)およびHGF(図1e)の分泌に影響を与えた。正常脳組織抽出物は培地単独の対照と比較して、インビトロですべての検出される増殖因子について分泌を増加した。各実験群で、BDNF、NGFおよびHGF分泌は、TBI抽出物によるコンディショニングで1日から7日を通して増加した。VEGF分泌は正常脳およびTBI後の脳の群で同様であった。VEGF分泌は1日のカルチャー中よりも4日および7日間のカルチャー中で一貫して大きかった。bFGF分泌のプロフィールは、他の栄養因子とは異なった。1日の期間のカルチャー中でbFGFの分泌値は、他の増加因子とは異なり、4日および7日の値を越えるか、または等しかった。これらのデータはTBIがインビトロでhMSCsによるNGFおよびBDNFの分泌を促進することを表し、そしてすべてのニューロトロフィンおよび試験した増殖因子が、血清代用培地中のhMSCsに比べて正常脳中でのhMSCs分泌に有意な上昇を示した。
TBI抽出物で処置したヒト骨髄間質細胞は、形態学的に神経様細胞に分化し、そして大脳実質細胞の表現型のタンパク質を発現することができる。hMSCsはBDNF、NGF、bFGF、VEGF、HGFを分泌し、そして分泌レベルはカルチャー中のTBI抽出物への暴露時期およびTBI組織が抽出された時期の両方に依存する。
et al.,2001;Lu et al.,2001b;Lu et al.,2001a;Mahmood et al.,2001)、ニューロン様細胞へ分化させられ得ることが報告された。このデータは初めて、幾らかのhMSCsがTBI組織抽出物を含む特異的な微小環境内にインビトロで置かれた時、脳実質細胞の形態学的ならびに表現型的特徴の推定により応答することを示す。治療用の移植で、これらの細胞はTBI傷害脳における細胞代替物の供給源を提供することができる。
t al.,1993;Bullock et al.,1999)。NGF注射後、またはNGF−生産繊維芽細胞を介して、およびNGFトランスジェニックマウスの神経保護的能力は、実験的な脳損傷の異なるパラダイムを証明した(Hefti,1986;Kromer,1987;Caneva et al.,1995;Gage,2000)。bFGFの静脈内投与はラット、マウスおよびネコを対象とした局所脳虚血のモデルにおいて、梗塞容量を減少させた(Sugimori et al.,2001)。血管新生の強力なプロモーターであるVEGFも、軸索伸長、神経細胞生存およびシュワン細胞増殖を刺激する(Sondell et al.,1999)。挫骨神経の挫壊損傷後のVEGF増加は、VEGFが神経再生に役割を果たしていることを示唆する(Sondell and Kanje,2001)。ラットの実験的発作をVEGFで処置すると、機能欠損が有意に減少する(Zhang et al.,2000b)。hMSCsはHGFを構成的に生産し(Takai et al.,1997)、そしてHGFは組織修復に重要な分子である(Mizuno et al.,2000)。したがってこの知見はhMSCsが正常な脳およびTBI環境に感受性であり、そして多くの因子の生産を有意に増加することにより応答することを強く示す。外傷的に損傷した神経組織に移植したMSCsの生存を仮定すると(Lu et al.,2001b;Lu et al.,2001a;Mahmood et al.,2001)、傷つけられた組織の局所レベルでのMSCsによる神経保護および血管新生因子の連続的および微小環境的応答分泌は、MSC移植により提供される機能的利益における鍵である。
方法:
ラットを一時的な中大脳動脈閉塞に供し、そして発作から1日後に3×106hMSCをIV注射した。機能的な成果を発作前および1、7および14日後に測定した。混合リンパ球反応および細胞傷害性Tリンパ球の発生は、hMSCの免疫拒絶を測定した。ヒト細胞核に特異的なモノクローナル抗体(mAb1281)を使用してhMSCを同定し、そして神経の表現型を測定した。ELISAはhMSC−処置または未処置ラットに由来する脳組織中のニュートロフィンレベルを分析した。ブロモデオキシウリジン注射を使用して新たに形成された細胞を同定した。結果:機能の有意な回復が虚血の対照ラットに比
