JP2008136475A - Cell catching device and cell catching method using the same - Google Patents

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JP2008136475A JP2007053514A JP2007053514A JP2008136475A JP 2008136475 A JP2008136475 A JP 2008136475A JP 2007053514 A JP2007053514 A JP 2007053514A JP 2007053514 A JP2007053514 A JP 2007053514A JP 2008136475 A JP2008136475 A JP 2008136475A
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Yoshinori Yamaguchi
山口佳則
Yoshikuni Edakawa
枝川義邦
Takahiro Arakawa
荒川貴博
Naoya Takeda
武田直也
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a cell catching member having a simple structure and realizing multiple functions comprising the capture, release and disintegration of separated single cell or multiple cells. <P>SOLUTION: The cell catching member has at least two parallelly placed main flow channels. A passing channel having a cross-section smaller than the maximum value of the cross-section of the material to be caught is placed between both main flow channels and liquids having different flow rates are passed through these two main flow channels to generate negative or positive pressure at the inlet part of the passing channel. The cell flowing through the main flow channel is caught or released at the inlet part of the passing channel. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、細胞の集団から分離された細胞の捕捉、放出、破砕、さらには培養を可能とする細胞捕捉装置及びそれを用いた細胞捕捉、放出、破砕、培養の方法に関するものである。   The present invention relates to a cell trapping device that enables capture, release, disruption, and culture of cells separated from a population of cells, and a method of cell capture, release, disruption, and culture using the same.

組織や培養細胞を用いて、再生医療、分子医療、ゲノム創薬を行う場合に、細胞の観察や実験は不可欠である。細胞の集団としての効果より綿密に解析する場合には、細胞塊ではなく、単一の細胞をそれぞれ単離し、若しくは数個の細胞群を空間的に分離した状態での観察・実験をすることが必要となる。さらに、集団としての機能が確立される組織においても、それを構成する細胞等をより詳しく調べることで、各細胞の分化の違いなどを明らかにすることが出来る。特に、細胞一個の内容物を調べることによって、特定のタンパク質やDNAの発現経路がより詳しくわかり、また同じ細胞であっても周囲の環境の違いや概日リズム等における時間的な違いによって、遺伝子やタンパク質の発現パターンが揺らぐもしくは異なる現象を詳しく理解することも可能となる。   When performing regenerative medicine, molecular medicine, and genomic drug discovery using tissues and cultured cells, cell observation and experiments are indispensable. When analyzing more closely than the effect of a group of cells, isolate a single cell, not a cell mass, or observe and experiment with several groups of cells spatially separated. Is required. Furthermore, even in a tissue in which a function as a group is established, the difference in differentiation of each cell can be clarified by examining the cells constituting the cell in more detail. In particular, by examining the contents of a single cell, the expression pathway of a specific protein or DNA can be understood in more detail. It is also possible to understand in detail the phenomenon in which the protein expression pattern fluctuates or is different.

これらの再生医療、ゲノム創薬を含む現代の先端的な医療分野や生物学において、集団の中の細胞一個の役割を調べる技術やそれを用いて得られる知見は、その全体としての生化学的機能の優れた組織を再生する上で有用である。また、細胞の集団や組織の中での細胞一個の役割を理解することにより、極めて微量な試料で遺伝性の病気や後天的な疾患を調べることが可能になる。これらの技術は、受精卵もしくは分化の進む前の細胞に適用し、早期の診断に用いることもできる。さらに、特定のタンパク質の生産力が高い大腸菌などの微生物を構築するなど、バイオテクノロジーへの応用も期待できる。   In these advanced medical fields and biology, including regenerative medicine and genomic drug discovery, the technology for investigating the role of a single cell in a population and the knowledge gained using it are biochemical as a whole. It is useful in regenerating a tissue with excellent functions. In addition, by understanding the role of a single cell in a cell population or tissue, it is possible to examine inherited diseases and acquired diseases with extremely small amounts of samples. These techniques can be applied to fertilized eggs or cells before progressing differentiation, and can be used for early diagnosis. Furthermore, it can be expected to be applied to biotechnology, such as constructing microorganisms such as Escherichia coli with high productivity of specific proteins.

単一の細胞に対して、なんらかの処置を行おうとする試みは例えば、特許文献１に見られるように、細胞の大きさよりも小さい開口を区画する通路と、通路に接続され、通路内に負圧を発生させる負圧発生手段と、通路に接続され、通路内の負圧を調整する負圧制御手段とを備えることを特徴とし、安定した細胞捕捉のための装置が開示されている。負圧発生手段として、真空ポンプが開示されている。   Attempts to perform some kind of treatment on a single cell are, for example, as shown in Patent Document 1, a passage defining an opening smaller than the size of a cell, a passage connected to the passage, and a negative pressure in the passage. An apparatus for stable cell trapping is disclosed, characterized by comprising negative pressure generating means for generating a negative pressure, and negative pressure control means for adjusting a negative pressure in the passage connected to the passage. A vacuum pump is disclosed as the negative pressure generating means.

また、特許文献２では、細胞の捕獲機構は、ウエル（窪み）を設け、その大きさは単一の細胞のみを保持する大きさ及び形状にすることを特徴として、細胞は重力によってウエル内部に保持されると開示されている。また、ウエルに保持された細胞を放出させる手法として、ウエルの下に設置されたチャンバーに泡核生成を引き起こし、チャンバー内側に容積膨張を作り出し、ウエルとチャンバーの間のチャネルを通じて、流体の噴出により、細胞をウエル外に排出されることを開示している。
特開２００６−１９７８８０ 細胞捕捉装置及び細胞捕捉方法 特表２００３−５１４２３６ 細胞を操作するための細胞分析及び選別装置 In Patent Document 2, the cell capturing mechanism is provided with a well (depression), and the size of the cell capture mechanism is such that it holds only a single cell. It is disclosed to be retained. In addition, as a method of releasing the cells held in the well, bubble nucleation is generated in the chamber placed under the well, volume expansion is created inside the chamber, and fluid is ejected through the channel between the well and the chamber. Discloses that cells are discharged out of the well.
Patent application title: Cell capture device and cell capture method Special table 2003-514236 Cell analysis and sorting device for manipulating cells

また、細胞を捕獲することによって、生じる効果として、従来の方法は捕獲した細胞にマイクロインジェクションなどの外的な操作を加え、その効果を調べるものを目的としたものであるが、本発明は、外的な操作を流路の内部で行うことが可能であり、外部環境に晒されにくく、より精密に細胞一個の形態や操作、分析を可能とするものである。   In addition, as an effect produced by capturing the cells, the conventional method is intended to investigate the effect by adding an external operation such as microinjection to the captured cells. An external operation can be performed inside the flow path, it is difficult to be exposed to the external environment, and the form, operation, and analysis of one cell can be performed more precisely.

