JP2009191039A - EXPRESSION PROMOTOR FOR HYALURONIC ACID SYNTHETASE 3mRNA, EXPRESSION PROMOTOR FOR AQUAPORIN 3mRNA, EXPRESSION PROMOTOR FOR SERINE PALMITOYLTRANSFERASE mRNA, AND PRODUCTION PROMOTOR FOR LAMININ 5 - Google Patents
EXPRESSION PROMOTOR FOR HYALURONIC ACID SYNTHETASE 3mRNA, EXPRESSION PROMOTOR FOR AQUAPORIN 3mRNA, EXPRESSION PROMOTOR FOR SERINE PALMITOYLTRANSFERASE mRNA, AND PRODUCTION PROMOTOR FOR LAMININ 5 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、ヒアルロン酸合成酵素３ｍＲＮＡ発現促進剤、アクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤及びラミニン５産生促進剤に関するものである。 The present invention relates to hyaluronic acid synthase 3 mRNA expression promoter, aquaporin 3 mRNA expression promoter, serine palmitoyltransferase mRNA expression promoter and laminin 5 production promoter.
ヒアルロン酸は、皮膚の水分保持や粘弾性に深く関与する主要な細胞外マトリックスの一つであり、真皮線維芽細胞に加え表皮角化細胞からも合成されることが知られている。また、表皮のヒアルロン酸の機能として、免疫系や分化調節等、皮膚の恒常性維持にも関与していることも知られている。 Hyaluronic acid is one of the major extracellular matrices that are deeply involved in skin moisture retention and viscoelasticity, and is known to be synthesized from epidermal keratinocytes in addition to dermal fibroblasts. It is also known that the function of hyaluronic acid in the epidermis is involved in maintaining skin homeostasis such as immune system and differentiation regulation.
しかし、生理的老化に伴い皮膚内のヒアルロン酸含量は減少することが知られており、皮膚内のヒアルロン酸含量の減少が、皮膚の乾燥・萎縮、弾力性の低下、小じわの形成等の老化に関与している可能性が推察されている（非特許文献１参照）。 However, it is known that the hyaluronic acid content in the skin decreases with physiological aging, and the decrease in the hyaluronic acid content in the skin causes aging such as dryness / atrophy of the skin, decreased elasticity, and formation of fine lines. (See Non-Patent Document 1).
したがって、表皮ヒアルロン酸の合成促進に関与するヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）の発現を促進することで、皮膚の老化を予防・改善することができるものと考えられる。このような考えに基づき、ヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）発現促進作用を有するものとして、例えば、トコフェリルレチノエート（特許文献１参照）等が知られている。 Therefore, it is considered that aging of the skin can be prevented and improved by promoting the expression of hyaluronic acid synthase 3 (HAS3) involved in promoting the synthesis of epidermal hyaluronic acid. Based on this idea, for example, tocopheryl retinoate (see Patent Document 1) is known as one having hyaluronic acid synthase 3 (HAS3) expression promoting action.
皮膚細胞では、水チャンネルとして知られるアクアポリンが、細胞膜上に発現して、細胞間隙の水をはじめとする低分子物質を細胞内へ取り込む役割を担っていることが知られている。 In skin cells, it is known that aquaporins, known as water channels, are expressed on the cell membrane and play a role of taking in low-molecular substances such as interstitial water into cells.
ヒトでは、１３種類のアクアポリン（ＡＱＰ０〜ＡＱＰ１２）の存在が知られている。表皮細胞においては、主としてＡＱＰ３が存在しており、水に加えて、水分保持作用に関与するグリセロールや尿素等の低分子化合物をも取り込む役割を担っていると考えられている。 In humans, the presence of 13 types of aquaporins (AQP0 to AQP12) is known. In epidermal cells, AQP3 is mainly present, and it is considered to play a role of taking in low-molecular compounds such as glycerol and urea involved in water retention action in addition to water.
しかしながら、ＡＱＰ３は加齢とともに減少し、このことが水分保持機能の低下の一因であることが示唆されているため、ＡＱＰ３の発現を促進することにより、加齢による水分保持能やバリア機能等を制御することが可能であると考えられる（非特許文献２参照）。このような考えに基づき、ＡＱＰ３発現促進作用を有するものとして、例えば、トコフェリルレチノエート（特許文献１参照）、ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物（特許文献２参照）等が知られている。 However, AQP3 decreases with aging, and it has been suggested that this contributes to a decrease in water retention function. Therefore, by promoting the expression of AQP3, the water retention capacity and barrier function due to aging, etc. Can be controlled (see Non-Patent Document 2). Based on such an idea, for example, tocopheryl retinoate (see Patent Document 1), an extract obtained from a Nozenhalenaceae plant (see Patent Document 2) and the like are known as having AQP3 expression promoting action.
セラミドは、表皮細胞の角化の過程においてセリンとパルミトイル−ＣｏＡとを基に、セラミド合成の律速酵素として知られるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）をはじめとする酵素の働きにより生成される。セラミドは、皮膚最外層を覆う角質細胞間脂質の主成分として特異的に存在し、皮膚本来が持つ生体と外界とのバリア膜としての機能維持に重要な役割を果たしている。 Ceramide is produced by the action of an enzyme such as serine palmitoyltransferase (SPT) known as a rate-limiting enzyme for ceramide synthesis based on serine and palmitoyl-CoA in the process of keratinization of epidermal cells. Ceramide exists specifically as the main component of the keratinocyte lipid covering the outermost layer of the skin, and plays an important role in maintaining the function of the skin itself as a barrier film between the living body and the outside world.
