JP2009192291A - 生体物質検出用チップおよび生体物質検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】少ない反応液で効率良く生体物質を検出することが可能な生体物質検出用チップを得る。
【解決手段】一端に検体を導入するための第１の開口部１０５を有し、検体の流れる方向に間隔をおいて複数の反応領域１０８が一列に形成された第１の流路１０３と、一端に検体と混和しない液体を導入するための第２の開口部１０６を有し、他方の端部が第１の流路１０３に接続された第２の流路１０４と、を備え、各々の反応領域１０８は、検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブを固定する領域を有する。
【選択図】図２

Description

本発明は、特定のＤＮＡやタンパク質などの生体物質を検出するための、生体物質検出用チップおよび生体物質検出方法に関するものである。

ガラス基板等に微細流路が設けられたマイクロ流体チップを使用して、化学分析や化学合成、あるいはバイオ関連の分析などを行う方法が注目されている。マイクロ流体チップは、マイクロTotal Analytical System (マイクロＴＡＳ)や、Lab-on-a-chip等とも呼ばれ、従来の装置に比較して試料や試薬の必要量が少ない、反応時間が短い、廃棄物が少ないなどのメリットがあり、医療診断、環境や食品のオンサイト分析、医薬品や化学品などの生産等、広い分野での利用が期待されている。試薬の量が少なくてよいことから、検査のコストを下げることが可能となり、また、試料および試薬の量が少ないことにより、反応時間も大幅に短縮されて検査の効率化が図れる。特に、医療診断に使用する場合には、試料となる血液など検体を少なくすることができるため、患者の負担を軽減できるというメリットもある。

マイクロ流体チップは、ＤＮＡマイクロアレイとして使用することができる。ＤＮＡマイクロアレイは、基板上に固定化されたプローブ（合成オリゴＤＮＡやｃＤＮＡなど）と検体中の遺伝子とを反応（ハイブリダイゼーション）させることにより、目標の遺伝子の有無を検出する。例えば、特許文献１には、多孔板の孔の中に多孔性の吸着性領域を設けてそこにプローブを固定し、ターゲットを含む溶液がプローブと接触しながら循環するための流路を備えた生化学解析用ユニット構造体が提案されている。
特開２００４−３６１３１６号公報

しかし、特許文献１に記載された従来の方法では、流路中でプローブとターゲット遺伝子が接触する機会が限られ、ハイブリダイゼーション反応の効率が十分とはいえなかった。

そこで、本発明の目的は、少ない反応液で効率良く生体物質を検出することが可能な生体物質検出用チップを得ることである。

本発明に係る生体物質検出用チップは、一端に検体を導入するための第１の開口部を有し、前記検体の流れる方向に間隔をおいて複数の反応領域が一列に形成された第１の流路と、一端に前記検体と混和しない液体を導入するための第２の開口部を有し、他方の端部が前記第１の流路に接続された第２の流路と、を備え、各々の前記反応領域は、前記検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブを固定する領域を有するものである。

本発明によれば、第１の開口部から検体を導入すると同時に、第２の開口部から検体と混和しない液体を導入することにより、第１の流路内に、検体と混和しない液体の液滴の間に挟まれた状態で検体を充填することができる。このような状態で検体を流路内で移動させると、液滴で分断された検体液の中に循環流が発生する。検体液の循環流が発生することにより、第１の流路の壁面近傍での検体液の移動が起こりやすくなり、検体に含まれる特定の生体物質と反応領域に固定されたプローブとの反応効率を向上させることができる。そのため、少ない反応液で短時間での効率良い検出を行うことができる。

また、前記第１の流路は、各々に溝が形成された２枚の基板を貼り合わせて形成されており、前記反応領域は、前記流路の内壁面に全周に亘って形成されていることが望ましい。
これにより、流路の一面のみに反応領域が設けられている場合よりも、検体とプローブとの反応機会が多くなり、さらなる反応効率の向上を図ることができる。