従来の技術や装置はこの用途に一致しているものはない。例えば、特許文献１の発明のような安定した細胞の捕捉に関する発明は、負圧発生手段や負圧制御手段として、真空ポンプや電空レギュレータを必要として、大掛かりな装置を必要としてしまう。また、特許文献２の発明は、細胞を保持する手法として、重力を利用しているので、効率的な細胞の捕捉が難しい。また、細胞の放出方法は泡核生成としているので、装置の構成が複雑なものとなる。   None of the prior art or devices match this application. For example, the invention relating to stable cell capture such as the invention of Patent Document 1 requires a vacuum pump and an electropneumatic regulator as the negative pressure generating means and the negative pressure control means, and requires a large-scale device. In addition, since the invention of Patent Document 2 uses gravity as a method for holding cells, it is difficult to efficiently capture cells. In addition, since the cell release method is bubble nucleus generation, the configuration of the apparatus becomes complicated.

そこで、本発明は、細胞の捕捉、放出、破砕、培養する方法において、単純な流路と流体を組み合わせることによって、単純な構造でありながら、細胞の捕捉、放出、破砕、培養に係る小さい動力で可能とする細胞一個の捕捉、放出、破砕、培養の方法及び装置の開発を目的とする。   Therefore, the present invention is a method for capturing, releasing, crushing, and culturing cells. By combining a simple flow path and fluid, the present invention has a simple structure and a small power related to cell capture, release, crushing, and culture. The purpose is to develop a method and apparatus for capturing, releasing, crushing, and culturing a single cell that can be achieved with this method.

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意工夫を重ねた結果、異なる流速で液体が流れることができる２以上の主流路とその主流路間に通過路を設けることで、異なる流速を発生させることによる当該通過路部位での流速の差を利用した細胞の捕捉、放出、破砕できることを見出し、本発明を完成するに至った。また、同時に捕捉した細胞を個別に培養することが可能であることも発見した。   As a result of intensive efforts to solve the above problems, the present inventor generates two different flow rates by providing two or more main flow channels capable of flowing liquid at different flow rates and a passage between the main flow channels. As a result, it was found that cells can be captured, released, and crushed using the difference in flow velocity at the passage portion, and the present invention has been completed. It was also discovered that simultaneously captured cells can be cultured individually.

本発明は、層流を生じせしめる程度の微小な並走する主流路を少なくとも２つ使用して当該主流路の流速を異なる流速とさせることによって細胞を捕捉する方法を提供するものである。ここで、上記主流路の直径幅が層流を生じしめる程度の１００マイクロメートル以下であるようなマイクロチャンネルであってもよい。また、上記主流路の高さが細胞一個の大きさ以上であるようなマイクロチャンネルであってもよい。本発明において、細胞とは、単一細胞、複数の単一細胞が結合した細胞群、又は、同細胞群が複数集まった細胞群が挙げられ、また、細胞は培養細胞でもよく、任意の組織から単一細胞若しくは数個の細胞群を分離したものであってもよい。また、細胞は、生体組織若しくは培養された一つの細胞集団から浮遊化されたもの、若しくは生来浮遊化しているものであってもよい。   The present invention provides a method for capturing cells by using at least two main parallel flow channels that generate a laminar flow so that the flow rates of the main flow channels are different. Here, it may be a microchannel whose diameter width of the main flow path is 100 micrometers or less enough to generate a laminar flow. Further, the microchannel may be such that the height of the main channel is not less than the size of one cell. In the present invention, the cell includes a single cell, a cell group in which a plurality of single cells are combined, or a cell group in which a plurality of the cell groups are collected, and the cell may be a cultured cell, and any tissue. A single cell or a group of several cells may be separated from each other. Further, the cells may be suspended from a living tissue or a cultured cell population, or may be suspended naturally.

また、本発明は、少なくとも２つの並走する主流路の間を繋ぐことができる、単一細胞の断面線分の最大値と同一若しくはそれ以下の長さの断面線分を有する流体の通過路を設けた細胞捕捉部材を利用することが挙げられる。また、少なくとも２つの並走する主流路の１又は２以上の特定の部位において、その幅が異なることを特徴とする前記部材を利用してもよい。上記の細胞の断面線分とは、細胞膜上の任意の2点を結んだ線分を意味する。   Further, the present invention provides a fluid passage having a cross-sectional line segment having a length equal to or less than the maximum value of the cross-sectional line segment of a single cell, which can connect between at least two parallel main flow paths. Use of a cell-capturing member provided with Moreover, you may utilize the said member characterized by the width differing in the 1 or 2 or more specific site | part of the at least 2 parallel main flow path. The above-mentioned cell cross-sectional line means a line connecting any two points on the cell membrane.

ここで、単一細胞の断面線分の最大値と同一若しくはそれ以下の長さの断面線分を有する流体の通過路としたのは、細胞が通過路を通過できない大きさとすることで、通過路入口部位で捕捉できるようにしたものである。ここでは、細胞を流速の速い主流路を流れるものとして、並行する他方の流路は流速の遅い液体を流すことで、この２つの主流路間の通過路において、圧力差が生じて通過路入口部位で細胞を捕捉することができる。２つの主流路の流速の調整は、通過路入口部位で細胞の形状が変化するなどストレスを与えない程度で捕捉できるものとするように行うことが望ましい。 Here, the fluid passage having the cross-sectional line length equal to or less than the maximum value of the cross-sectional line segment of a single cell is defined as a size that prevents the cell from passing through the passage. It can be captured at the road entrance site. Here, it is assumed that the cells flow through the main flow path with a high flow velocity, and the other flow passage in parallel flows a liquid with a low flow velocity. Cells can be captured at the site. It is desirable to adjust the flow speeds of the two main flow paths so that they can be captured to the extent that no stress is applied, such as changes in the cell shape at the entrance of the passage.

さらに、別の態様として、小さい断面積の流路を利用することによって、それぞれの細胞が捕捉された後、それぞれに加える圧力、流れが作りだす圧力の違い、細胞が通過路に押し込まれて受ける圧力を利用して細胞を破砕できる。   Furthermore, as another aspect, by using a channel with a small cross-sectional area, after each cell is captured, the pressure applied to each cell, the difference in the pressure created by the flow, the pressure received by the cell being pushed into the passage Can be used to disrupt cells.

また、主流路の配置方法は、例えば、中央とその両側に主流路を設けて、中央の流路には単離された細胞を含んだ液体を流し、その両側の流路には、流速の遅い液体を流して、中央の流路の側面にある通過路入口で捕捉してもよい。逆に、両側の主流路に単離された細胞を含んだ液体を流し、中央の流路に流速の遅い液体を流して、両側の主流路の側面にある通過路入口で捕捉してもよい。通過路は２つの主流路の間に、複数路を配置してもよい。また、通過路は、主流路に対して垂直、若しくは、細胞の流れる向きに対して、１８０度以内の斜め方向に配置してもよい。   In addition, for example, the main flow path is arranged by providing a main flow path at the center and both sides thereof, allowing the liquid containing the isolated cells to flow through the central flow path, Slow liquid may be flowed and captured at the passageway entrance on the side of the central channel. On the contrary, the liquid containing the isolated cells may flow in the main flow paths on both sides, the liquid with a low flow rate may flow in the central flow path, and captured at the passageway entrance on the side of the main flow paths on both sides. . A plurality of paths may be arranged between the two main flow paths. The passage may be arranged perpendicular to the main flow path or in an oblique direction within 180 degrees with respect to the cell flow direction.