角層の構造は、レンガとモルタルとに例えられ、１５層ほどに積み重なった角層細胞を細胞間脂質が繋ぎ止める形で強固なバリア膜を形成している。角層細胞は、アミノ酸を主成分とする天然保湿因子を細胞内に含有することによって水分を保持し、一方、角質細胞間脂質は、約５０％のセラミドを主成分とし、コレステロール、脂肪酸等の両親媒性脂質から構成されており、疎水性部分と親水性部分とが交互に繰り返される層板構造、いわゆるラメラ構造を特徴としている。 The stratum corneum structure is compared to brick and mortar, and a strong barrier membrane is formed in such a way that intercellular lipids connect the stratum corneum cells stacked in about 15 layers. The stratum corneum retains moisture by containing a natural moisturizing factor mainly composed of amino acids in the cell, while stratum corneum lipids are mainly composed of about 50% ceramide, such as cholesterol and fatty acids. It is composed of amphipathic lipids and is characterized by a so-called lamellar structure in which hydrophobic portions and hydrophilic portions are alternately repeated.
様々な内的・外的要因による皮膚のバリア機能の低下は、経表皮水分蒸散量を増加させ、皮膚のかさつき、落屑、掻痒感等を惹き起こし、いわゆる乾燥肌に陥る。また、皮膚のバリア機能の低下は、皮膚の炎症を増大させ、外界からの様々な刺激に対する防御機能が低下するという悪循環に陥る。最近の研究において、加齢により、又はバリア障害として知られるアトピー性皮膚炎患者において、角層セラミド成分（いわゆる細胞間脂質）の減少や組成変化が報告されており（非特許文献３参照）、皮膚のバリア機能の維持、改善にセラミドが重要であることが広く知られるようになっている。このような考え方に基づいて、皮膚のバリア機能を改善する方法として、セラミドを外部から補う方法（非特許文献４参照）や皮膚内部においてセラミド産生能を高める方法（非特許文献５参照）等が知られている。 The decrease in the skin barrier function due to various internal and external factors increases the transepidermal water transpiration, causing skin roughness, desquamation, pruritus, etc., resulting in so-called dry skin. Moreover, the decrease in the barrier function of the skin increases the inflammation of the skin and falls into a vicious circle in which the protective function against various stimuli from the outside world is reduced. In recent studies, in patients with atopic dermatitis known as aging or barrier disorder, a decrease in stratum corneum ceramide component (so-called intercellular lipid) and composition change have been reported (see Non-Patent Document 3), It is widely known that ceramide is important for maintaining and improving the barrier function of the skin. Based on such a concept, methods for improving the barrier function of the skin include a method of supplementing ceramide from the outside (see Non-Patent Document 4), a method of increasing the ceramide production ability inside the skin (see Non-Patent Document 5), and the like. Are known.
皮膚は角層、表皮、基底膜及び真皮から構成されている。基底膜は表皮真皮境界部に存在し、表皮と真皮を繋ぎ止めるだけでなく、皮膚機能の維持に重要な役割を果たしている（非特許文献６参照）。基底膜の主要骨格はＩＶ型コラーゲンからなる網目構造をしている。基底膜と表皮の境界に存在し、基底膜と表皮を繋ぎとめているのがラミニン５を主成分とする各種糖蛋白質である。若い皮膚においては、基底膜の働きにより表皮、真皮の相互作用が恒常性を保つことで水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。 The skin is composed of the stratum corneum, epidermis, basement membrane and dermis. The basement membrane exists in the epidermis dermis boundary part and plays an important role not only to connect the epidermis and dermis but also to maintain skin function (see Non-Patent Document 6). The main skeleton of the basement membrane has a network structure made of type IV collagen. Various glycoproteins mainly composed of laminin 5 exist at the boundary between the basement membrane and the epidermis and connect the basement membrane and the epidermis. In young skin, the basement membrane works to maintain the homeostatic interaction of the epidermis and dermis, ensuring moisture retention, flexibility, elasticity, and the like. Maintained.
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、基底膜の主要構成成分であるＩＶ型コラーゲンや、ラミニン５は分解・変質を起こし、基底膜構造が破壊される（非特許文献７参照）。その結果、皮膚は保湿機能や弾力性が低下し、角質は異常剥離を始めるから、肌は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。このように、皮膚の老化に伴う変化、すなわち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、基底膜成分の減少、基底膜の構造変化が関与しており、ラミニン５の産生を促進することにより、皮膚の老化症状を予防・改善することができると考えられる。 However, when there is an influence of certain external factors such as ultraviolet irradiation, excessive drying of the air, excessive skin washing, etc., or when aging progresses, type IV collagen, which is a main component of the basement membrane, and laminin 5 causes decomposition and alteration, and the basement membrane structure is destroyed (see Non-Patent Document 7). As a result, the skin's moisturizing function and elasticity are lowered, and the keratin begins to exfoliate abnormally, so the skin loses its tension and gloss, and exhibits aging symptoms such as roughness and wrinkles. In this way, changes associated with skin aging, that is, wrinkles, dullness, disappearance of texture, decrease in elasticity, etc. are associated with a decrease in basement membrane components and structural changes in basement membranes, and production of laminin 5 It is considered that aging symptoms of the skin can be prevented and ameliorated.
ラミニンは、α鎖、β鎖及びγ鎖の種々の組合せからなり、現在のところ１５種類のもの（ラミニン１〜１５）が知られている。これらのα鎖、β鎖及びγ鎖が長鎖（long arm）と呼ばれる部位で３本鎖構造を形成することで、巨大なラミニン分子が構成されている。その中でラミニン５（α３β３γ２）は、皮膚、消化器、腎臓、肺等の上皮組織の基底膜に多量に存在する。ラミニン５の各鎖をコードする遺伝子の先天的な異常に起因する遺伝子疾患（致死型先天性表皮水疱症，Herlitz junctional epidermolysis bullosa）においては、全身の表皮が剥離する致死性の症状を示すことが知られている。そして、ラミニン５は、他の細胞外マトリックス分子と比べ、強度に細胞を接着させ（細胞接着活性が高く）、細胞運動を強く促進する（細胞運動活性が高い）ことが知られている（非特許文献８参照）。 Laminin consists of various combinations of α chain, β chain, and γ chain, and 15 types (laminins 1 to 15) are known at present. These α chain, β chain, and γ chain form a triple chain structure at a site called a long arm, thereby forming a huge laminin molecule. Among them, laminin 5 (α3β3γ2) is abundantly present in the basement membrane of epithelial tissues such as skin, digestive organs, kidneys and lungs. In genetic diseases caused by congenital abnormalities of the genes encoding each chain of laminin 5 (lethal congenital epidermolysis bullosa, Herlitz junctional epidermolysis bullosa), the epidermis of the whole body may show fatal symptoms Are known. Laminin 5 is known to strongly adhere cells (high cell adhesion activity) and strongly promote cell motility (high cell motility activity) compared to other extracellular matrix molecules (non-cell motility activity). (See Patent Document 8).
