JP2009183162A - New enterobacter aerogenes strain and its utilization - Google Patents

New enterobacter aerogenes strain and its utilization Download PDF

Info

Publication number
JP2009183162A
JP2009183162A JP2008024018A JP2008024018A JP2009183162A JP 2009183162 A JP2009183162 A JP 2009183162A JP 2008024018 A JP2008024018 A JP 2008024018A JP 2008024018 A JP2008024018 A JP 2008024018A JP 2009183162 A JP2009183162 A JP 2009183162A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
strain
glycerol
raw material
enterobacter aerogenes
liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2008024018A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JP5196423B2 (en
Inventor
Naomichi Nishio
尚道 西尾
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hiroshima University NUC
Original Assignee
Hiroshima University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hiroshima University NUC filed Critical Hiroshima University NUC
Priority to JP2008024018A priority Critical patent/JP5196423B2/en
Publication of JP2009183162A publication Critical patent/JP2009183162A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP5196423B2 publication Critical patent/JP5196423B2/en
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new Enterobacter aerogenes strain which can efficiently produce hydrogen and ethanol from a biodiesel waste liquid, and to provide its utilization. <P>SOLUTION: Provided is the Enterobacter aerogenes HU201 strain and the Enterobacter aerogenes HU202 strain which each can treat high concentration of glycerol-containing biodiesel waste liquids in soil, river water or the like sampled from various lands. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、植物性油脂、動物性油脂、廃油等の油脂をメチルエステル化してバイオディーゼル燃料を製造する際に副生成物として得られる、いわゆるバイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを効率良く製造することができる新規エンテロバクター・アエロゲネス菌株、および上記菌株を用いて水素およびエタノールを効率良く製造する方法、並びに当該方法を行なうために用いられるキットに関するものである。   The present invention efficiently produces hydrogen and ethanol from so-called biodiesel waste liquor obtained as a by-product when producing biodiesel fuel by methyl esterification of fats such as vegetable oils, animal fats and waste oils. The present invention relates to a novel Enterobacter aerogenes strain that can be used, a method for efficiently producing hydrogen and ethanol using the strain, and a kit used for performing the method.

バイオディーゼル燃料(BDF)は植物性油脂、動物性油脂、および廃油等の油脂をリパーゼの存在下でメタノールと反応（メタノリシス反応）させることにより得られる脂肪酸メチルエステルのことであり、軽油代替エネルギーとして車、船、自家発電用燃料など様々な用途が期待されている。特に、植物から製造されるBDFは、カーボンニュートラルが成立するため、地表圏上のCO2の絶対量を増加させないこと、排ガス中に硫黄酸化物（SOｘ）を殆ど排出されないこと、S.P.M (Suspended Particulate Matter)の排出量が従来のBDFの１／３程度に抑えられること等の利点を有している。 Biodiesel fuel (BDF) is a fatty acid methyl ester obtained by reacting oils such as vegetable oils, animal oils, and waste oils with methanol in the presence of lipase (methanolysis reaction). Various uses such as fuel for cars, ships and private power generation are expected. In particular, BDF produced from plants has carbon neutrality, so it does not increase the absolute amount of CO 2 on the surface sphere, it emits almost no sulfur oxide (SOx) in the exhaust gas, SPM (Suspended Particulate Matter) has an advantage that the discharge amount is suppressed to about 1/3 of the conventional BDF.

バイオディーゼル燃料の生産には、現在化学触媒法(水酸化カリウムなどのアルカリを原料に混ぜ合わせて反応させる)が主に利用されている。しかし、この方法では高濃度グリセロール含有廃液（バイオディーゼル廃液）が副産物として同時に生成され、その処理が問題となっている。一方、そのような欠点を改善し、環境に負荷をかけない生産法として酵素触媒法があるが、この方法は酵素生成のコストが高く、実用化に至っていない。   For the production of biodiesel fuel, the chemical catalyst method (reacted by mixing an alkali such as potassium hydroxide with the raw material) is currently mainly used. However, in this method, a high-concentration glycerol-containing waste liquid (biodiesel waste liquid) is simultaneously generated as a by-product, and its treatment becomes a problem. On the other hand, there is an enzyme catalyst method as a production method that improves such drawbacks and does not place a burden on the environment. However, this method has a high cost for enzyme production and has not been put into practical use.

