JP2009192398A - 生体物質検出装置および生体物質検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】簡易な装置構成で効率良く生体物質を検出することが可能な生体物質検出装置を得る。
【解決手段】一端に検体を導入するための第1の開口部105を有し、検体の流れる方向に間隔をおいて複数の反応領域108が一列に形成された第1の流路103と、一端に検体と混和しない液体を導入するための第2の開口部106を有し、他方の端部が第1の流路103に接続された第2の流路104と、第1の流路103の、第2の流路104との接続部と反対の端部の近傍に固定された光学検出装置203とを備え、各々の反応領域108は、検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブを固定する領域を有する。
【選択図】図2
【解決手段】一端に検体を導入するための第1の開口部105を有し、検体の流れる方向に間隔をおいて複数の反応領域108が一列に形成された第1の流路103と、一端に検体と混和しない液体を導入するための第2の開口部106を有し、他方の端部が第1の流路103に接続された第2の流路104と、第1の流路103の、第2の流路104との接続部と反対の端部の近傍に固定された光学検出装置203とを備え、各々の反応領域108は、検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブを固定する領域を有する。
【選択図】図2
Description
本発明は、特定のDNAやタンパク質などの生体物質を検出するための、生体物質検出装置および生体物質検出方法に関するものである。
ガラス基板等に微細流路が設けられたマイクロ流体チップを使用して、化学分析や化学合成、あるいはバイオ関連の分析などを行う方法が注目されている。マイクロ流体チップは、マイクロTotal Analytical System (マイクロTAS)や、Lab-on-a-chip等とも呼ばれ、従来の装置に比較して試料や試薬の必要量が少ない、反応時間が短い、廃棄物が少ないなどのメリットがあり、医療診断、環境や食品のオンサイト分析、医薬品や化学品などの生産等、広い分野での利用が期待されている。試薬の量が少なくてよいことから、検査のコストを下げることが可能となり、また、試料および試薬の量が少ないことにより、反応時間も大幅に短縮されて検査の効率化が図れる。特に、医療診断に使用する場合には、試料となる血液など検体を少なくすることができるため、患者の負担を軽減できるというメリットもある。
マイクロ流体チップは、DNAマイクロアレイとして使用することができる。DNAマイクロアレイは、基板上に固定化されたプローブ(合成オリゴDNAやcDNAなど)と検体中の遺伝子とを反応(ハイブリダイゼーション)させることにより、目標の遺伝子の有無を検出する。例えば、特許文献1には、多孔板の孔の中に多孔性の吸着性領域を設けてそこにプローブを固定し、ターゲットを含む溶液がプローブと接触しながら循環するための流路を備えた生化学解析用ユニット構造体が提案されている。
特開2004−361316号公報
しかし、特許文献1に記載された従来の方法では、ハイブリダイゼーション反応を行う吸着性領域に化学発光基質を接触させる際に、発光物質が拡散するため、取得した画像データの解析精度が低いという問題があった。
そこで、本発明の目的は、簡易な装置構成で精度良く生体物質を検出することが可能な生体物質検出装置を得ることである。
本発明に係る生体物質検出装置は、一端に反応液を導入するための第1の開口部を有し、前記反応液の流れる方向に間隔をおいて複数の反応領域が一列に形成された第1の流路と、 一端に前記反応液と混和しない液体を導入するための第2の開口部を有し、他方の端部が前記第1の流路に接続された第2の流路と、光学検出装置とを備え、各々の前記反応領域は、特定の生体物質を検出するためのプローブを固定する領域を有するものである。
本発明によれば、第1の開口部から反応液を導入すると同時に、第2の開口部から反応液と混和しない液体を導入することにより、反応液は反応液と混和しない液体の液滴で分断されて互いに混ざりにくくなるため、それぞれの反応領域において酵素反応により生成された物質を独立して測定することができる。
また、前記第1の流路は、各々に溝が形成された2枚の基板を貼り合わせて形成されており、前記反応領域は、前記流路の内壁面に全周に亘って形成されていることが望ましい。
これにより、流路の一面のみに反応領域が設けられている場合よりも、検体とプローブとの反応機会が多くなり、さらなる反応効率の向上を図ることができる。また、検出感度も高くすることができる。