べてhMSCで処置したラットに14日で見いだされた。わずか(1〜5%)なhMSCが脳実質細胞の表現型のタンパク質を発現した。脳由来神経栄養因子および神経成長因子は有意に増加し、そしてアポトーシス細胞は虚血境界領域で有意に減少し;ブロモデオキシウリジン反応性細胞がhMSCで処置したラットの虚血性半球の脳室下領域でより有意により多く検出された。hMSCは細胞傷害性Tリンパ球の誘導なしにリンパ球の増殖を誘導した。
ラットの発作のhMSC処置から生じる神経学的利益は、虚血組織中の増殖因子の増加、損傷の半影領域のアポトーシスの減少、および脳室下領域中の内因性細胞の増殖からもたらされ得る。
材料および方法。
に測定した。
インビトロでのhMSCに対するラット細胞傷害性Tリンパ球応答
Tリンパ球は移植片−対−宿主の致死的医原性疾患のイニシエーターとして関わっている。したがってヒトの移植片−対−ラット宿主T細胞応答を、51Crアッセイを使用して測定して溶解効果(lytic effect)を決定する。健康なラットの脾臓細胞または2週間前に3×106のhMSCを注射したラットの脾臓細胞を、照射hMSCと5日間、10:1の応答物(脾臓細胞)−対−刺激物(hMSC)比で培養した。インキューベーション期間の終わりに、生きている細胞をカルチャーから回収し、そして51Cr−標識hMSCに対する細胞傷害性について8時間の51Cr放出アッセイで試験した。
成体のオスウィスターラット(体重270〜300g)を、チャールズリバーブリーデング社(Charles River Breeding Company)(ウィルミントン、マサチューセッツ州)から購入した。ラットは最初に3.5%ハロタンで麻酔をかけ、そしてフェイスマスクを使用して1.0%〜2.0%のハロタン(70%N2Oおよび30%O2中)で維持した。直腸温度はフィードバック調節温水システムを使用して、外科的手順の間を通して37℃に維持した。一過性のMCAOは、研究室で改良した血管内脈管閉塞(intraluminal vascular occlusion)の方法を使用して誘導した。右頸動脈、外頸動脈および内頸動脈を露出した。動物の体重により決定した長さの4−0のモノフィラメントナイロン糸(18.5〜19.5mm)を、その先端付近を焼炎加熱することにより丸くし、これを外頸動脈から内頸動脈の管腔へMCAの起点で遮断されるまで進めた。MCAOから2時間後、ハロタンで動物に再度麻酔をかけ、そして縫合糸をその先端が外頸動脈の管腔からとり除かれるまで引っ張ることにより再潅流を行った。
群1。
ニュートロフィンを測定するために、ラットは処置無しで(n=3)MCAOに供するか、または発作から1日後に1mLの全液体用量中に3×106MSC(n=3)または3×106肝臓繊維芽細胞(n=3)を尾の静脈に注射した。肝臓繊維芽細胞の実験は「対照」として限定され、ここで繊維芽細胞は対照細胞の宿主ラットに対する予期せぬ免疫応答を回避するために同種のウィスターラットから集めた。ラットはMCAOから7日後にニュートロフィンの測定のために屠殺した。3匹の健康なラットも対照個体として使用した。
ラットは3×106hMSC(n=9)または3×106ラット肝臓繊維芽細胞(n=9;対照)を1日目に注射するMCAOに、あるいは細胞ドナー無しのMCAO単独(n
=10;対照)に供した。ラットは細胞の形態を測定するためにMCAOから14日後に屠殺した。MCAOは上衣および上衣下領域(脳室領域/脳室下領域[VZ/SVZ]とも呼ばれる)中の内因性の神経幹細胞および前駆細胞の増殖を誘導するので、群2の17匹のラットは細胞増殖を確認するために、ドナー細胞のIV注射有り、または無しでMCAO後から14日間、連続して毎日、ブロモデオキシウリジン(BrdU、新たに合成されたDNAを標識するチミジン類似体[50mg/kg];シグマ、セントルイス)の腹腔内注射を受けた。対照としてさらに2匹の健康な動物に50mg/kgのBrdUの腹腔内注射を毎日、14日間、死ぬ前まで与えた。
すべての動物はMCAO前、およびMCAOから1、7および14日後に、実験群に対して知らされていない調査者による行動試験を受けた。前肢体性感覚不均斉を測定するために、小さい接着剤付きペーパードット(113.1mm2)を両側の触覚の刺激物として使用し、そしてホームケージ中、1日に5回の実験について各前肢の手首の橈側面に適用した。ラットの刺激物への接触および除去の時期を記録した。個々の実験は少なくとも5分間の間隔をあけた。動物は手術前に3日間、接着−除去ドット試験に慣らされた。いったんラットが10秒以内にドットを除去できれば、ラットをMCAOに供した。改良した神経学的重症度の採点(mNSS)を使用して、神経的機能の様々な観点を等級分けした。mNSSは運動(筋肉状態および異常な運動)、感覚(視覚、触覚および自己刺激感応性)および反射試験の複合である。