上記現状に鑑みて、上記グリセロール含有廃液の有効利用を行うべく、上記廃液から水素を回収する方法の開発が試みられている。例えば、特許文献１においては副生成物であるグリセロールを加熱気化させて水素ガスを発生させ回収する装置について記載されている。しかし、この方法は、加熱気化に相当量の熱量を必要とし、コスト面等に問題を有している。   In view of the present situation, in order to effectively use the glycerol-containing waste liquid, development of a method for recovering hydrogen from the waste liquid has been attempted. For example, Patent Document 1 describes an apparatus for generating and recovering hydrogen gas by heating and vaporizing glycerol as a by-product. However, this method requires a considerable amount of heat for vaporization by heating, and has a problem in cost.

一方、通性嫌気性細菌エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）は、グルコース等から水素を発酵生産することが知られている（非特許文献１参照）。また、本発明者らは、独自に分離したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株が、市販グリセロールを基質として発酵させた時に、最大の水素生産量が得られることを確認している（非特許文献２参照）。さらに、本発明者らは、上記ＨＵ１０１株を固定可能な多孔質担体を用いることにより、バイオディーゼル廃液を原料とした場合でも、水素生産速度を向上させることが可能であることを確認している（特許文献２参照）。
谷生 重晴ら、「Enterobacter aerogenes の発酵水素発生と利用基質について」、醗酵工学会誌、第６７巻、第１号、ｐ２９−３４、１９８９ Y. Nakashimada, M.A. Rachman, T. Kakizono, N. Nishio, "Hydrogen production of Enterobacter aerogenes altered by extracellular and intracellular redox states" International Journal of Hydrogen Energy 27(2002),1399-1405 特開２００４−２０９４１５号公報（公開日：平成１６年７月２９日） 特開２００６−１８０７８２号公報（公開日：平成１８年７月１３日） On the other hand, facultative anaerobic bacteria Enterobacter aerogenes are known to fermentatively produce hydrogen from glucose or the like (see Non-Patent Document 1). In addition, the present inventors have confirmed that the enterobacter aerogenes HU101 strain, which has been independently isolated, can obtain the maximum hydrogen production when fermented using commercially available glycerol as a substrate (non-existing). Patent Document 2). Furthermore, the present inventors have confirmed that by using a porous carrier capable of fixing the HU101 strain, it is possible to improve the hydrogen production rate even when biodiesel waste liquid is used as a raw material. (See Patent Document 2).
Shigeharu Tanio et al., “Generation of Fermentative Hydrogen and Substrates for Utilization of Enterobacter aerogenes”, Journal of Fermentation Engineering, Vol. 67, No. 1, p29-34, 1989 Y. Nakashimada, MA Rachman, T. Kakizono, N. Nishio, "Hydrogen production of Enterobacter aerogenes altered by extracellular and intracellular redox states" International Journal of Hydrogen Energy 27 (2002), 1399-1405 JP 2004-209415 A (publication date: July 29, 2004) JP 2006-180782 A (publication date: July 13, 2006)

しかしながら、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株が資化できるグリセロール濃度は１０〜２０ｇ／ｌであり、それ以上の濃度下では水素を安定に生産することはできていなかった。バイオディーゼル廃液に含まれるグリセロールの濃度が約４００〜４５０ｇ／ｌであることに鑑みると、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株で処理するためには、上記廃液を４０倍近く希釈しなければならないため、処理効率をさらに向上させることが望まれている。   However, the glycerol concentration that can be assimilated by Enterobacter aerogenes HU101 strain is 10 to 20 g / l, and hydrogen could not be stably produced at concentrations higher than that. Considering that the concentration of glycerol contained in the biodiesel waste liquid is about 400 to 450 g / l, in order to treat with Enterobacter aerogenes HU101 strain, the waste liquid must be diluted nearly 40 times. Therefore, it is desired to further improve the processing efficiency.

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを効率良く製造することができる新規エンテロバクター・アエロゲネス菌株およびその利用を提供することにある。   The present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide a novel Enterobacter aerogenes strain capable of efficiently producing hydrogen and ethanol from biodiesel waste liquid and use thereof. is there.

