JP2009501543A - グリコシル化されたil−7、調製及び使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新たな及び改善されたIL−7ポリペプチド、製剤原料並びに組成物を開示する。より具体的には、本発明は、グリコシル化の高い程度を有し、及び炭水化物部分のシアル化及びフコシル化によって、より大きな分子サイズとより低い等電点にシフトしたオリゴ糖特性を有する新規のIL−7分子種を開示する。本発明は、これらの新たなオリゴ糖特性が、これらの新たな製剤原料に対して改善された化学的及び薬学的安定性を付与し、並びに、平均残存時間(MRT)の増大によって性質決定せられる、インビボでの投与後における延長された薬物動態特性を付与することを示す。
a)上記組換え宿主細胞を培養すること、及び
b)前記細胞から産生されたIL−7ポリペプチドを回収すること
を含む。
本発明は、過剰グリコシル化されたIL−7組成物、それらの製造及び医薬産業におけるそれらの使用に関する。本発明は、まず、IL−7の活性及び/又は特性が、ポリペプチドのグリコシル化特性に依存して亢進し得ることを示す。本発明は、驚くべきことに、インビトロでのデータとは異なり、少なくとも2つから好ましくは3つの占有されたN結合型グリコシル化部位及び1つのO結合型グリコシル化部位並びにオリゴ糖部分の最大化された末端シアル化を有するIL−7ポリペプチドによって、インビボでの最高活性を達成できることも開示する。本発明は、延長された活性(これにより投与頻度を低下できる。)及び/又は減少した長期免疫原性を示す、人工的に作製された過剰グリコシル化されたIL−7ポリペプチドも開示する。IL−7の有用性を考慮すると、このようなポリペプチド及び組成物は、ヒト対象を含む対象における免疫反応を制御する上で使用するのに、極めて価値があり有用な活性分子である。
本発明において、「IL−7ポリペプチド」は、哺乳動物(例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ネコ又はイヌ)IL−7ポリペプチドを示す。より好ましくは、IL−7ポリペプチドは、特に治療薬又はワクチンとして使用するためのヒトIL−7ポリペプチドである。あるいは、特にヒト以外の霊長類での実験又は獣医学用途で使用する場合、IL−7ポリペプチドは、サルIL−7ポリペプチド又はイヌポリペプチド等のその他の哺乳動物IL−7ポリペプチドであり得る。
本発明において、「過剰グリコシル化されたIL−7」という用語は、少なくとも3つの占有されたグリコシル化部位を有する、すなわち、少なくとも3つのグリコシル化されたアミノ酸残基を有するIL−7ポリペプチドを表す。
Phe39Ser−Phe39Thr−Phe42Ser−Phe42Thr−Leu104Asn−Glu106Thr−Glu106Ser−Leu128Ser−Leu128Thr−Met147Asn及びこれらの組み合わせ、又はこれらの別個の断片
からなる群から選択される1つ又は数個のアミノ酸修飾を含む生物学的に活性な新規IL−7ポリペプチドに関する。
本発明の過剰グリコシル化されたIL−7ポリペプチド中の特定のグリコシル化部位に付着されたオリゴ糖単位の構造及び数は変化し得る。これらは、例えば、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、キシロース、グルクロン酸、イズロン酸及び/又はシアル酸であり得る。
a)哺乳動物型の糖鎖、好ましくはCHO細胞によって発現された種類の前記糖鎖;
b)複合N−糖鎖(例えば、三岐又は二岐構造)を含み、より好ましくは高マンノース及びアセチルグルコサミン分子及び多量の末端シアル酸残基を含有する糖鎖:
c)末端シアル酸残基を有さず、及び好ましくは末端シアル酸残基を有するO−糖鎖を含む糖鎖;
d)α2,6−シアリルトランスフェラーゼ又はα2,3−シアリルトランスフェラーゼによってシアル化された糖鎖;及び/又は