また、本発明は、請求項１の方法または本発明の細胞捕捉部材を用いて捕捉した細胞を、当該部材で培養する方法を提供するものである。さらに、層流を生じせしめる程度に微小である、少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって、前記細胞捕捉部材を利用して細胞を捕捉し培養する方法としてもよい。本発明の特徴として、本発明の細胞捕捉部材は、細胞を捕捉するとともに、当該部材で培養することができる。細胞が捕捉された流路に、細胞培養液を流すことができ、また、主流路に細胞培養液を流しつづけ、長時間の安定した培養を可能とすることが挙げられる。さらに、温度調整は、細胞捕捉部材を置くステージ等に加熱装置を設置することや、細胞捕捉部材若しくはその周辺機器をも、温度調節可能なインキュベーターのなかに入れることが挙げられる。また、捕捉した一個の細胞について細胞培養液を別個に一つの流路を用いて与えることを可能としてもよい。   Moreover, this invention provides the method of culture | cultivating the cell capture | acquired using the method of Claim 1, or the cell capture member of this invention by the said member. Furthermore, it is good also as a method of capturing and culturing a cell using the said cell capture member by changing the flow rate of the at least two parallel main flow paths which are so small as to cause laminar flow. As a feature of the present invention, the cell-capturing member of the present invention can capture cells and can be cultured on the member. For example, the cell culture solution can be flowed through the channel in which the cells are captured, and the cell culture solution can be continuously flowed through the main channel to enable stable culture for a long time. Furthermore, the temperature adjustment may be performed by installing a heating device on a stage or the like on which the cell capturing member is placed, or by placing the cell capturing member or its peripheral device in an incubator capable of adjusting the temperature. Further, it may be possible to separately give a cell culture solution to one captured cell using one channel.

本発明は、上述の物体捕捉装置を用いて単離された単一細胞若しくは数個の細胞群を培養する方法であって、細胞を通過路入口部位で捕捉するとともに、その部位にある細胞に細胞培養液を連続的に与えることができることを特徴とする細胞の培養方法を提供するものである。ここで、細胞は捕捉した後は、主流路の流れを止め、そのまま培養すること、または、流れを止めずに、かつ細胞の破砕等の変化が生じない条件で細胞を捕捉し続けて培養することが挙げられる。 The present invention is a method for culturing a single cell or a group of several cells isolated using the above-described object capturing device, wherein the cell is captured at the entrance of the passageway, and the cell at that site is captured. The present invention provides a method for culturing cells, characterized in that a cell culture solution can be continuously provided. Here, after capturing the cells, stop the flow in the main channel and culture as it is, or continue to capture and culture the cells without stopping the flow and under conditions that do not cause changes such as cell disruption. Can be mentioned.

細胞を培養するにあたっては、細胞の効果的な接着を促すために、流路内を細胞外基質のタンパク質やペプチドもしくは合成高分子を含む試薬で修飾してもよい。これらの修飾分子は、少なくとも２つの主流路の流速を制御することにより、流路の全部もしくは特異的な一部を修飾するようにしてもよい。また、修飾は物理的な吸着もしくは化学結合を利用してもよい。   In culturing the cells, the inside of the flow path may be modified with a reagent containing an extracellular matrix protein, peptide, or synthetic polymer in order to promote effective cell adhesion. These modifying molecules may modify all or a specific part of the channel by controlling the flow rate of at least two main channels. The modification may use physical adsorption or chemical bonding.

ここで、流路の全部もしくは特異的な一部を化学結合で修飾するために、適当な試薬を流して表面を予め化学的に修飾してもよい。また、細胞を接着しやすくするのと同様の方法を用いて、細胞を接着しにくくする試薬を用いて、流路を修飾してもよい。   Here, in order to modify all or a specific part of the channel with chemical bonds, the surface may be chemically modified in advance by flowing an appropriate reagent. Further, the flow path may be modified using a reagent that makes it difficult to adhere cells, using the same method as that for easily attaching cells.

また、本発明は、少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって、前記細胞捕捉部材内に補足した細胞を放出または解放する方法、さらに、その放出または解放した細胞を回収する方法を提供する。さらに、少なくとも前記細胞捕捉部材の少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって細胞を破砕する方法を提供するものである。ここで、主流路の構成等、若しくは利用する細胞捕捉部材については、上述した細胞を捕捉する方法で利用する細胞捕捉部材と同様である。   The present invention also provides a method for releasing or releasing the cells captured in the cell capturing member by changing the flow rates of at least two parallel main flow paths, and a method for recovering the released or released cells. I will provide a. Furthermore, the present invention provides a method for disrupting cells by changing the flow rate of at least two parallel main flow paths of at least the cell capturing member. Here, the configuration of the main flow path, etc., or the cell trapping member used is the same as the cell trapping member used in the above-described method of trapping cells.

また、本発明は、上述の細胞捕捉方法で捕捉した細胞を放出させる方法であって、通過路入口部位に捕捉された細胞がある主流路を流れる液体の流速を、通過路を共有した他方の主流路を流れる液体の流速に比して遅くすることを特徴とする細胞放出方法を提供する。ここでは、上記の捕捉方法における２つの主流路の流速を逆転させる。これにより、細胞の無い主流路を流れる液体が、圧力差により通過路を介して、もう片方の主流路の通過路入口部位を塞ぐように捕捉されている細胞を押し出し、細胞を放出させることができる。放出された細胞は主流路より回収し、他の培養器材で再び培養することも可能である。   Further, the present invention is a method for releasing the cells captured by the above-described cell capturing method, wherein the flow rate of the liquid flowing in the main channel where the cells captured at the passageway entrance site are present is the other Provided is a cell release method characterized in that the cell flow rate is slower than the flow rate of a liquid flowing in a main channel. Here, the flow rates of the two main flow paths in the above-described capturing method are reversed. As a result, the liquid flowing in the main flow path without cells pushes out the captured cells so as to block the passage passage entrance portion of the other main flow path through the passage due to the pressure difference, thereby releasing the cells. it can. The released cells can be collected from the main channel and cultured again with other culture equipment.

また、本発明は、通過路を共有した他方の主流路に比して、流速の速い主流路を流れる細胞を前記通過路入口部位で捕捉するとともに、細胞を流した主流路の流速を当該細胞が前記主流路を繋ぐ通過路に押し込まれる程度まで速くすることにより、細胞が同通過路で破砕され、その内容物が当該通過路を介して、流速の遅い他方の主流路を移動することを特徴とする細胞破砕方法を提供する。ここで、細胞が破砕するメカニズムとして、圧力差により、細胞がその大きさよりも狭い通過路に押し込まれることにより、細胞が破裂する。   In addition, the present invention captures cells flowing through the main flow path having a high flow rate at the entrance portion of the flow path as compared with the other main flow path sharing the passage, and the flow velocity of the main flow path through which the cells flow Is accelerated to such an extent that it is pushed into the passage connecting the main flow paths, so that the cells are crushed in the passage and the contents move through the other flow path through the other flow path. A cell disruption method is provided. Here, as a mechanism by which the cells are crushed, the cells are ruptured by being pushed into a passage that is narrower than the size due to a pressure difference.

