JP2009523413A

JP2009523413A - プロモーター配列

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Publication number: JP2009523413A
Application number: JP2008546252A
Authority: JP
Inventors: アイヒホルン，ハイコー; シユペヒト，トーマス; ツアドラ，イボ
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 2005-12-22
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2009-06-25
Also published as: US20090162897A1; EP1966382A2; WO2007071399A2; EP1801221A1; WO2007071399A3

Abstract

本発明は、ポリペプチドまたは核酸、特に糸状菌におけるアンチセンスＲＮＡおよびヘアピンＲＮＡの製造方法に関する。本発明はまた、単離されたペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）プロモーター配列、ならびにポリペプチドまたは核酸、特にアンチセンスＲＮＡおよびヘアピンＲＮＡをコードする核酸配列に機能的に連結された該プロモーター配列を含む核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞に関する。さらに、本発明は、該ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）プロモーター配列の使用による小有機化合物の発酵製造に関する。

Description

本発明は、ポリペプチドまたは核酸、特に糸状真菌におけるアンチセンスＲＮＡおよびヘアピンＲＮＡの製造方法に関する。本発明はまた、単離されたペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）プロモーター配列、ならびにポリペプチドまたは核酸（特にアンチセンスＲＮＡおよびヘアピンＲＮＡ）をコードする核酸配列に機能的に連結された該プロモーター配列を含む核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞に関する。さらに、本発明は、小有機化合物の発酵製造のためのペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）プロモーター配列の使用に関する。

真菌宿主細胞、特に糸状菌細胞、例えばペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）における同種タンパク質および異種タンパク質の組換え製造は、商業的に妥当な量でのタンパク質の製造を可能にする。さらに、同種タンパク質および異種タンパク質の過剰発現またはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡの発現は、β−ラクタム抗生物質（例えば、ペニシリン）のような小有機化合物の製造を増進し及び望ましくない副生成物を減少させることを可能にする。タンパク質、またはアンチセンスＲＮＡおよびヘアピンＲＮＡのような核酸の組換え製造は、該宿主細胞に適した、調節性遺伝子から切り出されたプロモーターの発現制御下に該タンパク質または該核酸をコードするＤＮＡが配置された発現ベクターを構築することにより達成される。該発現ベクターは、通常はプラスミド媒介形質転換により、該宿主細胞内に導入される。ついで、該発現ベクター内に含有されているプロモーターの適切な機能発現に必要な適当な条件下で該形質転換宿主細胞を培養することにより、該タンパク質または該核酸の製造が達成される。

糸状菌ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）およびアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）は、ペニシリンおよびセファロスポリンのような抗生物質を生産する能力を有し、したがってこれらに対する産業上の関心が寄せられている。商業的に使用される生産株の生産性を増加させるために、ここ数年の間に、これらの株の遺伝的操作の技術が開発されている。これらの技術には、フレオマイシン耐性遺伝子（Ｋｏｌａｒ，Ｍ．ら（１９８８），Ｇｅｎｅ６２，１２７−１３４）のような選択マーカーを含むベクターでのプロトプラストの形質転換が含まれる。関心のある遺伝子の発現の改変、例えば、遺伝子発現を改善するための、他の同種または異種プロモーターによるこれらの遺伝子のプロモーターの置換によるものが示されている。発現が非常に乏しい遺伝子、例えばアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）におけるｃｅｆＧ遺伝子のような遺伝子の場合には特に、構成的に高度に発現される遺伝子のプロモーターの利用はセファロスポリンの発酵力価および副生成物プロファイルに対して正の影響を及ぼすことが報告されている（ＧｕｔｉｅｒｒｅｚＳ．ら（１９９７）ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４８（５），６０６−６１４）。特定のシグナリングカスケードにおける望ましくない調節経路またはレギュレーターを排除するために、酵素またはレギュレーターの活性を排除または少なくとも下方制御するために、遺伝子発現の不活性化が、それが部分的な場合であってもほぼ完全なものであっても用いられる。ほとんどの場合、遺伝子破壊は適切ではない。なぜなら、倍数性のレベルが問題となったり、あるいは、該破壊が、生存不可能な生物を与えるからである。特に機能喪失変異が成長パラメーターの阻害を示してこの方法を産業目的に適用不可能にする場合の貴重なアプローチとして、遺伝子調節のモジュレーションまたは酵素活性の阻止のためのアンチセンス構築物の使用が、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）およびいくつかの他の糸状菌において示されている（Ｚａｄｒａら（２０００），Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６，４８１０−４８１６；Ｂａｕｔｉｓｔａ，Ｌ．Ｆ．ら（２０００），Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６（１０），４５７９−４５８１およびＷａｎｇ，Ｔ．Ｈ．ら（２００５），Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４０，４２４−４２９）。よく知られているアンチセンス技術に加えて、遺伝子発現を改変するための新たな方法であるＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングが、植物から動物にわたる種々のモデル生物において詳細に特徴づけられている。最近、この技術は糸状菌においても確立された。ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がコグネイトｍＲＮＡの分解を配列特異的に誘発する翻訳後遺伝子サイレンシングである（Ｎａｋａｙａｓｈｉｋｉ，Ｈ．ら（２００５），ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ４２，２７５−２８３）。ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングは幾つかの真菌種において機能的であることが証明されているにもかかわらず（Ｎａｋａｙａｓｈｉｋｉ，Ｈ．ら（２００５），ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ４２，２７５−２８３；Ｋａｄｏｔａｎｉ，Ｎ．ら（２００３）Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ１６，７６９−７７６ａｎｄＭｏｕｙｎａ，Ｉ．ら（２００４），ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２３７，３１７−３２４）、糸状菌に関しては、この技術は端緒についたばかりである。これは主として、利用可能な遺伝的手段が限られているからである。例えば、真菌への適用に適した及び／又は安定な形質転換のためのヘアピン構築物の作製に適した、限られた数のサイレンシングベクターしか利用可能でない。さらに、そのようなベクターにおけるプロモーターおよび内部スペーサー領域の選択は糸状菌におけるＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシング（ＲＮＡ干渉とも呼ばれる）に強い影響を及ぼすことが報告されている（Ｎａｋａｙａｓｈｉｋｉ，Ｈ．ら（２００５），ＦｕｎｇａｌＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ４２，２７５−２８３）。しかし、それらのベクターにおける使用に適したそのようなプロモーターは存在しないようである。

先行技術においては、種々の糸状菌からの幾つかのハウスキーピング遺伝子のプロモーターの、遺伝子発現の発現または不活性化のための使用を記載した引例が存在する。しかし、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）ｇｐｄＡ遺伝子（グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼをコードする）またはγ（ガンマ）‐アクチン遺伝子（そのプロモーターは遺伝子発現の過剰発現または不活性化のために頻繁に使用されている）のような幾つかのハウスキーピング遺伝子は、発生的に調節された様態または周期的に調節された様態で発現されることが示されうるであろう（Ｇｒｅｅｎｅ，Ａ．Ｖ．ら（２００３），ＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＣｅｌｌ２（２），２３１−２３７およびＪｅｏｎｇ，Ｈ−Ｙ．ら（２００１），Ｇｅｎｅ２６２（１−２），２１５−２１９）。

したがって、糸状菌における遺伝子発現を制御するための新規プロモーター、特に、構成的で安定かつ高い発現を示し更には前記方法における使用（例えば、ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングに適したベクターにおける使用）に適した新規プロモーターが当技術分野において必要とされている。

発明の概要
したがって、本発明は、真菌宿主細胞におけるポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡを製造するための改良された製造方法、およびそのような製造における新規プロモーターを提供する。本発明の新規プロモーターは、発酵の条件下で構成的で安定で高い転写率を示し、したがって、発酵により入手可能な小有機化合物の製造における使用および／またはそのような真菌宿主細胞の代謝の操作に適している。また、本発明の新規プロモーターは、そのような真菌宿主細胞の成長（増殖）の操作ならびに／または形態学的特徴および／もしくは芽胞形成の調節に関与する経路の操作に適している。さらに、本発明のプロモーターは、ＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの本明細書に記載の方法に適している。

したがって、本発明は、
（ａ）ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡの製造に適した培地内で真菌宿主細胞［該真菌宿主細胞は、配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号１および少なくとも１００ヌクレオチドであるこれらの部分配列ならびにこれらの変異体（該変異体は該プロモーター配列のプロモーター活性の少なくとも約２０％を有する。）、ハイブリッドおよび縦列プロモーターよりなる群から選ばれるプロモーター配列を含む第２核酸配列に機能的に連結された、該ポリペプチドまたは該核酸、好ましくは該アンチセンスＲＮＡもしくは該ヘアピンＲＮＡをコードする第１核酸配列を含む。］を培養する工程、および
（ｂ）該ポリペプチドを該培地から単離する、または
（ｃ）該ポリペプチドを該真菌宿主細胞から単離する工程
を含んでなる、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡの製造方法に関する。

本発明はまた、配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号１および少なくとも１００ヌクレオチドであるこれらの部分配列よりなる群から選ばれる核酸配列を含んでなる単離された核酸配列に関する。

本発明はまた、
（ａ）配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号１よりなる群から選ばれる配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列、
（ｂ）ストリンジェンシー条件（該ストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの室温で１５分間の洗浄から開始し次いで２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの４５℃で３０分間の洗浄を繰返し次いで０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの６０℃での洗浄を２回繰返す一連の洗浄と定義される。）下で（ｉ）配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号１よりなる群から選ばれる配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖にハイブリド形成する核酸配列、
（ｃ）１以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を含む（ａ）または（ｂ）の核酸配列、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の対立遺伝子変異体、ならびに
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の部分配列
よりなる群から選ばれる単離された核酸配列に関する。

本発明はまた、前記の核酸配列に機能的に連結された、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる核酸構築物に関する。本発明は更に、該核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクターおよび組換え宿主細胞に関する。

