JP2009213460A - Micro flow path system for treating particle, and method for treating the particle - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、動植物細胞、バクテリア、ウイルス等の細胞またはそれらの構成要素であるオルガネラ等の生物粒子、また、ポリマー粒子、セラミックス粒子や金属微粒子を、連続的かつ迅速に複数種類の流体中を通過させることによって、ある一定の時間、その表面および／または内部において物理的、化学的、あるいは生物学的な反応や修飾を行うための流路構造および方法に関する。 The present invention continuously and rapidly passes through a plurality of kinds of fluids such as animal and plant cells, bacteria, viruses and other biological particles such as organelles, polymer particles, ceramic particles and metal fine particles. The present invention relates to a flow channel structure and method for performing a physical, chemical, or biological reaction or modification on the surface and / or inside thereof for a certain period of time.
一般に、ポリマー粒子や金属粒子をある一定の時間、ある化学物質を含む溶液中に導入し、その後別の溶液で洗浄する、という技術は、粒子を利用した免疫分析、あるいは粒子を利用したＤＮＡ・ペプチド・ポリマーなどの固相合成等の分野において、非常に有用である。 In general, the technique of introducing polymer particles or metal particles into a solution containing a certain chemical substance for a certain period of time and then washing with another solution is an immunoassay using particles, or DNA / DNA using particles. This is very useful in the field of solid phase synthesis of peptides and polymers.
また、細胞をある一定の時間、たとえば１ミリ秒から１分程度の任意の時間のみ、ある溶液中に導入し、物理的、化学的、あるいは生物学的な処理を行い、さらにその処理を止めるために別の溶液中に導入する、という一連の技術は、たとえば細胞表面で起こる膜タンパク質分子の構造変化、細胞内でのシグナル伝達の解明などの研究分野において非常に重要であり、さらに、化学物質の細胞に対する急性毒性を評価する際にも非常に有用である。 In addition, cells are introduced into a solution only for a certain period of time, for example, an arbitrary period of about 1 millisecond to 1 minute, and a physical, chemical, or biological treatment is performed, and then the treatment is stopped. In order to achieve this, a series of techniques such as introduction into a separate solution is very important in research fields such as structural changes of membrane protein molecules that occur on the cell surface, elucidation of intracellular signal transduction, and It is also very useful in evaluating the acute toxicity of substances to cells.
さらに、細胞、オルガネラ、微生物などの粒子を、ある特定の表面分子に対する抗体マーカー等で染色する技術は、細胞集団の解析や分画等のための技術であるフローサイトメトリーにおいて不可欠であり、そのような染色の際に、染色時間を正確にコントロールすることは非常に重要である。 Furthermore, the technique of staining particles such as cells, organelles, and microorganisms with an antibody marker for a specific surface molecule is indispensable in flow cytometry, which is a technique for analyzing and fractionating cell populations. In the case of such staining, it is very important to accurately control the staining time.
従来、細胞や粒子をある一定の時間、ある化学物質を含む溶液を用いて処理する、あるいは、粒子表面においてある一定の時間化学反応を行うためには、粒子や細胞の懸濁溶液にある試薬を混合し、一定の時間後、膜状の構造あるいは遠心分離法を用いて、その溶液を回収する、あるいは他の溶液と交換する、という手法が用いられてきた。また、粒子を用いた固相合成を行う際には、カラムに粒子を充填し、反応溶液や洗浄溶液を段階的に導入し、溶液を交換する、という手法が用いられる。 Conventionally, in order to treat cells and particles with a solution containing a chemical substance for a certain period of time, or to perform a chemical reaction on the particle surface for a certain period of time, a reagent in a suspension solution of particles or cells After a certain period of time, a method has been used in which the solution is recovered or replaced with another solution using a membrane-like structure or a centrifugal separation method. Further, when performing solid-phase synthesis using particles, a method is used in which particles are packed in a column, a reaction solution or a washing solution is introduced stepwise, and the solution is exchanged.
しかしながら、このような手法には、細胞や粒子を連続的に処理することは不可能である。たとえば、１０秒程度以下の短時間での溶液の交換は困難であった。また、溶液を交換する際に、異なる組成の溶液の完全な交換が不可能であった。すなわち、交換する前の溶液の一部が交換した後の溶液中に混入してしまう、といった問題点生じていた。 However, it is impossible for such a technique to continuously treat cells and particles. For example, it was difficult to exchange the solution in a short time of about 10 seconds or less. Further, when the solution is exchanged, it is impossible to completely exchange solutions having different compositions. That is, there has been a problem that a part of the solution before replacement is mixed into the solution after replacement.
一方、たとえば細胞表面で起こる膜分子の構造変化を観察するときは、細胞を非常に短い時間、たとえば数十ミリ秒程度だけ、所定の試薬によって処理する、あるいは刺激を与え、さらにその処理反応を急激に停止するための手法として、急速冷凍法が用いられてきた。そのための装置としては、細胞懸濁液と細胞処理溶液を混合するためのフローセルと液体窒素やドライアイス等によって凍結を行うためのバイアルからなる装置が用いられてきた。しかしながら、この急速冷凍法には、細胞を生きたまま回収することが不可能であること、凍結した溶液から細胞処理のための試薬を取り除くことが困難であり、従って、一段階の処理しか実施できなかった。すなわち、複数の試薬を用いて洗浄と反応を繰り返すための段階的な処理ができない、といった問題点があった。
一方、最近、微細加工技術を利用して作製した流路構造を有するマイクロ流路システム（マイクロ流体デバイス、マイクロチップとも呼ばれる）を用いて、細胞や粒子が懸濁している溶液、つまりキャリアとなる溶液を交換する、というシステムが提案された。ここでは、たとえば超音波や誘電泳動とマイクロ流路内の層流を組み合わせることで、細胞をある溶液からある溶液の中に連続的に導入する、という操作が行われている。しかしながら、これらのマイクロ流路システムでは、外部から物理的な力を加えるための装置が必要である、多段階の溶液の交換には不向きである、といった問題点があった。また、これらのマイクロ流路システムにおいても、溶液の交換が短時間で達成されないため、分子拡散により溶液間での混合が起き、完全な交換ができず、すなわち、交換する前後の溶液がある程度混合してしまう、という問題点があった。
本発明は、従来の技術の有する上記したような種々の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、粒子や細胞をある試薬によって一定時間処理する場合に、交換前後の溶液間で混合がほとんど起きることなく、粒子や細胞の処理を可能とするシステムを提供しようとするものである。
また、本発明の目的とするところは、粒子や細胞を処理する際に、送液装置以外の物理的な制御装置を必要としないシステムを提供しようとするものである。
また、本発明の目的とするところは、粒子や細胞を処理する際に、目的によっては、多段階での処理を可能とし、また細胞を用いる場合は、細胞を凍結することなく回収することを可能とするシステムを提供しようとするものである。The present invention has been made in view of the above-described various problems of the prior art, and the object of the present invention is that before and after replacement when particles or cells are treated with a reagent for a certain period of time. It is an object of the present invention to provide a system that enables processing of particles and cells with little mixing between solutions.
Further, an object of the present invention is to provide a system that does not require a physical control device other than a liquid feeding device when processing particles or cells.
Further, the object of the present invention is to allow multi-stage processing depending on the purpose when processing particles or cells, and to recover cells without freezing them when cells are used. It is intended to provide a system that enables it.
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、主流路内に粒子懸濁溶液、粒子処理溶液、および粒子洗浄溶液をそれぞれ連続的に導入した際、主流路内において、粒子懸濁溶液、粒子処理溶液、および粒子洗浄溶液がそれぞれ９９％以上の純度でほとんど混合することなく流れる状況が形成され、かつ粒子はその溶液の流れの中を順に通過することで一定時間処理される、粒子処理用マイクロ流路システムを利用することで目的通りの処理を実施することができるようになることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted research and development by adding studies from various angles. As a result, when the particle suspension solution, the particle treatment solution, and the particle cleaning solution are continuously introduced into the main channel, 99% of the particle suspension solution, the particle processing solution, and the particle cleaning solution are respectively obtained in the main channel. The purpose is to use a micro-channel system for particle processing, in which a flow situation is formed with little or no purity and almost no mixing, and the particles are processed for a certain period of time by sequentially passing through the solution flow. It was found that it would be possible to carry out the street processing. The present invention has been completed based on such findings.