これにより、流路の一面のみに反応領域が設けられている場合よりも、検体とプローブとの反応機会が多くなり、さらなる反応効率の向上を図ることができる。また、検出感度も高くすることができる。
なお、前記第1の流路の内壁面は親水性であり、前記第2の流路の内壁面は疎水性であることが望ましい。こうすることによって、第1の流路と第2の流路の接続部において、反応液に混和しない液体の液滴を安定して導入することができる。さらに、第1の流路の内壁面を親水性にしておくことにより、第1の流路の内壁は検体液や検出用の反応液との親和性が高くなり、そのため、検体と混和しない液体の液滴は検体液や反応液の層を介して第1の流路の内壁面に接触することになるので、反応領域が検体と混和しない液体によって汚染されることを防止できる。
本発明に係る生体物質検出方法は、上記の生体物質検出装置を用いた生体物質検出方法であって、前記第1の流路内に、生体物質を含む検体を充填する工程と、前記検体に含まれる特定の生体物質と、前記プローブとを反応させる反応工程と、前記第1の開口部から、前記プローブと結合した前記生体物質を酵素反応を用いて検出するための基質を含む反応液を導入すると同時に、前記第2の開口部から前記反応液と混和しない液体を導入することにより、前記第1の流路内に、前記反応液と混和しない液体の液滴と前記反応液とを充填する工程と、前記光学検出装置を用いて、前記プローブと反応した前記生体物質を検出する検出工程と、を備えたものである。
本発明によれば、第1の開口部から反応液を導入すると同時に、第2の開口部から反応液と混和しない液体を導入することにより、反応液は反応液と混和しない液体の液滴で分断されて互いに混ざりにくくなるため、それぞれの反応領域において酵素反応により生成された物質の濃度を独立して測定することができる。
また、前記生体物質を検出する検出工程では、前記第1の流路内で前記反応液を移動させながら、前記光学検出装置を用いて、前記第1の流路上の1箇所で検出することが望ましい。
これにより、1つの光学検出装置ですべての反応領域に対応する酵素反応の生成物濃度を順次測定することができる。また、光学検出装置を移動させる駆動機構も不要なため装置を小型化、簡易化することができる。
これにより、1つの光学検出装置ですべての反応領域に対応する酵素反応の生成物濃度を順次測定することができる。また、光学検出装置を移動させる駆動機構も不要なため装置を小型化、簡易化することができる。
また、前記第1の流路内において、前記液滴の大きさ及び間隔は均一であり、前記液滴と前記液滴の間に均一な量の前記反応液が挟まれていることが望ましい。
これにより、検出感度を各反応領域で一定にすることができる。
これにより、検出感度を各反応領域で一定にすることができる。
また、前記第1の流路内において、前記液滴は、前記流路の内壁面の全周に接していることが望ましい。
これにより、確実に反応液を分離し、検出の精度を高めることができる。
これにより、確実に反応液を分離し、検出の精度を高めることができる。
また、前記液滴と前記反応液とを充填する工程では、前記液滴の間隔を、前記反応領域の前記送液方向の長さより短くすることが望ましい。
これにより、液滴に挟まれた、連続する複数の反応液のうちの最低1箇所は、全体が反応領域上に配置される。従って、1つの反応領域につき、最低1箇所の反応液は全体が反応領域に接する。酵素反応の生成物質の濃度は、この全体が反応領域と接している領域で最も高くなるので、その領域を測定対象とすることができる。
これにより、液滴に挟まれた、連続する複数の反応液のうちの最低1箇所は、全体が反応領域上に配置される。従って、1つの反応領域につき、最低1箇所の反応液は全体が反応領域に接する。酵素反応の生成物質の濃度は、この全体が反応領域と接している領域で最も高くなるので、その領域を測定対象とすることができる。
また、前記検出工程では、各々の前記反応領域に対応する複数の測定領域のうち、最も大きい測定値を示す領域を選択することが望ましい。
これにより、反応液全体が反応領域と接している領域の値を測定値として選択することができる。
これにより、反応液全体が反応領域と接している領域の値を測定値として選択することができる。
また、前記検出工程では、前記反応領域の直前の領域の測定値を基準値として、反応領域の測定値から基準値を差し引くことがさらに望ましい。
これにより、光学検出装置から遠い位置にある反応領域上に位置する反応液が、移動の途中で他の反応領域で生成された物質を含んでしまっても、その影響を除去することができる。
これにより、光学検出装置から遠い位置にある反応領域上に位置する反応液が、移動の途中で他の反応領域で生成された物質を含んでしまっても、その影響を除去することができる。
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態1.