さらに、本発明は、
（ａ）真菌宿主細胞［該真菌宿主細胞は、配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号１および少なくとも１００ヌクレオチドであるそれらの部分配列ならびにそれらの変異体（該変異体は該プロモーター配列のプロモーター活性の少なくとも約２０％を有する。）、ハイブリッドおよび縦列プロモーターよりなる群から選ばれるプロモーター配列を含む第２核酸配列に機能的に連結された、該ポリペプチドまたは該核酸、好ましくは該アンチセンスＲＮＡもしくは該ヘアピンＲＮＡをコードする第１核酸配列を含む。］を、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡ（これらは、該宿主細胞の代謝経路を調節し、それにより該小有機化合物の産生をもたらすよう意図されたものである。）の製造に適した培地内で培養する工程、
（ｂ）該ポリペプチドまたはアンチセンスもしくはヘアピンＲＮＡを発現させる工程、
（ｃ）該小有機化合物を発酵ブロスから単離する工程
を含んでなる、発酵的製造により入手可能な小有機化合物の発酵的製造のための製造方法
を提供する。

また、本発明は、発酵製造による小有機化合物の製造ならびに／または糸状菌宿主細胞の代謝の操作ならびに／もしくはその成長の操作ならびに／もしくは形態学的特徴および／もしくは芽胞形成の調節に関与する経路の操作のための、本発明の核酸配列の使用に関する。

発明の詳細な説明
本発明は、
（ａ）ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡの製造に適した培地内で真菌宿主細胞［該真菌宿主細胞は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５およびこれらの部分配列ならびにこれらの変異体、ハイブリッドおよび縦列プロモーターよりなる群から選ばれるプロモーター配列を含む第２核酸配列に機能的に連結された、該ポリペプチドまたは該核酸、好ましくは該アンチセンスＲＮＡもしくは該ヘアピンＲＮＡをコードする第１核酸配列を含む。］を培養する工程、および
（ｂ）該ポリペプチドを該培地から単離する、または
（ｃ）該ポリペプチドを該真菌宿主細胞から単離する工程
を含んでなる、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡの製造方法に関する。

工程（ａ）に記載の部分配列は、好ましくは、少なくとも１００ヌクレオチドである。工程（ａ）の変異体プロモーターは、工程（ａ）に記載のプロモーター配列のプロモーター活性の少なくとも約２０％を有しうる。

「ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡの製造に適した（すなわち適当な）培地」なる語は、所望のポリペプチドまたは核酸を得るために本明細書に記載の適当な発現ベクター内に含有させることが可能な本発明のプロモーターの適切な機能発現に適した（すなわち適当な）培地を意味すると理解される。

好ましくは、工程（ａ）および／または工程（ｃ）における真菌宿主細胞は糸状菌宿主細胞である。より好ましくは、工程（ａ）および／または工程（ｃ）における真菌宿主細胞はペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）またはアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）またはアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）またはペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｉｔｒｉｎｕｍ）である。

したがって、本発明は、前記の工程（ａ）および工程（ｂ）を含んでなる、あるいは前記の工程（ａ）または工程（ｃ）を含んでなる、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡの製造方法であり、工程（ａ）および／または工程（ｃ）における真菌宿主細胞が糸状菌宿主細胞、好ましくはペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）またはアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）またはアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）またはペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｉｔｒｉｎｕｍ）である製造方法に関する。

本発明の製造方法においては、当技術分野で公知の方法を用いて、該ポリペプチドまたは該核酸、好ましくは該アンチセンスＲＮＡもしくは該ヘアピンＲＮＡの製造に適した栄養培地内で該細胞を培養する。例えば、該ポリペプチドまたは該核酸、好ましくは該アンチセンスＲＮＡもしくは該ヘアピンＲＮＡの発現および／または単離を可能にする条件下、適当な培地内で行う実験室用または工業用発酵槽内の振とうフラスコ培養、小規模または大規模発酵（連続的、バッチ、フェッド・バッチまたは固体発酵を含む。）により、該細胞を培養することが可能である。該培養は、当技術分野で公知の方法を用いて、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む適当な栄養培地内で行う。適当な培地は商業的供給業者から入手可能である、または公開されている組成（例えば、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログにおけるもの、または例えばＧｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｓ．ら（１９９９），Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４５，３１７−３２４に記載されているもの）に基づいて調製されうる。該ポリペプチドが該栄養培地内に分泌される場合には、該ポリペプチドは該培地から直接的に回収されうる。該ポリペプチドが分泌されない場合には、それは細胞ライセートから回収されうる。得られたポリペプチドは、当技術分野で公知の方法により回収されうる。例えば、該ポリペプチドは、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む（これらに限定されるものではない）通常の方法により、該栄養培地から回収されうる。該ポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点フォーカシング）、溶解度差（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは抽出を含む（これらに限定されるものではない）当技術分野で公知の種々の方法により精製されうる（例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．ＪａｎｓｏｎおよびＬａｒｓＲｙｄｅｎ編，ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９を参照されたい）。

「プロモーター」なる語は、本明細書においては、ＲＮＡポリメラーゼに結合し該ポリメラーゼをポリペプチドまたは核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡ）コード化核酸配列の正しい下流転写開始部位へ導いて転写を開始させるＤＮＡ配列と定義される。ＲＮＡポリメラーゼは、該コード領域の適当なＤＮＡ鎖に相補的なメッセンジャーＲＮＡの構築を効果的に触媒する。「プロモーター」なる語はまた、ｍＲＮＡへの転写の後の翻訳のための５’非コード領域（プロモーターと翻訳開始部位との間）、シス作用性転写制御要素、例えばエンハンサー、および転写因子と相互作用する他のヌクレオチド配列を含むと理解される。

「変異体プロモーター」なる語は、本明細書においては、親プロモーターの１以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を含むヌクレオチド配列を有するプロモーターと定義され、ここで、該変異体プロモーターは、対応親プロモーターより高い又は低いプロモーター活性を有する。「変異体プロモーター」なる語はまた、自然変異体、および当技術分野でよく知られた方法（例えば、古典的な突然変異誘発、部位特異的変異誘発およびＤＮＡシャッフリング）を用いて得られるインビトロで作製される変異体を含む。「ハイブリッドプロモーター」なる語は、本明細書においては、コード配列に機能的に連結されｍＲＮＡへの該コード配列の転写をもたらす、２以上のプロモーターの融合体である配列を与えるよう互いに融合した２以上のプロモーターの部分と定義される。「縦列プロモーター」なる語は、本明細書においては、それぞれがコード配列に機能的に連結されｍＲＮＡへの該コード配列の転写をもたらす、２以上のプロモーター配列と定義される。「機能的に連結」なる語は、本明細書においては、制御配列、例えばプロモーター配列がコード配列に対して適切な位置に配置されていて該制御配列が、該コード配列によりコードされるポリペプチドまたは核酸、例えばアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡの産生を導くような配置と定義される。「コード配列」なる語は、本明細書においては、適当な制御配列の制御下、ｍＲＮＡへ転写されポリペプチドへ翻訳される核酸配列と定義される。コード配列の境界は一般に、ｍＲＮＡの５’末端においてオープンリーディングフレームの直上流に位置するＡＴＧ開始コドン、およびｍＲＮＡの３’末端においてオープンリーディングフレームの直下流に位置する転写終結配列により決定される。コード配列には、ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ、半合成、合成および組換え配列が含まれうるが、これらに限定されるものではない。コード配列はまた、例えばアンチセンスＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡのような核酸をコードすると理解される。

前記のポリペプチドまたは核酸、例えばアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡの製造方法の好ましい実施形態においては、プロモーターは配列番号１の核酸配列またはその部分配列を有する。もう１つの好ましい実施形態においては、プロモーターは配列番号５の核酸配列またはその部分配列を有する。より一層好ましい実施形態においては、プロモーターは配列番号３の核酸配列またはその部分配列を有する。もう１つのより一層好ましい実施形態においては、プロモーターは配列番号２の核酸配列またはその部分配列を有する。もう１つの更に好ましい実施形態においては、プロモーターは配列番号４の核酸配列またはその部分配列を有する。

本発明の方法においては、プロモーターはまた、１以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を有する、前記プロモーターの変異体でありうる。変異体プロモーターは１以上の変異を有しうる。各変異は、ヌクレオチドの、独立した置換、欠失および／または挿入である。プロモーター内へのヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入の導入は、当技術分野で公知の方法のいずれか、例えば古典的な突然変異誘発、部位特異的変異誘発またはＤＮＡシャッフリングを用いて達成されうる。

本発明の方法においては、プロモーターはまた、本発明の１以上のプロモーターの部分、すなわち、本発明のプロモーターの部分およびもう１つのプロモーターの部分、例えば一方のプロモーターのリーダー配列および他方のプロモーターの転写開始部位、あるいは本発明の１以上のプロモーターの部分および１以上の他のプロモーターの部分を含むハイブリッドプロモーターでありうる。他のプロモーターは、選択された真菌宿主細胞において転写活性を示す任意のプロモーター配列（変異体、トランケート化体およびハイブリッドプロモーターを含む）であることが可能であり、該宿主細胞にとって同種または異種である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から入手可能である。そのような他のプロモーター配列は、該ポリペプチドをコードする核酸配列にとって固有または外来性のものであることが可能であり、該細胞にとって固有または外来性のものであることが可能である。本発明のプロモーターとのハイブリッドプロモーターの構築に有用な他のプロモーターの具体例には、炭水化物、窒素、ホスファート、硫黄などのような細胞培地のいずれかの化合物または当技術分野で公知のいずれかの化学誘導物質により調節（例えば、誘導または抑制）される遺伝子から得られるプロモーターが含まれる。本発明のプロモーターとのハイブリッドプロモーターの構築に有用なプロモーターは、いずれかの物理的条件、例えば温度によっても誘導または抑制されうる。

プロモーターはまた、本発明の２以上のプロモーターを含む、あるいは本発明の１以上のプロモーターと１以上の他のプロモーター（例えば、前記で例示されているもの）とを含む縦列プロモーターでありうる。縦列プロモーターの２以上のプロモーター配列は該核酸配列の転写を同時に促進しうる。あるいは、縦列プロモーターのプロモーター配列の１以上は該細胞の成長の異なる段階において核酸配列の転写を促進しうる。

本発明の突然変異体、ハイブリッドまたは縦列プロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５のプロモーターのプロモーター活性の少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約１００％、より一層好ましくは少なくとも約２００％、最も好ましくは少なくとも約３００％、更に最も好ましくは少なくとも約４００％を有する。

