JP2009545301A - 涙リポカリンの突然変異タンパク質およびそれを得るための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)ヒト涙リポカリンをコードする核酸分子を、天然の成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106および108のうちのいずれかの少なくとも1つのコドンでの突然変異誘発にさらすことにより、ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質をコードする複数の核酸を得るステップであって、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列の配列位置61および153でシステイン残基をコードするコドンの少なくとも1つが、任意の他のアミノ酸残基をコードするように突然変異されているステップ、
(b)(a)で得られた1つまたは複数の突然変異タンパク質核酸分子を発現系において発現させることより、1つまたは複数の突然変異タンパク質を得るステップ、および
(c)ステップ(b)で得られた、ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに対する検出可能な結合親和性を有する1つまたは複数の突然変異タンパク質を選択および/または単離によって濃縮するステップ、
を含む方法を提供する。
(a)ヒト涙リポカリンをコードする核酸分子を、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置34、80、および104のうちのいずれかの少なくとも1つのコドンでの突然変異誘発にさらすことにより、ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質をコードする複数の核酸を得るステップ、
(b)(a)で得られた1つまたは複数の突然変異タンパク質核酸分子を発現系において発現させることにより、1つまたは複数の突然変異タンパク質を得るステップ、および
(c)ステップ(b)で得られた、ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに対する検出可能な結合親和性を有する1つまたは複数の突然変異タンパク質を選択および/または単離によって濃縮するステップ、
を含む方法を提供する。
(i)免疫学的ハプテン、ペプチド、タンパク質、または例えば多糖、核酸分子(例えばDNAもしくはRNA)、または完全ウイルス粒子もしくはウイロイド等の他の高分子の特徴を示す遊離形態またはコンジュゲート形態の化合物から成る群から選択される化合物を所与のリガンドとして提供すること、
(ii)複数の突然変異タンパク質を上述のリガンドと接触させて、上述のリガンドと、上述のリガンドに対する結合親和性を有する突然変異タンパク質との複合体の形成を可能にすること、および
(iii)結合親和性を有していないまたは実質的に有していない突然変異タンパク質を除去すること、
をさらに含む。
(1)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Gly;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Ile;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(2)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Lys;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Asn;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(3)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(4)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Ser;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(5)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→His;Leu33→Tyr;Glu34→Ser;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Ala;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(6)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Asp;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Lys;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;および
(7)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Gly;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Glnのうちの1つを含む。
(1)Arg26→Ser,Glu27→Ile,Glu30→Ser,Met31→Gly,Asn32→Arg,Leu33→Ile,Glu34→Tyr,Leu56→Lys,Ile57→Phe,Ser58→Arg,Asp80→Ser,Lys83→Glu,Glu104→Leu,Leu105→Ala,His106→Val,Lys108→Thr;
(2)Arg26→Ser,Glu27→Ile,Glu30→Ser,Met31→Gly,Asn32→Arg,Leu33→Ile,Glu34→Tyr,Leu56→Glu,Ile57→Phe,Ser58→Arg,Asp80→Ser,Lys83→Glu,Glu104→Leu,Leu105→Ala,His106→Val,Lys108→Thr;
(3)Arg26→Ser,Glu27→Ile,Glu30→Ser,Met31→Gly,Asn32→Arg,Leu33→Ile,Glu34→Tyr,Leu56→Ala,Ile57→Phe,Ser58→Arg,Asp80→Ser,Lys83→Glu,Glu104→Leu,Leu105→Ala,His106→Val,Lys108→Thr;および
(4)Arg26→Ser;Glu27→Ile;Glu30→Ser;Met31→Gly;Asn32→Arg;Leu33→Ile;Glu34→Tyr;Leu56→Glu;Ile57→Phe;Ser58→Arg;Asp80→Pro;Lys83→Glu;Glu104→Leu;Leu105→Ala;His106→Val;Lys108→Thrのうちの1つを含んでいてもよい。
(1)Arg26→Ser;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Asn;Lys108→Val;
(2)Arg26→Pro;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Glu;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(3)Arg26→Pro;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Asn;Lys108→Val;
(4)Arg26→Pro;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→Arg;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(5)Arg26→Pro;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(6)Arg26→Ser;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(7)Arg26→Val;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(8)Arg26→Leu;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;および
(9)Arg26→Ile;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Valのうちの1つを含んでいてもよい。
高度に複雑な、涙リポカリン(Tlc)のランダムライブラリーは、成熟野生型ヒト涙リポカリンの18個の選択されたアミノ酸位置26、27、28、29、30、31、32、33、34、56、57、58、80、83、104、105、106、および108の協奏的突然変異誘発によって調製した。このために、対応するコドンが標的様式でランダム化された遺伝子カセットを、先に記載された戦略に従って、2ステップで、縮重プライマーオリゴデオキシヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を介して構築した(Skerra,A.(2001)「Anticalins」:a new class of engineered−ligand−binding proteins with antibody−like properties.J.Biotechnol.74、257〜275)。このライブラリー設計では、涙リポカリンの野生型配列の最初の4つのN末端アミノ酸残基(HHLA)および最後の2つのC末端アミノ酸残基(SD)を欠失させた(この理由で、添付の配列リストに示されるすべての涙リポカリン突然変異タンパク質は、N末端残基として野生型配列のAla5およびC末端残基としてGly156を有する(例えば、後者はアフィニティータグに任意選択で融合される))。
ファージミドディスプレイおよび選択は、次の改変を有するWO2006/56464号の実施例2に記載されるように本質的に、実施例1から得られたファージミドを利用して行った:標的タンパク質(IL−4受容体アルファ、Peprotech)は200nMの濃度で利用し、ビオチン化タンパク質としてライブラリーに提示し、ストレプトアビジンビーズ(Dynal)を使用するファージ−標的複合体の捕捉を続けた。あるいは、標的タンパク質は、200nMの濃度でFc融合タンパク質(IL−4受容体アルファ−Fc、R&D Systems)として利用し、メーカーの指示に従って、プロテインGビーズ(Dynal)を使用するおよび抗ヒトFc捕捉抗体(Jackson Immuno Research)をコートしたイムノスティック(Nunc)上でのFc融合タンパク質の固定化によるファージ−標的複合体の捕捉を続けた。3または4回の選択を行った。
実施例2に従って選択された突然変異タンパク質のスクリーニングは、次の改変を有するWO2006/56464号の実施例3に記載されるように本質的に行った:発現ベクターはpTLPC10(図1)とした。使用した標的タンパク質は、共に2μg/mlのIL−4受容体アルファ−Fc(R&D Systems)およびIL−4受容体アルファ(Peprotech)とした。
突然変異タンパク質S148.3 J14(配列番号2)に基づいた変異体のライブラリーの生成は、オリゴヌクレオチドTL50bio(配列番号15)およびTL51bio(配列番号16)を使用して、WO2006/56464号の実施例5に記載されるように本質的に行い、平均で構造遺伝子当たり3つの置換を有するライブラリーがもたらされた。
突然変異タンパク質S148.3 J14(配列番号2)に基づいた変異体のライブラリーは、位置34、53、55、58、61、64、および66のランダム化によって設計し、これらの位置ですべての20種のアミノ酸を考慮した。ライブラリーは、デオキシヌクレオチドTL70(配列番号17)、TL71(配列番号18)、およびTL72(配列番号19)をそれぞれTL46、TL47、およびAN−14の代わりに使用した改変を伴って、実施例1に記載されるように本質的に構築した。
スクリーニングは、3nM IL−4受容体アルファ−Fc(R&D Systems)の濃度を使用したといった改変ならびにi)モノクローナル抗Strepタグ抗体(Qiagen)は産生された突然変異タンパク質を捕捉するためにELISAプレート上にコートし、涙リポカリンの捕捉された突然変異タンパク質に対するIL−4受容体アルファ−Fc(R&D Systems、3nMおよび0.75nM)の結合は、IL−4受容体アルファ−FcのFcドメインに対するHRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)コンジュゲートポリクローナル抗体を使用して検出したといった追加を伴って、実施例3に記載されるように行った。さらに、代替スクリーニング設定では、ii)IL−4はELISAプレート上にコートし、IL−4受容体アルファ−Fc(R&D Systems、3nM)は発現突然変異タンパク質と共にインキュベートし、非占有IL−4結合部位を有するIL−4受容体アルファ−Fcの結合は、IL−4受容体アルファ−FcのFcドメインに対するHRPコンジュゲートポリクローナル抗体を使用して検出した。