このように、ラミニン５は、細胞運動活性が高いことから、損傷皮膚中の細胞移動を促進し、皮膚の損傷治癒を促すことが知られている（特許文献３参照）。すなわち、ラミニン５の産生を促進することは、基底膜の構造が破壊されるような皮膚損傷の治癒を促す上で重要である。 Thus, since laminin 5 has high cell motility activity, it is known to promote cell movement in damaged skin and promote healing of damaged skin (see Patent Document 3). That is, promoting the production of laminin 5 is important in promoting healing of skin damage that destroys the structure of the basement membrane.
従来、ラミニン５を含有する皮膚外用剤（特許文献４参照）が知られており、また、ラミニン５産生促進作用を有するものとして、大豆抽出物（特許文献５参照）、フェニルプロパノイド類（特許文献６参照）、パントテン酸（特許文献７参照）、リゾホスファチジルコリン又はリゾホスファチジン酸（特許文献８参照）、コエンザイムＱ１０（特許文献９参照）等が知られている。
本発明は、安全性の高い天然物の中からヒアルロン酸合成酵素３ｍＲＮＡ発現促進作用、アクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進作用、又はラミニン５産生促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とするヒアルロン酸合成酵素３ｍＲＮＡ発現促進剤、アクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤、又はラミニン５産生促進剤を提供することを目的とする。 The present invention finds a highly safe natural product having hyaluronic acid synthase 3 mRNA expression promoting action, aquaporin 3 mRNA expression promoting action, serine palmitoyltransferase mRNA promoting action, or laminin 5 production promoting action. An object is to provide a hyaluronic acid synthase 3 mRNA expression promoter, aquaporin 3 mRNA expression promoter, serine palmitoyltransferase mRNA expression promoter, or laminin 5 production promoter as an active ingredient.
上記課題を解決するため、本発明のヒアルロン酸合成酵素３ｍＲＮＡ発現促進剤、アクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤及びラミニン５産生促進剤は、スターフルーツの葉部からの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。 In order to solve the above-mentioned problems, the hyaluronic acid synthase 3 mRNA expression promoter, aquaporin 3 mRNA expression promoter, serine palmitoyltransferase mRNA expression promoter and laminin 5 production promoter of the present invention are obtained by extracting an extract from the leaves of star fruit. It is contained as an active ingredient.
本発明によれば、天然物であるスターフルーツの葉部からの抽出物を有効成分として含有し、安全性に優れたヒアルロン酸合成酵素３ｍＲＮＡ発現促進剤、アクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤又はラミニン５産生促進剤を提供することができる。 According to the present invention, a hyaluronic acid synthase 3 mRNA expression promoter, aquaporin 3 mRNA expression promoter, serine palmitoyltransferase mRNA, which contains an extract from the leaf part of a natural star fruit as an active ingredient and is excellent in safety. An expression promoter or laminin 5 production promoter can be provided.
以下、本発明について説明する。
〔ヒアルロン酸合成酵素３ｍＲＮＡ発現促進剤，アクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤，セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤，ラミニン５産生促進剤〕
本発明のヒアルロン酸合成酵素３ｍＲＮＡ発現促進剤、アクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤又はラミニン５産生促進剤は、スターフルーツの葉部からの抽出物を有効成分として含有する。
The present invention will be described below.
[Hyaluronic acid synthase 3 mRNA expression promoter, aquaporin 3 mRNA expression promoter, serine palmitoyltransferase mRNA expression promoter, laminin 5 production promoter]
The hyaluronic acid synthase 3 mRNA expression promoter, aquaporin 3 mRNA expression promoter, serine palmitoyltransferase mRNA expression promoter or laminin 5 production promoter of the present invention contains an extract from the leaves of star fruit as an active ingredient.
ここで本発明において「スターフルーツの葉部からの抽出物」には、スターフルーツの葉部を抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。 Here, in the present invention, “the extract from the leaves of the star fruit” includes an extract obtained by using the leaves of the star fruit as an extraction raw material, a diluted or concentrated solution of the extract, and the extract obtained by drying. The obtained dried product, or any of these roughly purified products or purified products is included.
本発明において使用する抽出原料は、スターフルーツ（学名：Averrhoa carambola L.，別名：五斂子）である。 The extraction raw material used in the present invention is star fruit (scientific name: Averrhoa carambola L., also known as: Goshiko).
スターフルーツ（Averrhoa carambola L.）は、カタバミ科ゴレンシ属に属し、新鮮な果実は食用にされる。スターフルーツは、中国では紀元前から文献に記載され、果実の断面が星形であることからスターフルーツと呼ばれている。スターフルーツは、沖縄、中国東南部や雲南その他熱帯各地で栽培されており、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得る部位としては、葉部である。 Star fruit (Averrhoa carambola L.) belongs to the genus Carambola, and fresh fruit is edible. Star fruit has been described in China since the BC and is called star fruit because the cross section of the fruit has a star shape. Star fruit is cultivated in Okinawa, southeastern China, Yunnan and other tropical regions, and can be easily obtained from these regions. A part that can be used as an extraction raw material is a leaf.