すなわち、本発明は、平均粒径がＲμｍ（Ｒは１以上１００以下）である粒子の表面および／または内部を連続的に処理するための、主流路（Ｄ）に対し導入流路および導出流路を有するマイクロ流路システムであり、そのシステムが、（１）導入口（ＤＰ）より溶液Ａ（組成ａ）が連続的に導入される直径１．５Ｒμｍ〜３０Ｒμｍの主流路（流路部Ｄ１）と、合流点（ＤＰ１）において主流路（流路部Ｄ１）に合流し溶液Ａとは異なる組成の溶液Ｂ（組成ｂ）が連続的に導入される導入流路（Ｐ１）、並びに合流点（ＤＰ１）より下流における分岐点（ＤＲ１）において主流路（流路部Ｄ１）より分岐し溶液Ａおよび一部の溶液Ｂが排出される直径０．５Ｒμｍ〜１０Ｒμｍの導出流路（Ｒ１）、並びに分岐点（ＤＲ１）より下流における主流路（処理部ＤＥ）、から構成され、（２）さらに、主流路（処理部ＤＥ）の下流における直径１．５Ｒμｍ〜３０Ｒμｍの主流路（流路部Ｄ２）と、合流点（ＤＰ２）において主流路（流路部Ｄ２）に合流し溶液Ｃ（組成ｃ）が連続的に導入される導入流路（Ｐ２）、並びに合流点（ＤＰ２）より下流における分岐点（ＤＲ２）において主流路（流路部Ｄ２）より分岐し、主流路（処理部ＤＥ）内を通過した溶液および一部の溶液Ｃが排出される直径０．５Ｒμｍ〜１０Ｒｕｍの導出流路（Ｒ２）、並びに分岐点（ＤＰ２）の下流における主流路（Ｄ）の導出口（ＤＲ）、から構成され、（３）主流路（Ｄ）における分岐点（ＤＲ１）から主流路（処理部ＤＥ）へと流れる溶液の純度が、導入流路（Ｐ１）より導入された溶液Ｂ（組成ｂ）の９９％以上であり、（４）さらに主流路（Ｄ）における分岐点（ＤＲ２）から導出口（ＤＲ）へと流れる溶液の純度が、導入流路（Ｐ２）より導入された溶液Ｃ（組成ｃ）の９９％以上であり、（５）当該粒子が溶液Ａ（組成ａ）と共に主流路（Ｄ）に導入され、主流路（Ｄ）内を流れる各組成の溶液内を連続的に通過し、導出口（ＤＲ）より回収されることを特徴とする、粒子処理用マイクロ流路システムを提供する。加えて、本発明ではそのマイクロ流路システムを利用した粒子処理方法を提供する。 That is, the present invention provides an introduction flow path and a discharge flow with respect to the main flow path (D) for continuously treating the surface and / or the inside of particles having an average particle size of R μm (R is 1 or more and 100 or less). This is a micro-channel system having a channel, and (1) a main channel (channel unit D1) having a diameter of 1.5 Rm to 30 Rm into which the solution A (composition a) is continuously introduced from the inlet (DP) ), The introduction channel (P1) where the solution B (composition b) having a composition different from that of the solution A is merged into the main channel (channel part D1) at the junction (DP1), and the junction A discharge channel (R1) having a diameter of 0.5 Rμm to 10 Rμm branched from the main flow channel (flow channel portion D1) at a branch point (DR1) downstream from (DP1), and from which a solution B and a part of the solution B are discharged; Main downstream from the branch point (DR1) (2) Furthermore, at the confluence (DP2), the main flow path (flow path section D2) having a diameter of 1.5 Rμm to 30 Rμm downstream of the main flow path (processing section DE). The main flow path (flow) at the introduction flow path (P2) where the solution C (composition c) is continuously introduced into the main flow path (flow path portion D2) and the branch point (DR2) downstream from the merge point (DP2). A branch channel (R2) having a diameter of 0.5 Rm to 10 Rum from which the solution and a part of the solution C branched from the channel D2) and passed through the main channel (processing unit DE) are discharged, and a branch point (DP2) (3) The purity of the solution flowing from the branch point (DR1) in the main channel (D) to the main channel (processing section DE) is introduced. Of solution B (composition b) introduced from the flow path (P1) The purity of the solution flowing from the branch point (DR2) to the outlet (DR) in the main channel (D) is 9% or more, and the solution C (composition c) introduced from the introduction channel (P2) 99% or more)), and (5) the particles are introduced into the main channel (D) together with the solution A (composition a), and continuously pass through the solution of each composition flowing in the main channel (D), Provided is a microchannel system for particle processing, which is collected from an outlet (DR). In addition, the present invention provides a particle processing method using the microchannel system.
本発明の技術であれば粒子懸濁溶液、粒子処理溶液、粒子洗浄溶液を、それぞれある形状を持つ微細な流路構造に連続的に導入するだけで、外部からの電気的、機械的な操作を用いることなく、処理したい粒子を連続的に短時間処理することができるようになる。そして、その粒子の処理時間は、１ミリ秒から１分の間の任意の時間にすることができ、しかもその時間を正確に制御することができる、という優れた効果を発揮する。更に本発明であれば、粒子を複数の種類の溶液中を通過させる際、それらの溶液間の混合がほとんど起こることなく、ほぼ理想的な濃度条件での粒子の処理もできるようになる。従って、本発明は、免疫染色後の細胞を光学的に検出し、電気的にソーティングするためのＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）システム等のセルソーターにおいて、細胞の染色などの前処理のための装置・手法として組み入れることもできるようになる。 With the technology of the present invention, an electric and mechanical operation from the outside can be performed simply by continuously introducing a particle suspension solution, a particle treatment solution, and a particle cleaning solution into a fine channel structure having a certain shape. Without using, the particles to be processed can be continuously processed for a short time. And the processing time of the particle | grains can be made into arbitrary time between 1 millisecond and 1 minute, and the outstanding effect that the time can be controlled correctly is exhibited. Furthermore, according to the present invention, when passing particles through a plurality of types of solutions, the particles can be processed under almost ideal concentration conditions with little mixing between the solutions. Therefore, the present invention provides an apparatus for pretreatment such as cell staining in a cell sorter such as a FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) system for optically detecting and electrically sorting cells after immunostaining.・ It can also be incorporated as a method.
以下、添付の書類に基づいて、本発明による粒子処理用マイクロ流路システムおよび粒子処理方法の最良の形態を詳細に説明するものとする。 Hereinafter, the best mode of a particle processing microchannel system and a particle processing method according to the present invention will be described in detail with reference to the attached documents.
図１には、本発明における請求項１に記載の、粒子処理用マイクロ流路システムの流路構造の概略図例が示されている。図１において、主流路（Ｄ）は、３つの部分、主流路（流路部Ｄ１）、主流路（処理部ＤＥ）、主流路（流路部Ｄ２）から構成されており、主流路（流路部Ｄ１）は、導入流路（Ｐ１）および複数の導出流路（Ｒ１）とそれぞれ接続されており、また、主流路（流路部Ｄ２）は導入流路（Ｐ２）および複数の導出流路（Ｒ２）とそれぞれ接続されている。この流路構造において、流路構造は平面的でも３次元的に構成されていても良く、また、流路深さは一定であっても部分的に異なっていても良く、特に限定される者ではない。さらに、径の同じ円管、あるいは径の異なる円管が少なくとも部分的に接続された構造であっても良い。しかしながら、流路構造が少なくとも部分的に平面的に構成されているものの方が、流路設計における抵抗値の設定が容易になり、また、流路構造の作製が容易になる、という点において好ましい。 FIG. 1 shows a schematic diagram of a flow channel structure of a micro flow channel system for particle processing according to
本発明において、流路構造を作製する場合には、たとえばモールディングやエンボッシングといった鋳型を用いる作製技術が流路構造を容易に作製可能であるという点において好まししいが、その他にも、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、電子線直接描画、機械加工等の作製技術を用いることも可能であり、特に制約されるものではない。 In the present invention, when producing a flow channel structure, for example, a production technique using a mold such as molding or embossing is preferable in that the flow channel structure can be easily produced. Production techniques such as dry etching, laser processing, direct electron beam drawing, and machining can be used, and are not particularly limited.
本発明において、流路構造を作製する場合のマイクロ流体システムの材質は特に限定されるものではないが、たとえばＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、アクリル等の各種ポリマー材料、ガラス、シリコン、セラミクス、ステンレスなどの各種金属等が挙げられ、また、これらの材料のうち任意の２種類以上の材料からなる基板を組み合わせて用いても良い。 In the present invention, the material of the microfluidic system for producing the flow channel structure is not particularly limited. For example, various polymer materials such as PDMS (polydimethylsiloxane) and acrylic, glass, silicon, ceramics, stainless steel, etc. In addition, a substrate made of any two or more of these materials may be used in combination.
さらに、図１に示す流路構造において、導入流路および分岐流路は、それぞれ主流路に対し直角になるように接続されている。この角度は必ずしも直角である必要はないが、主流路と分岐および導入流路の合流する角度における鋭角部分が、１５度以上になることが好ましく、より好ましくは３０度以上、最も好ましくは４５度以上である。１５度以下の角度であると効率が悪くなり本発明として好適でない。 Furthermore, in the flow channel structure shown in FIG. 1, the introduction flow channel and the branch flow channel are connected so as to be perpendicular to the main flow channel. This angle does not necessarily have to be a right angle, but the acute angle portion at the angle at which the main flow path and the branching and introduction flow paths meet is preferably 15 degrees or more, more preferably 30 degrees or more, and most preferably 45 degrees. That's it. If the angle is 15 degrees or less, the efficiency is deteriorated, which is not suitable for the present invention.
図２には、粒子処理用マイクロ流路システムにおける流路構造の、より詳細な流路構造の概略図かつ実施図例と、粒子の移動の様子が示されており、図２（ａ）には流路構造の概略図かつ実施図例と内部の溶液の様子が、図２（ｂ）にはある一つの分岐点における粒子の挙動が示されている。 FIG. 2 shows a schematic diagram of a more detailed flow channel structure of the micro flow channel system for particle processing, an example of the flow channel structure, and an example of the movement of the particles. FIG. FIG. 2B is a schematic diagram of the flow channel structure, an example of the embodiment, and the state of the solution inside, and FIG. 2B shows the behavior of particles at one branch point.
図１、或いは図２の流路構造に、導入口（ＤＰ）から粒子懸濁溶液である溶液Ａを、導入流路（Ｐ１）から粒子処理溶液である溶液Ｂを、さらに導入流路（Ｐ２）から粒子洗浄溶液である溶液Ｃを、それぞれ連続的に導入することで、粒子の処理を行う。 In the flow channel structure of FIG. 1 or FIG. 2, the solution A, which is a particle suspension solution, is introduced from the introduction port (DP), the solution B, which is a particle processing solution, from the introduction channel (P1), and the introduction channel (P2). The particles C are treated by continuously introducing the solution C, which is a particle cleaning solution, from the above.
本発明で必須な条件としては、主流路（処理部ＤＥ）を流れる溶液における溶液Ｂの純度が９９％以上となることであり、また、主流路（流路部Ｄ２）における分岐点（ＤＲ２）より下流側の領域を流れる溶液における溶液Ｃの純度が９９％以上となることである。さらに、導入口（ＤＰ）より溶液Ａとともに導入した粒子のうち少なくとも一部が、主流路（Ｄ）における導出口（ＤＲ）より回収されるということが挙げられる。 The essential condition in the present invention is that the purity of the solution B in the solution flowing through the main flow path (processing section DE) is 99% or more, and the branch point (DR2) in the main flow path (flow path section D2). That is, the purity of the solution C in the solution flowing in the downstream region is 99% or more. Furthermore, it is mentioned that at least a part of the particles introduced together with the solution A from the inlet (DP) is recovered from the outlet (DR) in the main channel (D).
