JP2009511862A - Reactive surfaces, substrates and surfaces, methods for making and using substrates - Google Patents

Abstract

反応性表面、基質およびかかる基質および表面を製造および使用する方法が提供される。基質および表面は、単一分子分析などの異なった適用において使用するために好ましくは、ほかの場合なら非反応性の表面上に低密度反応性基を提供する。
Reactive surfaces, substrates and methods for making and using such substrates and surfaces are provided. The substrate and surface preferably provide low density reactive groups on otherwise non-reactive surfaces for use in different applications such as single molecule analysis.

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２００５年９月３０日に出願されたロイトマン（Ｒｏｉｔｍａｎ）らの米国特許出願第１１／２４０，６６２号明細書、「反応性表面、基質および同表面、基質の製造および使用方法」に対する優先権および利点を請求する。この先行出願は、あらゆる目的のために参照によって組み入れられる。 (Cross-reference of related applications)
No. 11 / 240,662, filed September 30, 2005, “Reactive Surface, Substrate and Surface, Method for Producing and Using Substrate”. Claim priority and benefits for. This prior application is incorporated by reference for all purposes.

（連邦政府により支援された研究に関する記載）
適用可能でない (Description of research supported by the federal government)
Not applicable

「神は固体状態を創った。神はその表面を悪魔に委ねた」−エンリコ・フェルミ（Ｅｎｒｉｃｏ Ｆｅｒｍｉ）
この考えは材料科学者には耳慣れないものではない。表面の特性およびその環境とのその相互作用に関して、理解またはその欠如は歴史的な発見、および歴史的な失敗の中心であった。この問題は、工学、化学または生物学の分野であれ、ナノ材料技術、地球外探査、半導体工学、バイオテクノロジー製造または薬剤管理および供給に焦点を合わせられるのであれ、ほとんど全ての技術的な試みに広がっている。材料のバルク性質は１つの問題点、すなわち、その材料が無くなる箇所を生じることを理解しながら、その材料の表面の性質を理解および／または扱わなければならず、その表面がその環境とどのように相互作用するのかは、まったく異なったものである。
米国特許第５，１５３，８５４号明細書 米国特許第５，４０５，７８３号明細書 米国特許第６，２６１，７７６号明細書 米国特許出願公開第２００３／００４４７８１号明細書 米国特許第６，９１７，７２６号明細書 米国特許出願第１１／２０１，７６８号明細書 リン（Ｌｉｎ）ら著、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００５年）、１２７：２６８６〜９５ページ デヴェラジ（Ｄｅｖｅｒａｊ）ら著、ＪＡＣＳ ２００５年、１２７：８６００〜８６０１ページ ルマーストーファー（Ｌｕｍｍｅｒｓｔｏｒｆｅｒ）ら著、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ（２００４年）１０８：３９６３〜３９６６ページ コールマン（Ｃｏｌｌｍａｎ）ら著、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）（２００４年）２０：１０５１〜１０５３ページ ギリア（Ｇｕｉｌｌｉｅｒ）ら著、Ｌｉｎｋｅｒｓ ａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１００：２０９１〜２１５７ページ（２０００年） ホン（Ｈｏｎｇ）ら著、（２００３）ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）２３５７〜２３６５ Ｇ．Ｔ．ハーマンソン（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）著、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）１９９６年 “God has created a solid state. He has entrusted the surface to the devil.”-Enrico Fermi
This idea is not unfamiliar to materials scientists. With regard to the properties of the surface and its interaction with the environment, understanding or lack thereof has been the center of historical discoveries and historical failures. This issue applies to almost any technical attempt, whether in the field of engineering, chemistry or biology, whether it is focused on nanomaterials technology, extraterrestrial exploration, semiconductor engineering, biotechnology manufacturing or drug management and supply. It has spread. While understanding that the bulk nature of a material creates one problem: where the material disappears, the nature of the surface of the material must be understood and / or handled and how the surface The interaction with is completely different.
US Pat. No. 5,153,854 US Pat. No. 5,405,783 US Pat. No. 6,261,776 US Patent Application Publication No. 2003/0044781 US Pat. No. 6,917,726 US patent application Ser. No. 11 / 201,768 By Lin et al. Am. Chem. Soc. (2005) 127: 2686-95 pages Deveraj et al., JACS 2005, 127: 8600-8601. Lummer Storfer et al. Phys. Chem. B (2004) 108: 3963-3966 Coleman et al., Langmuir (2004) 20: 1051-1053. Guillier et al., Linkers and Cleavage Strategies in Solid Phase Organic Synthesis and Combinatorial Chemistry, Chem. Rev. 100: 2091-2157 pages (2000) Hong et al., (2003) Langmuir 2357-2365. G. T.A. Hermanson, Bioconjugate Technologies (Academic Press 1996)

本発明は、望ましくない分子の過度の結合を防ぎながら、とりわけ、望ましい分子に選択的に結合するキャパシティおよび能力など、様々な異なった必要性を満たすように選択および／または構成される材料および／またはそれらの表面に関し、その他の有利な特性は、以下の開示内容を読めば明白であろう。   The present invention provides materials and materials that are selected and / or configured to meet a variety of different needs, such as, among other things, the capacity and ability to selectively bind to the desired molecule while preventing excessive binding of the unwanted molecule. Other advantageous properties with respect to these surfaces will be apparent upon reading the following disclosure.

本発明は一般に、様々な異なった有用な適用において有用である、改質された表面を有する基質、ならびにこのような基質を製造する方法およびこれらの基質の使用および適用に関する。特に、本発明の基質は、その表面上に配置された反応性基を選択された密度で、好ましくは、このような反応性基を選択された低い密度で有する表面を有する。   The present invention generally relates to substrates having modified surfaces that are useful in a variety of different useful applications, as well as methods of making such substrates and uses and applications of these substrates. In particular, the substrate of the present invention has a surface having reactive groups disposed on its surface at a selected density, preferably at a selected low density.

第１の態様において、本発明は、第１の反応性部分が結合された表面を含む基質を提供する。本発明のこの態様によって、反応性部分は、５０，０００ｎｍ^２当たり約１の反応性部分〜１００ｎｍ^２当たり１の反応性部分の間の密度において表面に結合されてもよい。同様に、本発明はまた、反応性部分が結合された表面を含む装置を提供し、反応性部分は、１００ｎｍ^２当たり１未満の反応性部分の密度において表面に結合される。 In a first aspect, the present invention provides a substrate comprising a surface to which a first reactive moiety is bound. This aspect of the present invention, the reactive moiety may be attached to the surface at a density between about 1 reactive moiety of the reactive moieties ~ 100 nm ² per per 50,000 ^2. Similarly, the present invention also provides an apparatus that includes a surface having a reactive moiety attached thereto, wherein the reactive moiety is bonded to the surface at a density of less than 1 reactive moiety per 100 nm ² .

関連して、本発明はまた、少なくとも第１の観察領域が設けられた基質を含むデバイスを提供し、観察領域は、約１００ｎｍ^２〜５００００ｎｍ^２の領域を有する。本発明のこれらの態様によって、基質は、観察領域内の表面に結合された１〜３の反応性部分を含有する。 Relatedly, the present invention also provides a device comprising a substrate at least a first observation region is provided, the observation region includes a region of about 100nm ² ~50000nm ^2. According to these aspects of the invention, the substrate contains 1-3 reactive moieties bound to the surface in the observation region.

本発明はまた、第１の反応性表面を有する基質を提供する工程と、次に第１および第２の表面改質剤の混合物を提供する工程であって、第１および第２の表面改質剤が各々、反応性表面に結合可能であると共に、第１および第２の表面改質剤が第２の比において反応性表面に結合するように選択された第１の比において混合物中に存在する工程とによって、本発明の基質およびデバイスを製造する方法を提供する。次に、反応性表面を混合物と接触させ、第１および第２の改質剤が第２の比において表面に結合された、改質された表面を製造する。   The present invention also includes providing a substrate having a first reactive surface and then providing a mixture of first and second surface modifiers, the first and second surface modifications. Each of the materials is capable of binding to the reactive surface and the first and second surface modifiers are in the mixture at a first ratio selected to bind to the reactive surface at a second ratio. Depending on the steps present, methods of manufacturing the substrates and devices of the present invention are provided. The reactive surface is then contacted with the mixture to produce a modified surface in which the first and second modifiers are bonded to the surface in a second ratio.

関連して、改質される表面を提供する工程と、改質される表面を表面改質組成物と接触させる工程とを含む、改質された表面を作製する方法もまた提供される。本発明のこの態様において、表面改質組成物が、所望の反応性部分に結合される第１の表面改質剤と、所望の反応性部分に結合されない第２の表面改質剤とを含む。第１の表面改質剤および第２の表面改質剤が、改質された表面を製造する比において表面改質組成物中に存在し、反応性部分が、５０，０００ｎｍ^２当たり約１の反応性部分〜１００ｎｍ^２当たり１の反応性部分の間の密度において改質された表面上に存在する。 Relatedly, there is also provided a method of making a modified surface comprising providing a surface to be modified and contacting the surface to be modified with a surface modifying composition. In this aspect of the invention, the surface modifying composition includes a first surface modifier that is bonded to the desired reactive moiety and a second surface modifier that is not bonded to the desired reactive moiety. . The first surface modifier and the second surface modifier are present in the surface modification composition in a ratio to produce a modified surface, and the reactive moiety is about 1 per 50,000 nm ² . Reactive moieties are present on the modified surface at a density between 1 reactive moiety per 100 nm ² .

さらに別の態様において、本発明は、表面に実質的に均一に結合する組成物で表面を処理する工程であって、組成物が、反応性部分を含有しない第１の成分と反応性部分を含む第２の成分とを含み、第２の成分が、反応性部分を所望の密度において表面上に提供するように第１の成分に対する濃度において組成物中に存在する工程を含む、反応性部分の所望の密度をその上に提供するように表面を構成する方法を提供する。
〔図面の簡単な説明〕 In yet another aspect, the invention includes treating a surface with a composition that binds substantially uniformly to the surface, wherein the composition comprises a first component that does not contain a reactive moiety and a reactive moiety. A reactive moiety, wherein the second component is present in the composition at a concentration relative to the first component so as to provide the reactive moiety on the surface at a desired density. A method is provided for configuring a surface to provide a desired density thereof.
[Brief description of the drawings]

反応性表面、基質および同反応性表面、基質の製造および使用方法
図１は低密度の反応性基をその上に有する表面の略図である。 Reactive Surface, Substrate and Same Reactive Surface, Method for Producing and Using Substrate FIG. 1 is a schematic representation of a surface having low density reactive groups thereon.

図２は比較的低密度の反応性基をその上に提供するための層状、または多層機能化を有する基質の略図である。     FIG. 2 is a schematic diagram of a substrate with layered or multilayer functionalization to provide relatively low density reactive groups thereon.

図３は本発明の表面を製造するための１つの典型的なプロセスを図解的に示す。     FIG. 3 schematically illustrates one exemplary process for producing the surface of the present invention.

図４は本発明の低密度反応性表面を製造するための別の典型的なプロセスを図解的に示す。     FIG. 4 schematically illustrates another exemplary process for producing the low density reactive surface of the present invention.

図５は選択的局在反応性基を提供する本発明の表面を製造するための立体障害に基づくプロセスの実施例を図解的に示す。     FIG. 5 schematically illustrates an example of a steric hindrance based process for producing a surface of the present invention that provides a selectively localized reactive group.

図６は比較的低密度の反応性表面を生じるために、２つの異なって官能化された誘導体化基が、その上に配置された表面の略図である。     FIG. 6 is a schematic representation of a surface on which two different functionalized derivatizing groups have been placed to produce a relatively low density reactive surface.

図７はほかの場合なら非反応性の基の表面に混じった様々な濃度の反応性基の表面上の水接触角のプロットである。     FIG. 7 is a plot of the water contact angle on the surface of various concentrations of reactive groups otherwise mixed with the surface of non-reactive groups.

本発明は一般に、材料およびそれらの表面を目的とし、以降、一般に基質と称され、そこで表面は、様々な適用のための望ましい性質を有するように選択および構成されている。また、本発明は、このような表面を製造するための方法およびプロセス、ならびに多数の異なった適用においてこのような表面を用いるための方法およびプロセスを目的とする。   The present invention is generally directed to materials and their surfaces, and hereinafter generally referred to as substrates, where the surfaces are selected and configured to have desirable properties for a variety of applications. The present invention is also directed to methods and processes for producing such surfaces, and methods and processes for using such surfaces in a number of different applications.

本発明に関して特に重要であるのは、例えば、その上に分子結合部分を選択的に含有することによって選択的な分子結合またはカップリング特性を有する基質および表面であり、選択的な方法で所望の分子を表面に選択的に結合するためにこのような表面を用いることである。さらにより重要であるのは、予備操作および／または分析操作においてなど、化学的および／または生化学的プロセスにおいて使用するために化学的および／または生物学的活性分子に選択的に結合される時にこのような表面を用いることである。   Of particular importance with respect to the present invention are substrates and surfaces that have selective molecular binding or coupling properties, for example, by selectively containing a molecular binding moiety thereon, as desired in a selective manner. The use of such a surface to selectively bind molecules to the surface. Even more important is when selectively coupled to chemically and / or biologically active molecules for use in chemical and / or biochemical processes, such as in preliminary and / or analytical operations. It is to use such a surface.

次の開示内容から明らかであるように、本発明は広い適用可能性を有するが、１つの特に好ましい実施例において、低密度の反応性基を有する表面は、観察されているおよび／またはモニタされている領域内に単一反応性基、好ましいケースにおいて核酸ポリメラーゼなどの酵素を含有し、その単一酵素によって触媒された反応、例えば、ＤＮＡ合成のリアルタイムの理解を観察者にもたらす。このようなシステムは、核酸の鋳型による分析、または配列決定において特に有用である。   As will be apparent from the following disclosure, the present invention has broad applicability, but in one particularly preferred embodiment, surfaces with low density reactive groups are observed and / or monitored. It contains a single reactive group, in the preferred case an enzyme such as a nucleic acid polymerase, within the region that provides the observer with a real-time understanding of reactions catalyzed by that single enzyme, eg, DNA synthesis. Such a system is particularly useful in nucleic acid template analysis or sequencing.

Ｉ．基質および表面
Ａ．概説
上に言及したように、表面が分子レベルでそれらの周囲と相互作用する能力および／または傾向は、化学および生物科学およびそれらの科学を利用する産業において特に重要である。例えば、表面上に存在する反応性基の操作のこれまでの試みは主に、一方の極端または他の極端に焦点が合わせられている。特に、特定の表面に結合した分子の密度を、その表面上の反応性基の数を最大にすることによって、例えば、高密度結合によって最大にすることから多数の適用が恩恵を受ける。他の適用において、所望の目標は、表面とそれらの表面に暴露された材料との間の、実質的に全ての結合または吸着などの他のカップリング相互作用を取り除き、表面上の反応性基をキャップするかあるいは他の方法でマスクすることによって、与えられた適用のために不活性表面を作り出すことであった。 I. Substrate and surface Overview As mentioned above, the ability and / or tendency of surfaces to interact with their surroundings at the molecular level is particularly important in chemistry and biological sciences and industries that utilize those sciences. For example, previous attempts at manipulating reactive groups present on a surface have mainly focused on one extreme or the other extreme. In particular, numerous applications benefit from maximizing the density of molecules bound to a particular surface by maximizing the number of reactive groups on that surface, eg, by high density bonding. In other applications, the desired goal is to remove substantially all other coupling interactions between the surfaces and the materials exposed to those surfaces, such as binding or adsorption, and reactive groups on the surfaces. Was to create an inert surface for a given application by capping or otherwise masking.

例えば、生物学的反応性表面の場合、ＤＮＡ配列技術は、例えば、与えられた領域内の同数の活性ポリヌクレオチドプローブを結合し、このようなプローブを用いて混成反応から発生された信号を最大にすることに焦点を合わせている。同じく、例えば、抗体を使用する親和表面は、感度を改良するために表面上の結合基の密度を増加させることに同様に焦点を合わせている。あるいは、多数の他の適用において、これまでの試みは、表面の結合作用を有効に中和して化学的または生化学的環境との表面の相互作用を最小にするかまたは除くことに向けられている。例えば、特に細管電気泳動技術など、マイクロフルイディクスの分野は、それらの表面との一切の分子会合を避けるために溶融シリカ細管の一切の官能基をマスクすることが意図される、研究者が認識するコーティング材料または他の表面処理の実施例が豊富である。   For example, in the case of biologically reactive surfaces, DNA sequencing techniques can, for example, bind the same number of active polynucleotide probes within a given region and use such probes to maximize the signal generated from the hybrid reaction. Focus on making. Similarly, for example, affinity surfaces using antibodies are equally focused on increasing the density of binding groups on the surface to improve sensitivity. Alternatively, in numerous other applications, previous attempts have been directed to effectively neutralize surface binding to minimize or eliminate surface interactions with chemical or biochemical environments. ing. For example, the field of microfluidics, particularly capillary electrophoresis technology, has been recognized by researchers, intended to mask any functional groups on fused silica tubules to avoid any molecular association with their surface. There are many examples of coating materials or other surface treatments to do.

しかしながら、本発明は、所定の表面上の反応性化学基を最大にすることも、完全に除くことも意図しない表面を目的としている。代わりに、本発明は、表面上の選択された比較的低密度の反応性基を有する表面を提供すること、および多数の有益な適用においてのこのような表面の使用を目的としている。理解されるように、反応性基の性質は、別の基と共有結合することができる基を意味せず、または必要としないが、疎水性／親水性相互作用、ファンデルワールス（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）相互作用等などの相互作用の他の形を生じる基を包含する。それ故に、表面の反応性は、一般に本明細書において記載されたように、とりわけ、共有結合および非共有結合による会合、例えば、吸着を包含する。   However, the present invention is directed to surfaces that are not intended to maximize or completely eliminate reactive chemical groups on a given surface. Instead, the present invention is directed to providing a surface with selected relatively low density reactive groups on the surface and the use of such a surface in a number of beneficial applications. As will be appreciated, the nature of a reactive group does not imply or require a group that can be covalently bonded to another group, but the hydrophobic / hydrophilic interaction, van der Waals (Van der Waals). ) Includes groups that produce other forms of interaction, such as interactions. Therefore, surface reactivity generally includes, inter alia, covalent and non-covalent association, eg, adsorption, as described herein.