虚血脳から抽出物の調製:
MCAOから7日後、群1のラットにハロタンで麻酔をかけ;脳を摘出し、そして虚血性半球を氷上で切開した。次いでサンプルを−80℃に保存した。続いて各組織サンプルを1g/mLのホモジネートバッファー中で均一化した。ホモジネートを4℃で10分間遠心し(10,000g)、そして上清を分泌を測定するために集めた。
BDNF ELISAキットはR&Dシステムズ(ミネアポリス、ミネソタ州)から得、そしてELISAは製造元の指示に従い調製した。ELISA溶液はNGFについて作成した。抗−β(2.5S、7S)NGFモノクローナル抗体、抗−β(2.5S、7S)NGF−β−ゲルおよびNGF−β標準は、ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ(インディアナポリス、インディアナ州)から購入した。簡単に説明すると、虚血性組織から集めた上清またはhMSCからの無血清培養基を、100−〜200−μLの3連サンプルに分割した。BDNFおよびNGFに対するモノクローナル抗体は、製造元の使用説明に従い使用した。続いて各1次抗体に対する2次特異的ポリクローナル抗体を加えた。発色基質とのインキューベーション期間の後、増殖因子の量に比例して発色し、そしてマイクロプレートリーダー(450〜620nm)を使用して測定する。
スライドの調製
MCAOから14日後まで生かした群2のラットを、形態学的分析に使用した。その時点で、ラットにケタミン(44〜80mg/kgを腹腔内に)およびキシラジン(13mg/kgを腹腔内に)で麻酔をかけ、そしてヘパリンを加えたリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、続いてPBS中の4%パラホルムアルデヒドを管系に経心臓的に潅流した。脳はPBS中の4%パラホルムアルデヒドに2日間浸し、そして次に脳組織を7つの等しい間隔(2mm)の皮質塊に切断した。組織を処理し、そして各塊から100μm厚の自由に流動するビブラトーム(vibratome)皮質スライド(1つの塊あたり5個のビブラトームスライド)を切断した。すべての残りの脳塊はパラフィンに包埋し、そして連続して隣接する6μm厚のスライドを切断した。
7個の塊から各皮質パラフィンスライドの1つ(6μm厚)をヘマトキシリン−エオシン(H−E)で染色した。7個の脳スライドはGlobal Lab Image分析システム(データ トランスレーション(Data Translation)、マルボロ、マサチューセッツ州)を使用して追跡した。間接的な損傷領域(ここで同側半球の完全な領域を反対側半球の領域から引く)を算出した。損傷容量は反対側半球と比較した損傷容量の割合として提示する。
正常血清でブロッキングした後、すべてのビブラトームスライドはPBS中で1:100に希釈したヒト核に特異的なモノクローナル抗体(mAb1281;ケミコン(Chemicon)、テメキューラ、カリフォルニア州)で4℃にて3日間処理した。マウスIgGに対するフルオレセインイソチオシアネート−結合ウサギ抗体(希釈、1:100、ダコパッツ、カリフォルニア州)との順次インキューベーション後、2次抗体をmAb1281に対する1次抗体に結合させた。hMSCに由来する細胞は形態学的基準およびドナー細胞に存在するが実質細胞には存在しないmAb1281での免疫組織化学的染色を使用して同定した。同じ細胞中でmAb1281および細胞型に特異的なマーカーの、細胞性同時局在を視覚化するために、二重染色を虚血中心部が中央にある連続参照ビブラトームスライド(100μm)に使用した(ブレグマで座標を取る−1.0、1.0mm)。各皮質スライドを第1の1次抗体、mAb1281で上記のように処理し、そして次にシアニン−5.18に結合した細胞型に特異的な第2の1次抗体(カルビオケム(calbiochem)、カリフォルニア州)で4℃にて3日間処理した:神経核抗原(神経核用のNeuN[希釈、1:200];ケミコン)、微小管−結合タンパク質2(神経樹状突起用のMAP−2[希釈、1:200];シグマ)、グリア繊維酸性タンパク質(星状細胞用のGFAP[希釈、1:1000];DAKO、カルピンテリア、カリフォルニア