本発明では、これらの条件が満たされるための、流路内各部における流量の絶対値に関しては、主流路（Ｄ）において、導入された複数の溶液間での混合がほとんど起こらないような状態が保たれる必要があるという観点から、流路内で安定な層流が保たれることが好ましく、流速がある値以下になる条件下で、具体的には、レイノルズ数が１０００以下になる条件下で送液操作を行うことが好ましく、好ましくはレイノルズ数が８００以下、さらに好ましくは５００以下である。しかしながら、直径が１ｍｍ以下の流路の場合では、通常乱流は形成されないため、上述のような条件を達成することは容易である。 In the present invention, in order to satisfy these conditions, with respect to the absolute value of the flow rate in each part in the flow path, there is a state in which mixing between a plurality of introduced solutions hardly occurs in the main flow path (D). From the viewpoint that it is necessary to be maintained, it is preferable that a stable laminar flow is maintained in the flow path, and under conditions where the flow velocity is a certain value or less, specifically, a condition where the Reynolds number is 1000 or less. The liquid feeding operation is preferably performed under a lower pressure, preferably a Reynolds number of 800 or less, more preferably 500 or less. However, in the case of a flow path having a diameter of 1 mm or less, a turbulent flow is not usually formed, so that it is easy to achieve the above conditions.
本発明では、次に、適切な流路設計および／あるいは入口流量の調節を行うことにより、図２（ａ）に示すように、導入口（ＤＰ）より導入した溶液Ａが、全て導出流路（Ｒ１）より排出され、さらに、導入流路（Ｐ１）より導入した溶液Ｂのうち少なくとも一部が導出流路（Ｒ１）より排出されるようになることが好ましい。その場合、マイクロ流路内では層流が支配的であるため、溶液Ａと溶液Ｂの境界面は、分子拡散以外の要因では混合されず、主流路Ｄにおける下流側、つまり主流路（処理部ＤＥ）において、流量の絶対値を一定の値以上にすることにより、溶液Ｂの純度を９９％以上、より好ましくは９９．８％以上、より好ましくは９９．９％以上にすることができる。 Next, in the present invention, by appropriately adjusting the flow path design and / or adjusting the inlet flow rate, as shown in FIG. 2 (a), the solution A introduced from the inlet (DP) is all discharged. It is preferable that at least a part of the solution B discharged from (R1) and further introduced from the introduction flow path (P1) is discharged from the discharge flow path (R1). In this case, since the laminar flow is dominant in the microchannel, the boundary surface between the solution A and the solution B is not mixed by factors other than molecular diffusion, and is downstream of the main channel D, that is, the main channel (processing unit). In DE), the purity of the solution B can be 99% or more, more preferably 99.8% or more, more preferably 99.9% or more by setting the absolute value of the flow rate to a certain value or more.
本発明では、導入口（ＤＰ）から導入された溶液Ａが、主流路（処理部ＤＥ）内に混入することを防ぐために、導出流路（Ｒ１）より排出される溶液の流量は、導入口（ＤＰ）より導入した溶液Ａの流量の１．１倍以上であることが好ましく、より好ましくは１．２倍以上、最も好ましくは１．３倍以上が良い。１．１倍以下であると溶液Ａが混入する程度が高くなり本発明として好適なものではなくなる。 In the present invention, in order to prevent the solution A introduced from the introduction port (DP) from being mixed into the main channel (processing section DE), the flow rate of the solution discharged from the outlet channel (R1) is The flow rate of the solution A introduced from (DP) is preferably 1.1 times or more, more preferably 1.2 times or more, and most preferably 1.3 times or more. When the ratio is 1.1 times or less, the degree of mixing of the solution A becomes high and is not suitable for the present invention.
本発明において、図１における流路構造においては、合流点（ＤＰ１）と分岐点（ＤＲ１）が、また、合流点（ＤＰ２）と分岐点（ＤＲ２）が、それぞれ互いに主流路の反対側の壁面に設置されており、このような配置によって、導出流路（Ｒ１）からの溶液Ａの効率的な排出と、導出流路（Ｒ２）からの、主流路（処理部ＤＥ）を通過してきた溶液の効率的な排出が可能になるため、このような配置は好ましい。ただし、このような配置関係は必ずしも必要ではなく、合流点と分岐点が、主流路における同じ壁面に設置されていても良い。 In the present invention, in the channel structure in FIG. 1, the junction point (DP1) and the branch point (DR1), and the junction point (DP2) and the branch point (DR2) are the opposite wall surfaces of the main channel. With such an arrangement, the solution A has been efficiently discharged from the outlet channel (R1) and has passed through the main channel (processing section DE) from the outlet channel (R2). Such an arrangement is preferable because it enables efficient discharge. However, such an arrangement relationship is not necessarily required, and the merging point and the branch point may be installed on the same wall surface in the main channel.
本発明において、溶液Ａと溶液Ｂの導入流量比に関しては、溶液Ａの流量割合が多すぎる場合には、溶液Ａが主流路（処理部ＤＥ）に混入してしまう、という問題が生じ、また、溶液Ｂの流量割合が多すぎる場合には、溶液Ａとともに導入される粒子の処理量が少なくなる、という問題が生じるが、主流路（処理部ＤＥ）を流れる溶液における溶液Ｂの純度が結果的に９９％以上、より好ましくは９９．９％以上になるような導入流量比であれば、どのような比率であっても良い。その際、溶液Ａと溶液Ｂの導入流量比は、操作の都合上、１：１０〜１０：１の間であることが好ましく、好ましくは１：７〜７：１が良く、より好ましくは１：３〜３：１の範囲にあることが良い。同様に、適切な流路設計および／あるいは入口流量の調節を行うことにより、図２（ａ）に示すように、主流路（処理部ＤＥ）を通過してきた、粒子処理溶液が、全て導出流路（Ｒ２）より排出され、さらに、導入流路（Ｐ２）より導入した溶液Ｃのうち少なくとも一部が導出流路（Ｒ２）より排出されるようにすることが可能であり、その場合も同様に、主流路（処理部ＤＥ）を通過してきた溶液と溶液Ｃの境界面は、分子拡散以外の要因では混合されないため、主流路（Ｄ）における下流側、つまり導出口（ＤＲ）側において、溶液Ｃの純度を９９％以上、より好ましくは９９．８％以上、より好ましくは９９．９％以上にすることができる。なお、主流路（処理部ＤＥ）を通過してきた溶液が、主流路（流路部Ｄ２）における分岐点（ＤＲ２）より下流を流れる溶液内に混入することを防ぐために、導出流路（Ｒ２）より排出される溶液の流量は、主流路（処理部ＤＥ）を通過した溶液の流量の１．１倍以上であることが好ましく、より好ましくは１．２倍以上、最も好ましくは１．３倍以上が良い。 In the present invention, regarding the introduction flow rate ratio of the solution A and the solution B, when the flow rate ratio of the solution A is too large, there arises a problem that the solution A is mixed into the main flow path (processing section DE). When the flow rate ratio of the solution B is too large, there arises a problem that the processing amount of the particles introduced together with the solution A is reduced, but the purity of the solution B in the solution flowing through the main channel (processing section DE) is the result. In particular, any ratio may be used as long as it is an introduction flow rate ratio of 99% or more, more preferably 99.9% or more. At that time, the flow rate ratio of the solution A and the solution B is preferably 1:10 to 10: 1, preferably 1: 7 to 7: 1, more preferably 1 for convenience of operation. : It is good to exist in the range of 3-3: 1. Similarly, by appropriately adjusting the flow path design and / or adjusting the inlet flow rate, as shown in FIG. 2A, all of the particle processing solution that has passed through the main flow path (processing section DE) is derived. It is possible to discharge at least a part of the solution C discharged from the passage (R2) and further introduced from the introduction flow path (P2) from the discharge flow path (R2). In addition, since the boundary surface between the solution C and the solution C that have passed through the main channel (processing unit DE) is not mixed by factors other than molecular diffusion, on the downstream side of the main channel (D), that is, on the outlet (DR) side, The purity of the solution C can be 99% or more, more preferably 99.8% or more, more preferably 99.9% or more. In order to prevent the solution that has passed through the main flow path (processing section DE) from being mixed into the solution flowing downstream from the branch point (DR2) in the main flow path (flow path section D2), the outlet flow path (R2). The flow rate of the solution to be discharged is preferably 1.1 times or more, more preferably 1.2 times or more, and most preferably 1.3 times the flow rate of the solution that has passed through the main channel (processing section DE). The above is good.
本発明では、流路内部におけるこれらの流量条件を達成するためには、流路のネットワークを抵抗回路のアナロジーとして考える。すなわち、流量分配は圧力に比例し流路の抵抗に反比例する、という考えに基づいて予測あるいは計算することができ、流路内の各地点における圧力と、流路構造の抵抗値を考えることにより、各地点における流量の分配割合を調節あるいはあらかじめ計算することができる。 In the present invention, in order to achieve these flow conditions inside the flow channel, the network of the flow channel is considered as an analogy of the resistance circuit. That is, the flow distribution can be predicted or calculated based on the idea that the flow distribution is proportional to the pressure and inversely proportional to the flow path resistance. By considering the pressure at each point in the flow path and the resistance value of the flow path structure, The distribution ratio of the flow rate at each point can be adjusted or calculated in advance.
本発明では、さらに、流路内部におけるこれらの流量条件を達成するための導入量の調節方法として、各導入口からシリンジポンプ等を用いて溶液を導入し、その際の流量をそれぞれある一定の値に調節する方法を採用することが操作上簡便であり好ましいが、各導入口および導出口をそれぞれある一定の圧力下に保つことによる送液方法を採用することで、流量を調節することができる他、それらの手法の組み合わせによる手法を採用することもでき、いずれの場合であっても、流路構造を抵抗回路とみなした場合の圧力・流量・抵抗値を考えることで計算もしくは調節が可能である。 In the present invention, furthermore, as a method for adjusting the amount of introduction to achieve these flow rate conditions inside the flow path, a solution is introduced from each inlet using a syringe pump or the like, and the flow rate at that time is set to a certain fixed value. Adopting a method of adjusting the value is simple and preferable in operation, but it is possible to adjust the flow rate by adopting a liquid feeding method by keeping each inlet and outlet at a certain pressure. In addition, a method based on a combination of these methods can be adopted, and in any case, calculation or adjustment can be performed by considering the pressure, flow rate, and resistance value when the channel structure is regarded as a resistance circuit. Is possible.