スターフルーツの葉部からの抽出物に含有されるＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用又はラミニン５産生促進作用を有する物質の詳細は不明であるが、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって、スターフルーツの葉部からこれらの作用を有する抽出物を得ることができる。 Although details of substances having HAS3 mRNA expression promoting action, AQP3 mRNA expression promoting action, SPT mRNA expression promoting action or laminin 5 production promoting action contained in the extract from the leaf of star fruit are unknown, it is generally used for plant extraction By the extraction method currently used, the extract which has these effect | actions can be obtained from the leaf part of a star fruit.
例えば、上記植物を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより、ＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用又はラミニン５産生促進作用を有する抽出物を得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、スターフルーツの葉部の極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。 For example, after drying the plant, it is pulverized as it is or using a crusher, and subjected to extraction with an extraction solvent, thereby having a HAS3 mRNA expression promoting action, an AQP3 mRNA expression promoting action, an SPT mRNA expression promoting action or a laminin 5 production promoting action. An extract can be obtained. Drying may be performed in the sun or using a commonly used dryer. Moreover, after performing pretreatment, such as degreasing, with a nonpolar solvent such as hexane, it may be used as an extraction raw material. By performing pretreatment such as degreasing, the extraction treatment with the polar solvent of the leaves of the star fruit can be performed efficiently.
抽出溶媒としては、極性溶媒を使用するのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。 As the extraction solvent, it is preferable to use a polar solvent, and examples thereof include water and hydrophilic organic solvents. These are used alone or in combination of two or more at room temperature or a temperature below the boiling point of the solvent. It is preferable.
抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。 Examples of water that can be used as the extraction solvent include pure water, tap water, well water, mineral spring water, mineral water, hot spring water, spring water, fresh water, and the like, and those subjected to various treatments. Examples of the treatment applied to water include purification, heating, sterilization, filtration, ion exchange, osmotic pressure adjustment, buffering, and the like. Therefore, the water that can be used as the extraction solvent in the present invention includes purified water, hot water, ion-exchanged water, physiological saline, phosphate buffer, phosphate buffered saline, and the like.
抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。 Examples of hydrophilic organic solvents that can be used as extraction solvents include lower aliphatic alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol, propyl alcohol, and isopropyl alcohol; lower aliphatic ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; 1,3-butylene. Examples thereof include polyhydric alcohols having 2 to 5 carbon atoms such as glycol, propylene glycol and glycerin.
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０容量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０容量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０容量部に対して多価アルコール１０〜９０容量部を混合することが好ましい。 When using the liquid mixture of 2 or more types of polar solvents as an extraction solvent, the mixing ratio can be adjusted suitably. For example, when using a mixed solution of water and a lower aliphatic alcohol, it is preferable to mix 1 to 90 parts by volume of a lower aliphatic alcohol with respect to 10 parts by volume of water. When using a mixed solution, it is preferable to mix 1 to 40 parts by volume of a lower aliphatic ketone with 10 parts by volume of water, and when using a mixed solution of water and a polyhydric alcohol, water 10 It is preferable to mix 10 to 90 parts by volume of a polyhydric alcohol with respect to the volume part.
抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を抽出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。 The extraction treatment is not particularly limited as long as the soluble component contained in the extraction raw material can be eluted in the extraction solvent, and can be performed according to a conventional method. For example, the extraction raw material is immersed in an extraction solvent 5 to 15 times (mass ratio) of the extraction raw material, the soluble components are extracted at room temperature or under reflux, and then filtered to remove the extraction residue. A liquid can be obtained. The obtained extract is diluted, concentrated, dried, purified, etc. according to a conventional method in order to obtain a diluted or concentrated solution of the extract, a dried product of the extract, or a crude purified product or a purified product thereof. Processing may be performed.
精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。得られた抽出液はそのままでもＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤又はラミニン５産生促進剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。 Purification can be performed by, for example, activated carbon treatment, adsorption resin treatment, ion exchange resin treatment, or the like. The obtained extract can be used as an active ingredient of a HAS3 mRNA expression promoter, AQP3 mRNA expression promoter, SPT mRNA expression promoter, or laminin 5 production promoter as it is, but a concentrated solution or a dried product is used. It's easy to do.
スターフルーツの葉部からの抽出物は特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、皮膚化粧料又は飲食品に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。 Since the extract from the leaves of star fruit has a unique odor, it can be purified for the purpose of decolorization, deodorization, etc. within the range that does not cause a decrease in its physiological activity. Since it is not used in a large amount when blended into foods or foods, there is no practical problem even if it is not purified.
以上のようにして得られるスターフルーツの葉部からの抽出物は、ＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用又はラミニン５産生促進作用を有しているため、それぞれの作用を利用してＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤又はラミニン５産生促進剤の有効成分として用いることができる。 Since the extract from the leaf part of star fruit obtained as described above has HAS3 mRNA expression promoting action, AQP3 mRNA expression promoting action, SPT mRNA expression promoting action or laminin 5 production promoting action, each action is utilized. Then, it can be used as an active ingredient of a HAS3 mRNA expression promoter, AQP3 mRNA expression promoter, SPT mRNA expression promoter or laminin 5 production promoter.
また、スターフルーツの葉部からの抽出物は、上記ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、セラミドの合成を促進し、皮膚バリア機能を改善することができるため、皮膚バリア機能改善剤の有効成分としても用いることができる。具体的にはアトピー性皮膚炎等の炎症性疾患による皮膚バリア機能障害の予防、治療又は改善剤等の有効成分として用いることができる。さらに、スターフルーツの葉部からの抽出物は、上記ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、セラミドの合成を促進することができるため、セラミドの合成障害に起因する疾患（例えば、アトピー性皮膚炎等）の予防又は治療剤の有効成分としても用いることができる。 In addition, the extract from the leaf part of the star fruit can promote the synthesis of ceramide through the SPT mRNA expression promoting action and improve the skin barrier function, so it can be used as an active ingredient of the skin barrier function improving agent. Can do. Specifically, it can be used as an active ingredient such as a preventive, therapeutic or ameliorating agent for skin barrier dysfunction due to inflammatory diseases such as atopic dermatitis. Furthermore, since the extract from the leaf portion of star fruit can promote the synthesis of ceramide through the above-mentioned action of promoting the expression of SPT mRNA, it can prevent diseases caused by ceramide synthesis disorders (for example, atopic dermatitis). Alternatively, it can be used as an active ingredient of a therapeutic agent.