本発明は、密着した複数の細胞からなる細胞塊を単一細胞若しくは数個の細胞群とするように分離処理して、当該単一細胞若しくは数個の細胞群がそれぞれ捕捉される前記細胞捕捉部材の任意の部位に捕捉され、全部若しくは一部の単一細胞又は数個の細胞群に対して、任意の処理をすることにより、当該単一細胞若しくは数個の細胞群を前記細胞捕捉部材を用いて試験する方法を提供する。   In the present invention, the cell trapping is performed by separating a cell mass composed of a plurality of closely attached cells into a single cell or several cell groups, and capturing the single cell or several cell groups, respectively. A single cell or several cell groups can be captured by an arbitrary treatment on all or part of single cells or several cell groups, and the single cell or several cell groups can be captured by the cell capturing member. Provides a method for testing using.

ここで、密着した複数の細胞からなる細胞塊とは、培養細胞の細胞塊や動物の組織などが挙げられる。分離処理とは、カルシウムイオンのキレート剤などの化学処理や物理的な分離処理がある。また、全部若しくは一部の単一細胞又は数個の細胞群に対して、任意の処理ができるのは、主流路に流れる液体を異なるものとすることで、任意の主流路の部位に捕捉されている細胞のみに特定の試薬などを処理させることができることが挙げられる。なお、細胞の試験とは、細胞にある処理をすることで、分化誘導を生じさせて観察することも含まれる。 Here, the cell mass composed of a plurality of closely adhered cells includes cell masses of cultured cells, animal tissues, and the like. Separation treatment includes chemical treatment such as calcium ion chelating agent and physical separation treatment. In addition, all or a part of single cells or several cell groups can be arbitrarily treated by making the liquid flowing in the main flow path different so that it can be trapped in any main flow path portion. It can be mentioned that only specific cells can be treated with a specific reagent. In addition, the test of a cell includes the observation by causing differentiation induction by performing a treatment on the cell.

また、本発明は、少なくとも２つの並走する主流路を配置した細胞捕捉部材であって、当該主流路間に、単一細胞の断面線分の最大値と同一若しくはそれ以下の長さの断面線分を有する通過路を有し、流速の異なる液体を当該２つの主流路に流すことにより、主流路を流れる細胞を通過路入口部位で捕捉及び放出できることを特徴とする細胞捕捉部材を提供するものである。また、前記通過路と主流路の接続部位において、曲面を有する細胞捕捉領域を設け、当該細胞捕捉領域の開口部は主流路に接し、当該開口部の断面積は前記通過路の断面積よりも大きいことを特徴とさせてもよい。ここで、曲面を有する細胞保持領域とは、半円形の形状などが挙げられる。   Further, the present invention is a cell capturing member in which at least two parallel main flow paths are arranged, and a cross section having a length equal to or less than a maximum value of a cross-section line segment of a single cell between the main flow paths. Provided is a cell-capturing member having a passage having a line segment and capable of capturing and releasing cells flowing in the main passage at the entrance portion of the passage by flowing liquids having different flow velocities into the two main passages. Is. In addition, a cell capture region having a curved surface is provided at a connection portion between the passage and the main channel, the opening of the cell capture region is in contact with the main channel, and the cross-sectional area of the opening is larger than the cross-sectional area of the passage It may be characterized by being large. Here, the cell holding region having a curved surface includes a semicircular shape.

また、本発明は、前記細胞捕捉部材の主流路に流路内壁を修飾する分子を流して、少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって、前記主流路および通過路の全部または一部を物理的または化学的に修飾する方法を提供する。ここで、前記主流路および通過路の全部または一部を物理的または化学的に修飾することは、主流路の液体が流れる流速を異なるものとすることで、可能となる。２つの主流路の一方のみを分子で流路内壁を修飾させるためには、その一方の主流路を流れる液体の流速を、他方の主流路に比して、速くすること等により実現できる。また、前記分子は、細胞が接着しやすいまたは接着しにくいものであってもよい。また、当該細胞捕捉部材の流路の任意の部位で細胞を培養してもよい。ここで、細胞を接着させやすい分子とは、フィブロネクチンなどがあり、逆に、細胞を接着させにくい分子とは、PEGによる修飾等がある。   In the present invention, all of the main flow path and the passage path are changed by flowing molecules for modifying the inner wall of the flow path in the main flow path of the cell capturing member and changing the flow velocity of at least two parallel main flow paths. Methods are provided for physically or chemically modifying a portion. Here, it is possible to physically or chemically modify all or part of the main flow path and the passage path by changing the flow rates of the liquid in the main flow path. In order to modify the inner wall of the channel with molecules of only one of the two main channels, it can be realized by increasing the flow velocity of the liquid flowing through one of the main channels compared to the other main channel. In addition, the molecule may be one that is easily or difficult to adhere to cells. Moreover, you may culture a cell in the arbitrary site | parts of the flow path of the said cell capture member. Here, the molecule that easily adheres to cells includes fibronectin and the like, and the molecule that does not easily adhere to cells includes modification with PEG.

また、本発明は、前記細胞捕捉部材に、流速の異なる液体を当該２つの主流路に流す液体搬送手段を連結させ、主流路を流れる細胞を通過路入口部位で捕捉及び放出できることを特徴とする細胞捕捉装置を提供するものである。前記液体搬送手段は、液体搬送ポンプを用いて、流路の幅の異なる少なくとも２つの主流路に同時に液体に挿入することとしても良い。   Further, the present invention is characterized in that the cell capturing member is connected to a liquid conveying means for flowing liquids having different flow velocities into the two main flow paths, and the cells flowing through the main flow paths can be captured and released at the entrance of the passage. A cell trapping device is provided. The liquid transport means may be inserted into the liquid simultaneously into at least two main flow paths having different flow path widths using a liquid transport pump.

ここで、液体搬送手段とは、それぞれの主流路の液体搬送口に、ペリスタポンプやプランジャポンプ等のポンプ装置、手動シリンジに続くチューブを接続させ、２つの主流路に流速の異なる液体をそれぞれ搬送することが挙げられる。   Here, the liquid transport means is connected to a pump device such as a peristaltic pump or a plunger pump and a tube following a manual syringe to the liquid transport port of each main flow path, and transports liquids having different flow rates to the two main flow paths, respectively. Can be mentioned.

また、これらの流速の違いを生み出す方法として、流路の幅を違えることによって、すなわち、一つの流路の幅をその流路の方向に対して太くしたり、あるいは細くすることによって、流体の動力源（ペリスタポンプやプランジャポンプ等のポンプ装置など）により流量を変化させることなく流速の違いを効果的に発生させることができる。   In addition, as a method of producing the difference in flow velocity, the flow of the fluid is changed by changing the width of the flow path, that is, by increasing or decreasing the width of one flow path with respect to the direction of the flow path. A difference in flow velocity can be effectively generated without changing the flow rate by a power source (pump device such as a peristaltic pump or a plunger pump).