IL−4受容体アルファ特異的突然変異タンパク質の調製用の産生については、発現ベクターpTLPC10(図1)上にコードされたそれぞれの突然変異タンパク質を収容している大腸菌K12株JM83を、Schlehuber、S.ら(J.Mol.Biol.(2000)、297、1105〜1120)に記載されるプロトコールに従ってLBアンピシリン培地中で2L振盪フラスコ培養物中で増殖させた。大量のタンパク質を必要とする場合、それぞれの発現ベクターを収容している大腸菌株W3110を、Schiweck,W.およびSkerra,A.Proteins(1995)23、561〜565)に記載されるプロトコールに基づいて、1lまたは10l管中でのベンチトップ発酵槽培養を介しての周辺質の産生のために使用した。
親和性測定は、約400RUのIL−4受容体アルファ−Fc(R&D Systems)を固定化し(WO2006/56464号で標的として使用される2000RUのヒトCTLA−4またはネズミCTLA−4−Fcの代わりに)、100μlの突然変異タンパク質を25nMの濃度で注射した(WO2006/56464号で使用される、5〜0.3μMの濃度の、40μl試料精製リポカリン突然変異タンパク質の代わりに)といった改変を伴って、WO2006/56464号の実施例9に記載されるように本質的に行った。
選択された突然変異タンパク質による、IL−4およびIL−4受容体アルファの間の相互作用の阻害を阻害ELISAで評価した。したがって、一定濃度のIL−4受容体アルファ(0.5nMビオチン化IL−4受容体アルファ、Peprotechまたは15nM IL−4受容体アルファ−Fc、R&D Systems)を希釈系列の涙リポカリン突然変異タンパク質とインキュベートし、非占有IL−4結合部位を有するIL−4受容体アルファの量を、プレートをIL−4またはアンタゴニスト抗IL−4受容体アルファモノクローナル抗体でコートしたELISAで定量化した。結合したビオチン化IL−4受容体アルファはHRPコンジュゲートExtravidin(Sigma)を使用して検出し、ビオチン化IL−4受容体アルファの規定量の標準曲線と比較した。S148.3 J14、S191.5 K12、S191.4 B24、S191.4 K19、S191.5 H16、S197.8 D22、およびS148.3 J14AM2C2の突然変異タンパク質を利用する測定からの結果を図12〜18に表し、表2に要約する。表2は、競合ELISAによって決定される、本発明の選択された涙リポカリン突然変異タンパク質のアンタゴニスト能力およびIL−4受容体アルファに対する親和性を示し、3回の実験の平均(標準の偏差)を示す。
IL−4およびIL−13刺激TF−1細胞増殖アッセイを、Lefortらに記載されるように本質的に行った(Lefort S.、Vita N.、Reeb R.、Caput D.、Ferrara P.(1995)FEBS Lett.366(2〜3)、122〜126)。TF−1増殖アッセイからの結果を図19に表す、またその結果は、高度な親和性の変異体S191.5 K12、S191.4 B24、S191.4 K19、S191.5 H16、S197.8 D22、およびS148.3 J14AM2C2がIL−4およびIL−13誘発性のシグナル伝達および増殖の強力なアンタゴニストであることを示す。
TF−1細胞は、10%加熱不活性化ウシ胎仔血清、2mM L−グルタミン、100ユニット/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを含有し、2ng/ml組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を補足したRPMI1640中で培養した。細胞は、直径100mmの組織培養皿中に20ml培地の全容量で5×104細胞/mlで接種し、分割し、2〜3日毎にこの濃度で再接種し、5%CO2の加湿大気中で37℃で培養した。
健常なヒトボランティアからの全血を9mlリチウムヘパリンチューブ中にAstra Zeneca(Macclesfield、UK)の臨床薬理部(CPU)によって収集した。カニクイザル由来のヘパリン処理した全血の試料(最低2匹の動物からプール)は、Harlan Sera−Lab(Bicester、UK)またはB and K Universal Ltd(Hull、UK)から得た。
実施例1から得られたファージミドを利用するファージミドディスプレイおよび選択は、次の改変を伴って、実施例2に記載されるように本質的に行った:標的タンパク質、つまりヒトVEGF−Aの組換え断片(VEGF8〜109、成熟ポリペプチド鎖のアミノ酸8〜109)を200nMの濃度で利用し、ビオチン化タンパク質としてファージミドライブラリーに提示し、メーカーの指示に従ってストレプトアビジンビーズ(Dynal)を使用するファージ−標的複合体の捕捉を続けた。4回の選択を行った。
実施例13で得られたTlc突然変異タンパク質のスクリーニングは、実施例11から得た組換え標的タンパク質VEGF8〜109を5μg/mlで利用し、マイクロタイタープレートに直接コートしたといった改変を伴って、実施例3に記載されるように本質的に行った。合計して2124個のクローンのスクリーニングは、972個の初代ヒットの同定につながり、ライブラリーからの突然変異タンパク質の単離がうまく行われたことを示す。このアプローチを使用して、Tlc突然変異タンパク質S168.4−L01(配列番号26)を同定した。
突然変異タンパク質S168.4−L01に基づいた変異体のライブラリーの生成は、オリゴヌクレオチドTL50bio(配列番号15)およびTL51bio(配列番号16)を使用して、実施例4に記載されるように本質的に行い、平均で構造遺伝子当たり5つの置換を有するライブラリーがもたらされた。
実施例15で選択された突然変異タンパク質のスクリーニングは、モノクローナル抗T7タグ抗体(Novagen)は産生された突然変異タンパク質を捕捉するためにELISAプレート上にコートし、捕捉されたTlc突然変異タンパク質に対するビオチン化VEGF8〜109(500nMおよび50nM)の結合はHRPコンジュゲートExtravidinを使用して検出したといった改変を伴って、実施例14に記載されるように行った。
産生は実施例7に記載されるように本質的に行った。
親和性測定値は、約250RUの組換えVEGFが標準のアミンの化学的性質を使用してセンサーチップに直接つながれた改変を伴って、実施例8に記載されるように本質的に行った。実施例15から得た40μlのTlc突然変異タンパク質を400nMの濃度で注入した。
VEGFおよびVEGF受容体2(VEGF−R2)の間の相互作用の阻害を阻害ELISAで評価した。このために、一定濃度のビオチン化VEGF8〜109(1nM)を希釈系列のそれぞれのTlc突然変異タンパク質とインキュベートし、非占有VEGF−R2結合部位を有するVEGFの量を、VEGF/VEGF−R2相互作用に干渉する抗VEGF抗体(MAB293、R&D Systems)をコートしたELISAで定量化した。結合したVEGFはHRPコンジュゲートExtravidin(Sigma)を使用して検出し、VEGFの規定量の標準曲線と比較した。突然変異タンパク質S209.2−C23、S209.2−D16、S209.2−N9、S209.6−H7、S209.6−H10、S209.2−M17、およびS209.2−O10(配列番号27〜33)を利用する測定からの結果を表6に要約する。表6は、競合ELISAによって決定される、本発明の選択された涙リポカリン突然変異タンパク質のアンタゴニスト能力およびVEGFに対する親和性を示す。
VEGFおよびFGF−2刺激HUVEC細胞増殖の阻害は、次の改変を伴って、以前に記載されるように本質的に判定した(Korherr C.、Gille H、Schafer R.、Koenig−Hoffmann K.、Dixelius J.、Egland K.A.、Pastan I.、およびBrinkmann U.(2006)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)103(11)4240〜4245):HUVEC細胞(Promocell)はメーカーの推奨に従って成長させ、継代2および6の間に使用した。1日目、1,400個の細胞を完全培地(Promocell)中に接種した。翌日、細胞を洗浄し、0.5%FCS、ヒドロコルチゾン、およびゲンタマイシン/アンホテリシンを含有するが他の栄養剤を含有しない基本培地(Promocell)を添加した。VEGF特異的突然変異タンパク質S209.2−C23、S209.2−D16、S209.2−N9、S209.6−H7、S209.6−H10、S209.2−M17、S209.2−O10(配列番号27〜33)、野生型涙リポカリン(pTLPC10の遺伝子産物;コントロール)、またはVEGF特異的治療モノクローナル抗体Avastin(登録商標)(Roche;コントロール)を3通りのウェル中に示す濃度で希釈系列で添加し、30分後、ヒトVEGF165(R&D Systems)またはヒトFGF−2(Reliatech)を添加した。細胞の生存率を、メーカーの指示に従ってCellTiter 96 Aqueous One(Promega)を用いて6日後に判定した。
実施例1から得られたファージミドを利用するファージミドディスプレイおよび選択は、次の改変を伴って、実施例2に記載されるように本質的に行った:標的タンパク質VEGF−R2−Fc(R&D Systems)を200nMの濃度で利用し、Fc融合タンパク質としてライブラリーに提示し、メーカーの指示に従ってプロテインGビーズ(Dynal)を使用するファージ−標的複合体の捕捉を続けた。4回の選択を行った。
スクリーニングは、標的タンパク質VEGF−R2−Fc(R&D Systems)を2.5μg/mlの濃度で使用したといった改変を伴って実施例3に記載されるように本質的に行った。
突然変異タンパク質S175.4 H11に基づいた変異体のライブラリーの生成は、オリゴデオキシヌクレオチドTL50bio(配列番号15)およびTL51bio(配列番号16)を使用して、実施例4に記載されるように本質的に行い、平均で構造遺伝子当たり2つの置換を有するライブラリーがもたらされた。
スクリーニングは、モノクローナル抗T7タグ抗体(Novagen)を産生されたTlc突然変異タンパク質を捕捉するためにELISAプレート上にコートし、捕捉された突然変異タンパク質へのVEGF−R2−Fc(R&D Systems、3nMおよび1nM)の結合をVEGF−R2−FcのFcドメインに対するHRPコンジュゲート抗体を使用して検出したといった改変を伴って、実施例3に記載されるように行った。
産生は実施例7に記載されるように本質的に行った。
親和性測定は、約500RUのVEGF−R2−Fc(R&D Systems)を捕捉したといった改変を伴って実施例8に記載されるように本質的に行い、80μlの突然変異タンパク質を1.5μMの濃度で注入した。
VEGF−R2特異的突然変異タンパク質による、VEGFおよびVEGF−R2の間の相互作用の阻害を阻害ELISAで評価した。したがって、一定濃度のVEGF−R2(4nM VEGF−R2−Fc、R&D Systems)を希釈系列のそれぞれの突然変異タンパク質とインキュベートし、非占有VEGF結合部位を有するVEGF−R2の量をVEGF8〜109をコートしたELISAで定量化した。結合したVEGF−R2はHRPコンジュゲート抗ヒトFc抗体(Dianova)を使用して検出し、VEGF−R2−Fcの特定量の標準曲線と比較した。S175.4−H11、S197.7−N1、S197.2−I18、S197.2−L22、S197.7−B6、およびS197.2−N24(配列番号35〜39)の測定からの結果を表8に要約する。表8は、競合ELISAによって決定される、本発明の選択された涙リポカリン突然変異タンパク質のアンタゴニスト能力およびVEGF−R2に対する親和性を示す。
不対システイン残基は、活性化PEGとつなぐための反応基を提供するために、IL−4受容体アルファ特異的突然変異タンパク質S148.3 J14(配列番号2)の位置131のアミノ酸Gluの代わりに点突然変異(point mutation)によって導入した。遊離Cys残基を保有する組換え突然変異タンパク質を、実施例7に記載されるように大腸菌中で続いて産生した。
親和性測定は、約500RUのIL−4受容体アルファ−Fc(R&D Systems)を固定化し、80μlの精製されたPEG化突然変異タンパク質を200nM、67nM、および22nMの濃度で注入したといった改変を伴って、実施例8に記載されるように本質的に行った。測定の結果を図22に表し、表9に要約する。そのPEG化形態(約30nM)の突然変異タンパク質S148.3 J14の親和性は、PEG化されていない突然変異タンパク質(約37nM、実施例8を参照されたい)と比較してほとんど不変である。表9は、Biacoreによって決定される、IL−4受容体アルファに対する本発明のPEG化突然変異タンパク質S148.3 J14の親和性を示す。
突然変異タンパク質S209.6−H10(配列番号30)に基づいた変異体のライブラリーは、位置26、69、76、87、89、および106のランダム化によって設計し、これらの位置ですべての20種のアミノ酸を考慮した。ライブラリーは、デオキシヌクレオチドTL107(カバー位置26)、TL109(カバー位置87および89)、TL110(カバー位置106)、ならびにTL111(カバー位置69および76)を、TL46、TL47、TL48、ならびにTL49の代わりにそれぞれ使用したといった改変を伴って、実施例1に記載されるように本質的に構築した。ファージミド選択は、限られた標的濃度(VEGF8〜109の10pMおよび2pMおよび0.5pM)を使用してまたはVEGFに対する競合的モノクローナル抗体(Avastin(登録商標))と組み合わせて、実施例13に記載されるように本質的に実行した。4回の選択を行った。