なお、前記第１の流路の内壁面は親水性であり、前記第２の流路の内壁面は疎水性であることが望ましい。
第１の流路の内壁面を親水性にしておくことにより、第１の流路の内壁は検体液との親和性が高くなり、そのため、検体と混和しない液体の液滴は検体液の層を介して第１の流路の内壁面に接触することになるので、反応領域が検体と混和しない液体によって汚染されることを防止できる。

本発明に係る生体物質検出方法は、上記の生体物質検出用チップを用いた生体物質検出方法であって、前記第１の開口部から前記検体を導入すると同時に、前記第２の開口部から前記検体と混和しない液体を導入することにより、前記第１の流路内に、前記検体と混和しない液体の液滴と前記検体とを充填する工程と、前記検体に含まれる特定の生体物質と、前記プローブとを反応させる反応工程と、前記プローブと反応した前記生体物質を検出する検出工程と、を備え、前記第１の流路内において、前記液滴の大きさ及び間隔は均一であり、前記液滴と前記液滴の間に均一な量の前記検体が挟まれているものである。

本発明によれば、第１の流路内に、検体と混和しない液体の液滴の間に挟まれた状態で検体を充填することができる。このような状態で検体を流路内で移動させると、液滴で分断された検体液の循環流が発生する。検体液の循環流が発生することにより、第１の流路の壁面近傍での検体液の移動が起こりやすくなり、検体に含まれる特定の生体物質と反応領域に固定されたプローブとの反応効率を向上させることができる。そのため、少ない反応液で短時間での効率良い検出を行うことができる。

また、前記第１の流路内において、前記液滴は、前記流路の内壁面の全周に接していることが望ましい。
これにより、確実に検体液を分離し、その内部に循環流を発生させることができる。

また、前記反応工程では、前記第１の流路内で前記検体を移動させながら前記反応を行うことが望ましい。
検体液を第１の流路内で移動させることにより、第１の流路内の全ての反応領域と検体液が均等に接触し、均一な反応が可能となる。また、第１の流路内で検体液を移動させることにより、液滴で分断された検体液の中に循環流が発生し、検体に含まれる特定の生体物質と反応領域に固定されたプローブとの反応効率が向上する。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
図１は、本発明の実施の形態１による、核酸検出用チップ（生体物質検出用チップ）１０を用いた核酸検出装置２０の概略構成を示す模式図である。核酸検出装置２０は、シリンジポンプ２０１，２０２、ＣＣＤカメラ等の光学検出機２０３、分注機２０４、温度調節用のヒータ２０５を備えている。

図２（Ａ）は、本発明の実施の形態１による核酸検出用チップ１０の概略構成を示す斜視図、図２（Ｂ）は、図２（Ａ）のＣ−Ｃ断面図である。図に示すように、核酸検出用チップ１０は、透明基板１０１，１０２、第１の流路１０３、第２の流路１０４、第１の開口部１０５、第２の開口部１０６、第３の開口部１０７を備えている。また、流路１０３の内壁には、複数の反応領域１０８が形成されている。

図２に示すように、核酸検出用チップ１０は、２枚の透明基板１０１，１０２を貼り合わせて構成されている。透明基板１０１，１０２それぞれに、流路１０３の一部となる溝が形成されており、透明基板１０１，１０２を貼り合わせることによって、立体的な流路１０３が形成される。なお、透明基板１０１，１０２は例えばガラスにより形成することができる。透明基板１０１，１０２の材質は処理温度、光学検出方法、プローブ分子の固定、ハイブリダイゼーションおよびブロッキング等の処理条件に応じて様々なものが選択可能である。

流路１０３は、検体の流れる方向（図中矢印Ｆの方向）に垂直な断面の形状が円形に形成されており、ここでは、直径が１００μｍである。なお、断面の形状は、楕円形など円形以外の形状であってもよい。

第１の開口部１０５及び第２の開口部１０６は、シリコンチューブまたはＰＥＥＫ製のチューブを介してシリンジポンプ２０１，２０２に接続されている。第３の開口部１０７から分注機２０４を用いて、検体や試薬などの供給ができるようになっている。