図1は、本発明の実施の形態1による、核酸検出装置(生体物質検出装置)20の概略構成を示す模式図である。核酸検出装置20は、核酸検出用チップ10、シリンジポンプ201,202、CCDカメラ等の光学検出装置203、分注機204、温度調節用のヒータ205を備えている。
実施の形態1.
図1は、本発明の実施の形態1による、核酸検出装置(生体物質検出装置)20の概略構成を示す模式図である。核酸検出装置20は、核酸検出用チップ10、シリンジポンプ201,202、CCDカメラ等の光学検出装置203、分注機204、温度調節用のヒータ205を備えている。
図2(A)は、本発明の実施の形態1による核酸検出用チップ10の概略構成を示す斜視図、図2(B)は、図2(A)のC−C断面図である。図に示すように、核酸検出用チップ10は、透明基板101,102、第1の流路103、第2の流路104、第1の開口部105、第2の開口部106、第3の開口部107を備えている。また、流路103の内壁には、複数の反応領域108が形成されている。
光学検出装置203は、第1の流路103の第3の開口部107の近傍に配置されている。
光学検出装置203は、第1の流路103の第3の開口部107の近傍に配置されている。
図2に示すように、核酸検出用チップ10は、2枚の透明基板101,102を貼り合わせて構成されている。透明基板101,102それぞれに、流路103の一部となる溝が形成されており、透明基板101,102を貼り合わせることによって、立体的な流路103が形成される。なお、透明基板101,102は例えばガラスにより形成することができる。透明基板101,102の材質は処理温度、光学検出方法、プローブ分子の固定、ハイブリダイゼーションおよびブロッキング等の処理条件に応じて様々なものが選択可能である。
流路103は、検体の流れる方向(図中矢印Fの方向)に垂直な断面の形状が円形に形成されており、ここでは、直径が100μmである。なお、断面の形状は、楕円形など円形以外の形状であってもよい。
第1の開口部105及び第2の開口部106は、シリコンチューブまたはPEEK製のチューブを介してシリンジポンプ201,202に接続されている。第3の開口部107から分注機204を用いて、検体や試薬などの供給ができるようになっている。
反応領域108には、プローブが塗布されている。反応領域108は、流路103の内壁面の全周に亘って形成されており、このためプローブとターゲットが広い面積で接することが可能となり、反応効率の向上が図れる。反応領域108は、例えば検体の流れる方向の長さを200μm、隣り合う反応領域108と反応領域108の間隔を200μmとすることができる。
プローブには、例えば血液、尿、唾液、髄液のような検体試料に含まれる標的物質(ターゲット)を捕捉し得る物質を用いることができる。例えば、ターゲットがDNAやRNAのような核酸である場合には、プローブとしては、これらの核酸とハイブリダイゼーション(相補的に結合)する核酸やヌクレオチド(オリゴヌクレオチド)等を用いることができる。このような核酸としては、例えばcDNAやPCR産物等が用いられる。
なお、ターゲットは核酸に限られず、例えば特定のタンパク質であってもよい。この場合には、プローブとしては、このタンパク質を特異的に捕捉(例えば、吸着、結合等)するもの等が用いられる。具体的には、抗原、抗体、レセプター、酵素等のタンパク質、ペプチド(オリゴペプチド)等である。
本実施形態では、各々の反応領域108には、それぞれ異なる1種類のプローブが固定されている。これにより、1度に複数種類のターゲットの検出が可能である。
本実施形態では、各々の反応領域108には、それぞれ異なる1種類のプローブが固定されている。これにより、1度に複数種類のターゲットの検出が可能である。
次に、本実施形態による核酸検出用チップ10の製造方法について説明する。