該核酸配列によりコードされるポリペプチドは、関心のある真菌宿主細胞にとって固有または異種のものでありうる。「ポリペプチド」なる語は、本明細書においては、特定の長さのコード化産物を意味するものではなく、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を含む。「異種ポリペプチド」なる語は、本明細書においては、該真菌細胞にとって固有（天然）でないポリペプチド、天然配列を改変するために修飾が施された天然ポリペプチド、または組換えＤＮＡ技術による該真菌細胞の操作の結果として発現が量的に改変された天然ポリペプチドと定義される。例えば、天然ポリペプチドは、例えば、該ポリペプチドの発現を増強するために、およびシグナル配列の使用により、関心のある天然ポリペプチドの細胞外輸送を促進するために、および該細胞により通常産生されるポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増加させるために、該ポリペプチドをコードする遺伝子を本発明のプロモーターの制御下に配置することにより、組換え的に製造されうる。該真菌細胞は、該ポリペプチドをコードする核酸配列の１以上のコピーを含有しうる。該天然またはホモログポリペプチドおよび異種ポリペプチドは非分泌性または分泌性ポリペプチドでありうる。

好ましくは、該ポリペプチドは天然またはホモログポリペプチドである。好ましい実施形態においては、該ポリペプチドは非分泌性ポリペプチドである。

「アンチセンスＲＮＡ」なる語は、本明細書においては、関心のある遺伝子（例えば、本明細書に記載の関心のあるポリペプチドをコードするもの）のｍＲＮＡに相補的なＲＮＡと定義され、このようなアンチセンスＲＮＡは、例えばＣｏｏｐｅｒＧ．Ｍ．，ＴｈｅＣｅｌｌ．ＡＭｏｌｅｃｕｌａｒＡｐｐｒｏａｃｈ，２^ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，２０００（オンライン版）に記載されている。このようなアンチセンスＲＮＡは、例えば、関心のある天然相同ポリペプチドの発現の下方制御を招くアンチセンスＲＮＡを得るために相同ポリペプチドのコード配列の一部または全部が本発明のプロモーターの制御下に逆方向に配置される技術により得られうる。該真菌宿主細胞は、該ポリペプチドをコードする核酸配列の１以上のコピーを含有しうる。

「ヘアピンＲＮＡ」なる語は、本明細書においては、例えばＡｌｂｅｒｔｓＢ．ら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＣｅｌｌ，４^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，２００２（オンライン版）に記載されているようなヘアピン構造を有するＲＮＡと定義される。ＲＮＡ干渉として文献に記載されている複雑な細胞メカニズムにより関心のある天然相同ポリペプチドの発現を減少させる二本鎖領域を有するヘアピンＲＮＡを得るために、相同ポリペプチドのコード配列の一部または全部が、小さな内部スペーサー領域により隔てられたセンス配向およびアンチセンス配向の両方の本発明のプロモーターの制御下に配置される技術により、そのようなヘアピンＲＮＡが得られうる。該真菌細胞は、該ポリペプチドをコードする核酸配列１以上のコピーを含有しうる。

本発明はまた、配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号１およびこれらの部分配列よりなる群から選ばれる核酸配列を含む単離された核酸配列に関する。

好ましい実施形態においては、単離された核酸配列は配列番号１の核酸配列またはその部分配列を含む。もう１つの好ましい実施形態においては、単離された核酸配列は配列番号５の核酸配列またはその部分配列を含む。より一層好ましい実施形態においては、単離された核酸配列は配列番号３の核酸配列またはその部分配列を含む。もう１つのより一層好ましい実施形態においては、単離された核酸配列は配列番号２の核酸配列またはその部分配列を含む。もう１つの更に好ましい実施形態においては、単離された核酸配列は配列番号４の核酸配列またはその部分配列を含む。

本発明はまた、本発明のプロモーターに機能的に連結された、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡをコードする核酸配列と、１以上の制御配列（これは、該制御配列に適した条件下、適当な宿主細胞における該コード配列の発現を導く。）とを含む核酸構築物に関する。核酸構築物がコード配列と、該コード配列の発現に要求される制御配列の全てとを含有する場合、核酸構築物なる語は発現カセットなる語と同義である。本発明の方法においては、該核酸配列は１以上の天然制御配列を含むことが可能であり、あるいは該天然制御配列の１以上は、宿主細胞におけるコード配列の発現を改善するために、該核酸配列にとって外来性である１以上の制御配列で置換されうる。「制御配列」なる語は、本明細書においては、本発明のポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡの発現のために必要なまたは有利である全成分を含むものとして定義される。各制御配列は、前記のポリペプチドまたは核酸をコードする核酸配列にとって固有または外来性のものでありうる。そのような制御配列には、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、本発明のプロモーター、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。少なくとも、該制御配列には、本発明のプロモーターならびに転写および翻訳終結シグナルが含まれる。該制御配列は、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡをコードする核酸配列のコード領域との該制御配列の連結を促進する、特定の制限部位を導入するためのリンカーを備えたものでありうる。

本発明はまた、本発明のプロモーター、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡをコードする核酸配列と、転写および翻訳終結シグナルとを含んでなる組換え発現ベクターに関する。前記の種々の核酸および制御配列を互いに連結させて、該プロモーターおよび／または該ポリペプチドもしくは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡをコードする核酸配列の、制限部位における挿入または置換を可能にする１以上の簡便な制限部位を含みうる組換え発現ベクターを得ることが可能である。あるいは、該核酸配列は、該核酸配列または該プロモーターおよび／もしくは配列を含む核酸構築物を発現のために適当なベクター内に挿入することにより発現させることが可能である。該発現ベクターを作製する場合、本発明のプロモーターおよび発現のための１以上の適当な制御配列にコード配列が機能的に連結されるよう、該コード配列をベクター内に配置する。組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に付され該核酸配列の発現をもたらしうる任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）でありうる。該ベクターの選択は典型的には、該ベクターが導入される宿主細胞との該ベクターの和合性に左右される。該ベクターは直鎖状または閉環状プラスミドでありうる。該ベクターは、自律複製性ベクター、すなわち、染色体外因子として存在し染色体の複製から独立して複製されるベクター、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体または人工染色体でありうる。該ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含有しうる。あるいは、該ベクターは、該宿主細胞内に導入されるとゲノム内に組込まれそれが組込まれた染色体と共に複製されるものでありうる。さらに、単一のベクターまたはプラスミド、あるいは一緒になって、該宿主細胞のゲノム内に導入される全ＤＮＡを含有する２以上のベクターまたはプラスミド、あるいはトランスポゾンが使用されうる。該ベクターは、同時形質転換の方法により、１以上の追加的なベクターと組合せて宿主細胞内に導入されうる。本発明のベクターは、好ましくは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１以上の選択マーカーを含有する。選択マーカーは、対応産物が生物致死物質またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性などを付与する遺伝子である。糸状菌宿主細胞において使用される適当なマーカーには、ヒグロマイシンまたはフレオマイシンが含まれるが、これらに限定されるものではない。他の適当なマーカーは例えばＦｉｎｋｌｓｔｅｉｎ，Ｂａｌｌ（編），ＡｐｐｌｉｅｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓｏｆＦｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉ（同誌）ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＦｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９２に記載されている。

本発明はまた、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡをコードする核酸配列に機能的に連結された本発明のプロモーターを含んでなる、該ポリペプチドまたは該核酸の組換え製造に有利に使用される組換え宿主細胞に関する。ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡをコードする核酸配列に機能的に連結された本発明のプロモーターを含んでなるベクターは、該ベクターが染色体組込み体または前記の自己複製性染色体外ベクターとして維持されるよう、宿主細胞内に導入される。「宿主細胞」なる語は、複製中に生じる突然変異のために親細胞と同一ではない、親細胞の任意の後代を含む。宿主細胞の選択は、該ポリペプチドをコードする遺伝子およびその起源に著しく左右される。あるいは、該宿主細胞の選択は、本明細書に記載のアンチセンスＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡのような核酸をコードする核酸配列に左右されうる。該宿主細胞は、本発明の方法において有用な任意の真菌細胞でありうる。好ましい実施形態においては、該真菌宿主細胞は糸状菌細胞である。好ましくは、糸状菌細胞はペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）またはアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）またはアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）またはペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｉｔｒｉｎｕｍ）である。

本発明はまた、
（ａ）配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号１よりなる群から選ばれる配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列、
（ｂ）ストリンジェンシー条件下で（ｉ）配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号１よりなる群から選ばれる配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖にハイブリド形成する核酸配列、
（ｃ）１以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を含む核酸配列、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の対立遺伝子変異体、ならびに
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の部分配列
よりなる群から選ばれる単離された核酸配列に関する。

（ｂ）のストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの室温で１５分間の洗浄から開始し次いで２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの４５℃で３０分間の洗浄を繰返し次いで０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの６０℃での洗浄を２回繰返す一連の洗浄と定義されうる。

好ましくは、（ｃ）の核酸配列は（ａ）または（ｂ）の核酸配列である。

１つの実施形態においては、本発明は、配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号１よりなる群から選ばれる配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する単離された核酸配列に関する。

好ましくは、相同性の度合は約８５％、より好ましくは約９０％、より一層好ましくは約９５％、最も好ましくは約９９％である。

本発明の目的においては、配列比較は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ配列アライメントアルゴリズム（例えば、Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＢｉｏｌｏｇｙ：Ｍａｐｓ，ｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄｇｅｎｏｍｅｓ．Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ．Ｌｏｎｄｏｎ：１９９５．ＩＳＢＮ０−４１２−９９３９１−０またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｈｔｏ．ｕｓｃ．ｅｄｕ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｅａａｌｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照されたい）。ローカルＳプログラム・バージョン１．１６は以下のパラメーターで使用される：マッチ１、ミスマッチペナルティ：０．３３、オープン・ギャップ・ペナルティ：２、伸長ギャップ・ペナルティ：２。

部分配列は、５’および／または３’末端からの１以上のヌクレオチドが欠失しているが完全なプロモーター活性の一部を保有している、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５に含まれる核酸配列である。あるいは、部分配列は、配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号１よりなる群から選ばれる核酸配列より高いプロモーター活性を有しうる。例えば、該５’および／または３’末端から約５０または約１００ヌクレオチドが欠失していることが可能である。

対立遺伝子変異体は、同一染色体遺伝子座を占める遺伝子の２以上の代替形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は突然変異により天然で生じ、集団内の多型をもたらしうる。

