JP2009515515A - Cell reprogramming and genetic modification - Google Patents

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Abstract

細胞の再プログラム化および任意選択的な遺伝学的改変のための方法が提供される。多能性ゲノムは、ＮａｎｏｇまたはＭＥＫ阻害剤の存在下において、多能性細胞を分化細胞と融合させることにより分化したゲノムから得られる。細胞は、染色体を個別に含む第１および第２の細胞を提供し、第１の細胞と第２の細胞を融合させ、次いで、第１の細胞由来の少なくとも１つの染色体および第２の細胞由来の少なくとも１つの染色体を有する二倍体細胞を得るために融合細胞を培養することにより遺伝学的に改変される。細胞融合の方法は、ＮａｎｏｇまたはＭＥＫ阻害剤の存在下で第１の細胞と第２の細胞を融合させることを含む。それにより得られる細胞およびそれらの使用について記載される。  Methods for cell reprogramming and optional genetic modification are provided. A pluripotent genome is obtained from a differentiated genome by fusing pluripotent cells with differentiated cells in the presence of Nanog or MEK inhibitors. The cell provides first and second cells that individually contain chromosomes, fuses the first and second cells, and then derives from at least one chromosome and second cell from the first cell Is genetically modified by culturing the fused cells to obtain diploid cells having at least one chromosome. The method of cell fusion comprises fusing a first cell and a second cell in the presence of a Nanog or MEK inhibitor. The resulting cells and their use are described.

Description

本発明は、細胞、特に再プログラム化されうる細胞の再プログラム化および遺伝子改変に関する。本発明は、特に細胞の多能性状態への再プログラム化、ならびに細胞の遺伝学的な改変、例えばかかる再プログラム化の前に遺伝子欠損を修復することに関する。   The present invention relates to reprogramming and genetic modification of cells, particularly cells that can be reprogrammed. The present invention particularly relates to reprogramming of cells to a pluripotent state, as well as genetic modification of cells, eg, repairing gene defects prior to such reprogramming.

胚発生の間、多能性細胞は多くの異なる細胞型に分化する。これらは、活性化または抑制される遺伝子の特異的なサブセット、すなわちエピゲノムにより決定される。有意なことに、分化したエピゲノムは、除核された卵母細胞への核移植およびＥＳまたはＥＧ細胞のいずれかとの細胞融合により多能性が回復されうる。ＥＳおよびＥＧ−Ｔ細胞のハイブリッドでは、Ｔ細胞の不活性化Ｘ、サイレントに刷り込まれた遺伝子およびサイレントなＯｃｔ４−ＧＦＰレポーター導入遺伝子の再活性化が示されている（Tada et al, 1997 and 2001）。さらに、ＥＳおよびＥＧ−Ｔ細胞のハイブリッドが３つの全一次胚葉を付与することがインビボで示され、それは多能性の特性を示す（Tada et al, 1997; 2001）。他の研究では、中枢神経系、骨髄および脾細胞の核がＥＳ細胞との融合後に多能性の可能性を示すことも示されている（Matveeva et al, 1998; Terada et al, 2002; Ying et al, 2002）。さらに、ＥＳ分化細胞のハイブリッドにおける体細胞ゲノムのクロマチン状態の解析では、ＥＳ細胞のゲノム特性が獲得されることが示された（Kimura et al, 2004）。これらの結果は、まとめると、ハイブリッドは単に２つのゲノムの集合体を含むだけでなく、体細胞のドナーゲノムが完全な再プログラム化を経ている可能性が高いことを示した。   During embryonic development, pluripotent cells differentiate into many different cell types. These are determined by a specific subset of genes that are activated or repressed, ie the epigenome. Significantly, the differentiated epigenome can be restored to pluripotency by nuclear transfer to enucleated oocytes and cell fusion with either ES or EG cells. ES and EG-T cell hybrids have shown T cell inactivation X, silently imprinted genes and silent Oct4-GFP reporter transgene reactivation (Tada et al, 1997 and 2001). ). Furthermore, ES and EG-T cell hybrids have been shown in vivo to confer three primary primary germ layers, which exhibit pluripotent properties (Tada et al, 1997; 2001). Other studies have also shown that the nucleus of the central nervous system, bone marrow and splenocytes show potential for pluripotency after fusion with ES cells (Matveeva et al, 1998; Terada et al, 2002; Ying et al, 2002). Furthermore, analysis of the chromatin status of somatic cell genomes in hybrids of ES differentiated cells has shown that the genomic properties of ES cells are acquired (Kimura et al, 2004). Together, these results indicated that the hybrid not only contains two genome assemblies, but the somatic donor genome is likely to have undergone a complete reprogramming.

除核された卵母細胞への体細胞核移植（ＳＣＮＴ）により生存できる動物が作成されているが、成功率は極めて低く、ほとんどの胚が発生の初期段階で致死となる（Hochedlinger and Jaenisch, 2003でレビュー）。主な起因因子はドナーゲノムの再プログラム化におけるエラーである可能性が高い（Humpherys et al, 2001, 2002; Kang et al, 2001, 2002; Xue et al, 2002; Santos et al, 2003）。さらに、一定の比率において、初期のクローン胚が多能性に関連する遺伝子Ｏｃｔ４の不完全な再活性化を示し、このことは、ほとんどのクローン胚が正確に多能性の胚集団を確立できないことを示唆している（Bortvin et al, 2003）。この考察を支持するように、Ｂ細胞核由来の成体マウスの作成は、クローン胚由来のＥＳ細胞の誘導を含むさらなる工程なしでは不可能である（Hochedlinger and Jaenisch, 2002）。したがって、エピジェネティックな再プログラム化の効率を改善することが望まれる。   Surviving animals have been created by somatic cell nuclear transfer (SCNT) into enucleated oocytes, but the success rate is very low and most embryos are lethal in the early stages of development (Hochedlinger and Jaenisch, 2003 Review). The main causal factor is likely an error in donor genome reprogramming (Humpherys et al, 2001, 2002; Kang et al, 2001, 2002; Xue et al, 2002; Santos et al, 2003). In addition, at a certain ratio, early cloned embryos show incomplete reactivation of the pluripotency-related gene Oct4, which means that most cloned embryos cannot accurately establish pluripotent embryo populations. (Bortvin et al, 2003). In support of this consideration, generation of adult mice derived from B cell nuclei is not possible without further steps involving the induction of cloned embryo-derived ES cells (Hochedlinger and Jaenisch, 2002). It is therefore desirable to improve the efficiency of epigenetic reprogramming.

ゲノムの再プログラム化はインビボでも生じる。１０．５ｄｐｃ〜１１．５ｄｐｃで生殖***に入り込む始原生殖細胞（ＰＧＣ）は、ゲノム全域にわたる脱メチル化、サイレントＸ染色体の再活性化および刷り込みの抹消を経る（Hajkova et al, 2002; Sato et al, 2003; Tam et al, 1994）。近年、再プログラム化が初期胚の特徴であることが報告された（Mak et al, 2004; Okamoto et al, 2004）。これらの研究では、刷り込まれたＸ染色体の不活化が後期桑実胚および胚盤胞の全細胞内で生じることが示された。これらの段階では、不活性Ｘのクロマチンは、他のエピジェネティックな標識とともに、Ｈ３−Ｋ９のジメチル化およびＨ３−Ｋ２７のトリメチル化の増多を示した。これは、不活性Ｘが細胞分化のマーカーであり、その状態が安定で遺伝的に伝達され、多能性細胞でのみ可逆性であることから、驚くべき結果であった（Wutz and Jaenisch, 2000）。重要なことに、不活性Ｘはエピジェネティックな標識を抹消し、約４．５ｄｐｃの胚盤葉上層において再活性化することが示された（Mak et al, 2004; Okamoto et al, 2004）。予想外なことに、マウス卵母細胞に移植されたＸＸ体細胞核におけるＸ染色体のエピジェネティックなダイナミクス解析では、正常胚との顕著な差異が示された（Bao et al, 2005）。不活性Ｘのエピジェネティックな標識であるトリメチルＨ３−Ｋ２７は、卵母細胞により抹消されず、Ｘの再活性化が生じた際に胚盤葉上層が形成するまで存続する。このことは、卵母細胞および胚盤葉上層がゲノムの再プログラム化に関して異なる特性を有することを示唆する。再プログラム化を構成する因子は知られていない。しかしながら、これらは、多能性胚盤葉上層を生じることになる胚盤胞の細胞内、ならびにＥＳ−分化細胞ハイブリッドにおけるＸの再活性化を担うＥＳ細胞内に存在しなければならない。同様に、これらの因子はまた、生殖***内に移動するＰＧＣ内およびＥＧ細胞内にも存在しなければならない。   Genomic reprogramming also occurs in vivo. Primordial germ cells (PGC) that enter genital ridges at 10.5 dpc to 11.5 dpc undergo genome-wide demethylation, silent X-chromosome reactivation and imprinting defeating (Hajkova et al, 2002; Sato et al, 2003; Tam et al, 1994). Recently, it has been reported that reprogramming is a characteristic of early embryos (Mak et al, 2004; Okamoto et al, 2004). These studies have shown that imprinted X chromosome inactivation occurs in all cells of late morula and blastocysts. At these stages, inactive X chromatin, along with other epigenetic labels, showed increased dimethylation of H3-K9 and trimethylation of H3-K27. This was a surprising result because inactive X is a marker of cell differentiation and its state is stable, genetically transmitted and reversible only in pluripotent cells (Wutz and Jaenisch, 2000). ). Importantly, inactive X has been shown to eliminate epigenetic labeling and re-activate in the upper blastoderm at about 4.5 dpc (Mak et al, 2004; Okamoto et al, 2004). Unexpectedly, epigenetic dynamics analysis of the X chromosome in XX somatic cell nuclei transplanted into mouse oocytes showed significant differences from normal embryos (Bao et al, 2005). Trimethyl H3-K27, an epigenetic label of inactive X, is not deleted by the oocyte and persists until the upper blastoderm layer is formed when X reactivation occurs. This suggests that the oocyte and the upper blastoderm have different properties with respect to genomic reprogramming. The factors that make up reprogramming are not known. However, they must be present in the blastocyst cells that will give rise to the pluripotent blastoderm, as well as in the ES cells responsible for X reactivation in ES-differentiated cell hybrids. Similarly, these factors must also be present in PGCs and EG cells that migrate into the genital ridge.

Ｎａｎｏｇは、多能性の哺乳類細胞内に存在し、初期発生に必須である固有のホメオドメインを含有するタンパク質である。胚盤胞内での多能性細胞の形成とともに、雌ＸＸ胚内で予め不活性化された親Ｘ染色体は再活性化状態になる。再活性化は、Ｎａｎｏｇを発現する細胞に限定され、Ｎａｎｏを含まない胚内で生じることがない。   Nanog is a protein that is present in pluripotent mammalian cells and contains a unique homeodomain that is essential for early development. With the formation of pluripotent cells in the blastocyst, the parent X chromosome, previously inactivated in the female XX embryo, becomes reactivated. Reactivation is limited to cells that express Nanog and does not occur in embryos that do not contain Nano.

初期胚におけるＮａｎｏｇの発現は、将来の多能性胚盤葉上層細胞を標識し、ＥＳ細胞の分化および胚の発生の間に急速に下方調節される（Chambers et al, 2003; Mitsui et al, 2003）。さらに、Ｎａｎｏｇは、ＥＳ細胞で過剰発現される場合、本来では必須な因子であるＬｉｆおよび血清（ＢＭＰ−４）の非存在下において自己再生を可能にするという独特の特性を示す（Chambers et al, 2003; Ying et al, 2003）。さらに、Ｎａｎｏｇは、再プログラム化が生じている多能性のＥＧ細胞およびＰＧＣで発現される（Chambers et al, 2003; Yamaguchi et al, 2005）。ＮａｎｏｇヌルＥＳ細胞および単離された内部細胞塊（ＩＣＭ）のインビトロにおける特徴付けでは、これらが未分化状態を保持できずに内胚葉様細胞に分化することが示された（Mitsui et al, 2003）。   Nanog expression in early embryos marks future pluripotent epiblast cells and is rapidly down-regulated during ES cell differentiation and embryo development (Chambers et al, 2003; Mitsui et al, 2003). Furthermore, Nanog, when overexpressed in ES cells, exhibits the unique property of allowing self-renewal in the absence of the essential factors Lif and serum (BMP-4) (Chambers et al , 2003; Ying et al, 2003). In addition, Nanog is expressed in pluripotent EG cells and PGCs undergoing reprogramming (Chambers et al, 2003; Yamaguchi et al, 2005). In vitro characterization of Nanog null ES cells and isolated inner cell mass (ICM) showed that they could not retain the undifferentiated state and differentiate into endoderm-like cells (Mitsui et al, 2003). ).

ＷＴとＮａｎｏｇ−／−４．５ｄｐｃおよび休止雌胚の比較解析では、Ｘ染色体の再活性化のみがＷＴ胚、Ｎａｎｏｇを発現する細胞に生じることが示された。   Comparative analysis of WT and Nanog − / − 4.5 dpc and resting female embryos showed that only X chromosome reactivation occurs in WT embryos, Nanog expressing cells.

ＷＯ０３／０６４４６３には、ＮａｎｏｇのＬＩＦとの併用により細胞または核が再プログラム化されることが記載されている。しかしながら、本明細書中に記載の比較例では、Ｎａｎｏｇの発現が再プログラム化を誘導するのに不十分であることが見出された。   WO 03/064463 describes that cells or nuclei are reprogrammed in combination with Nanog's LIF. However, in the comparative examples described herein, it was found that Nanog expression was insufficient to induce reprogramming.

細胞治療を目的として、細胞を遺伝学的に改変し、特に多能性細胞を改変し、それらから子孫を誘導することが望まれる。細胞の遺伝学的な改変は、核の再プログラム化と一緒に、例えばベクターを用いることが知られる。ＳＣＮＴにより生成される細胞の遺伝子改変は、例えば免疫不全の治療に用いられている（Rideout et al, 2002）。しかし、これらの方法はゲノム内に人工産物を残しうる。細胞治療の産物は二倍体細胞であるべきだが、二倍体細胞の融合は、四倍体細胞または染色体の分離が不均等な細胞を生じ、種々の異なる異数性の細胞型を生じることが知られる（Matveeva et al, 1998）。これは監督機関にとっては受け入れがたいものであると思われる。   For the purpose of cell therapy, it is desirable to genetically modify cells, in particular to modify pluripotent cells and to derive progeny therefrom. Genetic modification of cells is known to use, for example, vectors along with nuclear reprogramming. Genetic modification of cells produced by SCNT has been used, for example, in the treatment of immunodeficiency (Rideout et al, 2002). However, these methods can leave artifacts in the genome. The product of cell therapy should be diploid cells, but diploid cell fusion results in tetraploid cells or cells with unequal segregation of chromosomes, resulting in a variety of different aneuploid cell types. Is known (Matveeva et al, 1998). This seems to be unacceptable for supervisors.

それゆえ、核の再プログラム化の効率を高めることが望まれるだろう。しかし、上記のように、現在の効率は低い。遺伝学的な改変を再プログラム化された細胞に導入し、それから二倍体の子孫を誘導することもまた望まれるだろう。   Therefore, it would be desirable to increase the efficiency of nuclear reprogramming. However, as described above, current efficiency is low. It may also be desirable to introduce genetic modifications into the reprogrammed cells and then induce diploid progeny.

本発明の目的は、上記の課題に対する代替するものを改善するか、または少なくとも提供することである。本発明の特定の具体例の目的は、改善された再プログラム化の方法およびそれにより得られる細胞を提供することである。本発明の特定の具体例のさらなる目的は、細胞の遺伝学的な改変、必要に応じて、続いて改変された細胞の再プログラム化、次いでその子孫を誘導する方法を提供することである。   The object of the present invention is to improve or at least provide an alternative to the above problems. The purpose of certain embodiments of the present invention is to provide improved methods of reprogramming and cells obtained thereby. A further object of certain embodiments of the invention is to provide a method for inducing genetic modification of a cell, and optionally reprogramming the modified cell, and then its progeny, if necessary.

（発明の要約）
本発明によると、Ｎａｎｏｇの発現および／またはＭＥＫの阻害が細胞の再プログラム化のために用いられる。 (Summary of the Invention)
According to the present invention Nanog expression and / or inhibition of MEK is used for cell reprogramming.

（発明の詳細な説明）
本発明によると、多能性細胞を分化した細胞と融合させ、次いで融合細胞においてＮａｎｏｇを過剰発現させることを含む分化したゲノムから多能性ゲノムを得る方法が提供される。 (Detailed description of the invention)
According to the present invention, a method is provided for obtaining a pluripotent genome from a differentiated genome comprising fusing a pluripotent cell with a differentiated cell and then overexpressing Nanog in the fused cell.

Ｎａｎｏｇは、融合工程前に多能性細胞でＮａｎｏｇを過剰発現させ、融合の工程前に分化細胞でＮａｎｏｇを過剰発現させ、あるいは、すなわち融合工程後に融合細胞でＮａｎｏｇの過剰発現させることにより、過剰発現されうる。Ｎａｎｏｇは、Ｎａｎｏｇを発現する遺伝学的な構築物を細胞に導入することにより適切に過剰発現される。Ｎａｎｏｇはまた、細胞でＮａｎｏｇの発現を高める培地成分の存在下で、細胞を導入すること、または細胞を培養することにより過剰発現されうる。   Nanog can be overexpressed by overexpressing Nanog in pluripotent cells prior to the fusion step, overexpressing Nanog in differentiated cells prior to the fusion step, or overexpressing Nanog in the fused cells after the fusion step. Can be expressed. Nanog is suitably overexpressed by introducing into the cell a genetic construct that expresses Nanog. Nanog can also be overexpressed by introducing the cell or culturing the cell in the presence of a medium component that enhances the expression of Nanog in the cell.