本発明者は、様々な土地からサンプリングした土壌、川の水等から、より高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液を処理できる細菌を鋭意探索した。その結果、新規エンテロバクター・アエロゲネス菌株であるエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株が、バイオディーゼル廃液を５〜６倍希釈して調製した、グリセロール濃度が７５ｇ／ｌという高濃度の原料液中でも生育でき、水素およびエタノールを安定的に生産可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。   The present inventor has eagerly searched for bacteria capable of treating biodiesel waste liquid containing a higher concentration of glycerol from soil sampled from various lands, river water, and the like. As a result, the new Enterobacter aerogenes strains Enterobacter aerogenes HU201 and Enterobacter aerogenes HU202 strains were prepared by diluting biodiesel waste solution 5 to 6 times. Was able to grow even in a high concentration raw material solution of 75 g / l, and it was found that hydrogen and ethanol could be stably produced, and the present invention was completed.

本発明は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株（以下、単に「ＨＵ２０１菌株」とも称する）に係るものであることを特徴としている。また、本発明は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株（以下、単に「ＨＵ２０２菌株」とも称する）に係るものであることを特徴としている。   The present invention is characterized in that it relates to Enterobacter aerogenes HU201 strain (hereinafter also simply referred to as “HU201 strain”). Further, the present invention is characterized in that it relates to Enterobacter aerogenes HU202 strain (hereinafter also simply referred to as “HU202 strain”).

エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株は、バイオディーゼル廃液を含む原料液を用いる場合、水素の生産効率を高めるためには多孔質担体に固定する必要があった。一方、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、バイオディーゼル廃液を含む原料液であっても、多孔質担体に固定する必要はなく、しかも高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを生産することができる。   Enterobacter aerogenes HU101 strain had to be fixed to a porous carrier in order to increase hydrogen production efficiency when using a raw material liquid containing biodiesel waste liquid. On the other hand, the Enterobacter aerogenes HU201 strain and the Enterobacter aerogenes HU202 strain do not need to be fixed to the porous carrier even if it is a raw material liquid containing biodiesel waste liquid, and the concentration is high. Hydrogen and ethanol can be produced from glycerol-containing biodiesel wastewater.

それゆえ、バイオディーゼル廃液の希釈率を従来よりも格段に低くすることができ、高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの生産効率を簡便かつ飛躍的に向上させることができる。したがって、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株を用いる場合よりも、さらにバイオディーゼル廃液の有効利用を図ることができるといえる。   Therefore, the dilution rate of the biodiesel waste liquid can be made much lower than before, and the production efficiency of hydrogen and ethanol from the high-concentration glycerol-containing biodiesel waste liquid can be easily and dramatically improved. Therefore, it can be said that the biodiesel waste liquid can be used more effectively than when the Enterobacter aerogenes HU101 strain is used.

本発明に係る菌株は、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含み、グリセロール濃度が５０ｇ／ｌである原料液中のグリセロールを１５g／ｌ以上資化できることが好ましい。なお、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含む原料液を、以下、単に「原料液」という場合がある。   The strain according to the present invention includes biodiesel waste liquid obtained by removing methyl ester from a product obtained by methyl esterification of fats and oils, and glycerol in a raw material liquid having a glycerol concentration of 50 g / l is 15 g / l or more. Preferably it can be assimilated. In addition, the raw material liquid containing the biodiesel waste liquid obtained by removing methyl ester from a product obtained by methyl esterification of fats and oils may be simply referred to as “raw material liquid” hereinafter.

エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株は、グリセロール濃度が１０〜２０ｇ／ｌの原料液しか資化できず、グリセロール濃度が５０ｇ／ｌである原料液中での生育は困難であった。上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株は、グリセロール濃度が５０ｇ／ｌである原料液中でも十分に生育でき、しかも原料液中のグリセロールを１５g／ｌ以上資化できる。それゆえ、バイオディーゼル廃液を効率的に利用することができる。   The Enterobacter aerogenes HU101 strain could only assimilate a raw material solution having a glycerol concentration of 10 to 20 g / l, and was difficult to grow in the raw material solution having a glycerol concentration of 50 g / l. The HU201 strain and HU202 strain can sufficiently grow even in a raw material solution having a glycerol concentration of 50 g / l, and can further assimilate 15 g / l or more of glycerol in the raw material solution. Therefore, the biodiesel waste liquid can be used efficiently.

本発明に係るグリセロール資化剤は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を含有することが好ましい。   The glycerol assimilating agent according to the present invention preferably contains Enterobacter aerogenes HU201 strain and / or Enterobacter aerogenes HU202 strain.