反応領域１０８には、プローブが塗布されている。反応領域１０８は、流路１０３の内壁面の全周に亘って形成されており、このためプローブとターゲットが広い面積で接することが可能となり、反応効率の向上が図れる。反応領域１０８は、例えば検体の流れる方向の長さを２００μｍ、隣り合う反応領域１０８と反応領域１０８の間隔を２００μｍとすることができる。

プローブには、例えば血液、尿、唾液、髄液のような検体試料に含まれる標的物質（ターゲット）を捕捉し得る物質を用いることができる。例えば、ターゲットがＤＮＡやＲＮＡのような核酸である場合には、プローブとしては、これらの核酸とハイブリダイゼーション（相補的に結合）する核酸やヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）等を用いることができる。このような核酸としては、例えばｃＤＮＡやＰＣＲ産物等が用いられる。

なお、ターゲットは核酸に限られず、例えば特定のタンパク質であってもよい。この場合には、プローブとしては、このタンパク質を特異的に捕捉（例えば、吸着、結合等）するもの等が用いられる。具体的には、抗原、抗体、レセプター、酵素等のタンパク質、ペプチド（オリゴペプチド）等である。
本実施形態では、各々の反応領域１０８には、それぞれ異なる１種類のプローブが固定されている。これにより、１度に複数種類のターゲットの検出が可能である。

次に、本実施形態による核酸検出用チップ１０の製造方法について説明する。
核酸検出用チップ１０は、２枚の透明基板１０１，１０２を貼りあせて構成することができる。図３は、透明基板１０１の構成の一部を示す斜視図である。図に示すように、透明基板１０１には、第１の流路１０３の一部となる溝ｄが形成されている。溝ｄの検体の流れる方向に垂直な断面の形状は半円形である。透明基板１０２にも透明基板１０１と同様に、第１の流路１０３の一部となる溝ｄが形成されており、透明基板１０１，１０２を貼り合わせることによって断面が円形の第１の流路１０３が形成される。なお、図３では、第１の開口部１０５、第３の開口部１０７（第１の流路１０３の端部）、及び第２の流路１０４、第２の開口部１０６については図示を省略している。透明基板１０１，１０２がガラス基板の場合には、溝ｄは例えばエッチングまたはサンドブラスト法によって形成することができる。

次に、溝ｄにプローブを塗布し、反応領域１０８を形成する。溝ｄへプローブを塗布する方法には、ピンスポッターを使う方法や非接触で液滴を吐出する手段を使う方法などがある。しかし、本実施形態のように、溝ｄの幅が狭く、また溝ｄの底が平坦でない場合には、ピンスポッターよりも非接触で液滴を吐出する手段を用いて行う方がよい。図４（Ａ），（Ｂ）は、溝ｄへのプローブの塗布を説明する図である。図４（Ａ）に示すように、液滴吐出ヘッド（図示せず）を用いて、溝ｄ上の反応領域１０８を形成する領域に、プローブを含む液滴Ｐを吐出する。

図４（Ｂ）は、プローブを含む液滴Ｐが吐出された溝ｄの表面を示す図である。溝ｄにプローブを含む液体を塗布すると、表面張力により溝ｄの長さ方向及び幅方向に液体が濡れ広がるが、本実施形態のように溝ｄの断面が半円形の場合、塗布したプローブの形状や厚みを均一にすることができ、反応領域１０８全体のプローブの密度を均一にできる。

透明基板１０１及び１０２に形成された溝ｄには、両基板を貼り合わせた際に対向する領域に同じ種類のプローブが配置されるようにプローブを塗布する。

透明基板１０１，１０２の溝ｄにプローブを塗布し、反応領域１０８を形成したら、透明基板１０１，１０２を接着等のプローブを分解させない方法を用いて貼り合わせることによって、核酸検出用チップ１０が形成される。透明基板１０１及び１０２の溝ｄには、対向する位置に同じ種類のプローブが塗布されているので、反応領域１０８は第１の流路１０３の内壁面の全周に亘って形成される。