また、前記流速の異なる液体を当該２つの主流路に流す液体搬送手段は、１つの液体搬送ポンプを用いて、流路の幅の異なる２つの主流路に同時に液体に挿入することを特徴としてもよい。ここで、装置を簡略化するために、１つの液体搬送ポンプに続くチューブが、途中で、複数本のチューブに分かれる構成、また、２つの主流路の上流について、１つの流路として、途中で複数の流路に分かれる構成としてもよい。   Further, the liquid transport means for flowing liquids having different flow velocities into the two main flow paths may be simultaneously inserted into the two main flow paths having different flow path widths using one liquid transport pump. Good. Here, in order to simplify the apparatus, the tube following one liquid conveyance pump is divided into a plurality of tubes in the middle, and the upstream of the two main flow paths is defined as one flow path in the middle. It is good also as a structure divided into several flow paths.

本発明によれば、液体が異なる流速で流れる並走する主流路とそれを連結させる通過路の間に生じる圧力差を利用して、細胞を捕捉、放出、破砕、及び培養する構成としているため、複数の機能を同じ部材、装置で実現できるという簡易な構成でよい。また、圧力差の調整は、主流路の流速を異なるものとするだけで調節が可能となる。   According to the present invention, the cells are captured, released, crushed, and cultured using the pressure difference generated between the parallel main flow paths in which liquids flow at different flow rates and the passages connecting them. A simple configuration in which a plurality of functions can be realized by the same member and apparatus may be used. The pressure difference can be adjusted only by changing the flow velocity of the main flow path.

また、本発明では、捕捉した細胞に対して連続して特定の液体で浸すことができるため、本発明の部材の中で、細胞を培養することができ、また、任意の薬物等を細胞培養用培地液に添加することで、その影響を観察することができる。さらに、本部材の全部若しくは一部を透明のガラスやプラスチックもしくは樹脂やゴムで構成することもでき、細胞を顕微鏡で観察しながら、それらの処理ができる。   Further, in the present invention, since the captured cells can be continuously immersed in a specific liquid, the cells can be cultured in the member of the present invention, and any drug or the like can be cultured in the cell. The effect can be observed by adding to the culture medium solution. Further, all or a part of the member can be made of transparent glass, plastic, resin, or rubber, and these can be processed while observing the cells with a microscope.

また、本発明の細胞捕捉部材には、任意のタンパク質や試薬を流して本部材の全部若しくは一部の流路壁面を物理吸着または化学結合的に修飾することもでき、本部材が透明のガラスやプラスチックで構成することで、これらの修飾分子を蛍光染色などの手法により解析することができる。これにより、細胞の特定の極性、もしくは細胞の特定の領域にのみに、任意のタンパク質や試薬を処理することができる。   In addition, the cell capturing member of the present invention can be modified by physical adsorption or chemical bond modification of all or part of the channel wall surface of the member by flowing an arbitrary protein or reagent. These modified molecules can be analyzed by a technique such as fluorescent staining. Thereby, an arbitrary protein or reagent can be processed only in a specific polarity of a cell or a specific region of the cell.

以下、添付図面を参照にしつつ、本発明の一実施形態を説明する。本発明は以下の実施例に限定されるものではない。   Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. The present invention is not limited to the following examples.

（細胞捕捉部材の構成及び製造方法）
本発明に係る細胞捕捉部材の構成を説明する。図１は、細胞捕捉部材（１１）の上面を示したものである。基板のうえに、凹部状の３本の並行する独立した主流路（１２、１３、１４）が設けられており、図示しないが、基板上に、基板と同じ大きさのカバーを載せる。細胞が流れる主流路は、両側の主流路（12、14）であり、圧力差を生じさせるための流路は中央の主流路（13）である。主流路の幅は、５０μｍである。また、本発明の係る細胞捕捉部材の製造方法は、polydimethylsiloxane （PDMS）を用いたsoft-lithographyの手法により作製される。また図２は本発明の細胞捕捉部材の走査電子顕微鏡像である。 (Configuration and manufacturing method of cell trapping member)
The structure of the cell trapping member according to the present invention will be described. FIG. 1 shows the upper surface of the cell trapping member (11). Three independent main flow paths (12, 13, 14) in parallel with each other are provided on the substrate, and a cover having the same size as the substrate is placed on the substrate, although not shown. The main flow path through which the cells flow is the main flow paths (12, 14) on both sides, and the flow path for generating a pressure difference is the central main flow path (13). The width of the main channel is 50 μm. The method for producing a cell trapping member according to the present invention is produced by a soft-lithography technique using polydimethylsiloxane (PDMS). FIG. 2 is a scanning electron microscope image of the cell trapping member of the present invention.

また、図１に示す細胞捕捉部材では、両側の主流路に６つ（合計１２）の半円状の細胞捕捉領域（１５）を基板の中心側に向かって設けている。この半円状の細胞捕捉領域の大きさは、半径10-50μｍとしている。また、細胞捕捉領域（１５）の半円状の頂点部分には、主流路（12、14）と中央の主流路（13）の間を繋ぐ、幅３〜５μｍの通過路（１６）を設けている。図１に示す細胞捕捉部材では、半円状の細胞捕捉領域（１５）及び通過路（１６）の大きさをそれぞれ異なるものとしている。   Further, in the cell trapping member shown in FIG. 1, six (12 in total) semicircular cell trapping regions (15) are provided in the main flow paths on both sides toward the center side of the substrate. The size of this semicircular cell trapping region is set to a radius of 10-50 μm. A semicircular apex portion of the cell trapping region (15) is provided with a passage (16) having a width of 3 to 5 μm that connects the main channels (12, 14) and the central main channel (13). ing. In the cell capturing member shown in FIG. 1, the sizes of the semicircular cell capturing region (15) and the passage (16) are different from each other.

細胞捕捉部材の主流路（１２、１３、１４）の入口部位（１７）に、図示しない任意のポンプ等のチューブを連結、若しくは配置させ、チューブ等から液体を搬送させることができる。主流路を流れた液体は、主流路（１２、１３、１４）の出口部位（１８）から排出されることになる。液体の円滑な排出のために、出口部位（１８）に図示しない任意のポンプ等のチューブを連結、若しくは配置させ、チューブ等から液体を吸引して搬送させることができる。チューブ等を配置させる場合には、当該配置部位にはカバーされないカバー形状としてもよい。   A tube such as an arbitrary pump (not shown) can be connected to or arranged at the inlet portion (17) of the main flow path (12, 13, 14) of the cell trapping member, and the liquid can be conveyed from the tube or the like. The liquid that has flowed through the main flow channel is discharged from the outlet portion (18) of the main flow channel (12, 13, 14). In order to smoothly discharge the liquid, a tube such as an arbitrary pump (not shown) can be connected to or disposed at the outlet portion (18), and the liquid can be sucked and conveyed from the tube or the like. When a tube or the like is arranged, a cover shape that is not covered by the arrangement site may be used.