核酸検出用チップ10は、2枚の透明基板101,102を貼りあせて構成することができる。図3は、透明基板101の構成の一部を示す斜視図である。図に示すように、透明基板101には、第1の流路103の一部となる溝dが形成されている。溝dの検体の流れる方向に垂直な断面の形状は半円形である。透明基板102にも透明基板101と同様に、第1の流路103の一部となる溝dが形成されており、透明基板101,102を貼り合わせることによって断面が円形の第1の流路103が形成される。なお、図3では、第1の開口部105、第3の開口部107(第1の流路103の端部)、及び第2の流路104、第2の開口部106については図示を省略している。透明基板101,102がガラス基板の場合には、溝dは例えばエッチングまたはサンドブラスト法によって形成することができる。
核酸検出用チップ10は、2枚の透明基板101,102を貼りあせて構成することができる。図3は、透明基板101の構成の一部を示す斜視図である。図に示すように、透明基板101には、第1の流路103の一部となる溝dが形成されている。溝dの検体の流れる方向に垂直な断面の形状は半円形である。透明基板102にも透明基板101と同様に、第1の流路103の一部となる溝dが形成されており、透明基板101,102を貼り合わせることによって断面が円形の第1の流路103が形成される。なお、図3では、第1の開口部105、第3の開口部107(第1の流路103の端部)、及び第2の流路104、第2の開口部106については図示を省略している。透明基板101,102がガラス基板の場合には、溝dは例えばエッチングまたはサンドブラスト法によって形成することができる。
次に、溝dにプローブを塗布し、反応領域108を形成する。溝dへプローブを塗布する方法には、ピンスポッターを使う方法や非接触で液滴を吐出する手段を使う方法などがある。しかし、本実施形態のように、溝dの幅が狭く、また溝dの底が平坦でない場合には、ピンスポッターよりも非接触で液滴を吐出する手段を用いて行う方がよい。図4(A),(B)は、溝dへのプローブの塗布を説明する図である。図4(A)に示すように、液滴吐出ヘッド(図示せず)を用いて、溝d上の反応領域108を形成する領域に、プローブを含む液滴Pを吐出する。
図4(B)は、プローブを含む液滴Pが吐出された溝dの表面を示す図である。溝dにプローブを含む液体を塗布すると、表面張力により溝dの長さ方向及び幅方向に液体が濡れ広がるが、本実施形態のように溝dの断面が半円形の場合、塗布したプローブの形状や厚みを均一にすることができ、反応領域108全体のプローブの密度を均一にできる。
透明基板101及び102に形成された溝dには、両基板を貼り合わせた際に対向する領域に同じ種類のプローブが配置されるようにプローブを塗布する。
透明基板101,102の溝dにプローブを塗布し、反応領域108を形成したら、透明基板101,102を接着等のプローブを分解させない方法を用いて貼り合わせることによって、核酸検出用チップ10が形成される。透明基板101及び102の溝dには、対向する位置に同じ種類のプローブが塗布されているので、反応領域108は第1の流路103の内壁面の全周に亘って形成される。
次に、本実施形態による核酸検出用チップ10への検体液の充填方法について説明する。
検体液は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルから抽出したDNAやRNAを含む。必要に応じて、PCR法やIVT法を用いて、ターゲットとなる核酸の増幅処理を行っておく。
検体液は、分注機204を用いて第3の開口部107に供給する。検体液を第3の開口部107に供給したら、シリンジポンプ201を駆動して検体液を第1の開口部105に収容する。また、同様にしてシリンジポンプ202を駆動し、第2の開口部106にミネラルオイル(検体と混和しない液体)を収容する。次に、シリンジポンプ201とシリンジポンプ202を同時に駆動することにより、検体液とミネラルオイルを同時に第1の流路103内に導入する。