本発明では、導入口（ＤＰ）から導入した粒子の少なくとも一部が、導入口（ＤＲ）から回収される必要があるが、そのための手段として、本発明では、分岐点（ＤＲ１およびＤＲ２）における主流路の径と、導出流路へ分配される流量の割合の関係から、たとえ導出流路の径が粒子の径より大きい場合であっても、ある一定以上の大きさをもつ粒子は分岐流路へと導入されることがないという原理に着目している。具体的には、導入口（ＤＰ）より導入された粒子は、主流路（Ｄ）における、導出流路（Ｒ１）および導出流路（Ｒ２）への分岐点（ＤＲ１）および分岐点（ＤＲ２）において、たとえ粒子が壁近傍を流れていた場合でも、また、たとえ粒子の直径が導出流路の直径より小さい場合でも、導出流路内に導入されないようにすることが可能である。その原理としては、「水力学的フィルトレーション（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」と呼ばれる原理を用いることができ、より具体的には、図２（ｂ）に示すように、流路内におけるある分岐点において、分岐の中に導入される仮想的な流れの幅（Ｗ１）よりも半径が大きな粒子は、分岐の中に導入されない、という原理である。その仮想的な流れの幅は、流路幅Ｗ０と、流量Ｑ１と流量Ｑ２の比から決める、ということが好ましい。
本発明では、流路の幅Ｗ０を、処理対象となる粒子の平均直径Ｒに対して、なるべく小さな値にすることで、効率的な溶液の導出が可能となる。Ｗ０の値は、好ましくは１．５Ｒ〜３０Ｒの範囲にあれば良く、より好ましくは１．７〜２０Ｒが良く、最も好ましくは１．８〜１０Ｒの範囲が良い。しかしながら、流路幅と粒子径がほぼ同じ値の場合には、流路の閉塞等の問題が生じやすくなるため、Ｗ０の値は、好ましくは、２〜１０Ｒの範囲であり、最も好ましくは、２〜３Ｒの範囲である。 In the present invention, by setting the width W0 of the flow path to a value as small as possible with respect to the average diameter R of the particles to be processed, an efficient solution can be derived. The value of W0 is preferably in the range of 1.5R to 30R, more preferably 1.7 to 20R, and most preferably in the range of 1.8 to 10R. However, when the flow path width and the particle diameter are substantially the same value, problems such as blockage of the flow path are likely to occur. Therefore, the value of W0 is preferably in the range of 2 to 10R, most preferably It is in the range of 2 to 3R.
本発明においては、導出流路（Ｒ１およびＲ２）の幅を小さくすることで、より短い導出流路を用いた場合であっても、効率的な溶液排出および粒子操作が可能となるため、この幅は、粒子の平均直径Ｒに対して、０．５Ｒ〜１０Ｒの範囲にあることが好ましい。ただし、導出流路の場合も、幅が平均粒径Ｒより小さい場合には、流路の閉塞等の問題が生じやすくなるため、Ｗ０の値は、より好ましくは０．７〜８Ｒが良く、最も好ましくは１〜５Ｒの範囲が良い。導出流路（Ｐ１およびＰ２）の幅に関しては、どのような値であっても構わないが、実際の操作の都合上、極端に大きいあるいは小さい値は避けた方が好ましく、具体的には、主流路（流路部Ｄ１またはＤ２）の幅に対して、０．１倍〜１０倍の範囲にあることが好ましい。 In the present invention, by reducing the width of the outlet channel (R1 and R2), efficient solution discharge and particle manipulation are possible even when a shorter outlet channel is used. The width is preferably in the range of 0.5R to 10R with respect to the average diameter R of the particles. However, in the case of the outlet channel, if the width is smaller than the average particle diameter R, problems such as blockage of the channel are likely to occur. Therefore, the value of W0 is more preferably 0.7 to 8R. The range of 1-5R is most preferable. As for the width of the outlet channel (P1 and P2), any value may be used, but it is preferable to avoid an extremely large or small value for the convenience of actual operation. Specifically, The width of the main channel (channel part D1 or D2) is preferably in the range of 0.1 to 10 times.
本発明では、各導入口における溶液の導入流量は、導入口（ＤＰ）より導入した粒子の少なくとも一部が導出口（ＤＲ）より排出されるようにするためにも、それぞれある一定の範囲内になるように設定する必要があり、そのための必要条件としては、分岐点（ＤＲ１およびＤＲ２）における流れの幅Ｗ１が、導入した粒子のうち最大のものの半径より小さくなる、ということであり、より好ましい条件としては、Ｗ１は０．５Ｒ以下になることである。 In the present invention, the introduction flow rate of the solution at each inlet is within a certain range so that at least a part of the particles introduced from the inlet (DP) is discharged from the outlet (DR). The necessary condition for this is that the flow width W1 at the branch points (DR1 and DR2) is smaller than the radius of the largest of the introduced particles, and more As a preferable condition, W1 is 0.5R or less.
本発明において、溶液Ｃの導入流量に関しては、溶液Ｃの流量が溶液Ａおよび／あるいは溶液Ｂの導入流量に対し多い場合には、主流路（処理部ＤＥ）内の流れが逆転し、溶液Ｃが主流路（処理部ＤＥ）に混入してしまうという問題が生じて好ましくない。また、溶液Ｃの流量が少なすぎる場合には、主流路（処理部ＤＥ）内を通過してきた、溶液Ｂを９９％以上の純度で含む溶液が、主流路（流路部Ｄ２）における分岐点（ＤＲ２）より下流に混入してしまう、という問題が生じるため、これらの問題を防ぐという観点から、溶液Ｃの導入流量はある一定の範囲にある必要があるが、結果的に、主流路（処理部ＤＥ）を流れる溶液における溶液Ｂの純度が結果的に９９％以上、より好ましくは９９．９％以上になり、かつ、主流路（流路部Ｄ２）における分岐点（ＤＲ２）より下流の範囲において、溶液Ｃの純度が９９％以上、より好ましくは９９．８以上が良く、最も好ましくは９９．９％以上になるよれば良い。 In the present invention, regarding the introduction flow rate of the solution C, when the flow rate of the solution C is larger than the introduction flow rate of the solution A and / or the solution B, the flow in the main channel (processing section DE) is reversed, and the solution C Is not preferable because it causes a problem of being mixed into the main flow path (processing section DE). In addition, when the flow rate of the solution C is too small, the solution that has passed through the main flow path (processing section DE) and contains the solution B with a purity of 99% or more is a branch point in the main flow path (flow path section D2). (DR2) Since the problem of mixing downstream occurs, from the viewpoint of preventing these problems, the introduction flow rate of the solution C needs to be in a certain range, but as a result, the main flow path ( As a result, the purity of the solution B in the solution flowing through the processing unit DE) is 99% or more, more preferably 99.9% or more, and downstream of the branch point (DR2) in the main channel (channel unit D2). In the range, the purity of the solution C should be 99% or more, more preferably 99.8 or more, and most preferably 99.9% or more.
本発明では、導出流路（Ｒ１およびＲ２）の本数に関しては、僅かな流量を主流路から繰り返し引き抜くことで、小さな粒子であっても、あるいは、粒子の直径が導出流路の直径より小さい場合であっても、粒子は導出流路（Ｒ１およびＲ２）に導入されることなく、粒子を主流路の導出口（ＤＲ）より回収することが可能となる。導出流路の本数については、それぞれ少なくとも２本以上、好ましくは１０本以上、さらに好ましくは２０本以上であれば良いが、この本数に関しても、主流路（処理部ＤＥ）を流れる溶液における溶液Ｂの純度が結果的に９９％以上になり、より好ましくは９９．９％以上になり、かつ、主流路（流路部Ｄ２）における分岐点（ＤＲ２）より下流の範囲において、溶液Ｃの純度が９９％以上、より好ましくは９９．９％以上になる本数であれば良い。 In the present invention, regarding the number of outlet channels (R1 and R2), a small flow rate is repeatedly withdrawn from the main channel, so even if the particles are small or the diameter of the particles is smaller than the diameter of the outlet channel. Even so, the particles can be recovered from the outlet (DR) of the main channel without being introduced into the outlet channels (R1 and R2). The number of lead-out channels may be at least two, preferably ten or more, and more preferably twenty or more. However, the number of the lead-out channels may be solution B in the solution flowing through the main channel (processing section DE). As a result, the purity of the solution C becomes 99% or more, more preferably 99.9% or more, and the purity of the solution C is within the range downstream from the branch point (DR2) in the main channel (channel part D2). The number may be 99% or more, more preferably 99.9% or more.
本発明では、一定以上の大きさの粒子が導出流路に導入されないようにするために、導出流路（Ｒ１およびＲ２）の１本１本の抵抗値をそれぞれある至適な値に設定する必要がある。その値を保持しつつ全体の長さを一定にするために、導出流路（Ｒ１およびＲ２）の内径が、流れの方向に沿って徐々にあるいは段階的に大きくなるような流路設計を行うことが好ましく、さらに、図２（ａ）に示すように、導出流路それぞれを、細い部分と太い部分によって構成し、さらにその長さの比を変化させることがより好ましく、このような流路設計によって、導出流路の全体の長さを一定に保ちつつ、至適な抵抗値の設定を簡便に行うことが可能である。 In the present invention, in order to prevent particles of a certain size or more from being introduced into the outlet channel, the resistance value of each outlet channel (R1 and R2) is set to an optimum value. There is a need. In order to make the entire length constant while maintaining the value, the flow path design is made such that the inner diameter of the outlet flow paths (R1 and R2) gradually or stepwise increases along the flow direction. Further, as shown in FIG. 2 (a), it is more preferable that each of the outlet channels is constituted by a thin portion and a thick portion, and the ratio of the lengths is further changed. By design, it is possible to easily set an optimum resistance value while keeping the entire length of the outlet channel constant.
本発明では、また、図２（ａ）に示したように、導出流路（Ｒ１およびＲ２）を最終的にそれぞれ合流させ、ひとつの排出口に接続することは、溶液回収操作を簡便に行うという意味において好ましいが、この排出口はそれぞれ１つあるいは複数のいずれでも良く、導出流路のすべてあるいは一部が独立になっていても良い。 In the present invention, as shown in FIG. 2A, the solution recovery operation can be performed simply by finally joining the outlet channels (R1 and R2) and connecting them to one outlet. In this sense, one or a plurality of discharge ports may be provided, and all or a part of the outlet channels may be independent.