さらにまた、スターフルーツの葉部からの抽出物は、上記ラミニン５産生促進作用を通じて、皮膚の基底膜の再構築を誘導し、皮膚の基底膜の構造を正常化することができ、また皮膚の損傷の回復を促進することができるため、皮膚基底膜正常化剤又は皮膚損傷回復促進剤の有効成分としても用いることができる。また、かかるラミニン５産生促進作用を通じて、ラミニン５の欠乏（欠損）に起因する疾患（表皮水疱症等）の予防又は治療剤の有効成分としても用いることができる。 Furthermore, the extract from the leaf part of star fruit can induce remodeling of the skin basement membrane through the laminin 5 production promoting action, and can normalize the structure of the skin basement membrane. Since damage recovery can be promoted, it can also be used as an active ingredient of a skin basement membrane normalizing agent or a skin damage recovery promoting agent. Moreover, it can also be used as an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for diseases (such as epidermolysis bullosa) caused by laminin 5 deficiency (deficiency) through the laminin 5 production promoting action.
本発明のＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤又はラミニン５産生促進剤は、スターフルーツの葉部からの抽出物のみからなるものであってもよいし、上記抽出物を製剤化したものであってもよい。 The HAS3 mRNA expression promoter, AQP3 mRNA expression promoter, SPT mRNA expression promoter or laminin 5 production promoter of the present invention may consist of only an extract from the leaves of star fruit, It may be converted into one.
スターフルーツの葉部からの抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。スターフルーツの葉部からの抽出物は、他の組成物（例えば、皮膚化粧料等）に配合して使用することができるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。 The extract from the leaves of the star fruit can be any powder, granule, tablet, liquid, etc., using a pharmaceutically acceptable carrier such as dextrin and cyclodextrin and other optional auxiliaries according to conventional methods. It can be formulated into a dosage form. In this case, as an auxiliary agent, for example, an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant, a stabilizer, a flavoring agent and the like can be used. The extract from the leaf portion of star fruit can be used by blending it with other compositions (for example, skin cosmetics, etc.), and can also be used as an ointment, a liquid for external use, a patch, and the like.
なお、本発明のＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤又はラミニン５産生促進剤は、必要に応じて、ＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用又はラミニン５産生促進作用を有する他の天然抽出物を配合して有効成分として用いることができる。 The HAS3 mRNA expression promoting agent, AQP3 mRNA expression promoting agent, SPT mRNA expression promoting agent or laminin 5 production promoting agent of the present invention is a HAS3 mRNA expression promoting action, AQP3 mRNA expression promoting action, SPT mRNA expression promoting action or laminin 5 production as required. Other natural extracts having a promoting action can be blended and used as active ingredients.
本発明のＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤又はラミニン５産生促進剤の投与方法としては、一般に経皮投与、経口投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。また、本発明のＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤又はラミニン５産生促進剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。 Examples of the administration method of the HAS3 mRNA expression promoter, AQP3 mRNA expression promoter, SPT mRNA expression promoter or laminin 5 production promoter of the present invention include transdermal administration, oral administration, etc., depending on the type of disease, A suitable method for prevention / treatment or the like may be appropriately selected. In addition, the dose of the HAS3 mRNA expression promoter, AQP3 mRNA expression promoter, SPT mRNA expression promoter or laminin 5 production promoter of the present invention is appropriately determined depending on the type of disease, severity, individual differences among patients, administration method, administration period, etc. Just increase or decrease.
本発明のＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、スターフルーツの葉部からの抽出物が有するＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、ヒアルロン酸合成酵素３（ＨＡＳ３）の発現を促進することができるため、それによりヒアルロン酸の生成が促進され、皮膚の乾燥・萎縮、弾力性の低下、小じわの形成等の皮膚の老化症状を予防又は改善することができる。ただし、本発明のＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にもＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。 The HAS3 mRNA expression promoter of the present invention can promote the expression of hyaluronic acid synthase 3 (HAS3) through the HAS3 mRNA expression promoting action of the extract from the leaves of star fruit, thereby producing hyaluronic acid. Is promoted, and skin aging symptoms such as skin dryness / atrophy, reduced elasticity, and formation of fine lines can be prevented or improved. However, the HAS3 mRNA expression promoting agent of the present invention can be used for all purposes that are meaningful for exerting the HAS3 mRNA expression promoting action in addition to these uses.
本発明のＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、スターフルーツの葉部からの抽出物が有するＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、アクアポリン３（ＡＱＰ３）の発現を促進することができるため、皮膚の水分保持能やバリア機能を改善することができ、それにより皮膚の乾燥、しわの形成、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防又は改善することができる。ただし、本発明のＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にもＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。 Since the AQP3 mRNA expression promoter of the present invention can promote the expression of aquaporin 3 (AQP3) through the AQP3 mRNA expression promoting action of the extract from the leaves of the star fruit, the water retention ability and the barrier function of the skin can be achieved. It can be improved, thereby preventing or improving skin aging symptoms such as skin dryness, wrinkle formation, and reduced elasticity. However, the AQP3 mRNA expression promoter of the present invention can be used for all purposes other than these uses that are meaningful for exerting the AQP3 mRNA expression promoting action.
本発明のＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤は、スターフルーツの葉部からの抽出物が有するＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を通じて、セラミドの合成を促進することができ、これにより、しわ、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防又は改善することができるとともに、アトピー性皮膚炎等の炎症性疾患による皮膚バリア機能障害やアトピー性皮膚炎等のセラミド合成障害に起因する疾患を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明のＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤は、これらの用途以外にもＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。 The SPT mRNA expression promoter of the present invention can promote the synthesis of ceramide through the SPT mRNA expression promoting action of the extract from the leaves of star fruit, and thereby, skin aging such as wrinkles and reduced elasticity In addition to preventing or improving symptoms, it is possible to prevent, treat or improve diseases caused by skin barrier dysfunction due to inflammatory diseases such as atopic dermatitis or ceramide synthesis disorders such as atopic dermatitis. However, the SPT mRNA expression promoter of the present invention can be used for all purposes that are meaningful for exerting the SPT mRNA expression promoting action in addition to these uses.