本発明の特定の具体例では、本方法は、多能性細胞を分化細胞と融合させて融合細胞が形成され、ここで、多能性細胞、分化細胞および融合細胞のうちの少なくとも１つがＭＥＫ阻害剤で処理される。   In certain embodiments of the invention, the method comprises fusing a pluripotent cell with a differentiated cell to form a fused cell, wherein at least one of the pluripotent cell, the differentiated cell and the fused cell is MEK. Treated with inhibitors.

多能性細胞と分化細胞の両方がＭＥＫ阻害剤で処理されうる。   Both pluripotent and differentiated cells can be treated with MEK inhibitors.

この方法において、直接の過剰発現または例えばＭＥＫ阻害剤を用いる過剰発現を介してのＮａｎｏｇの使用が、多能性特性を示す細胞を得る効率を高めることは、有利に見出されている。ＭＥＫ阻害剤による処理がＮａｎｏｇの発現の上方調節をもたらされると考えられる。発明者はまた、さらなる培養後、分化細胞由来の遺伝子情報を有する多能性の二倍体細胞の取得が可能であることを有利に見出している。本発明の方法では、融合細胞は、培地中で維持され、その染色体相補対（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）が二倍体に減少し、回復するまでは自然に染色体を失う。一般に、分化細胞由来の少なくとも１つまたはそれ以上の染色体が、生じた多能性細胞の二倍体状態に寄与する。それゆえ、多能性細胞は、望ましい遺伝子または望ましい染色体あるいは他の望ましい遺伝物質を含む分化細胞をはじめとする細胞および組織を含むその分化した子孫を誘導するために得られ、用いられ得る。   In this way, it has been found to be advantageous that the use of Nanog via direct overexpression or overexpression using eg MEK inhibitors increases the efficiency of obtaining cells exhibiting pluripotent properties. It is believed that treatment with MEK inhibitors results in upregulation of Nanog expression. The inventor has also found that it is possible to obtain pluripotent diploid cells having genetic information derived from differentiated cells after further culturing. In the method of the present invention, the fused cells are maintained in culture medium and their chromosome complement decreases diploid and spontaneously loses chromosomes until they recover. In general, at least one or more chromosomes from differentiated cells contribute to the diploid state of the resulting pluripotent cell. Thus, pluripotent cells can be obtained and used to induce differentiated progeny, including cells and tissues, including differentiated cells that contain the desired gene or the desired chromosome or other desired genetic material.

多能性細胞は、適切には、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性癌腫（ＥＣ）細胞または胚の性腺（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｏｎａｄａｌ）（ＥＧ）細胞であり、下記により詳細に記載される本発明の特定の具体例では、細胞融合は、ＥＳ細胞を分化細胞と融合させることにより多能性ゲノムを生じさせることに成功している。   The pluripotent cell is suitably an embryonic stem (ES) cell, embryonic carcinoma (EC) cell or embryonic gonadal (EG) cell, of the present invention described in more detail below. In certain embodiments, cell fusion has been successful in generating pluripotent genomes by fusing ES cells with differentiated cells.

分化細胞は体細胞であり得、一般には、実質的にすべての体細胞が本明細書に記載される本発明の適用時の使用に適すると考えられる。分化細胞はまた、幹細胞でもあり得、さらに本発明の適用はいずれの特定の幹細胞に限定されないが、一般に幹細胞、特に神経幹細胞、造血幹細胞などまで広げると考えられる。本発明の特定の実施例の使用では、再プログラム化は、分化細胞が神経幹細胞である場合に成功している。   Differentiated cells can be somatic cells, and it is generally believed that substantially all somatic cells are suitable for use during the application of the invention described herein. Differentiated cells can also be stem cells and the application of the present invention is not limited to any particular stem cell, but is generally considered to extend to stem cells, particularly neural stem cells, hematopoietic stem cells, and the like. In the use of certain embodiments of the present invention, reprogramming is successful when the differentiated cell is a neural stem cell.

Ｎａｎｏｇは、様々な異なる手段を介して提供されうる。一の具体例では、Ｎａｎｏｇは多能性細胞でＮａｎｏｇを過剰発現させることにより提供され、別の具体例では、Ｎａｎｏｇは分化細胞でＮａｎｏｇを発現させることにより提供される。   Nanog can be provided via a variety of different means. In one embodiment, Nanog is provided by overexpressing Nanog in pluripotent cells, and in another embodiment, Nanog is provided by expressing Nanog in differentiated cells.

Ｎａｎｏｇが、多能性細胞および分化細胞の両者またはいずれかにおいて、１つまたはそれ以上の細胞に、適切なプロモーターと一緒にＮａｎｏｇをコードするヌクレオチド型配列を含むベクターをトランスフェクトすることにより利便的に直接発現されることも任意選択である。   Conveniently by Nanog transfecting one or more cells in both or any of pluripotent and / or differentiated cells with a vector containing a nucleotide type sequence encoding Nanog together with an appropriate promoter. It is also optional to be expressed directly in

本発明の方法が多能性細胞で過剰発現されるＮａｎｏｇを生じることが好ましく、実際には、内在性ＥＳ細胞レベルの２倍から１５倍までの発現レベルが適すると考えられ、好ましくは１つまたはそれ以上の実施例で用いられる正常レベルの約５倍である３〜１０倍である。   It is preferred that the method of the invention results in Nanog being overexpressed in pluripotent cells, and in practice, expression levels from 2 to 15 times the level of endogenous ES cells are considered suitable, preferably one Or 3 to 10 times, which is about 5 times the normal level used in further examples.

本発明は、一般に、マウス、ヒト、ブタ、ヒツジ、ウシおよびヤギを含む哺乳動物の細胞に適用されると考えられ、あらゆる場合において、多能性細胞および分化細胞が同種のものであることが好ましい。多能性細胞および分化細胞が、両方ともマウス細胞または両方ともヒト細胞であることがさらに好ましい。   The present invention is generally considered to apply to mammalian cells, including mice, humans, pigs, sheep, cows and goats, and in all cases the pluripotent and differentiated cells may be of the same species. preferable. More preferably, the pluripotent and differentiated cells are both mouse cells or both human cells.

これまでに、ＥＳ細胞の融合後、染色体の不均等な分離が存在することが記載されている（Matveva et al 2005）。しかしながら、本発明によると、再プログラム化の方法は、二倍体細胞を得るために融合細胞を培養することを含む。したがって、有利なことまたは驚くべきことに、本発明の教示に従うと、染色体分離が実際には不均等ではなく、二倍体の染色体相補対を含む細胞を得るために行うことができることが見出されている。これらの細胞の解析は、典型的には、それらが多能性細胞由来の染色体およびさらに分化細胞由来の染色体との混合物、すなわち染色体の混合物を有することを示す。   So far, it has been described that there is unequal segregation of chromosomes after fusion of ES cells (Matveva et al 2005). However, according to the present invention, the method of reprogramming involves culturing the fused cells to obtain diploid cells. Thus, advantageously or surprisingly, in accordance with the teachings of the present invention, it has been found that chromosomal segregation is not actually unequal and can be performed to obtain cells containing diploid chromosomal complements. Has been. Analysis of these cells typically indicates that they have a mixture of chromosomes from pluripotent cells and even chromosomes from differentiated cells, ie a mixture of chromosomes.

したがって、本発明の特に好ましい具体例では、多能性細胞と分化細胞の融合が四倍体細胞を生じ、本方法は、四倍体細胞の子孫を得て、次いで、例えば自然な染色体の喪失により二倍体であるか、二倍体になった、かかる子孫を同定することを含む。実際に、得られた細胞の有意な割合が二倍体である。いずれの理論にも縛られたくはないが、これらの細胞の大部分が二倍体状態に自然に戻る場合、および細胞の培養中、好ましくはＮａｎｏｇの存在下で継続される細胞の培養中である場合の両者では、実際に二倍体細胞にとって生存に有利な点が存在しているように思われる。それゆえ、二倍体細胞集団が２つの出発原料細胞の各々に由来する染色体とともに得られうる。   Thus, in a particularly preferred embodiment of the invention, the fusion of pluripotent cells and differentiated cells results in tetraploid cells, and the method obtains the progeny of tetraploid cells and then for example natural chromosome loss Identifying such progeny that are diploid or have become diploid. In fact, a significant percentage of the cells obtained are diploid. Without wishing to be bound by any theory, when most of these cells return spontaneously to a diploid state, and in cell culture, preferably continued in the presence of Nanog. In both cases, there appears to be a survival advantage for diploid cells. Therefore, a diploid cell population can be obtained with chromosomes from each of the two starting material cells.

それゆえ、本発明は、記載されるごとき再プログラム化の工程を行い、その後、融合細胞の子孫として得られた二倍体の多能性細胞を培養し、次いで二倍体の多能性細胞から分化細胞を誘導することにより、分化細胞から体細胞または幹細胞あるいは他の細胞を誘導する機会を提供する。   Therefore, the present invention performs a reprogramming step as described, followed by culturing diploid pluripotent cells obtained as progeny of fusion cells, and then diploid pluripotent cells. Inducing differentiated cells from provides an opportunity to induce somatic cells or stem cells or other cells from differentiated cells.

本発明は、
染色体を含む第１の細胞を提供し、
染色体を含む第２の細胞を提供し、
第１の細胞および第２の細胞を融合させて融合細胞が形成され、次いで
第１の細胞由来の少なくとも１つの染色体および第２の細胞由来の少なくとも１つの染色体を含む二倍体細胞を得るために融合細胞を培養すること
を含む、遺伝学的に細胞を改変する方法をさらに提供する。 The present invention
Providing a first cell comprising a chromosome;
Providing a second cell comprising a chromosome;
To fuse a first cell and a second cell to form a fused cell, and then obtain a diploid cell comprising at least one chromosome from the first cell and at least one chromosome from the second cell Further provided is a method of genetically modifying a cell comprising culturing the fused cell.

任意選択的に、Ｎａｎｏｇは、第１の細胞、第２の細胞および／または融合細胞において過剰発現される。例えば、第１の細胞、第２の細胞および融合細胞のうちの少なくとも１つがＭＥＫ阻害剤で処理されうる。第１の細胞および第２の細胞は、好ましくは両方とも二倍体であり、両方ともマウス細胞または両方ともヒト細胞でありうる。   Optionally, Nanog is overexpressed in the first cell, second cell and / or fusion cell. For example, at least one of the first cell, the second cell, and the fusion cell can be treated with a MEK inhibitor. The first and second cells are preferably both diploid and both can be mouse cells or both human cells.

このようにして得られた細胞が第１の細胞および第２の細胞の各々に由来する染色体を含むことから、本方法は、２つの異なる供給源由来の遺伝的材料を組み合わせて用いることができる。生じた二倍体細胞の得た後、これを試験することにより、染色体のどの特定の組み合わせが二倍体細胞となったかが同定され、必要に応じ、選択が行われて染色体の特に望ましい組み合わせを有する細胞が同定されうる。   Since the cells thus obtained contain chromosomes derived from each of the first and second cells, the method can be used in combination with genetic material from two different sources. . After obtaining the resulting diploid cells, this is tested to identify which particular combination of chromosomes has become a diploid cell, and if necessary, selection is performed to identify a particularly desirable combination of chromosomes. Cells can be identified.

本方法の実施では、第１の細胞および第２の細胞の一方が多能性であることが好ましい。第１の細胞および第２の細胞の他方は、必要に応じて多能性であり、体細胞、必要に応じて幹細胞でありうる。下記の実施例では、他方の細胞は神経幹細胞である。   In carrying out this method, it is preferred that one of the first cell and the second cell is pluripotent. The other of the first cell and the second cell is pluripotent as necessary, and may be a somatic cell, optionally a stem cell. In the examples below, the other cell is a neural stem cell.

染色体の特定の組み合わせを有する細胞の選択は、本発明によって達成されうる。したがって、本発明の具体例は、遺伝子の望ましいコピーおよび改変されるべき同じ遺伝子の望ましくないコピーを有する第１の細胞を同定すること、望ましくない遺伝子の改変形態を有する第２の細胞を同定すること、第１の細胞と第２の細胞を融合させること、融合細胞を培養すること、次いで、遺伝子の望ましいコピーと望ましくない遺伝子の改変形態の両方を含む融合細胞の子孫を同定することを含む。この方法では、第１および第２の細胞に由来する遺伝子の組み合わせは、遺伝的欠損を含まず、望ましくない遺伝子を含まない細胞を生じる。染色体／遺伝子の望ましい組み合わせを含むかまたは含まない細胞の同定および分離を可能にする技術は容易に利用可能であり、それにより欠損を含まない改変された細胞の単離細胞または純粋な集団が得られる。   Selection of cells having a particular combination of chromosomes can be achieved by the present invention. Thus, embodiments of the present invention identify a first cell having a desired copy of a gene and an undesirable copy of the same gene to be modified, and identifying a second cell having a modified form of the undesired gene Fusing the first cell with the second cell, culturing the fused cell, and then identifying the progeny of the fused cell containing both a desired copy of the gene and a modified form of the unwanted gene. . In this method, the combination of genes from the first and second cells does not contain a genetic defect and results in cells that do not contain unwanted genes. Techniques that allow the identification and isolation of cells that contain or do not contain the desired chromosome / gene combination are readily available, resulting in isolated cells or pure populations of modified cells that do not contain defects. It is done.

本発明は、第１の細胞における遺伝的欠損を修復するために有効に利用され、ここで、望ましくない遺伝子が欠損を有する遺伝子を構成し、第２の細胞における遺伝子の改変形態が修復される。   The present invention is effectively used to repair a genetic defect in a first cell, where an undesired gene constitutes a defective gene and a modified form of the gene in a second cell is repaired .

本発明の別の具体例は、正常な内在性遺伝子の発現を変化させるように改変された第１の細胞と内在性遺伝子の正常なコピーを含む第２の細胞との融合、融合細胞を培養すること、次いで、遺伝子の正常なコピーと遺伝子の改変形態の両方を含む融合細胞の子孫を同定することを含む。本発明は、遺伝子発現において代償の変化を起こさせることによって病気を治療するために有効に利用される。   Another embodiment of the present invention is the fusion of a first cell modified to alter the expression of a normal endogenous gene and a second cell containing a normal copy of the endogenous gene, culturing the fused cell Then identifying the progeny of the fusion cell that contains both the normal copy of the gene and the modified form of the gene. The present invention is effectively utilized to treat diseases by causing a compensatory change in gene expression.

修復または改変された遺伝子が第２の細胞で作り出されることも任意であり、このことは、第１の細胞との融合用の遺伝子の適切な組み合わせを有する利用可能な第２の細胞が存在しない場合に適切でありうる。それゆえ、適切な第２の細胞が作られる場合の本発明の方法は、第２の細胞に望ましくない遺伝子の改変形態を導入するために、第１の細胞との融合前に、第２の細胞を遺伝学的に改変することを含みうる。本発明の他の態様に関して記載されるように、初めにまたは潜在的に異数体、一般には四倍体の生じた細胞は、染色体の分離を経ることにより許容される比率で二倍体細胞となり、例えば、進行中の培養、子孫の誘導および細胞治療に有用な細胞を生じ得ることが見出されている。   It is also optional that a repaired or modified gene is created in the second cell, which means that there is no second cell available with the appropriate combination of genes for fusion with the first cell. May be appropriate in some cases. Therefore, the method of the present invention when a suitable second cell is made may include a second cell prior to fusion with the first cell in order to introduce an undesired modified form of the gene into the second cell. It may include genetically modifying the cell. As described with respect to other aspects of the invention, cells that are initially or potentially aneuploid, generally tetraploid, are diploid cells at a rate that is allowed by undergoing chromosome segregation. It has been found that, for example, cells can be generated that are useful for ongoing culture, induction of offspring and cell therapy.

さらなる態様では、本発明は、ＭＥＫ阻害剤の存在下で第１の細胞と第２の細胞を融合させることを含む、細胞融合の方法を提供する。   In a further aspect, the present invention provides a method of cell fusion comprising fusing a first cell and a second cell in the presence of a MEK inhibitor.

第１の細胞は、好ましくは多能性であり、ＥＳ、ＥＣまたはＥＧ細胞であってもよい。第２の細胞はまた、多能性でありうるが、好ましくは体細胞であり、より好ましくは幹細胞である。Ｎａｎｏｇは、本明細書中の他の箇所で記載されるように、第１の細胞および／または第２の細胞でＮａｎｏｇを発現されることにより提供されうる。第１の細胞、第２の細胞および／または融合細胞は、さらに本明細書中の他の箇所で記載されるのように、ＭＥＫ阻害剤の存在下で培養されうる。   The first cell is preferably pluripotent and may be an ES, EC or EG cell. The second cell may also be pluripotent, but is preferably a somatic cell, more preferably a stem cell. Nanog can be provided by expressing Nanog in a first cell and / or a second cell, as described elsewhere herein. The first cell, second cell and / or fusion cell can be further cultured in the presence of a MEK inhibitor, as described elsewhere herein.

二倍体細胞を得る方法を用いることが望ましく、前記方法の実施の際、両方の細胞由来の染色体の最初の組み合わせを有する初めの細胞が高頻度で二倍体状態に戻ることが見出されている。本発明の方法は、第１および第２の細胞を融合させて異数体細胞を生じさせ、次いで融合細胞を培養してその二倍体の子孫を得ることを含む。   It is desirable to use a method of obtaining diploid cells, and when performing said method, it has been found that the first cells with the first combination of chromosomes from both cells frequently return to the diploid state. ing. The method of the invention comprises fusing first and second cells to generate aneuploid cells, and then culturing the fused cells to obtain their diploid progeny.