e)3から30の、好ましくは7から23の間のシアリル−N−アセチルガラクトサミンを示すシアル化された糖鎖;
から選択されるN結合型及び/又はO結合型糖鎖を含む(又はそれらに富む。)。
b)前記ポリペプチドは、IL−7ポリペプチドあたりのシアル酸残基を多量に含有し、等電点の値を減少させ、及び平均残存時間の改善をもたらし;及び/又は
c)前記ポリペプチドは、分子間凝集から保護され;及び/又は
d)前記ポリペプチドは、タンパク質分解に対して低下した感受性を有し;及び/又は
e)前記ポリペプチドは、マスクされた抗原部位を含有し、低下した免疫原性傾向、MHCII分子を通じた、APC(抗原提示細胞)捕捉、プロセッシング及び提示に対して低下した脆弱性を反映し;及び/又は
f)前記ポリペプチドは、化学的安定性を増大させ;及び/又は
g)前記ポリペプチドは、グリコシル化されていない親ペプチドと比較して、インビボでの延長された生物学的半減期を有し(IL−7の長期作用イソフォーム);及び/又は
h)前記ポリペプチドは、主として、より優れた平均残存時間(MRT)のために、グリコシル化されていない親タンパク質と比較してインビボでの増大した薬理学的活性を有し;及び/又は
i)前記ポリペプチドは、より長期間作用する生成物のために、1週間に3/4回から1週間に2回又は1回又は2週間ごとに1回まで、投薬スケジュールをあまり頻繁にせず;及び/又は
j)前記ポリペプチドは、改善された薬物動態学的特性(減少したピーク濃度及び改善された平均残存時間)を示し、及び/又は
k)前記ポリペプチドは、質量分析から測定される25KDa、又はSDS−PAGE分析から測定される27kDaを上回る平均分子量及び6.5を下回る平均等電点を示す。
b)グリコシル化の1つの付加的な部位を導入するように修飾されたIL−7一次アミノ酸配列を有し、4つのN結合型炭水化物部位上でグリコシル化され、及び1つのO結合型炭水化物部位(Thr110)でさらにグリコシル化されている又はされていない生物学的に活性なインターロイキン−7類縁体の大部分(80%超、好ましくは90%超、最も好ましくは約95%超);好ましくは、前記構造物は、(1つのO結合型炭水化物部位へ会合されている又は会合されていない)3つ又は2つのN結合型炭水化物部位上のみでグリコシル化された同一類縁体の一部(20%未満、好ましくは約10%未満)を含有する及び/又はモノグリコシル化されたタンパク質若しくはグリコシル化されていないタンパク質を実質的に含まない;又は
c)グリコシル化の2つの付加的な部位を導入するように修飾されたIL−7一次アミノ酸配列を有し、5つのN結合型炭水化物部位上でグリコシル化されており、及び1つのO結合型炭水化物部位(Thr110)上でさらにグリコシル化されている又はされていないインターロイキン−7の生物学的に活性な類縁体の大部分(80%超、好ましくは90%超、最も好ましくは約95%超);好ましくは、前記構造物は、1つのO結合型炭水化物部位に会合されている又は会合していない4、3又は2つのN結合型炭水化物部位のみの上でグリコシル化された同一類縁体の一部(20%未満、好ましくは約10%未満)を含有する及び/又はモノグリコシル化されたタンパク質若しくはグリコシル化されていないタンパク質を実質的に含まない;又は
d)グリコシル化の3つの付加的な部位を導入するよう修飾されたIL−7一次アミノ酸配列を有し、6つのN結合型炭水化物部位上でグリコシル化され、及び1つのO結合型炭水化物部位(Thr110)上でさらにグリコシル化されている又はされていないインターロイキン−7の生物学的に活性な類縁体の大部分(80%超、好ましくは90%超、最も好ましくは約95%超);好ましくは、前記構造物は、1つのO結合型炭水化物部位に会合されている又は会合されていない5、4、3、又は2つのN結合型炭水化物部位上のみでグリコシル化された同一類縁体の一部(20%未満、好ましくは約10%未満)を含有する及び/又はモノグリコシル化されているか若しくはグリコシル化していないタンパク質を実質的に含まない;又は