TL107(配列番号40):GAAGGCCATGACGGTGGACNNSGGCGCGCTGAGGTGCCTC
TL109(配列番号41):GGCCATCGGGGGCATCCACGTGGCANNSATCNNSAGGTCGCACGTGAAGGAC
TL110(配列番号42):CACCCCTGGGACCGGGACCCCSNNCAAGCAGCCCTCAGAG
TL111(配列番号43):CCCCCGATGGCCGTGTASNNCCCCGGCTCATCAGTTTTSNNCAGGACGGCCCTCACCTC
スクリーニングは、1μg/ml VEGFの濃度を使用したといった修飾ならびに
i)モノクローナル抗T7タグ抗体(Novagen)は産生された突然変異タンパク質を捕捉するためにELISAプレート上にコートし、涙リポカリンの捕捉された突然変異タンパク質へのビオチン化VEGF(3nMおよび1nM)の結合はHRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)コンジュゲートextravidinを使用して検出したといった追加を伴って、実施例14に記載されるように行った。さらに、代替スクリーニング設定では、
ii)ヒトVEGF8〜109の代わりに、マウスVEGF164(R&D Systems)をマイクロタイタープレート(1μg/ml)に直接コートした。
iii)VEGF結合突然変異タンパク質を含有する抽出物を1時間で60℃に加熱した。
iv)mAB293(R&D Systems、5μg/ml)をELISAプレート上にコートし、ビオチン化VEGF8〜109を発現突然変異タンパク質とプレインキュベートした。mAB293へのVEGF8〜109の結合は、HRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)コンジュゲートextravidinを使用して検出した。
産生は実施例7に記載されるように本質的に行った。
親和性測定は実施例18に記載されるように本質的に行った(固定化されたVEGF8〜109へのヒト涙リポカリン突然変異タンパク質S236.1−A22(配列番号44)の結合のBiacore測定を示す図23も参照されたい)。手短かに言えば、VEGF8〜109は標準のアミンの化学的性質を使用してCM5チップ上に固定化した。リポカリン突然変異タンパク質は、500nM〜16nMの6つの濃度で30μl/分の流速で加えた。センサーグラムの評価は、それぞれの突然変異タンパク質のKon、Koff、およびKDを決定するためにBIA T100ソフトウェアを用いて行った。表10は、25℃でのBiacore測定によって決定される、VEGFに対する本発明の選択された突然変異タンパク質の親和性を示す。
VEGFおよびVEGF受容体2(VEGF−R2)の間の相互作用の阻害は、1時間のインキュベーション時間を10分間に減らした改変を伴って、本質的に実施例19に記載されるように阻害ELISAで評価した。阻害定数を下表11に要約する。表11は、競合ELISAによって決定される、本発明の選択された涙リポカリン突然変異タンパク質のアンタゴニスト能力およびVEGFに対する親和性を示す。
親和性測定は、突然変異タンパク質S236.1−A22(配列番号44)をセンサーチップ上に固定化したといった改変を伴って実施例18に記載されるように本質的に行った。70μlの試料を250nMの濃度で注入した。
円二色性測定は、使用した波長を228nMとする改変を伴って国際特許出願WO2006/056464号の実施例14に記載されるように本質的に行った。例えば、涙リポカリン突然変異タンパク質S236.1−A22(配列番号44)の融解温度Tmは、75℃であると決定された。
PBSおよびヒト血清中での37℃でのVEGF結合突然変異タンパク質S236.1−A22の安定性は、利用した濃度を1mg/mlとしたことを除いて、国際特許出願WO2006/056464の実施例15に記載されるように本質的に試験した。突然変異タンパク質の変化は、HPLC−SECによって判断されるようにPBS中での7日間のインキュベーション期間の間に検出することができなかった(データ示さず)。ヒト血清中のリポカリン突然変異タンパク質のインキュベーションは、基準と比較しておよそ70%まで7日後に親和性の低下をもたらした(図25aも参照されたい)。
血清半減期延長目的については、抗VEGF突然変異タンパク質をアルブミン結合ドメイン(ABD)とC末端で融合した。発現に使用した遺伝子構築物をpTLPC51_S236.1−A22(配列番号50)と名付けた。(図26を参照されたい)
S236.1−A22−ABD IC50:760pM
S236.1−A22−ABD(+HSA)IC50:470pM
HUVEC(Promocell)はゼラチンをコートした皿上で増し、継代P2およびP8の間に使用した。1日目、1400個の細胞を、完全培地中に96ウェルプレート中にウェル毎に接種した。2日目、細胞を洗浄し、0.5%FCS、ヒドロコルチゾン、およびゲンタマイシン/アンホテリシンを含有する100μlの基本培地を添加した。増殖は、リポカリン突然変異タンパク質S236.1−A22(配列番号44)と混合し、30分間インキュベートし、ウェルに添加した20ng/ml VEGF165または10ng/ml FGF−2を用いて刺激した。生存率は6日目に決定し、結果は阻害%として表現する。IC50値は以下のとおりに決定された(図29も参照されたい)。FGF−2媒介性の刺激はVEGFアンタゴニストによって影響を与えられなかった(データ示さず)。
S236.1−A22 IC50:0.51nM
Avastin IC50:0.56nM
HUVECは、標準の培地(Promocell、Heidelberg)中にウェル当たり1,400個の細胞で96ウェルプレート中に接種した。翌日、FCSを0.5%に低下させ、培養を16時間継続した。次いで、細胞を5時間基本培地中0.5%BSA中で飢餓状態にした。HUVECは、用量応答曲線を得るために、増加性の濃度の涙リポカリン突然変異タンパク質A22またはAvastin(ベバシズマブ、Genentech/Roche)の存在下で10分間VEGF165(Reliatech、Braunschweig)を用いて刺激した。MAPキナーゼERK1およびERK2のリン酸化は、メーカーのマニュアル(Active Motif、Rixensart、Belgium)に従ってELISAを使用して定量化した。IC50値は突然変異タンパク質A22(配列番号44)について4.5nMおよびAvastin(登録商標)について13nMであると決定された(図30を参照されたい)。
体重が350±50gのDuncan−Hartleyモルモットは、肩および背を剪毛した。動物は、1mlの1%Evan’s Blue色素の耳静脈を介しての静脈内注射を受けた。30分後、20ng VEGF165(Calbiochem)を10倍のモル過剰で試験物質またはコントロール物と混合し、3×4グリッド上に皮内に注射した。30分後、動物はCO2窒息によって安楽死させた。VEGF注射の1時間後に、グリッドパターンを含有する皮膚を摘出し、結合組織をきれいにした。色素血管外遊出のエリアは、画像解析器(Image Pro Plus 1.3、Media Cybernetics)の使用によって定量化した(図31を参照されたい)。
示されるようにFGF−2(500ng)、VEGF(150ng)、および涙リポカリン突然変異タンパク質(1.35μg)またはAvastin(10μg)を含有するコラーゲンオンプラント(onplant)を10日目のニワトリ胚(4つ/動物、10匹の動物/グループ)のCAMの上に置いた。24時間目に、涙リポカリン突然変異タンパク質またはAvastinを同じ用量でオンプラントに局所的に再び適用した。72時間後に、オンプラントを収集し、画像を保存した。少なくとも1つの血管を含有するポジティブグリッドの百分率を盲検化した観察者によって決定した。中央値の血管形成指数は、VEGFアンタゴニストであるS209.2−O10(配列番号33)およびAvastin(登録商標)ならびに陽性グリッドの画分としての野生型涙リポカリンコントロールについて報告する(図32を参照されたい)。
i.v.の後の涙リポカリン突然変異タンパク質S236.1 A22(配列番号44)(4mg/kg)およびi.v.またはi.p.単一ボーラス投与の後でのABDとの突然変異タンパク質S236.1 A22の融合タンパク質(配列番号51)(5.4mg/kg)についての薬物動態(PK)パラメーター(半減期血漿濃度、生物学的利用率)をNMRIマウスで決定した。血漿は、事前に決めた時点で採取した末端血液試料から調製し、リポカリン突然変異タンパク質の濃度はELISAによって決定した。結果は、WinNonlinソフトウェア(Pharsight Corp.、Mountain View、USA)を使用して分析した。T1/2 A22 i.v.:0.42時間;T1/2 A22−ABD i.v.:18.32時間;T1/2 A22−ABD i.p.:20.82時間。融合タンパク質A22−ABDのi.p.投与の後での生物学的利用率は82.5%であった(図33を参照されたい)。
実験の12時間前に、試験物質またはコントロールをグループ当たり3匹の動物に静脈内に注射した。グループ1:PBS媒体;グループ2:Avastin、10mg/kg;グループ3:突然変異タンパク質S236.1 A22−ABD、6.1mg/kg;グループ4:TLPC51:6.1mg/kg。時間=0に、Evan’s Blueを注射した。30分後に、4つの用量のVEGF(5、10、20、または40ng)を3×4グリッド上に皮内に3通り注射した。VEGF注射の30分後に、動物を犠牲死させ、色素血管外遊出を上記のように定量化した(図34を参照されたい)。
照射(2.5Gy、Co60)スイスヌードマウスは、右側腹部中に、マトリゲル中の1×107 A673横紋筋肉腫細胞(ATTC)を皮下に接種した(グループ当たりn=12)。治療薬を腹腔内に投与し、同日に開始し、21日間継続した。グループ1:PBS媒体、毎日;グループ2:Avastin(ベバシズマブ、Genentech/Roche)、5mg/kg、3日毎;グループ3:突然変異タンパク質A22−ABD(配列番号51)、毎日、3.1mg/kg;グループ4:TLPC51、毎日、3.1mg/kg。リポカリンA22−ABDの用量は、マウスでのA22−ABD PKデータおよび抗体の推算された血清半減期に基づいて突然変異タンパク質およびAvastinのVEGF結合部位の等モル数が一定に存在することを達成するように選んだ。腫瘍サイズはカリパスを用いて毎週2回測定し、腫瘍量は式(長さ×幅2)/2によって推算した。腫瘍量が2,000mm3を超過した場合に、マウスを犠牲死させた(図35を参照されたい)。
例えば活性化PEGとつなぐための反応基を提供するために、不対システイン残基を部位特異的突然変異誘発によって導入した。遊離Cys残基を保有する組換え突然変異タンパク質を、実施例7に記載されるように大腸菌中で続いて産生し、発現収量を決定し、親和性を実施例14に記載されるようにELISAによって本質的に測定した。
A22_D95Cフォワード:GAGGTCGCACGTGAAGTGCCACTACATCTTTTACTCTGAGG(配列番号56)、
A22_D95Cリバース:CCTCAGAGTAAAAGATGTAGTGGCACTTCACGTGCGACCTC(配列番号57)、
A22_T40Cフォワード:GGGTCGGTGATACCCACGTGCCTCACGACCCTGGAAGGG(配列番号58)、
A22_T40Cリバース:CCCTTCCAGGGTCGTGAGGCACGTGGGTATCACCGACCC(配列番号59)、
A22_E73Cフォワード:CCGTCCTGAGCAAAACTGATTGCCCGGGGATCTACACGG(配列番号60)、
A22_E73Cリバース:CCGTGTAGATCCCCGGGCAATCAGTTTTGCTCAGGACGG(配列番号61)、
A22_E131Cフォワード:GCCTTGGAGGACTTTTGTAAAGCCGCAGGAG(配列番号62)、
A22_E131Cリバース:CTCCTGCGGCTTTACAAAAGTCCTCCAAGGC(配列番号63)、
A22_R90Cフォワード:CGTGGCAAAGATCGGGTGCTCGCACGTGAAGGACC(配列番号64)、および
A22_R90Cリバース:GGTCCTTCACGTGCGAGCACCCGATCTTTGCCACG(配列番号65)。
エオタキシン−3分泌アッセイを72時間にわたってA549細胞上で行った。A549細胞等の肺上皮細胞は、IL−4/IL−13刺激に際してエオタキシン−3を分泌する。したがって、A549細胞は、増加性の濃度のIL−4受容体アルファ結合突然変異タンパク質S191.4 B24(配列番号4)を用いて処理し、それぞれ0.7nM IL−4または0.83nM IL−13を用いて刺激した。エオタキシン−3分泌は市販のサンドイッチELISA(R&D Systems)を使用して72時間後に判定した。結果(図36)は、IL−4受容体アルファ結合突然変異タンパク質S191.4 B24が、それぞれ32および5.1nMのIC50値で、A549細胞中でIL−4およびIL−13媒介性のエオタキシン−3分泌を阻害することを実証する(表13)。表13は、A549細胞中でのIL−4およびIL−13媒介性のエオタキシン−3分泌に対するS191.4 B24のIC50値を示す。