細胞もまた、本発明によって提供され、細胞は本発明のいずれの態様における方法に従っても得られる。本発明は、細胞を用いる細胞治療の方法、ならびに、治療、好ましくは細胞治療における使用のための医薬品の製造における本発明による細胞の使用をさらに提供する。本発明の治療方法は、患者に本発明の細胞の有効な量を投与することを含む。   Cells are also provided by the present invention, and the cells are obtained according to the method of any aspect of the present invention. The invention further provides a method of cell therapy using cells, as well as the use of cells according to the invention in the manufacture of a medicament for use in therapy, preferably cell therapy. The therapeutic methods of the invention comprise administering to a patient an effective amount of the cells of the invention.

治療のさらなる方法は、患者に本発明の遺伝学的に改変された細胞の有効な量を投与することを含む。   A further method of treatment involves administering to the patient an effective amount of the genetically modified cells of the invention.

治療は、適切には、
遺伝学的に改変された細胞を必要とする患者を同定し、
前記患者の治療に必要である遺伝学的な改変を同定し、次いで
本発明のいずれの具体例の方法に従って遺伝学的に改変された細胞を調製すること
を含みうる。 Treatment is appropriate
Identify patients in need of genetically modified cells,
Identifying genetic modifications that are necessary for the treatment of the patient, and then preparing genetically modified cells according to the methods of any embodiment of the invention.

さらに、本発明は、多能性細胞および体細胞の融合により得られた細胞の再プログラム化におけるＮａｎｏｇの使用を提供する。多能性細胞は典型的にはＥＳ細胞であり、体細胞は、典型的には幹細胞であり、特定の具体例では神経幹細胞である。   Furthermore, the present invention provides the use of Nanog in reprogramming cells obtained by fusion of pluripotent and somatic cells. Pluripotent cells are typically ES cells, somatic cells are typically stem cells, and in specific embodiments are neural stem cells.

本発明はまた、多能性細胞および体細胞の融合により得られた細胞の再プログラム化におけるＭＥＫ阻害剤の使用を提供する。多能性細胞は、典型的にはＥＳ細胞であり、体細胞は、典型的には幹細胞であり、特定の具体例では神経幹細胞である。   The present invention also provides the use of MEK inhibitors in the reprogramming of cells obtained by fusion of pluripotent and somatic cells. Pluripotent cells are typically ES cells, somatic cells are typically stem cells, and in specific embodiments are neural stem cells.

本発明はまた、多能性細胞を得るための体細胞核移植の改善された方法におけるＮａｎｏｇの使用を提供する。それゆえ、本発明の核移植の方法は、体細胞核をレシピエント細胞に移植して核移植細胞を形成させ、次いで核移植細胞でＮａｎｏｇを過剰発現させることを含む。それにより、ドナーの体細胞核の再プログラム化が改善された効率で成し遂げられる。   The present invention also provides the use of Nanog in an improved method of somatic cell nuclear transfer to obtain pluripotent cells. Therefore, the method of nuclear transfer of the present invention comprises transplanting somatic cell nuclei into recipient cells to form nuclear transplant cells, and then overexpressing Nanog in the nuclear transplant cells. Thereby, reprogramming of the somatic cell nucleus of the donor is accomplished with improved efficiency.

一の具体例では、本発明はまた、多能性細胞を得るための体細胞核移植の改善された方法におけるＭＥＫ阻害剤の使用についても提供する。それゆえ、本発明の核移植の方法は、体細胞核をレシピエント細胞に移植して核移植細胞が形成され、次いで核移植細胞をＭＥＫ阻害剤で処理することを含む。ドナーの体細胞核の再プログラム化が改善された効率で成し遂げられる。   In one embodiment, the present invention also provides for the use of a MEK inhibitor in an improved method of somatic cell nuclear transfer to obtain pluripotent cells. Therefore, the method of nuclear transfer of the present invention comprises transplanting a somatic cell nucleus into a recipient cell to form a nuclear transplant cell, and then treating the nuclear transplant cell with a MEK inhibitor. Reprogramming of the donor somatic cell nucleus is accomplished with improved efficiency.

レシピエント細胞は、一般に卵母細胞であり、好ましくは除核され、さらに好ましくはドナーと同種である。   The recipient cell is generally an oocyte, preferably enucleated and more preferably allogeneic with the donor.

本発明の好ましい具体例では、ＭＥＫ阻害剤はＭＥＫ１阻害剤である。既に当該技術分野で既知の適切なＭＥＫ阻害剤の例として、ＭＥＫ１阻害剤ＰＤ１８４３５２およびDavies et al（2000）で開示されたものが挙げられる。   In a preferred embodiment of the invention, the MEK inhibitor is a MEK1 inhibitor. Examples of suitable MEK inhibitors already known in the art include those disclosed in MEK1 inhibitor PD184352 and Davies et al (2000).

本発明のこれらと他の態様における最終段階の子孫は、クローン化された非ヒト動物（ヒトクローニングの形態であり、本発明の一部でない）および多能性細胞培養物を含みうる。それ故、本発明のさらなる具体例では、本発明の細胞融合または核移植の方法を含む、生きた非ヒト動物を得る方法、ならびに本発明の細胞融合または核移植の方法を含む、多能性幹細胞の培養物を得る方法が提供される。   The final stage progeny in these and other aspects of the invention may include cloned non-human animals (in the form of human cloning and not part of the invention) and pluripotent cell cultures. Therefore, further embodiments of the present invention include pluripotency, including methods of obtaining living non-human animals, including cell fusion or nuclear transfer methods of the present invention, and cell fusion or nuclear transfer methods of the present invention. A method of obtaining a culture of stem cells is provided.

ドナー体細胞は、より好ましくは幹細胞であり、特に神経幹細胞である。Ｎａｎｏｇは、本明細書中に記載されるように、ドナー体細胞で発現させることにより提供される。ＭＥＫ阻害剤は、本明細書中の他の箇所で記載されるようにも用いられうる。ＭＥＫ阻害剤は、本明細書中に記載されるようにＮａｎｏｇの発現を上方調節する。Ｎａｎｏｇは、ＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇの発現の正常な内在性レベルを超えたレベル、例えば、ＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇの内在性発現のレベルの２〜１５倍のレベルで発現されることによりドナー体細胞で過剰発現されることが好ましい。   The donor somatic cell is more preferably a stem cell, particularly a neural stem cell. Nanog is provided by expression in donor somatic cells as described herein. MEK inhibitors can also be used as described elsewhere herein. MEK inhibitors up-regulate Nanog expression as described herein. Nanog is overexpressed in donor somatic cells by being expressed at levels above the normal endogenous level of Nanog expression in ES cells, eg, 2-15 times the level of Nanog endogenous expression in ES cells. It is preferably expressed.

本発明の具体例は、核移植のための遺伝子欠損を有するドナー体細胞を用い、次いで病気の治療における使用のための当該技術分野で既知の方法により、得られた多能性細胞における遺伝子欠損を修復することである。この具体例は、一般に、マウス、ヒト、ブタ、ヒツジ、ウシおよびヤギを含む哺乳動物の細胞に適用されると考えられ、あらゆる場合にレシピエント卵母細胞およびドナー体細胞が同種であることが好ましい。   Embodiments of the present invention use a donor somatic cell having a gene defect for nuclear transfer, and then a gene defect in the resulting pluripotent cell by methods known in the art for use in treating disease Is to repair. This embodiment is generally considered to apply to mammalian cells including mice, humans, pigs, sheep, cows and goats, and in all cases the recipient oocytes and donor somatic cells may be allogeneic. preferable.

本発明の好ましい具体例では、細胞はＭＥＫ阻害剤で前処理される。   In a preferred embodiment of the invention, the cells are pretreated with a MEK inhibitor.

本明細書中でのＮａｎｏｇに対する参照については、WO03/064463で記載されるポリペプチド（記載される好ましいポリペプチドを含む）のファミリーを指し、それゆえ、例えば２００〜４００個のアミノ酸を有する多能性決定因子であるポリペプチドを示す。詳細には、マウス多能性決定因子は上記文献中の配列番号２により表され、ヒト多能性決定因子は上記文献中の配列番号４により表され、ラット多能性決定因子は上記文献中の配列番号６により表され、ならびにマカク多能性決定因子は上記文献中の配列番号８により表され、WO03/064463の内容は十分に参照され、参照により本明細書中に援用される。   Reference herein to Nanog refers to the family of polypeptides described in WO03 / 064463 (including the preferred polypeptides described), and thus, for example, multipotent having 200-400 amino acids Polypeptides that are sex determinants are shown. Specifically, the mouse pluripotency determinant is represented by SEQ ID NO: 2 in the above document, the human pluripotency determinant is represented by SEQ ID NO: 4 in the above document, and the rat pluripotency determinant is described in the above document. And the macaque pluripotency determinant is represented by SEQ ID NO: 8 in the above document, the contents of WO03 / 064463 are fully referenced and incorporated herein by reference.

Ｎａｎｏｇはまた、多能性状態に細胞を維持する因子を指し、細胞内で作用し、ホメオドメイン、特に、上記文献中の配列番号２、４、６または８に由来するホメオドメインと少なくとも５０％の配列同一性を有するホメオドメイン、あるいは、所定の種の細胞における因子に関し、同一種の多能性決定因子のホメオドメインと少なくとも５０％の配列同一性を有するものを含む。一般に、ホメオドメインは約６０個のアミノ酸の長さであり、この因子は、任意の２０個のアミノ酸断片が配列番号２、４、６または８のホメオドメインと少なくとも３５％の配列同一性を有するホメオドメインを含む。   Nanog also refers to factors that maintain cells in a pluripotent state and act intracellularly, and are at least 50% more than homeodomains, in particular homeodomains derived from SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 in the above document. Homeodomains having the same sequence identity, or those having at least 50% sequence identity with the homeodomain of a pluripotency determinant of the same species with respect to factors in cells of a given species. In general, the homeodomain is approximately 60 amino acids long, and this factor is that any 20 amino acid fragment has at least 35% sequence identity with the homeodomain of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8. Includes homeodomain.

Ｎａｎｏｇは、（ａ）配列番号２、４、６または８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド分子；（ｂ）（ａ）の自然発生型変異型；（ｃ）（ａ）または（ｂ）のオーソログ、ならびに（ｄ）それらの生物学的に活性であり、診断的または治療的に有用である断片、類似体および誘導体を含む単離ポリペプチドをさらに指す。   Nanog is (a) a polypeptide molecule comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8; (b) a naturally occurring variant of (a); (c) (a) or (b) Further refers to orthologs, and (d) isolated polypeptides, including fragments, analogs and derivatives thereof that are biologically active and useful diagnostically or therapeutically.

Ｎａｎｏｇは、配列番号２、４、６および８のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）、ならびに、配列番号２、４、６または８のポリペプチドに対して少なくとも５０％の類似性（好ましくは少なくとも５０％の同一性）を有するポリペプチド、より好ましくは配列番号２、４、６または８のポリペプチドに対して少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも９０％の同一性）、およびさらにより好ましくは配列番号２、４、６または８のポリペプチドに対して少なくとも９５％の類似性（さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性）をさらに含み、一般に少なくとも３０個のアミノ酸およびより好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸を含有するポリペプチドのかかる部分を有するかかるポリペプチドの一部も含む。２つのポリペプチド間の「類似性」は、第１のポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換基を、第２のポリペプチドの配列と比較することにより調べられる。様々な異なるアプローチが配列の類似性および同一性の計算について知られている。一般に、これらの計算を行うための適する方法は、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのプログラムを用いてデータベース検索を行い、１つまたは好ましくは２つもしくはさらに３つの類似性の表を用いることである。ＢｌｏｓｕｍおよびＰＡＭ（受容点突然変異（Ｐｏｉｎｔ Ａｃｃｅｐｔｅｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎ）マトリックスは、データベース検索および配列アラインメントに適するアミノ酸の類似性マトリックスである。スミス−ウォーターマンまたはＦＡＳＴＡが用いられる場合、オープンギャップペナルティが十分に大きいことを保証することが適切であり、初期の実行が全く相同配列を明らかにしない場合、異なるアルゴリズムを試みることが適切でありうる（これはヒューリスティックアルゴリズム、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡの一つから始める場合に特に該当する）。   Nanog has at least 50% similarity (preferably at least 50) to the polypeptide of SEQ ID NO: 2, 4, 6 and 8 (especially the mature polypeptide) and the polypeptide of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8. % Identity), more preferably at least 90% similarity (more preferably at least 90% identity) to the polypeptide of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, and even more preferred Further comprises at least 95% similarity (even more preferably at least 95% identity) to the polypeptide of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, generally at least 30 amino acids and more preferably at least 50 Also included are portions of such polypeptides having such portions of a polypeptide containing a single amino acid. “Similarity” between two polypeptides is determined by comparing the amino acid sequence of the first polypeptide and its conserved amino acid substituents to the sequence of the second polypeptide. A variety of different approaches are known for calculating sequence similarity and identity. In general, a suitable method for performing these calculations is to perform a database search using programs such as Smith-Waterman, BLAST or FASTA, and one or preferably two or even three similarities. Use a table. Blosum and PAM (Point Accepted Mutation matrices are amino acid similarity matrices suitable for database searching and sequence alignment. When Smith-Waterman or FASTA is used, the open gap penalty is sufficiently large. If it is appropriate to guarantee and the initial run reveals no homologous sequences, it may be appropriate to try a different algorithm (this is especially true when starting with one of heuristic algorithms, BLAST or FASTA) ).

下記により詳細が示される本発明の実施例では、神経幹細胞は、体細胞、すなわち分化したエピゲノムの供給源として用いられる。神経幹（ＮＳ）細胞は拡張可能であり、遺伝学的に操作しやすい（Conti et al, 2005）。これらは胎児および成人の脳ならびにＥＳ細胞に由来することができる。ＮＳ細胞は、再生可能な様式で、放射状グリア細胞の形態および分子的特徴を表す均一な集団を形成する。さらに、移植アッセイでは、これらの細胞はさらなる増殖後であっても形質転換されないことが示された（Conti et al, 2005）。ＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇの過剰発現は、ＥＳ×ＮＳ細胞融合後にＮＳ細胞ゲノムの再プログラム化を促進することが示された。さらに、Ｎａｎｏｇの発現は、Ｎａｎｏｇ−／−ＥＳ細胞がＥＳ−ＮＳ細胞のハイブリッドを作成できないことにより示されているように、ＮＳ細胞の再プログラム化に必要である。しかしながら、我々の試験では、この特性は、Ｎａｎｏｇ−／−ＥＳ細胞および少し限定されたＮＳ細胞の両方において、Ｎａｎｏｇのトランスジェニックな発現の導入により回復された。ＥＳ−ＥＳおよびＥＳ−ＮＳのＦＡＣＳにより選別されたハイブリッドにおけるＥＳ様コロニーを生成する能力の比較では、ＥＳ細胞由来のＮａｎｏｇの過剰発現がＮＳ細胞ゲノムの再プログラム化に必要となる唯一の因子であることが示唆された。本試験では、再プログラム化との関連における結果を分析し、分化したゲノムから多能性ゲノムの構築のためのＮａｎｏｇに基づく系を提供する。   In the examples of the present invention described in more detail below, neural stem cells are used as a source of somatic cells, ie differentiated epigenome. Neural stem (NS) cells are expandable and genetically manipulated (Conti et al, 2005). They can be derived from fetal and adult brain and ES cells. NS cells form a homogeneous population that represents the morphology and molecular characteristics of radial glial cells in a reproducible manner. Furthermore, transplantation assays showed that these cells were not transformed even after further growth (Conti et al, 2005). Overexpression of Nanog in ES cells has been shown to promote reprogramming of the NS cell genome after ES × NS cell fusion. Furthermore, Nanog expression is required for reprogramming of NS cells, as indicated by the failure of Nanog − / − ES cells to create ES-NS cell hybrids. However, in our study, this property was restored by the introduction of Nanog transgenic expression in both Nanog-/-ES cells and slightly restricted NS cells. In comparison of the ability to generate ES-like colonies in ES-ES and ES-NS FACS-selected hybrids, overexpression of ES cell-derived Nanog is the only factor required for reprogramming of the NS cell genome It was suggested that there is. In this study, we analyze the results in the context of reprogramming and provide a Nanog-based system for the construction of pluripotent genomes from differentiated genomes.

下記でより詳細に示されるさらなる実施例では、胚性幹細胞（ＥＳ）におけるＮａｎｏｇの過剰発現は、神経幹（ＮＳ）細胞との融合後に得られる多能性ハイブリッドの２００倍の頻度まで増大する。このことは、細胞生存度またはクローン原性（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）に関するＮａｎｏｇの効果によって説明できない。ＮＳ細胞におけるＮａｎｏｇの強制発現はそれらをＥＳ細胞に変換しないが、再プログラム化にはＮａｎｏｇにさらなる因子が必要であることを示す。しかしながら、Ｎａｎｏｇを過剰発現させるＥＳ細胞は、ＥＳ×ＥＳ融合体と同じ効率で、ＮＳ細胞と多能性ハイブリッドを形成するが、そこには再プログラム化はなされなかった。このことは、Ｎａｎｏｇのレベルが、ＮＳ細胞エピゲノムをハイブリッド内で多能性に再プログラム化させる唯一の制限因子であることを意味した。   In a further example, shown in more detail below, Nanog overexpression in embryonic stem cells (ES) increases to 200 times the frequency of pluripotent hybrids obtained after fusion with neural stem (NS) cells. This cannot be explained by Nanog's effect on cell viability or clonogenicity. Forced expression of Nanog in NS cells does not convert them to ES cells, but indicates that Nanog requires additional factors for reprogramming. However, ES cells that overexpress Nanog form pluripotent hybrids with NS cells with the same efficiency as ESxES fusions, but were not reprogrammed there. This meant that the level of Nanog was the only limiting factor that reprogrammed the NS cell epigenome to pluripotency within the hybrid.