上述のように、これらの本発明に係る菌株は、従来よりもはるかに高濃度のグリセロールを含有する原料液から、安定的に水素およびエタノールを生産することができる。したがって、上記構成によれば、従来廃棄されていたバイオディーゼル廃液の有効利用を図ることができる。   As described above, these strains according to the present invention can stably produce hydrogen and ethanol from a raw material solution containing a much higher concentration of glycerol than before. Therefore, according to the said structure, the effective utilization of the biodiesel waste liquid conventionally discarded can be aimed at.

本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、上記原料液を、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株によって発酵させる発酵工程を含むことが好ましい。   The method for producing hydrogen and ethanol according to the present invention uses, as a raw material liquid, a biodiesel waste liquid obtained by removing methyl ester from a product obtained by methyl esterification of fats and oils. It preferably comprises a fermentation step, fermented by the strains of Enterobacter aerogenes HU201 and / or Enterobacter aerogenes HU202.

上記バイオディーゼル廃液は、その大部分がグリセロールである。エンテロバクター（Enterobacter）属細菌は、そのグリセロールを利用して水素およびエタノールを発酵生産することができる。そして、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、グリセロールを高濃度に含有するバイオディーゼル廃液を含む原料液中でも生育でき、グリセロールを資化して水素およびエタノールを生産することができる。   Most of the biodiesel waste liquid is glycerol. Enterobacter bacteria can produce hydrogen and ethanol by fermentation using the glycerol. The Enterobacter aerogenes HU201 strain and the Enterobacter aerogenes HU202 strain can also grow in a raw material liquid containing a biodiesel waste liquid containing a high concentration of glycerol. Ethanol can be produced.

したがって、上記構成によれば、バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの発酵生産の効率を従来法に比して格段に向上させることができる。   Therefore, according to the said structure, the efficiency of the hydrogen and ethanol fermentation production from a biodiesel waste liquid can be improved significantly compared with the conventional method.

本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、上記原料液がコーンスティープリカーを含有することが好ましい。   In the method for producing hydrogen and ethanol according to the present invention, the raw material liquid preferably contains corn steep liquor.

後述する実施例に示すように、コーンスティープリカー（以下「ＣＳＬ」称する）を原料液に含有させることによって、グリセロール濃度９０ｇ／ｌという、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の生育が通常確認できなかった高濃度の原料液中であってもエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を生育させることが可能となる。それゆえ、上記構成によれば、バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの発酵生産の効率をさらに飛躍的に向上させることができる。   As shown in Examples to be described later, by containing corn steep liquor (hereinafter referred to as “CSL”) in the raw material liquid, the growth of Enterobacter bacteria having a glycerol concentration of 90 g / l was not normally confirmed. Enterobacter aerogenes HU201 strain and Enterobacter aerogenes HU202 strain can be grown even in a high concentration raw material solution. Therefore, according to the above configuration, the efficiency of fermentation production of hydrogen and ethanol from the biodiesel waste liquid can be further improved dramatically.

本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、上記原料液のグリセロール濃度が２０ｇ／ｌを超えることが好ましい。   In the method for producing hydrogen and ethanol according to the present invention, the glycerol concentration of the raw material liquid is preferably over 20 g / l.

エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株を用いた従来の方法では、グリセロール濃度が２０ｇ／ｌを超える原料液を資化することはできなかった。上記構成によれば、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株が高濃度のグリセロールを含有する原料液中でも生育可能であるため、グリセロール濃度が２０ｇ／ｌを超えていても、原料液を十分に資化し、水素およびエタノールを生産することができる。よって、バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの発酵生産の効率を向上させることができる。   In the conventional method using Enterobacter aerogenes HU101 strain, it was not possible to assimilate a raw material solution having a glycerol concentration exceeding 20 g / l. According to the above configuration, the Enterobacter aerogenes HU201 strain and the Enterobacter aerogenes HU202 strain can grow in a raw material solution containing a high concentration of glycerol, so that the glycerol concentration is 20 g / l. However, the raw material liquid can be sufficiently assimilated to produce hydrogen and ethanol. Therefore, the efficiency of fermentation production of hydrogen and ethanol from the biodiesel waste liquid can be improved.