考察を簡単にするために、基質および表面は一般に、平面固体基質の点から本明細書において記載されるが、本発明の方法、プロセス、表面等は、本発明の反応性表面の性質が有用でありうる様々な異なった基質のタイプに適用可能であることは理解されよう。特に、このような表面は、シリカベースの基質（すなわち、ガラス、石英、溶融シリカ、ケイ素等）などの無機材料、他の半導体材料（すなわち、ＩＩＩ−Ｖ族、ＩＩ−ＶＩ族またはＩＶ族半導体）、ならびにポリマー材料（すなわち、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、セルロース、アガロース、または反応性媒体のための支持体として通常に用いられる様々な有機支持材料のいずれか）などの有機材料などの平面固体表面を含んでもよい。基質として有用な様々な材料に加えて、このような材料は、マイクロ粒子、すなわち、ビーズ、ナノ粒子、すなわち、ナノ結晶、ファイバー、マイクロファイバー、ナノファイバー、ナノワイヤー、ナノチューブ、マット、平面シート、平面ウエハまたはスライド、多井戸プレートの他、付加的な構造物を含む光学スライド、細管、マイクロ流体チャネル等の様々な物理的構成において提供されてもよいことは理解されよう。   For ease of discussion, substrates and surfaces are generally described herein in terms of planar solid substrates, but the methods, processes, surfaces, etc. of the present invention benefit from the nature of the reactive surfaces of the present invention. It will be appreciated that it can be applied to a variety of different substrate types. In particular, such surfaces can be inorganic materials such as silica-based substrates (ie, glass, quartz, fused silica, silicon, etc.), other semiconductor materials (ie, III-V, II-VI or IV semiconductors). ), And organic materials such as polymeric materials (ie, polymethylmethacrylate, polyethylene, polypropylene, polystyrene, cellulose, agarose, or any of a variety of organic support materials commonly used as supports for reactive media), etc. Other planar solid surfaces. In addition to various materials useful as substrates, such materials can be microparticles, i.e. beads, nanoparticles, i.e. nanocrystals, fibers, microfibers, nanofibers, nanowires, nanotubes, mats, flat sheets, It will be appreciated that a flat wafer or slide, multi-well plate, as well as optical slides including additional structures, capillaries, microfluidic channels, etc. may be provided in various physical configurations.

操作において、本発明の表面のこの選択的なおよび限られた反応性は、表面上のどこかの目的の分子および／または他の潜在的干渉分子の結合を防ぎながら、限られた方法で、特定の所望の目的の分子または分子のタイプ、典型的に目的の選択された反応性分子、例えば、特定の酵素、核酸等を表面上に提供することを目的としている。好ましい適用のために、所望の結果は、ほかの場合なら非反応性の表面によって囲まれた選択された反応性分子の比較的低密度を含有する表面である。目的の分子または分子のタイプの点から考察されたが、例えば、目的の２、３、４つ以上の異なった分子または分子のタイプなど、混合官能価の表面もまた、本発明の範囲に包含されることは理解されよう。   In operation, this selective and limited reactivity of the surface of the present invention is in a limited way while preventing the binding of any molecule of interest and / or other potential interfering molecules on the surface, It is intended to provide a specific desired molecule or type of target molecule, typically a selected reactive molecule of interest, such as a specific enzyme, nucleic acid, etc. on the surface. For preferred applications, the desired result is a surface that contains a relatively low density of selected reactive molecules that are otherwise surrounded by a non-reactive surface. Although discussed in terms of the molecule or molecule type of interest, surfaces of mixed functionality such as, for example, 2, 3, 4 or more different molecules or molecule types of interest are also within the scope of the present invention. It will be understood that

従って、本明細書中で用いられるとき、用語「反応性」および「非反応性」は本発明の基質表面上の異なった基を指すとき、（１）このような表面成分と与えられた目的の分子との相対的な反応性または会合を指し、好ましくはまた、（２）このような表面の所定の適用においてこのような表面成分と他の試薬（検出を妨げる場合がある標識反応体およびまたは生成物など、このような試薬はこのような適用を妨げることがある）、ならびに表面または他の箇所の反応性部分の目的の反応の進行を妨げる抑制剤または他の薬剤との相対的な反応性または会合を指す。   Thus, as used herein, the terms “reactive” and “non-reactive” refer to different groups on the substrate surface of the present invention when (1) such surface components and a given purpose And preferably also (2) such surface components and other reagents in a given application of such a surface (labeling reactants that may interfere with detection and Or such reagents, such as products, may interfere with such applications), as well as relative to inhibitors or other agents that interfere with the progress of the intended reaction of reactive moieties at the surface or elsewhere. Refers to reactivity or association.

このような反応性の第１の態様を用いて、表面上の反応性部分または基は典型的に、非反応性表面よりも目的の分子に対して１０倍大きい親和性、好ましくは１００倍超の親和性、より好ましくは目的の分子に対して少なくとも１０００倍大きい親和性を有する。それ故に、目的の分子と反応性表面との間の会合のレベルは同様な条件下で非反応性表面の場合よりも実質的に大きく、例えば、１０倍超、１００倍超、好ましくは１０００倍超であることは理解されよう。このようなより大きな会合には、個々の会合のより大きな頻度および／またはより大きな存続時間を含める。   With such a reactive first aspect, the reactive moiety or group on the surface is typically 10 times greater affinity for the molecule of interest than the non-reactive surface, preferably more than 100 times. And more preferably at least 1000 times greater affinity for the molecule of interest. Therefore, the level of association between the molecule of interest and the reactive surface is substantially greater than for non-reactive surfaces under similar conditions, eg, more than 10 times, more than 100 times, preferably 1000 times. It will be understood that it is super. Such larger meetings include greater frequency and / or greater lifetime of individual meetings.

表面の反応性または非反応性の第２の態様の観点からいえば、多くの場合、このような反応性は第１の態様と一致している。特に、酵素が表面の反応性部分を構成する場合、それは一般にその基質に対する高い親和性を有し、従って、例えば、上に記載されたように、非反応性部分よりもずっと大きなレベルでこのような基質と会合する。しかしながら、いくつかの場合、表面の「反応性」部分は、特定の潜在的干渉分子と会合する能力を備えなくてもよい。このような場合、吸着および非吸着という用語もまた、用いてもよい。それにもかかわらず、このような干渉分子が表面の残部と会合しないようにすることが望ましい。それ故に、非反応性表面は、このような干渉成分とのその反応性の点から定義されてもよい。   In view of the surface reactive or non-reactive second aspect, in many cases such reactivity is consistent with the first aspect. In particular, when an enzyme constitutes a reactive part of a surface, it generally has a high affinity for its substrate, and thus, for example, at a much greater level than a non-reactive part, as described above. Associates with various substrates. In some cases, however, the “reactive” portion of the surface may not have the ability to associate with a particular potential interfering molecule. In such cases, the terms adsorption and non-adsorption may also be used. Nevertheless, it is desirable to prevent such interfering molecules from associating with the rest of the surface. Therefore, a non-reactive surface may be defined in terms of its reactivity with such interfering components.

多くの適用について望ましくない干渉の主要原因は、所望の反応性部分においてではなく試薬と表面の非反応性部分との非特異的相互作用にあるので、このような場合、非反応性表面は非反応性基と特定の干渉分子との間の会合平衡定数が反応性表面と反応性分子との会合平衡定数より好ましくは１０倍低く、好ましくは１００倍（以上）低いことを一般に特徴とする場合がある。また、非反応性表面の会合反応は低い活性化バリアを特徴とし、その結果、相当する解離反応の速度論は速いことが予想され、平均結合時間は好ましくは、適用の測定プロセスの相当な時間尺度より少なくとも１０倍小さく、好ましくは１００倍以上小さい。   In such cases, the non-reactive surface is non-reactive because the major cause of unwanted interference for many applications is in the non-specific interaction of the reagent with the non-reactive portion of the surface rather than in the desired reactive portion. In general, the association equilibrium constant between the reactive group and the specific interfering molecule is preferably 10 times lower, preferably 100 times (or higher) lower than the association equilibrium constant between the reactive surface and the reactive molecule There is. Also, the association reaction of the non-reactive surface is characterized by a low activation barrier, so that the corresponding dissociation reaction kinetics are expected to be fast and the average binding time is preferably a substantial amount of time for the application measurement process. It is at least 10 times smaller than the scale, preferably 100 times smaller.

理解されるように、このような非反応性および反応性表面の特性は典型的に、例えば、ｐＨ、塩の濃度等の環境的特性を含めて、表面が置かれる特定の適用に依存する。特に好ましい態様において、環境条件には典型的に、生化学系の環境条件、例えば、約２〜約９のｐＨ、および生化学的に妥当なイオン強度の塩レベル、例えば、約０ｍＭ〜１００ｍＭが挙げられる。   As will be appreciated, the properties of such non-reactive and reactive surfaces typically depend on the particular application in which the surface is placed, including environmental properties such as pH, salt concentration, and the like. In particularly preferred embodiments, the environmental conditions typically include biochemical environmental conditions such as a pH of about 2 to about 9, and a salt level of biochemically reasonable ionic strength, such as about 0 mM to 100 mM. Can be mentioned.

図１は、ブロック線図の形の本発明の表面の簡略図を示す。示されるように、基質１００は表面１０２を備える。本明細書中の他の箇所に記載したように、表面１０２を場合により誘導体化して全活性表面１０４を提供する。以下に記載したように、場合により、基質は本質的に、全反応性表面を有することができる。次に、反応性表面１０４を処理して、比較的低い密度において反応性表面１０４に結合された反応性基１０６を含有する表面を提供する。以下に記載したように、これらの反応性部分は好ましくは、ほかの場合なら中性または非反応性の表面１０８上または中に配置される。特に好ましい態様において、反応性基１０６は、同じく図１に示されるように、付加的な反応性基、例えば、酵素１１０等の触媒成分を含有するか、または含有するようにさらに処理されてもよい。   FIG. 1 shows a simplified view of the surface of the present invention in the form of a block diagram. As shown, the substrate 100 comprises a surface 102. As described elsewhere herein, surface 102 is optionally derivatized to provide total active surface 104. As described below, in some cases, the substrate can have an essentially reactive surface. The reactive surface 104 is then treated to provide a surface containing reactive groups 106 attached to the reactive surface 104 at a relatively low density. As described below, these reactive moieties are preferably disposed on or in an otherwise neutral or non-reactive surface 108. In a particularly preferred embodiment, the reactive group 106 contains or is further processed to contain additional reactive groups, for example catalytic components such as enzyme 110, also as shown in FIG. Good.

本発明の表面の１つの重要な利点は、比較的単離した反応性基を提供することである。反応性基の単離により、隣接した反応性基からの干渉を伴わずに特定の反応性を機能させるおよび／またはモニタすることができる。これは、単一分子反応に基づいた分析を行なう時に特に重要であり、そこでは例えば、反応性分子の間で光学的に識別する（光学的単離）、異なった反応性分子においての反応の間で電気化学的に識別することができる（電気化学的単離）ように、または１つの位置の１つの反応からの化学的汚染が隣接した位置の反応に影響を与えることがある（化学的単離）場合、検出分解能は単離を必要とする。   One important advantage of the surface of the present invention is that it provides relatively isolated reactive groups. The isolation of reactive groups allows specific reactivity to function and / or be monitored without interference from adjacent reactive groups. This is particularly important when performing analyzes based on single-molecule reactions, where, for example, optically distinguishing between reactive molecules (optical isolation), the reaction of different reactive molecules Chemical contamination from one reaction at one location may affect the reaction at an adjacent location (chemically) so that it can be electrochemically distinguished between them (electrochemical isolation) In the case of isolation), the detection resolution requires isolation.

本発明の表面のさらに別の利点は、不活性である表面の残部が潜在的干渉分子、例えば、螢光性分析物または生成物と結合することができることである。特に、少数の選択された分子の結合は一連の適用のために望ましいが、表面の残部の制御されないまたは非特異的結合はしばしば非常に望ましくない。所望の反応性を有する部分をそれ自体含むか、またはいくつかの場合、所望の反応性を有する別の分子と反応させられる、所望の反応性基を選択された比較的低密度において提供することによって、表面の残部を必要に応じて選択的に処理してそれを望ましくない結合に対して有効に中性にすることができ、従って表面上の他の箇所のこのような望ましくない結合を実質的に低減するかまたは除くことができる。本発明の好ましい態様によって、このような望ましくない表面相互作用を低減するために、選択された反応性基を提供することと表面の残部の上に非反応性基を提供することとの両方が同じ工程段階において行なわれる。   Yet another advantage of the surface of the present invention is that the remainder of the surface that is inert can bind to potential interfering molecules, such as fluorescent analytes or products. In particular, binding of a small number of selected molecules is desirable for a range of applications, but uncontrolled or non-specific binding of the remainder of the surface is often highly undesirable. Providing the desired reactive group at a selected, relatively low density, including the moiety having the desired reactivity itself, or in some cases, reacted with another molecule having the desired reactivity Allows the remainder of the surface to be selectively treated as necessary to effectively neutralize it against unwanted bonds, thus substantially eliminating such unwanted bonds elsewhere on the surface. Can be reduced or eliminated. In accordance with a preferred embodiment of the present invention, both reducing selected reactive groups and providing non-reactive groups on the rest of the surface to reduce such undesirable surface interactions Performed in the same process step.

Ｂ．密度
本発明によって、表面上の選択された所望の反応性部分または化学基の低密度が特定の適用において、例えば、単一分子分析において使用するために比較的大きな領域内に、その領域の残部は実質的に非反応性のまま、単一反応性部分を提供するように設計される。典型的に、これは、当該の表面積の残部の上にほかの場合なら存在する一切の反応性基がキャップ、マスクされるか、あるいは他の方法で非反応性にされることを意味する。それ故に、低密度の反応性基が典型的に、表面積の１／１×１０^６ｎｍ^２超、約１／１００ｎｍ^２未満の反応性基の密度において基質表面上に存在する。より好ましい態様において、表面上の反応性基の密度は１／１００，０００ｎｍ^２超、１／５０，０００ｎｍ^２超、１／２０，０００ｎｍ^２超および１／１０，０００ｎｍ^２超であり、約１／１００ｎｍ^２未満、１／１０００ｎｍ^２未満、および１／１０，０００ｎｍ^２未満である。特定の好ましい適用について、密度はしばしば約１／２５００ｎｍ^２〜約１／３００ｎｍ^２の間であり、いくつかの場合、約１／１５０ｎｍ^２までである。 B. Density According to the present invention, the low density of the selected desired reactive moiety or chemical group on the surface is within a relatively large area for use in a particular application, eg, single molecule analysis, with the remainder of that area. Are designed to provide a single reactive moiety while remaining substantially non-reactive. Typically, this means that any reactive groups that are otherwise present on the remainder of the surface area of interest are capped, masked, or otherwise rendered non-reactive. Thus, low density reactive groups are typically present on the substrate surface at a density of reactive groups greater than 1/1 × 10 ⁶ nm ^{2 of} surface area and less than about 1/100 nm ² . In a more preferred embodiment, the density of reactive groups on the surface 1 / 100,000 ² greater than 1 / 50,000 ² than a 1 / 20,000 nm ² greater and 1 / 10,000nm ^2, greater than about 1 / 100 nm less than ^2, less than 1/1000 nm ^2, and 1 / 10,000nm less than ^2. For certain preferred applications, the density is often between about 1/2500 nm ² to about 1/300 nm ² and in some cases up to about 1/150 nm ² .

Ｃ．観察領域
特に好ましい態様において、本発明は、モニタリングまたは観察を受ける領域（「観察領域」）内に１個、２個、３個または少数の反応性基が存在するような密度において表面上に反応性基を提供する。観察領域内に個々のまたは少数の反応性基を提供することによって、個々の特異的反応性基とのまたはそれによって触媒された反応を特異的にモニタすることができる。このような観察領域は、例えば、モニタリングを行なっている検出システム、例えば、反応、例えば蛍光性（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）、蛍光発生性（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）、発光性、発色性または発色団反応体を製造、消費またはそれらに結合する反応をインテロゲートする（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）ために基質表面上に向けられたレーザースポットサイズ、または光学モニタリングシステムの光ファイバーのファイバー先端領域、化学電界効果トランジスタ（ＣｈｅｍＦＥＴ）センサーのゲート領域等によって決定されてもよく、またはそれらは、例えば、観察領域をさらに画定および表現する構造閉じ込めまたは光閉じ込めの使用によって別々に画定されてもよい。 C. Observation Area In a particularly preferred embodiment, the present invention reacts on the surface at a density such that there are one, two, three or a few reactive groups in the area to be monitored or observed (“observation area”). Provide sex groups. By providing individual or small numbers of reactive groups within the observation region, reactions with or catalyzed by individual specific reactive groups can be specifically monitored. Such an observation area is, for example, producing, consuming or consuming a monitoring system that is monitoring, for example, a reaction such as fluorescing, fluorogenic, luminescent, chromogenic or chromophore reactants. Depending on the laser spot size directed onto the substrate surface to interrogate the reactions that bind to them, or the fiber tip region of an optical fiber of an optical monitoring system, the gate region of a chemical field effect transistor (ChemFET) sensor, etc. They may be determined or they may be defined separately, for example by the use of structural confinement or optical confinement that further defines and represents the viewing region.

特に好ましい観察領域の１つの例は、ゼロモード導波路（ＺＭＷ）などの光閉じ込めを備える。ゼロモード導波路、ならびに単一分子分析においてのそれらの使用は、米国特許第６，９１７，７２６号明細書（その内容を参照によって全ての目的のためにその全体において本願明細書に組み入れるものとする）においてかなり詳細に記載されている。このようなＺＭＷは、極度に小さい、例えば、ゼプトリットルのオーダーである観察体積を提供することができるので、単一分子分析において使用するために利用されている。このような場合、観察領域は一般に、観察体積の断面積、特に、当該の表面を横断する観察体積のその部分を含める。   One example of a particularly preferred viewing area comprises optical confinement such as a zero mode waveguide (ZMW). Zero mode waveguides, as well as their use in single molecule analysis, are described in US Pat. No. 6,917,726, the contents of which are hereby incorporated by reference in their entirety for all purposes. Are described in considerable detail. Such ZMWs are utilized for use in single molecule analysis because they can provide extremely small observation volumes, for example on the order of zeptoliters. In such cases, the observation region generally includes the cross-sectional area of the observation volume, in particular that portion of the observation volume that traverses the surface.