（単一細胞の捕捉）
図３は、上記の細胞捕捉部材を用いて、実際に細胞を捕捉したことを示す顕微鏡写真である。ここで、細胞は、NIH3T3細胞を用いて、細胞を流す主流路（１２、１４）の流量を、０．５μL/min、圧力差を生じさせるための主流路（１３）の流量を、０．２μL/minとした。図３では、主流路間の流量の違いにより生じる水圧により、単一細胞（１９）が細胞捕捉領域（１５）の通過路を塞ぐように捕捉される。他の態様として、通過路に捕捉された細胞について、細胞捕捉部材の温度を調整すること、また、培養液を流し続けることなどにより、培養することができるものとすることが挙げられる。矢印は、水流及び細胞の流れる方向を示している。 (Single cell capture)
FIG. 3 is a photomicrograph showing that cells were actually captured using the above-described cell capturing member. Here, using NIH3T3 cells, the flow rate of the main flow path (12, 14) for flowing cells is 0.5 μL / min, and the flow rate of the main flow path (13) for generating a pressure difference is set to 0. 2 μL / min. In FIG. 3, the single cell (19) is captured so as to block the passage of the cell capturing region (15) by the water pressure generated by the difference in flow rate between the main flow paths. As another aspect, it is possible to cultivate the cells trapped in the passage by adjusting the temperature of the cell trapping member and continuing to flow the culture solution. Arrows indicate the direction of water flow and cell flow.

（捕捉された単一細胞の放出）
図４は、上記の細胞捕捉部材を用いて、実際に、捕捉された細胞を放出させたことを示
す顕微鏡写真である。細胞を流す主流路（１２、１４）の流量を、０μL/min、圧力差を
生じさせるための主流路（１３）の流量を、３０μL/minとした。図３では、圧力差を与えるための主流路からの液体が通過路に流れ、その水圧により、細胞捕捉領域の通過路に補足された細胞（１９）が放出されて、流速の遅い主流路に向かって流れる。 (Release of trapped single cells)
FIG. 4 is a photomicrograph showing that the captured cells were actually released using the above-described cell capturing member. The flow rate of the main flow path (12, 14) for flowing cells was 0 μL / min, and the flow rate of the main flow path (13) for generating a pressure difference was 30 μL / min. In FIG. 3, the liquid from the main flow path for giving a pressure difference flows through the passage, and the water pressure releases the cells (19) captured in the passage of the cell trapping region to the main flow path having a low flow rate. It flows toward.

（単一細胞の破砕）
図５は、上記の細胞捕捉部材を用いて、実際に、捕捉された細胞を破砕することを示す顕微鏡写真である。細胞を流す主流路（１２、１４）の流速を、２．０μL/min、圧力差を生じさせるための主流路（１３）の流量を、０．２μL/minとした。図３では、細胞を流れる主流路の液体が通過路を介して、細胞を流れる主流路と比して高い水圧で他の主流路に流れることで、単一細胞が細胞捕捉領域（１５）の通過路に詰るように捕捉される。続いて、図２の場合と異なり、圧力差の程度を強力なものとすることで、通過路入口に捕捉された細胞が通過路の中に押し込まれて形状を維持することができず、破砕される。細胞が破砕されることで細胞内にあった内容物は、通過路を介して、流速の遅い主流路に向かって流れる。他の態様として、流速の遅い主流路の出口にドレインを結合させることで、破砕された内容物を回収することができる。図５に示す矢印で、細胞及び細胞が破砕され流出した内容物を示しているが、（a）から（ｃ）に経時的に細胞が、主流路（１２）から流れてきた細胞が、通過路（１６）部分で破砕されて、その内容物が主流路（１３）に流れ出ることが示されている。 (Single cell disruption)
FIG. 5 is a photomicrograph showing that the captured cells are actually crushed using the above-described cell capturing member. The flow rate of the main flow path (12, 14) through which cells flow was 2.0 μL / min, and the flow rate of the main flow path (13) for generating a pressure difference was 0.2 μL / min. In FIG. 3, the liquid in the main flow path that flows through the cells flows to the other main flow path through the passage with higher water pressure than the main flow path that flows through the cells. Captured to block the passage. Subsequently, unlike the case of FIG. 2, by making the degree of the pressure difference strong, the cells trapped at the entrance of the passage cannot be pushed into the passage and the shape cannot be maintained. Is done. The contents in the cells as the cells are crushed flow toward the main flow path having a low flow rate through the passage. As another embodiment, the crushed contents can be recovered by coupling the drain to the outlet of the main flow path having a low flow rate. The arrows shown in FIG. 5 show the cells and the contents of the cells that have been crushed and flown out. From (a) to (c), the cells flow from time to time, and the cells that have flowed from the main channel (12) pass through. It is shown that the contents are crushed in the channel (16) and the contents flow out to the main channel (13).

（細胞捕捉領域及び通過路の流れの解析）
図６は、上記の細胞捕捉部材の細胞捕捉領域及び通過路に係る流速シミュレーションを示したものである。上図は、図の上方にある主流路の流量を、1.0μL/min、として、圧力差を生じさせる主流路の流量を、0μL/minとした。下図は、図の上方にある主流路の流量を、1.0μL/min、として、圧力差を生じさせる主流路の流量を、０.０5μL/minとした。シミュレーションは、Coventor Ware社のFEM/CFDsimulation を用いた。矢印の向きは液体の流れる方向を示し、矢印の長さは、流速の速さを示している。流速が速いほど、長く表現している。シミュレーションにおいても、液体の流れる方向は、実験結果と一致し、また、２つの主流路間の流速の差分が大きいほど、通過路および細胞捕捉領域の液体の流れる流速、水圧も大きくなることが示されている。 (Analysis of cell trapping area and flow of passage)
FIG. 6 shows a flow velocity simulation relating to the cell trapping region and the passage of the cell trapping member. In the upper diagram, the flow rate of the main channel at the top of the diagram is 1.0 μL / min, and the flow rate of the main channel causing the pressure difference is 0 μL / min. In the lower figure, the flow rate of the main flow path in the upper part of the figure is 1.0 μL / min, and the flow rate of the main flow path causing the pressure difference is 0.05 μL / min. For the simulation, FEM / CFDsimulation of Coventor Ware was used. The direction of the arrow indicates the direction in which the liquid flows, and the length of the arrow indicates the speed of the flow velocity. The faster the flow rate, the longer it is expressed. Also in the simulation, it is shown that the direction of liquid flow agrees with the experimental results, and that the greater the difference in flow velocity between the two main flow paths, the greater the flow speed and water pressure of the liquid in the passage and cell capture region. Has been.