他の点では比較的正常であるが、ＮａｎｏｇヌルＥＳ細胞は、ＮＳ細胞との融合によるいずれの多能性ハイブリッドを生じることができなかった。それらの能力はＮａｎｏｇ導入遺伝子の導入により完全に回復された。これらの知見は、Ｎａｎｏｇが多能性の維持にとって重要でないが、未使用の初期胚細胞と分化した細胞核の再プログラム化の両者において、多能性エピゲノムの形成を編成するのに極めて重要な役割を果たすことを示した。   Although otherwise normal, Nanog null ES cells were unable to produce any pluripotent hybrid by fusion with NS cells. Their ability was fully restored by the introduction of the Nanog transgene. These findings are not critical for Nanog's maintenance of pluripotency, but play a pivotal role in organizing the formation of pluripotent epigenomes both in unused early embryonic cells and in the reprogramming of differentiated cell nuclei Showed that

また、多能性特性を有する細胞を得る効率を高め、細胞におけるＮａｎｏｇの発現を上方調節するためのＭＥＫ阻害剤の使用について下記に記載される。細胞がＭＥＫ阻害剤で処理される場合、Ｎａｎｏｇ導入遺伝子を用いる処理と同様の効果を有する細胞融合により再プログラム化が促進されることが示されている。   Also described below is the use of MEK inhibitors to increase the efficiency of obtaining cells with pluripotent properties and to upregulate Nanog expression in the cells. It has been shown that when cells are treated with a MEK inhibitor, reprogramming is facilitated by cell fusion that has similar effects as treatment with Nanog transgene.

本発明のさらなる具体例では、細胞の再プログラム化におけるＭＥＫ阻害剤の使用について提供される。好ましくは、細胞は体細胞である。好ましい具体例では、細胞はインビトロで再プログラム化される。好ましくは、細胞は融合細胞ではない。   In a further embodiment of the invention, there is provided for the use of a MEK inhibitor in cell reprogramming. Preferably, the cell is a somatic cell. In preferred embodiments, the cells are reprogrammed in vitro. Preferably the cell is not a fused cell.

細胞をＭＥＫ阻害剤で処理することを含む体細胞を再プログラム化する方法がさらに提供される。   Further provided is a method of reprogramming somatic cells comprising treating the cells with a MEK inhibitor.

このことに関して、本発明は、体細胞に多能性を戻す再プログラム化を許容し、細胞融合または核移植を伴わない多能性細胞の誘導を可能にする。   In this regard, the present invention allows reprogramming to return pluripotency to somatic cells and allows induction of pluripotent cells without cell fusion or nuclear transfer.

本明細書中のＭＥＫ阻害剤に関する参照については、一般にＭＥＫ阻害剤を示す。ＭＥＫ１阻害剤、例えばＰ１８４３５２についても参照がなされる（Davies et al, 2000）。Ｐ１８４３５２は、他の既知のＭＥＫ阻害剤と比較して高い特異性および効力を有することが見出されている。   References to MEK inhibitors herein generally refer to MEK inhibitors. Reference is also made to MEK1 inhibitors, eg P184352 (Davies et al, 2000). P184352 has been found to have high specificity and potency compared to other known MEK inhibitors.

本発明は、ここでは以下の実施例にて示され、下記の図により添付される特定の具体例において例示される。   The invention will now be illustrated in the following examples, and illustrated in the specific examples attached by the following figures.

図１は、Ｎａｎｏｇの発現がインビボにおけるＸの再活性化に必要であることを示す。   FIG. 1 shows that Nanog expression is required for X reactivation in vivo.

図２は、ＮａｎｏｇがＥＳ細胞におけるＥＳ−分化細胞ハイブリッドコロニーを形成するＥＳ細胞の能力を高めることを示す。   FIG. 2 shows that Nanog enhances the ability of ES cells to form ES-differentiated cell hybrid colonies in ES cells.

図３は、細胞の生存および分化におけるＰＥＧの効果を示す。   FIG. 3 shows the effect of PEG on cell survival and differentiation.

図４は、ＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドにおけるＮＳエピゲノムの解析を示す。   FIG. 4 shows analysis of NS epigenome in ES-NS cell hybrids.

図５は、融合混合物のＦＡＣＳ解析を示す。   FIG. 5 shows FACS analysis of the fusion mixture.

図６は、ＮａｎｏｇがＥＳ様ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの作成に必要であることを示す。   FIG. 6 shows that Nanog is required for the generation of ES-like ES-NS hybrid colonies.

図７（補図１）は、ハイブリッドクローンの染色体の計数値を示す。   FIG. 7 (Supplementary FIG. 1) shows the chromosome counts of the hybrid clones.

図８（補図２）は、ＥＳ−ＮＳハイブリッドがトランスジェニックＮａｎｏｇの欠失後に多能性を示すことを示す。   FIG. 8 (Supplementary FIG. 2) shows that ES-NS hybrids show pluripotency after deletion of transgenic Nanog.

図９は、多能性ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの形成におけるＰＤ１８４３５２の効果を示す。   FIG. 9 shows the effect of PD184352 in the formation of pluripotent ES-NS hybrid colonies.

より詳細には、図１は、Ｎａｎｏｇの発現がインビボにおけるＸの再活性化に必要であることを示す。（Ａ〜Ｄ）Ｎａｎｏｇのヘテロ接合型マウス間の交配により得られた、雌（ＸＸ）４．５ｄｐｃおよび休眠胚におけるＥｅｄおよびＮａｎｏｇに対する免疫蛍光。図（Ａ、Ｂ）は、解析した胚の完全な共焦点像を示す。矢印はＮａｎｏｇ陽性細胞を示す。（Ｃ、Ｄ）より高い倍率のＡおよびＢのｎａｎｏｇ陽性胚。Ｎａｎｏｇ陽性細胞由来ではＥｅｄの大きな焦点が存在しないことに留意のこと（白色矢じり）。図は、解析した胚の部分的な共焦点像を示す。赤色矢じりは、Ｅｅｄの大きな焦点（不活性Ｘ）を示す細胞核の例を示す。胚の核をＤａｐｉで対比染色した。（Ｅ、Ｆ）４．５（Ｅ）および休眠（Ｆ）胚のＮａｎｏｇ陽性細胞におけるＥｅｄの大きな焦点の存在（Ｘｉを伴う）または非存在（Ｘｉを伴わない）のスコアをまとめた表。   More specifically, FIG. 1 shows that Nanog expression is required for X reactivation in vivo. (AD) Immunofluorescence against Eed and Nanog in female (XX) 4.5dpc and dormant embryos obtained by mating between Nanog heterozygous mice. Figures (A, B) show complete confocal images of the analyzed embryos. Arrows indicate Nanog positive cells. (C, D) Higher magnification A and B nanog positive embryos. Note that there is no major focus of Eed from Nanog positive cells (white arrowheads). The figure shows a partial confocal image of the analyzed embryo. The red arrowhead shows an example of a cell nucleus showing a large Eed focus (inactive X). Embryonic nuclei were counterstained with Dapi. Table summarizing scores for presence (with Xi) or absence (without Xi) of Eed's large focus in Nanog positive cells of (E, F) 4.5 (E) and dormant (F) embryos.

図２は、ＮａｎｏｇがＥＳ−分化細胞ハイブリッドコロニーを形成するＥＳ細胞の能力を高めることを示す。（Ａ〜Ｆ）リーシュマンで染色されたハイブリッドコロニーを含むプレートを示す。ＥＳ Ｏ４ＧｉＰ（Ａ）、ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ（胚）（Ｂ）、ＮＳ ＴＧＦＰ（Ｄ）、ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ（成体）（Ｅ）およびＭＥＦ ＴＧＦＰ（Ｆ）を有するＲＨおよびＲＨＮ ＥＳ細胞に関する融合体のスコア化されたコロニーは、赤色および緑色蛍光を示した（右欄の例を参照）。スコア化されたＥＦ４×ＮＳ Ｏ４ＧｉＰＧＦＰＩＨ（Ｃ）コロニーは緑色蛍光のみを示した。全スコア化されたコロニーはＥＳの形態を示し、細胞の培養中にスコア化が行われた。（Ｇ）ＲＨ、ＲＨＮ、ＥＦ４、ＥＦ４ｃｒｅ３、ＥＳ Ｏ４ＧｉＰ、ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ（胚）およびＮＳ ＴＧＦＰ細胞におけるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２レベルの解析。α−チューブリンをローディングコントロールとして用いた。ＥＳ Ｏ４ＧｉＰ細胞がピューロマイシンの選択下で培養され、それはＯｃｔ４調節配列により駆動されることから、比較的純粋なＥＳ細胞集団を示すことに留意のこと。   FIG. 2 shows that Nanog enhances the ability of ES cells to form ES-differentiated cell hybrid colonies. (AF) Plates containing hybrid colonies stained with Leishman are shown. Scored fusions for RH and RHN ES cells with ES O4GiP (A), NS O4GiP (embryo) (B), NS TGFP (D), NS O4GiP (adult) (E) and MEF TGFP (F) The colonies showed red and green fluorescence (see example in the right column). The scored EF4 × NS O4GiPGGFPIH (C) colonies showed only green fluorescence. All scored colonies showed ES morphology and were scored during cell culture. (G) Analysis of Nanog, Oct4 and Sox2 levels in RH, RHN, EF4, EF4cre3, ES O4GiP, NS O4GiP (embryo) and NS TGFP cells. α-tubulin was used as a loading control. Note that ES O4GiP cells are cultured under puromycin selection, which is driven by Oct4 regulatory sequences, thus representing a relatively pure ES cell population.

図３は、細胞の生存および分化におけるＰＥＧの効果を示す。（Ａ）ＲＨおよびＲＨＮ細胞のＰＥＧ処理２４時間後における１００ｍｍプレートに接着したＥＳ細胞の数を示す棒グラフ。１０６個の細胞を蒔いた。（Ｂ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）で染色されたＲＨおよびＲＨＮコロニーを含む９６ウェルプレートを示す。ＰＥＧにより処理された細胞および未処理の細胞は、トリプシン化（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚｅｄ）する前に培養プレート中で４時間静置状態にし、単一の細胞を９６ウェルプレートにＦＡＣＳで選別した。次いで、細胞を１２日間培養した。（Ｃ）９６ウェルプレートのデータをまとめた表。 FIG. 3 shows the effect of PEG on cell survival and differentiation. (A) Bar graph showing the number of ES cells attached to a 100 mm plate 24 hours after PEG treatment of RH and RHN cells. 10 6 cells were seeded. (B) 96 well plate containing RH and RHN colonies stained with alkaline phosphatase (AP). Cells treated with PEG and untreated cells were allowed to rest in the culture plate for 4 hours before trypsinized, and single cells were sorted by FACS into 96-well plates. The cells were then cultured for 12 days. (C) Table summarizing data of 96 well plates.

図４は、ＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドにおけるＮＳエピゲノムの解析を示す。（Ａ〜Ｄ）ＸＸ ＮＳ ＴＧＦＰ、ＸＹ ＲＨ、ＸＹ ＲＨＮ、ＸＸＸＹ ＲＨ−ＮＳ ＴＧＦＰおよびＸＸＸＹ ＲＨＮ−ＮＳ ＴＧＦＰ細胞における、トリメチルＨ３−Ｋ２７（ｍｅ３Ｈ３−Ｋ２７）（Ａ）およびユビキチル（Ｕｂｉｑｕｉｔｙｌ）Ｈ２Ａ（ｕｂＨ２Ａ）（Ｂ）に対する免疫蛍光、ならびにＸｉｓｔ（Ｃ）およびＯｃｔ４（Ｄ）に対するＲＮＡ ＦＩＳＨ。黄色矢じりは、ＸＸ ＮＳ ＴＧＦＰ細胞におけるｍｅ３Ｈ３−Ｋ２７、ｕｂＨ２ＡまたはＸｉｓｔ ＲＮＡ核小体の存在を示す。これらのマーカーを示す細胞の百分率は黄色で示される。白色矢じりは、Ｏｃｔ４またはＸｉｓｔ ＲＮＡの発生期（ｎａｓｅｃｅｎｔ）の転写産物の存在を示す。期待される対立遺伝子の発現を示す細胞の百分率を白色で示す。全ての核をＤａｐｉで対比染色した。（Ｅ）ＮＳ ＴＧＦＰ、ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ、ＲＨ、ＲＨＮ、ＲＨ−ＮＳ ＴＧＦＰ（クローン１および２）ならびにＲＨＮ−ＮＳ ＴＧＦＰ（クローン１および２）におけるＢｌｂｐ、Ｏｌｉｇ２およびＯｃｔ４のＲＴ−ＰＣＲ解析。Ｇａｐｄｈを遍在的（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ）に発現される対照として用いた。ｃｌ−クローン。 FIG. 4 shows analysis of NS epigenome in ES-NS cell hybrids. (AD) XX NS TGFP, XY RH, XY RHN, XXXY RH-NS TGFP and XXXY RHN-NS TGFP cells in trimethyl H3-K27 (me 3 H3-K27) (A) and ubiquityl H2A ( Immunofluorescence for ubH2A) (B) and RNA FISH for Xist (C) and Oct4 (D). Yellow arrowhead indicates the presence of me 3 H3-K27, ubH2A or Xist RNA nucleolus in XX NS TGFP cells. The percentage of cells showing these markers is shown in yellow. White arrowheads indicate the presence of Oct4 or Xist RNA nascent transcripts. The percentage of cells showing the expected allele expression is shown in white. All nuclei were counterstained with Dapi. (E) RT-PCR analysis of Blbp, Olig2 and Oct4 in NS TGFP, NS O4GiP, RH, RHN, RH-NS TGFP (clone 1 and 2) and RHN-NS TGFP (clone 1 and 2). Gapdh was used as a ubiquitously expressed control. cl-clone.

図５は融合混合物のＦＡＣＳ分析を示す。（Ａ〜Ｃ）ＲＨ×ＮＳ ＴＧＦＰ、ＲＨＮ×ＮＳ ＴＧＦＰ、ＲＨＮ×ＥＳ Ｏ４ＧｉＰ、ＲＨＮ×ＭＥＦ ＴＧＦＰおよびＲＨＮ×Ｔ ＴＧＦＰの赤色および緑色蛍光の両方を検出するＦＡＣＳプロットを示す。（Ａ）ハイブリッド集団の解析およびＦＡＣＳ選別におけるゲート制御をもたらすモック（ｍｏｃｋ）融合体；（Ｂ）ＰＥＧ処理２４時間後における融合混合物；（Ｃ）Ｂでゲート制御され、ＦＡＣＳにより選別されたハイブリッドの精製度確認；（Ｄ）Ｂで選別されたハイブリッドが蒔かれ、形成されたコロニーは、蒔かれたハイブリッド当たりのコロニーの百分率としてスコア化された。これらのスコアでは、ＦＡＣＳにより選別された細胞の精製度を考慮する。繰り返し実験から得られたスコアを（Ｅ）で示す。   FIG. 5 shows FACS analysis of the fusion mixture. (AC) FACS plots detecting both red and green fluorescence of RH × NS TGFP, RHN × NS TGFP, RHN × ES O4GiP, RHN × MEF TGFP and RHN × T TGFP. (A) Mock fusions resulting in analysis of hybrid populations and gating in FACS sorting; (B) Fusion mixture 24 hours after PEG treatment; (C) Hybrids gated with B and sorted by FACS Purity confirmation; (D) B selected hybrids were sown and colonies formed were scored as a percentage of colonies per sown hybrid. These scores take into account the degree of purification of cells sorted by FACS. The score obtained from the repeated experiment is indicated by (E).

図６は、ＮａｎｏｇがＥＳ様ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの作成に必要であることを示す。（Ａ、Ｂ）ＲＣ×ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ、ＲＣＡ−／−×ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ、ＲＣＡ−／−ＮＺ×ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ、ＲＣＡ−／−×ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ ＮＰ、ＲＣＢ−／−×ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ、ＲＣＢ−／−ＮＺ×ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ、ＲＣＢ−／−×ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ ＮＰ細胞間の融合において、アルカリホスファターゼで染色されたハイブリッドコロニーを含むプレートを示す。スコアを各プレートの下に示す。（Ｄ）ＥＳ Ｏ４ＧｉＰ、ＲＣ、ＲＣＡ−／−、ＲＣＢ−／−、ＲＣＡ−／−ＮＺ、ＲＣＢ−／−ＮＺ、ＮＳ Ｏ４ＧｉＰおよびＮＳ Ｏ４ＧｉＰ ＮＰ細胞におけるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２レベルの解析。α−チューブリンをローディングコントロールとして用いた。（Ｅ）ＥＳ Ｏ４ＧｉＰ、ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ ＮＰおよびＮＳ Ｏ４ＧｉＰ細胞におけるＢｌｂｐ、Ｏｌｉｇ２、ＧＦＰおよびＯｃｔ４のＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｇａｐｄｈを偏在的に発現される対照として用いた。（Ｆ）ＲＣ、ＲＣＢ−／−およびＲＣＢ−／−ＮＺ細胞の生存におけるＰＥＧの効果。棒グラフは、ＰＥＧ処理２４時間後における１００ｍｍのプレートに接着したＥＳ細胞の数を示す。２×１０６個の細胞を蒔いた。 FIG. 6 shows that Nanog is required for the generation of ES-like ES-NS hybrid colonies. (A, B) RC × NS O4GiP, RCA − / − × NS O4GiP, RCA − / − NZ × NS O4GiP, RCA − / − × NS O4GiP NP, RCB − / − × NS O4GiP, RCB − / − NZ × FIG. 6 shows plates containing hybrid colonies stained with alkaline phosphatase in fusion between NS O4GiP, RCB − / − × NS O4GiP NP cells. Scores are shown below each plate. (D) Analysis of Nanog, Oct4 and Sox2 levels in ES O4GiP, RC, RCA − / −, RCB − / −, RCA − / − NZ, RCB − / − NZ, NS O4GiP and NS O4GiP NP cells. α-tubulin was used as a loading control. (E) RT-PCR analysis of Blbp, Olig2, GFP and Oct4 in ES O4GiP, NS O4GiP NP and NS O4GiP cells. Gapdh was used as a ubiquitously expressed control. (F) Effect of PEG on survival of RC, RCB − / − and RCB − / − NZ cells. The bar graph shows the number of ES cells attached to a 100 mm plate 24 hours after PEG treatment. 2 × 10 6 cells were seeded.