検体液は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルから抽出したDNAやRNAを含む。必要に応じて、PCR法やIVT法を用いて、ターゲットとなる核酸の増幅処理を行っておく。
検体液は、分注機204を用いて第3の開口部107に供給する。検体液を第3の開口部107に供給したら、シリンジポンプ201を駆動して検体液を第1の開口部105に収容する。また、同様にしてシリンジポンプ202を駆動し、第2の開口部106にミネラルオイル(検体と混和しない液体)を収容する。次に、シリンジポンプ201とシリンジポンプ202を同時に駆動することにより、検体液とミネラルオイルを同時に第1の流路103内に導入する。
検体液とミネラルオイルを同時に第1の流路103内に導入する際、ミネラルオイルの粘度と、検体液の導入速度との速度比等をコントロールすることにより、図5に示すように、ミネラルオイルの液滴300が流路の内壁面の全周に接するように形成することができる。これにより、液滴300で検体液を分離することができる。さらに、図5に示すように、液滴300の大きさや間隔は均一であり、各々の液滴300に挟まれた検体液301の量はほぼ均一にすることができる。第1の流路103の内壁面を親水性にしておくことにより、第1の流路103の内壁は検体液との親和性が高くなり、そのためミネラルオイルは検体液の層を介して第1の流路103の内壁面に接触することになるので、反応領域108がオイルによって汚染されることはない。
ターゲット(核酸)とプローブとのハイブリダイゼーション処理を行う際には、図5に示すような条件下でシリンジポンプ201を駆動することにより、所定の周期で検体液を第1の流路103内で往復させる。この時の流速は、例えば1μl/min程度とすることができる。ミネラルオイルで分断された検体液内では、図5に示すように、第1の流路103の断面内の速度差による循環が発生する。検体液の循環流が発生することにより、第1の流路103の壁面近傍での検体液の移動が起こりやすくなり、ハイブリダイゼーション反応の効率を向上させることができる。そのため、少ない反応液で短時間での効率良い検出を行うことができる。例えば、検体液のみを第1の流路103に充填して往復送液を行っても、第1の流路103内では検体液の移動は層流になり、第1の流路103の壁面近傍での検体液の移動が起こりにくい。本実施形態によれば、検体液をミネラルオイルの液滴300で分断しているため、検体液の循環流を起こすことができ、ハイブリダイゼーション反応の効率を著しく向上させることができる。
なお、本実施形態では、検体液とミネラルオイルを同時に第1の流路103内に導入し、図5に示すように、検体液が液滴300で分断されるようにしたが、第1の流路103内には検体液のみを充填してハイブリダイゼーション処理を行ってもよい。
なお、本実施形態では、検体液とミネラルオイルを同時に第1の流路103内に導入し、図5に示すように、検体液が液滴300で分断されるようにしたが、第1の流路103内には検体液のみを充填してハイブリダイゼーション処理を行ってもよい。
第1の流路103の内径を100μm、全体の長さを200mmとした場合、第1の流路103全体を充填するために必要な検体液の量は約1.6μLであり、非常に少ない反応液量でのハイブリダイゼーション反応を行うことができる。また、本実施形態のようにシリンジポンプ201を駆動して検体液を第1の流路103内で往復させることにより、第1の流路103内の全ての反応領域108と検体液が均等に接触し、均一なハイブリダイゼーション反応が可能となる。また、第1の流路103内で常に検体液を移動させることにより循環流が発生し、プローブにより多くのターゲットが接するようになり、反応効率が向上する。
なお、第1の流路103に検体液を供給する前に、必要に応じて第1の流路103内にブロッキング液を充填し、プローブが固定化されていない領域をブロッキングしておいてもよい。
なお、第1の流路103に検体液を供給する前に、必要に応じて第1の流路103内にブロッキング液を充填し、プローブが固定化されていない領域をブロッキングしておいてもよい。