本発明では、導出流路（Ｒ１およびＲ２）の間隔は、流路構造の作製技術の都合上ゼロにすることは不可能である。しかしながら、主流路（流路部Ｄ１およびＤ２）における、各分岐点間の抵抗値を極力減少させることによって、流路システム全体のサイズをコンパクトにでき、また、複数の導出流路を狭い範囲に密集して並列化することで、導出流路からの溶液の排出を効率的に行うことが可能となる。その際は、可能な限り小さい値に設定することが好ましく、具体的には、対象となる粒子の平均直径Ｒに対し、５Ｒ以下に設定することが好ましく、より好ましくは４Ｒ以下、最も好ましくは３Ｒ以下に設定することが良い。 In the present invention, the interval between the outlet channels (R1 and R2) cannot be made zero because of the manufacturing technology of the channel structure. However, by reducing the resistance value between the branch points in the main channel (channel units D1 and D2) as much as possible, the size of the entire channel system can be made compact, and a plurality of outlet channels can be made narrow. By densely arranging in parallel, it is possible to efficiently discharge the solution from the outlet channel. In that case, it is preferable to set the value as small as possible. Specifically, it is preferably set to 5R or less, more preferably 4R or less, and most preferably, with respect to the average diameter R of the target particles. It is good to set to 3R or less.
以上のような流路構成および／あるいは流量調整により、導入口（ＤＰ）より導入された粒子は、主流路（Ｄ）中を、主流路（流路部Ｄ１）、主流路（処理部ＤＥ）、主流路（流路部Ｄ２）の順に通過し、導出口（ＤＲ）より排出されるが、それらを通過する際に、溶液Ａ（組成ａ）、溶液Ｂ（組成ｂ）の純度が９９％以上の溶液、溶液Ｃ（組成ｃ）の純度が９９％以上の溶液中を、それぞれ順に通過することとなり、一定の時間、粒子処理溶液である溶液Ｂ中を通過することとなる。つまり、粒子懸濁溶液（溶液Ａ）を導入口（ＤＰ）から、粒子処理溶液（溶液Ｂ）を導入流路（Ｐ１）から、粒子洗浄溶液（溶液Ｃ）を導入流路（Ｐ２）から、それぞれ連続的に導入するだけで、複雑な装置を用いることなく、連続的かつ正確かつ簡便に、粒子処理溶液の有する物理・化学・生物学的な性質によって、粒子を処理することが可能となる。その際、粒子を処理する時間、つまり、粒子が高純度（９９％以上）の溶液Ｂ中を通過する時間は、主流路（処理部ＤＥ）の体積を変化させる、あるいは、導入流量の絶対値を変化させる、あるいはその両方により、たとえば１ミリ秒以上１分以下の範囲において自由に制御できるようになる。そのため、通常のフィルトレーションや遠心分離法では不可能な、１０秒以下の短時間での粒子の処理が可能となり、また、通常の１００ミリ秒程度の細胞処理のために用いられる、フローセルと凍結バイアルを組み合わせた複雑な装置等を必要とすることなく、１００ミリ秒程度、あるいはそれ以下の短時間での処理も可能となる。 Particles introduced from the introduction port (DP) by the flow path configuration and / or flow rate adjustment as described above pass through the main flow path (D) through the main flow path (flow path section D1) and the main flow path (processing section DE). , And passes through the main channel (channel part D2) in this order and is discharged from the outlet (DR), but when passing through them, the purity of the solution A (composition a) and the solution B (composition b) is 99%. The solution and the solution C (composition c) having a purity of 99% or more are sequentially passed through the solution, and the solution is passed through the solution B as the particle processing solution for a certain time. That is, the particle suspension solution (solution A) is introduced from the introduction port (DP), the particle treatment solution (solution B) is introduced from the introduction channel (P1), and the particle cleaning solution (solution C) is introduced from the introduction channel (P2). It is possible to treat particles according to the physical, chemical, and biological properties of the particle treatment solution continuously and accurately and simply without using complicated devices simply by introducing them continuously. . At that time, the time for processing the particles, that is, the time for the particles to pass through the high purity (99% or more) solution B changes the volume of the main flow path (processing section DE) or the absolute value of the introduction flow rate. It is possible to freely control, for example, in the range of 1 millisecond or more and 1 minute or less by changing or both. Therefore, it is possible to process particles in a short time of 10 seconds or less, which is impossible with normal filtration or centrifugation, and a flow cell used for normal cell processing of about 100 milliseconds. Processing in a short time of about 100 milliseconds or less is possible without the need for a complicated device combined with a frozen vial.
また、これらの流路においては、分岐点（ＤＲ１）を通過した粒子は、主流路（Ｄ）における分岐点（ＤＲ１）の存在する壁面に沿って一列に流れるため、粒子の流れる位置が、主流路の流れと垂直な方向の断面において一定となり、滞留時間の均一化を図ることができる、つまり、処理時間の均一化を図ることができる。 In these flow paths, the particles that have passed through the branch point (DR1) flow in a line along the wall surface where the branch point (DR1) is present in the main flow path (D). It becomes constant in the cross section in the direction perpendicular to the flow of the path, and the residence time can be made uniform, that is, the treatment time can be made uniform.
図３（ａ）および（ｂ）には、多段階処理のためのマイクロ流体システムの概略図かつ実施図例を示すが、これらの図のように、図１におけるシステムユニット（Ｕ）を繰り返し、さらに、それぞれのユニットにおける導入流路から、異なる組成を持つ溶液を導入することで、２種類以上の溶液を用いた粒子の処理が可能となる。なお、それぞれのシステムユニットにおける、導入流路、導出流路の向きを、図３（ａ）に示すように同じになる向きに配置しても良く、図３（ｂ）のように交互になる向きに配置しても良い。また、システムユニット（Ｕ）を、３つ以上直列に接続しても良く、その場合は、３種類以上の溶液を用いた処理が可能となるため、目的に応じて多段階の処理が可能となるほか、２種類以上の処理の間に、粒子の洗浄処理を行うことも可能となる。 FIGS. 3A and 3B show a schematic diagram and an example of a microfluidic system for multi-stage processing. As shown in these figures, the system unit (U) in FIG. 1 is repeated, Furthermore, by introducing solutions having different compositions from the introduction channels in each unit, it is possible to treat particles using two or more types of solutions. In addition, the direction of the introduction flow path and the discharge flow path in each system unit may be arranged in the same direction as shown in FIG. 3 (a), or alternately as shown in FIG. 3 (b). You may arrange in the direction. In addition, three or more system units (U) may be connected in series. In that case, since processing using three or more types of solutions is possible, multi-stage processing is possible depending on the purpose. In addition, it is possible to perform a particle cleaning process between two or more types of processes.
なお、上記の流路システムにおいて、安定な層流を保持する必要があるという観点上、形成される流路はマイクロ流路であるものが好ましく、この場合のマイクロ流路とは、具体的には、レイノルズ数を１０００以下にすることが容易な流路である。 In the above flow channel system, from the viewpoint that it is necessary to maintain a stable laminar flow, the formed flow channel is preferably a micro flow channel. In this case, the micro flow channel is specifically Is a flow path that can easily make the Reynolds number 1000 or less.
本発明のマイクロ流路システムを用いて、処理を行う対象となる粒子としては、目的に応じて、ポリスチレン等のポリマー粒子、金属微粒子、セラミックス粒子、またはそれらの表面に物理的あるいは化学的な処理を施した粒子を用いることができる他、動植物細胞、細菌、ウイスルやそれらの構成要素であるオルガネラ等の生物粒子を用いることができる。 Particles to be treated using the microchannel system of the present invention include polymer particles such as polystyrene, metal fine particles, ceramic particles, or physical or chemical treatment on the surface according to the purpose. In addition, it is possible to use biological particles such as animal and plant cells, bacteria, viruses, and organelles that are constituents thereof.
本発明において、これらの粒子の形状は球形あるいは非球形のいずれの場合も考えうるが、非球形の粒子の場合、その粒子を代表する最も短い径、つまり、その粒子を閉じ込めることができる最小体積の直方体における最小の辺の長さの値の半分が、図２（ｂ）におけるＷ１よりも大きい場合には、そのような粒子は、分岐流路に導入されることがない、ということを、流路の設計において考慮に入れることが好ましい。 In the present invention, the shape of these particles can be either spherical or non-spherical, but in the case of non-spherical particles, the shortest diameter representative of the particles, that is, the minimum volume that can confine the particles If half of the minimum side length value in the rectangular parallelepiped is larger than W1 in FIG. 2B, such particles are not introduced into the branch flow path. It is preferable to take into account the design of the flow path.
本発明において、粒子懸濁溶液としては、目的に応じて様々な溶液を用いることができ、例えば粒子としてポリマー粒子や金属粒子を用いる場合には、各種化学物質を含む水溶液の他、有機溶液、イオン性流体等を用いることができる。さらに、粒子として細胞等の生物粒子を用いる場合には、細胞培養液や緩衝液などの細胞と等張の水溶液を用いるのが好ましい。ただし、たとえばバクテリアや植物細胞のような比較的低張あるいは高張溶液に対し耐性をもつ細胞の場合には、必ずしも等張である必要はない。また、操作の都合上、溶液の密度と粒子の密度の差が大きくない系がより好ましい。 In the present invention, as the particle suspension solution, various solutions can be used according to the purpose. For example, when polymer particles or metal particles are used as particles, in addition to an aqueous solution containing various chemical substances, an organic solution, An ionic fluid or the like can be used. Furthermore, when biological particles such as cells are used as the particles, it is preferable to use an aqueous solution that is isotonic with cells, such as a cell culture solution or a buffer solution. However, in the case of cells that are resistant to relatively hypotonic or hypertonic solutions, such as bacteria and plant cells, it is not always necessary to be isotonic. In view of operation, a system in which the difference between the density of the solution and the density of the particles is not large is more preferable.
本発明において、粒子処理溶液としては、化学反応種を含む水溶液あるいは有機溶媒などの他、粒子懸濁溶液とは温度の異なる溶液、放射性物質を含む溶液等、粒子にとって物理的、化学的、あるいは生物学的に刺激を与えうる物質あるいは性質を含む溶液を用いることができる。また、粒子として細胞を用いる場合は、細胞に対する刺激物質、あるいは細胞表面での分子反応・相互作用を起こす物質等を適宜含んだ溶液の他、高張・低張溶液、酸・アルカリ溶液、有機溶液、ウイルスやナノ粒子等の懸濁液を、対象とする処理系に応じて用いることができる。 In the present invention, the particle treatment solution includes an aqueous solution containing a chemically reactive species or an organic solvent, a solution having a temperature different from that of the particle suspension solution, a solution containing a radioactive substance, and the like. Solutions that contain biologically irritating substances or properties can be used. In addition, when cells are used as particles, in addition to solutions containing stimulating substances for cells or substances that cause molecular reaction / interaction on the cell surface, hypertonic / hypotonic solutions, acid / alkali solutions, organic solutions Suspensions such as viruses and nanoparticles can be used depending on the target treatment system.