図７（補図１）は、ハイブリッドクローンの染色体の計数値を示す。実施例は、ＲＨ−ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ（Ａ）、ＲＨＮ−ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ（Ｂ）、ＲＨ−ＮＳ ＴＧＦＰ（Ｃ）およびＲＨＮ−ＮＳ ＴＧＦＰ（Ｃ）の***中期の拡張を示す。***中期染色体を各ハイブリッド細胞株の３クローンにつき８から１１個の細胞で計数し、各図の下に示す。ｃｌ−クローン。   FIG. 7 (Supplementary FIG. 1) shows the chromosome counts of the hybrid clones. The examples show metaphase expansion of RH-NS O4GiP (A), RHN-NS O4GiP (B), RH-NS TGFP (C) and RHN-NS TGFP (C). Metaphase chromosomes are counted in 8 to 11 cells for 3 clones of each hybrid cell line and are shown below each figure. cl-clone.

図８（補図２）は、ＥＳ−ＮＳハイブリッドがトランスジェニックＮａｎｏｇの欠失後に多能性を示すことを示す。（Ａ）ＥＦ４および神経幹（ＮＳ）Ｏ４ＧｉＰ ＲＢ細胞の模式図。ＥＦ４細胞はｌｏｘＰ部位に隣接した構成的に発現するＮａｎｏｇ導入遺伝子を含み、それによりｃｒｅ組換え酵素を用いてＮａｎｏｇの欠失が可能となり、ＧＦＰの構成的発現をもたらすことになる。ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ ＲＢは、Ｏｃｔ４プロモーター配列により促進されるＧＦＰ導入遺伝子および構成的に発現するＲＥＤ蛍光導入遺伝子を含む。灰色の四角はＩＲＥＳ配列を示す。（Ｂ）緑色（ＧＦＰ）および赤色（ｄｓＲＥＤ）蛍光を示すＥＦ４−ＮＳ ＲＢ Ｏ４ＧｉＰハイブリッド。これらのマーカーはドナーＮＳ細胞ゲノムから発現される。（Ｃ）ＮａｎｏｇのＣｒｅ欠失後におけるＥＦ４−ＮＳ ＲＢ Ｏ４ＧｉＰ細胞。ＧＦＰ発現の増大に留意のこと。（Ｄ）図面は、ＥＦ４−ＮＳ ＲＢ Ｏ４ＧｉＰ ｃｒｅハイブリッドの胚様体（ＥＢ）の分化を示す。（Ｅ）分化（ｄｉｆｆ．）後３、５、７および８日目（ｄ）のＥＦ４−ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ ＲＢ ｃｒｅ ＥＢにおけるＴ−ｂｒａｃｈｙｕｒｙ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。未分化のハイブリッドおよび親／ドナー細胞系についても解析した。Ｇａｐｄｈを偏在的に発現される対照として用いた。（Ｆ）蒔かれたＥＢにおけるα−アクチニン（青色）に対する免疫蛍光。   FIG. 8 (Supplementary FIG. 2) shows that ES-NS hybrids show pluripotency after deletion of transgenic Nanog. (A) Schematic diagram of EF4 and neural stem (NS) O4GiP RB cells. EF4 cells contain a constitutively expressed Nanog transgene adjacent to the loxP site, which allows deletion of Nanog using cre recombinase, resulting in constitutive expression of GFP. NS O4GiP RB contains a GFP transgene driven by an Oct4 promoter sequence and a constitutively expressed RED fluorescent transgene. Gray squares indicate IRES sequences. (B) EF4-NS RB O4GiP hybrid showing green (GFP) and red (dsRED) fluorescence. These markers are expressed from the donor NS cell genome. (C) EF4-NS RB O4GiP cells after Nano deletion of Cre deletion. Note the increase in GFP expression. (D) Drawing shows EF4-NS RB O4GiP cre hybrid embryoid body (EB) differentiation. (E) RT-PCR analysis of T-brachyury expression in EF4-NS O4GiP RB cre EBs 3, 5, 7, and 8 days after differentiation (diff.). Undifferentiated hybrids and parent / donor cell lines were also analyzed. Gapdh was used as a ubiquitously expressed control. (F) Immunofluorescence for α-actinin (blue) in sprinkled EBs.

図９は、多能性ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの形成におけるＰＤ１８４３５２の効果の分析を示す。（Ａ〜Ｃ）ＲＨ×ＮＳ ＴＧＦＰ融合体の赤色および緑色蛍光におけるＦＡＣＳ分析。（Ａ）ＰＥＧ処理２４時間後における融合混合物；（Ｂ）Ａでゲート制御され、ＦＡＣＳにより選別されたハイブリッドの精製度度確認。（Ｃ）Ａで選別されたハイブリッドが蒔かれ、次いで形成されたコロニーが蒔かれたハイブリッド当たりのコロニーの百分率としてスコア化された。これらのスコアは、ＦＡＣＳにより選別された細胞の精製度を考慮に入れている。（Ｄ）データのまとめ。（Ｅ）ハイブリッドのコロニー形態の例。   FIG. 9 shows an analysis of the effect of PD184352 in the formation of pluripotent ES-NS hybrid colonies. (AC) FACS analysis in red and green fluorescence of RH × NS TGFP fusion. (A) Fusion mixture 24 hours after PEG treatment; (B) Purity confirmation of hybrid gated with A and selected by FACS. (C) Hybrids selected with A were sown and then the formed colonies were scored as the percentage of colonies per hybrid sown. These scores take into account the degree of purification of the cells sorted by FACS. (D) Summary of data. (E) Example of hybrid colony morphology.

実施例１
初期胚におけるＮａｎｏｇの発現は必要であり、進行性のＸの再活性化と相関する
Ｘ染色体の再活性化は、約４．５ｄｐｃの雌胚の胚盤葉上層においてインビボで生じることが知られる（Mak et al, 2004; Okamoto et al, 2004）。インビボにおけるＮａｎｏｇの再プログラム化への推定される関与を調べるため、４．５ｄｐｃのＮａｎｏｇ−／−雌胚をＥｅｄとＮａｎｏｇ両方に対する免疫蛍光により試験した。Ｅｅｄは着床前の胚における不活性なＸ染色体のマーカーである（Silva et al, 2003; Mak et al, 2004; Okamoto et al, 2004）。Ｎａｎｏｇ＋／−マウス間の交配から得られた２５個の胚のうち、６つがＮａｎｏｇ染色を欠失し、それらのうちの４つが雌であった。Ｎａｎｏｇ陰性胚は、胚の全ての核において、アポトーシス性で希少なＥｅｄで染色されない細胞を除き、単一の大きいＥｅｄの焦点が存在することを示した（図１Ａ）。Ｎａｎｏｇ陽性胚は、多数のＮａｎｏｇ陽性ＩＣＭ細胞を示した（図１Ｅ）。残りの胚とは対照に、これらの細胞の一部は、Ｘの再活性化に一致するＥｅｄの焦点を全く示さなかった（図１Ｃ、Ｅ）。一般に、Ｎａｎｏｇ−／−胚はより小さい。これが発生の遅延によるものであるかを調べるため、休眠中の６．５ｄｐｃ胚を分析した（図１Ｂ）。試験した３１個の胚のうち、８個がＮａｎｏｇ染色を欠失し、それらのうちの３個が雌であった。４．５ｄｐｃの胚と同様、これらもまた全細胞でＥｅｄ焦点の存在を示した。対照的に、雌のＮａｎｏｇ陽性胚はＮａｎｏｇ陽性のほぼ全ての細胞に対してＥｅｄの焦点を示さなかった（図１Ｄ〜Ｆ）。 Example 1
Nanog expression in early embryos is required and correlates with progressive X reactivation. X-chromosome reactivation is known to occur in vivo in the upper blastoderm of female embryos of approximately 4.5 dpc (Mak et al, 2004; Okamoto et al, 2004). To examine the possible involvement of Nanog in reprogramming in vivo, 4.5 dpc Nanog − / − female embryos were tested by immunofluorescence against both Eed and Nanog. Eed is an inactive X chromosome marker in preimplantation embryos (Silva et al, 2003; Mak et al, 2004; Okamoto et al, 2004). Of the 25 embryos obtained from mating between Nanog +/− mice, 6 lacked Nanog staining and 4 of them were female. Nanog-negative embryos showed that there was a single large Eed focus in all nuclei of the embryo, except for apoptotic and rare Eed stained cells (FIG. 1A). Nanog positive embryos showed a large number of Nanog positive ICM cells (FIG. 1E). In contrast to the rest of the embryos, some of these cells did not show any Eed focus consistent with X reactivation (FIGS. 1C, E). In general, Nanog − / − embryos are smaller. To examine whether this was due to developmental delay, dormant 6.5 dpc embryos were analyzed (FIG. 1B). Of the 31 embryos tested, 8 lacked Nanog staining and 3 of them were female. Like the 4.5 dpc embryos, these also showed the presence of Eed foci in all cells. In contrast, female Nanog positive embryos showed no Eed focus on almost all Nanog positive cells (FIGS. 1D-F).

結論として、このデータがＮａｎｏｇ−／−雌胚がサイレントなＸ染色体を再活性化できないことを示したことから、エピジェネティックな再プログラム化におけるＮａｎｏｇの役割が示唆される。   In conclusion, this data showed that Nanog − / − female embryos were unable to reactivate the silent X chromosome, suggesting a role for Nanog in epigenetic reprogramming.

実施例２
Ｎａｎｏｇを過剰発現するＥＳ細胞は、ＥＳ様ＥＳ−分化細胞のハイブリッドコロニーを形成する高い能力を有する
Ｎａｎｏｇが再プログラム化に関与するか否かを検討するために、ＥＳ細胞と他のＥＳ、ＮＳ、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）および胸腺細胞（Ｔ）との細胞融合を用い、ＷＴおよびＮａｎｏｇにより操作された細胞のＥＳ様ＥＳ−分化細胞のハイブリッドコロニーを産生する能力を調べた。多能性ハイブリッドは、これまで、３つの異なる細胞融合の方法、すなわち電気融合、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在の細胞融合および共培養による自然な細胞融合を用いて生成されている（Matveeva et al, 1998; Terada et al, 2002; Ying et al, 2002）。ここでは、ＰＥＧにより誘導される融合を用いて細胞ハイブリッドを形成させた。初めに、赤色蛍光およびハイグロマイシン耐性遺伝子を構成的に発現するＲＨ ＥＳ細胞、ならびにＮａｎｏｇを過剰発現するＲＨ ＥＳ細胞誘導体、ＲＨＮを用いた。これらを、ＧＦＰおよびピューロマイシン耐性（Ｏ４ＧｉＰ）（Ying et al, 2002）を駆動するマウスＯｃｔ４遺伝子（Yeom et al, 1996）の調節配列を有する導入遺伝子を運ぶＥＳおよびＮＳ細胞の両方と融合させた。この導入遺伝子は多能性細胞で排他的に発現され、それによりＮＳ細胞ゲノムがＥＳ−ＮＳ細胞融合後に再プログラム化する場合に限り再活性化される。ＮＳ細胞を１４．５ｄｐｃの胎児前脳から得た。異なる融合ペア間で比較できる結果を生じさせるため、融合手順は同じパラメータを用いて同時に行うこととした。ＥＳ細胞と他のＥＳまたはＮＳ細胞との融合の結果として、薬剤耐性の赤色および緑色の蛍光コロニーが培養プレート上に見られた。これらは、核の拡大以外にはほとんどＥＳの形態を示した。Ｎａｎｏｇの過剰発現とは無関係に、ＥＳ細胞間の融合では、多数のハイブリッドコロニーを含むプレートを生じた（図２Ａ）。対照的に、ＥＳ×ＮＳの細胞融合は異なる結果を示した。ＲＨＮ×ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ融合体は、ＲＨ×ＮＳのＯ４ＧｉＰ融合体と比べて約２００倍異なる、有意により多数のコロニーを示した（図２Ｂ）。 Example 2
ES cells overexpressing Nanog have a high ability to form hybrid colonies of ES-like ES-differentiated cells. To investigate whether Nanog is involved in reprogramming, ES cells and other ES, NS Using cell fusion with mouse embryonic fibroblasts (MEF) and thymocytes (T), the ability to produce hybrid colonies of ES-like ES-differentiated cells of cells engineered by WT and Nanog was examined. Pluripotent hybrids have so far been generated using three different cell fusion methods: electrofusion, polyethylene glycol (PEG) mediated cell fusion and natural cell fusion by co-culture (Matveeva et al, 1998; Terada et al, 2002; Ying et al, 2002). Here, cell hybrids were formed using fusion induced by PEG. Initially, RH ES cells that constitutively express red fluorescent and hygromycin resistance genes, and an RH ES cell derivative, RHN, that overexpresses Nanog were used. These were fused with both ES and NS cells carrying transgenes with regulatory sequences of the mouse Oct4 gene (Yeom et al, 1996) driving GFP and puromycin resistance (O4GiP) (Ying et al, 2002). . This transgene is expressed exclusively in pluripotent cells and is thus reactivated only if the NS cell genome is reprogrammed after ES-NS cell fusion. NS cells were obtained from 14.5 dpc fetal forebrain. In order to produce comparable results between different fusion pairs, the fusion procedure was performed simultaneously using the same parameters. As a result of the fusion of ES cells with other ES or NS cells, drug-resistant red and green fluorescent colonies were seen on the culture plate. These showed almost ES morphology other than nuclear enlargement. Regardless of Nanog overexpression, fusion between ES cells resulted in plates containing multiple hybrid colonies (FIG. 2A). In contrast, ES × NS cell fusion showed different results. The RHN × NS O4GiP fusion showed a significantly larger number of colonies that differed approximately 200-fold compared to the RH × NS O4GiP fusion (FIG. 2B).

Ｎａｎｏｇを過剰発現するＥＳ細胞におけるＥＳ−ＮＳ細胞のハイブリッドコロニーを形成する能力の向上を確認するために、ｌｏｘＰに隣接された（ｆｌｏｘｅｄ）Ｎａｎｏｇ ＥＳ細胞（ＥＦ４）およびｃｒｅ欠失の誘導物であるＥＦ４ ｃｒｅ３を用いて実験を行った（Chambers et al, 2003）。これらを、構成性のハイグロマイシン薬剤耐性を与える第２の導入遺伝子ＣＡＧ−ｅｇｆｐ−Ｉｒｅｓ−Ｈｙｇｒｏ（ＧＦＰＩＨ）を運ぶＮＳ Ｏ４ＧｉＰ誘導細胞と融合させた。ＥＦ４細胞系統は、以前に、ＬｉＦの非存在下で自己再生することが示されたものであり、ＥＦ４ ｃｒｅ３細胞系統は胚盤胞注入後にキメラを生成することができる（Chambers et al, 2003）。上記の結果と一致し、ＥＦ４×ＮＳ細胞融合が多数の薬剤耐性コロニーを生成する一方、ＥＦ４ ｃｒｅ３×ＮＳ細胞融合は薬剤耐性コロニーを生成しなかった（図２Ｃ）。   In order to confirm the improved ability of ES-NS cells to form hybrid colonies in ES cells overexpressing Nanog, it is an inducer of floxed Nanog ES cells (EF4) and cre deletions Experiments were performed using EF4 cre3 (Chambers et al, 2003). These were fused with NS O4GiP-derived cells carrying a second transgene CAG-egfp-Ires-Hygro (GFPIH) conferring constitutive hygromycin drug resistance. The EF4 cell line was previously shown to self-renew in the absence of LiF, and the EF4 cre3 cell line can generate chimeras after blastocyst injection (Chambers et al, 2003). . Consistent with the above results, EF4 × NS cell fusion generated a large number of drug resistant colonies, whereas EF4 cre3 × NS cell fusion did not generate drug resistant colonies (FIG. 2C).

この現象をさらに特徴付けるため、融合タンパク質ＴＡＵＧＦＰおよびピューロマイシン耐性遺伝子を構成的に発現する樹立されたＮＳ細胞系統ＴＧＦＰを用いた（Pratt et al, 2000）。これらの細胞をＲＨおよびＲＨＮ ＥＳ細胞の両方に融合させた。さらに再度、ＲＨＮ×ＮＳ ＴＧＦＰ融合が多数のハイブリッドコロニーを生じる一方、ＲＨ×ＮＳ ＴＧＦＰ融合が１つのハイブリッドのみを生成するという対照的な結果を得た（図２Ｄ）。この現象は、ＥＳ×ＮＳ（ＥＳおよび誘導された成体）融合、および程度がより少ないがＥＳ×ＴおよびＥＳ×ＭＥＦ融合においても観察された（図２Ｅ、Ｆ）。   To further characterize this phenomenon, the established NS cell line TGFP constitutively expressing the fusion protein TAUGFP and the puromycin resistance gene was used (Pratt et al, 2000). These cells were fused to both RH and RHN ES cells. Again, contrasting results were obtained, where the RHN × NS TGFP fusion yielded a large number of hybrid colonies, while the RH × NS TGFP fusion produced only one hybrid (FIG. 2D). This phenomenon was also observed in ES × NS (ES and induced adult) fusions, and to a lesser extent ES × T and ES × MEF fusions (FIGS. 2E, F).