次に、本実施形態による核酸検出用チップ１０への検体液の充填方法について説明する。
検体液は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルから抽出したＤＮＡやＲＮＡを含む。必要に応じて、ＰＣＲ法やＩＶＴ法を用いて、ターゲットとなる核酸の増幅処理を行っておく。
検体液は、分注機２０４を用いて第３の開口部１０７に供給する。検体液を第３の開口部１０７に供給したら、シリンジポンプ２０１を駆動して検体液を第１の開口部１０５に収容する。また、同様にしてシリンジポンプ２０２を駆動し、第２の開口部１０６にミネラルオイル（検体と混和しない液体）を収容する。次に、シリンジポンプ２０１とシリンジポンプ２０２を同時に駆動することにより、検体液とミネラルオイルを同時に第１の流路１０３内に導入する。

検体液とミネラルオイルを同時に第１の流路１０３内に導入する際、ミネラルオイルの粘度と、検体液の導入速度との速度比等をコントロールすることにより、図５に示すように、ミネラルオイルの液滴３００が流路の内壁面の全周に接するように形成することができる。これにより、液滴３００で検体液を分離することができる。さらに、図５に示すように、液滴３００の大きさや間隔は均一であり、各々の液滴３００に挟まれた検体液３０１の量はほぼ均一にすることができる。第１の流路１０３の内壁面を親水性にしておくことにより、第１の流路１０３の内壁は検体液との親和性が高くなり、そのためミネラルオイルは検体液の層を介して第１の流路１０３の内壁面に接触することになるので、反応領域１０８がオイルによって汚染されることはない。

ターゲット（核酸）とプローブとのハイブリダイゼーション処理を行う際には、図５に示すような条件下でシリンジポンプ２０１を駆動することにより、所定の周期で検体液を第１の流路１０３内で往復させる。この時の流速は、例えば１μｌ／ｍｉｎ程度とすることができる。ミネラルオイルで分断された検体液内では、図５に示すように、第１の流路１０３の断面内の速度差による循環が発生する。検体液の循環流が発生することにより、第１の流路１０３の壁面近傍での検体液の移動が起こりやすくなり、ハイブリダイゼーション反応の効率を向上させることができる。そのため、少ない反応液で短時間での効率良い検出を行うことができる。例えば、検体液のみを第１の流路１０３に充填して往復送液を行っても、第１の流路１０３内では検体液の移動は層流になり、第１の流路１０３の壁面近傍での検体液の移動が起こりにくい。本実施形態によれば、検体液をミネラルオイルの液滴３００で分断しているため、検体液の循環流を起こすことができ、ハイブリダイゼーション反応の効率を著しく向上させることができる。

第１の流路１０３の内径を１００μｍ、全体の長さを２００ｍｍとした場合、第１の流路１０３全体を充填するために必要な検体液の量は約１．６μＬであり、非常に少ない反応液量でのハイブリダイゼーション反応を行うことができる。また、本実施形態のようにシリンジポンプ２０１を駆動して検体液を第１の流路１０３内で往復させることにより、第１の流路１０３内の全ての反応領域１０８と検体液が均等に接触し、均一なハイブリダイゼーション反応が可能となる。また、第１の流路１０３内で常に検体液を移動させることにより循環流が発生し、プローブにより多くのターゲットが接するようになり、反応効率が向上する。
なお、第１の流路１０３に検体液を供給する前に、必要に応じて第１の流路１０３内にブロッキング液を充填し、プローブが固定化されていない領域をブロッキングしておいてもよい。

なお、核酸検出用チップ１０への検体液の供給方法は、本実施形態のように分注機２０４を用いる方法に限定されない。例えば図６に示すように、分注機２０４の代わりに、複数の液体収容部２１１を備えた収容容器２１２と、ターンテーブル２１３を備えた供給装置２１を用いても良い。各々の液体収容部２１１には、それぞれ検体液や試薬が収容されている。収容容器２１２はターンテーブル２１３に設置されている。

核酸検出用チップ１０にキャピラリ管２１０を装着し、キャピラリ管２１０を通して第３の開口部１０７に液体収容部２１１内の液体が供給されるようにする。ターンテーブル２１３を駆動して位置決めを行うことにより、キャピラリ管２１０の先端を浸漬する液体収容部２１１を選択することができる。キャピラリ管２１０を所定の液体収容部２１１内の液体に浸漬した状態でシリンジポンプ２０１を用いて吸引を行うことにより、第１の流路１０３内部に検体液を導入することができる。