本発明において、粒子洗浄溶液としては、粒子懸濁溶液と同じものを用いることができるほか、化学反応を停止するための停止剤を含んだ溶液等を用いることができる。また、粒子として細胞を用いる場合は、粒子懸濁溶液とは種類の異なる各種緩衝役、培養液などを用いることができ、さらに、細胞表面で起こる反応を停止するための固定液として、たとえばホルムアルデヒド水溶液、パラホルムアルデヒド水溶液、メタノールあるいはその水溶液、エタノールあるいはその水溶液等を用いることもできる。 In the present invention, as the particle cleaning solution, the same as the particle suspension solution can be used, and a solution containing a stopping agent for stopping the chemical reaction can be used. In addition, when cells are used as particles, various types of buffers, culture solutions, and the like that are different from the particle suspension solution can be used. Further, as a fixing solution for stopping the reaction occurring on the cell surface, for example, formaldehyde An aqueous solution, a paraformaldehyde aqueous solution, methanol or an aqueous solution thereof, ethanol or an aqueous solution thereof can also be used.
本発明において、粒子懸濁溶液、粒子処理溶液、粒子洗浄溶液の粘度に関しては、これらの粘度における差が小さい系がより好ましいが、粒子の処理を可能とするシステムであれば、粘度に差があっても構わない。 In the present invention, regarding the viscosity of the particle suspension solution, the particle treatment solution, and the particle cleaning solution, a system having a small difference in these viscosities is more preferable. However, if the system is capable of processing particles, there is a difference in viscosity. It does not matter.
本発明において、これらの溶液を送液する手段としては、シリンジポンプを用いた定流量送液の他、ボンベ、圧力装置等を用いた定圧送液のほかに、電気浸透流や遠心力等を用いた送液方法などを用いることができる。 In the present invention, as means for feeding these solutions, in addition to constant flow feeding using a syringe pump, in addition to constant pressure feeding using a cylinder, a pressure device, etc., electroosmotic flow, centrifugal force, etc. The liquid feeding method used can be used.
本発明において、導出口から流出する、粒子を含むあるいは含まない溶液を回収するために、導出口に、回収のためのチューブ構造あるいは溶液回収ウェル等を設けることが望ましい。ただし、処理後の粒子を回収せずに、たとえば粒子の分析・検出を行うためには、フローサイトメトリー等の装置と連結することで、細胞の評価を行う系との統合なども可能であり、また、粒子として細胞を用いる場合には、流路構造内にせき止め構造あるいは機構を備えることで、処理後の細胞を流路システム内で培養することもできる。 In the present invention, in order to collect the solution containing or not containing particles flowing out from the outlet, it is desirable to provide a tube structure for recovery or a solution recovery well at the outlet. However, in order to analyze and detect particles without collecting the treated particles, for example, it is possible to integrate with a system that evaluates cells by connecting to a device such as flow cytometry. In addition, when cells are used as the particles, the cells after the treatment can be cultured in the flow channel system by providing a damming structure or mechanism in the flow channel structure.
以上に述べたシステム構成および操作により、粒子や細胞を、目的に応じたある一定の時間だけ、正確かつ簡便かつ連続的に処理することが可能となる。 With the system configuration and operation described above, particles and cells can be processed accurately, simply and continuously for a certain period of time according to the purpose.
以下、添付の書類に基づいて、本発明による粒子処理用マイクロ流路システムおよび粒子処理方法の実施例を詳細に説明するものとする。 Hereinafter, embodiments of the microchannel system for particle processing and the particle processing method according to the present invention will be described in detail based on the attached documents.
図４に示す通り、本発明による粒子処理用マイクロ流路システムおよび粒子処理方法のマイクロ流路システムを作成した。図４（ａ）はマイクロ流路システムの全体図、図４（ｂ）（ｃ）はそれぞれ、図４（ａ）における部分ＡとＢの拡大図、図４（ｄ）は、図４（ａ）に示したマイクロ流路システムとは異なる形状の主流路（処理部ＤＥ）を有するマイクロ流路システムにおける、図４（ａ）における部分Ｂに相当する部分の拡大図である。 As shown in FIG. 4, a microchannel system for particle processing and a microchannel system of a particle processing method according to the present invention were created. 4A is an overall view of the microchannel system, FIGS. 4B and 4C are enlarged views of portions A and B in FIG. 4A, and FIG. 4D is FIG. FIG. 5 is an enlarged view of a portion corresponding to a portion B in FIG. 4A in a microchannel system having a main channel (processing section DE) having a shape different from that of the microchannel system shown in FIG.
このマイクロ流路システムは、粒子懸濁溶液、粒子処理溶液、粒子洗浄溶液を、それぞれ導入口１，２，３から、流量比約１：１：０．３で導入すると、それぞれの溶液の粘度がほぼ等しい場合には、導入口１から導入された直径約７μｍ以上の大きさの粒子は、途中で粒子処理溶液の流れの中を通過しつつ、導出口１へと排出されるように設計されている。このマイクロ流路システムは、微細な溝構造を有する平板状のポリマー基板（ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン））と、溝構造を有さない平板状の基板（ガラス板）を上下にボンディングすることにより形成されている。上部のポリマー基板の下面には、流路構造が形成されており、その深さは約４０μｍである。この値に関しては、用いる対象の大きさに応じて、１μｍから１ｃｍまでの任意の値の流路構造を採用することが可能であり、また、下部の基板の上面にも同様の加工が施されていても良く、流路構造は部分的に深さが異なっていても良い。 In this microchannel system, when a particle suspension solution, a particle treatment solution, and a particle washing solution are introduced from the
本発明において、導入口１、２、３はそれぞれ、細胞懸濁溶液、細胞処理溶液、細胞洗浄溶液の入口であり、導出口１，２，３は粒子および／あるいは溶液の排出口であるが、それらの位置において、上部の基板に貫通孔が形成されており、その貫通孔によって外部と流路の接続が可能となる。なおこのような貫通孔は上下どちらの基板に形成されていても良い。 In the present invention, the
本発明において、導入口における貫通孔に対して、外径２ｍｍ、内径１ｍｍのシリコーンチューブが、導出口における貫通孔に対して、外径１ｍｍ、内径０．５ｍｍのシリコーンチューブがそれぞれ接続されているが、より細い、あるいは太いチューブ、あるいは他の材質のチューブ等を送液する装置の必要性に応じて接続することができる。尚、このマイクロ流路システムにおいて、主流路は導入口１と導入口２を接続する流路であるが、導入口付近の流路構造（幅５００μｍ）は、この場合は導入口（ＤＰ）の一部であり、主流路（Ｄ）の一部とは定義されない。 In the present invention, a silicone tube having an outer diameter of 2 mm and an inner diameter of 1 mm is connected to the through hole in the introduction port, and a silicone tube having an outer diameter of 1 mm and an inner diameter of 0.5 mm is connected to the through hole in the outlet port. However, connection can be made according to the necessity of a device for feeding a thinner or thicker tube, a tube of another material, or the like. In this microchannel system, the main channel is a channel that connects the
本発明において、このマイクロ流路システムにおいて、導入口の内部に、フィルター構造が設けられており、このフィルター構造によって、流路を閉塞させるほどの大きな粒子が主流路に入るのを防ぐことが可能になっているが、導入口の構造の一部として、フィルター構造が無くても良く、また、他の構造を採用することもできる。 In the present invention, in this microchannel system, a filter structure is provided inside the inlet, and this filter structure can prevent particles that are large enough to block the channel from entering the main channel. However, the filter structure may not be provided as a part of the structure of the introduction port, and other structures may be employed.
本発明における主流路（Ｄ）の全体の長さは７．５ｍｍであり、主流路（流路部Ｄ１）と主流路（流路部Ｄ２）の幅はともに３５μｍであり、主流路（処理部ＤＥ）の幅は、図４（ｃ）に示す流路システムの場合は１００μｍ、図４（ｄ）に示す流路システムの場合は、３００μｍである。 The overall length of the main channel (D) in the present invention is 7.5 mm, the width of the main channel (channel unit D1) and the main channel (channel unit D2) is 35 μm, and the main channel (processing unit) The width of DE) is 100 μm in the case of the flow path system shown in FIG. 4C, and 300 μm in the case of the flow path system shown in FIG.
本発明で提案したマイクロ流路システムでは、主流路（処理部ＤＥ）の幅および／あるいは長さを変化させることで、粒子が粒子処理溶液中を通過する時間を大幅に変化させることができるため、流速を変化させることにより、図３（ｃ）に示した構造では、典型的には１０ミリ秒から１００ミリ秒、図３（ｄ）に示した構造では、１００ミリ秒から１秒程度に変化させることができる。これらの値は、主流路（処理部ＤＥ）のデザインの異なる流路構造を採用することによって、０．１ミリ秒以上の１分以下の任意の値に調節することが可能である。 In the microchannel system proposed in the present invention, the time for the particles to pass through the particle processing solution can be significantly changed by changing the width and / or length of the main channel (processing section DE). By changing the flow velocity, the structure shown in FIG. 3 (c) is typically 10 to 100 milliseconds, and the structure shown in FIG. 3 (d) is about 100 to 1 second. Can be changed. These values can be adjusted to an arbitrary value of not less than 0.1 milliseconds and not more than 1 minute by adopting a channel structure with a different design of the main channel (processing section DE).