本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、上記発酵工程において、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．５以上７．５以下に保持することが好ましい。原料液を発酵させると、水素およびエタノール以外に、主に１，３−プロパンジオールからなる有機酸が多量に生成し、グリセロールの円滑な資化を妨げる傾向が見られる。上記構成によれば、原料液および／または発酵液のｐＨが中性付近に保たれるため、有機酸の影響を回避することができ、水素およびエタノールの発酵生産の効率をさらに向上させることができる。   In the method for producing hydrogen and ethanol according to the present invention, in the fermentation step, the pH of the raw material liquid and / or the fermentation liquid obtained by the fermentation is preferably maintained at 6.5 or more and 7.5 or less. When the raw material liquid is fermented, a large amount of an organic acid mainly composed of 1,3-propanediol is generated in addition to hydrogen and ethanol, and a tendency to hinder smooth assimilation of glycerol is observed. According to the above configuration, since the pH of the raw material liquid and / or the fermentation liquid is kept in the vicinity of neutrality, the influence of organic acids can be avoided, and the efficiency of hydrogen and ethanol fermentation production can be further improved. it can.

本発明に係る水素およびエタノールの製造方法を行うためのキットは、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株、並びに上記菌株を培養可能な培地が含まれることが好ましい。   The kit for carrying out the method for producing hydrogen and ethanol according to the present invention comprises Enterobacter aerogenes HU201 strain and / or Enterobacter aerogenes HU202 strain, and a medium capable of culturing the strain. It is preferably included.

上記本発明にかかるキットによれば、バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを効率良く、且つ簡便に生産することができるという効果を奏する。   According to the kit of the present invention, there is an effect that hydrogen and ethanol can be efficiently and easily produced from biodiesel waste liquid.

本発明は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株に係るものである。また、本発明は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株に係るものである。これらの菌株は、高濃度でグリセロールを含有するバイオディーゼル廃液を含む原料液を資化することができる。それゆえ、高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液からの水素およびエタノールの生産効率を簡便かつ飛躍的に向上させることができるという効果を奏する。   The present invention relates to Enterobacter aerogenes HU201 strain. The present invention also relates to Enterobacter aerogenes HU202 strain. These strains can assimilate raw material liquids including biodiesel waste liquids containing glycerol at high concentrations. Therefore, the production efficiency of hydrogen and ethanol from a high-concentration glycerol-containing biodiesel waste liquid can be improved easily and dramatically.

水素は燃料電池用の燃料としてその利用が期待されており、またエタノールも燃料、溶媒として広範囲に利用されているものである。よって本発明は、植物性油脂、動物性油脂を始めとするバイオマスを無駄にすることなく、有効に利用することができる菌株およびこれを用いた水素およびエタノールの製造方法を提供することができる。   Hydrogen is expected to be used as a fuel for fuel cells, and ethanol is also widely used as a fuel and solvent. Therefore, the present invention can provide a strain that can be used effectively without wasting biomass such as vegetable oils and animal fats and a method for producing hydrogen and ethanol using the same.

本発明の実施の形態について説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。   An embodiment of the present invention will be described as follows, but the present invention is not limited to this.

〔１．本発明に係る菌株〕
本発明に係る菌株であるエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、本発明者らが自然界から独自に分離した菌株であり、検討の結果、高濃度でグリセロールを含むバイオディーゼル廃液を資化することができることを見出したものである。そこで、まず、これらの菌株について具体的に説明する。 [1. Strains according to the present invention]
The strains Enterobacter aerogenes HU201 and Enterobacter aerogenes HU202, which are strains according to the present invention, are strains independently isolated from nature by the present inventors. It has been found that biodiesel waste liquid containing glycerol at a concentration can be assimilated. First, these strains will be specifically described.

（１）形態的性質および培養的性質
表１に示す培地に生育したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の形態的性質および培養的性質を説明する。 (1) Morphological and cultural properties The morphological and cultural properties of Enterobacter aerogenes HU201 and HU202 strains grown in the medium shown in Table 1 will be described.