好ましい態様において、本発明は、導波路の下部表面上に１つまたはごく少数の反応性基を提供する。このような場合、密度は、反応性基の数を導波路の下部表面の表面積によって割った値によって測定される。従って、純粋に例示目的のために、円形導波路が１０ｎｍの半径を有し、その下部表面上に固定化された単一反応性分子を有する場合、反応性基の密度は約１／３１４ｎｍ^２である。従って、ゼロモード導波路または他の観察領域を用いて、および例示目的のために、約１０〜約１００ｎｍの半径を有する領域、または３１４ｎｍ^２〜約３１，４１６ｎｍ^２の領域それぞれに、１、２、３または１０個までの反応性分子の密度において存在する反応性分子（すなわち、より大きな領域により多数の分子）はここにに記載された密度によって包含されることは理解されよう。好ましい態様において、観察領域につき１、２または３個の分子が一般に好ましい。 In a preferred embodiment, the present invention provides one or very few reactive groups on the lower surface of the waveguide. In such a case, the density is measured by the number of reactive groups divided by the surface area of the lower surface of the waveguide. Thus, purely for illustrative purposes, if the circular waveguide has a radius of 10 nm and has a single reactive molecule immobilized on its lower surface, the density of reactive groups is about 1/314 nm ^2. It is. Thus, using a zero mode waveguide or other viewing region, and for illustrative purposes, a region having a radius of about 10 to about 100 nm, or a region of 314 nm ² to about 31,416 nm ² respectively, 1, 2 It will be appreciated that reactive molecules present at a density of up to 3 or 10 reactive molecules (ie, a larger number of molecules by a larger area) are encompassed by the densities described herein. In preferred embodiments, one, two or three molecules per observation region are generally preferred.

多くの場合、ＺＭＷは１０、１００、１０００、１０，０００以上の導波路のアレイにおいて提供される。それ故に、各々および全てのＺＭＷ内に単一反応性基、例えば、酵素を固定化することは難しい。しかしながら、希釈ベースのプロトコルは、酵素によって占有されていないいくつかのＺＭＷを生じるが、本発明の表面と組みあわされるとき、一般に、その中に配置された１つだけまたはほかの場合なら所望の数の酵素を有する大部分の占有ＺＭＷ（その中に固定化された少なくとも１つの酵素分子を有するＺＭＷ）をもたらす。特に、その中に配置された酵素のような反応性分子を有するＺＭＷの場合、典型的に、占有ＺＭＷの５０％超が、その中に配置された単一または所望の数の反応性分子、例えば、特定のタイプの酵素分子を有し、好ましくは、占有ＺＭＷの７５％超、より好ましくは約９０％超およびさらに９５％超が、その中に配置された所望の数の反応性分子を有し、それは特に好ましい態様において、与えられたタイプの１、２、３または１０個までの反応性分子であってもよい。他の箇所に記載したように、いくつかの状況において、また、異なった反応性分子を所望の密度において提供して混合官能価の表面を提供してもよい。本発明によって、参照される反応性基のタイプ、例えば、触媒または結合に応じて、単一占有ＺＭＷ上、またはアレイの多数のＺＭＷ上の密度の決定が行なわれてもよいことは理解されよう。   In many cases, the ZMW is provided in an array of 10, 100, 1000, 10,000 or more waveguides. Therefore, it is difficult to immobilize a single reactive group, such as an enzyme, within each and every ZMW. However, the dilution-based protocol yields some ZMW that is not occupied by the enzyme, but when combined with the surface of the present invention, generally only one or otherwise placed therein is desired. This results in the most occupied ZMW with a number of enzymes (ZMW with at least one enzyme molecule immobilized therein). In particular, in the case of a ZMW having a reactive molecule such as an enzyme disposed therein, typically more than 50% of the occupied ZMW comprises a single or desired number of reactive molecules disposed therein, For example, having a particular type of enzyme molecule, preferably more than 75% of the occupied ZMW, more preferably more than about 90% and even more than 95% have the desired number of reactive molecules disposed therein. Having, in particularly preferred embodiments, up to 1, 2, 3 or up to 10 reactive molecules of a given type. As described elsewhere, in some situations and different reactive molecules may be provided at a desired density to provide a mixed functionality surface. It will be appreciated that the present invention may determine the density on a single occupied ZMW or on multiple ZMWs in an array, depending on the type of reactive group referred to, eg, catalyst or binding. .

Ｄ．特定の反応性基
本発明の表面上に存在する反応性基または部分は、外からの添加によって材料または基質の表面に結合されるかまたはこのような表面上に本来存在している、化学活性および／または生物活性を有する広範囲の異なったタイプの反応性基を含有する。これらの反応性基は、他の化学基に対する結合活性、例えば、特異的または非特異的相互作用によって、共有結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって別の化学的部分を結合する能力を有する表面上の基を包含する。表面上に広範囲の反応性基を提供することは本技術分野において容易に理解されるが、例えば、イオン性官能基、多イオン基、エポキシド、アミド、チオール、疎水性基、例えば、脂肪族基、単環式または多環式基等、例えば、逆相および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）において一般に用いられる場合、スタウディンガーｌｉｇａｔｉｏｎ基（例えば、リン（Ｌｉｎ）ら著、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００５年）、１２７：２６８６〜９５ページを参照のこと）、化学選択的アジド−アセチレン結合を用いるクリックケミストリーカップリング（デヴェラジ（Ｄｅｖｅｒａｊ）ら著、ＪＡＣＳ ２００５年、１２７：８６００〜８６０１ページ；ルマーストーファー（Ｌｕｍｍｅｒｓｔｏｒｆｅｒ）ら著、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ（２００４年）１０８：３９６３〜３９６６ページ、およびコールマン（Ｃｏｌｌｍａｎ）ら著、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）（２００４年）２０：１０５１〜１０５３ページ（その内容の各々を参照によって全ての目的のためにその全体において本願明細書に組み入れるものとする）を参照のこと）および非特異的に他の基と会合するかまたは結合されうるその他の基などがある。さらに、表面上の特異的結合基、例えば、相補的結合パートナーを特異的に認識する基、例えば、相補的核酸対、抗体−エピトープ対、特異的高分子構造、例えば、タンパク質の認識配列を認識する結合ペプチド、ペプチドまたは核酸、レクチン、キレーター、ビオチン−アビジン結合等の使用が記載されている。 D. Specific reactive groups Reactive groups or moieties present on the surface of the present invention are bound to or inherently present on the surface of the material or substrate by external addition. And / or contains a wide variety of different types of reactive groups having biological activity. These reactive groups have binding activity to other chemical groups, such as the ability to bind another chemical moiety by covalent bonds, van der Waals forces, hydrophobic interactions, etc., by specific or non-specific interactions. Including groups on the surface having Providing a wide range of reactive groups on the surface is readily understood in the art, but includes, for example, ionic functional groups, polyionic groups, epoxides, amides, thiols, hydrophobic groups, such as aliphatic groups Monocyclic or polycyclic groups, such as Staudinger ligation groups (see, for example, Lin et al., J. Biol.), As commonly used in reverse phase and / or hydrophobic interaction chromatography (HIC). Am. Chem. Soc. (2005), 127: 2686-95), click chemistry coupling using a chemoselective azido-acetylene bond (Deveraj et al., JACS 2005, 127: 8600-8601; Lummerstorf et al., J. MoI. Phys.Chem.B (2004) 108: 3963-3966, and by Collman et al., Langmuir (2004) 20: 1051-1053 (each of which is incorporated by reference for all purposes) For example) and other groups that can non-specifically associate with or be bound to other groups. In addition, specific binding groups on the surface, such as groups that specifically recognize complementary binding partners, such as complementary nucleic acid pairs, antibody-epitope pairs, specific macromolecular structures, such as protein recognition sequences, are recognized. The use of binding peptides, peptides or nucleic acids, lectins, chelators, biotin-avidin bonds and the like is described.

反応性基の数および／または密度の同定は一般に、リポーター分子を用いて確認されてもよく、それは多くの場合、反応性基自体であってもよい。特に、例として、その酵素の活性の検定によって表面積に結合された酵素分子の数を確認することができる。同じく、他の反応性基が他の方法、例えば、標識基の滴定、カップリング等によって定量化されてもよい。   Identification of the number and / or density of reactive groups may generally be confirmed using a reporter molecule, which in many cases may be the reactive group itself. In particular, by way of example, the number of enzyme molecules bound to the surface area can be ascertained by assaying the activity of the enzyme. Similarly, other reactive groups may be quantified by other methods, such as titration of label groups, coupling, and the like.

本明細書中で用いられるとき、反応性基および非反応性基の両方とも、表面がそこで適用されると共に反応性、または非反応性が明らかである環境を想定する。理解されるように、異なった基が特定の環境において反応性であり他の環境において非反応性であってもよく、本発明は、一般に実施されるとき、広範囲の異なった環境においての適用可能性を想定する。考察を簡単にするために、好ましい態様において、本発明の表面は非常にしばしば、生物学的または生化学的反応において適用され、そのままで適切な環境下におかれる。このような環境には典型的に、約２〜約９、好ましくは約５〜約８のｐＨの範囲である生化学的に妥当なイオン強度を有する水性系があるが、それは、実施される反応に応じて変化してもよい。   As used herein, both reactive and non-reactive groups assume an environment where the surface is applied there and reactive or non-reactive is evident. As will be appreciated, different groups may be reactive in a particular environment and non-reactive in other environments, and the present invention is applicable in a wide variety of different environments when practiced in general. Assume gender. For ease of discussion, in preferred embodiments, the surfaces of the present invention are very often applied in biological or biochemical reactions and left in place in a suitable environment. Such environments typically have aqueous systems with biochemically relevant ionic strengths that are in the pH range of about 2 to about 9, preferably about 5 to about 8, but are implemented. It may vary depending on the reaction.

特定の好ましい態様において、反応性化学基にはまた、触媒活性を有する基、例えば、結合以外によって別の部分と相互作用してその部分を変える能力、すなわち、酵素活性、触媒電荷移動活性等を有する基がある。特に好ましい態様において、本発明の活性化学基には、化学的結合基、場合によりおよびさらに、触媒基があり、そこで結合基を用いて、本発明によって触媒基を所定の表面に結合する。例えば、酵素または他の触媒基が表面に中間結合基またはリンカー基を介して結合されてもよく、そして次に、それは、所望の密度において表面材料上に配置されている反応性基に直接に結合される。   In certain preferred embodiments, the reactive chemical group also includes a group having catalytic activity, e.g., the ability to interact with and alter another moiety other than by attachment, i.e., enzyme activity, catalytic charge transfer activity, etc. There are groups that have. In a particularly preferred embodiment, the active chemical group of the present invention includes a chemical linking group, optionally and further, a catalytic group, where the linking group is used to attach the catalytic group to a given surface according to the present invention. For example, an enzyme or other catalytic group may be attached to the surface via an intermediate linking group or linker group, and then it is directly attached to the reactive group located on the surface material at the desired density. Combined.

多数の異なった反応性基が本発明によって用いられてもよく、ある程度、用いられる表面に依存することがあり、および反応性基が低密度の一般的または非特異的結合または会合機能、低密度の特異的結合機能、または低密度触媒機能を提供することが意図されるかどうかに依存することがある。   A number of different reactive groups may be used by the present invention, may depend to some extent on the surface used, and the reactive groups have a low density general or non-specific binding or association function, low density Depending on whether it is intended to provide a specific binding function or low density catalytic function.

例えば、シリカベースの表面、例えば、ガラス、石英、溶融シリカ、ケイ素等については、反応性基は、例えばエポキシシラン、アミノシラン、活性化カルボン酸シラン、イソシアナトシラン、アルデヒドシラン、メルカプトシラン、ビニルシラン、ヒドロキシ末端シラン、アクリレートシラン等を用いて、表面のシラン処理によって提供されてもよい。このような処理は、例えば、低密度の非特異的会合基の点からみて反応性基を生じることができ、またはそれらは、最終反応性基として特異的結合基または触媒基をもたらすかまたはさらに処理されて提供することができる。あるいはまたはさらに、他の無機または有機反応性基が表面上に提供されてもよい。シリカベースの基質のような無機表面の場合、このような付加的な材料は、例えば、シラン化学を用いて、すなわち、上に記載されたように、中間化学結合を介して表面に結合されてもよい。これらの付加的な材料には、小分子、例えば、イオン性基、金属イオン、小さな有機基、ならびにより大きなまたはポリマー／オリゴマー分子、例えば、有機ポリマーなどが挙げられる。考察を簡単にするために、同様な化学構造の多数のサブユニットを含有する分子を指すためにポリマーおよびオリゴマーは本明細書において交換可能に用いられる。   For example, for silica-based surfaces such as glass, quartz, fused silica, silicon, etc., the reactive groups are, for example, epoxy silane, amino silane, activated carboxylate silane, isocyanato silane, aldehyde silane, mercapto silane, vinyl silane, It may be provided by surface silane treatment using hydroxy-terminated silanes, acrylate silanes, and the like. Such treatment can, for example, yield reactive groups in terms of low density non-specific associating groups, or they can provide specific binding or catalytic groups as the final reactive group or Can be processed and provided. Alternatively or additionally, other inorganic or organic reactive groups may be provided on the surface. In the case of inorganic surfaces such as silica-based substrates, such additional materials can be bound to the surface using, for example, silane chemistry, i.e., via intermediate chemical bonds, as described above. Also good. These additional materials include small molecules such as ionic groups, metal ions, small organic groups, and larger or polymer / oligomer molecules such as organic polymers. For ease of discussion, polymers and oligomers are used interchangeably herein to refer to molecules that contain multiple subunits of similar chemical structure.

特に好ましい態様において、より長いリンカー分子、および好ましくは有機リンカー分子を用いて反応性基を表面に連結して、例えば、表面と反応性基との間により大きな空間を提供することによってさらなる柔軟性を結合全体に提供してもよい。特に、所望の反応性基を一方の端に有するポリマーまたはオリゴマー鎖は、ガラスの表面の場合、例えば、シラン結合を介して他方の端において表面に連結されてもよい。ポリマーリンカーの異なったタイプおよび長さを選択することによって、表面の性質、例えば、異なった基／領域の相対的な疎水性、表面に対する相対的な距離、全体または局部表面電荷等をさらに調節することができる。有用なポリマーリンカーの例には、例えば、セルロースポリマー（ヒドロキシエチル−セルロース、ヒドロキシプロピル−セルロース等）、アルカンまたはアケニルリンカー、ポリアルコール（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）など）、アクリルポリマー（ポリアクリルアミド、ポリアクリレート等）、ポリエチレンポリマー（ポリエチレンオキシドなど）、バイオポリマー（ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン等のようなポリアミノ酸など）、他の炭水化物ポリマー（キサンタン、アルギナート、デキストランなど）、合成ポリアニオンまたはポリカチオン（ポリアクリル酸、カルボキシル末端デンドリマー、ポリエチレンイミン等）などがある。また、用いられたリンカーのタイプに応じて、リンカーは、それに結合した所望の反応性基をさらに含有してもよい。   In particularly preferred embodiments, longer linker molecules, and preferably organic linker molecules, are used to link the reactive group to the surface, for example by providing more space between the surface and the reactive group. May be provided for the entire bond. In particular, the polymer or oligomer chain having the desired reactive group at one end may be linked to the surface at the other end, for example via a silane bond, in the case of a glass surface. By further selecting the different types and lengths of polymer linkers, the surface properties such as relative hydrophobicity of different groups / regions, relative distance to the surface, overall or local surface charge, etc. are further controlled be able to. Examples of useful polymer linkers include, for example, cellulose polymers (hydroxyethyl-cellulose, hydroxypropyl-cellulose, etc.), alkane or alkenyl linkers, polyalcohols (polyethylene glycol (PEG), polyvinyl alcohol (PVA), etc.), acrylics Polymers (polyacrylamide, polyacrylate, etc.), polyethylene polymers (polyethylene oxide, etc.), biopolymers (polyamino acids such as polylysine, polyarginine, polyhistidine, etc.), other carbohydrate polymers (xanthan, alginate, dextran, etc.), There are synthetic polyanions or polycations (polyacrylic acid, carboxyl-terminated dendrimers, polyethyleneimine, etc.). Also, depending on the type of linker used, the linker may further contain a desired reactive group attached thereto.

反応性基の、表面への適用の点から一般に記載されるが、活性基が所望の反応性基に対して不活性またはそれほど反応性でない前駆物質として表面に適用され、次いで活性化されて所望の反応性基を生じることができることは理解されよう。特に、反応性基は、目的の反応性部分をブロックする、例えば、光分解性キャッピング基、温度感受性キャッピング基または酸または塩基不安定キャッピング基を有する光、熱的または化学的に活性化可能な前駆基として提供されてもよい。次に、その基を例えば、光、熱的または化学的処理を用いて選択的に活性化して所望の表面を生じてもよい。様々なこのような基は本技術分野に公知であり、例えば、ギリア（Ｇｕｉｌｌｉｅｒ）ら著、Ｌｉｎｋｅｒｓ ａｎｄ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１００：２０９１〜２１５７ページ（２０００年）に記載されている。   Although generally described in terms of application of a reactive group to a surface, the active group is applied to the surface as a precursor that is inert or less reactive to the desired reactive group, and then activated to be desired It will be appreciated that the following reactive groups can be generated. In particular, the reactive group can be activated by light, thermal or chemical activation, for example having a photodegradable capping group, a temperature sensitive capping group or an acid or base labile capping group, blocking the reactive moiety of interest. It may be provided as a precursor group. The group may then be selectively activated using, for example, light, thermal or chemical treatment to produce the desired surface. A variety of such groups are known in the art, see, for example, Guillier et al., Linkers and Cleavage Strategies in Solid Phase Organic Synthesis and Combinatorial Chemistry, Chem. Rev. 100: 2091-2157 (2000).