また、導出流路（Ｒ１）および導出流路（Ｒ２）は、それぞれ４０本の導出流路から成り、導出流路（群）はそれぞれ導出口２、導出口３に接続されている。導出流路（Ｒ１およびＲ２）の長さは、それぞれ１２ｍｍ、７ｍｍであった。さらにそれぞれの導出流路は、図２（ａ）に示すように、幅が細い部分と幅が太い部分からなっており、それぞれの幅は２０μｍ、３５μｍであり、また導出流路の中心間の距離は６０μｍである。なお、請求項７における、導出流路の１本１本の間隔とは、この場合３５μｍである。これらの値も、対象となる細胞の大きさによって、１μｍ以上の任意の値に設定することが可能である。 The outlet channel (R1) and the outlet channel (R2) are each composed of 40 outlet channels, and the outlet channel (group) is connected to the
このような流路設計によって、それぞれ４０の分岐点（ＤＲ１およびＤＲ２）において、その各分岐点を通過する流量のおよそ２．５％ずつが導出流路に分配されるようになっており、この値は、図２（ｂ）におけるＷ１の値に換算すると、約３．５μｍである。なおこれらの値は、流路の構造によって決まり、対象とする粒子の大きさによって、０．１％から３０％の間で任意に設定することができる。また、これらの流量の分配割合は、流量・管径・圧力損失の関係を表したハーゲン・ポアズイユの式などをもとに計算することができる。また、導入口１、２、３から流量比約１：１：０．３で、粘度の同じ溶液を導入すると、導出口１，２，３からはそれぞれ、導入した全流量の約７％、６８％、２５％が流出するような設計になっており、これらの数値も、流量と抵抗の関係から計算する、あるいは任意の値に設定することができる。 With such a flow path design, at each of 40 branch points (DR1 and DR2), approximately 2.5% of the flow rate passing through each branch point is distributed to the outlet flow path. The value is about 3.5 μm when converted to the value of W1 in FIG. These values are determined by the structure of the flow path and can be arbitrarily set between 0.1% and 30% depending on the size of the target particles. Further, the distribution ratio of these flow rates can be calculated based on the Hagen-Poiseuille equation representing the relationship between the flow rate, the pipe diameter, and the pressure loss. When a solution having the same viscosity is introduced from the
以上の構成において、上記したマイクロ流路システムを用いた、短時間の粒子処理の実施例として、化学物質の暴露時間が細胞の生存率および表面構造に与える影響を評価するための細胞処理、より具体的には、界面活性剤を用いた細胞処理について説明する。 In the above configuration, as an example of short-time particle treatment using the above-described microchannel system, cell treatment for evaluating the effect of chemical exposure time on cell viability and surface structure, and more Specifically, cell treatment using a surfactant will be described.
まず、粒子懸濁溶液としてはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用い、また、細胞処理溶液として、界面活性剤の持つ急性細胞毒性を評価するために、非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００を０．１または０．２％（ｗ／ｖ）を含むＰＢＳを用い、さらに、細胞洗浄溶液としても、細胞懸濁溶液として用いた溶液と同じく、ＰＢＳを用いた。また、細胞としてはＨｅＬａ細胞（直径８−３０μｍ、平均直径１８μｍ）を用い、ＰＢＳに懸濁した後に、４０μｍのフィルターを用いて、大きな細胞塊や粉塵等の除去を行った。 First, PBS (phosphate buffered saline) is used as the particle suspension, and the nonionic surfactant Triton-X is used as the cell treatment solution in order to evaluate the acute cytotoxicity of the surfactant. PBS containing 100 or 0.1% or 0.2% (w / v) was used, and PBS was also used as the cell washing solution in the same manner as the solution used as the cell suspension solution. Further, HeLa cells (diameter: 8-30 μm, average diameter: 18 μm) were used as the cells, and after suspending in PBS, large cell masses and dusts were removed using a 40 μm filter.
そして、用意した細胞懸濁溶液、細胞処理溶液、細胞洗浄溶液を、導入口１、２、３から、それぞれ連続的に供給した。なお、流体の供給のために、シリンジポンプを用いた定流量送液を行った。 Then, the prepared cell suspension solution, cell treatment solution, and cell washing solution were continuously supplied from the
この流路構造を用いた場合、入口流量比が約１：１：０．３の場合、直径約７μｍ以上の細胞は、導入口１から導出口１へと流れつつ、主流路（流路部Ｄ１）において、４０の分岐点（ＤＲ１）における２０番目の分岐点から、４０の分岐点（ＤＲ２）における１９番目の分岐点の間の領域において、細胞処理溶液（純度９９％以上）の流れの中を通過する。 When this flow path structure is used, when the inlet flow ratio is about 1: 1: 0.3, cells having a diameter of about 7 μm or more flow from the
なお、モデル粒子として、粒径１０μｍのポリスチレン微粒子を０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０水溶液に懸濁させた懸濁溶液を導入口１から、粒子を懸濁させない溶液を導入口２、３から、それぞれシリンジポンプを用いて流量３０、３０、１０μＬ／ｍｉｎで導入したところ、分岐点（ＤＲ１）より下流の主流路においては、粒子は壁側にそってほぼ一列に流れ、さらに、導入した粒子のほぼ１００％は導出口１から排出されることが確かめられた。 As a model particle, a suspension solution in which polystyrene fine particles having a particle diameter of 10 μm are suspended in a 0.5% (w / v) Tween 80 aqueous solution is introduced from the
さらに、溶液ＡとしてＰＢＳ、溶液Ｂとして蛍光物質を含むＰＢＳ、溶液ＣとしてＰＢＳを、それぞれ導入口１、２、３から流速３０、３０、１０μＬ／ｍｉｎで、図４（ａ）に示すマイクロ流路システムに導入し、蛍光物質の濃度を定量したところ、主流路（Ｄ）における、主流路（処理部ＤＥ）内での蛍光物質濃度は、導入口２から導入した溶液の蛍光物質濃度のほぼ１００％であり、また、導出口１から排出された溶液中の蛍光物質濃度は、導入口２から導入した蛍光物質濃度の０．１％以下であり、これらの溶液間にほとんど混合が起こっていないことが確かめられた。 Further, PBS as the solution A, PBS containing the fluorescent substance as the solution B, and PBS as the solution C are respectively supplied from the
また、実際に、細胞としてＨｅＬａ細胞を用いた処理を行い、全体の流量を３５μＬ／ｍｉｎから１４０μＬ／ｍｉｎに変化させ、また、図４（ｃ）（ｄ）にそれぞれ示した２種類の流路構造を用いることで、滞留時間（処理時間）を約１０−２００ミリ秒の間に変化させることができ、さらに、ハイスピードカメラを用いて観察を行った結果、滞留時間の平均値に対する標準偏差は、いずれの流速条件下でも１０％以下であることが確認できた。 In addition, the treatment using HeLa cells as the cells was actually performed to change the overall flow rate from 35 μL / min to 140 μL / min, and the two types of flow paths shown in FIGS. 4C and 4D, respectively. By using the structure, the residence time (processing time) can be changed between about 10-200 milliseconds. Furthermore, as a result of observation using a high-speed camera, the standard deviation from the average value of the residence time Was 10% or less under any flow rate condition.
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００の暴露時間による細胞生存率の変化を確認したところ、細胞の生存率は、処理時間が３０ミリ秒程度以下の場合には、処理前と比較してほとんど差がないが、４０ミリ秒程度を超えると劇的に減少し、１００ミリ秒以上の場合には、ほぼ生存率は０％になることが分かった。 As a result of confirming the change in the cell viability with the exposure time of Triton-X 100, the cell viability is almost the same as that before the treatment when the treatment time is about 30 milliseconds or less. It was found that when the time exceeded about milliseconds, the number decreased dramatically, and when the time was longer than 100 milliseconds, the survival rate was almost 0%.
図５には、処理前後の細胞の表面を電子顕微鏡によって観察した写真を示した。図５（ａ）（ｂ）（ｃ）はそれぞれ、処理前、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で約２０ミリ秒処理、１００ミリ秒処理、の細胞の写真であるが、処理時間が１００ミリ秒の場合では、細胞の表面が大幅にダメージを受けている様子が観察され、化学物質の暴露時間の細胞に与えるダメージを、定性的・定量的に評価することに成功した。 In FIG. 5, the photograph which observed the surface of the cell before and behind a process with the electron microscope was shown. FIGS. 5 (a), (b), and (c) are photographs of cells that have been processed with 0.2% Triton-X100 for about 20 milliseconds and 100 milliseconds, respectively, before the treatment. In the case of, it was observed that the surface of the cells was significantly damaged, and we succeeded in qualitatively and quantitatively evaluating the damage to the cells during the chemical exposure time.
なお、以上の実施例においては、界面活性剤が直接的にＨｅＬａ細胞表面の膜構造に与えるダメージについての評価を行ったが、目的に応じて、他の細胞種や化学物質を用いて、化学物質のもつ急性毒性の評価を行うことも可能である。 In the above examples, the damage was directly evaluated by the surfactant on the membrane structure of the HeLa cell surface. However, depending on the purpose, other cell types and chemical substances were used for the chemical reaction. It is also possible to evaluate the acute toxicity of the substance.
また、たとえば、細胞の膜上に存在するタンパク質の急速な構造変化を観察する場合には、処理溶液として、薬理活性を有する金属イオン・有機小分子・ペプチド等を含む溶液を、また、洗浄溶液として、細胞を固定化する成分を含んだ溶液をそれぞれ導入することで、処理時間を厳密に制御しつつ、細胞表面での分子構造変化を観察することが可能となる。 For example, when observing a rapid structural change of a protein present on a cell membrane, a solution containing a metal ion / organic small molecule / peptide having pharmacological activity as a treatment solution, or a washing solution As described above, by introducing a solution containing a component for immobilizing cells, it is possible to observe the molecular structure change on the cell surface while strictly controlling the treatment time.
たとえば、表面に活性分子種を有する粒子を単体として用い、粒子処理溶液としてモノマー分子を含む溶液を、粒子洗浄溶液として反応停止作用のある溶液を用いることで、粒子表面において時間を制御しつつ高分子の重合を行うことができる。 For example, by using particles having active molecular species on the surface as a simple substance, a solution containing monomer molecules as the particle treatment solution, and a solution having a reaction stopping action as the particle cleaning solution, the time can be controlled while controlling the time on the particle surface. Polymerization of molecules can be performed.
さらに、同様な粒子を用い、表面における化学反応と洗浄を繰り返すことで、粒子を用いたＤＮＡ等の合成を、連続的かつ非常に迅速に行うことが可能となる。 Furthermore, by using similar particles and repeating chemical reaction and washing on the surface, it becomes possible to synthesize DNA and the like using the particles continuously and very rapidly.