この相関をより詳細に試験するため、細胞系統間におけるＮａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のレベルを比較した（図２Ｇ）。高レベルのＮａｎｏｇがＲＨＮおよびＥＦ４ ＥＳ細胞の両方で検出される一方、残りのＥＳ細胞系統において類似のより低いレベルのＮａｎｏｇを見出した。ＥＦ４およびＥＦ４ ｃｒｅ３細胞系統では、Ｎａｎｏｇレベルの差異が５倍であると判定されている（Yates and Chambers, 2005）。多能性マーカーＯｃｔ４およびＳｏｘ２のレベルは、用いられた全ＥＳ細胞系統中で相違しなかった。予想通り、ＮＳ細胞はＳｏｘ２の発現を示した。   To test this correlation in more detail, the levels of Nanog, Oct4 and Sox2 between cell lines were compared (FIG. 2G). While high levels of Nanog were detected in both RHN and EF4 ES cells, similar lower levels of Nanog were found in the remaining ES cell lines. In EF4 and EF4 cre3 cell lines, the difference in Nanog levels has been determined to be 5-fold (Yates and Chambers, 2005). The levels of pluripotency markers Oct4 and Sox2 were not different in all ES cell lines used. As expected, NS cells showed Sox2 expression.

同時に、これらの結果は、ＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇの過剰発現がＥＳ−ＥＳハイブリッドコロニーではなくＥＳ−ＮＳを形成する能力を有意に高めることを示し、これは再プログラム化におけるＮａｎｏｇの役割を示唆する。   At the same time, these results indicate that Nanog overexpression in ES cells significantly increases the ability to form ES-NS but not ES-ES hybrid colonies, suggesting a role for Nanog in reprogramming.

実施例３
ＰＥＧは、ＲＨｎａｎｏｇ ＥＳ細胞と比較してＲＨにおける細胞死または分化の促進を誘導しない
ＲＨ対ＲＨＮ ＥＳ細胞におけるＰＥＧ処理に対する異なる効果の可能性を評価するため、細胞の生存および分化についての解析を進めた。細胞の生存を、ＰＥＧ処理２４時間後に、１００ｍｍプレートに接着したＥＳ細胞の数としてスコア化した。翌日、蒔かれた１０６個のＰＥＧ処理済みＲＨおよびＲＨＮ ＥＳ細胞から各々、６．６×１０５個および５．３×１０５個の細胞をカウントした（図３Ａ）。ＰＥＧ処理済みのＥＳ細胞における分化誘導能の可能性およびＥＳ細胞コロニーを増殖させ、形成する能力の変化を検証するため、ＰＥＧで処理されたＲＨとＲＨＮ ＥＳ細胞および未処理のＲＨおよびＲＨＮ ＥＳ細胞の単一細胞のＦＡＣＳ選別を行った。ＦＡＣＳ選別から約１２日後に、未分化ＥＳ細胞状態の同定のため、ウェルをアルカリホスファターゼで染色した。蒔かれた未処理のＲＨおよびＲＨＮ ＥＳ細胞の大部分が未分化のコロニーを形成する一方（図３Ｂ、Ｃ）、ＰＥＧで処理された細胞はコロニー総数の減少を示した。ＲＨコロニーはほぼ５０％まで減少したが、ＲＨＮコロニー形成への影響は非常に少なかった。分化の促進は観察されず、ＲＨコロニーの３９個のうちの４個のみおよびＲＨＮコロニーの７３個のうちの１個のみがＡＰ陰性であった。 Example 3
PEG does not induce the promotion of cell death or differentiation in RH compared to RHnanog ES cells. To evaluate the potential for different effects on PEG treatment in RH vs. RHN ES cells, we are proceeding with analysis of cell survival and differentiation. It was. Cell survival was scored as the number of ES cells attached to 100 mm plates 24 hours after PEG treatment. The next day, 6.6 × 10 5 and 5.3 × 10 5 cells were counted from 10 6 PEG-treated RH and RHN ES cells, respectively, (FIG. 3A). PEG-treated RH and RHN ES cells and untreated RH and RHN ES cells to verify the potential for differentiation induction in PEG-treated ES cells and changes in the ability to grow and form ES cell colonies FACS sorting of single cells was performed. Approximately 12 days after FACS sorting, wells were stained with alkaline phosphatase for identification of undifferentiated ES cell status. While most of the seeded untreated RH and RHN ES cells formed undifferentiated colonies (FIG. 3B, C), cells treated with PEG showed a decrease in the total number of colonies. Although RH colonies were reduced to almost 50%, the impact on RHN colony formation was very small. No promotion of differentiation was observed and only 4 out of 39 RH colonies and 1 out of 73 RHN colonies were AP negative.

このデータ全体から、ＰＥＧは、ＲＨおよびＲＨＮ ＥＳ細胞の両方で細胞死をある程度誘導するが、細胞の分化は誘導しないことが示唆される。ＲＨＮ細胞は、ＦＡＣＳおよびＰＥＧ処理後にさらに２倍のクローン形成能を有するが、このことはハイブリッドで測定された２００倍の増加を説明するには十分ではないことが示された。   Overall, this data suggests that PEG induces cell death to some extent in both RH and RHN ES cells, but not cell differentiation. RHN cells have an additional 2-fold clonal capacity after FACS and PEG treatment, but this has not been shown to be sufficient to explain the 200-fold increase measured in the hybrid.

実施例４
ハイブリッド細胞は染色体を分離し、有意な頻度で染色体を二倍体に戻す
ＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドを特徴付けるために、染色体含有量およびＮＳ細胞エピゲノムの同一性に着目した。前者を解析するため、ＲＨ×ＮＳ Ｏｃｔ４ＧｉＰ、ＲＨｎａｎｏｇ×ＮＳ Ｏｃｔ４ＧｉＰ、ＲＨ×ＮＳ ＴＧＦＰおよびＲＨｎａｎｏｇ×ＮＳ ＴＧＦＰの間の融合から生じた１２個の独立したＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドクローンに着目した。５回継代した後、クローンはスコア化された***中期の大部分で８０個の染色体を示した（補図１）。 Example 4
Hybrid cells segregated chromosomes and returned chromosomes to diploid with significant frequency. To characterize ES-NS cell hybrids, attention was focused on chromosome content and NS cell epigenome identity. To analyze the former, we focused on 12 independent ES-NS cell hybrid clones that resulted from the fusion between RH × NS Oct4GiP, RHnanog × NS Oct4GiP, RH × NS TGFP and RHnanog × NS TGFP. After 5 passages, the clones showed 80 chromosomes in the majority of metaphases scored (Supplementary Figure 1).

ＮＳ細胞ゲノムに対して排他的に選択された６個のＥＳ−ＮＳクローンの解析では、継代数とともに増加する二倍体集団の存在が示された。これはおそらく、四倍体細胞に対する二倍体細胞の増殖の利点によるものである。これらのクローンのうちの２つを継代１２回目で解析し、各々３０％および５０％の二倍体（４０個の染色体）含有量を示した。さらに、細胞集団は２つの別々の集団、すなわち、約４０個の染色体を有する集団とそれとは別に８０個の染色体を有する集団からなり、それらは染色体の分離が単一の事象で生じたことを示唆する。これらの新たに再プログラム化された二倍体ハイブリッドにおけるＮＳ細胞ゲノムの割合を評価するには、さらなる解析が必要とされる。しかしながら、データは、二倍体の未分化ＥＳ細胞が、細胞融合により分化細胞から取得できることを意味する。   Analysis of six ES-NS clones selected exclusively against the NS cell genome showed the presence of a diploid population that increased with passage number. This is probably due to the advantage of diploid cell growth over tetraploid cells. Two of these clones were analyzed at passage 12 and showed 30% and 50% diploid (40 chromosomes) content, respectively. In addition, the cell population consists of two separate populations: a population with about 40 chromosomes and another population with 80 chromosomes, which indicate that the segregation of chromosomes occurred in a single event. Suggest. Further analysis is required to assess the percentage of NS cell genome in these newly reprogrammed diploid hybrids. However, the data means that diploid undifferentiated ES cells can be obtained from differentiated cells by cell fusion.

実施例５
ＮＳゲノムはＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドにおけるＥＳ細胞の同一性を獲得する
ＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドにおけるＮＳ細胞エピゲノムの同一性を評価するため、不活性Ｘ染色体の状態、ならびにＯｃｔ４および神経幹細胞遺伝子ＢｌｂｐとＯｌｉｇ２の対立遺伝子の発現を観察した。ＸＸ多能性細胞とは対照的に、ＸＸ分化細胞は１つの不活性Ｘ染色体を有する。様々な細胞学的なマーカーの中で、不活性Ｘ染色体はＸｉｓｔ ＲＮＡに関連して見出され、トリメチルＨ３−Ｋ２７およびユビキチルＨ２Ａを豊富に含む（Brown et al, 1992; Napoles et al, 2004; Silva et al, 2003）。共焦点解析は、ＮＳ細胞の分化状態とともに、ＸｉｓｔＲＮＡ、トリメチルＨ３−Ｋ２７およびモノ−ユビキチルＨ２Ａのうちの１つの単一の核小体を明らかにした（図４Ａ〜Ｃ）。さらに、不活性Ｘは、Ｈ３−Ｋ９に対して低アセチル化され、Ｈ３−Ｋ４に対して低メチル化され、ヒストン変異体ｍａｃｒｏＨ２Ａが豊富に含まれることが見出された（データは示さず）。したがって、再プログラム化がＸＸＸＹ ＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドで生じる場合、不活性Ｘはサイレンシングマーカーを喪失する。このことは、Ｘｉｓｔ ＲＮＡの核小体が喪失し、代わりに、ＥＳ細胞の特徴を有し、Ｘｉｓｔの初期転写産物に対応する、３つの明確なＸｉｓｔシグナルが検出されたこととともに観察された（図４Ｃ）。さらに、ＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドのクロマチン状態の免疫蛍光分析は、トリメチルＨ３−Ｋ２７およびモノ−ユビキチン化Ｈ２Ａ核小体の喪失を示した（図４Ａ、Ｂ）。ＸＸＸＹ ＥＳ−ＮＳハイブリッドにおけるＯｃｔ４発現に対するＲＮＡ ＦＩＳＨ解析は、１つの細胞核当たり３もしくは４つの明確なシグナルの存在を明らかにし、ＮＳ細胞由来のＯｃｔ４対立遺伝子の再活性化を示した（図４Ｄ）。ＸＸＸＹ ＥＳ−ＮＳハイブリッドのさらなる特徴付けは、ＮＳ細胞で発現され、ＥＳ細胞でサイレンシングされる遺伝子、Ｏｌｉｇ２およびＢｌｂｐの発現解析を包含した（Conti et al, 2005）。ＲＴ−ＰＣＲ解析によると、上記の結果に一致し、ＥＳ−ＮＳハイブリッド細胞でＢｌｂｐおよびＯｌｉｇ２の両方のスイッチがオフにされることが示された（図４Ｅ）。 Example 5
NS Genome Acquires ES Cell Identity in ES-NS Cell Hybrids To assess the identity of NS cell epigenomes in ES-NS cell hybrids, the status of the inactive X chromosome, and the Oct4 and neural stem cell genes Blbp and Olig2 The expression of alleles was observed. In contrast to XX pluripotent cells, XX differentiated cells have one inactive X chromosome. Among various cytological markers, the inactive X chromosome is found in association with Xist RNA and is rich in trimethyl H3-K27 and ubiquityl H2A (Brown et al, 1992; Napoles et al, 2004; Silva et al, 2003). Confocal analysis revealed a single nucleolus of XistRNA, trimethyl H3-K27 and mono-ubiquityl H2A along with the differentiation status of NS cells (FIGS. 4A-C). Furthermore, inactive X was found to be hypoacetylated to H3-K9, hypomethylated to H3-K4, and rich in the histone variant macroH2A (data not shown) . Thus, when reprogramming occurs in the XXXY ES-NS cell hybrid, inactive X loses the silencing marker. This was observed along with the loss of Xist RNA nucleolus, and instead of detection of three distinct Xist signals that had ES cell characteristics and corresponded to the initial transcript of Xist ( FIG. 4C). Furthermore, immunofluorescence analysis of the chromatin state of ES-NS cell hybrids showed loss of trimethyl H3-K27 and mono-ubiquitinated H2A nucleolus (FIGS. 4A, B). RNA FISH analysis for Oct4 expression in the XXXY ES-NS hybrid revealed the presence of 3 or 4 distinct signals per cell nucleus, indicating reactivation of the Oct4 allele from NS cells (FIG. 4D). Further characterization of XXXY ES-NS hybrids included expression analysis of genes expressed in NS cells and silenced in ES cells, Olig2 and Blbp (Conti et al, 2005). RT-PCR analysis, consistent with the above results, showed that both Blbp and Olig2 were turned off in ES-NS hybrid cells (FIG. 4E).

多能性能を調べるために、Ｎａｎｏｇを過剰発現するＥＳおよびＮＳ細胞間の融合によるハイブリッドが胚様体の形成によって分化可能となり、中胚葉マーカーＴ−ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現について分析した（補図２）。Ｎａｎｏｇの過剰発現が分化を阻害することを考慮に入れて（Chambers et al, 2003）、ＥＦ４−ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ ＲＢハイブリッドを用いた。上記のように、ＥＦ４細胞がｃｒｅ組換え酵素の作用によりその欠失を可能にするｌｏｘＰに隣接されたＮａｎｏｇの導入遺伝子を有する一方、ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ ＲＢは赤色蛍光タンパク質およびブラスチシジン耐性遺伝子を構成的に発現する（補図２Ａ）。それゆえ、ＥＦ４−ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ ＲＢハイブリッドはＮＳ由来の赤色および緑色蛍光を示した（補図２Ｂ）。ｃｒｅ組換え酵素による処理後、ハイブリッドが緑色蛍光の増大を示すと同時に、Ｎａｎｏｇの過剰発現の喪失が観察された（補図２Ｃ）。次いで、これらのＥＦ４−ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ ＲＢ ｃｒｅハイブリッドは、Ｌｉｆの除去および胚体（ＥＢ）の形成により分化が可能となり、Ｔ−ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現について解析された（補図２Ｄ、Ｅ）。予想通り、Ｔ−ｂｒａｃｈｙｕｒｙはドナー細胞または未分化ハイブリッドで検出されなかった。しかし、多能性能を有することから、分化したハイブリッドで発現された。ＥＢの場合にも１ウェル当たり１〜３個蒔き、接着する細胞の存在について解析した。ウェルの約７０％（２４／３５）は拍動する（ｂｅａｔｉｎｇ）細胞を示し、それらを骨格および心筋細胞の特異的なマーカーであるα−アクチニンに対して陽性に染色された（補図２Ｆ）。   In order to examine pluripotency, hybrids by fusion between ES and NS cells overexpressing Nanog were differentiated by formation of embryoid bodies and analyzed for the expression of the mesoderm marker T-brachyury (Supplementary Figure 2). Taking into account that Nanog overexpression inhibits differentiation (Chambers et al, 2003), EF4-NS O4GiP RB hybrids were used. As described above, EF4 cells have a Nanog transgene flanked by loxP that allows its deletion by the action of cre recombinase, while NS O4GiP RB constitutively displays red fluorescent protein and blasticidin resistance gene It is expressed (Supplementary figure 2A). Therefore, the EF4-NS O4GiP RB hybrid showed NS-derived red and green fluorescence (Supplementary Fig. 2B). After treatment with cre recombinase, the hybrid showed an increase in green fluorescence, while a loss of Nanog overexpression was observed (Supplement Figure 2C). These EF4-NS O4GiP RB cre hybrids were then able to differentiate by removal of the Lif and formation of embryonic bodies (EB) and analyzed for T-brachyury expression (Supplementary Figures 2D, E). As expected, T-brachyury was not detected in donor cells or undifferentiated hybrids. However, because of its pluripotent performance, it was expressed in differentiated hybrids. Also in the case of EB, 1 to 3 cells per well were analyzed and analyzed for the presence of adherent cells. Approximately 70% (24/35) of the wells showed beating cells that stained positive for α-actinin, a specific marker of skeletal and cardiomyocytes (Supplementary Figure 2F) .

まとめると、データは、全ての解析されたマーカーにおいてＮＳゲノムがＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドでＥＳ細胞の同一性を獲得することを示す。さらに、ハイブリッドは多能性能を維持した。   Taken together, the data show that the NS genome acquires ES cell identity with ES-NS cell hybrids in all analyzed markers. In addition, the hybrid maintained pluripotent performance.