なお、核酸検出用チップ10への検体液の供給方法は、本実施形態のように分注機204を用いる方法に限定されない。例えば図6に示すように、分注機204の代わりに、複数の液体収容部211を備えた収容容器212と、ターンテーブル213を備えた供給装置21を用いても良い。各々の液体収容部211には、それぞれ検体液や試薬が収容されている。収容容器212はターンテーブル213に設置されている。
核酸検出用チップ10にキャピラリ管210を装着し、キャピラリ管210を通して第3の開口部107に液体収容部211内の液体が供給されるようにする。ターンテーブル213を駆動して位置決めを行うことにより、キャピラリ管210の先端を浸漬する液体収容部211を選択することができる。キャピラリ管210を所定の液体収容部211内の液体に浸漬した状態でシリンジポンプ201を用いて吸引を行うことにより、第1の流路103内部に検体液を導入することができる。
第1の流路103内で所定時間のハイブリダイゼーション反応を行ったら、シリンジポンプ201を用いて第1の流路103内より検体液を排出する。必要に応じて第1の流路103内の洗浄を行った後、ハイブリダイゼーション反応の検出処理を行う。
本実施形態では、化学発光物質を用いた検出を行う。一般にDNAマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション反応の測定には蛍光標識剤を用いた検出方法を用いることも多いが、蛍光強度がターゲット核酸に結合している蛍光標識剤の量に依存するのに対し、化学発光物質を用いた検出方法では、ターゲット核酸に結合した酵素が触媒となって生成される発光物質の量によって発光強度が調整できるので、化学発光物質を用いた方法のほうが検出感度が高い。しかし、本発明は化学発光を用いる方法に限定されない。酵素反応により生成された物質の濃度が光学的に検出できるものであればよいので、蛍光物質、色素などを用いることができる。
具体的には、第1の流路103内に化学発光標識用酵素(HRP)とストレプトアビジンの複合体液(濃度10μg/ml)を充填し、反応領域108に捕捉されている予めビオチン標識したターゲット核酸と化学発光標識用酵素(HRP)を結合させる。次に、第1の流路103内に洗浄液を流して、特異的に結合していないHRPを除去した後、化学発光基質液(プローブと反応した前記生体物質を検出するための反応液)を加える。化学発光基質液には、ルミノールと過酸化水素が含まれる。HRPはルミノールと過酸化水素と反応して発光物質を産出し発光する。発光物質の産出量はルミノールと過酸化水素を増やすことにより増加させることができるので、検出感度を高めることが容易である。本実施例においては、プローブが内壁の全周に固定されているため、発光物質が反応領域内に高濃度に産出され、高感度の測定が期待できる。また、拡散の方向が流路の長さ方向に限られるため、従来のように2次元的に反応領域を配置した場合に比べて発光物質の拡散が抑制され、測定精度が高いという特徴がある。なお、ルミノール、過酸化水素水と共にエンハンサーを含む発光基質液(ピアスケミカル社、Supersignal Chemiluminescent Substrate等)を充填してもよい。
基質液の第1の流路103への導入は、シリンジポンプ201,202を同時に駆動することにより、基質液をミネラルオイルの液滴とともに第1の流路103に充填する。
図7は、第1の流路103に基質液とミネラルオイルの液滴300を充填した状態を示す図である。ここで、図に示すように、液滴300の間隔は、反応領域108の送液方向の長さより短くすることが望ましい。これにより、液滴300に挟まれた、連続する3つの基質液301a〜301cのうちの最低1つ(ここでは301b)は、基質液全体が反応領域108上に配置される。従って、1つの反応領域108につき、最低1つの基質液301は、全体が反応領域108に入るため、発光強度の検出の際には、基質液全体が反応領域108と接している領域の発光輝度がもっとも強くなるので、その領域を測定対象とすることができる。