本発明のラミニン５産生促進剤は、スターフルーツの葉部からの抽出物が有するラミニン５産生促進作用を通じて、ラミニン５の産生を促進することができる。これにより、基底膜構造の再構築を誘導し、しわ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等の皮膚の老化症状を予防又は改善したり、表皮水疱症等のラミニン５の欠乏（欠損）に起因する疾患を予防、治療又は改善したりすることができる。ただし、本発明のラミニン５産生促進剤は、これらの用途以外にもラミニン５産生促進作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。 The laminin 5 production promoter of the present invention can promote the production of laminin 5 through the laminin 5 production promoting action of the extract from the leaves of star fruit. This induces remodeling of the basement membrane structure to prevent or improve skin aging symptoms such as wrinkles, dullness, loss of texture, reduced elasticity, and laminin-5 deficiency (deficiency) such as epidermolysis bullosa It is possible to prevent, treat or ameliorate a disease caused by. However, the laminin 5 production promoter of the present invention can be used for all purposes that are meaningful for exerting a laminin 5 production promoting action in addition to these uses.
なお、本発明のＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進剤、ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進剤、ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進剤又はラミニン５産生促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。 Note that the HAS3 mRNA expression promoter, AQP3 mRNA expression promoter, SPT mRNA expression promoter or laminin 5 production promoter of the present invention is preferably applied to humans, as long as each effect is exhibited. It can also be applied to animals other than humans.
以下、試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。なお、下記試験例において、試料としてスターフルーツ葉部抽出物（丸善製薬社製，商品名：スターフルーツ葉抽出液，試料１）を使用した。 Hereinafter, although a test example is shown and this invention is demonstrated concretely, this invention is not restrict | limited to each following example at all. In the following test examples, a star fruit leaf extract (manufactured by Maruzen Pharmaceutical Co., Ltd., trade name: star fruit leaf extract, sample 1) was used as a sample.
〔試験例１〕ＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記スターフルーツ葉部抽出物（試料１）について、以下のようにしてＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
[Test Example 1] HAS3 mRNA expression promoting action test The above-mentioned starfruit leaf extract (sample 1) was tested for HAS3 mRNA expression promoting action as follows.
正常ヒト新生児***表皮角化細胞（normal human epidermal keratinocyte；ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（Epilife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。 Normal human epidermal keratinocytes (NHEK) were cultured in a growth medium (Epilife-KG2) for long-term culture of normal human epidermal keratinocytes in an 80 cm 2 flask at 37 ° C., 5% CO 2 -95% air. The cells were precultured under the above conditions and cells were collected by trypsin treatment.
回収した細胞を３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で、Epilife-KG2を用いて一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、Epilife-KG2で溶解した試料溶液（試料１，試料濃度：１２．５μｇ／ｍＬ）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat. No. 311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調製した。 The collected cells were seeded at 40 × 10 4 cells / 2 mL in a 35 mm petri dish (manufactured by FALCON), and cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 -95% air using Epilife-KG2. After 24 hours, the culture solution was discarded, and 2 mL of the sample solution (sample 1, sample concentration: 12.5 μg / mL) dissolved in Epilife-KG2 was added to each dish, and the temperature was changed to 37 ° C., 5% CO 2 -95% air. Cultured for 24 hours under the conditions. After culturing, the culture solution is discarded, and total RNA is extracted with ISOGEN (Nippon Gene, Cat. No. 311-02501), and the amount of each RNA is measured with a spectrophotometer so that it becomes 200 μg / mL. Total RNA was prepared.
この総ＲＮＡを鋳型とし、ＨＡＳ３（Hyaluronan Synthase 3）及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR Prime Script RT-PCR kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２Step RT-PCR反応により行った。ＨＡＳ３の発現量は、「試料無添加」で及び「試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに「試料無添加」の補正値を１００としたときの「試料添加」の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。 Using this total RNA as a template, the expression levels of HAS3 (Hyaluronan Synthase 3) and the internal standard GAPDH mRNA were measured. Detection was performed by real-time 2Step RT-PCR reaction using TaKaRa SYBR Prime Script RT-PCR kit (Perfect Real Time, code No. RR063A) using a real-time PCR device Smart cycler (Cepheid). The expression level of HAS3 was determined based on the total RNA preparation prepared from the cells cultured with “no sample added” and “added sample”, respectively, and a correction value was obtained from the GAPDH value. The correction value of “sample addition” when the correction value was 100 was calculated. From the obtained results, the HAS3 mRNA expression promotion rate (%) was calculated by the following formula.
ＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
上記式において、Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
HAS3 mRNA expression promotion rate (%) = A / B × 100
In the above formula, A represents “correction value when sample is added”, and B represents “correction value when sample is not added”.
上記試験の結果、スターフルーツ葉部抽出物（試料１）のＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進率は、１０８．９％であった。このように、スターフルーツ葉部抽出物は、優れたＨＡＳ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。 As a result of the above test, the HAAS3 mRNA expression promotion rate of the star fruit leaf extract (sample 1) was 108.9%. Thus, it was confirmed that the star fruit leaf extract has an excellent HAS3 mRNA expression promoting action.
〔試験例２〕ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記スターフルーツ葉部抽出物（試料１）について、以下のようにしてＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
[Test Example 2] AQP3 mRNA expression promoting action test The AQP3 mRNA expression promoting action was tested on the above-mentioned starfruit leaf extract (sample 1) as follows.
正常ヒト新生児***表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（Epilife-KG2）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。 Normal human newborn foreskin epidermal keratinocytes (NHEK) in a growth medium (Epilife-KG2) for long-term culture of normal human epidermal keratinocytes in an 80 cm 2 flask under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 -95% air. The cells were collected by pre-culture and trypsin treatment.