実施例６
ＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇの過剰発現は、細胞融合後のＮＳ細胞の再プログラム化に必要とされる唯一の因子である
Ｎａｎｏｇを過剰発現するＥＳ細胞は、ＷＴ ＥＳ細胞よりより高い融合性を有しうる可能性がある。この点を対処するため、融合２４時間後のＲＨ×ＮＳ ＴＧＦＰおよびＲＨＮ×ＮＳ ＴＧＦＰの細胞集団を、一次ハイブリッドである赤色および緑色蛍光両方を示す細胞の存在について、ＦＡＣＳにより解析した。予想通り、二重の陽性細胞の数は比較的少なかった。ＲＨ×ＮＳ ＴＧＦＰおよびＲＨＮ×ＮＳ ＴＧＦＰでは、二重の陽性細胞が各々、０．１７％および０．１％であることが示された（図５Ｂ）。加えて、ＦＡＣＳにより選別された一次ハイブリッドのコロニーを形成する能力を試験した。融合２４時間後、ハイブリッドを赤色および緑色蛍光の両方について選別した。この段階において、再プログラム化が進行中でありうるが、Ｏｃｔ４調節配列により駆動されるＧＦＰ発現が細胞融合約４８時間後に最初に検出されることが以前に示されたことから、完全ではない（Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ， ２００１； Ｄｏ ａｎｄ Ｓｃｈｏｌｅｒ， ２００４）。そして、この段階での一次ハイブリッドは、細胞周期の調整などの検討事項に加え、エピゲノムの差異を克服してＥＳ様コロニーを生成しなければならない。ＦＡＣＳ選別の３日後、蒔かれた一次ハイブリッドをハイグロマイシンおよびピューロマイシンの両方で選別した。２つの独立した実験から得られた結果は、ＲＨ×ＮＳ ＴＧＦＰ融合体から選別された一次ハイブリッドがハイブリッドコロニーを生成しないことを示した（図５Ｄ、Ｅ）。対照的に、ＦＡＣＳで選別された２０００個および７００個の細胞のうちの各々３４個および１１個のハイブリッドコロニーをＲＨＮ×ＮＳ ＴＧＦＰ融合から得た（図５Ｄ、Ｅ）。 Example 6
Nanog overexpression in ES cells is the only factor required for reprogramming of NS cells after cell fusion ES cells overexpressing Nanog may have higher fusogenicity than WT ES cells there is a possibility. To address this point, RH × NS TGFP and RHN × NS TGFP cell populations 24 hours after fusion were analyzed by FACS for the presence of cells that exhibit both red and green fluorescence as primary hybrids. As expected, the number of double positive cells was relatively small. RH × NS TGFP and RHN × NS TGFP showed double positive cells of 0.17% and 0.1%, respectively (FIG. 5B). In addition, the ability to form colonies of primary hybrids selected by FACS was tested. 24 hours after fusion, hybrids were screened for both red and green fluorescence. At this stage, reprogramming may be ongoing, but is not complete since it has previously been shown that GFP expression driven by Oct4 regulatory sequences is first detected approximately 48 hours after cell fusion ( Tada et al, 2001; Do and Scholler, 2004). The primary hybrid at this stage must overcome the epigenetic differences and generate ES-like colonies in addition to considerations such as cell cycle adjustment. Three days after FACS sorting, the sowed primary hybrids were selected with both hygromycin and puromycin. The results obtained from two independent experiments showed that the primary hybrid selected from the RHxNS TGFP fusion did not produce hybrid colonies (Figure 5D, E). In contrast, 34 and 11 hybrid colonies each of 2000 and 700 cells sorted by FACS were obtained from the RHNxNS TGFP fusion (Figure 5D, E).

これらの結果は、再プログラム化におけるＮａｎｏｇ過剰発現に関する課題を提起した。これに取り組むため、形成されたＲＨＮ−ＮＳ ＴＧＦＰコロニーの数をＲＨＮ−ＥＳ Ｏ４ＧｉＰの数と比較し、後者は、蒔かれたハイブリッド当たりのコロニー形成に対する所定の単位であるとした。ＦＡＣＳで選別された真の二重陽性細胞の総数当たりのハイブリッドコロニーの割合を考慮すると、ＲＨＮ−ＮＳ ＴＧＦＰおよびＲＨＮ−ＥＳ Ｏ４ＧｉＰの一次ハイブリッドは、ＥＳ様コロニーを生成する同一の能力を有するようである（図５Ｄ、Ｅ）。   These results posed challenges for Nanog overexpression in reprogramming. To address this, the number of RHN-NS TGFP colonies formed was compared to the number of RHN-ES O4GiP, the latter being the predetermined unit for colony formation per sown hybrid. Considering the percentage of hybrid colonies per total number of true double positive cells sorted by FACS, the primary hybrids of RHN-NS TGFP and RHN-ES O4GiP appear to have the same ability to generate ES-like colonies. Yes (Fig. 5D, E).

要するに、ＥＳ−ＮＳハイブリッドのＦＡＣＳ選別および分析は、Ｎａｎｏｇの過剰発現が細胞融合を増進させないことを示すが、ＥＳ様ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの作成を促進させることを確認した。そのことはまた、ＮａｎｏｇがＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの作成におけるエピジェネティックな差異の克服に必要とされる唯一の制限因子でありうることを示す。   In summary, FACS sorting and analysis of ES-NS hybrids showed that Nanog overexpression does not enhance cell fusion, but confirmed that it facilitates the generation of ES-like ES-NS hybrid colonies. That also indicates that Nanog may be the only limiting factor needed to overcome epigenetic differences in the creation of ES-NS hybrid colonies.

実施例７
再プログラム化におけるドナー細胞としての神経細胞
体細胞核移植（ＳＣＮＴ）では、用いられたドナー細胞のタイプがＥＳ細胞の胚盤胞からの誘導効率に影響することが示された（Hoechedlinger and Jaenisch 2002; Blelloch et al, 2004; Eggan et al, 2004; Inoue et al, 2005）。これらの研究において、ＥＳ細胞が最良の結果をもたらすことが示されており、ドナー細胞の分化状態が重要な因子であることが示唆される。ＮＳ細胞は多能性の体性幹細胞であり（Conti et al, 2005）、それゆえに多少可塑性のエピゲノムを含む。本発明者らの実験では、ＲＨＮ−ＮＳの一次ハイブリッドは、ＲＨＮ−ＥＳの一次ハイブリッドと同じ効率でＥＳ様ハイブリッドコロニーを生成することが示された。これがＮＳエピゲノムの特性によるものか、またはＮａｎｏｇの過剰発現のみによるものかという点に対処するため、ＥＳ様コロニーを生成するＭＥＦおよび胸腺細胞（Ｔ）の一次ハイブリッドの能力を解析した。ＭＥＦおよびＴ細胞をＲＨおよびＲＨＮ ＥＳ細胞に融合させた。一次ハイブリッドは、ＲＨ−ＮＳ、ＲＨ−ＭＥＦおよびＲＨ−Ｔの場合と同様、ＥＳ様コロニーを生成できなかった（データは示さず）。ＲＨＮ−ＭＥＦおよびＲＨＮ−Ｔの一次ハイブリッドは、ＥＳ様コロニーを生成できたが、ＲＨＮ−ＥＳおよびＲＨＮ−ＮＳの一次ハイブリッドの場合よりも極めて低い効率（各々、０．０８％および０．３３％）であった（図５Ａ〜Ｅ）。 Example 7
Neurons as donor cells in reprogramming Somatic cell nuclear transfer (SCNT) showed that the type of donor cells used affected the induction efficiency of ES cells from blastocysts (Hoechedlinger and Jaenisch 2002; Blelloch et al, 2004; Eggan et al, 2004; Inoue et al, 2005). In these studies, ES cells have been shown to give the best results, suggesting that the differentiation state of donor cells is an important factor. NS cells are pluripotent somatic stem cells (Conti et al, 2005) and therefore contain a somewhat plastic epigenome. Our experiments have shown that RHN-NS primary hybrids produce ES-like hybrid colonies with the same efficiency as RHN-ES primary hybrids. To address whether this was due to NS epigenetic characteristics or only Nanog overexpression, the ability of MEF and thymocyte (T) primary hybrids to generate ES-like colonies was analyzed. MEF and T cells were fused to RH and RHN ES cells. The primary hybrid failed to generate ES-like colonies as in RH-NS, RH-MEF and RH-T (data not shown). The RHN-MEF and RHN-T primary hybrids were able to generate ES-like colonies, but at a much lower efficiency than the RHN-ES and RHN-NS primary hybrids (0.08% and 0.33%, respectively). (FIGS. 5A to 5E).

これらのデータは、ＮＳ細胞エピゲノムがＮａｎｏｇを過剰発現するＥＳ細胞への融合によってその分化した対応物よりも再プログラム化に対してより感受性が高いであろうことを示す。   These data indicate that the NS cell epigenome will be more sensitive to reprogramming than its differentiated counterpart by fusion to an ES cell that overexpresses Nanog.

実施例８（比較）
ＮＳ細胞におけるＮａｎｏｇの発現は再プログラム化には十分でない
Ｎａｎｏｇの発現がＮＳゲノムをＥＳ細胞のゲノムに再プログラム化するのに十分であるか否かを検討するため、ＮＳ細胞にＮａｎｏｇをトランスフェクトした（ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ ＮＰ）。これらの細胞はＮａｎｏｇを安定的に発現し、タンパク質レベルはＥＳ細胞で見出されるレベルと同様である（図６Ｄ）。さらに、細胞は正常に増殖し、ＮＳ細胞マーカーＢｌｂｐおよびＯｌｉｇ２の発現を示した（図６Ｅ）。しかしながら、内在性のＯｃｔ４またはＯｃｔ４調節配列から駆動されるＧＦＰの発現は存在しなかった。標準的なＧＭＥＭまたはＮ２Ｂ２７ ＥＳ培地中に蒔かれる場合、先行文献にあるようにアストロサイト型細胞に分化した（Conti et al, 2005）。２つの強力なエピジェネティックな脱安定剤（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）であるトリコスタチンＡおよび５−アザシチジンを用いる追加の実験においても、Ｎａｎｏｇを発現するＮＳ細胞を再プログラム化することができなかった（データは示さず）。 Example 8 (comparison)
Nanog expression in NS cells is not sufficient for reprogramming To examine whether Nanog expression is sufficient to reprogram NS genome into ES cell genome, NS cells were transfected with Nanog (NS O4GiP NP). These cells stably express Nanog and protein levels are similar to those found in ES cells (FIG. 6D). Furthermore, the cells grew normally and showed expression of NS cell markers Blbp and Olig2 (FIG. 6E). However, there was no expression of GFP driven from endogenous Oct4 or Oct4 regulatory sequences. When seeded in standard GMEM or N2B27 ES media, they differentiated into astrocyte-type cells as in the prior literature (Conti et al, 2005). In additional experiments with trichostatin A and 5-azacytidine, two potent epigenetic destabilizers, NS cells expressing Nanog could not be reprogrammed (data shown) )

これらの結果は、まとめると、ＥＳ細胞内容物の外側では、Ｎａｎｏｇ発現は再プログラム化を誘導するのに十分でないことを示唆している。   These results collectively suggest that outside the ES cell contents, Nanog expression is not sufficient to induce reprogramming.

実施例９
ＮａｎｏｇはＥＳ様ＥＳ−ＮＳ細胞のハイブリッドコロニーの作成に必要である
Ｎａｎｏｇヌルの単離ＩＣＭおよびＥＳ細胞の両培養物は、未分化状態を維持できなかった（Mitsui et al, 2003）。これらの結果は、多能性状態の維持におけるＮａｎｏｇの役割を示すものとして解釈された。しかし、条件付き欠失方法を用いることにより、多能性マーカーを発現するＮａｎｏｇ−／−−ＥＳ様細胞（ＲＣ−／−）を誘導し、それは連続的に継代され、多能性能を維持することができる。この方法は、ｌｏｘＰに挟まれたＮａｎｏｇ導入遺伝子のＥＳ細胞への導入と、その後、両Ｎａｎｏｇ内在性遺伝子を標的とした欠失および最終的なトランスジェニックなＮａｎｏｇのｃｒｅ除去を含む。ＲＣ−／−細胞が真のＥＳ細胞であるというさらなる証拠は、標的化（ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ）ベクターにより導入される、Ｇ４１８およびハイグロマイシン耐性遺伝子を駆動する内在性Ｎａｎｏｇプロモーターの活性によって選択が行われうるという事実から得られる。このことが純粋なＥＳ様集団の選択を可能にし、そこではＯｃｔ４とＳｏｘ２両方のレベルが他のＮａｎｏｇ発現ＥＳ細胞集団と同様であった（図６Ｄ）。Ｎａｎｏｇが再プログラム化に必要であるか否かを検討するため、ＲＣ−／−またはその親細胞系統ＲＣのいずれか一方とＮＳＯ４ＧｉＰ細胞とを同時に融合を行った。また、ＲＣ−／−を、トランスジェニックＮａｎｏｇを発現するＮＳ Ｏ４ＧｉＰ、ＮＳ Ｏ４ＧｉＰ ＮＰと融合させた。最終的に、Ｎａｎｏｇを発現する導入遺伝子（ＲＣ−／−ＮＺ）で回復されたＲＣ−／−細胞をＮＳ Ｏ４ＧｉＰと融合させた。これらの実験は、２つの別々に標的化されたクローン、ＲＣ−／−ＡおよびＢを用いて行われた。ハイブリッドコロニー数の有意な値を得るために、２×１０６個：２×１０６個の融合混合物を蒔いた。予想通り、親細胞系統ＲＣとＮＳＯ４ＧｉＰとの融合はハイブリッドコロニーを生じた（図６Ａ、Ｂ）。対照的に、ＲＣ−／−細胞はこの能力を完全に喪失していた。Ｎａｎｏｇで回復されたＲＣ−／−細胞であるＲＣ−／−ＮＺは、ハイブリッドコロニーの生成能力を獲得するだけでなく、ＲＣ細胞に関してそれをさらに高めていた。この結果は、ＲＣ−／−ＮＺ細胞におけるより高いレベルのＮａｎｏｇの存在と相関する（図６Ｄ）。興味深いことに、ＲＣ−／−細胞はまた、Ｎａｎｏｇを発現するＮＳＯ４ＧｉＰ ＮＰに融合される場合、ハイブリッドコロニーを形成することもできた。 Example 9
Nanog is required to generate hybrid colonies of ES-like ES-NS cells Both Nanog null isolated ICM and ES cell cultures were unable to maintain an undifferentiated state (Mitsui et al, 2003). These results were interpreted as indicating the role of Nanog in maintaining the pluripotent state. However, using a conditional deletion method induces Nanog-/-ES-like cells (RC-/-) that express pluripotency markers, which are continuously passaged and maintain pluripotent performance can do. This method involves the introduction of a Nanog transgene sandwiched between loxPs into an ES cell, followed by deletion targeting both Nanog endogenous genes and the final transgenic Nanog cre removal. Further evidence that RC − / − cells are true ES cells is that the selection can be made by the activity of the endogenous Nanog promoter driving G418 and the hygromycin resistance gene, introduced by the targeting vector. Derived from the facts. This allowed selection of pure ES-like populations, where both Oct4 and Sox2 levels were similar to other Nanog-expressing ES cell populations (FIG. 6D). In order to investigate whether Nanog is required for reprogramming, NSO4GiP cells were fused simultaneously with either RC − / − or its parent cell line RC. In addition, RC − / − was fused with NS O4GiP and NS O4GiP NP expressing transgenic Nanog. Finally, RC-/-cells recovered with a transgene expressing Nanog (RC-/-NZ) were fused with NS O4GiP. These experiments were performed using two separately targeted clones, RC − / − A and B. In order to obtain a significant value for the number of hybrid colonies, 2 × 10 6 : 2 × 10 6 fusion mixtures were seeded. As expected, fusion of the parent cell line RC and NSO4GiP resulted in a hybrid colony (FIGS. 6A, B). In contrast, RC − / − cells completely lost this ability. RC-/-NZ, RC-/-cells recovered with Nanog, not only acquired the ability to generate hybrid colonies, but also enhanced it with respect to RC cells. This result correlates with the presence of higher levels of Nanog in RC − / − NZ cells (FIG. 6D). Interestingly, RC − / − cells could also form hybrid colonies when fused to Nanog-expressing NSO4GiP NP.

これらの結果は、まとめると、Ｎａｎｏｇの発現の存在がＥＳ×ＮＳ細胞融合後のＮＳゲノムの再プログラム化に必須であることを示唆している。   Together, these results suggest that the presence of Nanog expression is essential for the reprogramming of the NS genome after ES × NS cell fusion.

実施例１０
Ｎａｎｏｇの発現はＭＥＫ阻害剤により高められる
ＭＥＫの阻害剤ＰＤ１８４３５２がＥＳ細胞におけるＮａｎｏｇのレベルを高めることが示された。 Example 10
Nanog expression is enhanced by MEK inhibitors It was shown that the MEK inhibitor PD184352 increases Nanog levels in ES cells.

再プログラム化におけるＰＤ１８４３５２の効果についても、細胞融合との関連において、ＮＳ細胞の多能性への転換を調べることにより検討した。   The effect of PD184352 on reprogramming was also examined by examining the conversion of NS cells to pluripotency in the context of cell fusion.

ｄｓＲｅｄ蛍光タンパク質およびハイグロマイシン耐性を構成的に発現するＲＨ ＥＳ細胞を、ＩＲＥＳを介してピューロマイシン耐性に連結させた融合タンパク質ＴａｕＧＦＰを発現する胎児由来の神経幹細胞（ＮＳ ＴＧＦＰ）に融合させた。この融合体のうちの１つにおいて、ＲＨ細胞を３μＭ ＰＤ１８４３５２との融合の前後３日間に処理した。対照において、ＰＤ１８４３５２を添加しなかった。処理および未処理の一次ハイブリッドを融合２４時間後に選別し、次いで蒔いた（図９Ａ〜Ｃ）。３日後、ハイグロマイシンおよびピューロマイシンをＥＳ培地に添加して選別した。ｄｓＲｅｄ２およびＧＦＰ蛍光を発現し、かつＥＳ細胞の形態を示すコロニーをスコア化した（図９ＤおよびＥ）。結果は、ＰＤ１８４３５２がＥＳ−ＮＳハイブリッドのコロニー形成を４５倍まで高めることを示した。興味深いことに、ＰＤ１８４３５２で処理されたＲＨ細胞では、蒔かれたハイブリッド当たりに形成されたハイブリッドコロニーの百分率は、Ｎａｎｏｇを過剰発現するＥＳ細胞と比べて単に２倍低かった（２．２５％対４％）。この結果は、ＰＤ１８４３５２が細胞融合の過程における再プログラム化を促進することを示す。この効果は、処理されたＲＨ細胞におけるＮａｎｏｇレベルの増加により介在される可能性が高い。したがって、Ｎａｎｏｇが内在的に発現される場合、ＭＥＫ阻害剤を用いることにより、Ｎａｎｏｇを上方調節し、再プログラム化の促進などの関連した効果を得ることが可能である。   RH ES cells constitutively expressing dsRed fluorescent protein and hygromycin resistance were fused to fetal-derived neural stem cells (NS TGFP) expressing the fusion protein TauGFP linked to puromycin resistance via IRES. In one of the fusions, RH cells were treated for 3 days before and after fusion with 3 μM PD184352. In the control, PD184352 was not added. Treated and untreated primary hybrids were selected 24 hours after fusion and then seeded (FIGS. 9A-C). Three days later, hygromycin and puromycin were added to the ES medium for selection. Colonies that expressed dsRed2 and GFP fluorescence and exhibited ES cell morphology were scored (FIGS. 9D and E). The results indicated that PD184352 increased ES-NS hybrid colony formation by 45-fold. Interestingly, in RH cells treated with PD184352, the percentage of hybrid colonies formed per plated hybrid was simply 2 times lower than ES cells overexpressing Nanog (2.25% vs 4). %). This result indicates that PD184352 promotes reprogramming in the process of cell fusion. This effect is likely mediated by increased Nanog levels in treated RH cells. Thus, when Nanog is expressed endogenously, it is possible to upregulate Nanog and obtain related effects such as promoting reprogramming by using MEK inhibitors.