全ヒトPBMCをバッフィーコートから単離した。PBMCを、増加性の濃度のIL−4受容体アルファ結合突然変異タンパク質S191.4 B24を用いて処理し、IL−4またはIL−13を、それぞれ、1.0nMおよび2.5nMの最終濃度まで添加した。PBMCを10%FCSを含有するRPMI培地中で48時間培養した。細胞を抗CD14−FITC抗体および抗CD23−PE抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーによって分析した。各時点について、すべてのCD14ポジティブ単球の中からのダブルポジティブ細胞の百分率を決定し、突然変異タンパク質濃度の関数としてプロットした。
Schild分析は、突然変異タンパク質の仮定された競合的結合モードを確かめ、かつ細胞上でのKdを決定するために実行した。TF−1細胞は、固定濃度のIL−4受容体アルファ結合突然変異タンパク質S191.4 B24(0、4.1、12.3、37、111.1、333.3、または1000nM)を用いて処理し、IL−4を用いて滴定し、細胞生存率を4日後に判定した(図38A)。EC50値を非線形回帰によって決定した。得られた結果の従来のSchild分析(図38B)から192pMのKdを得(線形回帰)、より正確な非線形回帰から116pMを得た。1.084のSchildの傾きは拮抗的阻害を示す、つまり、突然変異タンパク質およびIL−4はIL−4受容体アルファ結合について競合する。
PBMCをヒト血液から単離し、異なる濃度のIL−4受容体アルファ結合ヒト涙リポカリン突然変異タンパク質S191.4 B24または野生型ヒト涙リポカリン(TLPC26)と共にインキュベートした。次いで、細胞は、抗CD20−FITCモノクローナル抗体およびビオチン化抗リポカリン抗血清、その後ストレプトアビジン−PEを用いて染色した。野生型リポカリンおよびIL−4受容体アルファ結合リポカリン突然変異タンパク質S191.4 B24についての結果を図39AおよびBにそれぞれ示す。PEポジティブB細胞について決定した百分率をリポカリン突然変異タンパク質の濃度に対してあてはめ(図39C)、EC50を得られた曲線から算出した。IL−4受容体アルファ結合突然変異タンパク質S191.4 B24(配列番号4)の初代B細胞への結合についてのEC50は105pMとして算出された。
IL−4受容体アルファ結合突然変異タンパク質S191.4 B24の生物学的利用率は、ラットでの4mg/kgのボーラス注射(bolus injection)の後に4時間、突然変異タンパク質S191.4 B24の血漿濃度を監視することによって、静脈内、皮下、または気管内投与の後に決定した。気管内投与は、シリンジに付けられた長く薄いチューブの先端からのエアロゾルを生成する、市販で入手可能な気管内投薬デバイス(MicroSprayer(登録商標)、Penn−Century Inc、Philiadelphia、PA、USA)を使用して実行した。エアロゾルサイズは約20μmとした。非コンパートメント薬物動態(PK)分析の結果は、皮下注射に際しての100%の生物学的利用率および抗体とは対照的に、ヒト涙リポカリン突然変異タンパク質の肺送達は実現可能なように思われることを実証する。得られた結果を表15に示す。表15は、静脈内(i.v.)、皮下(s.c.)、および気管内(i.t.)投与の後のS191.4 B24の半減期および生物学的利用率を示す。
VEGF刺激HUVEC細胞増殖の阻害は、次の改変を伴って実施例20に記載されるように本質的に判定した:VEGF特異的突然変異タンパク質S236.1−A22(配列番号44)は、上記実施例28に記載されるように、位置95CでPEG20、PEG30、またはPEG40につないだ。突然変異タンパク質、そのPEG化誘導体、および野生型涙リポカリン(pTLPC26の遺伝子産物;コントロールとして)をVEGF165に希釈系列で添加し、室温で30分間インキュベートした。混合物を3通りのウェル中のHUVEC細胞に添加して、示されるように20ng/ml VEGFの最終濃度ならびに0.003nMおよび2,000nMの間の濃度を得た。細胞の生存率を、メーカーの指示に従ってCellTiter−Glo(Promega)を用いて6日後に判定した。
Claims (147)
- ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに検出可能な結合親和性で結合する、ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質を生成するための方法であって、
(a)ヒト涙リポカリンをコードする核酸分子を、天然の成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106および108のうちのいずれかの少なくとも1つのコドンでの突然変異誘発にさらすことにより、ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質をコードする複数の核酸を得るステップであって、前記成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列の配列位置61および153でシステイン残基をコードするコドンの少なくとも1つが、任意の他のアミノ酸残基をコードするように突然変異されているステップ、
(b)(a)で得られた前記1つまたは複数の突然変異タンパク質核酸分子を発現系において発現させることより、1つまたは複数の突然変異タンパク質を得るステップ、および
(c)(b)で得られた、ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに対する検出可能な結合親和性を有する前記1つまたは複数の突然変異タンパク質を選択および/または単離によって濃縮するステップ、
を含む方法。 - ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに検出可能な結合親和性で結合する、ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質を生成するための方法であって、
(a)ヒト涙リポカリンをコードする核酸分子を、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置34、80および104のうちのいずれかの少なくとも1つのコドンでの突然変異誘発にさらすことにより、ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質をコードする複数の核酸を得るステップ、
(b)(a)で得られた前記1つまたは複数の突然変異タンパク質核酸分子を発現系において発現させることより、1つまたは複数の突然変異タンパク質を得るステップ、および
(c)(b)で得られた、ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに対する検出可能な結合親和性を有する前記1つまたは複数の突然変異タンパク質を選択および/または単離によって濃縮するステップ、
を含む方法。 - 成熟ヒト涙リポカリンの前記線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106および108のうちのいずれかのコドンの少なくとも2、3、4、5、6、8、10、12、14または16個が突然変異されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置26、27、28、29、30、31、32、33、34、56、57、58、80、83、104、105、106および108のコドンの18個すべてが突然変異されることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置26〜33、56〜58、83、105〜106および108のうちのいずれかのコドンのさらに少なくとも2、3、4、5、6、8、10、12、14または15個が突然変異されることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置61および153をコードするコドンの少なくとも1つが、位置61でアラニン、フェニルアラニン、リシン、アルギニン、トレオニン、アスパラギン、チロシン、メチオニン、セリン、プロリンもしくはトリプトファンおよび/または位置153でセリンもしくはアラニンをコードするように突然変異されることを特徴とする請求項1ないし請求項5のいずれか1項に記載の方法。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記線状ポリペプチド配列のアミノ酸配列位置111および114をコードするコドンが位置111でアルギニンおよび位置114でトリプトファンをコードするように突然変異されることを特徴とする請求項1ないし請求項6のいずれか1項に記載の方法。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記線状ポリペプチド配列の位置101でシステインをコードするコドンが任意の他のアミノ酸をコードするように突然変異されることを特徴とする請求項1ないし請求項7のいずれか1項に記載の方法。
- 成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列の位置101でシステインをコードするコドンがセリンをコードするように突然変異されることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- ステップ(c)が、
(a)免疫学的ハプテン、ペプチド、タンパク質または他の高分子(macromolecule)の特徴を示す遊離形態またはコンジュゲート形態の化学化合物から成る群から選択される化合物を所与のリガンドとして提供し、
(b)前記リガンドと、前記リガンドに対する結合親和性を有する突然変異タンパク質との複合体の形成を可能にするために、前記複数の突然変異タンパク質を前記リガンドと接触させ、および
(c)結合親和性を有していないまたは実質的に有していない突然変異タンパク質を除去する、
ことをさらに含むことを特徴とする請求項1ないし請求項9のいずれか1項に記載の方法。 - 前記リガンドがタンパク質またはその断片(fragment)であることを特徴とする請求項1ないし請求項10のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(c)における前記選択を競合的条件下で実行することを特徴とする請求項1ないし請求項11のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも1つの突然変異タンパク質を所与のリガンドの結合について選択するために、突然変異誘発によって得られ、ヒト涙リポカリンの前記複数の突然変異タンパク質をコードする核酸を、M13ファミリーの糸状バクテリオファージのコートタンパク質pIIIまたはこのコートタンパク質の断片をコードする遺伝子と3’端で作動可能に融合することを特徴とする請求項1ないし請求項12のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1ないし請求項13のいずれか1項に記載の方法によって入手可能であり、ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドに対して検出可能な結合親和性を有するヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質。
- 野生型(wild−type)涙リポカリンの配列位置61および153に存在するシステイン残基が他のアミノ酸と交換され、少なくとも1つの突然変異したアミノ酸残基が成熟ヒト涙リポカリンの前記線状ポリペプチド配列の配列位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106および108のうちのいずれかに存在することを特徴とする請求項14に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記線状ポリペプチド配列の配列位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106および108の少なくとも2、3、4、5、6、8、10、12、14または16個の突然変異したアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項14または請求項15に記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置26、27、28、29、30、31、32、33、34、56、57、58、80、83、104、105、106および108の18個すべてで突然変異したアミノ酸残基を含むことを特徴とする請求項14または請求項15に記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸置換Cys61→Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Tyr、Met、Ser、ProまたはTrp、およびCys153→SerまたはAlaの少なくとも1つを含むことを特徴とする請求項14ないし請求項17のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- Arg111→ProおよびLys114→Trpから選択される少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項14ないし請求項18のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記配列の位置101でシステイン残基のアミノ酸置換をさらに含むことを特徴とする請求項14ないし請求項19のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- 突然変異Cys101→Serを含むことを特徴とする請求項20に記載の突然変異タンパク質。