（通過路を斜めに配置した細胞捕捉部材と細胞の連続捕獲）
図７は、通過路を主流路に対して斜め方向に配置した細胞捕捉部材を示す。この説明図のように、細胞の流れる向きに対して、180度以内の斜め方向、ここでは、４５度程度にしたものである。さらに、通過路の位置は、細胞捕捉領域の中心ではなく、細胞を捕捉し易いように、中心点と主流路の間に配置することが示されている。図７の下側の細胞捕捉領域の通過路には、細胞が捕捉されていることが示されている。これらの細胞は、図中右側の通過路から順に捕捉されたものである。この経時的な様子を図８に示す。図８a,b,cの順で、図中左側から流れる液体とともに、細胞が右側の細胞捕捉領域から順に捕捉されていることが示される。 (Cell capture member with diagonal passage and continuous capture of cells)
FIG. 7 shows the cell trapping member in which the passage is arranged in an oblique direction with respect to the main channel. As shown in this explanatory diagram, it is an oblique direction within 180 degrees with respect to the cell flowing direction, here, about 45 degrees. Furthermore, it is shown that the position of the passage is not located at the center of the cell trapping region but is arranged between the center point and the main channel so that cells can be easily trapped. It is shown that the cells are captured in the passage of the cell capturing region on the lower side of FIG. These cells are captured in order from the passage on the right side in the figure. FIG. 8 shows the state over time. In the order of FIGS. 8a, b, and c, it is shown that the cells are sequentially captured from the cell capture region on the right side together with the liquid flowing from the left side in the figure.

（様々な細胞の捕獲）
図９（a）は、通過路が主流路の直行方向からおよそ４５度斜めに傾いた形状をもつ細胞捕捉部材で、PC12、NIH3T3、アストロサイトの各単一細胞を捕捉した顕微鏡像である。主流路を流れる流体の流量は、細胞が流れる主流路は0.5μL/minとその他の主流路は、0.2 μL/minである(図９（ｂ）)。 (Capture various cells)
FIG. 9 (a) is a microscopic image obtained by capturing each single cell of PC12, NIH3T3, and astrocytes with a cell trapping member having a shape in which the passage is inclined at an angle of about 45 degrees from the orthogonal direction of the main channel. The flow rate of the fluid flowing through the main channel is 0.5 μL / min for the main channel through which the cells flow, and 0.2 μL / min for the other main channels (FIG. 9B).

（細胞捕捉部材のガラス底面の局所的なフィブロネクチン修飾）
図１０は、ガラス底面を局所的にフィブロネクチンでコーティングした実施例である。（a）に示すように、フィブロネクチンを含むPBS溶液を中央の主流路に流量0.03μL/minで流し、図中下側の主流路にはPBSのみを同じく流量0.03 μL/minで流した。このため2つの流路間の通過路には圧力差が生じず、下側の主流路には中央流路からのフィブロネクチンの流入が起こらない。一方、図中上側の主流路にはPBSのみを流量0.02μL/minで流すと、中央流路よりも僅かに流速が小さいため、通過路を通って中央流路からのフィブロネクチンの流入が起こる。ただし、流速比が小さいため、2つの流路間の圧力差は僅かであると考えられ、上側主流路の層流に遮られてフィブロネクチンの流入は通過路出口の近傍に限られる。（b）は両側の主流路に設けた細胞捕捉部位でNIH3T3細胞の捕捉と培養を行った顕微鏡像である。フィブロネクチンがコーティングされた上側の流路では、細胞の顕著な接着・伸展が観察される。 (Local fibronectin modification on the glass bottom of the cell trapping member)
FIG. 10 shows an example in which the glass bottom is locally coated with fibronectin. As shown in (a), a PBS solution containing fibronectin was flowed through the central main channel at a flow rate of 0.03 μL / min, and only PBS was flowed through the lower main channel in the figure at a flow rate of 0.03 μL / min. For this reason, there is no pressure difference in the passage between the two flow paths, and fibronectin does not flow into the lower main flow path from the central flow path. On the other hand, when only PBS is flowed through the upper main channel in the figure at a flow rate of 0.02 μL / min, the flow rate is slightly smaller than that of the central channel, so that fibronectin flows from the central channel through the passage. However, since the flow rate ratio is small, the pressure difference between the two channels is considered to be small, and the inflow of fibronectin is limited to the vicinity of the passageway outlet due to the laminar flow in the upper main channel. (B) is a microscopic image obtained by capturing and culturing NIH3T3 cells at the cell trapping sites provided in the main channels on both sides. In the upper flow path coated with fibronectin, remarkable cell adhesion / extension is observed.

本発明の細胞捕捉部材によれば、異なる流速で液体が流れる並走する主流路とそれを連結させる通過路の間に生じる圧力差を利用して、細胞を捕捉、放出、破砕する構成としているため、簡単な構成で複数の機能を実現することができ、研究機器として提供することができる。   According to the cell capturing member of the present invention, the cell is captured, released, and crushed using the pressure difference generated between the parallel main flow channels through which the liquid flows at different flow rates and the passages connecting them. Therefore, a plurality of functions can be realized with a simple configuration and can be provided as research equipment.

また、本発明の細胞捕捉部材では、捕捉した細胞に対して連続して特定の液体で浸すことができるため、部材の中で、細胞を培養することができ、また、任意の薬物等を細胞培養用培地液に添加することで、その影響を観察することができる。さらに、本部材の全部若しくは一部を透明のガラスやプラスチックで構成することもでき、細胞を顕微鏡で観察しながら、それらの処理ができる。単一細胞若しくは数個の細胞についての培養装置、観察装置として提供することができる。   Further, in the cell capturing member of the present invention, since the captured cells can be continuously immersed in a specific liquid, the cells can be cultured in the member, and any drug or the like can be cultured in the cell. The effect can be observed by adding to the culture medium solution. Furthermore, all or a part of the member can be made of transparent glass or plastic, and these treatments can be performed while observing the cells with a microscope. It can be provided as a culture device or observation device for a single cell or several cells.

細胞捕捉部材の構成を示す図The figure which shows the structure of a cell capture member 細胞捕捉部材を示す走査電子顕微鏡像Scanning electron microscope image showing cell trapping member 細胞捕捉領域の通過路で捕捉される細胞を示す顕微鏡写真Photomicrograph showing cells trapped in the passage of the cell trapping area 細胞捕捉領域の通過路で捕捉された細胞が主流路に放出されたこと示す顕微鏡写真A micrograph showing that the cells captured in the passage of the cell trapping area are released into the main channel. 細胞捕捉領域の通過路で破砕される細胞を示す顕微鏡写真Photomicrograph showing cells disrupted in the passage of the cell capture area 細胞捕捉領域の流れの状態を示すシミュレーションSimulation showing the flow state of the cell trapping region 通過路が主流路に対して斜め方向に設けられた細胞捕捉部材を示す説明図Explanatory drawing which shows the cell capture member by which the passage was provided in the diagonal direction with respect to the main flow path 細胞捕捉領域に経時的に細胞が捕捉されていることを示す顕微鏡写真Photomicrograph showing that cells are captured in the cell capture area over time (a)異なる種類の細胞が、細胞捕捉領域に捕捉されていることを示す顕微鏡写真 (b)各主流路に流れる液体の流量を説明する説明図(a) Micrograph showing that different types of cells are trapped in the cell trapping region (b) Explanatory drawing explaining the flow rate of liquid flowing in each main channel (a)各主流路に流れる液体の流量と液体の種類を説明する説明図 (b)一方の主流路にフィブロネクチンが処理され、細胞接着の様子を示す顕微鏡写真(a) Explanatory drawing explaining the flow rate and type of liquid flowing in each main channel (b) Micrograph showing the state of cell adhesion after fibronectin is treated in one main channel