もう１つの実施形態においては、本発明は、ストリンジェンシー条件下で（ｉ）配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号１よりなる群から選ばれる配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖にハイブリド形成する単離された核酸配列に関する。

配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５の部分配列は少なくとも１００ヌクレオチド、または好ましくは少なくとも２００ヌクレオチドでありうる。

実質的に類似した核酸断片は、当業者に公知のストリンジェンシー条件下で互いにハイブリド形成するそれらの能力により特徴づけられうる（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編，（１９８５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）。ストリンジェンシー条件は、（密接に）関連した生物からの機能性酵素を複製する遺伝子のような（高度に）類似した断片をスクリーニングするよう調節されうる。ハイブリド形成後の洗浄はストリンジェンシー条件を決定する。「ストリンジェンシー条件」なる語は、本明細書においては、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの室温で１５分間の洗浄から開始し次いで２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの４５℃で３０分間の洗浄を繰返し次いで０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの６０℃での洗浄を２回繰返す一連の洗浄と定義される。「高ストリンジェンシー条件」なる語は、本明細書においては、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの室温で１５分間の洗浄から開始し次いで２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの４５℃で３０分間の洗浄を繰返し次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの６５℃での洗浄を２回繰返す一連の洗浄と定義される。

本発明の目的においては、ハイブリド形成は、核酸配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５に示す核酸配列、それらの相補鎖またはそれらの部分配列に対応する標識核酸プローブにストリンジェンシー条件下、好ましくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリド形成することを意味する。

本発明のプロモーターは、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡの高い発現を表す構成的で安定で高い転写率を示す。構成的高発現に関しては、本発明のより好ましいプロモーターは、実施例６．１に示すとおり、例えばよく知られた強力なアクチンプロモーターより強力、例えば少なくとも約２〜４倍強力である。

もう１つの利点として、本発明のプロモーターの構成的高発現は安定であり、これは、該発現が長期間、例えば数日間、例えば本明細書に記載の発酵製造期間にわたって永久的に高いことを意味すると理解される。この安定な構成的高発現は例えば実施例１．１、２．１、２．１．１、３．１、４．１および５．１において認められうる。前記のとおり例えば発生周期および／または他の例えば概日周期により影響されうる活性を有する公知プロモーターとは対照的に、本発明の新規プロモーターの高発現はいずれかのそのような周期により影響されないようであり、前記の長期間にわたって安定であり及び／又は連続的に高い。

もう１つの態様において、本発明は、発酵製造により入手可能な小有機化合物の発酵製造のための製造方法であり、
（ａ）真菌宿主細胞［該真菌宿主細胞は、配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号１および少なくとも１００ヌクレオチドであるこれらの部分配列ならびにこれらの変異体（該変異体は該プロモーター配列のプロモーター活性の少なくとも約２０％を有する。）、ハイブリッドおよび縦列プロモーターよりなる群から選ばれるプロモーター配列を含む第２核酸配列に機能的に連結された、該ポリペプチドまたは該核酸、好ましくは該アンチセンスＲＮＡもしくは該ヘアピンＲＮＡをコードする第１核酸配列を含む。］を、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡ（これらは、該宿主細胞の代謝経路を調節し、それにより該小有機化合物の産生をもたらすよう意図されたものである。）の製造に適した培地内で培養する工程ならびに
（ｂ）該ポリペプチドまたはアンチセンスもしくはヘアピンＲＮＡを発現させる工程、および
（ｃ）該小有機化合物を発酵ブロスから単離する工程
を含んでなる製造方法を提供する。

本明細書中で用いる「発酵製造」なる語は、発酵による製造、例えば、本明細書に記載の条件下、栄養培地内で真菌宿主細胞を培養することによる製造を意味すると理解される。

工程（ａ）に記載の、該宿主細胞の代謝経路を調節し、それにより該小有機化合物の産生をもたらすよう意図されたポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡは、好ましくは、該小有機化合物の製造の増進および／または該小有機化合物の望ましくない副生成物の産生の減少をもたらしうる。

本明細書に記載の小有機化合物、例えば、発酵により入手可能な小有機化合物は、抗生物質、例えばβ‐ラクタム抗生物質、例えばペニシリンもしくはセファロスポリン、またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター、例えばスタチン、例えばロバスタチンなどの群（何らこれらに限定されるものではない）から選ばれうる。該小有機化合物は、それぞれ、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）およびアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）の発酵により入手可能であろう。該小有機化合物は、工程（ｃ）に記載のとおり、培地から単離されうる。あるいは、該小有機化合物は、培養された真菌宿主細胞から単離可能であり、例えば、公知方法に従い発酵の完了後に得られた真菌宿主細胞から抽出されうる。

したがって、もう１つの態様において、本発明は、発酵製造による小有機化合物の製造のための、配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号１およびそれらの部分配列（好ましくは、該部分配列は少なくとも１００ヌクレオチドである）よりなる群から選ばれる核酸配列の使用に関する。

もう１つの態様において、本発明は、
（ａ）配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号１よりなる群から選ばれる配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列、
（ｂ）ストリンジェンシー条件（該ストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの室温で１５分間の洗浄から開始し次いで２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの４５℃で３０分間の洗浄を繰返し次いで０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの６０℃での洗浄を２回繰返す一連の洗浄と定義される。）下で（ｉ）配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号１よりなる群から選ばれる配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列、または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖にハイブリド形成する核酸配列、
（ｃ）１以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を含む、（ａ）または（ｂ）の核酸配列、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の対立遺伝子変異体、ならびに
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の部分配列
よりなる群から選ばれる核酸配列の使用に関する。

本発明のプロモーターの使用は、該小有機化合物に関して得られる製造力価（生産力価）の増加をもたらすことが可能であり、および／または該小有機化合物の望ましくない副生成物の減少をもたらすことが可能である。

本明細書に記載の小有機化合物につながることが可能であり、本発明の方法を適用することによりそれ自体が本発明のプロモーターの制御下となる、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡにより調節されうる代謝経路の具体例を以下に記載する。

ペニシリン、セファロスポリンおよび／またはロバスタチンの生合成、すなわち、それらの代謝経路に関与する遺伝子の調節は種々のシス作用性ＤＮＡ要素および調節因子の制御下にあり、しばしば、発生調節に密接に関連している。例えば、強力なａｌｃＡプロモーターにより駆動されるｌａｅＡ遺伝子の過剰発現は、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）におけるペニシリンおよび／またはロバスタチンの生合成に関与する遺伝子のアップレギュレーションを招くことが示されている（Ｂｏｋ，Ｊ．Ｗ．およびＫｅｌｌｅｒ，ＮＰ．（２００４）ＥｕｃａｒｙｏｔｉｃＣｅｌｌ３（２），５２７−５３５）。

遺伝子発現の過剰発現および／または不活性化は、部分的なものもほぼ完全なものも、ｌａｅＡのような鍵レギュレーターを操作するために、あるいはβ‐ラクタム抗生物質またはロバスタチンの生合成および輸送に直接的または間接的に関与する代謝経路を操作するために新規方法を明らかにするための貴重な手段であることが示されている（Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ｍ．ら（２００６）ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７２（４），２９５７−２９７０）。Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚらは、構成的に高度に発現される遺伝子のプロモーターを利用するアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）におけるｃｅｆＧ遺伝子の過剰発現がセファロスポリンの発酵力価の増加および副生成物濃度の減少をもたらすことを示している（ＧｕｔｉｅｒｒｅｚＳ．ら，（１９９７），ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４８（５），６０６−６１４）。

本発明のプロモーターは、例えば前記の代謝経路における使用に適しており、例えば、それに関与している遺伝子の過剰発現をもたらすために使用されうる。

したがって、本発明のプロモーターは、例えば本明細書に記載の糸状菌宿主細胞の代謝、例えば代謝状態を操作するために使用されうる。

さらに、該プロモーターは、真菌宿主細胞、例えば本明細書に記載の糸状菌宿主の成長の操作ならびに／またはその形態学的特徴および／もしくは芽胞形成の調節に関与する経路の操作のために使用されうる。したがって、本発明の方法に従う本発明のプロモーターの使用は、成長ならびに／または形態学的特徴および／もしくは芽胞形成の調節に関与する経路に関与する１以上のタンパク質および／または核酸、例えばＲＮＡの発現の変化を招きうる。発現におけるそのような変化は、例えば、該タンパク質または核酸の発現の過剰発現または発現減少を招くことが可能であり、ついでこれは、例えば、該真菌細胞の芽胞形成の改善を招きうる。また、１以上のタンパク質および／または核酸、例えばＲＮＡの発現における該変化は、例えば成長の変化、例えば該真菌宿主細胞の成長の改善を招きうる。同様に、該真菌宿主細胞の形態学的特徴は、本発明の方法に従い本発明のプロモーターを適用することにより影響されうる。ついで、真菌宿主細胞の成長のこれらの操作ならびに／または真菌宿主細胞の形態学的特徴および／もしくは芽胞形成の調節に関与する経路のこれらの操作は、代謝産物、例えば本明細書に記載の小有機化合物の製造、例えば発酵製造における変化をもたらすことが可能であり、例えば、該小有機化合物の発酵製造の増進および／または該小有機化合物の望ましくない副生成物の減少をもたらしうる。

したがって、本発明はまた、糸状菌宿主細胞の代謝の操作ならびに／または糸状菌宿主細胞の成長の操作ならびに／または糸状菌宿主細胞の形態学的特徴および／もしくは芽胞形成の調節に関与する経路の操作のための、前記の本発明の核酸配列の使用に関する。

本発明のプロモーターが構成的で安定で高発現のプロモーターであるという事実は、該プロモーターを、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡの製造方法に有用なものとし、および／または本発明の方法による小有機化合物の発酵製造における使用に有用なものとする。もう１つの利点として、本発明のプロモーターは本明細書に記載のＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシング法において使用されうる。

以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を何ら限定するものではない。以下の実施例において用いる「Ｐ−ＰｃＸｇＹ」または「ｐ−ＰｃＸｇＹ」なる語は「ＰｃＸｇプロモーター」を意味すると理解され、それ自体は「ＰｃＸｇＹプロモーター領域」なる語と同義であると理解される。例えば、実施例１．３において用いる「Ｐ−Ｐｃ１２ｇ０９３２０」なる語は、例えば実施例１．４に記載の「Ｐｃ１２ｇ０９３２０プロモーター」と同義であり、すなわち、該「Ｐｃ１２ｇ０９３２０プロモーター」を意味し、実施例１．２に記載の「Ｐｃ１２ｇ０９３２０プロモーター領域」と同義である、すなわち、該「Ｐｃ１２ｇ０９３２０プロモーター領域」を意味する。