上に指摘したように、表面上の反応性基は、前述の特異的または非特異的結合部分から成ってもよく、または表面に直接に、上述の特異的または非特異的結合または会合基を介して、そして次にそれらは表面に直接にまたは間接的に結合されるか、または表面に結合された付加的な特異的または非特異的結合基を介してのいずれかで表面に結合される触媒基を含めてもよい。触媒基は、触媒化学物質、例えば、ニッケル、亜鉛、チタン、二酸化チタン、白金、金等の触媒金属または金属含有化合物を含めてもよい。しかしながら、好ましい態様において、本発明の表面上に所望の低密度において存在する触媒基は、例えば、核酸、核酸類似体、生物学的結合化合物、例えば、ペプチドまたはタンパク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン等、および酵素などの生物活性分子を含む。核酸または核酸類似体の場合、このような表面は、例えば、目的の核酸セグメントのための核酸の混合物をインテロゲートするための様々な特異的結合検定において有用である（例えば、米国特許第５，１５３，８５４号明細書、米国特許第５，４０５，７８３号明細書、および米国特許第６，２６１，７７６号明細書を参照のこと）。同じく、結合タンパク質およびペプチドはしばしば、目的の所定の分子の存在または不在について生物学的試料をインテロゲートするのに有用である。典型的にこのようなタンパク質またはペプチドは、抗体またはこのような抗体のそれらの結合フラグメントまたは結合エピトープに取り入れられる。特に好ましい態様において、触媒基を有する本発明の表面は、目的の酵素を含み、その酵素活性をモニタするために用いられる。多種多様な酵素が定期的にモニタされ、生物学的、生化学的および製薬研究および診断において検出される。好ましい酵素の例には、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレアーゼ（エンドおよびエキソヌクレアーゼ）、リガーゼなどのＤＮＡ配列決定適用のような遺伝分析においてモニタされた酵素、およびキナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、リパーゼ等などの様々な他の製薬上および診断上妥当な反応に関与する酵素などがある。   As pointed out above, the reactive groups on the surface may consist of the aforementioned specific or non-specific binding moieties, or have the specific or non-specific binding or association groups described above directly on the surface. And then they are bound to the surface either directly or indirectly to the surface, or via additional specific or non-specific binding groups bound to the surface. A catalytic group may be included. The catalytic group may include catalytic chemicals, such as catalytic metals or metal-containing compounds such as nickel, zinc, titanium, titanium dioxide, platinum, gold. However, in preferred embodiments, the catalytic groups present at the desired low density on the surface of the present invention include, for example, nucleic acids, nucleic acid analogs, biological binding compounds such as peptides or proteins, biotin, avidin, streptavidin, and the like. And biologically active molecules such as enzymes. In the case of nucleic acids or nucleic acid analogs, such surfaces are useful, for example, in various specific binding assays for interrogating a mixture of nucleic acids for a nucleic acid segment of interest (eg, US Pat. , 153,854, US Pat. No. 5,405,783, and US Pat. No. 6,261,776). Similarly, binding proteins and peptides are often useful for interrogating biological samples for the presence or absence of a given molecule of interest. Typically such proteins or peptides are incorporated into antibodies or their binding fragments or binding epitopes of such antibodies. In a particularly preferred embodiment, the surface of the invention having a catalytic group contains the enzyme of interest and is used to monitor its enzyme activity. A wide variety of enzymes are regularly monitored and detected in biological, biochemical and pharmaceutical research and diagnostics. Examples of preferred enzymes include polymerases such as DNA and RNA polymerases, enzymes monitored in genetic analysis such as DNA sequencing applications such as nucleases (endo and exonucleases), ligases, and kinases, phosphatases, proteases, lipases There are a variety of other pharmaceutical and diagnostically relevant enzymes such as and the like.

本発明による表面上の酵素の固定化に関して、本発明の表面のさらに別の利点は、本明細書の他の箇所に示された組合せられた利点から生じる。特に、酵素のような生体分子を、特異的結合を介して選択的に固定化して、表面上の他の箇所のそれらの吸着を排除するとき、表面上に存在する生体分子の活性をより選択的に維持することができるが、吸着が存在するだけで、かなりの集団の不活性またはそれほど活性でない分子を生じた可能性がある。従って、得られた表面、存在する生体分子は、低密度において存在しながら、それにもかかわらず、比較的高い特異的活性、例えば、目的の活性生体分子の数対存在する生体分子の総数）において存在する。   With respect to the immobilization of enzymes on the surface according to the present invention, yet another advantage of the surface of the present invention arises from the combined advantages shown elsewhere herein. In particular, when biomolecules such as enzymes are selectively immobilized via specific binding to eliminate their adsorption elsewhere on the surface, the activity of the biomolecule present on the surface is more selective Can be sustained, but the presence of adsorption alone may have resulted in a significant population of inactive or less active molecules. Thus, the resulting surface, the biomolecule present, is present at a low density, but nevertheless at a relatively high specific activity, eg, the number of active biomolecules of interest versus the total number of biomolecules present Exists.

特定の触媒反応性基、例えば、酵素の場合、このような反応性基の密度は、固定化された不活性分子とは対照的に活性分子の密度をさらに想定する。例えば、比較的低密度において表面上に固定化された酵素の場合、このような密度は典型的に、固定化された酵素の特異的活性、例えば、固定化プロセスの効率の分配を包含する。従って、固定化プロセスが５０％の生存または活性酵素しか生じない場合、活性およびその他の酵素分子の全密度は一般に、活性分子の密度の２倍である。したがって、このような反応性基の所望の密度を確認するとき、活性分子を堆積させるときに固定化プロセスの相対的な効率を評価することがしばしば望ましい。本明細書中の他の箇所に記載したように、本発明の方法の特定の態様は、表面上に固定化された酵素の非常に高い特異的活性を保持するのに特に有用であり（実施例を参照のこと）、好ましくは、２０％超、３０％超、より好ましくは、５０％超およびさらにより好ましい態様において、７５％超、いくつかの場合９０％超の特異的活性（活性を有する固定化された酵素の率）を提供する。   In the case of certain catalytic reactive groups, such as enzymes, the density of such reactive groups further assumes the density of active molecules as opposed to immobilized inert molecules. For example, in the case of an enzyme immobilized on a surface at a relatively low density, such density typically includes a distribution of the specific activity of the immobilized enzyme, eg, the efficiency of the immobilization process. Thus, if the immobilization process results in only 50% viable or active enzyme, the total density of active and other enzyme molecules is generally twice the density of active molecules. Thus, when ascertaining the desired density of such reactive groups, it is often desirable to assess the relative efficiency of the immobilization process when depositing active molecules. As described elsewhere herein, certain embodiments of the methods of the invention are particularly useful for retaining the very high specific activity of an enzyme immobilized on a surface. See examples), preferably more than 20%, more than 30%, more preferably more than 50% and in an even more preferred embodiment more than 75%, in some cases more than 90% specific activity (activity Ratio of immobilized enzyme).

本発明の基質上の低密度の所望の反応性基と対照的に、当該の表面の残部が非反応性であることも典型的に好ましい。前に記載したように、このような非反応性は、反応性基と比較した時に目的の分子に対する実質的により低い親和性を有するが、さらに、表面の最終適用を場合によっては妨げる、分子との過度の結合または会合がないのが好ましい。例えば、付加的な触媒基が表面上の所望の反応性基の所望の低密度集団に結合される場合、このような触媒基は特異的にまたは非特異的に表面の残部と実質的に会合しないことが一般に望ましい。同じく、適用において、付加的な化学基が本発明の表面にさらされる場合、残部または非反応性表面がこのような材料との反応を触媒しないかまたは目的の反応性基の反応に対応しない不都合なまたはノイズのある信号をもたらす場合がある材料と結合あるいは他の方法で会合しないことが一般に望ましい。   In contrast to the low density of desired reactive groups on the substrate of the present invention, it is also typically preferred that the remainder of the surface is non-reactive. As described previously, such non-reactivity has a substantially lower affinity for the molecule of interest when compared to the reactive group, but additionally, molecules that may interfere with the final application of the surface. Preferably, there is no excessive binding or association. For example, when additional catalytic groups are attached to the desired low density population of desired reactive groups on the surface, such catalytic groups are specifically or non-specifically associated with the rest of the surface. It is generally desirable not to. Similarly, in application, if additional chemical groups are exposed to the surface of the present invention, the remaining or non-reactive surface does not catalyze the reaction with such materials or does not accommodate the reaction of the desired reactive group It is generally desirable not to bind or otherwise associate with material that may result in a clean or noisy signal.

蛍光性単一分子検定の場合、特に望ましいことの１つは、未反応蛍光性試薬または蛍光性生成物と、目的の反応性基、例えば、酵素以外の表面との過度の（例えば、時間および／または頻度において）非特異的結合または会合または「スティッキング」を避けることであり、このような会合は、時間が経つにつれて誤信号の生成、バックグラウンド信号ノイズおよび信号ノイズ発生につながることがある。一般に、化合物と表面の非反応性部分との非特異的会合が溶液中のこのような化合物の拡散速度に比較できることが望ましい。観察領域または光閉じ込めにおいて観察されている標識化合物の点から言い直すと、化合物と非反応性表面との非特異的会合から生じる信号は典型的に、与えられた分析のための流体の観察領域または体積へのおよびからのこのような化合物のランダム拡散から生じる信号と同じかまたは同様なオーダー、例えば、このような拡散に基づいた信号の１００倍未満および好ましくはこのような拡散に基づいた信号の１０倍未満（時間および頻度のどちらかまたは両方において）である。場合によっては所望の適用を妨げることがある蛍光性化合物または他の信号発生化合物の点から、このような化合物と非反応性表面との会合から生じた一切の信号（ここで「非特異的信号発生」と称される）は、反応性基によって発生された信号よりも少なくとも１０倍低く、好ましくは１００倍超少なく、さらにより好ましくは、反応性分子の作用、例えば、所望の酵素活性から生じた信号（「特異的信号発生」）よりも１０００超少ないことが一般に望ましい。非特異的信号発生のこのような低減には、頻度または時間のどちらかまたは両方の低減、例えば、信号事象の数の低減またはこのような非特異的信号発生から出る信号の総量の低減などがある。   In the case of fluorescent single molecule assays, one particularly desirable is that excessive (eg time and time) between unreacted fluorescent reagent or product and the reactive group of interest, eg a surface other than an enzyme. Avoiding non-specific binding or association (or “sticking”) (in frequency), such association can lead to false signal generation, background signal noise and signal noise generation over time. In general, it is desirable that the nonspecific association of a compound with a non-reactive portion of the surface can be compared to the diffusion rate of such compound in solution. In other words, in terms of the observation compound or the labeled compound being observed in optical confinement, the signal resulting from the non-specific association of the compound with the non-reactive surface is typically the observation region of the fluid for a given analysis or In the same or similar order as the signal resulting from random diffusion of such compounds into and out of the volume, e.g. less than 100 times the signal based on such diffusion and preferably of signals based on such diffusion Less than 10 times (in time and / or frequency). In view of fluorescent compounds or other signal-generating compounds that may interfere with the desired application in some cases, any signals resulting from the association of such compounds with non-reactive surfaces (here “non-specific signals” Generation ”) is at least 10 times lower than the signal generated by the reactive group, preferably more than 100 times less, and even more preferably it results from the action of the reactive molecule, eg the desired enzyme activity. It is generally desirable to have more than 1000 less than the signal (“specific signal generation”). Such reductions in non-specific signal generation include a reduction in either frequency or time, or both, such as a reduction in the number of signal events or a reduction in the total amount of signals emanating from such non-specific signal generation. is there.

様々な非反応性基が表面の残部上で用いられてもよく、それはまた、表面がさらされる環境に依存する。しかしながら、一般に、例えば、非反応性アルコールおよびポリオールにおいて、末端ヒドロキシル基、メチル基、エチル基、環状アルキル基、メトキシ基、ヒドロキシル基の他、不活化カルボキシレート基、酸化エチレン、スルホレン基、親水性アクリルアミド等。   A variety of non-reactive groups may be used on the remainder of the surface, which also depends on the environment to which the surface is exposed. However, in general, for example, in non-reactive alcohols and polyols, in addition to terminal hydroxyl groups, methyl groups, ethyl groups, cyclic alkyl groups, methoxy groups, hydroxyl groups, inactivated carboxylate groups, ethylene oxide, sulfolene groups, hydrophilic Acrylamide etc.

Ｅ．層状表面／厚さ
何度も上に記載したように、反応性基は、上に示したように、基質の表面に直接に結合されるか、または所望の反応性基と支持材料の固有または自然表面との間に１つまたは複数の中間分子層を提供する１つまたは複数の中間連結基を介して結合されてもよい。再び述べると、表面の各成分は、反応性であろうと非反応性であろうと、成分の１つまたは複数の層から得られ、所望の得られた表面成分を提供することができる。 E. Layered Surface / Thickness As described above many times, the reactive groups are bound directly to the surface of the substrate, as indicated above, or the intrinsic or desired nature of the reactive group and the support material. It may be linked via one or more intermediate linking groups that provide one or more intermediate molecular layers with the natural surface. Again, each component of the surface, whether reactive or non-reactive, can be obtained from one or more layers of the component to provide the desired resulting surface component.

例えば、その最も簡単な形において、反応性および非反応性基の両方を基質の自然表面に直接に結合して本発明の低密度反応性表面を生じてもよい。あるいは、連結基の１つまたは複数の層を表面に加えて層状表面を生じてもよく、次に、それに反応性および非反応性基を結合して所望の表面を生じる。これらの場合のどちらにおいても、表面上に反応性および非反応性基を配分するためのプロセスが最終層の堆積において行なわれる。   For example, in its simplest form, both reactive and non-reactive groups may be attached directly to the natural surface of the substrate to produce the low density reactive surface of the present invention. Alternatively, one or more layers of linking groups may be added to the surface to produce a layered surface, which is then combined with reactive and non-reactive groups to produce the desired surface. In either of these cases, a process for distributing reactive and non-reactive groups on the surface is performed in the final layer deposition.

さらにより複雑な構成において、最終表面層上の反応性および非反応性基の配分は、表面上の以前の層の選択および堆積において行なわれてもよい。言い換えれば、第１の低密度反応性層を用いて後続のまたは所望の低密度反応性層の堆積を実施してもよい。例として、低密度の非特異的結合基を含有する第１の層は、例えば、触媒基が結合基に結合する場合、低密度の触媒基を有する後続層の堆積のための鋳型として用いられてもよい。さらに別の態様において、このような配分は、堆積プロセスをより精密に調整するために、多数の層の上で行なわれてもよい。例えば、結合基および非結合基の混合物を例えば含有する第１の配分された層が、さらなる配分を有する付加的な層の下にあってもよい。また、このような複雑な層は、ほかの場合なら非反応性の表面上に多数の異なったタイプの反応性基、例えば、異なった酵素、異なった核酸、異なった抗体等を含有する本発明による表面を堆積するのに特に有用である。   In even more complex configurations, the distribution of reactive and non-reactive groups on the final surface layer may be performed in the selection and deposition of previous layers on the surface. In other words, a subsequent or desired low density reactive layer may be deposited using the first low density reactive layer. As an example, a first layer containing low density non-specific binding groups can be used as a template for the deposition of subsequent layers with low density catalytic groups, for example, where the catalytic groups are bound to binding groups. May be. In yet another aspect, such distribution may be performed on multiple layers in order to fine tune the deposition process. For example, a first distributed layer containing, for example, a mixture of linking and non-bonding groups may be below an additional layer with further distribution. Also, such complex layers contain many different types of reactive groups, such as different enzymes, different nucleic acids, different antibodies, etc. on an otherwise non-reactive surface. Particularly useful for depositing surfaces by

前述の内容によって、いくつかの場合、表面の固有の性質が反応性または中間基をそれにカップリングするのを可能にすることがあり、多くの場合、表面を、そのままで用いるために、または中間連結基にさらにカップリングするために、最初に誘導体化して反応性基を提供しなければならない。多くの場合、誘導体化プロセスは、所望の反応性基を誘導体化化学物質の成分として提供することによって反応性基のカップリングと同時であってもよい。このような場合において、目的の反応性基を有する誘導体化剤は比較的低密度において表面に結合される。典型的に、および以下により詳細に示されるように、これは、表面を改質するその能力以外に実質的に非反応性である誘導体化剤を用いて適切な比で目的の反応性基を有する誘導体化剤を提供することによって行なわれてもよい。   Depending on the foregoing, in some cases the inherent nature of the surface may allow a reactive or intermediate group to be coupled to it, and in many cases the surface is used as is or intermediate In order to further couple to the linking group, it must first be derivatized to provide a reactive group. In many cases, the derivatization process may be simultaneous with the coupling of the reactive groups by providing the desired reactive group as a component of the derivatization chemical. In such cases, the derivatizing agent having the desired reactive group is bound to the surface at a relatively low density. Typically, and as will be shown in more detail below, this involves the desired reactive group in an appropriate ratio with a derivatizing agent that is substantially non-reactive other than its ability to modify the surface. It may be performed by providing a derivatizing agent having.

別の構成において、全表面を前述の反応性基のいずれかを用いて誘導体化して、中間連結基が結合されてもよい反応性表面を提供してもよい。このような場合、中間連結基は、目的の反応性基を有する連結基および非反応性連結基の比において提供されるが、次に反応性表面と接触されて最終表面上に目的の反応性基の所望の密度を提供する。理解されるように、中間反応性基またはカップリング基は、中間基へのその最終基のカップリングのレベルに応じて、所望の最終反応性基が提供される密度よりも高い密度において提供されてもよい。例えば、最終反応性基が１０の中間基ごとに１つの結合の率において中間カップリング基に結合することが予想される場合（または計画される場合でも）、このような中間反応性基は１０倍高いレベルにおいて存在してもよい。典型的に、このような中間反応性基を用いるとき、それらの密度は、最終反応性基よりも約１〜約１０００倍大きく、しばしば約１〜約１００倍、いくつかの場合、最終反応性基、例えば、酵素の密度よりも１〜約１０倍大きい。   In another configuration, the entire surface may be derivatized with any of the aforementioned reactive groups to provide a reactive surface to which intermediate linking groups may be attached. In such cases, the intermediate linking group is provided in a ratio of linking group having the desired reactive group and non-reactive linking group, but is then contacted with the reactive surface to provide the desired reactivity on the final surface. Provides the desired density of the group. As will be appreciated, the intermediate reactive group or coupling group is provided at a higher density than the density at which the desired final reactive group is provided, depending on the level of coupling of that final group to the intermediate group. May be. For example, if the final reactive group is expected (or even planned) to bind to an intermediate coupling group at a rate of one bond for every 10 intermediate groups, such intermediate reactive groups are 10 It may be present at twice the level. Typically, when using such intermediate reactive groups, their density is about 1 to about 1000 times greater than the final reactive group, often about 1 to about 100 times, in some cases final reactive 1 to about 10 times greater than the density of the group, eg, enzyme.

このような「層状」表面の１つの実施例が図２に図解的に示され、それは、付加的な化学物質が結合されてもよい全反応性表面２０４を提供するために処理または誘導体化される初期または固有表面２０２を有する基質２００を提供する。反応性表面２０４は、リンカー／スペーサー層２０６をそれに結合しており、そして次にそれは、末端層２０８を有する。末端層２０８は、比較的低密度において末端層２０８の残部の間に散在された反応性基２１０を有する。層の数、タイプ、および順序は、本明細書において記載された本発明の様々な態様によって、および所望の最終表面を達成するために変化されてもよい。   One example of such a “layered” surface is schematically illustrated in FIG. 2, which has been treated or derivatized to provide a total reactive surface 204 to which additional chemicals may be attached. A substrate 200 having an initial or characteristic surface 202 is provided. The reactive surface 204 has a linker / spacer layer 206 attached to it, and then it has an end layer 208. End layer 208 has reactive groups 210 interspersed between the remainder of end layer 208 at a relatively low density. The number, type, and order of layers may be varied according to various aspects of the invention described herein and to achieve a desired final surface.