流路103内に化学発光基質液を充填したら化学発光物質の産出を待つ。この時、流路103内での往復送液操作は行わない。反応は、シリンジポンプを停止した状態で、例えば40℃で20分行うことが望ましい。これは、産出された発光物質が流路103内を移動してしまい、測定精度が低下することを防止するためである。化学発光物質が産出されたら、光学検出装置203を用いて発光強度を測定する。
発光強度の測定は、シリンジポンプ201を駆動して基質液を移動させながら、第3の開口部107の近くに固定された光学検出装置203によって、各々の反応領域108に対応する化学発光強度を順次測定する。この時の送液の速度は、1μL/min程度が望ましい。基質液はミネラルオイルの液滴で分断されていて互いに混ざりにくいため、第1の流路103内を移動させながら、それぞれの反応領域108で生成された化学発光物質による発光強度を独立して測定することができる。
図8は、測定結果のグラフの例である。横軸は時間、縦軸は発光強度を表している。図に示すように、1つの反応領域108に対し、3つの発光強度のピークa,b,cが観察される。これは、図7に示すように、1つの反応領域108に接する基質液301a〜301cそれぞれにおける測定値がピークとして現れているためであり、最も大きなピークbは、基質液全体が反応領域108と接している領域(301b)に対応する。従って、最大のピーク値をその反応領域の測定値として採用することができる。
また、光学検出装置203から遠い位置にある反応領域108において生成された化学発光物質を含む基質液は、移動の途中で他の反応領域108を通過するため、他の領域で生成される化学発光物質も含んでしまう可能性がある。その影響を除去するためには、図8に示すように、直前の値を基準値として、基準値のライン以下の部分は除去した部分の積分値を測定値とすればよい。
なお、ハイブリダイゼーション反応によって捕捉されたターゲットDNAの量を推定するためには、発光強度の積分値と、予め標準サンプルから求めておいた検量線を用いて算出することができる。
なお、化学発光物質を用いた検出に用いる酵素や基質等は、上記に示すものに限られない。ここでは、酵素としてHRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)を用いているが、他にアルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼなどを用いることができる。これらの酵素に、化学発光基質、色素基質、あるいは蛍光基質を接触させると、それぞれ、化学発光、発色、蛍光が検出される。化学発光基質としては、酵素がアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。
以上のように、本実施形態によれば、第1の開口部105から基質液を導入すると同時に、第2の開口部106からミネラルオイルを導入することにより、基質液はミネラルオイルの液滴300で分断されて互いに混ざりにくくなるため、それぞれの反応領域108において生成された化学発光物質による発光強度を独立して測定することができる。また、プローブと反応したターゲット核酸を検出するための基質液を第1の流路103内で移動させながら、1箇所に固定された光学検出装置203によって発光強度の測定を行うことにより、1つの光学検出装置203ですべての反応領域108に対応する化学発光強度を順次測定することができる。また、光学検出装置203を移動させる駆動機構も不要なため装置を小型化、簡易化することができる。
また、液滴300の間隔を、反応領域108の送液方向の長さより短くすることにより、液滴300に挟まれた、連続する3つの基質液のうちの最低1箇所は、全体が反応領域108上に配置されるため、発光強度の検出の際には当該領域の発光強度がもっとも強くなるので、その領域を測定対称とすることができる。