- 酵素、タンパク質もしくはタンパク質ドメイン、ペプチド、シグナル配列、および/またはアフィニティータグにそのN末端またはそのC末端で作動可能に融合されることを特徴とする請求項14ないし請求項21のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- 突然変異タンパク質の血清半減期を延長する成分(moiety)に融合されることを特徴とする請求項14ないし請求項22のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- 前記血清半減期を延長する成分が、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミンまたはアルブミン断片、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質およびトランスフェリンから成る群から選択されることを特徴とする請求項23に記載の突然変異タンパク質。
- 前記アルブミン結合タンパク質が、細菌アルブミン結合タンパク質、アルブミンに対する抗体もしくは抗体断片、またはアルブミンに対する結合活性を有するリポカリン突然変異タンパク質であることを特徴とする請求項24に記載の突然変異タンパク質。
- 前記細菌アルブミンドメインが連鎖球菌プロテインGのアルブミン結合ドメインであることを特徴とする請求項25に記載の突然変異タンパク質。
- 前記アルブミン結合ペプチドが式Cys−Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Cysを有し、Xaa1がAsp、Asn、Ser、ThrまたはTrpであり;Xaa2がAsn、Gln、His、Ile、LeuまたはLysであり;Xaa3がAla、Asp、Phe、TrpまたはTyrであり;Xaa4がAsp、Gly、Leu、Phe、SerまたはThrであることを特徴とする請求項24に記載の突然変異タンパク質。
- 有機分子、酵素標識(label)、放射性標識、蛍光性標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、コロイド金および突然変異タンパク質の血清半減期を延長する成分から成る群から選択される標識にコンジュゲートされることを特徴とする請求項14ないし請求項21のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- 前記血清半減期を延長する成分が、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、パルミチン酸または他の脂肪酸分子、免疫グロブリンのFc部分、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミンまたはアルブミン断片、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質およびトランスフェリンから成る群から選択されることを特徴とする請求項28に記載の突然変異タンパク質。
- 前記アルブミン結合タンパク質が、細菌アルブミン結合タンパク質またはアルブミンに対する結合活性を有するリポカリン突然変異タンパク質であることを特徴とする請求項29に記載の突然変異タンパク質。
- 前記細菌アルブミンドメインが連鎖球菌プロテインGのアルブミン結合ドメインであることを特徴とする請求項30に記載の突然変異タンパク質。
- 前記ポリアルキレングリコールがポリエチレン(PEG)またはその活性化誘導体であることを特徴とする請求項29に記載の突然変異タンパク質。
- 前記アルブミン結合ペプチドが式Cys−Xaa1−Xaa2−Xaa3−Xaa4−Cysを有し、Xaa1がAsp、Asn、Ser、ThrまたはTrpであり;Xaa2がAsn、Gln、His、Ile、LeuまたはLysであり;Xaa3がAla、Asp、Phe、TrpまたはTyrであり;Xaa4がAsp、Gly、Leu、Phe、SerまたはThrであることを特徴とする請求項29に記載の突然変異タンパク質。
- 前記非天然リガンドがタンパク質またはその断片であることを特徴とする請求項14ないし請求項33のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- 前記タンパク質またはその断片が、血管内皮成長因子(VEGF)、血管内皮成長因子受容体2(VEGF−R2)およびインターロイキン4受容体アルファ鎖(IL−4受容体アルファ)の群から選択されることを特徴とする請求項34に記載の突然変異タンパク質。
- 前記タンパク質がIL−4受容体アルファであることを特徴とする請求項35に記載の突然変異タンパク質。
- 前記タンパク質がヒトIL−4受容体アルファであることを特徴とする請求項36に記載の突然変異タンパク質。
- 前記タンパク質がIL−4受容体アルファの細胞外領域またはドメインであることを特徴とする請求項36または請求項37に記載の突然変異タンパク質。
- IL−4アンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項36ないし請求項38のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- ヒトIL−4のアンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項39に記載の突然変異タンパク質。
- IL−13アンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項36ないし請求項40のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- ヒトIL−13のアンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項41に記載の突然変異タンパク質。
- カニクイザルIL−4受容体アルファと交差反応することを特徴とする請求項36ないし請求項42のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記アミノ酸配列に関して位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106および108のうちのいずれかでのシステイン残基による天然のアミノ酸の少なくとも2つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項36ないし請求項43のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- IL−4受容体アルファの細胞外領域またはドメインに200nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項36から44のいずれか一項に記載の突然変異タンパク質。
- IL−4受容体アルファの細胞外領域またはドメインに100nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項45に記載の突然変異タンパク質。
- IL−4受容体アルファの細胞外領域またはドメインに20nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項46に記載の突然変異タンパク質。
- IL−4受容体アルファの細胞外領域またはドメインに1nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項47に記載の突然変異タンパク質。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記アミノ酸配列に関して少なくとも6、8、10、12、14または16個のアミノ酸置換を含み、そのアミノ酸置換が、Arg26→Ser,Pro;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr,His;Leu33→Tyr;Glu34→Gly,Ser,Ala,Asp,Lys,Asn,Thr,Arg;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Ile,Ala,Arg,Val,Thr,Asn,Lys,Tyr,Leu,Met;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;およびLys108→Glnから成る群から選択されることを特徴とする請求項36ないし請求項48のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- Met39→Val;Thr42→Met,Ala;Thr43→Ile,Pro,Ala;Glu45→Lys,Gly;Asn48→Asp,His,Ser,Thr;Val53→Leu,Phe,Ile,Ala,Gly,Ser;Thr54→Ala,Leu;Met55→Leu,Ala,Ile,Val,Phe,Gly,Thr,Tyr;Glu63→Lys,Gln,Ala,Gly,Arg;Val64→Gly,Tyr,Met,Ser,Ala,Lys,Arg,Leu,Asn,His,Thr,Ile;Ala66→Ile,Leu,Val,Thr,Met;Glu69→Lys,Gly;Lys70→Arg,Gln,Glu;Thr78→Ala;Ile89→Val;Asp95→Asn,Ala,Gly;andTyr100→Hisから成る群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換をさらに含むことを特徴とする請求項49に記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸置換:Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Leu33→Tyr;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;andLys108→Glnを含むことを特徴とする請求項49または請求項50に記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸置換の次のセット:
(1)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Gly;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Ile;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(2)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Lys;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Asn;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(3)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys,Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(4)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Ser;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(5)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→His;Leu33→Tyr;Glu34→Ser;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Ala;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(6)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Asp;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Lys;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;および
(7)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Gly;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln
のうちの1つを含むことを特徴とする請求項49ないし請求項51のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。 - 配列番号2〜8またはその断片もしくは変異体のいずれか1つに記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項36ないし請求項52のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- 配列番号5またはその断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項53に記載の突然変異タンパク質。
- 配列番号6またはその断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項53に記載の突然変異タンパク質。
- 前記リガンドがVEGF−R2であることを特徴とする請求項35に記載の突然変異タンパク質。
- 前記リガンドがVEGF−R2の細胞外領域またはドメインであることを特徴とする請求項56に記載の突然変異タンパク質。
- VEGFアンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項56または請求項57に記載の突然変異タンパク質。
- VEGF−R2に200nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項56ないし請求項58のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- VEGF−R2に100nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項59に記載の突然変異タンパク質。
- VEGF−R2に20nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項60に記載の突然変異タンパク質。
- VEGF−R2に1nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項61に記載の突然変異タンパク質。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記アミノ酸配列に関して少なくとも6、8、10、12、14、または16個のアミノ酸置換を含み、そのアミノ酸置換が、Arg26→Ser;Glu27→Ile;Glu30→Ser;Met31→Gly;Asn32→Arg;Leu33→Ile;Glu34→Tyr;Leu56→Lys,Glu,Ala,Met;Ile57→Phe;Ser58→Arg;Asp80→Ser,Pro;Lys83→Glu,Gly;Glu104→Leu;Leu105→Ala;His106→Val;およびLys108→Thrから成る群から選択されることを特徴とする請求項56ないし請求項62のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- Leu41→Phe;Glu63→Lys,Val64→Met;Asp72→Gly;Lys76→Arg,Glu;Ile88→Val,Thr;Ile89→Thr;Arg90→Lys;Asp95→Gly;Phe99→Leu;およびGly107→Arg,Lys,Gluから成る群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換をさらに含むことを特徴とする請求項63に記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸置換:Arg26→Ser;Glu27→Ile;Glu30→Ser;Met31→Gly;Asn32→Arg;Leu33→Ile;Glu34→Tyr;Ile57→Phe;Ser58→Arg;Lys83→Glu;Glu104→Leu;Leu105→Ala;His106→Val;およびLys108→Thrを含むことを特徴とする請求項63または請求項64に記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸置換の次のセット:
(1)Arg26→Ser;Glu27→Ile;Glu30→Ser;Met31→Gly;Asn32→Arg;Leu33→Ile;Glu34→Tyr;Leu56→Lys;Ile57→Phe;Ser58→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Glu;Glu104→Leu;Leu105→Ala;His106→Val;Lys108→Thr;
(2)Arg26→Ser;Glu27→Ile;Glu30→Ser;Met31→Gly;Asn32→Arg;Leu33→Ile;Glu34→Tyr;Leu56→Glu;Ile57→Phe;Ser58→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Glu;Glu104→Leu;Leu105→Ala;His106→Val;Lys108→Thr;
(3)Arg26→Ser;Glu27→Ile;Glu30→Ser;Met31→Gly;Asn32→Arg;Leu33→Ile;Glu34→Tyr;Leu56→Ala;Ile57→Phe;Ser58→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Glu;Glu104→Leu;Leu105→Ala;His106→Val;Lys108→Thr; および
(4)Arg26→Ser;Glu27→Ile;Glu30→Ser;Met31→Gly;Asn32→Arg;Leu33→Ile;Glu34→Tyr;Leu56→Glu;Ile57→Phe;Ser58→Arg;Asp80→Pro;Lys83→Glu;Glu104→Leu;Leu105→Ala;His106→Val;Lys108→Thr
のうちの1つを含むことを特徴とする請求項63ないし請求項65のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。 - 配列番号34〜39に記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項56ないし請求項66のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
- 前記リガンドがVEGFまたはその断片であることを特徴とする請求項35に記載の突然変異タンパク質。
- VEGFのその受容体への結合を阻害することによってVEGFアンタゴニストとして作用し、VEGFに対する前記受容体はVEGF−R1、VEGF−R2およびニューロピリン−Iから成る群から選択されることを特徴とする請求項68に記載の突然変異タンパク質。
- VEGFに対する前記受容体がVEGF−R2であることを特徴とする請求項69に記載の突然変異タンパク質。
- VEGFに200nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項68ないし請求項70のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- VEGFに100nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項71に記載の突然変異タンパク質。
- VEGFに20nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項72に記載の突然変異タンパク質。
- VEGFに1nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項73に記載の突然変異タンパク質。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記アミノ酸配列に関して少なくとも6、8、10、12、14、16個のアミノ酸置換を含み、そのアミノ酸置換が、Arg26→Ser,Pro,Val,Leu,Ile;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His,Arg,Tyr,Gln;Ile57→Val,Thr,Leu;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Asn,Ser;およびLys108→Ala,Valから成る群から選択されることを特徴とする請求項68ないし請求項74のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- Val36→Ala;Thr37→Ala,Ile;Met39→Thr;Thr40→Ala,Ser;Asn48→Asp,Ala51→Val;Lys52→Arg;Thr54→Val;Met55→Val;Ser61→Pro;Lys65→Arg;Ala66→Val;Val67→Ile;Glu69→Gly,Ser,Thr;Lys76→Arg,Ile,Ala,Met,Pro;Tyr87→Arg,His,Lys,Gln;Ile89→Thr,Val,Gly,His,Met,Lys;Arg90→Gly;Ile98→Val;andGly107→Gluから成る群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換をさらに含むことを特徴とする請求項75に記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸置換:Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;andLys108→Valを含むことを特徴とする請求項75または請求項76に記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸置換の次のセット:
(1)Arg26→Ser;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Asn;Lys108→Val;
(2)Arg26→Pro;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Glu;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(3)Arg26→Pro;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Asn;Lys108→Val;
(4)Arg26→Pro;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→Arg;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(5)Arg26→Pro;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(6)Arg26→Ser;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(7)Arg26→Val;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(8)Arg26→Leu;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;および
(9)Arg26→Ile;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val
のうちの1つを含むことを特徴とする請求項75ないし請求項77のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。 - 配列番号26〜33または44〜47に記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項68ないし請求項78のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- 請求項14ないし請求項79のいずれかに記載の突然変異タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸分子。
- ベクター中に含まれることを特徴とする請求項80に記載の核酸分子。
- ファージミドベクター中に含まれることを特徴とする請求項81に記載の核酸分子。
- 請求項80ないし請求項82のいずれか1項に記載の核酸分子を含有することを特徴とする宿主細胞。
- 請求項14ないし請求項35のいずれか1項に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
- 請求項36ないし請求項55のいずれか1項に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
- 請求項56ないし請求項79のいずれか1項に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
- 請求項14ないし請求項79のいずれかに記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質を産生するための方法であって、前記突然変異タンパク質を、細菌または真核生物の宿主生物中での遺伝子操作法によって該突然変異タンパク質をコードする核酸から開始して産生させ、この宿主生物またはその培養物から単離することを特徴とする方法。