州)およびvWF(内皮細胞用[希釈、1:400];DAKO)。各動物に関する陰性対照スライドは、免疫組織化学染色については1次抗体を省略した点を除き同一の調製を受けた。
皮質のビブラトームスライドは、ツァイス(Zeiss)顕微鏡(バイオ−ラッド、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)に乗せたバイオ−ラッド(Bio−Rad)のMSC1024(アルゴンおよびクリプトン)レーザー走査共焦点撮像システムで分析した。免疫蛍光標識スライドには、スライド上の緑(フルオレセインイソチオシアネート)および赤(シアニン−5.18)フルオロクロムを488nmおよび647nmのレーザービームにより励起し、そして発光を522nmおよび670nmの発光フィルターを通す光電子倍増管を用いて順次獲得した。mAb1281陽性細胞の総数は、全7個の塊に由来する各塊について5枚の連続スライド(100μm厚)を、細胞計数用のXYZステージエンコーダーを使用することにより測定した。26 次いで全前脳のmAb1281−陽性細胞の総数は、すべての7個の塊からmAb1281−陽性細胞数を合わせることにより算出した。動物あたり全部で500個のmAb1281−陽性細胞を計数して、細胞型に特異的なマーカー(NeuN、MAP−2、vWFおよびGFAP)と同時に局在するmAb1281−陽性細胞の割合を二重染色により得た。
ブレグマ−1.0に位置する上記の参照塊に由来する5枚の皮質パラフィンスライド(6μm厚;25−μm間隔)、1.0mmをアポトーシス細胞分析に使用した。これらのスライドはin situアポトーシス細胞検出のために、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼが媒介するdUTP−ビオチンニックエンド−ラベリング(TUNEL)法により染色された(ApopTag キット;オンコール(Oncor)、ゲチスバーグ、メリーランド州)。PBS中のH2O2で内因性のペルオキシダーゼ活性を消した後、スライドをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの中に置いた。抗−ジゴキシゲニン−ペルオキシダーゼをスライドに加え、そしてペルオキシダーゼを3,3’−ジアミノベンジジンで検出した。TUNEL染色後、スライドをメイヤー(Mayer)のヘマトキシリンでカウンター染色した。陰性対照スライドは各塊から行った。TUNEL調製物では、暗く茶色いアポトーシス体(>2)を含む細胞のみをアポトーシス細胞とした。
すべての測定は盲検的に行った。行動の採点(接着−除去ドット試験およびmNSS)
は正常について評価した。反復測定分析を行って行動の採点に及ぼす処置の効果を試験した。分析は0.1の有意さレベルで処置−時間の相互関係について試験することから始まり;全体の処置効果についての試験は、0.05の有意さレベルで相互関係が検出されない場合に行った。0.1の有意さレベルでの処置−時間の相互関係または0.05の有意さレベルでの全体的処置効果が存在するならば、各時点で各々の行動の採点に及ぼす処置効果のサブグループ分析を有意さレベル0.05で行った。あるいはサブグループ分析は予備的と考えた。損傷容量および細胞数という意味で、スチューデントt検定を使用して対照群と処置群との間の差異を評価した。ELISAデータはBDNFおよびNGF濃度の対数 対 光学密度の対数をプロットすることにより直線化し、そして回帰分析により最も合った直線を決定した。各標準、対照およびサンプルについて二連の読み取りの平均を作成し、そしてゼロ標準の光学密度の平均を引いた。処置および対照群の間の差異を試験するために、平均(SD)およびp値を提示する。
インビトロでのhMSCの増殖動力学
3名の健康なヒトドナーからの骨髄由来hMSCを、培養拡大により試験した。初代培養では、hMSCは形態学的に均一な繊維芽様細胞群に成長した。通常7日の間隔でその後の継代中、hMSCは密に詰められた螺旋状細胞の一巻として成長した。5週目の終わりに(4継代)、hMSCは5.4から6.6×107細胞の間の範囲になった(表2)。
なかった。これらのデータはhMSCがラット脾臓リンパ球に1次増殖応答を誘導でき、hMSCのラットへの投与は2次的なインビトロ増殖応答についてリンパ球をインビボで感作できないことを示す。