符号の説明Explanation of symbols

11 細胞捕捉部材
12・14 細胞を流す主流路
13 圧力差を生じさせるための主流路
15 細胞捕捉領域
16 通過路
17 入口部位
18 出口部位
19 細胞捕捉領域に捕捉された単一細胞
11 Cell trapping member
12.14 Main flow path for cells
13 Main flow path for creating pressure difference
15 Cell capture region
16 Passage
17 Entrance part
18 Exit part
19 Single cell trapped in the cell trapping area

Claims (16)

層流を生じせしめる程度の微小な並走する主流路を少なくとも２つ使用し、当該主流路の流速を異なる流速とすることによって細胞を捕捉する方法。   A method of capturing cells by using at least two main flow paths that are parallel to each other to generate laminar flow, and setting the flow rates of the main flow channels to different flow rates. 少なくとも２つの並走する主流路の間を繋ぐことができる、単一細胞の断面線分の最大値と同一若しくはそれ以下の長さの断面線分を有する流体の通過路を設けた細胞捕捉部材を利用した請求項１記載の細胞捕捉方法。   A cell-capturing member provided with a fluid passage having a cross-sectional line length equal to or less than a maximum value of a cross-sectional line segment of a single cell, which can be connected between at least two parallel main flow paths The cell capturing method according to claim 1, wherein the method is used. 少なくとも２つの並走する主流路の１又は２以上特定の部位において、その幅が異なることを特徴とする前記細胞捕捉部材を利用した請求項１又は２に記載の細胞捕捉方法。   The cell trapping method according to claim 1 or 2, wherein the cell trapping member is used in which one or more specific portions of at least two parallel main flow paths have different widths. 請求項１乃至３に記載の方法を用いて捕捉した細胞を、当該細胞捕捉部材で培養する方法。   A method for culturing cells captured by the method according to claim 1, using the cell capturing member. 層流を生じせしめる程度に微小である、少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって、請求項２又は３に記載した細胞捕捉部材を利用して細胞を捕捉し培養する方法。   A method for capturing and culturing cells using the cell capturing member according to claim 2 or 3 by changing flow velocities of at least two parallel main flow paths that are so small as to cause laminar flow. 少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって、前記細胞捕捉部材内に補足した細胞を放出または解放し、細胞を回収する方法。   A method for recovering cells by releasing or releasing the cells captured in the cell trapping member by changing the flow velocity of at least two parallel main flow paths. 前記細胞捕捉部材の少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって細胞を破砕する方法。   A method of disrupting cells by changing the flow speed of at least two parallel main flow paths of the cell trapping member. 通過路を共有した他方の主流路に比して、流速の速い主流路を流れる細胞を前記通過路入口部位で捕捉するとともに、細胞を流した主流路の流速を当該細胞が破砕される程度まで速くすることにより、細胞が前記主流路を繋ぐ通過路で破砕され、その内容物が当該通過路を介して、流速の遅い他方の主流路を移動することを特徴とする細胞破砕方法。   Compared with the other main channel sharing the passage, the cells flowing through the main channel having a high flow rate are captured at the entrance of the passage, and the flow rate of the main channel through which the cells have flowed is reduced to such an extent that the cells are crushed. A cell disruption method characterized in that, by increasing the speed, cells are crushed in a passageway connecting the main flow paths, and the contents move through the passageway in the other main flow path having a slow flow rate. 密着した複数の細胞からなる細胞塊を単一細胞若しくは数個の細胞群とするように分離処理して、当該単一細胞若しくは数個の細胞群がそれぞれ捕捉される前記細胞捕捉部材の任意の部位に捕捉され、全部若しくは一部の単一細胞又は数個の細胞群に対して、任意の処理をすることにより、当該単一細胞若しくは数個の細胞群について前記細胞捕捉部材を用いて当該単一細胞若しくは数個の細胞群を試験する方法。   The cell capturing member may be any one of the cell capturing members that separates a cell mass composed of a plurality of closely-contacted cells into a single cell or several cell groups, and each of the single cells or several cell groups is captured. By capturing the single cell or several cell groups, the cell capture member is used for the single cell or several cell groups. A method of testing a single cell or a group of several cells. 少なくとも２つの並走する主流路を配置した細胞捕捉部材であって、当該主流路間に、単一細胞の断面線分の最大値と同一若しくはそれ以下の長さの断面線分を有する通過路を有し、流速の異なる液体を当該２つの主流路に流すことにより、主流路を流れる細胞を通過路入口部位で捕捉及び放出できることを特徴とする細胞捕捉部材。   A cell trapping member having at least two parallel main flow paths arranged therein, and having a cross-sectional line segment having a length equal to or less than a maximum value of a cross-sectional line segment of a single cell between the main flow paths. A cell-capturing member, wherein cells flowing through the main channel can be captured and released at the entrance of the passageway by flowing liquids having different flow rates into the two main channels. 前記通過路と主流路の接続部位において、曲面を有する細胞捕捉領域を設け、当該細胞捕捉領域の開口部は主流路に接し、当該開口部の断面積は前記通過路の断面積よりも大きいことを特徴とする請求項１０に記載の細胞捕捉部材。   A cell capture region having a curved surface is provided at a connection site between the passage and the main channel, the opening of the cell capture region is in contact with the main channel, and the cross-sectional area of the opening is larger than the cross-sectional area of the passage The cell-capturing member according to claim 10. 前記主流路に流路内壁を修飾する分子を流して、少なくとも２つの並走する主流路の流速を変化させることによって、前記主流路および通過路の全部または一部を物理的または化学的に修飾する方法。   The main channel and all or part of the passage are physically or chemically modified by flowing molecules that modify the inner wall of the channel and changing the flow velocity of at least two parallel main channels. how to. 前記方法で、細胞が接着しやすいまたは接着しにくいように流路内壁の全部または一部を修飾した前記細胞補足部材。   The cell supplementary member, wherein all or part of the inner wall of the flow path is modified so that the cells are easily or difficult to adhere by the method. 前記細胞捕捉部材で、流路の任意の部位で細胞を培養する方法。   A method of culturing cells at an arbitrary part of a flow path with the cell trapping member. 前記細胞捕捉部材に、流速の異なる液体を当該２つの主流路に流す液体搬送手段を連結させ、主流路を流れる細胞を通過路入口部位で捕捉及び放出できることを特徴とする細胞捕捉装置。   A cell trapping device characterized in that liquid transporting means for flowing liquids having different flow velocities to the two main flow paths is connected to the cell trapping member so that cells flowing through the main flow path can be captured and released at the entrance of the passage. 前記流速の異なる液体を当該２つの主流路に流す液体搬送手段は、液体搬送ポンプを用いて、流路の幅の異なる少なくとも２つの主流路に同時に液体に挿入することを特徴とする細胞捕捉装置。


The cell trapping device, wherein the liquid transport means for flowing liquids having different flow velocities into the two main channels is simultaneously inserted into the liquid into at least two main channels having different channel widths using a liquid transport pump. .


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