e)グリコシル化の4つの付加的な部位を導入するように修飾されたIL−7一次アミノ酸配列を有し、7つのN結合型炭水化物部位上でグリコシル化され、及び1つのO結合型炭水化物部位(Thr110)上でさらにグリコシル化されている又はされていないインターロイキン−7の生物学的に活性な類縁体の大部分(80%超、好ましくは90%超、最も好ましくは約95%超);好ましくは、前記構成物は、1つのO結合型炭水化物部位に会合されている又は会合されていない6、5、4、3又は2つのN結合型炭水化物部位上のみでグリコシル化された同一類縁体の一部(20%未満、好ましくは約10%未満)を含有する及び/又はモノグリコシル化された若しくはグリコシル化していないタンパク質を本質的に欠失していることを含む。
本発明の更なる目的は、上記IL−7ポリペプチドをコードする核酸分子に存する。前記核酸分子は、全てのDNA又はRNA分子、典型的にはcDNA分子であり得る。
本発明の別の目的は、所望の生成物として、上記IL−7ポリペプチド、典型的には過剰グリコシル化されたIL−7ポリペプチドを含む製剤原料に存する。より好ましくは、前記製剤原料は、グリコシル化されていない又はモノグリコシル化されたIL−7ポリペプチド約10%未満を含有するか、及び/又は生成物関連不純物を実質的に含まない。
好ましい投与経路は、非経口経路である。非経口経路は、好ましくは腫瘍内、より好ましくは静脈内又は皮下的投与である。非経口投与には、動脈内、腹腔内又は筋肉内注入も含まれる。しかしながら、患者の健康状態及び反応性に応じて、その他の適切な投与経路を想定し得ることを理解すべきである。
−悪性細胞又は感染因子に対する特異的免疫反応の増強を誘導するのに有効な量のワクチン増強剤としての使用(抗原投与の前、途中又は実質的に同時の該組成物の投与);及び
−起源が、感染、照射、移植(BMT、SCT)又は薬物の何れであれ、患者の免疫再構成を誘導するための使用;
が含まれる。
本発明の別の態様は、上述の構成物、特に上述の過剰グリコシル化されたIL−7ポリペプチド、構成物及び製剤原料を、その医薬的使用に十分な量及び質で作製するための適切なコンストラクト及び方法を提供することである。
a)上記組換え宿主細胞を培養すること、及び
b)該細胞から産生されるIL−7ポリペプチドを回収すること
を含む。
哺乳動物細胞中での、最適化されたヒト(h)及びサル(s)IL−7コードヌクレオチド配列の構築及び発現
A1.最適化されたヒトIL−7コードヌクレオチド配列の構築
1.1.ペプチドシグナルの最適化:
天然IL−7ペプチドシグナルに対して5’末端で連結されたIL−7cDNA断片の発現が非常に低いため、本発明者らは、数個のシグナルペプチド配列を検査した。新たなヒトIL−7コードcDNA配列を、重合した合成オリゴヌクレオチドから化学的に取得した。
EP/7hIL−7アミノ酸配列を維持しながら、
−(Graphical Codon Usage Analyserソフトウェアを使用する)ヒトのレアコドンの除去
−シグナルペプチド配列(Kim et al.; 1997; Gene; 199)を除く配列の「GC」含有量を亢進させること、及び「CA」ジヌクレオチドの連続を最小化すること
によってmRNA安定性を亢進させることによって核酸配列を最適化した。
ヒトIL−7コード配列に関して記載のとおり、EP/7−sIL−7最適化配列を合成した(配列番号3)。
イヌ腎臓cDNAライブラリ(Biochain)からのPCRによって、イヌIL−7cDNAを増幅し、ヒトIL−7コード配列に対して上述したとおりに、クローニング及び配列決定を行い、IL−7SP又はEP/7SP−cIL−7配列を合成した(配列番号6)。
ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)(Mullis et al.; 1987;Methods in Enzymology; 155: 335−350)により、IL−7コードcDNA配列を増幅し、発現ベクターへのクローニングのための制限部位(NotI/SwaI)を作製した。