第１の流路１０３内で所定時間のハイブリダイゼーション反応を行ったら、シリンジポンプ２０１を用いて第１の流路１０３内より検体液を排出する。必要に応じて第１の流路１０３内の洗浄を行った後、ハイブリダイゼーション反応の検出処理を行う。

本実施形態では、化学発光物質を用いた検出を行う。一般にＤＮＡマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション反応の測定には蛍光標識剤を用いた検出方法を用いることも多いが、蛍光強度がターゲット核酸に結合している蛍光標識剤の量に依存するのに対し、化学発光物質を用いた検出方法では、ターゲット核酸に結合した酵素が触媒となって生成される発光物質の量によって発光強度が調整できるので、化学発光物質を用いた方法のほうが検出感度が高い。

具体的には、第１の流路１０３内に化学発光標識用酵素（ＨＲＰ）とストレプトアビジンの複合体液（濃度１０μｇ／ｍｌ）を充填し、反応領域１０８に捕捉されている予めビオチン標識したターゲット核酸と化学発光標識用酵素（ＨＲＰ）を結合させる。次に、第１の流路１０３内に洗浄液を流して、特異的に結合していないＨＲＰを除去した後、化学発光基質液（ルミノール、過酸化水素）を加える。これにより、ＨＲＰがルミノールと過酸化水素と反応して発光物質を産出し発光する。発光物質の産出量はルミノールと過酸化水素を増やすことにより増加させることができるので、検出感度を高めることが容易である。本実施例においては、プローブが内壁の全周に固定されているため、発光物質が反応領域内に高濃度に産出され、高感度の測定が期待できる。また、拡散の方向が流路の長さ方向に限られるため、従来のように２次元的に反応領域を配置した場合に比べて発光物質の拡散が抑制され、測定精度が高いという特徴がある。なお、ルミノール、過酸化水素水と共にエンハンサーを含む発光基質液（ピアスケミカル社、Supersignal Chemiluminescent Substrate等）を充填してもよい。

流路１０３内に化学発光基質液を充填したら化学発光物質の産出を待つ。この時、流路１０３内での往復送液操作は行わない。反応は、シリンジポンプを停止した状態で、例えば４０℃で２０分行うことが望ましい。これは、産出された発光物質が流路１０３内を移動してしまい、測定精度が低下することを防止するためである。化学発光物質が産出されたら、光学検出機２０３（ＣＣＤカメラ等）を用いて発光強度を測定する。なお、化学発光物質を用いた検出に用いる酵素や基質等は、上記に示すものに限られない。ここでは、酵素としてＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を用いているが、他にアルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼなどを用いることができる。これらの酵素に、化学発光基質、色素基質、あるいは蛍光基質を接触させると、それぞれ、化学発光、発色、蛍光が検出される。化学発光基質としては、酵素がアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。

なお、検体液の導入時と同様に、シリンジポンプ２０１，２０２を同時に駆動することにより、基質液（ルミノール、過酸化水素水）をミネラルオイルの液滴とともに第１の流路１０３に充填してもよい。

図７は、第１の流路１０３に基質液とミネラルオイルの液滴３００を充填した状態を示す図である。図に示すように、液滴３００の間隔を、反応領域１０８の送液方向の長さより小さくすることが望ましい。これにより、液滴３００に挟まれた、連続する３つの基質液３０１ａ〜３０１ｃのうちの最低１つ（ここでは３０１ｂ）は、全体が反応領域１０８上に配置される。従って、１つの反応領域１０８につき、最低１つの基質液３０１は、全体が反応領域１０８に入るため、発光強度の検出の際には、全体が反応領域１０８と接している領域の発光輝度がもっとも強くなるので、その領域を測定対称とすることができる。