- 請求項14ないし請求項79のいずれかに記載の突然変異タンパク質を含有する医薬組成物を投与するステップを含むことを特徴とする疾患または障害を治療する方法。
- 請求項36ないし請求項55のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質または請求項85に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含むことを特徴とする疾患または障害を治療する方法。
- 前記疾患または障害がTh2免疫応答の増加と関連すること、または、前記疾患が癌であることを特徴とする請求項89に記載の方法。
- 前記疾患または障害がアレルギー反応またはアレルギー性炎症であることを特徴とする請求項89または請求項90に記載の方法。
- 前記アレルギー性炎症がアレルギー性喘息、鼻炎、結膜炎または皮膚炎と関連することを特徴とする請求項91に記載の方法。
- 請求項56ないし請求項79のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質または請求項86に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含むことを特徴とする疾患または障害を治療する方法。
- 前記疾患または障害が、血管新生の増加によってもたらされる、または促進される疾患または障害から成る群から選択されることを特徴とする請求項93に記載の方法。
- 前記疾患または障害が、癌、新生血管滲出型加齢黄斑変性(AMD)、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、未熟児網膜症および網膜静脈閉塞から成る群から選択されることを特徴とする請求項94に記載の方法。
- 前記癌が、胃腸管、直腸、結腸、前立腺、卵巣、膵臓、***、膀胱、腎臓、子宮内膜および肺の癌腫(carcinoma)、白血病、ならびに黒色腫(melanoma)から成る群から選択されることを特徴とする請求項95に記載の方法。
- ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドを検出するための、請求項14ないし請求項79のいずれか1項に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質の使用であって、
(a)前記突然変異タンパク質を、前記所与のリガンドを含有していると思われる試料と適切な条件下で接触させることにより、前記突然変異タンパク質と前記所与のリガンドとの複合体の形成を可能にするステップ、および
(b)前記複合突然変異タンパク質を適切なシグナルによって検出するステップ、
を含むことを特徴とする使用。 - ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドの分離するための、請求項14ないし請求項79のいずれか1項に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質の使用であって、
(a)前記突然変異タンパク質を、前記リガンドを含有すると推測される試料と適切な条件下で接触させることにより、前記突然変異タンパク質と前記所与のリガンドとの複合体の形成を可能にするステップ、および
(b)前記突然変異タンパク質/リガンド複合体を試料から分離するステップ、
を含むことを特徴とする使用。 - 前記突然変異タンパク質/リガンド複合体が固形支持体上に結合されることを特徴とする請求項97または請求項98に記載の使用。
- 化合物を生物または組織中の事前に選択された部位にターゲティングするための、請求項14ないし請求項79のいずれか1項に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質の使用であって、
(a)前記突然変異タンパク質を前記化合物とコンジュゲートさせるステップ、および
(b)前記突然変異タンパク質/化合物複合体を事前に選択された部位に送達するステップ、
を含むことを特徴とする使用。 - ヒト涙リポカリンの所与の非天然リガンドとの複合体形成のための、請求項14ないし請求項79のいずれか1項に記載のヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質の使用。
- ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質であって、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列の配列位置24〜36、53〜66、79〜84および103〜110のうちの任意の2つ以上での少なくとも1つの突然変異したアミノ酸残基を含み、IL−4受容体アルファに結合することを特徴とする突然変異タンパク質。
- ヒトIL−4受容体アルファに結合することを特徴とする請求項102に記載の突然変異タンパク質。
- IL−4受容体アルファの細胞外領域またはドメインに結合することを特徴とする請求項102または請求項103に記載の突然変異タンパク質。
- IL−4アンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項102ないし請求項104のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- ヒトIL−4のアンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項105に記載の突然変異タンパク質。
- IL−13アンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項102ないし請求項106のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- ヒトIL−13のアンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項107に記載の突然変異タンパク質。
- カニクイザルIL−4受容体アルファと交差反応することを特徴とする請求項102ないし請求項108のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記アミノ酸配列に関して位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106および108のうちのいずれかでのシステイン残基による天然のアミノ酸残基の少なくとも2つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項102ないし請求項109のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- IL−4受容体アルファの細胞外領域またはドメインに200nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項102ないし請求項110のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- IL−4受容体アルファの細胞外領域またはドメインに100nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項111に記載の突然変異タンパク質。
- IL−4受容体アルファの細胞外領域またはドメインに20nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項112に記載の突然変異タンパク質。
- IL−4受容体アルファの細胞外領域またはドメインに1nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項113に記載の突然変異タンパク質。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記アミノ酸配列に関して少なくとも6、8、10、12、14または16個のアミノ酸置換を含み、そのアミノ酸置換が、Arg26→Ser,Pro;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Asn32→His;Leu33→Tyr;Glu34→Gly,Ser,Ala,Asp,Lys,Asn,Thr,Arg;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Ile,Ala,Arg,Val,Thr,Asn,Lys,Tyr,Leu,Met;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;およびLys108→Glnから成る群から選択されることを特徴とする請求項102ないし請求項114のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- Met39→Val,Thr42→Met,Ala;Thr43→Ile,Pro,Ala;Glu45→Lys,Gly;Asn48→Asp,His,Ser,Thr;Val53→Leu,Phe,Ile,Ala,Gly,Ser;Thr54→Ala,Leu;Met55→Leu,Ala,Ile,Val,Phe,Gly,Thr,Tyr;Glu63→Lys,Gln,Ala,Gly,Arg;Val64→Gly,Tyr,Met,Ser,Ala,Lys,Arg,Leu,Asn,His,Thr,Ile;Ala66→Ile,Leu,Val,Thr,Met;Glu69→Lys,Gly;Lys70→Arg,Gln,Glu;Thr78→Ala;Ile89→Val;Asp95→Asn,Ala,Gly;およびandTyr100→Hisから成る群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換をさらに含むことを特徴とする請求項115に記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸置換:Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Leu33→Tyr;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;およびLys108→Glnを含むことを特徴とする請求項115または請求項116に記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸置換の次のセット:
(1)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Gly;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Ile;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(2)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Lys;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Asn;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(3)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys,Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(4)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Ser;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(5)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→His;Leu33→Tyr;Glu34→Ser;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Ala;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;
(6)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Asp;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Ser58→Lys;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln;and
(7)Arg26→Ser;Glu27→Arg;Phe28→Cys;Glu30→Arg;Met31→Ala;Asn32→Tyr;Leu33→Tyr;Glu34→Gly;Leu56→Gln;Ile57→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Arg;Glu104→Leu;Leu105→Cys;His106→Pro;Lys108→Gln
のうちの1つを含むことを特徴とする請求項115ないし請求項117のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。 - 配列番号2〜8またはその断片もしくは変異体のいずれか1つに記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項102ないし請求項118のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- 配列番号5またはその断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項119に記載の突然変異タンパク質。