−tkプロモーター:pMEP4由来のEcoRI/HindIII PCR断片(Invitrogen);
−sv40エンハンサー:pVitro2.mcs由来のBssHII/EcoRI PCR断片(Invitrogen);
−MARウサギBグロビン:染色質の高度に転写された領域pSG5(Stratagene)由来のEcoRV/AgeIウサギβグロビンイントロン2PCR断片中へのより優れた組み込みのための「マトリクス付着領域」候補;
−SpA:pCAT3コントロール(Promega)由来のStuI/BspEI断片
−Pgkプロモーター:pQBI.pgk(Q−biogen)由来のKpnI/BssHII PCR断片;
−5’UTRint1:pCAT3−コントロール(Promega)由来のHindIIIキメライントロン断片;
−NotI/SwaI又はNotI/PmlI IL−7コードcDNA及び変異体;
−hghpA:M.Goodman(DeNoto et al.; 1981; Nucl.Acid.Res.;9(51):3719−3730)により記載されたヒト成長ホルモンcDNA配列由来のNruI/SwaI合成。
pgkプロモーターはまた、同一発現ベクター中にて、PubMed(X53530番)(Carter et al.; 1984; Proc.Natl.Acad.Sci.USA; 81: 7392−7396)において参照される、化学的に合成されたBspEI/BssHII「マウスMT1」配列によって、置換されている。
哺乳動物宿主細胞培養における細胞生存率を亢進させるために、従って、IL−7産生の量を最適化するために、Bcl2の抗アポトーシス作用をバイオリアクター生成において検査できるように、tkプロモーターとhph cDNAとの間にBcl2 cDNA配列を挿入することによって変異体発現プラスミドを調製した(Zhong et al.; 1993; Proc.Natl.Acad.Sci.USA; 90: 4533−4537、Lee et al.; 2000; Journal of cell Science; 114(4):677−684)(図2参照)。
哺乳動物細胞中でのIL−7コードヌクレオチド配列の過剰グリコシル化された類縁体の構築及び発現
B1.過剰グリコシル化されたIL−7類縁体のcDNA配列の構築
変異誘発法を含む数個の技術を使用して、過剰グリコシル化されたIL−7類縁体を得た。重合した合成オリゴヌクレオチドから、過剰グリコシル化されたIL−7類縁体(あるいは、HG37 −40 −104 −126及び−147)を化学的に構築した。1つ又はそれ以上の更なるグリコシル化部位を有するIL−7類縁体を与えるように、1つ又はそれ以上の望ましい変異を導入することによって、数個の類縁体を得た。従って、NotI及びPmlI制限酵素による消化の後、発現ベクター内への直接的クローニングためのNotI/PmlI制限部位の間に、1つ又は複数の望ましい更なるグリコシル化部位を含有する得られた全長cDNA配列を挿入した(図1又は2と同様であるが、適切なIL−7配列を含有している。)。
A4章からA6章に上述されているとおり、過剰グリコシル化されたIL−7類縁体の発現を実施した。
バイオリアクター培養条件における組換えhIL−7の産生
高細胞密度培養物中での生産性及び増殖について最適化されたクローンを得るために、数個の培地及び成分スクリーニングによって、実施例A4のような最も安定な陽性クローンを無血清懸濁培養用に適応させた。100から2000Lのバイオリアクターへの播種の前に、「波動動作バッグ(wave bag)」系中で前培養を実施する。10から15日間、灌流系又は流加系で100から2000Lのバイオリアクター中で細胞培養を実施する。植物ペプトンを補充した低グルタミン含有培地中で、1千万個細胞/mLの濃度まで細胞を増殖させた。最初の増殖段階において、培養温度を37℃に制御し、細胞密度を増大させる。