上記ＨＵ２０１菌株、ＨＵ２０２菌株ともに、形態的には桿菌であり、表１に示す培地を用いて３７℃で３日間培養後のコロニーは直径０．５ｍｍの円形で、色調は白色であった。コロニーの***状態は半球状、周縁は全縁、表面の形状はスムーズで、透明度は半透明、粘稠性を有していた。培地の混濁状態は白濁であった。コロニーの形態の多型性としては、変異によるコロニー形態の変化はなく、培養条件や生理的状態によるコロニー形態の変化もなかった。運動性を有し、鞭毛の着生状態は周毛状である。また、胞子は有さない。   Both the HU201 strain and HU202 strain were gonococcal in shape, and the colonies after culturing at 37 ° C. for 3 days using the medium shown in Table 1 were circular with a diameter of 0.5 mm, and the color tone was white. The raised state of the colony was hemispherical, the peripheral edge was the whole edge, the surface shape was smooth, the transparency was translucent and viscous. The turbidity of the medium was cloudy. As the polymorphism of the colony form, there was no change in the colony form due to the mutation, and there was no change in the colony form due to the culture conditions and physiological conditions. It has motility, and the flagellar state is pericytes. There are no spores.

図１（ａ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株の形態を撮影した写真であり、図１（ｂ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の形態を撮影した写真である。上記ＨＵ２０１菌株、ＨＵ２０２菌株の培養液を数μｌプレパラートに垂らし、カバーガラスを被せ、顕微鏡(Nikon ： E600W、倍率１０００倍)を用いて形態観察を行なった。上記ＨＵ２０１菌株、ＨＵ２０２菌株はともに桿状であり、長さは約１μｍであった。   FIG. 1 (a) is a photograph of the morphology of Enterobacter aerogenes HU201 strain, and FIG. 1 (b) is a photograph of the morphology of Enterobacter aerogenes HU202 strain. is there. The culture solutions of the HU201 strain and HU202 strain were hung on a few μl preparation, covered with a cover glass, and observed for morphology using a microscope (Nikon: E600W, magnification 1000 times). Both the HU201 strain and the HU202 strain were rod-shaped and had a length of about 1 μm.

図２は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の比増殖速度を解析した結果を示すものである。   FIG. 2 shows the result of analyzing the specific growth rate of Enterobacter aerogenes HU201 strain and HU202 strain.

表１に示す培地を蒸留水で１０倍希釈し、対数増殖期が終わるまで、吸光光度計（島津分光高度計 UV-1600）で、ＯＤ６００を測定し菌体濃度の指標とした。結果を図２に示した。   The medium shown in Table 1 was diluted 10-fold with distilled water, and OD600 was measured with an absorptiometer (Shimadzu spectrophotometer UV-1600) until the logarithmic growth phase was completed, and used as an indicator of cell concentration. The results are shown in FIG.

図３は、図２に示す結果を基に、対数増殖期におけるＯＤ値の対数を取りプロットしたものである。図３に示される２本の検量線のうち、下方の検量線は、式１で表される。
ｙ＝０．１９８ｘ−３．５２（ｘ：ｔｉｍｅ、Ｒ2＝０．９９３）・・・（１）
また、上方の検量線は式２で表される。
ｙ＝０．１８６ｘ−３．０９（ｘ：ｔｉｍｅ、Ｒ2＝０．９６３）・・・（２）
式１で表されるグラフの傾きより、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株の比増殖速度を０．１９８ｈ-1、式２で表されるグラフの傾きより、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の比増殖速度を０．１８６ｈ-1と決定した。 FIG. 3 is a plot of the logarithm of the OD value in the logarithmic growth phase based on the results shown in FIG. Of the two calibration curves shown in FIG. 3, the lower calibration curve is expressed by Equation 1.
y = 0.198x−3.52 (x: time, R 2 = 0.993) (1)
The upper calibration curve is expressed by Equation 2.
y = 0.186x−3.09 (x: time, R 2 = 0.963) (2)
From the slope of the graph represented by Formula 1, the specific growth rate of Enterobacter aerogenes HU201 strain is 0.198 h −1 , and from the slope of the graph represented by Formula 2, Enterobacter aerogenes (Enterobacter aerogenes) ) The specific growth rate of HU202 strain was determined to be 0.186 h −1 .

（２）生理学的性質
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の生理学的性質は、表２に示すとおりである。 (2) Physiological Properties Table 2 shows the physiological properties of Enterobacter aerogenes HU201 and HU202 strains.

なお、表２では、表２に記載した性質を有する場合を「＋」、有さない場合を「−」で表している。   In Table 2, the case of having the properties described in Table 2 is represented by “+”, and the case of not having the properties is represented by “−”.