- 配列番号6またはその断片もしくは変異体のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項119に記載の突然変異タンパク質。
- ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質であって、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列の配列位置24〜36、53〜66、79〜84、および103〜110のうちの任意の2つ以上での少なくとも1つの突然変異したアミノ酸残基を含み、VEGF受容体2(VEGF−R2)に結合することを特徴とする突然変異タンパク質。
- 前記リガンドがVEGF−R2の細胞外領域またはドメインであることを特徴とする請求項122に記載の突然変異タンパク質。
- VEGFアンタゴニストとして作用することを特徴とする請求項122または請求項123に記載の突然変異タンパク質。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記アミノ酸配列に関して位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106および108のうちのいずれかでのシステイン残基による天然のアミノ酸残基の少なくとも2つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項122ないし請求項124のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- VEGF−R2に200nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項122ないし請求項125のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- VEGF−R2に100nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項126に記載の突然変異タンパク質。
- VEGF−R2に20nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項127に記載の突然変異タンパク質。
- VEGF−R2に1nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項128に記載の突然変異タンパク質。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記アミノ酸配列に関して少なくとも6、8、10、12、14または16個のアミノ酸置換を含み、そのアミノ酸置換が、Arg26→Ser;Glu27→Ile;Glu30→Ser;Met31→Gly;Asn32→Arg;Leu33→Ile;Glu34→Tyr;Leu56→Lys,Glu,Ala,Met;Ile57→Phe;Ser58→Arg;Asp80→Ser,Pro;Lys83→Glu,Gly;Glu104→Leu;Leu105→Ala;His106→Val;およびLys108→Thrから成る群から選択されることを特徴とする請求項122ないし請求項129のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- Leu41→Phe;Glu63→Lys,Val64→Met;Asp72→Gly;Lys76→Arg;Lys76→Glu;Ile88→Val,Thr;Ile89→Thr;Arg90→Lys;Asp95→Gly;Phe99→Leu;Gly107→Arg,Gly107→Lys;およびGly107→Gluから成る群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換をさらに含むことを特徴とする請求項130に記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸置換:Arg26→Ser;Glu27→Ile;Glu30→Ser;Met31→Gly;Asn32→Arg;Leu33→Ile;Glu34→Tyr;Ile57→Phe;Ser58→Arg;Lys83→Glu;Glu104→Leu;Leu105→Ala;His106→Val;およびLys108→Thrを含むことを特徴とする請求項130または請求項131に記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸置換の次のセット:
(1)Arg26→Ser;Glu27→Ile;Glu30→Ser;Met31→Gly;Asn32→Arg;Leu33→Ile;Glu34→Tyr;Leu56→Lys;Ile57→Phe;Ser58→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Glu;Glu104→Leu;Leu105→Ala;His106→Val;Lys108→Thr;
(2)Arg26→Ser;Glu27→Ile;Glu30→Ser;Met31→Gly;Asn32→Arg;Leu33→Ile;Glu34→Tyr;Leu56→Glu;Ile57→Phe;Ser58→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Glu;Glu104→Leu;Leu105→Ala;His106→Val;Lys108→Thr;
(3)Arg26→Ser;Glu27→Ile;Glu30→Ser;Met31→Gly;Asn32→Arg;Leu33→Ile;Glu34→Tyr;Leu56→Ala;Ile57→Phe;Ser58→Arg;Asp80→Ser;Lys83→Glu;Glu104→Leu;Leu105→Ala;His106→Val;Lys108→Thr;および
(4)Arg26→Ser;Glu27→Ile;Glu30→Ser;Met31→Gly;Asn32→Arg;Leu33→Ile;Glu34→Tyr;Leu56→Glu;Ile57→Phe;Ser58→Arg;Asp80→Pro;Lys83→Glu;Glu104→Leu;Leu105→Ala;His106→Val;Lys108→Thr
のうちの1つを含むことを特徴とする請求項130ないし請求項132のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。 - 配列番号34〜39に記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項122ないし請求項133のいずれかに記載の突然変異タンパク質。
- ヒト涙リポカリンの突然変異タンパク質であって、成熟ヒト涙リポカリンの線状ポリペプチド配列の配列位置24〜36、53〜66、79〜84および103〜110のうちの任意の2つ以上での少なくとも1つの突然変異したアミノ酸残基を含み、VEGFまたはその断片に結合することを特徴とする突然変異タンパク質。
- VEGFのその受容体への結合を阻害することによってVEGFアンタゴニストとして作用し、VEGFに対する前記受容体はVEGF−R1、VEGF−R2およびニューロピリン−Iから成る群から選択されることを特徴とする請求項135に記載の突然変異タンパク質。
- VEGFに対する前記受容体がVEGF−R2であることを特徴とする請求項136に記載の突然変異タンパク質。
- 成熟ヒト涙リポカリンの前記アミノ酸配列に関して位置26〜34、56〜58、80、83、104〜106および108のうちのいずれかでのシステイン残基による天然のアミノ酸残基の少なくとも2つのアミノ酸置換を含むことを特徴とする請求項135ないし請求項137のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- VEGFに200nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項135ないし請求項138のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- VEGFに100nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項139に記載の突然変異タンパク質。
- VEGFに20nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項140に記載の突然変異タンパク質。
- VEGFに1nM以下のKDで結合することを特徴とする請求項141に記載の突然変異タンパク質。
- 成熟ヒト涙リポカリンのアミノ酸配列に関して少なくとも6、8、10、12、14、16個のアミノ酸置換を含み、そのアミノ酸置換が、Arg26→Ser,Pro,Val,Leu,Ile;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His,Arg,Tyr,Gln;Ile57→Val,Thr,Leu;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Asn,Ser;およびLys108→Ala,Valから成る群から選択されることを特徴とする請求項135ないし請求項142のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
- Val36→Ala;Thr37→Ala,Ile;Met39→Thr;Thr40→Ala,Ser;Asn48→Asp,Ala51→Val;Lys52→Arg;Thr54→Val;Met55→Val;Glu58→Lys;Ser61→Pro;Lys65→Arg;Ala66→Val;Val67→Ile;Glu69→Gly,Ser,Thr;Lys76→Arg,Ile,Ala,Met,Pro;Tyr87→Arg,His,Lys,Gln;Ile89→Thr,Val,Gly,His,Met,Lys;Arg90→Gly;Ile98→Val;およびGly107→Gluから成る群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換をさらに含むことを特徴とする請求項143に記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸置換:Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;およびLys108→Valを含むことを特徴とする請求項143または請求項144に記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸置換の次のセット:
(1)Arg26→Ser;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Asn;Lys108→Val;
(2)Arg26→Pro;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Glu;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(3)Arg26→Pro;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Asn;Lys108→Val;
(4)Arg26→Pro;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→Arg;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(5)Arg26→Pro;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(6)Arg26→Ser;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(7)Arg26→Val;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(8)Arg26→Leu;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val;
(9)Arg26→Ile;Glu27→Gly;Phe28→Ala;Pro29→Leu;Glu30→Arg;Met31→Cys;Asn32→Leu;Leu33→Ala;Glu34→Gly;Leu56→His;Ser58→Lys;Asp80→Ile;Lys83→Ile;Glu104→Cys;His106→Ser;Lys108→Val
のうちの1つを含むことを特徴とする請求項143ないし請求項145のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。 - 配列番号26〜33または44〜47に記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項135ないし請求項146のいずれか1項に記載の突然変異タンパク質。
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