数日後、約28/32℃まで温度を低下させ、細胞増殖を阻害し、より良好な発現レベルとした。さらに、温度を低下させて、分泌経路の速度を低下させ、増加した部位占有率を有する発現されたIL−7のグリコシル化をより良好なものとした。培養終了の数日前、培地中の0.5から10mM酪酸ナトリウムの添加により、IL−7発現を強化した。上述の条件下で、IL−7発現を細胞の内側と培地中の両者でモニターした(図3)。高分子量IL7グリコフォームを得るために、良好な酸素負荷並びに、培養時の培地中での3g/Lのグルコース及び3mMのグルタミンを維持する。アミノ酸消費量もモニターし、アミノ酸の枯渇した培養物を提供する。細胞生存率が90%未満に低下したら直ちに、細胞培養物を回収する。
HEK−293及びCHO細胞中で発現された組換えヒトIL−7生成物の精製
粗細胞培地を回収し、遠心分離して全細胞及び細胞片をペレットにした。あるいは、これは、Mustang XTカプセル(Pall)、Sartoclear P(Sartorius)、Millistak+Opticap(Millipore)又は中空ファイバーカートリッジ(AXHクロスフロー10(GE))又は均等物等の清澄カプセル又はモジュール上での深層ろ過によって達成できる。メンブレンが10kDaをカットオフするCentrasette Cassette装置(Pall Life Sciences)を使用して、遠心分離した培地を約10倍に濃縮し、上清の容積を低下させた。同様の空隙率を有するその他のろ過/濃縮系も使用できた。
糖タンパク質炭水化物の分析
組換えヒトIL−7の作製は、以下の理由のため、CHO細胞ベースの発現系において実施したが、以下の理由に限定されるものではない。CHO細胞は、組換えヒト治療用糖タンパク質の産生に使用される最も有効性が確認され、かつ最も一般的な現在の宿主である。さらに、シアリル−α−1−6トランスフェラーゼを発現する遺伝的に改変されたCHO細胞株などのCHO細胞が、ヒト細胞において観察されるのと同様に、定性的な様式で組換えタンパク質をグリコシル化できることが、多数の詳しい研究によって報告されている。この特定の特徴は、ヒト患者に注入する場合に、組換え糖タンパク質が有し得る免疫原性を低下させるために特に重要であった。
LEAは、リコペルシコン・エスキュレンタム(Lycopersicon esculentum)由来のレクチンである。
WGAは、トリチカムバルガレ(Triticum vulgare)由来である。
UEA.Iは、ユーレックスエウロペウス(Ulex europeus)由来である。
MAAは、マーキア・アムレンシス(Maackia amurensis)由来である。
ACAは、アマランザスコーダタス(Amaranthus Caudatus)由来である。
AIAは、アルトカルパス・インテルグリフォリア(Artocarpus intergrifolia)由来である。
ABAは、アガリクス・ビスポラス(Agaricus bisporus)由来である。
PHA.Lは、ファセオラス・バルガリス(Phaseolus vulgaris)由来である。
製剤原料から薬品まで:組換えCHO細胞によって発現されたhIL−7の製剤、保存及び長期安定性
精製されたタンパク質の長期安定性に及ぼす多様なストレス条件(温度、緩衝液、pH、緊張度修飾因子濃度、撹拌、強い照明)の影響を評価するためのコンビナトリー(combinatory)マトリクス研究を通じて、製剤原料の最適な製剤に対する検索を実施した。高度重合型の精製された組換えヒトIL−7は、5から50mMの間の範囲の濃度で、コハク酸塩緩衝液及び酢酸塩中で安定であることが示された。適切なpHは、pH=5.0から7.0から選択され、理想貯蔵温度は−20℃から+4℃の間であった。糖及び界面活性剤(ポリソルベートポリマー)の低濃度を調製物へ添加して、非共有結合性の可溶性凝集を防止し得る。このような条件において、IL−7は、0.5から8.0mg/mL、好ましくは2.0から4.0mg/mLの範囲の濃度で12ヶ月間超、+4℃で(液状で)保存できた。液状の医薬組成物は、改善された安定特性を有する。