ＩＩ．基質および表面の作製方法
多数の方法を用いて本発明の表面を作製することができる。少なくとも第１の方法において、用いられる本発明の方法は、比または希釈に基づく処理を表面に適用して所望の密度を生じる。特に、簡単な表面改質プロトコルは少なくとも２つの異なった表面改質剤の混合物を使用し、そこで第１の薬剤は、表面にカップリングするための部分のほかに、目的の反応性基を含有し、その結果、表面への第１の薬剤のカップリングはまた、その反応性を維持するように反応性基を提供する。第２の薬剤または希釈剤は、表面に結合するその能力以外に、表面が置かれる適用の環境に対してほかの場合なら非反応性である。 II. Substrate and surface preparation methods Numerous methods can be used to make the surface of the present invention. At least in the first method, the method of the present invention used applies a ratio or dilution based treatment to the surface to produce the desired density. In particular, a simple surface modification protocol uses a mixture of at least two different surface modifiers, where the first agent contains the reactive group of interest in addition to the moiety for coupling to the surface. As a result, the coupling of the first drug to the surface also provides a reactive group to maintain its reactivity. The second agent or diluent is otherwise non-reactive to the environment of the application in which the surface is placed, other than its ability to bind to the surface.

図１および２に示された線図と同様、プロセスの略図が図３に示される。示されるように、基質３０２上の表面、すなわち、ガラスまたはシリカベースの表面３０４を例えばシラン化学を用いて初期に誘導体化して全反応性表面３０４を提供する。次に、反応性表面３０４を、反応性表面３０４にカップリングされうる、表面改質剤３０６および３０８の混合物で処理する。薬剤の混合物は、目的の反応性基３０６を有する薬剤の濃度と非反応性基３０８を提供する薬剤の濃度とを含有する。２つの薬剤は、その表面上の所望の反応性基の密度３０６において反応性表面３０４への薬剤の結合をもたらす比において存在する。例えば、反応性表面への両方の改質剤のカップリングの結合速度論が等しい場合、反応性薬剤３０６の、非反応性薬剤３０８に対する１：１０比が、その表面上の１０個の非反応性基３０８ごとに反応性表面３０４に結合された１個の反応性基３０６の密度比を有効にもたらす。反応性表面３０４への接触およびカップリングの後、最終基質表面３１０は、所望の相対的な密度において（薬剤３０６によって提供された）所望の反応性基を有する。考察を簡単にするために、表面上にそれらの使用から生じる表面改質剤および基が同じ図解および数表示を用いて示されるが、薬剤および得られた基が異なった化学構造を有してもよいことは理解されよう。   Similar to the diagram shown in FIGS. 1 and 2, a schematic diagram of the process is shown in FIG. As shown, the surface on the substrate 302, ie, the glass or silica-based surface 304, is initially derivatized to provide a fully reactive surface 304, for example using silane chemistry. Next, the reactive surface 304 is treated with a mixture of surface modifiers 306 and 308 that can be coupled to the reactive surface 304. The drug mixture contains a concentration of drug having the desired reactive group 306 and a concentration of drug that provides the non-reactive group 308. The two agents are present in a ratio that results in the binding of the agent to the reactive surface 304 at the desired reactive group density 306 on the surface. For example, if the coupling kinetics of the coupling of both modifiers to a reactive surface are equal, a 1:10 ratio of reactive agent 306 to non-reactive agent 308 will result in 10 non-reactives on that surface. Effectively results in a density ratio of one reactive group 306 bonded to the reactive surface 304 for each reactive group 308. After contacting and coupling to the reactive surface 304, the final substrate surface 310 has the desired reactive groups (provided by the agent 306) at the desired relative density. For ease of discussion, the surface modifiers and groups resulting from their use are shown on the surface using the same illustrations and numbers, but the drugs and the resulting groups have different chemical structures. It will be appreciated.

関連しているが別の典型的な方法において、初期誘導体化プロセスは、異なった表面誘導体化剤の混合物を用いて低密度反応性を有する基質表面を生じる。例えば、シリカベースの表面は、表面に結合された時に反応性基を有する第１のシラン試薬、例えば、アミノシランと、キャップされるかあるいは他の方法で非反応性であるシラン試薬、例えば、ヒドロキシルシラン、メチルシラン、フルオロアルキルシラン等とを含有するシラン試薬の混合物を用いて初期に誘導体化されてもよい。例えば、図３を参照して、初期誘導体化プロセスは、付加的な反応性部分を有さない、例えば、キャップ、ブロックされるかあるいは他の方法で非反応性であるシランと、目的の反応性基を含有しないシランとの混合物を用いてもよい。この混合物による誘導体化は、全反応性層３０４の代わりに、例えば、層３１０に似た、低密度反応性層を備える基質表面を製造する。   In another related but related method, the initial derivatization process uses a mixture of different surface derivatizing agents to produce a substrate surface with low density reactivity. For example, a silica-based surface may be capped or otherwise non-reactive with a first silane reagent having a reactive group when bound to the surface, such as an aminosilane, such as a hydroxyl group. It may be initially derivatized with a mixture of silane reagents containing silane, methylsilane, fluoroalkylsilane, and the like. For example, referring to FIG. 3, the initial derivatization process can be performed with a target reaction with a silane that does not have additional reactive moieties, such as capped, blocked, or otherwise unreactive. You may use the mixture with the silane which does not contain a sex group. Derivatization with this mixture produces a substrate surface with a low density reactive layer, eg, similar to layer 310, instead of the total reactive layer 304.

前に記載したように、上に記載されたケースのいずれかにおいて比較的低密度において最初に表面に結合される目的の反応性基は、所望の最終適用のための所望の最終反応性基であってもよく、またはそれは、最終反応性基に連結することができる中間連結基であってもよい。例として、図３に示された低密度反応性表面３１０を目的の特定の反応性基、例えば、酵素３１２でさらに処理して、酵素３１２を反応性基３０６に結合してもよい。酵素をさらに処理して、それを例えば、リンカー部分、特異的結合パートナーを反応性基３０６に導入する等によって反応性基にカップリングしやすくしてもよい。例として、反応性基が特異的結合対の一方のメンバー、例えば、アビジンを含有してもよく、一方、酵素３１２は、結合対の相補的メンバー、例えば、ビオチンを含有する。次に、既存のまたは中間反応性基３０６への酵素３１２（最終的に望ましい反応性基）のカップリングは、相補的結合対メンバーの間の親和性相互作用のためになる条件下で酵素を表面と接触させる工程を必要とする。   As previously described, the desired reactive group initially attached to the surface at a relatively low density in any of the cases described above is the desired final reactive group for the desired final application. It may be or it may be an intermediate linking group that can be linked to the final reactive group. As an example, the low density reactive surface 310 shown in FIG. 3 may be further treated with a specific reactive group of interest, such as enzyme 312, to bind enzyme 312 to reactive group 306. The enzyme may be further processed to facilitate coupling it to a reactive group, such as by introducing a linker moiety, a specific binding partner into the reactive group 306, and the like. As an example, a reactive group may contain one member of a specific binding pair, such as avidin, while enzyme 312 contains a complementary member of the binding pair, such as biotin. Next, the coupling of enzyme 312 (the ultimate desired reactive group) to an existing or intermediate reactive group 306 causes the enzyme to undergo a reaction under conditions that result in affinity interactions between the complementary binding pair members. Requires a step of contacting the surface.

理解されるように、低密度反応性表面を製造する方法は、同様な結果を生じる限りは、多数の異なった方向から取り組まれてもよい。例えば、上の図３を参照しておよび示されるように、酵素３１２を基質表面３０２に結合するために用いられる表面改質反応性基３０６を、最初に表面改質非反応性基３０８で希釈し、酵素（または目的の他の反応性基）が結合される低密度鋳型を生じる。   As will be appreciated, the method of producing a low density reactive surface may be addressed from a number of different directions as long as it produces similar results. For example, referring to and shown in FIG. 3 above, the surface modifying reactive group 306 used to bind enzyme 312 to substrate surface 302 is first diluted with surface modified non-reactive group 308. This results in a low density template to which the enzyme (or other reactive group of interest) is attached.

あるいは、表面改質反応性基３０６の一部が酵素３１２に前もって結合され、次に、反応性表面３０４に結合される時に所望の密度を生じるように適切な希釈において反応性表面結合剤３０６（または場合により、非反応性表面改質剤３０８）で希釈されてもよい。   Alternatively, a portion of the surface modifying reactive group 306 is pre-bound to the enzyme 312 and then the reactive surface binder 306 (at an appropriate dilution to yield the desired density when bound to the reactive surface 304. Or, optionally, it may be diluted with a non-reactive surface modifier 308).

このプロセスの実施例は図４に図解的に示される。示されるように、誘導体化表面４０４を有する基質４００を実質的に均一にビオチニル化して、実質的に均一にビオチニル化された表面４０６を提供する。次に、ビオチン部分４１２が結合された酵素４１０を、中間アビジン／ストレプトアビジン結合４１４（説明を簡単にするために、以下、アビジンと称される）を用いてビオチニル化表面４０６に結合する。１つの態様において、ビオチニル化表面４０６をアビジン４１４で均一に処理して均一なアビジン表面を提供してもよい。比較的低密度において酵素４１０を提供するために、ビオチニル化酵素４１０／４１２は、混合物が全ビオチニル化表面４０６に結合される時に酵素の所望の密度を生じることが意図された比において、酵素を含有しないビオチン４１６と場合により混合される。あるいは、ビオチニル化表面４０６をアビジン４１４で処理し、ビオチニル化酵素４１０／４１２と遊離ビオチン４１６との混合物を適用する代わりに、ビオチニル化酵素４１０／４１２を過剰なアビジン４１４と所望の比において混合してそれをビオチニル化表面４０６に適用し、アビジン／ビオチン結合を介してビオチニル化表面４０６に結合された同じ低密度の酵素を生じることができる。この場合、ビオチニル化表面に対するカップリングの率がビオチニル化酵素に結合されたアビジンおよび未複合アビジンについて同等であることを純粋に実施例のために仮定すると、１：１０の比のこのような種の混合物は、１：１０の酵素の未複合アビジンに対するおよその密度を表面上に生じる。理解されるように、この仮定は例を容易にするために簡略化され、実際の結合率はおそらくかなり変化するが、一般に日常実験によって容易に較正される。   An example of this process is shown schematically in FIG. As shown, substrate 400 having derivatized surface 404 is substantially uniformly biotinylated to provide a substantially uniformly biotinylated surface 406. Next, the enzyme 410 with the biotin moiety 412 attached is attached to the biotinylated surface 406 using an intermediate avidin / streptavidin linkage 414 (hereinafter referred to as avidin for simplicity). In one embodiment, biotinylated surface 406 may be uniformly treated with avidin 414 to provide a uniform avidin surface. In order to provide the enzyme 410 at a relatively low density, the biotinylated enzyme 410/412 may have the enzyme in a ratio that is intended to produce the desired density of enzyme when the mixture is bound to the total biotinylated surface 406. Optionally mixed with biotin 416 not contained. Alternatively, instead of treating biotinylated surface 406 with avidin 414 and applying a mixture of biotinylated enzyme 410/412 and free biotin 416, biotinylated enzyme 410/412 is mixed with excess avidin 414 in the desired ratio. It can be applied to the biotinylated surface 406 to produce the same low density enzyme bound to the biotinylated surface 406 via an avidin / biotin bond. In this case, assuming that the rate of coupling to the biotinylated surface is equivalent for avidin bound to biotinylated enzyme and uncomplexed avidin for pure examples, such a ratio of 1:10 such species This produces a rough density on the surface of 1:10 enzyme to unconjugated avidin. As will be appreciated, this assumption is simplified to ease the example, and the actual coupling rate will probably vary considerably, but is generally easily calibrated by routine experimentation.

また、ビオチン／アビジン／ビオチン結合を介して誘導体化表面に連結された酵素の点から記載されるが、広範囲の異なった結合、異なった反応性基、異なった表面、および混合／希釈の異なった順等を用いて本発明の表面を遂行してもよいことは理解されよう。   Also described in terms of an enzyme linked to a derivatized surface via a biotin / avidin / biotin bond, but with a wide range of different bonds, different reactive groups, different surfaces, and different mixing / dilutions It will be appreciated that the surface of the present invention may be accomplished using order or the like.

別の代替の態様において、本発明は、介在空間からのこのような反応性基の立体排除によって表面上に比較的低密度の反応性部分を提供する。このような方法は、他の分子または分子成分を利用して、反応性部分を結合することができない表面上の排除領域を作り出す。このような分子または成分は、反応性部分の成分または反応性部分のための連結分子であってもよく、またはそれらは別個の分子成分を含んでもよい。例として、比較的大きな分子、例えば、不規則なポリマー、タンパク質、ポリアミノ酸、大きな有機種、例えば、デンドロン等は、単一または少数の反応性部分を有するが、それらが有する反応性部分間で空間セパレータとして用いられてもよい（例えば、ホン（Ｈｏｎｇ）ら著、（２００３）ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）２３５７〜２３６５を参照のこと。   In another alternative embodiment, the present invention provides a relatively low density reactive moiety on the surface by steric exclusion of such reactive groups from the intervening space. Such methods utilize other molecules or molecular components to create exclusion areas on the surface that cannot bind reactive moieties. Such molecules or components may be components of the reactive moiety or linking molecules for the reactive moiety, or they may include separate molecular components. As an example, relatively large molecules, such as irregular polymers, proteins, polyamino acids, large organic species, such as dendrons, have a single or few reactive moieties, but between the reactive moieties they have It may be used as a spatial separator (see, for example, Hong et al., (2003) Langmuir 2357-2365).

あるいは、表面会合分子の１つのクラスまたは種を表面の部分上に提供し、その部分内に反応性部分を有する表面会合分子結合を排除してもよい。例として、ゼロモード導波路、または他の構造閉じ込めの場合、表面会合分子の１つの群が閉じ込めの観察領域表面上にではなく、閉じ込めの壁部分上に選択的に提供されてもよい。壁上の表面会合分子の存在によって、閉じ込めの断面寸法を有効に低減してその領域の中心付近の観察領域に結合された一切の分子を局在化する。これの略図を図５に示す。示されるように、ゼロモード導波路５０２は、クラッディング層５０６がその上に配置された基礎基質５０４を備える。クラッディング層５０６は、それを通して配置された開口を構成する、導波路コアー５０８を備える。このようなコアーは断面寸法において変化してもよいが、好ましい態様において、それらは、直径約２０ｎｍ〜２００ｎｍの間である。排除分子５１０を壁表面にカップリングすることによって、壁上の分子５１０の有効排除長さ（寸法５１２によって示される）によって、反応性基、例えば、酵素の結合のために有効な導波路コアー内の基質表面の半径（寸法５１４によって示される）を有効に低減する。また、クラッディング層、例えば、層５０６を製造するために用いられた材料は典型的に、下にある基質とは異なった材料、例えば、二酸化ケイ素とは対照的に、アルミニウム、金またはクロムのような金属、またはケイ素であるので、それらの異なった表面性質を利用して排除分子５１０を壁表面に選択的に結合することができる。金属クラッディング材料、例えば、アルミニウム、クロムまたは金の場合、下にあるガラスまたはシリカベースの表面とは対照的にクラッディング表面に優先的に結合する表面結合基が選択される。例えば、金属または金属キレート基を含む排除分子が、下にあるガラスまたはシリカベースの基質ではなく、金属クラッディング層と会合されてもよい。このような基の例には、クラッディング層上の薄い金層と会合するとき、チオール基、例えば、メルカプトウンデカン酸、またはクラッディング材料上のニッケル層と会合するとき、ニトリロ酢酸が挙げられ、それに大きな分子、例えば、ポリマー、不規則なポリマー、ポリアミノ酸、タンパク質等が結合される。次に、これらの大きな分子は、全表面上に存在する活性基を遮蔽して、比較的低密度のアクセス可能な反応性基を提供するか、または単一触媒反応性基、例えば、酵素が観察領域表面上の与えられた領域内に局在化するために十分なだけの空間を提供する。   Alternatively, one class or species of surface associated molecules may be provided on a portion of the surface, eliminating surface associated molecular bonds having reactive moieties within that portion. As an example, in the case of a zero mode waveguide, or other structural confinement, one group of surface associated molecules may be selectively provided on the wall portion of the confinement rather than on the surface of the confinement observation region. The presence of surface-associated molecules on the wall effectively reduces the cross-sectional dimensions of the confinement and localizes any molecules bound to the observation region near the center of the region. A schematic diagram of this is shown in FIG. As shown, the zero mode waveguide 502 comprises a base substrate 504 having a cladding layer 506 disposed thereon. The cladding layer 506 includes a waveguide core 508 that defines an opening disposed therethrough. While such cores may vary in cross-sectional dimensions, in preferred embodiments they are between about 20 nm and 200 nm in diameter. By coupling the exclusion molecule 510 to the wall surface, the effective exclusion length of the molecule 510 on the wall (indicated by dimension 512) allows the reactive group, for example, within the waveguide core to be effective for the binding of the enzyme. Effectively reduces the radius of the substrate surface (indicated by dimension 514). Also, the material used to make the cladding layer, eg, layer 506, is typically a different material from the underlying substrate, eg, aluminum, gold, or chromium as opposed to silicon dioxide. Since such metals or silicon, their different surface properties can be used to selectively bind the exclusion molecule 510 to the wall surface. In the case of metal cladding materials such as aluminum, chromium or gold, surface binding groups are selected that preferentially bind to the cladding surface as opposed to the underlying glass or silica based surface. For example, an exclusion molecule comprising a metal or metal chelate group may be associated with the metal cladding layer rather than the underlying glass or silica-based substrate. Examples of such groups include thioloacetic acid when associated with a thin gold layer on the cladding layer, such as a thiol group, such as mercaptoundecanoic acid, or a nickel layer on the cladding material, Large molecules such as polymers, irregular polymers, polyamino acids, proteins, etc. are attached to it. These large molecules then mask active groups present on the entire surface to provide relatively low density accessible reactive groups, or single catalytic reactive groups such as enzymes Provide enough space to localize within a given area on the surface of the observation area.