発作から14日後に、接着−除去ドット試験(p<0.05;図3A)およびmNSS試験(p<0.05;図3Bを参照にされたい)により示された機能的回復は、MCAOのみに供された対照ラットおよび3×106ラット肝臓繊維芽細胞を注射したラットに比べて、MCAOから1日後に3×106hMSCを注射したラットで見いだされた。
サンドイッチELISA法を使用して、BDNF(969±198pg/mL対434±59pg/mLおよび498±76pg/mL)およびNGF(1,227±111pg/mL対834±123pg/mLおよび980±55pg/mL)の分泌レベルは、細胞処置無しでMCAOのみから7日後の動物およびラット肝臓繊維芽細胞で処置したラットに比べて、hMSC処置ラットの虚血半球で増加した(p<0.05)。インビトロのデータは、hMSCがBDNFおよびNGFを時間依存的様式で分泌することを示す。BDNFおよびNGFにおける有意な上昇は、1日に比べて4および7日の培養で無血清培地中に検出された(表3)。
2時間のMCAOに供したラットに、虚血から1日後に3×106hMSCを注入し、そして形態学的分析のためにMCAOから14日後に屠殺した。H−Eで染色した皮質スライド内に、暗く、そして赤いニューロンがhMSC注射を含む、または含まないMCAOに供したすべてのラットの虚血中心部で観察された。虚血傷害の容量における有意な減少は、MCAOのみ(36.3%±10.5%)に供した対照ラット、またはMCAOから14日後にラットの肝臓繊維芽細胞を注射したラット(34.6%±9.1%)に比べて、hMSC−処置ラット(損傷容量、33.3%±7.6%)で検出されなかった。
多くのmAb1281で標識されたhMSC(全124×103±46×103の60%)が虚血境界領域に位置した。数個の細胞が反対側半球でも観察された(9×103±2×103;3×106hMSCの0.3%)。
hMSC処置を含むMCAOに供されたラットの同側半球のVZ/SVZで検出された(図7hを参照にされたい)。ブレグマ−1.0 1.0mmに位置する標準参照切片から5枚の皮質パラフィンスライド(6μm厚;25μm間隔)を、BrdU反応性細胞分析に使用した。hMSC処置を含むMCAOに供されたラットのVZ/SVZ中のスライドあたりBrdU−陽性細胞の数(95.3±24.1)は、MCAOのみに供したラット
(27.5±18.5)または肝臓繊維芽細胞で処置した虚血ラットのVZ/SVZ(37.8±11.2)よりも有意に高かった。発作から14日後、hMSC処置を含むMCAOに供したラットは、MCAOのみに供したラットまたは肝臓繊維芽細胞で処置したラットよりも、スライドあたり多数のBrdU陽性細胞が、NeuN(2.5±0.4対0.5±0.6または0.6±0.4;p<0.05)およびGFAP(4.4±2.3対1.4±1.1または1.7±0.5;p<0.05)を発現した。
発作から1日後のhMSCのIV注射は、MCAOのみに供したラットまたは肝臓繊維芽細胞を注射したラットに比べて、体性感覚採点およびmNSSに従い機能的成果を有意に改善した。この利点はラットにおいて、発作後に傷害を受けた実質細胞の修復を促進できるニュートロフィンを含む増殖因子の生産に影響を及ぼし、虚血境界領域のアポトーシスを減少し、そしてVZ/SVZ中の内因性神経幹および前駆細胞の増殖および分化を強化することができる。
環境の信号(cue)に応答する。これは損傷した組織中の細胞が組織の必要性に滴定された(titrated)栄養および増殖因子を発現することを示唆している。脳での発作のMSCを用いた処置では、特異的因子の単回の局在化注射とは明らかに対照的に、種々の栄養因子およびサイトカインが解剖学的に分布され、組織感受性で、しかも一時的に進行する様式で生産される。
神経損傷の処置:前臨床プロトコール
MSCが発作後の機能的回復を促進するという仮定の調査において、出願人は前臨床細胞治療プロトコールを実施するための様々な選択に直面した。中でも取り組むべき問題は、何時そして何処に細胞を移植するかということである。関心は修復治療であるので、虚血損傷のサイズが効果的な修復治療により改変しないと仮定して、出願人は最初に動物を発作から1日以上後に処置することを選んだ。31,32この時期は臨床的に合理的である。欠損が発作から1日持続する場合、この出来事は発作と分類され、そして一過性の虚血性攻撃とは分類されない。1日で患者は安定し、そして神経欠損の重症度を容易に評価することができる。