各々の反応領域108に対応して測定される複数の発光強度ピークのうち、最も大きいピークの積分値を測定値とするようにしたので、基質液全体が反応領域108と接している領域の発光強度を測定値として選択することができる。
また、発光強度ピークの直前の発光強度を基準値として、基準値のライン以下の部分を除去した積分値を測定値とすることにより、光学検出装置203から遠い位置にある反応領域108において生成された化学発光物質を含む基質液が、移動の途中で他の反応領域108で生成された化学発光物質も含んでしまっても、その影響を除去することができる。
10 核酸検出用チップ、101,102 透明基板、103 第1の流路、104 第2の流路、105 第1の開口部、106 第2の開口部、107 第3の開口部、108 反応領域、20 核酸検出装置、201,202 シリンジポンプ、203 光学検出装置、204 分注機、205 ヒータ、210 キャピラリ管、21 供給装置、211 液体収容部、212 収容容器、213 ターンテーブル、300 液滴
Claims (10)
- 一端に反応液を導入するための第1の開口部を有し、前記反応液の流れる方向に間隔をおいて複数の反応領域が一列に形成された第1の流路と、
一端に前記反応液と混和しない液体を導入するための第2の開口部を有し、他方の端部が前記第1の流路に接続された第2の流路と、
光学検出装置と、を備え、
各々の前記反応領域は、特定の生体物質を検出するためのプローブを固定する領域を有する、ことを特徴とする生体物質検出装置。 - 前記第1の流路は、各々に溝が形成された2枚の基板を貼り合わせて形成されており、
前記反応領域は、前記流路の内壁面に全周に亘って形成されていることを特徴とする請求項1に記載の生体物質検出装置。 - 前記第1の流路の内壁面は親水性であり、
前記第2の流路の内壁面は疎水性であることを特徴とする請求項1または請求項2に記載の生体物質検出装置。 - 請求項1から請求項3のいずれかに記載の生体物質検出装置を用いた生体物質検出方法であって、
前記第1の流路内に、生体物質を含む検体を充填する工程と、
前記検体に含まれる特定の生体物質と、前記プローブとを反応させる反応工程と、
前記第1の開口部から、前記プローブと結合した前記生体物質を酵素反応を用いて検出するための基質を含む反応液を導入すると同時に、前記第2の開口部から前記反応液と混和しない液体を導入することにより、前記第1の流路内に、前記反応液と混和しない液体の液滴と前記反応液とを充填する工程と、
前記光学検出装置を用いて、前記プローブと反応した前記生体物質を検出する検出工程と、を備えた生体物質検出方法。 - 前記生体物質を検出する検出工程では、前記第1の流路内で前記反応液を移動させながら、前記光学検出装置を用いて、前記第1の流路上の1箇所で検出することを特徴とする請求項4に記載の生体物質検出方法。
- 前記第1の流路内において、前記液滴の大きさ及び間隔は均一であり、前記液滴と前記液滴の間に均一な量の前記反応液が挟まれていることを特徴とする請求項4または請求項5に記載の生体物質検出方法。
- 前記第1の流路内において、前記液滴は、前記流路の内壁面の全周に接していることを特徴とする請求項4から請求項6のいずれかに記載の生体物質検出方法。
- 前記液滴と前記反応液とを充填する工程では、前記液滴の間隔を、前記反応領域の前記送液方向の長さより短くすることを特徴とする請求項4から請求項7のいずれかに記載の生体物質検出方法。
- 前記検出工程では、各々の前記反応領域に対応する複数の測定領域のうち、最も大きい測定値を示す領域を選択することを特徴とする請求項8に記載の生体物質検出方法。
- 前記検出工程では、前記反応領域の直前の領域の測定値を基準値として、反応領域の測定値から基準値を差し引くことを特徴とする請求項9に記載の生体物質検出方法。
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-
2008
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