特異的バイオアッセイにおける哺乳動物細胞由来の組換えヒトIL−7の増殖活性分析
増殖に関してIL−7に厳密に依存的な(Mire−Slouis et al.; 2000;J.Immunol.Methods; 236: 71−76)、CBA/C57BLマウス由来の骨髄細胞由来のネズミプレB細胞系PB−1(German Cell Bank DSMZ、Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen)への特異的バイオアッセイにおいて、哺乳動物細胞由来の組換えヒトIL−7の生物活性を評価した。これらの細胞を、市販のIL−7含有培地中の培養物中で維持し、IL−7に関して枯渇させた後、バイオアッセイを実施した。公知のイー・コリ由来のIL−7陽性対照及びIL−7を欠失する陰性対照と平行して、検査されるべきIL−7試料でバイオアッセイを実施した。
図14は、典型的なバイオアッセイにおいて通常のようにして得られた用量−反応動態データ及び曲線を示す。(イー・コリ中で発現した)グリコシル化されていないr−hIL−7又は(哺乳動物細胞中で産生した)高度にグリコシル化されているか又は過剰グリコシル化されたr−hIL−7により、PB−1細胞増殖を誘導した。(データ地点は、三通りの測定の平均±標準偏差を表す。)
各試料に関して考慮されるべき重要なパラメータは、最大活性の半分を与えるED50=濃度(ng/mL)であった。より高いED50は、より低い活性を意味する。IL−7バッチ間の活性の比較は、傾斜係数、最大活性等の用量反応曲線パラメータの分析を介して行った。全ての曲線パラメータから、(ng/mLでの)ED50濃度は、パラメータ変動を一緒にプールする。ED50は、インビトロでの可能な最大誘導活性の半分を誘導するのに必要なIL−7用量に相当する。この点において、高度に生物学的に活性な分子は、低いED50値に相当するのに対し、より高いED50濃度は、典型的には、インビトロでのより低い生物活性のIL−7調製物から得られる。それにもかかわらず、インビトロでの生物活性の差異は、本発明における同様のインビボでの生物活性の差異を必ずしも表さない。
霊長類での過剰グリコシル化されたIL−7ポリペプチドの免疫原性のインビボでの評価
CHO細胞系(実施例A2、A6及びB)において発現され、実施例Dに従って精製された過剰グリコシル化されたサルIL−7(sIL−7)を、生じ得る免疫原性に関してインビボで評価した後、正常な霊長類でsIL−7の反復投与を実施した。
正常な霊長類においてhIL−7の薬物動態及び薬力学的特性を測定するために、CHO細胞系(実施例A1、A6及びB)で発現され、実施例Dのように精製された過剰グリコシル化されたヒトIL−7(hIL−7)をインビボで評価した。
・血漿特性は、ピーク吸収後に二指数関数的低下を示した。
・血漿中で観察された生成物半減期は、30/40時間の範囲であった。この半減期は、同一条件下で投与されたイー・コリ由来の組換えIL−7で観察される半減期(5から8時間)と比較すると、有意に増大している。このことは、血液中での過剰グリコシル化されたIL−7ポリペプチドのインビボでの改善された安定性を反映する。
・平均残存時間(MRT)は、約40時間であったのに対し、イー・コリ生成物では約10時間であった。
・最大濃度に到達する時間は180分であった。
Claims (38)
- 少なくとも3つのN−グリコシル化されたアミノ酸残基を含有する、精製された、哺乳類の過剰グリコシル化されたIL−7ポリペプチド。
- 少なくとも3つの異なるアミノ酸残基上でN−グリコシル化された少なくとも80%のIL−7ポリペプチドを含む、過剰グリコシル化されたIL−7構成物。
- 少なくとも3つの異なるアミノ酸残基上でN−グリコシル化される80%と95%の間のIL−7ポリペプチドを含む、請求項2に記載の構成物。