実施例

１．１ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のＰｃ１２ｇ０９３２０遺伝子の定量的ＰＣＲ発現分析
新規遺伝子Ｐｃ１２ｇ０９３２０の発現パターンを証明し、その高発現レベルを定量するために、定量的ＰＣＲ分析（ＡＢＩ７９００ＨＴ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を行う。種々の条件下、すなわち、製造条件下で成長させ、滅菌布での濾過により集めた、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の菌糸から全ＲＮＡを単離する。該湿潤菌糸を液体窒素中で急速冷凍し、乳鉢および乳棒を使用して粉末へと粉砕する。ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抽出プロトコールを用いて、全ＲＮＡを抽出する。すべての操作は該製造業者のプロトコールに従い行う。抽出後、該ＲＮＡサンプルをＲＮｅａｓｙ（登録商標）カラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、ＲＮアーゼ非含有ＤＮアーゼセットキット（ＲＮａｓｅ−ＦｒｅｅＤＮａｓｅＳｅｔＫｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してカラム上でのＤＮアーゼ消化を行う。ＲＮＡをＤＥＰＣ処理無菌蒸留水に再懸濁させ、分光光度法（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３１００ｐｒｏ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）によりその濃度を測定する。ＲＮＡ６０００ＮａｎｏＡｓｓａｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用するＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ測定（Ａｇｉｌｅｎｔ）により該ＲＮＡの質を調べる。ついで、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙｃＤＮＡＡｒｃｈｉｖｅＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、逆転写を行う。ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｐｃ１２ｇ０９３２０遺伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを設計する。Ｐｃ１２ｇ０９３２０遺伝子配列のそれぞれ２０７−２２４位および３０６−２８８位に及ぶフォワードプライマーＰｃ１２ｇ０９３２０Ｕ１（５’−ＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＣＡＣＡＧＣＴＴ−３’）（配列番号６）およびリバースプライマーＰｃ１２ｇ０９３２０Ｌ１（５’−ＧＣＣＧＡＧＡＣＧＧＴＴＧＡＣＧＡＡＴ−３’）（配列番号７）を設計する。対照として、１１９ｂｐのアンプリコンを与えるフォワードプライマーＰｃａｃｔＡＵ１（５’−ＧＧＴＧＡＴＧＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＡＧ−３’）（配列番号８）およびリバースプライマーＰｃａｃｔＡＬ１（５’−ＡＧＣＴＣＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＴＧ−３’）（配列番号９）の設計のために、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の公知ａｃｔ遺伝子（Ａｃｅ．Ｎｏ．ＡＦ０５６９７５）を使用する。ＰＣＲ反応には、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒｍｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する。該反応は、それぞれ５０ｎｇの鋳型ｃＤＮＡを含有する２０μｌの反応液を使用して、該製造業者のプロトコールに従い行う。各鋳型に関する試薬中のいずれかの混入物（コンタミ）に関する対照試験のために、鋳型ＲＮＡが添加されていない鋳型非含有対照（ＮＴＣ）を含める。標準曲線により、使用した全てのプライマーセットの良好な効率を実証する。結果は、全ゲノムマイクロアレイ分析によっても検出される非常に強力かつ構成的な遺伝子発現レベルを証明している。特に、この永久的かつ構成的発現レベルは製造条件下で検出される。

１．２Ｐｃ１２ｇ０９３２０プロモーター領域のクローニングおよび特徴づけ
適当な受容レポーター遺伝子ベクターを作製するために、プラスミドｐＧｅｎ４．５を２工程で作製する。第１工程において、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）γ−アクチン遺伝子（アクセッション番号ＡＦ０５６９７５）の６０７ｂｐのターミネーター領域をプルーフリーディングＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）でのＰＣＲにより増幅し、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内にクローニングする。次工程において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｉｄＡ遺伝子のコード領域を含む１８１２ｂｐの断片をプルーフリーディングＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）でのＰＣＲにより増幅し、ＮａｒＩおよびＰｓｔＩで消化し、該γアクチンターミネーター領域を含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内にクローニングする。ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ゲノムに基づいて、Ｐｃ１２ｇ０９３２０の上流の遺伝子Ｐｃ１２ｇ０９３１０のコード領域がその推定プロモーター領域の範囲を定めると仮定して、遺伝子Ｐｃ１２ｇ０９３２０の推定プロモーター領域を評価する。以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、Ｐｃ１２ｇ０９３２０プロモーター領域をクローニングする：Ｐｃ１２ｇ０９３２０−ｆｏｒ（５’−ＧＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＴＧＴＡＣＴＴＡＣＣＡＡＴＧＧＣ−３’）（配列番号１０）およびＰｃ１２ｇ０９３２０−ｒｅｖ（５’−ＡＧＴＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＡ−３’）（配列番号１１）。プルーフリーディングＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）でのＰＣＲにより得た３５１ｂｐのＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｉｄＡ遺伝子およびペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ａｃｔターミネーター領域を含有する、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化されたプラスミドｐＧｅｎ４．５内にサブクローニングして、プラスミドｐＧｅｎ４．２４を得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子をＰｃ１２ｇ０９３２０プロモーター領域に翻訳的に融合させる。ＳｐｈＩ部位が、ｕｉｄＡ遺伝子の開始メチオニンをコードするＡＴＧ開始コドンの部分となるよう、該ＳｐｈＩ部位を設計して、これを行う。増幅されたプロモーター領域、およびｐ−Ｐｃ１２ｇ０９３２０とｕｉｄＡ遺伝子との間の融合領域の配列決定は、該プロモーター配列の正確さ、および正しいリーディングフレームでの後者のレポーター遺伝子の正確な配置を証明している。

１．３．Ｐ−Ｐｃ１２ｇ０９３２０により駆動されるペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子の発現
ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株Ｑ１７６内へのｐＧｅｎ４．２４の同時形質転換のために、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）からのイソペニシリン‐Ｎ‐シンターゼプロモーターの制御下にＴｎ５−フレオマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドｐＢＣ１００３を選択マーカーとして使用する（２）。Ｃａｎｔｏｒａｌら（１）に従い、プロトプラストを形質転換し、窒素および炭素源としてのそれぞれＮａＮＯ_３およびグルコースならびに３０μｇ／ｍｌフレオマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含有する最少培地内で形質転換体を選択する。窒素および炭素源としてのそれぞれＮａＮＯ_３およびグルコースならびにＵＩＤＡタンパク質の基質としての５０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸のシクロヘキシルアンモニウム塩（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ）を含有する最少培地上のＵＩＤＡ−プレートアッセイにより、陽性クローンのスクリーニングを行う。陽性クローンは、２５℃で２〜５日間のインキュベーションの後に青色コロニーを生成するそれらの能力により特定されうる。ホモカリオン形質転換体を得るために、単一のホモカリオン芽胞からのコロニーを拾い、該発現構築物のゲノム組込みをサザン分析により確認する。異所性に組込まれたｐＧｅｎ４．２４のコピーを含有する４つの独立した形質転換体を成長試験、ノーザンブロットおよびｑＰＣＲ分析のために選択する。サザン分析はプラスミドｐＧｅｎ４．２４の存在を証明している。ＵＩＤＡ転写産物の存在はノーザンブロット分析およびｑＰＣＲ分析による相対量により判定されうる。ＵＩＤＡ−プレートアッセイならびにノーザンおよびｑＰＣＲ分析は、該形質転換Ｐ−Ｐｃ１２ｇ０９３２０−ｕｉｄＡ構築物が該異種細菌β−グルクロニダーゼ遺伝子を発現することを明らかに示している。

１．４．Ｐｃ１２ｇ０９３２０プロモーターの制御下のペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）におけるｕｉｄＡ遺伝子の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子を、実施例１の第１．２節に記載されているＰｃ１２ｇ０９３２０プロモーターに融合させる。ｕｉｄＡ遺伝子の異種発現を定量的ＰＣＲ（７９００ＨＴ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により特徴づける。ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｕｉｄＡ遺伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを設計する。５６ｂｐの産物を与えるフォワードプライマーＥｃｕｉｄＡＵ１（５’−ＴＴＣＡＴＧＣＣＡＧＴＣＣＡＧＣＧＴＴ−３’）（配列番号１２）およびリバースプライマーＥｃｕｉｄＡＬ１（５’−ＣＧＡＣＣＧＣＡＡＡＣＣＧＡＡＧＴＣ−３’）（配列番号１３）。ＲＮＡの単離および精製ならびにｃＤＮＡ合成ならびにそれに続く定量的ＰＣＲ分析（ａｃｔ遺伝子を対照として使用する）の操作を、実施例１の第１．１節に記載されているとおりに行う。Ｐｃ１２ｇ０９３２０プロモーターの制御下にｕｉｄＡ遺伝子を含有する４つの独立したペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株をｑＰＣＲにより分析する。これらの株の全てにおいて、非常に高レベルのｕｉｄＡｍＲＮＡが検出される。この結果は、該Ｐｃ１２ｇ０９３２０−プロモーター−ｕｉｄＡ構築物が異種ｕｉｄＡ遺伝子および内因性Ｐｃ１２ｇ０９３２０遺伝子を発現することを証明している。この結果は、発色性プレート培地上で観察される強力なＵＩＤＡ酵素活性に符合している（実施例１第１．３節を参照されたい）。