さらに別の態様において、目的の反応性基の低密度は表面構造中の層の相互作用によって達成されてもよい。特に、いくつかの場合、表面に結合された第１の反応性層と後続の層との相互作用は、目的の反応性基に関して、後続の層の特定部分が非反応性にされるという結果をもたらすことがある。このような場合、その相互作用は、希釈工程と同じように有効に機能し、本発明の目標を遂行するために用いられてもよい。例として、第１の反応性層は、例えば、ＰＥＧリンカーを介して表面に結合されたビオチン基のフィールドを含有してもよい。ビオチン層の上のアビジンまたはストレプトアビジン層の堆積はアビジン層の一部の特定レベルの飽和をもたらすように見えるのが観察された。操作の特定の理論に縛られなければ、下にあるビオチンリンカーはアビジン層の適度の飽和をもたらしている場合があり、非反応性アビジンの一部を生じると考えられ、例えば、ＰＥＧ／アビジン結合は、他のアビジン分子は下にある層によって不飽和であるまま、個々のアビジン分子上の多数の認識部位に表面結合ビオチン／リンカー基によって結合することを可能にする十分な配座柔軟性を有しうる場合がある。有効に、このような表面は機能的に希釈されたアビジン表面をもたらしており、そこで表面の一部は反応性であるが（例えば、不飽和アビジン）、一方、表面の残部はブロックされる（例えば、飽和アビジン）。   In yet another embodiment, the low density of the reactive group of interest may be achieved by the interaction of layers in the surface structure. In particular, in some cases, the interaction between the first reactive layer bonded to the surface and the subsequent layer results in a specific portion of the subsequent layer being rendered non-reactive with respect to the reactive group of interest. May bring. In such cases, the interaction functions as effectively as the dilution step and may be used to accomplish the goals of the present invention. As an example, the first reactive layer may contain a field of biotin groups attached to the surface via, for example, a PEG linker. It was observed that the deposition of the avidin or streptavidin layer on the biotin layer appears to result in a certain level of saturation of a portion of the avidin layer. Without being bound to a specific theory of operation, the underlying biotin linker may result in moderate saturation of the avidin layer, which is thought to result in some non-reactive avidin, for example, PEG / avidin binding Provides sufficient conformational flexibility that allows surface-bound biotin / linker groups to bind to multiple recognition sites on individual avidin molecules while other avidin molecules remain unsaturated by the underlying layer. May have. Effectively, such a surface results in a functionally diluted avidin surface where a portion of the surface is reactive (eg, unsaturated avidin) while the rest of the surface is blocked ( For example, saturated avidin).

配座柔軟性リンカー、または様々な長さのリンカー、例えば、より短いリンカーとより長いリンカーとの混合物を利用して上にある層を部分的にブロックする副層を設計することによって様々な相互作用副層（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｌａｙｅｒｓ）を作製し、最終表面上に所望の反応性基の密度を生じてもよい。   Conformational flexibility linkers, or linkers of various lengths, for example by using a mixture of shorter and longer linkers to design various sub-layers that partially block the overlying layer. Interacting sublayers may be created to produce the desired density of reactive groups on the final surface.

前述の内容に加えて、本発明の表面を作り出すために異なった成分の混合物を参照する多数の方法が記載されるが、多くの場合、混合物として所望の材料を合成して、用いられる各成分の適切な比を確実にすることが望ましいことは理解されよう。この比率混合物の合成はそのようなものとして、（合成スキーム変動の点から、およびロット間変動性の点の両方から）異なった合成反応から生じる、表面を製造するのに用いられた構成要素の表面結合変動性を防ぐ。例として、単一シラン前駆物質と反応性である、例えば、反応性または非反応性末端を有する２つ以上の前駆物質ｂａｃｋｂｏｎｅｓを組み合わせることによって混合反応性基および非反応性基、例えば、混合シランを合成することにより、表面に対して、得られたシラン混合物の均一な反応性を確実にする。   In addition to the foregoing, a number of methods are described that refer to a mixture of different components to create the surface of the present invention, but in many cases each component used is synthesized as a mixture and the desired material is used. It will be appreciated that it is desirable to ensure an appropriate ratio. The synthesis of this ratio mixture is such that the components used to produce the surface resulting from different synthesis reactions (both from the point of synthesis scheme variation and from lot to lot variability). Prevent surface bond variability. As an example, mixed reactive groups and non-reactive groups, such as mixed silanes, by combining two or more precursor backbones that are reactive with a single silane precursor, for example, having reactive or non-reactive ends To ensure uniform reactivity of the resulting silane mixture with the surface.

ＩＩＩ．基質および表面の典型的な適用
本発明の選択的反応性表面は、個々の分子またはそれらの反応を互いに単離することが望ましい場合がある様々な異なった適用を有する。例えば、単一または少数の反応性分子を有するビード基質を、ＦＡＣＳまたは他のビード選別方法を用いて容易をインテロゲートし、例えば、コンビナトリアル・ケミストリー・ライブラリ、定向進化ライブラリ、またはファージ・ディスプレイ・ライブラリにおいて所望の反応性基を確認することができる。本発明の表面改質技術はこのようなシステムに適用可能である。 III. Typical Applications of Substrates and Surfaces The selectively reactive surfaces of the present invention have a variety of different applications where it may be desirable to isolate individual molecules or their reactions from each other. For example, a bead substrate having a single or a small number of reactive molecules can be easily interrogated using FACS or other bead sorting methods, such as combinatorial chemistry libraries, directed evolution libraries, or phage display libraries. The desired reactive group can be identified in the library. The surface modification technique of the present invention is applicable to such a system.

あるいは、与えられた酵素システム上で単一分子分析を行い、単一反応およびその反応のエフェクターをモニタしてもよい。このような分析には、キナーゼ酵素、ホスファターゼ酵素、プロテアーゼ酵素、ヌクレアーゼ酵素、ポリメラーゼ酵素等、診断上または治療上重要である場合がある酵素検定が含まれる。   Alternatively, single molecule analysis may be performed on a given enzyme system to monitor a single reaction and the effectors of that reaction. Such assays include enzyme assays that may be diagnostically or therapeutically important, such as kinase enzymes, phosphatase enzymes, protease enzymes, nuclease enzymes, polymerase enzymes, and the like.

好ましい態様において、表面を用いて基質上の光学的に単離した位置において低い密度でＤＮＡポリメラーゼ酵素を結合して、リアルタイムで配列決定反応を分析し、合成反応の配列をそれらが起こる時にモニタおよび同定する。本発明の表面の特に好ましい適用の例は、米国特許出願公開第２００３／００４４７８１号明細書（その内容を参照によって全ての目的のためにその全体において本願明細書に組み入れるものとする）に記載されており、特に、米国特許第６，９１７，７２６号明細書（参照によって全ての目的のためにその全体において本願明細書に予め組み入れるものとする）に記載されているようなゼロモード導波路構造物においてのこのような方法の適用が挙げられる。特に、上述の配列決定方法からの配列決定データは、個々の反応、すなわち、個々のポリメラーゼ酵素からのデータを他の酵素からのデータから分離することができるとき、より容易に分析される。このような酵素を表面上に低密度において提供することによって、物理的単離をもたらし、従って、１つの酵素を別の酵素から光学的に単離する能力をもたらす。その最も好ましい態様において、単一酵素分子が各ゼロモード導波路の観察表面上に提供され、各導波路が単一酵素分子の反応のためのデータを提供することを可能にする。全ての導波路または他の観察領域が単一酵素を有することを確実にするのは難しい場合があるので、密度が選択され、それによって多くの導波路が単一酵素を含有し、一方、若干は、２または３以上の酵素を含有する。   In a preferred embodiment, the surface is used to bind DNA polymerase enzymes at low density at optically isolated locations on a substrate to analyze sequencing reactions in real time, monitor the sequences of the synthesis reactions as they occur, and Identify. Examples of particularly preferred applications of the surface of the present invention are described in US 2003/0044781, which is hereby incorporated by reference in its entirety for all purposes. In particular, a zero-mode waveguide structure as described in US Pat. No. 6,917,726, which is previously incorporated herein by reference in its entirety for all purposes. Application of such a method in a product is mentioned. In particular, sequencing data from the above-described sequencing methods is more easily analyzed when individual reactions, ie, data from individual polymerase enzymes, can be separated from data from other enzymes. Providing such an enzyme at low density on a surface provides physical isolation and thus the ability to optically isolate one enzyme from another. In its most preferred embodiment, a single enzyme molecule is provided on the observation surface of each zero-mode waveguide, allowing each waveguide to provide data for the reaction of a single enzyme molecule. Since it can be difficult to ensure that all waveguides or other observation regions have a single enzyme, the density is selected so that many waveguides contain a single enzyme, while some Contains two or more enzymes.

理解されるように、本発明の高度に画定された表面は、広範囲の適用、技術および産業にわたって適用することができる。例えば、他の適用において、本発明の表面は、表面の機能性のレベルを正確に制御してこのような表面の物理的性質を制御することが望ましい様々な適用のいずれにおいて用いられてもよい。例えば、多数の適用において、表面上のイオン性基の正確な制御は、表面がその環境と相互作用する時にこのようなイオン性基の影響の正確な制御をもたらすことができる。例として、材料の電気泳動および／または電気浸透輸送のために用いられるシステムにおいて、例えば、マイクロ流体導管、例えば、チャネル、細管等において、表面のゼータ電位の正確な制御は、このような導管中の材料の電気浸透移動度に広範な影響を与えることができ、そして次にそれは、例えば、電気泳動適用において、システムの相対的な有効性に影響を与えることができる。   As will be appreciated, the highly defined surfaces of the present invention can be applied across a wide range of applications, technologies and industries. For example, in other applications, the surfaces of the present invention may be used in any of a variety of applications where it is desirable to accurately control the level of surface functionality to control the physical properties of such surfaces. . For example, in many applications, precise control of ionic groups on a surface can provide precise control of the effects of such ionic groups as the surface interacts with its environment. As an example, in systems used for electrophoretic and / or electroosmotic transport of materials, for example in microfluidic conduits such as channels, tubules, etc., precise control of the zeta potential of the surface can be achieved in such conduits. The material can have a wide range of effects on electroosmotic mobility, which in turn can affect the relative effectiveness of the system, for example, in electrophoretic applications.

さらに、高表面積導管、例えば、細管またはチャネルの適用において、材料と表面との間の過度の相互作用を防ぎながら表面においての特定の低いレベルの機能性を維持することが望ましい場合がある。例えば、細管電気泳動のための動的コーティングを提供するとき、コーティング材料と表面との間の特定のレベルの相互作用が望ましい場合があるが、一方、分析物と表面との間の相互作用はほとんどないかまたは全くないことが望ましい。   Furthermore, in high surface area conduits, such as tubules or channels, it may be desirable to maintain a certain low level of functionality at the surface while preventing excessive interaction between the material and the surface. For example, when providing a dynamic coating for capillary electrophoresis, a certain level of interaction between the coating material and the surface may be desirable, while the interaction between the analyte and the surface is Desirably little or no.

さらに他の適用において、本発明の表面を用いて医療インプラントおよびグラフトの表面改質を精密調整し、その上の表面改質のレベルをより正確に制御することによって、このようなデバイスの生体適合性を強化してもよい。   In yet other applications, the biocompatibility of such devices by using the surfaces of the present invention to fine tune the surface modification of medical implants and grafts and more precisely control the level of surface modification thereon. Sexuality may be strengthened.

本発明による改質された表面の１つの実施例は、分子を含有する反応性／結合部位と、キャップされるかまたは非反応性の結合部位との混合層で基質表面をコーティングすることによって製造されてもよい。シリカベースの基質表面の場合、典型的な混合層組成物は、非反応性またはキャップされた部位についてはシラン−ＰＥＧ−Ｘ（Ｘは−ＯＨまたはＣＨ２であってもよい）、およびカルボキシル、エポキシド、アミン、ビオチン、グルタチオン、Ｎｉ−ＮＴＡ、または他の公知の結合基を含有する（例えば、Ｇ．Ｔ．ハーマンソン（Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）著、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）１９９６年）を参照のこと）。表面上に比較的低密度の反応性／結合部位を達成するために、適用された混合物中のキャップされた／非反応性分子のモル含有量および反応性分子のモル含有量は、得られた表面上に所望の比または密度を生じるように選択される。この比は、表面に対する成分の結合速度論、ならびに最終表面上の反応性基の非反応性基に対する所望の最終比によって決定される。さらに、蒸着方法が用いられる場合、蒸着蒸気中の相対的な濃度が重要であり、それ故、蒸着チャンバ内の各成分の蒸気圧力は要因に入れられる。   One embodiment of a modified surface according to the present invention is produced by coating a substrate surface with a mixed layer of reactive / binding sites containing molecules and capped or non-reactive binding sites. May be. For silica-based substrate surfaces, typical mixed layer compositions include silane-PEG-X (X may be —OH or CH 2), and carboxyl, epoxide for non-reactive or capped sites. , Amines, biotin, glutathione, Ni-NTA, or other known linking groups (eg, by GT Hermanson, Bioconjugate Techniques (Academic Press 1996). Year)). In order to achieve a relatively low density of reactive / binding sites on the surface, the molar content of capped / non-reactive molecules and the molar content of reactive molecules in the applied mixture was obtained. It is selected to produce the desired ratio or density on the surface. This ratio is determined by the binding kinetics of the component to the surface as well as the desired final ratio of reactive groups to non-reactive groups on the final surface. Furthermore, when a deposition method is used, the relative concentration in the deposition vapor is important, and therefore the vapor pressure of each component in the deposition chamber is factored.

改質された表面の略図を図６に示す。示されるように、ガラス基質は、シラン−ＰＥＧ−ＯＨおよびシラン−ＰＥＧ−エポキシド分子が結合される上面を有し、そこで非反応性シラン−ＰＥＧ−ヒドロキシル分子は、反応性エポキシドを有する基よりも数がはるかに多い。関連した態様において、エポキシド部分が、特異的結合分子、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、結合ペプチド、抗体、抗原、グルタチオン、ＧＳＴに連結するために用いられてもよく、そして次にそれらは、付加的な分子、例えば、酵素のような触媒分子に結合するために用いられてもよく、またはこのような触媒分子がエポキシド基を介して直接に結合されてもよい。理解されるように、様々な適用においてゼロモード導波路の動作の機能の性質は、観察の課題である反応性基が導波路の下部表面の比較的近くにあることを要求する。それ故に、ゼロモード導波路の適用のための適切な結合スキームは典型的に、導波路の妥当な観察体積内に配置されている目的の反応性基をもたらすが、それは、使用されている光の波長に或る程度は依存する。特定の態様において、その距離は好ましくは、下部表面から約０ｎｍ〜約２０ｎｍである。本発明の好ましい表面の場合、所望のレベルの反応性基をもたらして他の場合なら非反応性である表面の厚さは典型的に、０．８ｎｍ〜約２０ｎｍ、より好ましくは約１ｎｍ〜約１０ｎｍの範囲である。このような表面は、好ましい光閉じ込めの観察体積内に反応性基をもたらす一方で、干渉相互作用を十分に排除する。   A schematic of the modified surface is shown in FIG. As shown, the glass substrate has a top surface to which silane-PEG-OH and silane-PEG-epoxide molecules are attached, where non-reactive silane-PEG-hydroxyl molecules are more than groups with reactive epoxides. There are many more. In related embodiments, epoxide moieties may be used to link to specific binding molecules such as biotin, avidin, streptavidin, binding peptides, antibodies, antigens, glutathione, GST, and then they are It may be used to bind to additional molecules, for example catalytic molecules such as enzymes, or such catalytic molecules may be directly bonded via an epoxide group. As will be appreciated, the functional nature of the operation of the zero mode waveguide in various applications requires that the reactive group that is the subject of observation be relatively close to the lower surface of the waveguide. Therefore, a suitable coupling scheme for zero-mode waveguide applications typically results in the desired reactive group being located within a reasonable observation volume of the waveguide, which is the light used It depends to some extent on the wavelength of. In certain embodiments, the distance is preferably from about 0 nm to about 20 nm from the lower surface. For preferred surfaces of the present invention, the thickness of the surface that results in the desired level of reactive groups and is otherwise non-reactive is typically from 0.8 nm to about 20 nm, more preferably from about 1 nm to about The range is 10 nm. Such a surface provides reactive groups within the preferred optical confinement observation volume while sufficiently eliminating interference interactions.

前に記載したように、本発明の基質は、好ましい態様において、これらの低密度表面上に生じる特定の反応をモニタするために光学検出システムと共に用いられる。特に、これらのシステムは典型的に、励起源と、インテロゲートされる表面の方向に励起放射線を向けて、放射された光を基質から検出器上に集束させるための光学縦列とを備える蛍光検出システムを使用する。このようなシステムの１つの実施例は、２００５年、８月１１日に出願された米国特許出願第１１／２０１，７６８号明細書（その内容を参照によって全ての目的のためにその全体において本願明細書に組み入れるものとする）に示されている。   As previously described, the substrates of the present invention are used in a preferred embodiment with an optical detection system to monitor specific reactions occurring on these low density surfaces. In particular, these systems typically include an excitation source and an optical column for directing excitation radiation in the direction of the interrogated surface and focusing the emitted light from the substrate onto the detector. Use a detection system. One embodiment of such a system is described in US patent application Ser. No. 11 / 201,768, filed Aug. 11, 2005, the contents of which are hereby incorporated by reference in their entirety for all purposes. To be incorporated into the description).

ＩＶ．実施例
実施例１：シラン−ＰＥＧ２０−ビオチン／アビジン表面
トリメトキシシランＰＥＧ２０−ビオチン分子はバイオリンク・ライト・サイエンス（ＢｉｏＬｉｎｋ Ｌｉｔｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ノースカロライナ州、ケアリー（Ｃａｒｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ））によって合成され、そこで「２０」は、反復エチレン（ｅｔｈｌｙｌｅｎｅ）グリコール単位の数を指す。前駆試薬は市販されている。 IV. Examples Example 1: Silane-PEG20-Biotin / Avidin Surface The trimethoxysilane PEG20-biotin molecule was synthesized by BioLink Lite Sciences (Cary, North Carolina) where “20” refers to the number of repeating ethylene glycol units. Precursor reagents are commercially available.

４時間、溶剤１ｇ当たり１ｕｇ ＰＥＧ２０−ビオチン中で基質を培養することによってＰＥＧ２０−ビオチン表面を製造した。溶剤は、メタノール、１重量％の水、および０．１％のＴｗｅｅｎ ２０非イオン性界面活性剤から成った。ＰＥＧ２０−ビオチンコートの厚さは、エリプソメトリーによって測定した時にｔ＝１．１ｎｍであり、（滴下付着の５秒以内に測定された）水接触角はθ＝３５度であった。   A PEG20-biotin surface was prepared by culturing the substrate in 1 ug PEG20-biotin per gram of solvent for 4 hours. The solvent consisted of methanol, 1% by weight water, and 0.1% Tween 20 nonionic surfactant. The thickness of the PEG20-biotin coat was t = 1.1 nm as measured by ellipsometry, and the water contact angle (measured within 5 seconds of drop deposition) was θ = 35 degrees.