- 1つのO−グリコシル化部位及び最大7つのN−グリコシル化部位を含む、3つから最大8つの異なるアミノ酸残基上でグリコシル化された少なくとも80%のIL−7ポリペプチドを含む、請求項2又は3に記載の過剰グリコシル化されたIL−7。
- 1つのO−グリコシル化部位及び最大7つのN−グリコシル化部位を含む、3つから最大8つの異なるアミノ酸残基上でグリコシル化された少なくとも80%と95%の間のIL−7ポリペプチドを含む、請求項4に記載の構成物。
- IL−7ポリペプチドがヒトIL−7ポリペプチドである、請求項2から5の何れか一項に記載の過剰グリコシル化されたIL−7構成物。
- グリコシル化部位が、IL−7ポリペプチド配列中に天然に存在する及び/又は人工的に作製される、請求項2から6の何れか一項に記載の過剰グリコシル化されたIL−7構成物。
- IL−7ポリペプチドがヒトIL−7ポリペプチドであり、並びに、グリコシル化部位が、位置70、91及び116に存在するAsn残基;位置110に存在するThr、並びに表1に列挙されており、及び好ましくは表2に列挙されている人工的に作製された全てのグリコシル化部位又はそれらの組み合わせから選択される、請求項2から7の何れか一項に記載の過剰グリコシル化されたIL−7構成物。
- 前記IL−7ポリペプチドが、
a)好ましくはCHO細胞によって発現された種類の、哺乳類型の糖鎖;
b)複合N−糖鎖(例えば、三岐又は二岐構造)を含み、より好ましくは高マンノース及びアセチルグルコサミン分子並びに高末端シアル酸残基を含有する糖鎖;
c)α2,6−シアリルトランスフェラーゼ又はα2,3−シアリルトランスフェラーゼによってシアル化された糖鎖;及び/又は
d)3から30の間の、好ましくは7から23のシアリル−N−アセチルガラクトサミンを示すシアル化された糖鎖;
から選択されるN結合型を含む又はN結合型に富む、請求項2から7の何れか一項に記載の過剰グリコシル化されたIL−7構成物。 - 前記IL−7ポリペプチドが、末端のシアル酸残基を有するO結合型糖鎖を更に含む又は末端のシアル酸残基を有するO結合型糖鎖に更に富む、請求項9に記載の過剰グリコシル化されたIL−7構成物。
- 糖鎖が、部分的又は完全な末端シアル化を有する四岐から二岐の構造、より好ましくは三岐構造及び三シアル化又は二シアル化及び/又は二シアル化を有する二岐構造を含む、請求項9に記載の過剰グリコシル化されたIL−7構成物。
- 前記IL−7ポリペプチドが、6.5未満の平均等電点及び質量分析によって測定される25KDaを超える見かけの平均分子量又はSDSゲル電気泳動法によって測定される27KDaを超える平均分子量を有する、請求項2から11の何れか一項に記載の過剰グリコシル化されたIL−7構成物。
- 前記IL−7過剰グリコシル化されたポリペプチドが、哺乳動物宿主において、インビボでの延長された半減期及び平均滞留時間を示す、請求項2から12の何れか一項に記載の過剰グリコシル化されたIL−7構成物。
- 修飾されたアミノ酸配列が、少なくとも1つの人工的に作製されたグリコシル化部位を含む、前記アミノ酸配列を有するIL−7ポリペプチド。
- ポリペプチドが、1、2、3又は4個の、より好ましくは1、2又は3個の、更により好ましくは1又は2個の人工的に作製されたグリコシル化部位を含む、請求項14に記載のポリペプチド。
- Lys28Asn−Ile30Ser−Ile30Thr−Ile30Asn−Ser32Thr−Leu35Ser−Leu35Thr−Glu38Ser−Glu38Thr−Phe39Ser−Phe39Thr−Phe42Ser−Phe42Thr−Glu52Ser−Glu52Thr−Val82Asn−Glu84Thr−Glu84Ser−Lys97Asn−Arg99Thr−Arg99Ser−Ala102Asn−Leu104Thr−Leu104Ser−Leu104Asn−Glu106Thr−Glu106Ser−Leu128Ser−Leu128Thr−Ile145Asn−Met147Thr−Met147Ser−Met147Asn−Thr149Serから選択される1つ又は複数のアミノ酸修飾を含むヒトIL−7ポリペプチドの配列、又は、その、少なくとも5つのアミノ酸残基、典型的には少なくとも8、9、10、11、12又は15の残基を含有する個別の断片を含む、請求項14又は15に記載のポリペプチド。