２．１．ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のＰｃ１２ｇ１００００遺伝子の定量的ＰＣＲ発現分析
全ゲノムマイクロアレイ分析により検出された新規遺伝子Ｐｃ１２ｇ０９３２０の高発現レベルを確認し定量するために、定量的ＰＣＲ分析を行う。ｑＰＣＲ分析は、実施例１の第１．１節に記載されているとおりに行う。種々の条件下、すなわち、製造条件下で成長させた、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の菌糸から、全ＲＮＡを単離する。ついで逆転写を行って、ｑＰＣＲ分析における鋳型として使用するｃＤＮＡを得る（実施例１の第１．１節を参照されたい）。ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｐｃ１２ｇ１００００遺伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを設計する。Ｐｃ１２ｇ１００００遺伝子配列のそれぞれ１００−１１９位および１９９−１８０位に及ぶフォワードプライマーＰｃ１２ｇ１００００Ｕ１（５’−ＡＡＣＡＡＣＡＴＴＧＣＧＣＴＣＧＡＴＧＡ−３’）（配列番号１４）およびリバースプライマーＰｃ１２ｇ１００００Ｌ１（５’−ＣＣＴＴＧＧＡＡＡＣＣＧＴＧＴＴＣＧＴＴ−３’）（配列番号１５）を設計する。結果は、全ゲノムマイクロアレイ分析によっても検出された非常に強力かつ構成的な遺伝子発現レベルを証明している。該分析は製造条件下のＰｃ１２ｇ０９３２０の永久的かつ構成的な発現レベルを証明している。

２．１．１．ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のＰｃ１２ｇ１００００遺伝子の定量的ＰＣＲ発現分析
全ゲノムマイクロアレイ分析により検出された新規遺伝子Ｐｃ１２ｇ１００００の高発現レベルを確認し定量するために、定量的ＰＣＲ分析を行う。ｑＰＣＲ分析は、実施例１の第１．１節に記載されているとおりに行う。種々の条件下、すなわち、製造条件下で成長させた、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の菌糸から、全ＲＮＡを単離する。ついで逆転写を行って、ｑＰＣＲ分析における鋳型として使用するｃＤＮＡを得る（実施例１の第１．１節を参照されたい）。ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｐｃ１２ｇ１００００遺伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを設計する。Ｐｃ１２ｇ１００００遺伝子配列のそれぞれ１００−１１９位および１９９−１８０位に及ぶフォワードプライマーＰｃ１２ｇ１００００Ｕ１（５’−ＡＡＣＡＡＣＡＴＴＧＣＧＣＴＣＧＡＴＧＡ−３’）（配列番号１４）およびリバースプライマーＰｃ１２ｇ１００００Ｌ１（５’−ＣＣＴＴＧＧＡＡＡＣＣＧＴＧＴＴＣＧＴＴ−３’）（配列番号１５）を設計する。結果は、全ゲノムマイクロアレイ分析によっても検出された非常に強力かつ構成的な遺伝子発現レベルを証明している。該分析は製造条件下のＰｃ１２ｇ１００００の永久的かつ構成的な発現レベルを証明している。

２．２．Ｐｃ１２ｇ１００００プロモーター領域のクローニングおよび特徴づけ
以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、Ｐｃ１２ｇ１００００プロモーター領域をクローニングする：Ｐｃ１２ｇ１００００−ｆｏｒ（５’−ＧＴＣＡＡＡＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＧＡＴＣＴＣＧＴＣ−３’）（配列番号１６）およびＰｃ１２ｇ１００００−ｒｅｖ（５’−ＧＡＧＧＧＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＴＧＴＴＣＡＣＴＴＣＡＡＧＧ−３’）（配列番号１７）。プルーフリーディングＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）でのＰＣＲにより得た７６４ｂｐのＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｉｄＡ遺伝子およびペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ａｃｔターミネーター領域を含有する、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化されたプラスミドｐＧｅｎ４．５内にサブクローニングして、プラスミドｐＧｅｎ４．２４を得る（実施例１第１．２節を参照されたい）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子をＰｃ１２ｇ１００００プロモーター領域に翻訳的に融合させる。ＳｐｈＩ部位が、ｕｉｄＡ遺伝子の開始メチオニンをコードするＡＴＧ開始コドンの部分となるよう、該ＳｐｈＩ部位を設計して、これを行う。増幅されたプロモーター領域、およびｐ−Ｐｃ１２ｇ１００００とｕｉｄＡ遺伝子との間の融合領域の配列決定は、該プロモーター配列の正確さ、および正しいリーディングフレームでの後者のレポーター遺伝子の正確な配置を証明している。

２．３．Ｐ−Ｐｃ１２ｇ１００００により駆動されるペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子の発現
実施例１第１．３節に記載されているのと同じ方法により、ｐＧｅｎ４．２５を形質転換し、形質転換事象を確認する。サザン分析はプラスミドｐＧｅｎ４．２４の存在を証明している。ＵＩＤＡ転写産物の存在はノーザンブロット分析およびｑＰＣＲ分析による相対量により判定されうる。ＵＩＤＡ−プレートアッセイならびにノーザンおよびｑＰＣＲ分析は、該形質転換Ｐ−Ｐｃ１２ｇ１００００−ｕｉｄＡ構築物が該異種細菌β−グルクロニダーゼ遺伝子を発現することを明らかに示している。

２．４．Ｐｃ１２ｇ１００００プロモーターの制御下のペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）におけるｕｉｄＡ遺伝子の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子を、実施例２の第２．２節に記載されているＰｃ１２ｇ０９３２０プロモーターに融合させる。ｕｉｄＡ遺伝子の異種発現を定量的ＰＣＲ（７９００ＨＴ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により特徴づける。実施例１の第１．４節に記載されているとおりに、ｕｉｄＡ遺伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを設計する。ＲＮＡの単離および精製ならびにｃＤＮＡ合成ならびにそれに続く定量的ＰＣＲ分析（ａｃｔ遺伝子を対照として使用する）の操作を、実施例１の第１．４節に記載されているとおりに行う。Ｐｃ１２ｇ１００００プロモーターの制御下にｕｉｄＡ遺伝子を含有する３つの独立したペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株をｑＰＣＲにより分析する。これらの株の全てにおいて、非常に高レベルのｕｉｄＡｍＲＮＡが検出される。この結果は、該１２ｇ１００００−プロモーター−ｕｉｄＡ構築物が異種ｕｉｄＡ遺伝子および内因性Ｐｃ１２ｇ０９３２０遺伝子を発現することを証明している。この結果は、発色性プレート培地上で観察される強力なＵＩＤＡ酵素活性に符合している（実施例２第２．３節を参照されたい）。

２．４．１Ｐｃ１２ｇ１００００プロモーターの制御下のペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）におけるｕｉｄＡ遺伝子の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子を、実施例２の第２．２節に記載されているＰｃ１２ｇ１００００プロモーターに融合させる。ｕｉｄＡ遺伝子の異種発現を定量的ＰＣＲ（７９００ＨＴ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により特徴づける。実施例１の第１．４節に記載されているとおりに、ｕｉｄＡ遺伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを設計する。ＲＮＡの単離および精製ならびにｃＤＮＡ合成ならびにそれに続く定量的ＰＣＲ分析（ａｃｔ遺伝子を対照として使用する）の操作を、実施例１の第１．１節に記載されているとおりに行う。Ｐｃ１２ｇ１００００プロモーターの制御下にｕｉｄＡ遺伝子を含有する３つの独立したペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株をｑＰＣＲにより分析する。これらの株の全てにおいて、非常に高レベルのｕｉｄＡｍＲＮＡが検出される。この結果は、該Ｐｃ１２ｇ１００００−プロモーター−ｕｉｄＡ構築物が異種ｕｉｄＡ遺伝子および内因性Ｐｃ１２ｇ１００００遺伝子を発現することを証明している。この結果は、発色性プレート培地上で観察される強力なＵＩＤＡ酵素活性に符合している（実施例２第３．３節を参照されたい）。

３．１．ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のＰｃ１６ｇ００６６０遺伝子の定量的ＰＣＲ発現分析
全ゲノムマイクロアレイ分析により検出された新規遺伝子Ｐｃ１６ｇ００６６０の高発現レベルを確認し定量するために、定量的ＰＣＲ分析を行う。ｑＰＣＲ分析は、実施例１の第１．１節に記載されているとおりに行う。種々の条件下、すなわち、製造条件下で成長させた、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の菌糸から、全ＲＮＡを単離する。ついで逆転写を行って、ｑＰＣＲ分析における鋳型として使用するｃＤＮＡを得る（実施例１の第１．１節を参照されたい）。ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｐｃ１６ｇ００６６０遺伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを設計する。Ｐｃ１６ｇ００６６０遺伝子配列のそれぞれ１１２２−１１４３位および１２２１−１２０１位に及ぶフォワードプライマーＰｃ１６ｇ００６６０Ｕ１（５’−ＴＧＡＡＧＴＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＴＧＡＴＧ−３’）（配列番号１８）およびリバースプライマーＰｃ１６ｇ００６６０Ｌ１（５’−ＣＧＣＴＴＧＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＴＧＴＴ−３’）（配列番号１９）を設計する。該ｑＰＣＲ分析は、全ゲノムマイクロアレイ分析によっても検出された非常に強力かつ構成的な遺伝子発現レベルを証明している。該分析は製造条件下のＰｃ１６ｇ００６６０の永久的かつ構成的な発現レベルを証明している。

３．２．Ｐｃ１６ｇ００６６０プロモーター領域のクローニングおよび特徴づけ
以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、Ｐｃ１６ｇ００６６０プロモーター領域をクローニングする：Ｐｃ１６ｇ００６６０−ｆｏｒ（５’−ＧＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＧＴＧＧＡＧＣＣＴＧＣＧ−３’）（配列番号２０）およびＰｃ１６ｇ００６６０−ｒｅｖ（５’−ＴＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＡＡＴＣＣＡＧ−３’）（配列番号２１）。プルーフリーディングＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）でのＰＣＲにより得た１４９８ｂｐのＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｉｄＡ遺伝子およびペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ａｃｔターミネーター領域を含有する、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化されたプラスミドｐＧｅｎ４．５内にサブクローニングして、プラスミドｐＧｅｎ４．２６を得る（実施例１第１．２節を参照されたい）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子をＰｃ１６ｇ００６６０プロモーター領域に翻訳的に融合させる。ＳｐｈＩ部位が、ｕｉｄＡ遺伝子の開始メチオニンをコードするＡＴＧ開始コドンの部分となるよう、該ＳｐｈＩ部位を設計して、これを行う。増幅されたプロモーター領域、およびｐ−Ｐｃ１６ｇ００６６０とｕｉｄＡ遺伝子との間の融合領域の配列決定は、該プロモーター配列の正確さ、および正しいリーディングフレームでの後者のレポーター遺伝子の正確な配置を証明している。