ＰＥＧ２０−ビオチンは、希釈メタノール溶液から溶融シリカスライドおよび自然酸化物を含有するＳｉ基質上に薄いコーティング（約２ｎｍ）を形成し（メタノール１ｇ中に約１ｍｇのＰＥＧ２０−ビオチン）、そこで厚さは、溶剤組成物、および室温においての培養時間に応じて変化する。（エリプソメトリーによって測定された）コーティングの厚さが１ｎｍ以上に達したとき、表面は一般に、方向付けられた結合（例えばビオチン−アビジン）に対して非常に良い特異性およびタンパク質非特異的結合の高度の排除を示すことが観察された。２ｎｍより厚いコーティングは、さらなる改良を示さないことがわかり、一方、０．８ｎｍ未満のフィルムは、１ｎｍ以上のフィルムほどタンパク質結合に対して特異性を示さなかった。ＰＥＧ２０−ビオチンで改質された（自然酸化物を有する）Ｓｉ表面上で行なわれたエリプソメトリー測定は、アレキサ（Ａ１ｅｘａ）４８８標識ストレプトアビジン（乾燥）に結合された時の層の厚さが約３ｎｍ〜４．３ｎｍであることを示した。   PEG20-biotin forms a thin coating (about 2 nm) on a Si substrate containing fused silica slides and native oxide from diluted methanol solution (about 1 mg PEG20-biotin in 1 g methanol) where the thickness is It varies depending on the solvent composition and the incubation time at room temperature. When the coating thickness (measured by ellipsometry) reaches 1 nm or more, the surface generally has a very good specificity for directed binding (eg biotin-avidin) and non-protein specific binding. It was observed to show a high degree of exclusion. Coatings thicker than 2 nm were found to show no further improvement, whereas films below 0.8 nm showed less specificity for protein binding than films above 1 nm. Ellipsometry measurements performed on a PEG20-biotin modified Si surface (with native oxide) showed that the layer thickness when bound to Alexa 488 labeled streptavidin (dry) was approximately It was shown to be 3 nm to 4.3 nm.

これらの観察を明示および定量化するように試験パネルを設計した。パネルは溶融シリカスライド（約２５ｍｍ×７５ｍｍ）上の４つの別個の領域から成った。各四角形は６ｍｍ×６ｍｍであり、９６井戸フォーマットパターンを形成するプラスチック枠ウインドウ（シュライヒヤー＆シュル・バイオサイエンス（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ）によって販売されたファスト・フレーム（Ｆａｓｔ Ｆｒａｍｅ）（登録商標））上のポリジメチルシロキサン（ｐｄｍｓ）ガスケットによって他の領域から単離された。典型的に、各コードラントまたは井戸は約７０μＬの溶液を必要とする。   A test panel was designed to demonstrate and quantify these observations. The panel consisted of four separate areas on a fused silica slide (about 25 mm x 75 mm). Each square is 6 mm x 6 mm and is a poly on plastic frame window (Fast Frame® sold by Schleicher & Schuell Biosciences) that forms a 96-well format pattern. Isolated from other areas by dimethylsiloxane (pdms) gasket. Typically, each cordant or well requires about 70 μL of solution.

陽性および陰性コントロールパネルは、蛍光標識ストレプトアビジン（アレクサ（Ａｌｅｘａ）−４８８）またはニュートラアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）（登録商標）、または過剰なビオチンで予め培養された標識ストレプトアビジンまたはニュートラアビジン（登録商標）でＰＥＧ２０−ビオチン表面をインテロゲートし、適度の特異的対非特異的相互作用をもたらす。次に、試験パネルを標識Φ２９ポリメラーゼでインテロゲートし、異なったイオン強度緩衝条件下、例えば、「低塩」（約２５ｍＭ）および「高塩」（約１５０ｍＭ）でタンパク質の非特異的会合のレベル（または表面によって提供されたタンパク質「排除」のレベル）を定量した。   Positive and negative control panels are fluorescently labeled streptavidin (Alexa-488) or NeutraAvidin®, or labeled streptavidin or Neutravidin® pre-cultured with excess biotin. PEG20-biotin surface is interrogated, resulting in moderate specific versus non-specific interactions. The test panel is then interrogated with labeled Φ29 polymerase, and non-specific association of proteins under different ionic strength buffer conditions, eg, “low salt” (about 25 mM) and “high salt” (about 150 mM). The level (or level of protein “exclusion” provided by the surface) was quantified.

ＰＥＧ２０−ビオチン表面のストレプトアビジン（またはニュートラアビジン（登録商標））結合特異性およびポリメラーゼ排除特性を、無被覆溶融シリカスライドとの会合と比較した。全てのスライドをナノストリップ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｐ）（登録商標）でよく清浄にし、その後、酸素プラズマクリーニング（中出力、２０００ｍＴｏｒｒで５分、Ｈａｒｒｉｃｋ ｘｘ）を行なった。タンパク質−結合スライドを蛍光走査計測器で走査した。典型的に光電子増倍管ゲインは５５０Ｖに設定され、ピクセル分解能は１００μｍであった。   The streptavidin (or Neutravidin®) binding specificity and polymerase exclusion properties of the PEG20-biotin surface were compared to association with uncoated fused silica slides. All slides were thoroughly cleaned with Nanostrip®, followed by oxygen plasma cleaning (medium power, 5 minutes at 2000 mTorr, Harrick xx). The protein-bound slide was scanned with a fluorescence scanning instrument. Typically, the photomultiplier tube gain was set to 550 V and the pixel resolution was 100 μm.

培養条件は以下の通りであった。Ａ４８８−ＳＡ（分子プローブ／インビトロゲン）を緩衝液中に溶解した。Ａ４８８−ＳＡをビオチンで予め培養した。Φ−２９ポリメラーゼを市販の標識キットを用いてＡ４８８で標識した。酵素を２５ｍＭ トリス、１ｍＭおよび５ｍＭ β−メルカプトエタノール（βＭＥ）中で、および付加的な１５０ｍＭ ＫＣｌで希釈した。溶液を典型的に、１時間培養した。その後、各井戸を緩衝液で、次いで水でリンスし、空気銃でブロー乾燥させた。   The culture conditions were as follows. A488-SA (molecular probe / Invitrogen) was dissolved in buffer. A488-SA was pre-cultured with biotin. Φ-29 polymerase was labeled with A488 using a commercially available labeling kit. The enzyme was diluted in 25 mM Tris, 1 mM and 5 mM β-mercaptoethanol (βME) and with additional 150 mM KCl. The solution was typically incubated for 1 hour. Each well was then rinsed with buffer, then with water, and blown dry with an air gun.

ＰＥＧ２０−ビオチンで改質された溶融シリカおよびＳｉ基質は、Φ−２９ポリメラーゼで攻撃された時に高レベルのタンパク質「排除」を示し、次いでそれを蛍光標識抗体エピトープで染色し、低および高塩条件の両方においてビオチンブロック蛍光標識ストレプトラビジン（ｓｔｒｅｐｔｒａｖｉｄｉｎ）またはニュートラアビジン（登録商標）と同等の蛍光強度を生じた。特に、結果は、未処理溶融シリカ上の陽性コントロール（Ａ４８８−ＳＡ）またはタンパク質吸着の場合よりも１００倍超で低い蛍光強度を示した。   Fused silica and Si substrates modified with PEG20-biotin show a high level of protein “exclusion” when challenged with Φ-29 polymerase, which is then stained with fluorescently labeled antibody epitopes, low and high salt conditions Both produced a fluorescence intensity equivalent to that of biotin-blocked fluorescently labeled streptavidin or Neutravidin®. In particular, the results showed more than 100 times lower fluorescence intensity than in the case of positive control on untreated fused silica (A488-SA) or protein adsorption.

溶融シリカおよびＰＥＧ２０−ビオチン表面上のΦ−２９ポリメラーゼの非特異的結合の比較は、低いイオン強度固定化条件下で溶融シリカ上に高いポリメラーゼ表面被覆率（４０〜６０％）を示し、溶融シリカと比較した時に（低いイオン強度において）ＰＥＧ２０−ビオチン上の非特異的吸着のほぼ２００倍の低減を示した。また、それは、ＰＥＧ２０−ビオチンがストレプトアビジンに対して高度の結合特異性を与えることを示す。ＰＥＧ層が厚さ１ｎｍ未満になる時に表面のポリメラーゼ排除特性が減少する。   Comparison of non-specific binding of Φ-29 polymerase on fused silica and PEG20-biotin surface showed high polymerase surface coverage (40-60%) on fused silica under low ionic strength immobilization conditions Showed a nearly 200-fold reduction in non-specific adsorption on PEG20-biotin (at low ionic strength). It also shows that PEG20-biotin provides a high degree of binding specificity for streptavidin. When the PEG layer is less than 1 nm thick, the surface polymerase exclusion properties decrease.

次に、ＰＥＧ２０−ビオチン表面を有するパネルを、非標識ストレプトアビジンによって媒介された、ビオチニル化Ａ４８８−ポリメラーゼでインテロゲートした。簡単に言えば、ＰＥＧ２０−ビオチン表面を有するスライド上の全ての井戸を、最初にストレプトアビジンで培養し、次いで、過剰な未標識ストレプトアビジンで予め培養されるかまたは予め培養されていないビオチニル化Ａ４８８−標識ポリメラーゼでインテロゲートし、表面に対する特異的ストレプトアビジン媒体結合のレベルを定量した。表面とビオチニル化タンパク質との間の特異的相互作用は、非特異的相互作用の約５０倍の増加を示した（そこでビオチニル化タンパク質を、それを表面と接触させる前にストレプトアビジンで予めブロックした）。   Next, a panel with a PEG20-biotin surface was interrogated with biotinylated A488-polymerase mediated by unlabeled streptavidin. Briefly, all wells on slides with a PEG20-biotin surface are first cultured with streptavidin and then biotinylated A488 pre-cultured with excess unlabeled streptavidin or not pre-cultured. -Interrogated with labeled polymerase and quantified the level of specific streptavidin media binding to the surface. Specific interaction between the surface and the biotinylated protein showed an approximately 50-fold increase in non-specific interaction (where the biotinylated protein was pre-blocked with streptavidin before contacting it with the surface. ).

実施例２：シラン−ＰＥＧ２４−ビオチン／アビジン表面
α−ビオチニル−ω−トリメトキシシリル末端ポリ（エチレングリコール）（２４単位）（ＰＥＧ２４−ビオチン）をポリマー・ソース（カナダ、モントリオールのドーバル（Ｄｏｒｖａｌ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ Ｃａｎａｄａ））によって合成した。 Example 2: Silane-PEG24-biotin / avidin surface α-biotinyl-ω-trimethoxysilyl-terminated poly (ethylene glycol) (24 units) (PEG24-biotin) as a polymer source (Doval, Montreal, Canada) Canada)).

溶剤１グラム当たり０．６ｍｇのＰＥＧ２４−ビオチンの濃度においてＰＥＧ２４−ビオチンをエタノール中に溶解することによって溶液を調製した。少量のメタノール（約０．４重量％）を混合物に添加して、シラン試薬の、（約２ｎｍの自然酸化物を有する）Ｓｉチップに対する堆積速度を３〜５時間で（エリプソメトリーによって）１ｎｍ〜１．５ｎｍに調節した。   A solution was prepared by dissolving PEG24-biotin in ethanol at a concentration of 0.6 mg PEG24-biotin per gram of solvent. A small amount of methanol (about 0.4% by weight) is added to the mixture so that the deposition rate of the silane reagent on the Si chip (with native oxide of about 2 nm) is increased from 1 nm to 3-5 hours (by ellipsometry). Adjusted to 1.5 nm.

また、ＰＥＧ２４−ビオチンで改質された溶融シリカおよびＳｉ基質は、蛍光標識Φ−２９ポリメラーゼならびにビオチンブロックニュートラアビジンで攻撃された時に低レベルの非特異的相互作用を示したが、一方、同時に、ニュートラアビジンおよびストレプトアビジンに対して高レベルの（特異的）結合を示した。再び述べると、本発明の表面は、所望の基、例えば、ビオチニル化タンパク質との高レベルの特異的相互作用を示し、一方、タンパク質、例えば、過剰な酵素、ならびに潜在的干渉ラベル分子（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｌａｂｅｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、例えば、蛍光性アビジンの両方の低レベルの非特異的結合を示した（または類推によって、核酸分析の場合、標識ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり、それらは観察領域内で非特異的に吸着させられる場合、ほかの場合なら酵素反応の検出を妨げることがある）。この実験において、蛍光標識ストレプトアビジンおよびポリメラーゼは、蛍光強度とフルオロフォア表面密度との間の線形関係を維持するために１／１０の比において未標識タンパク質と予混合された。   Also, fused silica and Si substrates modified with PEG24-biotin showed a low level of non-specific interaction when challenged with fluorescently labeled Φ-29 polymerase and biotin-blocked neutravidin, while simultaneously It showed a high level (specific) binding to neutravidin and streptavidin. Again, the surface of the present invention exhibits a high level of specific interaction with the desired group, eg, biotinylated protein, while the protein, eg, excess enzyme, as well as potential interfering molecules. label molecules), eg, low levels of non-specific binding of both fluorescent avidin (or by analogy, in the case of nucleic acid analysis, labeled nucleotides or nucleotide analogs, which are non-specific within the observation region Otherwise it may interfere with the detection of the enzymatic reaction). In this experiment, fluorescently labeled streptavidin and polymerase were premixed with unlabeled protein at a ratio of 1/10 to maintain a linear relationship between fluorescence intensity and fluorophore surface density.

実施例３：反応性基の密度の調節
希釈プロトコルを用いて反応性官能基の表面密度を調節する能力を試験するためにシステムを作製した。特に、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）グルコンアミド（ＴＥＳ−Ｇ）（市販品の試薬）（ペンシルベニア州、モリスビルのゲレスト社（Ｇｅｌｅｓｔ Ｉｎｃ，ＰＡ）製品＃ＳＩＴ８１８９−０）の溶液中のＰＥＧ２４−ビオチンの様々な希釈溶液を用いてＰＥＧ２４−ビオチン表面を調製した。 Example 3: Adjusting the density of reactive groups A system was created to test the ability to adjust the surface density of reactive functional groups using a dilution protocol. In particular, PEG24 in a solution of N- (3-triethoxysilylpropyl) gluconamide (TES-G) (commercially available reagent) (Gelest Inc, PA, product # SIT8189-0, Morrisville, PA). -PEG24-biotin surface was prepared using various diluted solutions of biotin.

ＴＥＳ−Ｇ原液を、エタノールと０．４％のメタノールとの溶剤混合物１ｇ当たり２ｍｇの試薬の希釈によって調製した。ＰＥＧ２４−ビオチン原液を、溶剤（エタノール／メタノール混合物）１グラム当たり１．５ｍｇの濃度に調製した。各々１０ｍＬの５つのアリコートを調製し、ＰＥＧ２４−ビオチン原料の増加量、すなわち、０，４０μＬ（０．３％）、８０μＬ（０．６％）、２００μＬ（１．４％）、４００μＬ（２．７％）および８００μＬ（５．４％）を各アリコートに添加した。溶融シリカブランクおよびＳｉウエハを１５時間、５つのアリコート中で同時に培養した。その後、基質を反応溶液から除去し、メタノールで３回洗浄し、１０分間８０Ｃの空気中でアニールし、水中で１０分間、超音波撹拌によって洗浄して弱く結合した分子を除去し、窒素ガス銃で乾燥させた。表面上の水接触角を測定することによって表面上のＰＥＧ２４−ビオチンの量の尺度を提供したが、高純度ＰＥＧ２４表面は、約３５°の接触角を有する。   A TES-G stock solution was prepared by diluting 2 mg of reagent per gram of solvent mixture of ethanol and 0.4% methanol. A PEG24-biotin stock solution was prepared at a concentration of 1.5 mg per gram of solvent (ethanol / methanol mixture). Five aliquots of 10 mL each are prepared and increasing amounts of PEG24-biotin raw material, ie, 0.40 μL (0.3%), 80 μL (0.6%), 200 μL (1.4%), 400 μL (2. 7%) and 800 μL (5.4%) were added to each aliquot. Fused silica blanks and Si wafers were cultured simultaneously in 5 aliquots for 15 hours. Thereafter, the substrate is removed from the reaction solution, washed 3 times with methanol, annealed in 80 C air for 10 minutes, washed with ultrasonic agitation for 10 minutes in water to remove weakly bound molecules, and a nitrogen gas gun And dried. While measuring the water contact angle on the surface provided a measure of the amount of PEG24-biotin on the surface, the high purity PEG24 surface has a contact angle of about 35 °.

図７は、水接触角対ＴＥＳ−Ｇ中のＰＥＧ２４−ビオチンの濃度のプロットを示し、活性基の表面密度が希釈方法を用いて容易に制御可能であることを示す。   FIG. 7 shows a plot of water contact angle versus the concentration of PEG24-biotin in TES-G, indicating that the surface density of the active groups can be easily controlled using dilution methods.

実施例４：混合官能価のＰＥＧ２４表面
表面の均一性を提供するために、構造的に似た基を用いて、表面の結合基または反応性基、ならびに非反応性成分を提供した。特に、他の分子と相互作用するその能力以外に、均一な特性、例えば、厚さを有する表面を提供するために、ＰＥＧ２４−ビオチンを（上記の）実施例２に記載されたＰＥＧ２４基と同様な、ＰＥＧ２４−メトキシ基で希釈した。ＰＥＧ２４−メトキシはポリマー・ソース社（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｃ．）（カナダ、モントリオールのドーバル）によって特注で合成され、受け取られたまま使用された。０．４％のメタノールを有するエタノール中に試薬０．６ｍｇを含有する溶液中で室温において基質を培養することによって、ＰＥＧ２４−メトキシを溶融シリカスライドおよびＳｉウエハ上に堆積した。Ｓｉ基質を異なった時間間隔において溶液から除去し、接触角およびフィルム厚さを測定した。堆積速度およびフィルム厚さは、同様な溶剤および濃度条件下で堆積されたＰＥＧ２４−ビオチンフィルムと同等であった。 Example 4: Mixed Functionality PEG24 Surface To provide surface uniformity, structurally similar groups were used to provide surface binding or reactive groups as well as non-reactive components. In particular, in addition to its ability to interact with other molecules, PEG24-biotin is similar to the PEG24 group described in Example 2 (above) to provide a surface with uniform properties, eg, thickness. Diluted with PEG24-methoxy group. PEG24-methoxy was custom synthesized by Polymer Source Inc. (Dorval, Montreal, Canada) and used as received. PEG24-methoxy was deposited on fused silica slides and Si wafers by incubating the substrate at room temperature in a solution containing 0.6 mg of reagent in ethanol with 0.4% methanol. The Si substrate was removed from the solution at different time intervals and the contact angle and film thickness were measured. The deposition rate and film thickness were comparable to PEG24-biotin films deposited under similar solvent and concentration conditions.