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したがって、本発明は、細胞の融合および組み合わせを介する細胞の再プログラム化、遺伝的改変の方法、子孫ならびにそれらの使用を提供する。   Thus, the present invention provides cell reprogramming, methods of genetic modification, progeny and their use through cell fusion and combinations.

Ｎａｎｏｇの発現がインビボにおけるＸの再活性化に必要であることを示す。Figure 9 shows that Nanog expression is required for X reactivation in vivo. ＮａｎｏｇがＥＳ細胞におけるＥＳ−分化細胞ハイブリッドコロニーを形成するＥＳ細胞の能力を高めることを示す。FIG. 5 shows that Nanog enhances the ability of ES cells to form ES-differentiated cell hybrid colonies in ES cells. 細胞の生存および分化におけるＰＥＧの効果を示す。Figure 3 shows the effect of PEG on cell survival and differentiation. ＥＳ−ＮＳ細胞ハイブリッドにおけるＮＳエピゲノムの解析を示す。2 shows analysis of NS epigenome in ES-NS cell hybrid. 融合混合物のＦＡＣＳ解析を示す。FACS analysis of the fusion mixture is shown. ＮａｎｏｇがＥＳ様ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの作成に必要であることを示す。Figure 5 shows that Nanog is required for the generation of ES-like ES-NS hybrid colonies. ハイブリッドクローンの染色体数を示す。The number of chromosomes of the hybrid clone is shown. ＥＳ−ＮＳハイブリッドがトランスジェニックＮａｎｏｇの欠失後に多能性を示すことを示す。FIG. 5 shows that ES-NS hybrids show pluripotency after deletion of transgenic Nanog. 多能性ＥＳ−ＮＳハイブリッドコロニーの形成におけるＰＤ１８４３５２の効果を示す。Figure 2 shows the effect of PD184352 on the formation of pluripotent ES-NS hybrid colonies.

Claims (68)

分化したゲノムから多能性ゲノムを得る方法であって、
多能性細胞を分化細胞と融合させ、次いで
多能性細胞、分化細胞および／または生じた融合細胞でＮａｎｏｇを過剰発現させることを含む方法。 A method for obtaining a pluripotent genome from a differentiated genome,
A method comprising fusing a pluripotent cell with a differentiated cell and then overexpressing Nanog in the pluripotent cell, the differentiated cell and / or the resulting fused cell. 多能性細胞および／または分化細胞でＮａｎｏｇを過剰発現させることを含む、請求項１に記載の方法。   2. The method of claim 1, comprising overexpressing Nanog in pluripotent cells and / or differentiated cells. 融合細胞でＮａｎｏｇを発現させることを含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。   The method according to claim 1, comprising expressing Nanog in a fused cell. 分化したゲノムから多能性ゲノムを得る方法であって、
多能性細胞を分化細胞と融合させて融合細胞が形成されることを含み、多能性細胞、分化細胞または融合細胞のうちの少なくとも１つがＭＥＫ阻害剤で処理されることを含む方法。 A method for obtaining a pluripotent genome from a differentiated genome,
A method comprising fusing a pluripotent cell with a differentiated cell to form a fused cell, wherein at least one of the pluripotent cell, the differentiated cell or the fused cell is treated with a MEK inhibitor. 多能性細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性癌腫（ＥＣ）細胞または胚の性腺（ＥＧ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the pluripotent cells are embryonic stem (ES) cells, embryonic carcinoma (EC) cells or embryonic gonads (EG). 分化細胞が体細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the differentiated cell is a somatic cell. 分化細胞が幹細胞である、請求項６に記載の方法。   The method according to claim 6, wherein the differentiated cell is a stem cell. 分化細胞が神経幹細胞である、請求項６に記載の方法。   The method according to claim 6, wherein the differentiated cell is a neural stem cell. 多能性細胞および分化細胞がマウス細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the pluripotent cells and differentiated cells are mouse cells. 多能性細胞および分化細胞がヒト細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the pluripotent cells and differentiated cells are human cells. 二倍体細胞を得るために融合細胞を培養することを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。   11. A method according to any one of claims 1 to 10, comprising culturing the fused cells to obtain diploid cells. 多能性細胞と分化細胞の融合が四倍体細胞を生じ、ならびに前記方法が四倍体細胞の子孫を得て、次いで二倍体であるかかる子孫を同定することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。   The fusion of pluripotent cells and differentiated cells results in tetraploid cells, and the method comprises obtaining tetraploid cell progeny and then identifying such progeny that are diploid. 12. The method according to any one of 11 above. 融合細胞の子孫として得られた二倍体の多能性細胞を培養し、次いで二倍体の多能性細胞から分化細胞を誘導することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。   13. The method of any one of claims 1 to 12, further comprising culturing diploid pluripotent cells obtained as progeny of the fused cells and then inducing differentiated cells from the diploid pluripotent cells. The method described in 1. 細胞を遺伝学的に改変する方法であって、
染色体を含む第１の細胞を提供し、
染色体を含む第２の細胞を提供し、
前記第１の細胞と前記第２の細胞を融合させて融合細胞が形成され、次いで
前記第１の細胞由来の少なくとも１つの染色体および前記第２の細胞由来の少なくとも１つの染色体を含む二倍体細胞を得るために前記融合細胞を培養することを含む方法。 A method for genetically modifying a cell, comprising:
Providing a first cell comprising a chromosome;
Providing a second cell comprising a chromosome;
A diploid comprising a fused cell formed by fusing the first cell and the second cell and then comprising at least one chromosome derived from the first cell and at least one chromosome derived from the second cell Culturing the fused cells to obtain cells. 第１の細胞、第２の細胞および融合細胞のうちの少なくとも１つがＭＥＫ阻害剤で処理される、請求項１４に記載の方法。   15. The method of claim 14, wherein at least one of the first cell, the second cell and the fusion cell is treated with a MEK inhibitor. 第１の細胞および第２の細胞の両方が二倍体である、請求項１４または１５に記載の方法。   16. A method according to claim 14 or 15, wherein both the first cell and the second cell are diploid. 第１の細胞および第２の細胞の両方がマウス細胞である、請求項１４、１５または１６に記載の方法。   17. A method according to claim 14, 15 or 16, wherein both the first cell and the second cell are mouse cells. 第１の細胞および第２の細胞の両方がヒト細胞である、請求項１４、１５または１６に記載の方法。   17. A method according to claim 14, 15 or 16, wherein both the first cell and the second cell are human cells. 第１の細胞および第２の細胞の一方が多能性であり、第１の細胞および第２の細胞の他方が任意で多能性である、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。   19. The method of claim 14, wherein one of the first cell and the second cell is pluripotent and the other of the first cell and the second cell is optionally pluripotent. the method of. 他方の細胞が体細胞である、請求項１９に記載の方法。   The method of claim 19, wherein the other cell is a somatic cell. 他方の細胞が幹細胞である、請求項１９または２０に記載の方法。   21. The method according to claim 19 or 20, wherein the other cell is a stem cell. 他方の細胞が神経幹細胞である、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 19 to 21, wherein the other cell is a neural stem cell. 請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、
（ｉ）望ましい遺伝子および（ｉｉ）改変されるべき望ましくない遺伝子を有する第１の細胞を同定し、
望ましくない遺伝子の改変形態を有する第２の細胞を同定し、
第１の細胞および第２の細胞を融合させ、
融合細胞を培養し、次いで
望ましい遺伝子と望ましくない遺伝子の改変形態の両方を含む融合細胞の子孫を同定することを含む方法。 23. A method according to any one of claims 14 to 22, comprising
Identifying a first cell having (i) a desired gene and (ii) an undesirable gene to be modified;
Identifying a second cell having an undesired modified form of the gene;
Fusing a first cell and a second cell;
Culturing the fused cell and then identifying the progeny of the fused cell containing both the desired gene and a modified form of the undesirable gene. 第１の細胞の遺伝子欠損を修復するためであって、望ましくない遺伝子が欠損を有する遺伝子であり、第２の細胞における前記遺伝子の改変形態が修復される、請求項２３に記載の方法。   24. The method of claim 23, for repairing a gene deficiency in a first cell, wherein an undesirable gene is a gene having a deficiency and the modified form of the gene in a second cell is repaired. 第２の細胞に望ましくない遺伝子の改変形態を導入するために、第１の細胞との融合の前に第２の細胞を遺伝学的に改変することを含む、請求項２４に記載の方法。   25. The method of claim 24, comprising genetically modifying the second cell prior to fusion with the first cell to introduce an undesired modified form of the gene into the second cell. Ｎａｎｏｇの存在下で細胞を培養することを含む、請求項１４〜２５のいずれか１項に記載の方法。   26. A method according to any one of claims 14 to 25 comprising culturing the cells in the presence of Nanog. 第１の細胞および／または第２の細胞でＮａｎｏｇを発現させることを含む、請求項１４〜２６のいずれか１項に記載の方法。   27. A method according to any one of claims 14 to 26, comprising expressing Nanog in the first cell and / or the second cell. Ｎａｎｏｇの存在下で第１の細胞と第２の細胞を融合させることを含む、細胞融合の方法。   A method of cell fusion comprising fusing a first cell and a second cell in the presence of Nanog. ＭＥＫ阻害剤の存在下で第１の細胞と第２の細胞を融合させることを含む、細胞融合の方法。   A method of cell fusion comprising fusing a first cell and a second cell in the presence of a MEK inhibitor. 第１の細胞が多能性である、請求項２８または２９に記載の方法。   30. The method of claim 28 or 29, wherein the first cell is pluripotent. 第１の細胞がＥＳ、ＥＣまたはＥＧ細胞である、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。   31. The method of any one of claims 28-30, wherein the first cell is an ES, EC or EG cell. 第２の細胞が体細胞である、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。   32. The method according to any one of claims 28 to 31, wherein the second cell is a somatic cell. 第２の細胞が幹細胞である、請求項３２に記載の方法。   35. The method of claim 32, wherein the second cell is a stem cell. 幹細胞が神経幹細胞である、請求項３３に記載の方法。   34. The method of claim 33, wherein the stem cell is a neural stem cell. 第１の細胞でＮａｎｏｇを発現させることを含む、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。   35. A method according to any one of claims 28 to 34, comprising expressing Nanog in the first cell. 第１および第２の細胞の融合が異数性細胞を生じさせる、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の方法であって、該方法が融合細胞を培養してその二倍体の子孫を得ることを含む方法。   36. The method of any one of claims 28 to 35, wherein the fusion of the first and second cells results in an aneuploid cell, wherein the method comprises culturing the fused cell and diploid A method comprising obtaining offspring. 請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の細胞融合の方法を含む、生きた非ヒト動物を得る方法。   A method for obtaining a living non-human animal comprising the method of cell fusion according to any one of claims 28 to 36. ＭＥＫ阻害剤がＭＥＫ１阻害剤である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。   38. The method of any one of claims 1-37, wherein the MEK inhibitor is a MEK1 inhibitor. ＭＥＫ１阻害剤がＰＤ１８４３５２である、請求項３８に記載の方法。   40. The method of claim 38, wherein the MEK1 inhibitor is PD184352. 前記細胞が約０.１μＭおよび約２５μＭのＭＥＫ阻害剤で処理される、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。   40. The method of any one of claims 1-39, wherein the cells are treated with about 0.1 [mu] M and about 25 [mu] M MEK inhibitor. 細胞が約１μＭおよび約５μＭのＭＥＫ阻害剤で処理される、請求項４０に記載の方法。   41. The method of claim 40, wherein the cells are treated with about 1 [mu] M and about 5 [mu] M MEK inhibitor. 請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法により得られる細胞。   The cell obtained by the method of any one of Claims 1-41. 治療における使用のための医薬品の製造における、請求項４２に記載の細胞の使用。   43. Use of a cell according to claim 42 in the manufacture of a medicament for use in therapy. 細胞の治療における請求項４３に記載の使用。   44. Use according to claim 43 in the treatment of cells. 患者に有効な量の請求項４２記載の細胞を投与することを含む、治療方法。   43. A method of treatment comprising administering to a patient an effective amount of the cells of claim 42. 患者に有効な量の請求項１４〜２７のいずれか１項により得られた遺伝学的に改変された細胞を投与することを含む、治療方法。   28. A method of treatment comprising administering to a patient an effective amount of genetically modified cells obtained according to any one of claims 14-27. 遺伝学的に改変された細胞を必要とする患者を同定し、
前記患者の治療に必要とされる遺伝学的改変を同定し、
請求項１４〜２７のいずれか１項の方法により遺伝学的に改変された細胞を調製すること
を含む、請求項４６記載の治療方法。 Identify patients in need of genetically modified cells,
Identifying genetic modifications required for treatment of the patient;
49. A method of treatment according to claim 46, comprising preparing a genetically modified cell by the method of any one of claims 14-27. 多能性細胞と体細胞の融合によって得られた細胞の再プログラム化におけるＮａｎｏｇの使用。   Use of Nanog in reprogramming cells obtained by fusion of pluripotent and somatic cells. 多能性細胞がＥＳ細胞である、請求項４８に記載の使用。   49. The use according to claim 48, wherein the pluripotent cell is an ES cell. 体細胞が神経幹細胞である、請求項４８または４９に記載の使用。   50. Use according to claim 48 or 49, wherein the somatic cells are neural stem cells. 多能性細胞と体細胞の融合によって得られた細胞の再プログラム化におけるＭＥＫ阻害剤の使用。   Use of MEK inhibitors in the reprogramming of cells obtained by fusion of pluripotent and somatic cells. 多能性細胞がＥＳ細胞である、請求項５１に記載の使用。   52. The use according to claim 51, wherein the pluripotent cell is an ES cell. 体細胞が神経幹細胞である、請求項５０または５１に記載の使用。   52. Use according to claim 50 or 51, wherein the somatic cells are neural stem cells. 体細胞の核をレシピエント細胞に移植して核移植細胞を形成し、次いで前記核移植細胞においてＮａｎｏｇを過剰発現させることを含む、核移植の方法。   A method of nuclear transfer comprising transplanting a somatic cell nucleus into a recipient cell to form a nuclear transplant cell, and then overexpressing Nanog in said nuclear transplant cell. レシピエント細胞が卵母細胞である、請求項５４に記載の方法。   55. The method of claim 54, wherein the recipient cell is an oocyte. レシピエント細胞が除核された卵母細胞である、請求項５４に記載の方法。   55. The method of claim 54, wherein the recipient cell is an enucleated oocyte. ＥＳ細胞において、Ｎａｎｏｇの内在性発現レベルの２〜１５倍のレベルでＮａｎｏｇを発現させることを含む、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の方法。   57. The method according to any one of claims 54 to 56, comprising expressing Nanog in ES cells at a level 2 to 15 times the endogenous expression level of Nanog. 体細胞の核をレシピエント細胞に移植して核移植細胞を形成させ、次いで前記核移植細胞をＭＥＫ阻害剤で処理することを含む、核移植の方法。   A method of nuclear transfer comprising transplanting a somatic cell nucleus into a recipient cell to form a nuclear transplant cell, and then treating the nuclear transplant cell with a MEK inhibitor. レシピエント細胞が卵母細胞である、請求項５８に記載の方法。   59. The method of claim 58, wherein the recipient cell is an oocyte. レシピエント細胞が除核された卵母細胞である、請求項５８に記載の方法。   59. The method of claim 58, wherein the recipient cell is an enucleated oocyte. 請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の核移植の方法を含む、生きた非ヒト動物を得る方法。   61. A method of obtaining a living non-human animal comprising the method of nuclear transfer according to any one of claims 54-60. 請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の核移植の方法を含む、多能性幹細胞の培養物を得る方法。   61. A method for obtaining a culture of pluripotent stem cells, comprising the method of nuclear transfer according to any one of claims 54-60. Ｎａｎｏｇの発現の上方調節におけるＭＥＫ阻害剤の使用。   Use of MEK inhibitors in upregulation of Nanog expression. 細胞の再プログラム化におけるＭＥＫ阻害剤の使用。   Use of MEK inhibitors in cell reprogramming. 細胞が体細胞である、請求項６４に記載の使用。   65. Use according to claim 64, wherein the cell is a somatic cell. 細胞がインビトロで再プログラム化される、請求項６４または６５に記載の使用。   66. Use according to claim 64 or 65, wherein the cells are reprogrammed in vitro. 細胞が融合細胞でない。請求項６４〜６６のいずれか１項に記載の使用。   The cell is not a fused cell. Use according to any one of claims 64-66. 細胞をＭＥＫ阻害剤で処理することを含む、体細胞を再プログラム化する方法。   A method of reprogramming somatic cells comprising treating the cells with a MEK inhibitor.
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