- 請求項14から15の何れか一項に記載のIL−7ポリペプチドをコードする核酸分子。
- 配列番号19を含むポリペプチドをコードする核酸分子。
- 配列番号2若しくは4の配列又はそれらの相補鎖を含む核酸分子。
- 配列番号6の配列を含む核酸分子。
- 請求項17から20の何れか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項21に記載のベクターを含む組換え宿主又は宿主細胞。
- 前記宿主又は宿主細胞が、天然に又は遺伝子組換え後に、適切なグリコシルトランスフェラーゼ及び/又はシアリルトランスフェラーゼ遺伝子、好ましくはα2−6シアリルトランスフェラーゼ遺伝子を発現する又は過剰発現する、請求項22に記載の組換え宿主又は宿主細胞。
- a)IL−7ポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞を培養すること、及び
b)前記細胞から産生されたIL−7ポリペプチドを収集すること
を含み、過剰グリコシル化されたIL−7ポリペプチドの産生を可能にするため、培養が流加培養又は灌流培養モードで実施される、請求項1から16の何れか一項に記載のIL−7ポリペプチドを産生する方法。 - グリコシル化されていない又はモノグリコシル化されたIL−7ポリペプチドの約10%未満を含有し、及び/又は産物関連不純物を実質的に含まない、請求項2から16の何れか一項に記載のIL−7ポリペプチド組成物を含む製剤原料。
- 請求項1から16の何れか一項に記載のIL−7ポリペプチドと特異的に免疫反応性である、抗体及びその断片又は誘導体。
- 請求項26に記載の抗体を含む医薬組成物。
- 哺乳動物対象におけるリンパ球増殖性疾患又は自己免疫疾患を治療するための医薬の製造のための、請求項26に記載の抗体の使用。
- 請求項25に記載の製剤原料の有効量と、及び医薬として適合性のある1つ又はそれ以上の担体又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
- 前記組成物が、1週間に3回、1週間に2回、1週間に1回、隔週ごとに1回、1ヶ月に1回、ワクチン接種前に1回若しくは2回又はワクチン接種の前及び後に投与される、請求項29に記載の医薬組成物。
- 対象における免疫反応を引き起こし又は調節するための医薬の製造のための、請求項2から13の何れか一項に記載の過剰グリコシル化されたIL−7ポリペプチド構成物の使用。
- 医薬が、延長されたリンパ球新生の刺激及び/又は免疫反応の増幅の誘導のための医薬である、請求項31に記載の使用。
- 医薬が、HIV感染、ウィルス肝炎、ウェストナイル熱、デング熱などのウィルス感染を治療するための医薬である、請求項31に記載の使用。
- 過剰グリコシル化されたIL−7ポリペプチドが、インターフェロン分子とともに投与される、請求項33に記載の使用。
- 医薬が、免疫無防備状態の対象における胸腺新生の回復を改善させるためのものである、請求項31に記載の使用。
- 過剰グリコシル化されたIL−7ポリペプチドが、角化細胞増殖因子、幹細胞因子、ゴナドスチムリンアンタゴニスト又は成長ホルモンとともに投与される、請求項35に記載の使用。
- 過剰グリコシル化されたIL−7ポリペプチドが、悪性細胞、ウィルス又は細菌に対する治療用免疫化を提供するために、抗原又は抗原の混合物とともに投与される、請求項21に記載の使用。
- 過剰グリコシル化されたIL−7ポリペプチドが更に、GM−CSFとともに投与される、請求項37に記載の使用。
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