回収した細胞を３５ｍｍシャーレ（FALCON社製）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で、Epilife-KG2を用いて一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、Epilife-KG2で溶解した試料溶液（試料１，試料濃度：１２．５μｇ／ｍＬ）を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Cat. No. 311-02501）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調製した。 The collected cells were seeded at 40 × 10 4 cells / 2 mL in a 35 mm petri dish (manufactured by FALCON), and cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 -95% air using Epilife-KG2. After 24 hours, the culture solution was discarded, and 2 mL of the sample solution (sample 1, sample concentration: 12.5 μg / mL) dissolved in Epilife-KG2 was added to each dish, and the temperature was changed to 37 ° C., 5% CO 2 -95% air. Cultured for 24 hours under the conditions. After culturing, the culture solution is discarded, and total RNA is extracted with ISOGEN (Nippon Gene, Cat. No. 311-02501), and the amount of each RNA is measured with a spectrophotometer so that it becomes 200 μg / mL. Total RNA was prepared.
この総ＲＮＡを鋳型とし、ＡＱＰ３（aquaporin 3）及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR Prime Script RT-PCR kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２Step RT-PCR反応により行った。ＡＱＰ３の発現量は、「試料無添加」で及び「試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに「試料無添加」の補正値を１００としたときの「試料添加」の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。 Using this total RNA as a template, the expression levels of AQP3 (aquaporin 3) and internal standard GAPDH mRNA were measured. Detection was performed by real-time 2-step RT-PCR reaction using TaKaRa SYBR Prime Script RT-PCR kit (Perfect Real Time, code No. RR063A) using a real-time PCR device Smart Cycler (Cepheid). The expression level of AQP3 was determined based on the total RNA preparation prepared from the cells cultured with “no sample added” and “added sample”, respectively, and a correction value was obtained from the GAPDH value. The correction value of “sample addition” when the correction value was 100 was calculated. From the obtained results, the AQP3 mRNA expression promotion rate (%) was calculated by the following formula.
ＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
上記式において、Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
AQP3 mRNA expression promotion rate (%) = A / B × 100
In the above formula, A represents “correction value when sample is added”, and B represents “correction value when sample is not added”.
上記試験の結果、スターフルーツ葉部抽出物（試料１）のＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進率は、１２６．３％であった。このように、スターフルーツ葉部抽出物は、優れたＡＱＰ３ｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。 As a result of the above test, the AQP3 mRNA expression promotion rate of the star fruit leaf extract (sample 1) was 126.3%. Thus, it was confirmed that the star fruit leaf extract has an excellent AQP3 mRNA expression promoting action.
〔試験例３〕ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記スターフルーツ葉部抽出物（試料１）について、以下のようにしてＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を試験した。
[Test Example 3] SPT mRNA expression promoting action test The star fruit leaf extract (sample 1) was tested for SPT mRNA expression promoting action as follows.
正常ヒト新生児***表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を３５ｍｍのｄｉｓｈに播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養を行った。培養終了後、培地を所定濃度の試料添加培地（試料１，試料濃度：１２．５μｇ／ｍＬ）に交換し、さらに２４時間培養した。培養終了後、下記方法により総ＲＮＡを調製した。また、「試料無添加」で培養した細胞についても、同様にして総ＲＮＡを調製した。 Normal human neonatal foreskin keratinocytes (NHEK) were seeded in a 35 mm dish, and cultured for 24 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 -95% air. After completion of the culture, the medium was replaced with a sample-added medium having a predetermined concentration (sample 1, sample concentration: 12.5 μg / mL), and further cultured for 24 hours. After completion of the culture, total RNA was prepared by the following method. In addition, total RNA was prepared in the same manner for cells cultured with “no sample added”.
細胞を１ｍＬのＲＮＡ抽出用試薬（ＩＳＯＧＥＮ，ニッポンジーン社製）で溶解し、クロロホルムを２００μＬ添加後、遠心（１２０００回転，４℃，１５分間）にて上層ＲＮＡ層を単離し、さらにイソプロパノールで濃縮した。濃縮沈殿させた総ＲＮＡをＴＥ溶液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／１ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して総ＲＮＡ標品とし、ＰＣＲ装置（TaKaRa PCR Thermal Cycler MP，タカラバイオ社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（TaKaRa ExScript RT reagent Kit，RR035A，タカラバイオ社製）を用いてＳＰＴｍＲＮＡ発現量を測定するための鋳型に使用する一本鎖ＤＮＡを合成した。 Cells were lysed with 1 mL of RNA extraction reagent (ISOGEN, manufactured by Nippon Gene), 200 μL of chloroform was added, and the upper RNA layer was isolated by centrifugation (12,000 rpm, 4 ° C., 15 minutes), and further concentrated with isopropanol. . Concentrated and precipitated total RNA is dissolved in a TE solution (10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA, pH 8.0) to obtain a total RNA preparation. A PCR device (TaKaRa PCR Thermal Cycler MP, manufactured by Takara Bio Inc.) and real time A single-stranded DNA used as a template for measuring the expression level of SPT mRNA was synthesized using a PCR kit (TaKaRa ExScript RT reagent Kit, RR035A, manufactured by Takara Bio Inc.).
これを鋳型とし、ＳＰＴ及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Smart Cycler（Cepheid社製）を用いて、TaKaRa SYBR Prime Script RT-PCR kit（Perfect Real Time，code No. RR063A）によるリアルタイム２Step RT-PCR反応により行った。ＳＰＴの発現量は、「試料無添加」で及び「試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに「試料無添加」の補正値を１００としたときの「試料添加」の補正値を算出した。得られた結果から、下記式によりＳＰＴｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。 Using this as a template, the expression level of SPT and the internal standard GAPDH mRNA was measured. Detection was performed by real-time 2-step RT-PCR reaction using TaKaRa SYBR Prime Script RT-PCR kit (Perfect Real Time, code No. RR063A) using a real-time PCR device Smart Cycler (Cepheid). The expression level of SPT was calculated based on the total RNA preparation prepared from the cells cultured with “no sample added” and “added sample”, respectively. The correction value of “sample addition” when the correction value was 100 was calculated. From the obtained results, the SPT mRNA expression promotion rate (%) was calculated by the following formula.