なお、光学検出機２０３による発光強度の測定は、光学検出機２０３を移動させて核酸検出用チップ１０の領域全体を測定するようにしてもよいし、光学検出機２０３を第３の開口部１０７の近くに固定し、シリンジポンプ２０１を駆動して基質液を移動させながら、各々の反応領域１０８に対応する化学発光強度を順次測定するようにしてもよい。この時の送液の速度は、１μＬ／ｍｉｎ程度が望ましい。基質液はミネラルオイルの液滴で分断されていて互いに混ざりにくいため、第１の流路１０３内を移動させながら、それぞれの反応領域１０８で生成された化学発光物質による発光強度を独立して測定することができる。

以上のように、本実施形態によれば、第１の開口部１０５から検体液を導入すると同時に、第２の開口部１０６から検体液と混和しないミネラルオイルを導入することにより、第１の流路１０３内に、ミネラルオイルの液滴の間に挟まれた状態で検体液を充填することができる。このような状態で検体液を第１の流路１０３内で移動させると、液滴で分断された検体液の循環流が発生する。検体液の循環流が発生することにより、第１の流路１０３の壁面近傍での検体液の移動が起こりやすくなり、検体に含まれる特定の生体物質と反応領域に固定されたプローブとの反応効率を向上させることができる。そのため、少ない反応液で短時間での効率良い検出を行うことができる。

本発明の実施の形態１による、核酸検出用チップを用いた核酸検出装置の概略構成を示す模式図である。 図２（Ａ）は、本発明の実施の形態１による核酸検出用チップの概略構成を示す斜視図、図２（Ｂ）は、図２（Ａ）のＣ−Ｃ断面図である。 透明基板の構成の一部を示す斜視図である。 溝へのプローブの塗布を説明する図である。 本発明の実施の形態１による、流路内の液滴と検体液の状態を示す図である。 核酸検出用チップへの検体液の供給方法の他の例を示す図である。 第１の流路に基質液とミネラルオイルの液滴を充填した状態を示す図である。

符号の説明

１０ 核酸検出用チップ、１０１，１０２ 透明基板、１０３ 第１の流路、１０４ 第２の流路、１０５ 第１の開口部、１０６ 第２の開口部、１０７ 第３の開口部、１０８ 反応領域、２０ 核酸検出装置、２０１，２０２ シリンジポンプ、２０３ 光学検出機、２０４ 分注機、２０５ ヒータ、２１０ キャピラリ管、２１ 供給装置、２１１ 液体収容部、２１２ 収容容器、２１３ ターンテーブル、３００ 液滴

Claims (6)

1. 一端に検体を導入するための第１の開口部を有し、前記検体の流れる方向に間隔をおいて複数の反応領域が一列に形成された第１の流路と、
   一端に前記検体と混和しない液体を導入するための第２の開口部を有し、他方の端部が前記第１の流路に接続された第２の流路と、を備え
   各々の前記反応領域は、前記検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブを固定する領域を有する、ことを特徴とする生体物質検出用チップ。
2. 前記第１の流路は、各々に溝が形成された２枚の基板を貼り合わせて形成されており、
   前記反応領域は、前記流路の内壁面に全周に亘って形成されていることを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出用チップ。
3. 前記第１の流路の内壁面は親水性であり、
   前記第２の流路の内壁面は疎水性であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の生体物質検出用チップ。
4. 請求項１から請求項３のいずれかに記載の生体物質検出用チップを用いた生体物質検出方法であって、
   前記第１の開口部から前記検体を導入すると同時に、前記第２の開口部から前記検体と混和しない液体を導入することにより、前記第１の流路内に、前記検体と混和しない液体の液滴と前記検体とを充填する工程と、
   前記検体に含まれる特定の生体物質と、前記プローブとを反応させる反応工程と、
   前記プローブと反応した前記生体物質を検出する検出工程と、を備え、
   前記第１の流路内において、前記液滴の大きさ及び間隔は均一であり、前記液滴と前記液滴の間に均一な量の前記検体が挟まれていることを特徴とする生体物質検出方法。
5. 前記第１の流路内において、前記液滴は、前記流路の内壁面の全周に接していることを特徴とする請求項４に記載の生体物質検出方法。
6. 前記反応工程では、前記第１の流路内で前記検体を移動させながら前記反応を行うことを特徴とする請求項４または請求項５に記載の生体物質検出方法。

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