３．３．Ｐ−Ｐｃ１６ｇ００６６０により駆動されるペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子の発現
実施例１第１．３節に記載されているのと同じ方法により、ｐＧｅｎ４．２６を形質転換し、形質転換事象を確認する。サザン分析はプラスミドｐＧｅｎ４．２６の存在を証明している。ＵＩＤＡ転写産物の存在はノーザンブロット分析およびｑＰＣＲ分析による相対量により判定されうる。ＵＩＤＡ−プレートアッセイならびにノーザンおよびｑＰＣＲ分析は、該形質転換Ｐ−Ｐｃ１６ｇ００６６０−ｕｉｄＡ構築物が該異種細菌β−グルクロニダーゼ遺伝子を発現することを明らかに示している。

３．４．Ｐｃ１６ｇ００６６０プロモーターの制御下のペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）におけるｕｉｄＡ遺伝子の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子を、実施例３の第３．２節に記載されているＰｃ１６ｇ００６６０プロモーターに融合させる。ｕｉｄＡ遺伝子の異種発現を定量的ＰＣＲ（７９００ＨＴ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により特徴づける。実施例１の第１．４節に記載されているとおりに、ｕｉｄＡ遺伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを設計する。ＲＮＡの単離および精製ならびにｃＤＮＡ合成ならびにそれに続く定量的ＰＣＲ分析（ａｃｔ遺伝子を対照として使用する）の操作を、実施例１の第１．１節に記載されているとおりに行う。Ｐｃ１６ｇ００６６０プロモーターの制御下にｕｉｄＡ遺伝子を含有する４つの独立したペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株をｑＰＣＲにより分析する。これらの株の全てにおいて、非常に高レベルのｕｉｄＡｍＲＮＡが検出される。この結果は、該Ｐｃ１６ｇ００６６０−プロモーター−ｕｉｄＡ構築物が異種ｕｉｄＡ遺伝子および内因性Ｐｃ１６ｇ００６６０遺伝子を発現することを証明している。この結果は、発色性プレート培地上で観察される強力なＵＩＤＡ酵素活性に符合している（実施例３第３．３節を参照されたい）。

４．１．ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のＰｃ２１ｇ０４８３０遺伝子の定量的ＰＣＲ発現分析
全ゲノムマイクロアレイ分析により検出された新規遺伝子Ｐｃ２１ｇ０４８３０の高発現レベルを確認し定量するために、定量的ＰＣＲ分析を行う。ｑＰＣＲ分析は、実施例１の第１．１節に記載されているとおりに行う。種々の条件下、すなわち、製造条件下で成長させた、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の菌糸から、全ＲＮＡを単離する。ついで逆転写を行って、ｑＰＣＲ分析における鋳型として使用するｃＤＮＡを得る（実施例１の第１．１節を参照されたい）。ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、Ｐｃ２１ｇ０４８３０遺伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを設計する。Ｐｃ２１ｇ０４８３０遺伝子配列のそれぞれ４９０−５１０位および５８９−５７０位に及ぶフォワードプライマーＰｃ２１ｇ０４８３０Ｕ１（５’−ＴＴＧＴＣＣＴＧＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＡＴＴ−３’）（配列番号２２）およびリバースプライマーＰｃ２１ｇ０４８３０Ｌ１（５’−ＣＣＡＧＧＣＣＴＡＣＣＧＴＡＣＣＡＴＴＧ−３’）（配列番号２３）を設計する。該ｑＰＣＲ分析は、全ゲノムマイクロアレイ分析によっても検出された非常に強力かつ構成的な遺伝子発現レベルを証明している。該分析は製造条件下のＰｃ２１ｇ０４８３０の永久的かつ構成的な発現レベルを証明している。

４．２．Ｐｃ２１ｇ００４８３０プロモーター領域のクローニングおよび特徴づけ
以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、Ｐｃ２１ｇ０４８３０プロモーター領域をクローニングする：Ｐｃ２１ｇ０４８３０−ｆｏｒ（５’−ＧＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＧＴＣＧＣＣ−３’）（配列番号２４）およびＰｃ２１ｇ０４８３０−ｒｅｖ（５’−ＴＣＡＴＧＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧ−３’）（配列番号２５）。プルーフリーディングＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）でのＰＣＲにより得た１３６３ｂｐのＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｉｄＡ遺伝子およびペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ａｃｔターミネーター領域を含有する、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化されたプラスミドｐＧｅｎ４．５内にサブクローニングして、プラスミドｐＧｅｎ４．２７を得る（実施例１第１．２節を参照されたい）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子をＰｃ２１ｇ０４８３０プロモーター領域に翻訳的に融合させる。ＳｐｈＩ部位が、ｕｉｄＡ遺伝子の開始メチオニンをコードするＡＴＧ開始コドンの部分となるよう、該ＳｐｈＩ部位を設計して、これを行う。増幅されたプロモーター領域、およびｐ−Ｐｃ２１ｇ０４８３０とｕｉｄＡ遺伝子との間の融合領域の配列決定は、該プロモーター配列の正確さ、および正しいリーディングフレームでの後者のレポーター遺伝子の正確な配置を証明している。

４．３．Ｐ−Ｐｃ２１ｇ０４８３０により駆動されるペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子の発現
実施例１第１．３節に記載されているのと同じ方法により、ｐＧｅｎ４．２７を形質転換し、形質転換事象を確認する。サザン分析はプラスミドｐＧｅｎ４．２７の存在を証明している。ＵＩＤＡ転写産物の存在はノーザンブロット分析およびｑＰＣＲ分析による相対量により判定されうる。ＵＩＤＡ−プレートアッセイならびにノーザンおよびｑＰＣＲ分析は、該形質転換Ｐ−Ｐｃ２１ｇ０４８３０−ｕｉｄＡ構築物が該異種細菌β−グルクロニダーゼ遺伝子を発現することを明らかに示している。

４．４．Ｐｃ２１ｇ０４８３０プロモーターの制御下のペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）におけるｕｉｄＡ遺伝子の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子を、実施例４の第４．２節に記載されているＰｃ２１ｇ０４８３０プロモーターに融合させる。ｕｉｄＡ遺伝子の異種発現を定量的ＰＣＲ（７９００ＨＴ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により特徴づける。実施例１の第１．４節に記載されているとおりに、ｕｉｄＡ遺伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを設計する。ＲＮＡの単離および精製ならびにｃＤＮＡ合成ならびにそれに続く定量的ＰＣＲ分析（ａｃｔ遺伝子を対照として使用する）の操作を、実施例１の第１．１節に記載されているとおりに行う。Ｐｃ２１ｇ０４８３０プロモーターの制御下にｕｉｄＡ遺伝子を含有する４つの独立したペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株をｑＰＣＲにより分析する。これらの株の全てにおいて、非常に高レベルのｕｉｄＡｍＲＮＡが検出される。この結果は、該Ｐｃ２１ｇ０４８３０−プロモーター−ｕｉｄＡ構築物が異種ｕｉｄＡ遺伝子および内因性Ｐｃ１６ｇ００６６０遺伝子を発現することを証明している。この結果は、発色性プレート培地上で観察される強力なＵＩＤＡ酵素活性に符合している（実施例３第３．３節を参照されたい）。

５．１．ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）のＰｃ２１ｇ２０３００遺伝子の定量的ＰＣＲ発現分析
全ゲノムマイクロアレイ分析により検出された新規遺伝子Ｐｃ２１ｇ２０３００の高発現レベルを確認し定量するために、定量的ＰＣＲ分析を行う。ｑＰＣＲ分析は、実施例１の第１．１節に記載されているとおりに行う。種々の条件下、すなわち、製造条件下で成長させた、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の菌糸から、全ＲＮＡを単離する。ついで逆転写を行って、ｑＰＣＲ分析における鋳型として使用するｃＤＮＡを得る（実施例１の第１．１節を参照されたい）。ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、Ｐｃ２１ｇ０４８３０遺伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを設計する。Ｐｃ２１ｇ２０３００遺伝子配列のそれぞれ１０３−１２１位および２３０−２０８位に及ぶフォワードプライマーＰｃ２１ｇ２０３００Ｕ１（５’−ＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＡＴＧＧＴＴＧＣＴ−３’）（配列番号２６）およびリバースプライマーＰｃ２１ｇ２０３００Ｌ１（５’−ＴＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＴＣＣＴＴ−３’）（配列番号２７）を設計する。該ｑＰＣＲ分析は、全ゲノムマイクロアレイ分析によっても検出された非常に強力かつ構成的な遺伝子発現レベルを証明している。該分析は製造条件下のＰｃ２１ｇ２０３００の永久的かつ構成的な発現レベルを証明している。

５．２．Ｐｃ２１ｇ２０３００プロモーター領域のクローニングおよび特徴づけ
以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、Ｐｃ２１ｇ２０３００プロモーター領域をクローニングする：Ｐｃ２１ｇ２０３００−ｆｏｒ（５’−ＧＴＣＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＴＧ−３’）（配列番号２８）およびＰｃ２１ｇ２０３００−ｒｅｖ（５’−ＧＣＴＧＡＴＧＣＡＴＣＴＴＧＡＴＧＧＡＴＴＧＡＣＴ−３’）（配列番号２９）。プルーフリーディングＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）でのＰＣＲにより得た１３５９ｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｓｉＩで消化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｉｄＡ遺伝子およびペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ａｃｔターミネーター領域を含有する、ＥｃｏＲＩおよびＮｓｉＩで消化されたプラスミドｐＧｅｎ４．５内にサブクローニングして、プラスミドｐＧｅｎ４．３０を得る（実施例１第１．２節を参照されたい）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子をＰｃ２１ｇ２０３００プロモーター領域に翻訳的に融合させる。ＮｓｉＩ部位が、ｕｉｄＡ遺伝子の開始メチオニンをコードするＡＴＧ開始コドンの部分となるよう、該ＮｓｉＩ部位を設計して、これを行う。増幅されたプロモーター領域、およびｐ−Ｐｃ２１ｇ２０３００とｕｉｄＡ遺伝子との間の融合領域の配列決定は、該プロモーター配列の正確さ、および正しいリーディングフレームでの後者のレポーター遺伝子の正確な配置を証明している。