ＰＥＧ２４−メトキシおよびＰＥＧ２４−ビオチンの混合溶液から堆積されたシランフィルムを、４−コードラントパネルを用いて調査した。ＰＥＧ２４−メトキシ濃度はエタノール／メタノール溶剤（０．４％メタノール）１ｇ当たり０．８３ｍｇであり、溶剤１ｇ当たり０．６７ｍｇを含有するＰＥＧ２４−ビオチン原液の増加量を混合することによって４つのアリコートを調製した。末端メトキシ基に対してビオチンのモルパーセントを用いての最終溶液濃度は０％、０．２％、０．７％、および２％であった。Ｓｉウエハおよび溶融シリカスライドを室温において３．５時間、各アリコート中で培養した。その後、基質を３回メタノール中でリンスし、空気中で乾燥させ、８０℃において１０分間アニールし、超音波混合によって水中で洗浄して、弱く結合したＰＥＧ分子を除去した。フィルムの厚さは全ての試料についてｔ＝１．３ｎｍに近く、相当する接触角は４２°（ＰＥＧ２４−ビオチン無し）〜３８°（２％のビオチン）であった。混合表面への標識ストレプトアビジンの結合は、混合表面のＰＥＧ２４−ビオチンのモルパーセントの増加との十分な相関関係を示したが、一方、予めブロックされたストレプトアビジンの結合は大きく変化していなかった。   Silane films deposited from a mixed solution of PEG24-methoxy and PEG24-biotin were investigated using a 4-coderant panel. PEG24-methoxy concentration is 0.83 mg / g ethanol / methanol solvent (0.4% methanol) and four aliquots are prepared by mixing increasing amounts of PEG24-biotin stock solution containing 0.67 mg / g solvent did. Final solution concentrations using mole percent of biotin to terminal methoxy group were 0%, 0.2%, 0.7%, and 2%. Si wafers and fused silica slides were incubated in each aliquot for 3.5 hours at room temperature. The substrate was then rinsed three times in methanol, dried in air, annealed at 80 ° C. for 10 minutes, and washed in water by ultrasonic mixing to remove weakly bound PEG molecules. The film thickness was close to t = 1.3 nm for all samples and the corresponding contact angle was 42 ° (no PEG24-biotin) to 38 ° (2% biotin). The binding of labeled streptavidin to the mixed surface was well correlated with an increase in the molar percentage of PEG24-biotin on the mixed surface, whereas the binding of the pre-blocked streptavidin was not significantly altered. .

実施例５：結合媒介層の希釈による表面上の低密度反応性ポリメラーゼの堆積
本発明の方法は、各導波路内にＰＥＧ２４−ビオチン表面を提供する工程と、ストレプトアビジンとビオチニル化ポリメラーゼとの混合物を堆積する工程とによって、ゼロモード導波路アレイ内に比較的低密度のΦ２９ＤＮＡポリメラーゼ酵素を堆積するのに用いられる。ニュートラアビジンの、ビオチニル化ポリメラーゼに対する比を調節して、過剰なニュートラアビジンで残りの表面をブロックしたまま、ポリメラーゼとＰＥＧ−２４−ビオチン表面との間の所望のレベルのニュートラアビジン媒介結合をもたらした。 Example 5: Low Density Reactive Polymerase Deposition on Surface by Dilution of Binding Mediating Layer The method of the present invention comprises providing a PEG24-biotin surface in each waveguide and a mixture of streptavidin and biotinylated polymerase Is used to deposit a relatively low density Φ29 DNA polymerase enzyme in a zero mode waveguide array. Adjusting the ratio of neutravidin to biotinylated polymerase resulted in the desired level of neutravidin-mediated binding between the polymerase and the PEG-24-biotin surface while blocking the remaining surface with excess neutravidin. .

初めに、統計分析を行なってストレプトアビジン中のポリメラーゼの相対的な希釈を定量し、各占有導波路が１つ以下のポリメラーゼ酵素を含有する許容範囲の確率を生じた。特に、平均密度μのポアソン統計の占有確率（Ｐ_ｏｃｃ）は、Ｐ_ｏｃｃ＝１−Ｐμ（０）＝１−ｅ（−μ）として与えられる。小さな占有数についてはＰ_ｏｃｃ＝μ−μ^２／２＋μ^３／６＋Ｏ（μ^４）である。このように、μを測定する手段として占有確率を用いることによって、μ^２のオーダーの誤差を生じる。このため、μが小さいときはいつでも平均占有数μの尺度として占有確率Ｐ_ｏｃｃを用いることができる。０．３の占有確率については、μの実際値を計算すると約０．３５６７である場合がある。すなわち、この場合、平均占有の推定値として占有確率を使用することによって１６％の誤差をもたらす。０．３５６７の平均占有数については、一切の導波路が空になる７０％の可能性があり、導波路が１つおよびちょうど１つのポリメラーゼを含有する２５％の可能性があり、導波路が１つまたは複数のポリメラーゼを含有する５％の可能性があることは注目に価する。これは、十分に低い占有数については、占有確率の使用は平均占有数の許容範囲の推定値であることを示す。 Initially, statistical analysis was performed to quantify the relative dilution of the polymerase in streptavidin, resulting in an acceptable probability that each occupied waveguide contained no more than one polymerase enzyme. In particular, the occupancy probability (P _oc ) of Poisson statistics with average density μ is given as P _oc = 1−Pμ (0) = 1−e (−μ). For small occupation numbers are ^{_{P occ = μ-μ 2/}} 2 + μ 3/6 + O (μ 4). Thus, by using the occupation probability as a means for measuring μ, an error of the order of μ ² is generated. Therefore, whenever μ is small, the occupation probability P _occ can be used as a measure of the average occupation number μ. For an occupation probability of 0.3, the actual value of μ may be calculated to be about 0.3567. That is, in this case, using an occupation probability as an estimate of average occupation results in a 16% error. For an average occupancy of 0.3567, there is a 70% chance that all waveguides will be empty, a 25% chance that the waveguide will contain one and exactly one polymerase, It is worth noting that there is a 5% chance of containing one or more polymerases. This indicates that for a sufficiently low occupancy number, the use of the occupancy probability is an estimate of the average occupancy number tolerance.

次に、これは、５０倍の過剰なニュートラアビジン中でのビオチニル化酵素の希釈を行なうことによって達成された。希釈および堆積の後、得られた導波路アレイを試験すると、ほぼ３０％の占有を有し、確率とよく相関することがわかった。さらに、これらの導波路内の酵素の特異的活性は、平面表面上で生成された特異的活性データによく相関し（固定化された酵素の非常に高い特異的活性を示した）、統計的方法をさらに実証した。   This was then accomplished by performing a biotinylated enzyme dilution in a 50-fold excess of neutravidin. After dilution and deposition, the resulting waveguide array was tested and found to have approximately 30% occupancy and correlate well with probability. Furthermore, the specific activity of the enzymes in these waveguides correlated well with the specific activity data generated on the planar surface (which showed very high specific activity of the immobilized enzyme) and statistical The method was further demonstrated.

説明目的のためにいくらか詳細に記載されたが、当業者に公知であるかまたは理解される多数の変型が本発明の範囲内で実施されてもよいことは容易に理解されよう。別途、文脈から明らかであるかまたは明記されない限り、本明細書中で与えられた一切の濃度の値は一般に、混合物の特定の成分を添加した時かまたは後に生じるいかなる変換にも関係なく混合値またはパーセンテージを用いて与えられる。本願明細書にすでに明らかに組み込まれていない程度まで、本開示において言及された全ての公開文献および特許文書は、あらゆる目的のためにそれらの全体において参照によって本願明細書に組み込まれる。   Although described in some detail for purposes of illustration, it will be readily understood that numerous variations that are known or understood by those skilled in the art may be implemented within the scope of the present invention. Unless otherwise apparent from the context or specified, any concentration values given herein are generally mixed values regardless of any transformations that occur when or after certain components of the mixture are added. Or given as a percentage. To the extent that they are not clearly incorporated herein, all published documents and patent documents mentioned in this disclosure are incorporated herein by reference in their entirety for all purposes.

反応性表面、基質および同反応性表面、基質の製造および使用方法
低密度の反応性基をその上に有する表面の略図である。 比較的低密度の反応性基をその上に提供するための層状、または多層機能化を有する基質の略図である。 本発明の表面を製造するための１つの典型的なプロセスを図解的に示す。 本発明の低密度反応性表面を製造するための別の典型的なプロセスを図解的に示す。 選択的局在反応性基を提供する本発明の表面を製造するための立体障害に基づくプロセスの実施例を図解的に示す。 比較的低密度の反応性表面を生じるために、２つの異なって官能化された誘導体化基が、その上に配置された表面の略図である。 ほかの場合なら非反応性の基の表面に混じった様々な濃度の反応性基の表面上の水接触角のプロットである。 Reactive surfaces, substrates and methods of making and using the same
1 is a schematic representation of a surface having low density reactive groups thereon. FIG. 2 is a schematic representation of a substrate having a layered or multilayer functionalization to provide relatively low density reactive groups thereon. 1 schematically illustrates one exemplary process for producing a surface of the present invention. Figure 3 schematically illustrates another exemplary process for producing the low density reactive surface of the present invention. Figure 3 schematically illustrates an example of a steric hindrance based process for producing a surface of the present invention that provides a selectively localized reactive group. FIG. 2 is a schematic representation of a surface on which two different functionalized derivatizing groups are placed to produce a relatively low density reactive surface. FIG. 5 is a plot of water contact angle on the surface of various concentrations of reactive groups mixed with otherwise non-reactive group surfaces.

Claims (36)

第１の反応性部分が結合された表面
を含み、前記反応性部分が、５０，０００ｎｍ^２当たり約１の反応性部分〜１００ｎｍ^２当たり１の反応性部分の間の密度において前記表面に結合される、基質。 Includes a surface where the first reactive moiety has been bound, the reactive moiety is coupled to said surface in a density of between reactive moieties of from about 1 reactive moiety ~ 100 nm ² per per 50,000 ² The substrate. 前記反応性部分が、８０００ｎｍ^２当たり約１の反応性部分〜３００ｎｍ^２当たり１の反応性部分の間の密度において前記表面に結合される、請求項１に記載の基質。 Wherein the reactive moiety is bonded to the surface at a density between about 1 reactive moiety of the reactive moieties to 300 nm ² per per 8000 nm ^2, a substrate according to claim 1. 前記反応性部分が、８０００ｎｍ^２当たり約１の反応性部分〜１０００ｎｍ^２当たり１の反応性部分の間の密度において前記表面に結合される、請求項１に記載の基質。 Wherein the reactive moiety is bonded to the surface at a density between about 1 reactive moiety of the reactive moieties 1000 nm ² per per 8000 nm ^2, a substrate according to claim 1. 前記反応性部分以外の前記表面の残部が実質的に非反応性の表面である、請求項１に記載の基質。   The substrate of claim 1, wherein the remainder of the surface other than the reactive portion is a substantially non-reactive surface. 前記反応性部分がリンカー基を介して前記表面に結合される、請求項１に記載の基質。   The substrate of claim 1, wherein the reactive moiety is attached to the surface via a linker group. 前記リンカー基がポリマーを含む、請求項５に記載の基質。   6. A substrate according to claim 5, wherein the linker group comprises a polymer. 前記リンカー基がポリエチレングリコールを含む、請求項５に記載の基質。   6. A substrate according to claim 5, wherein the linker group comprises polyethylene glycol. 前記反応性部分がリンカー基を介して前記表面に結合され、前記実質的に非反応性の表面が、前記反応性部分のない前記リンカー基を含む、請求項４に記載の基質。   5. The substrate of claim 4, wherein the reactive moiety is attached to the surface via a linker group, and the substantially non-reactive surface comprises the linker group without the reactive moiety. 前記第１の反応性部分が結合部分を含む、請求項１に記載の基質。   The substrate of claim 1, wherein the first reactive moiety comprises a binding moiety. 前記結合部分が非特異的結合部分を含む、請求項９に記載の基質。   The substrate of claim 9, wherein the binding moiety comprises a non-specific binding moiety. 前記結合部分が特異的結合部分を含む、請求項９に記載の基質。   10. A substrate according to claim 9, wherein the binding moiety comprises a specific binding moiety. 前記結合部分が特異的結合対の一方のメンバーを含む、請求項１１に記載の基質。   The substrate of claim 11, wherein the binding moiety comprises one member of a specific binding pair. 前記結合部分が抗原、抗体、抗体の結合フラグメント、ポリヌクレオチド、結合ペプチド、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項９に記載の基質。   10. A substrate according to claim 9, wherein the binding moiety is selected from the group consisting of an antigen, an antibody, an antibody binding fragment, a polynucleotide, a binding peptide, biotin, avidin and streptavidin. 前記第１の反応性部分が触媒部分を含む、請求項１に記載の基質。   The substrate of claim 1, wherein the first reactive moiety comprises a catalytic moiety. 前記触媒部分が触媒金属を含む、請求項１４に記載の基質。   The substrate of claim 14, wherein the catalytic moiety comprises a catalytic metal. 前記触媒部分が酵素を含む、請求項１４に記載の基質。   15. A substrate according to claim 14, wherein the catalytic moiety comprises an enzyme. 前記酵素が核酸ポリメラーゼ、リガーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、キナーゼおよびホスファターゼから選択される、請求項１６に記載の基質。   17. A substrate according to claim 16, wherein the enzyme is selected from nucleic acid polymerases, ligases, nucleases, proteases, kinases and phosphatases. 前記酵素がＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１６に記載の基質。   17. A substrate according to claim 16, wherein the enzyme comprises a DNA polymerase. 前記表面が観察領域を含む、請求項１に記載の基質。   The substrate of claim 1, wherein the surface comprises an observation region. 前記表面が光閉じ込めの観察表面を含む、請求項１に記載の基質。   The substrate of claim 1, wherein the surface comprises an optical confinement viewing surface. 前記観察領域がゼロモード導波路の観察表面を含む、請求項１９に記載の基質。   The substrate of claim 19, wherein the viewing region comprises a viewing surface of a zero mode waveguide. 前記基質の前記表面がシリカを含む、請求項１に記載の基質。   The substrate of claim 1, wherein the surface of the substrate comprises silica. 前記基質の前記表面がガラス、石英、溶融シリカ、およびケイ素から選択される、請求項１に記載の基質。   The substrate of claim 1, wherein the surface of the substrate is selected from glass, quartz, fused silica, and silicon. 少なくとも第１の観察領域が設けられた基質であって、前記観察領域が、約１００ｎｍ^２〜５００００ｎｍ^２の領域を有する、基質と、
前記観察領域内の前記表面に結合された１〜３の反応性部分と
を含む、デバイス。 A substrate at least a first observation region is provided, the observation area has an area of about 100nm ² ~50000nm ^2, and the substrate,
1 to 3 reactive moieties bonded to the surface in the observation region. 前記観察領域が、光学的に不透明なクラッディングによって境界を定められる、請求項２４に記載のデバイス。   25. The device of claim 24, wherein the viewing region is bounded by an optically opaque cladding. 前記反応性部分が酵素を含む、請求項２４に記載のデバイス。   25. The device of claim 24, wherein the reactive moiety comprises an enzyme. 前記酵素がＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項２６に記載のデバイス。   27. The device of claim 26, wherein the enzyme comprises a DNA polymerase. 第１の反応性表面を有する基質を提供する工程と、
第１および第２の表面改質剤の混合物を提供する工程であって、前記第１および第２の表面改質剤が各々、前記反応性表面に結合可能であると共に、前記第１および第２の表面改質剤が第２の比において前記反応性表面に結合するように選択された第１の比において前記混合物中に存在する工程と、
前記反応性表面を前記混合物と接触させ、第１および第２の改質剤が前記第２の比において表面に結合された、改質された表面を製造する工程と
を含む、改質された表面を作製する方法。 Providing a substrate having a first reactive surface;
Providing a mixture of first and second surface modifiers, wherein the first and second surface modifiers are each capable of binding to the reactive surface, and the first and second Two surface modifiers are present in the mixture at a first ratio selected to bind to the reactive surface at a second ratio;
Contacting the reactive surface with the mixture and producing a modified surface wherein first and second modifiers are bonded to the surface in the second ratio. A method of creating a surface. 改質される表面を提供する工程と、
改質される前記表面を表面改質組成物と接触させる工程と
を含み、前記表面改質組成物が、
所望の反応性部分に結合される第１の表面改質剤と、
前記所望の反応性部分に結合されない第２の表面改質剤と
を含み、
前記第１の表面改質剤および第２の表面改質剤が、改質された表面を製造する比において前記表面改質組成物中に存在し、前記反応性部分が、５０，０００ｎｍ^２当たり約１の反応性部分〜１００ｎｍ^２当たり１の反応性部分の間の密度において前記改質された表面上に存在する、改質された表面を作製する方法。 Providing a surface to be modified;
Contacting the surface to be modified with a surface modifying composition, wherein the surface modifying composition comprises:
A first surface modifier bound to the desired reactive moiety;
A second surface modifier that is not bound to the desired reactive moiety;
The first surface modifier and the second surface modifier are present in the surface modification composition in a ratio to produce a modified surface, and the reactive moiety is per 50,000 nm ² . A method of making a modified surface present on the modified surface at a density between about 1 reactive portion to 1 reactive portion per 100 nm ² . それに結合された反応性部分を有する表面を含み、前記反応性部分が１００ｎｍ^２当たり１未満の反応性部分の密度において前記表面に結合される、装置。 An apparatus comprising a surface having a reactive moiety attached thereto, wherein the reactive moiety is bonded to the surface at a density of less than 1 reactive moiety per 100 nm ² . 前記反応性部分が１０００ｎｍ^２当たり１未満の反応性部分の密度において前記表面に結合される、請求項３０に記載の装置。 Wherein the reactive moiety is attached to the surface at a density of reactive moieties of less than 1 per 1000 nm ^2, apparatus according to claim 30. 前記反応性部分が１００００ｎｍ^２当たり１未満の反応性部分の密度において前記表面に結合される、請求項３０に記載の装置。 Wherein the reactive moiety is attached to the surface at a density of reactive moieties of less than 1 per 10000 nm ^2, apparatus according to claim 30. 前記反応性部分が分子結合基を含む、請求項３０に記載の装置。   32. The device of claim 30, wherein the reactive moiety comprises a molecular binding group. 前記分子結合基が特異的分子結合基を含む、請求項３３に記載の装置。   34. The device of claim 33, wherein the molecular binding group comprises a specific molecular binding group. 前記特異的分子結合基が、抗体、抗原、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、結合ペプチドから選択される、請求項３４に記載の装置。   35. The apparatus of claim 34, wherein the specific molecular binding group is selected from an antibody, antigen, avidin, streptavidin, biotin, polynucleotide, polynucleotide analog, binding peptide. 表面に実質的に均一に結合する組成物で表面を処理する工程であって、前記組成物が、反応性部分を含有しない第１の成分と前記反応性部分を含む第２の成分とを含み、前記第２の成分が、前記反応性部分を所望の密度において前記表面上に提供するように前記第１の成分に対する濃度において前記組成物中に存在する工程を含む、反応性部分の所望の密度をその上に提供するように表面を構成する方法。   Treating the surface with a composition that binds substantially uniformly to the surface, the composition comprising a first component that does not include a reactive moiety and a second component that includes the reactive moiety. A desired portion of the reactive moiety comprising the step of presenting the second component in the composition at a concentration relative to the first component to provide the reactive moiety on the surface at a desired density. A method of configuring a surface to provide density thereon.