ＳＰＴｍＲＮＡ発現促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
上記式において、Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
SPT mRNA expression promotion rate (%) = A / B × 100
In the above formula, A represents “correction value when sample is added”, and B represents “correction value when sample is not added”.
上記試験の結果、スターフルーツ葉部抽出物（試料１）のＳＰＴｍＲＮＡ発現促進率は、１１０．３％であった。このように、スターフルーツ葉部抽出物は、優れたＳＰＴｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。 As a result of the above test, the SPT mRNA expression promotion rate of the star fruit leaf extract (sample 1) was 110.3%. Thus, it was confirmed that the star fruit leaf extract has an excellent SPT mRNA expression promoting action.
〔試験例４〕ラミニン５産生促進作用試験
上記スターフルーツ葉部抽出物（試料１）について、以下のようにしてラミニン５産生促進作用を試験した。
[Test Example 4] Laminin 5 production promoting action test The star fruit leaf extract (sample 1) was tested for laminin 5 production promoting action as follows.
正常ヒト新生児***表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞培地（ＫＧＭ）を用いて３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０５個／ｍＬの細胞密度となるようにＫＧＭからＢＰＥを除いた培地（ＫＧＭ−ＢＰＥ）で希釈した後、２４ウェルプレートに１ウェルあたり５００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で一晩培養した。 Normal human neonatal foreskin keratinocytes (NHEK) were cultured in an 80 cm 2 flask using normal human epidermal keratinocyte medium (KGM) at 37 ° C., 5% CO 2 -95% air, and treated with trypsin. The cells were collected by The collected cells were diluted with a medium (KGM-BPE) obtained by removing BPE from KGM so that the cell density was 1.0 × 10 5 cells / mL, and then seeded at 500 μL per well in a 24-well plate. ° C., and cultured overnight under conditions of 5% CO 2 -95% air.
培養終了後、培地を抜き、ＫＧＭ−ＢＰＥで溶解した試料溶液（試料１，試料濃度１２．５μｇ／ｍＬ）を各ウェルに５００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で４８時間培養した。培養終了後、上清１００μＬをＥＬＩＳＡプレートに移し換え、３７℃で２時間プレートに吸着させた後、溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて洗浄を行った。 After completion of the culture, the medium was removed, and a sample solution (sample 1, sample concentration 12.5 μg / mL) dissolved in KGM-BPE was added to each well at 500 μL, and the conditions were 37 ° C., 5% CO 2 -95% air. The cells were cultured for 48 hours. After completion of the culture, 100 μL of the supernatant was transferred to an ELISA plate, adsorbed onto the plate at 37 ° C. for 2 hours, and then the solution was discarded, and phosphate physiological buffer (PBS-T) containing 0.05% Tween-20 was used. And washed.
その後、１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸生理緩衝液で、ブロッキング操作を行った。溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて洗浄を行い、抗ヒトラミニン５抗体（マウスＩｇＧ，ケミコン社製）を反応させた。溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて洗浄を行い、ビオチン化抗マウスＩｇ抗体（ヒツジＩｇＧ，アマシャム社製）を反応させた。溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて洗浄を行い、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体と反応させた後、溶液を捨て、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）にて洗浄を行い、発色反応を行った。得られた測定結果から、下記式によりラミニン５産生促進率（％）を算出した。 Thereafter, a blocking operation was performed with a phosphate physiological buffer containing 1% bovine serum albumin. The solution was discarded, washed with a phosphate physiological buffer solution (PBS-T) containing 0.05% Tween-20, and reacted with anti-human laminin 5 antibody (mouse IgG, manufactured by Chemicon). The solution was discarded, washed with a phosphate physiological buffer solution (PBS-T) containing 0.05% Tween-20, and reacted with a biotinylated anti-mouse Ig antibody (sheep IgG, manufactured by Amersham). The solution was discarded, washed with a phosphate physiological buffer solution (PBS-T) containing 0.05% Tween-20, and reacted with a streptavidin-peroxidase complex. Then, the solution was discarded and 0.05% Tween. The plate was washed with a phosphate physiological buffer solution (PBS-T) containing -20 to carry out a color reaction. From the obtained measurement results, the laminin 5 production promotion rate (%) was calculated by the following formula.
ラミニン５産生促進率(％)＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「試料添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度」を表し、Ｂは「試料無添加時の波長４０５ｎｍにおける吸光度」を表す。
Laminin 5 production promotion rate (%) = A / B × 100
In the formula, A represents “absorbance at a wavelength of 405 nm when a sample is added”, and B represents “absorbance at a wavelength of 405 nm when no sample is added”.
上記試験の結果、スターフルーツ葉部抽出物（試料１）のラミニン５産生促進率は、１１３．０％であった。このように、スターフルーツ葉部抽出物は、優れたラミニン５産生促進作用を有することが確認された。 As a result of the above test, the laminin 5 production promotion rate of the star fruit leaf extract (sample 1) was 113.0%. Thus, it was confirmed that the star fruit leaf extract has an excellent laminin 5 production promoting action.
本発明のヒアルロン酸合成酵素３ｍＲＮＡ発現促進剤、アクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤、セリンパルミトイルトランスフェラーゼｍＲＮＡ発現促進剤及びラミニン５産生促進剤は、皮膚の老化症状等の予防又は改善に大きく貢献できる。 The hyaluronic acid synthase 3 mRNA expression promoter, aquaporin 3 mRNA expression promoter, serine palmitoyltransferase mRNA expression promoter and laminin 5 production promoter of the present invention can greatly contribute to the prevention or improvement of skin aging symptoms and the like.
Claims (4)
Priority Applications (1)
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