かった。
して行くべき場所を知るのか?どのメカニズムがこれらの細胞を損傷部位に特異的に標的させるのか?しかし最も興味深い問題は細胞が脳に及ぼす効果、およびこれらの効果がどのように治療的利益に翻訳されるのかである。
静脈内注射された細胞はどこへ行くのか?最初に、注射された細胞を、それらが組織中で同定できるようにするために印を付けなければならない。MSCは種々の標識に反応性の抗体により同定することができる。MSCはブロモデオキシウリジンで標識することができる;オスに由来する細胞をメスの動物に注射し、そしてin−situハイブリダイゼーションによりY染色体を同定することができる;あるいはヒト細胞をラットに注射し、そしてヒト抗原に対する抗体を使用することができる。静脈内に注射された細胞は肝臓、腎臓、脾臓および骨髄内に見いだされた。しかし最も確認されたMSCはこれらの器官内で微血管を囲み、実質に局在する細胞はほとんど無い。大変わずかな細胞(処置から14〜35日後に、3百万個の注射されたMSCの1.5〜3.0%)が脳組織の実質に検出された。損傷した脳では、発作後または外的損傷後であろうとも、ほとんどの細胞が損傷の領域を標的とした。例えば発作後、80%より多くの細胞が影響を受けた半球内にあり、これら細胞のほとんどが損傷の回りの領域内に集まった。多くの細胞が血管に隣接またはその中にも存在した。細胞はどのようにして損傷した組織を標的とし、そしてこれら細胞の微小脈管への局在化は重要なのか?
細胞がどのように脳に影響を及ぼし、そしてそれにより損傷および病理的プロセスから機能的回復が促進されるのか?脳細胞になることによりMSCが大脳組織に与える利益の可能性の見込は無いようである。静脈内注射および多くても数十万を数える実質内細胞数で、たとえそれらが脳細胞になっても、数立方ミリメートル強の組織容量を交換するための大変少量の細胞が存在するだけである。多くの場合で利益は処置から2、3日に検出さ
れる。多くてもわずかな比率の細胞が実質細胞の表現型のタンパク質を発現する。これらタンパク質の発現は真の分化およびニューロンまたはグリア−細胞機能を示さない。そのような短期間の後、さらに分化した細胞が組織に真に一体化され、そして機能を向上させる複雑な結合を形成する見込みはほとんどない。このようにMSCがそれらの有益な効果を促進することによるメカニズムとしての組織代替はありそうにもない。この利益についてより合理的な説明は、MSCが脳の内因性の回復効果を活性化するように大脳組織を誘導するということである。MSCは反応を始め、そして脳と相互作用して回復的、そして恐らくは再生的メカニズムを活性化することができる。
GFでの発作の処置が機能的回復を有意に改善し、そして血管新生を増加することを示した。
この細胞治療の形態が発作の患者に使用できる前に、明らかに安全性の問題に取り組まなければならない。骨髄移植は癌処置では普通の手順であり、そして多発性硬化症における併用療法としても使用されてきたが、発作における安全性に関するフェイズI実験が認められている。今日まで発作を生じたほぼ2000匹の動物に関する実験で、出願人は治療のいかなる副作用または腫瘍形成の兆候も検出しなかった。患者は彼ら自身の細胞、HLAが合った細胞またはユニバーサル−ドナー群で処置されるべきか?これまでの前臨床データは、ドナー細胞による処置が可能であることを示唆している。しかし前臨床およびフェイズI臨床試験はこの問題に取り組むために行なわなければならない。この再考を説明する前臨床および基本的試験は、MSCでの発作の処置が現実的かつ高度に効果的な回復的治療を提供することができることを示す。すなわち臨床試験は実証される。
の説明的性質を持つことを意図していると理解される。
分化前の組織からヒト間葉系幹細胞を単離し、そして精製し;そして
神経学的および筋骨格治療用の道具を生産するために間葉系幹細胞を培養拡大する、
工程を含んでなる上記方法。
Claims (1)
- 血管新生および脈管形成の誘導に使用する治療薬であって、該治療薬が幹細胞から単離された血管新生および脈管形成誘導因子を、血管新生および脈管形成を誘導するための製薬学的に許容され得る細胞治療薬と一緒に含んでなる上記治療薬。
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