５．３．Ｐ−Ｐｃ２１ｇ２０３００により駆動されるペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子の発現
実施例１第１．３節に記載されているのと同じ方法により、ｐＧｅｎ４．３０を形質転換し、形質転換事象を確認する。サザン分析はプラスミドｐＧｅｎ４．３０の存在を証明している。ＵＩＤＡ転写産物の存在はノーザンブロット分析およびｑＰＣＲ分析による相対量により判定されうる。ＵＩＤＡ−プレートアッセイならびにノーザンおよびｑＰＣＲ分析は、該形質転換Ｐ−Ｐｃ２１ｇ２０３００−ｕｉｄＡ構築物が該異種細菌β−グルクロニダーゼ遺伝子を発現することを明らかに示している。

５．４．Ｐｃ２１ｇ２０３００プロモーターの制御下のペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）におけるｕｉｄＡ遺伝子の発現
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子を、実施例５の第５．２節に記載されているＰｃ２１ｇ２０３００プロモーターに融合させる。ｕｉｄＡ遺伝子の異種発現を定量的ＰＣＲ（７９００ＨＴ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により特徴づける。実施例１の第１．４節に記載されているとおりに、ｕｉｄＡ遺伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを設計する。ＲＮＡの単離および精製ならびにｃＤＮＡ合成ならびにそれに続く定量的ＰＣＲ分析（ａｃｔ遺伝子を対照として使用する）の操作を、実施例１の第１．１節に記載されているとおりに行う。Ｐｃ２１ｇ２０３００プロモーターの制御下にｕｉｄＡ遺伝子を含有する３つの独立したペニシリウム・クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）株をｑＰＣＲにより分析する。これらの株の全てにおいて、非常に高レベルのｕｉｄＡｍＲＮＡが検出される。この結果は、該Ｐｃ２１ｇ２０３００−プロモーター−ｕｉｄＡ構築物が異種ｕｉｄＡ遺伝子および内因性Ｐｃ２１ｇ２０３００遺伝子を発現することを証明している。この結果は、発色性プレート培地上で観察される強力なＵＩＤＡ酵素活性に符合している（実施例３第５．３節を参照されたい）。

定量的ＰＣＲ発現分析によるペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）の公知アクチンプロモーターに対する新規プロモーターＰ−Ｐｃ２１ｇ０４８３０、Ｐ−Ｐｃ１２ｇ１００００およびＰ−Ｐｃ１６ｇ００６６０の発現強度の比較
新規プロモーターＰ−Ｐｃ２１ｇ０４８３０（配列番号４）、Ｐ−Ｐｃ１２ｇ１００００（配列番号２）およびＰ−Ｐｃ１６ｇ００６６０（配列番号３）に融合したレポーター遺伝子ｕｉｄＡの発現の量を、同様にｕｉｄＡに融合した（例えば、ＵＳ６，３００，０９５Ｂ１に記載されている）良く知られたペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）アクチンプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５６９７５）の発現レベルと比較するために、比較用の定量的ＰＣＲ分析を行う。レポーター遺伝子ｕｉｄＡへの新規プロモーターＰ−Ｐｃ２１ｇ０４８３０、Ｐ−Ｐｃ１２ｇ１００００およびＰ−Ｐｃ１６ｇ００６６０の融合を、それぞれ実施例４の第４．４節、実施例２の第２．４．１節および実施例３の第３．４節に記載されているとおりに行う。発現レベルの比較のために、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）アクチンプロモーター領域（ＵＳ６，３００，０９５Ｂ１，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５６９７５）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子に翻訳的に融合する。以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、該アクチンプロモーター領域をクローニングする：ａｃｎＰ−Ｐ５Ｂ（５’−ＣＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣＣＡＴＣ−３’）（配列番号３０）およびａｃｎＰ−Ｐ３Ｂ（５’−ＣＣＣＴＡＴＧＣＡＴＧＣＧＴＧＡＣＴＧＡＴＴＡＡＡＣＡＡＧＧＧ−３’）（配列番号３１）。プルーフリーディングＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）でのＰＣＲにより得た６４８ｂｐのＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｉｄＡ遺伝子およびペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ａｃｔターミネーター領域を含有する、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化されたプラスミドｐＧｅｎ４．５内にサブクローニングして、プラスミドｐＧｅｎ４．３を得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｕｉｄＡ遺伝子を該アクチンプロモーター領域に翻訳的に融合させる。ＳｐｈＩ部位が、ｕｉｄＡ遺伝子の開始メチオニンをコードするＡＴＧ開始コドンの部分となるよう、該ＳｐｈＩ部位を設計して、これを行う。増幅されたプロモーター領域、および該アクチンプロモーターとｕｉｄＡ遺伝子との間の融合領域の配列決定は、該プロモーター配列の正確さ、および正しいリーディングフレームでの後者のレポーター遺伝子の正確な配置を証明している。

定量的ＰＣＲ（７９００ＨＴ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、ｕｉｄＡ遺伝子の異種発現を分析する。したがって、ｕｉｄＡ遺伝子に対する特異的オリゴヌクレオチドを、実施例１の第１．４節に記載されているとおりに設計する。ＲＮＡの単離および精製ならびにｃＤＮＡ合成ならびにそれに続く定量的ＰＣＲ分析（アクチン遺伝子を対照として使用する）の操作を、実施例１の第１．１節に記載されているとおりに行う。結果は、Ｐｃ２１ｇ０４８３０−プロモーター−ｕｉｄＡ構築物、Ｐｃ１２ｇ１００００−プロモーター−ｕｉｄＡ構築物およびＰｃ１６ｇ００６６０−プロモーター−ｕｉｄＡ構築物が、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）アクチン−プロモーター−ｕｉｄＡ構築物より少なくとも２〜４倍強力にｕｉｄＡ遺伝子を発現することを証明している。該データは、Ｐ−Ｐｃ２１ｇ０４８３０、Ｐ−Ｐｃ１２ｇ１００００およびＰ−Ｐｃ１６ｇ００６６０が、公知アクチンプロモーターより遥かに強力なプロモーターであることを明らかに証明している。

引用文献

図１はＰｃ１２ｇ０９３２０プロモーター配列（配列番号１）を示す。図２はＰｃ１２ｇ１００００プロモーター配列（配列番号２）を示す。図３はＰｃ１６ｇ００６６０プロモーター配列（配列番号３）を示す。図４はＰｃ２１ｇ０４８３０プロモーター配列（配列番号４）を示す。図５はＰｃ２１ｇ２０３００プロモーター配列（配列番号５）を示す。

Claims

（ａ）ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡの製造に適した培地内で真菌宿主細胞［該真菌宿主細胞は、配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号１および少なくとも１００ヌクレオチドであるこれらの部分配列ならびにこれらの変異体（該変異体およびハイブリドプロモータは該プロモーター配列のプロモーター活性の少なくとも約２０％を有する。）、ハイブリッドおよび縦列プロモーターよりなる群から選ばれるプロモーター配列を含む第２核酸配列に機能的に連結された、該ポリペプチドまたは該核酸、好ましくは該アンチセンスＲＮＡもしくは該ヘアピンＲＮＡをコードする第１核酸配列を含む。］を培養する工程、および
（ｂ）該ポリペプチドを該培地から単離する、または
（ｃ）該ポリペプチドを該真菌宿主細胞から単離する工程
を含んでなる、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡの製造方法。
工程（ａ）および／または工程（ｃ）における真菌宿主細胞が糸状菌宿主細胞である、請求項１記載の製造方法。
工程（ａ）および／または工程（ｃ）における真菌宿主細胞がペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）またはアクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）またはアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｔｅｒｒｅｕｓ）またはペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｉｔｒｉｎｕｍ）である、請求項１または２記載の製造方法。
配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号１および少なくとも１００ヌクレオチドであるこれらの部分配列よりなる群から選ばれる核酸配列を含んでなる単離された核酸配列。
（ａ）配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号１よりなる群から選ばれる配列に対して少なくとも８０％の相同性を有する核酸配列、
（ｂ）ストリンジェンシー条件（該ストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの室温で１５分間の洗浄から開始し次いで２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの４５℃で３０分間の洗浄を繰返し次いで０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの６０℃での洗浄を２回繰返す一連の洗浄と定義される。）下で（ｉ）配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号１よりなる群から選ばれる配列、（ｉｉ）少なくとも１００ヌクレオチドの（ｉ）の部分配列または（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の相補鎖にハイブリド形成する核酸配列、
（ｃ）１以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を含む（ａ）または（ｂ）の核酸配列、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の対立遺伝子変異体、ならびに
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の部分配列
よりなる群から選ばれる単離された核酸配列。
請求項４または５記載の核酸配列に機能的に連結された、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡをコードする核酸配列を含んでなる核酸構築物。
請求項６記載の核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクター。
請求項６記載の核酸構築物を含んでなる組換え宿主細胞。
（ａ）真菌宿主細胞［該真菌宿主細胞は、配列番号４、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号１および少なくとも１００ヌクレオチドであるこれらの部分配列ならびにこれらの変異体（該変異体およびハイブリドプロモータは該プロモーター配列のプロモーター活性の少なくとも約２０％を有する。）、ハイブリッドおよび縦列プロモーターよりなる群から選ばれるプロモーター配列を含む第２核酸配列に機能的に連結された、該ポリペプチドまたは該核酸、好ましくは該アンチセンスＲＮＡもしくは該ヘアピンＲＮＡをコードする第１核酸配列を含む。］を、ポリペプチドまたは核酸、好ましくはアンチセンスＲＮＡもしくはヘアピンＲＮＡ（これらは、該宿主細胞の代謝経路を調節し、それにより該小有機化合物の産生をもたらすよう意図されたものである。）の製造に適した培地内で培養する工程、
（ｂ）該ポリペプチドまたはアンチセンスもしくはヘアピンＲＮＡを発現させる工程、
（ｃ）該小有機化合物を発酵ブロスから単離する工程
を含んでなる、発酵的製造により入手可能な小有機化合物の発酵的製造のための方法。
発酵的製造による小有機化合物の製造のための、請求項４または５記載の核酸配列の使用。
真菌宿主細胞の代謝の操作ならびに／もしくはその成長の操作ならびに／もしくは形態学的特徴および／もしくは芽胞形成の調節に関与する経路の操作のための、請求項４または５記載の核酸配列の使用。