本発明は、たとえば化学物質の細胞に対する毒性や薬理効果を評価するための、暴露時間と濃度を正確にコントロールできる手段を提供できる。また、本発明は、以上説明したように構成されているので、たとえば細胞生物学や構造生物学等の研究分野において、通常の装置では評価できない急速な膜分子構造変化を観察することができるため、たとえば新薬を設計・創造するための有用な手段となりうる。さらに、本発明は、以上説明したように構成されているので、たとえばＦＡＣＳのようなフローサイトメトリー等の装置において、細胞を一定の時間処理あるいは染色するための前処理を簡便、正確、かつ連続的に行うことを可能とするシステムとして、広く利用されることが期待される。また、さらに、本発明は、以上説明したように構成されているので、たとえば粒子を用いた化学合成を行う際に、反応時間を正確に制御しつつ、多段階の反応を連続的に行うことができるため、鎖長を制御した高分子合成や、ＤＮＡ・ペプチド等の合成を正確に行うことが可能となり、幅広い応用が期待される。 The present invention can provide means for accurately controlling the exposure time and concentration, for example, for evaluating the toxicity and pharmacological effects of chemical substances on cells. In addition, since the present invention is configured as described above, for example, in a research field such as cell biology and structural biology, it is possible to observe a rapid change in the molecular structure of a membrane that cannot be evaluated by an ordinary apparatus. For example, it can be a useful tool for designing and creating new drugs. Furthermore, since the present invention is configured as described above, for example, in a device such as flow cytometry such as FACS, pretreatment for treating or staining cells for a certain period of time is simple, accurate, and continuous. The system is expected to be widely used as a system that can be performed automatically. Furthermore, since the present invention is configured as described above, for example, when performing chemical synthesis using particles, a multi-stage reaction is continuously performed while accurately controlling the reaction time. Therefore, it is possible to accurately synthesize macromolecules with controlled chain length and to synthesize DNA / peptides, and a wide range of applications are expected.
Claims (16)
（１）導入口（ＤＰ）より溶液Ａ（組成ａ）が連続的に導入される直径１．５Ｒμｍ〜３０Ｒμｍの主流路（流路部Ｄ１）と、合流点（ＤＰ１）において主流路（流路部Ｄ１）に合流し溶液Ａとは異なる組成の溶液Ｂ（組成ｂ）が連続的に導入される導入流路（Ｐ１）、並びに合流点（ＤＰ１）より下流における分岐点（ＤＲ１）において主流路（流路部Ｄ１）より分岐し溶液Ａおよび一部の溶液Ｂが排出される直径０．５Ｒμｍ〜１０Ｒμｍの導出流路（Ｒ１）、並びに分岐点（ＤＲ１）より下流における主流路（処理部ＤＥ）、から構成され、
（２）さらに、主流路（処理部ＤＥ）の下流における直径１．５Ｒμｍ〜３０Ｒμｍの主流路（流路部Ｄ２）と、合流点（ＤＰ２）において主流路（流路部Ｄ２）に合流し溶液Ｃ（組成ｃ）が連続的に導入される導入流路（Ｐ２）、並びに合流点（ＤＰ２）より下流における分岐点（ＤＲ２）において主流路（流路部Ｄ２）より分岐し、主流路（処理部ＤＥ）内を通過した溶液および一部の溶液Ｃが排出される直径０．５Ｒμｍ〜１０Ｒμｍの導出流路（Ｒ２）、並びに分岐点（ＤＰ２）の下流における主流路（Ｄ）の導出口（ＤＲ）、から構成され、
（３）主流路（Ｄ）における分岐点（ＤＲ１）から主流路（処理部ＤＥ）へと流れる溶液の純度が、導入流路（Ｐ１）より導入された溶液Ｂ（組成ｂ）の９９％以上であり、
（４）さらに主流路（Ｄ）における分岐点（ＤＲ２）から導出口（ＤＲ）へと流れる溶液の純度が、導入流路（Ｐ２）より導入された溶液Ｃ（組成ｃ）の９９％以上であり、
（５）当該粒子が溶液Ａ（組成ａ）と共に主流路（Ｄ）に導入され、主流路（Ｄ）内を流れる各組成の溶液内を連続的に通過し、導出口（ＤＲ）より回収されることを特徴とする、
粒子処理用マイクロ流路システム。A micro flow channel having an introduction flow channel and a discharge flow channel with respect to the main flow channel (D) for continuously treating the surface and / or the inside of particles having an average particle size of R μm (R is 1 or more and 100 or less). System, and that system
(1) A main flow path (flow path portion D1) having a diameter of 1.5 Rm to 30 Rm through which the solution A (composition a) is continuously introduced from the introduction port (DP), and a main flow path (flow path at the junction (DP1)) The main flow path at the introduction flow path (P1) where the solution B (composition b) having a different composition from the solution A is continuously introduced into the part D1) and at the branch point (DR1) downstream from the merge point (DP1) The outlet channel (R1) having a diameter of 0.5 Rm to 10 Rm from which the solution A and a part of the solution B are discharged by branching from the channel unit D1 and the main channel (processing unit DE) downstream from the branch point (DR1) ), And
(2) Further, the main flow path (flow path section D2) having a diameter of 1.5 Rm to 30 Rm downstream of the main flow path (processing section DE) and the main flow path (flow path section D2) are joined at the junction (DP2). The main flow path (processing section D2) branches off at the introduction flow path (P2) into which C (composition c) is continuously introduced, and the branch point (DR2) downstream from the junction (DP2). Part DE), the outlet channel (R2) having a diameter of 0.5 Rm to 10 Rm from which the solution and a part of the solution C are discharged, and the outlet port of the main channel (D) downstream of the branch point (DP2) ( DR), and
(3) The purity of the solution flowing from the branch point (DR1) in the main channel (D) to the main channel (processing section DE) is 99% or more of the solution B (composition b) introduced from the introduction channel (P1). And
(4) The purity of the solution flowing from the branch point (DR2) to the outlet (DR) in the main channel (D) is 99% or more of the solution C (composition c) introduced from the introduction channel (P2). Yes,
(5) The particles are introduced into the main channel (D) together with the solution A (composition a), continuously pass through the solution of each composition flowing in the main channel (D), and collected from the outlet (DR). It is characterized by
Microchannel system for particle processing.
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010071857A (en) * | 2008-09-19 | 2010-04-02 | Sekisui Chem Co Ltd | Plasma separation device |
| JP2011147387A (en) * | 2010-01-21 | 2011-08-04 | Foundation For The Promotion Of Industrial Science | Method for controlling substance distribution, device, method for culturing cell, and method for controlling cell differentiation |
| KR20160123656A (en) * | 2015-04-16 | 2016-10-26 | 주식회사 엘지화학 | Method for preparation of high-concentrated graphene solution |
| JP2017211203A (en) * | 2016-05-23 | 2017-11-30 | 新日本無線株式会社 | Biological sample collector and method of collecting biological samples |
| CN110753750A (en) * | 2017-05-17 | 2020-02-04 | 公立大学法人大阪 | Particle trap device and particle trap method |
| WO2020036115A1 (en) * | 2018-08-14 | 2020-02-20 | 株式会社 ＴＬ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ | Fluid device |
| WO2020045434A1 (en) * | 2018-08-28 | 2020-03-05 | 京セラ株式会社 | Particle separation device and particle separation apparatus |
| WO2023006504A1 (en) * | 2021-07-29 | 2023-02-02 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Sample carrier, use thereof, and methods, in particular for detecting pathogens |
| WO2024018925A1 (en) * | 2022-07-21 | 2024-01-25 | 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス | Separation device |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001281233A (en) * | 2000-03-28 | 2001-10-10 | Inst Of Physical & Chemical Res | Microchip for water distribution and water distribution method using it |
| JP2007021465A (en) * | 2005-07-12 | 2007-02-01 | Minoru Seki | Flow passage structure and method for concentrating/separating particle continuously |
| JP2007175684A (en) * | 2005-12-26 | 2007-07-12 | Minoru Seki | Flow passage structure and method for concentration and classification of fine particle |
| JP2007244244A (en) * | 2006-03-14 | 2007-09-27 | National Institute For Materials Science | Method for preparing transformed cell population |
-
2008
- 2008-03-12 JP JP2008101939A patent/JP4982768B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001281233A (en) * | 2000-03-28 | 2001-10-10 | Inst Of Physical & Chemical Res | Microchip for water distribution and water distribution method using it |
| JP2007021465A (en) * | 2005-07-12 | 2007-02-01 | Minoru Seki | Flow passage structure and method for concentrating/separating particle continuously |
| JP2007175684A (en) * | 2005-12-26 | 2007-07-12 | Minoru Seki | Flow passage structure and method for concentration and classification of fine particle |
| JP2007244244A (en) * | 2006-03-14 | 2007-09-27 | National Institute For Materials Science | Method for preparing transformed cell population |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010071857A (en) * | 2008-09-19 | 2010-04-02 | Sekisui Chem Co Ltd | Plasma separation device |
| JP2011147387A (en) * | 2010-01-21 | 2011-08-04 | Foundation For The Promotion Of Industrial Science | Method for controlling substance distribution, device, method for culturing cell, and method for controlling cell differentiation |
| KR20160123656A (en) * | 2015-04-16 | 2016-10-26 | 주식회사 엘지화학 | Method for preparation of high-concentrated graphene solution |
| KR101993907B1 (en) | 2015-04-16 | 2019-06-27 | 주식회사 엘지화학 | Method for preparation of high-concentrated graphene solution |
| JP2017211203A (en) * | 2016-05-23 | 2017-11-30 | 新日本無線株式会社 | Biological sample collector and method of collecting biological samples |
| CN110753750B (en) * | 2017-05-17 | 2024-01-16 | 公立大学法人大阪 | Particle capturing device and particle capturing method |
| CN110753750A (en) * | 2017-05-17 | 2020-02-04 | 公立大学法人大阪 | Particle trap device and particle trap method |
| WO2020036115A1 (en) * | 2018-08-14 | 2020-02-20 | 株式会社 ＴＬ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ | Fluid device |
| CN112601613A (en) * | 2018-08-28 | 2021-04-02 | 京瓷株式会社 | Particle separation device and particle separation apparatus |
| JPWO2020045434A1 (en) * | 2018-08-28 | 2021-08-26 | 京セラ株式会社 | Particle Separator and Particle Separator |
| JP6999825B2 (en) | 2018-08-28 | 2022-01-19 | 京セラ株式会社 | Particle Separation Device and Particle Separation Device |
| CN112601613B (en) * | 2018-08-28 | 2022-07-05 | 京瓷株式会社 | Particle separation device and particle separation apparatus |
| WO2020045434A1 (en) * | 2018-08-28 | 2020-03-05 | 京セラ株式会社 | Particle separation device and particle separation apparatus |
| WO2023006504A1 (en) * | 2021-07-29 | 2023-02-02 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Sample carrier, use thereof, and methods, in particular for detecting pathogens |
| WO2024018925A1 (en) * | 2022-07-21 | 2024-01-25 | 株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス | Separation device |
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| Publication number | Publication date |
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