（３）新種の特徴を示すために必要な性質
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の特徴を示すために必要な性質は、表３に示すとおりである。 (3) Properties required to show characteristics of new species Properties required to show the characteristics of Enterobacter aerogenes HU201 and HU202 strains are as shown in Table 3.

なお、表３では、表３に記載した性質を有する場合を「＋」、有さない場合を「−」で表している。   In Table 3, “+” indicates that the properties described in Table 3 are provided, and “−” indicates that the properties are not included.

（４）化学分類学的性質
エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の化学分類学的性質として、例えば以下のものを挙げることができる。 (4) Chemical taxonomic properties Examples of the chemical taxonomic properties of Enterobacter aerogenes HU201 and HU202 strains include the following.

エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の近縁菌種とのDNA-DNA 相同性としては、１６S rRNA遺伝子の相同性が、Enterobacter aerogensesと９８%、Enterobacter amnigenseと９７%、Enterobacter asburiaeと９８%、Enterobacter gergoviaeと９６%、Enterobacter hormaecheiと９７%、 Enterobacter intermediusと９７%、Enterobacter sakazakiiと９６%である。   The DNA-DNA homology with Enterobacter aerogenes HU201 and closely related strains of HU202 is 16S rRNA gene homology with Enterobacter aerogenses 98%, Enterobacter amnigense 97%, Enterobacter asburiae And 98%, Enterobacter gergoviae and 96%, Enterobacter hormaechei and 97%, Enterobacter intermedius and 97%, and Enterobacter sakazakii and 96%.

なお、上記エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株は、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１４９２として寄託されている（寄託日：平成２０年１月２５日）。エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センターにおいて、ＦＥＲＭ ＡＰ−２１４９３として寄託されている（寄託日：平成２０年１月２５日）。   The Enterobacter aerogenes HU201 strain has been deposited as FERM AP-21492 in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (Deposit date: January 25, 2008). . Enterobacter aerogenes HU202 strain has been deposited as FERM AP-21493 in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (Deposit date: January 25, 2008).

（５）本発明に係る菌株の単離方法
まず、福井県敦賀市の砂浜、砂浜付近松林、広島大学構内等からサンプリングした土壌及び余剰汚泥をリン酸バッファーで１０倍希釈して、５分間振盪後、静置した。この際に分離した上清をサンプル微生物含有液とした。また、広島県内河川水の場合は、そのままサンプル微生物含有液とした。 (5) Isolation method of strain according to the present invention First, soil sampled from sandy beach in Tsuruga City, Fukui Prefecture, pine forest near sandy beach, Hiroshima University campus etc. and excess sludge were diluted 10 times with phosphate buffer and shaken for 5 minutes After that, it was left to stand. The supernatant separated at this time was used as a sample microorganism-containing solution. In the case of river water in Hiroshima Prefecture, the sample microorganism-containing liquid was used as it was.

次に、試験管に、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの８ｍｌに炭素源としての市販のグリセロール（シグマアルドリッチジャパン製）１ｍｌを加えたもの（以下「液体培地」という）を入れ、上記サンプル微生物含有液１ｍｌを、それぞれ接種し、３７℃、１２０ｒｐｍ、嫌気条件下で振とう培養した。サンプル微生物含有液の対照としては、上記液体培地を１０００倍希釈したものを用いた。上記液体培地中のグリセロール濃度は、５０ｇ／ｌである。   Next, in a test tube, 8 ml of the synthetic medium shown in Table 1 with glycerol removed and 1 ml of commercially available glycerol (manufactured by Sigma Aldrich Japan) as a carbon source (hereinafter referred to as “liquid medium”) are placed. 1 ml of the sample microorganism-containing solution was inoculated and cultured under shaking at 37 ° C., 120 rpm under anaerobic conditions. As a control for the sample microorganism-containing liquid, a solution obtained by diluting the liquid medium 1000 times was used. The concentration of glycerol in the liquid medium is 50 g / l.

上記液体培地は、１２０℃で１５分間オートクレーブを用いて滅菌後に使用したが、オートクレーブする際、培地中に炭素源、リン酸塩、マグネシウム塩が同時に存在すると培地が褐変するため、炭素源、リン酸塩、マグネシウム塩をそれぞれ別々に調製し、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたものを滅菌後に、シリンジで嫌気的に混合した。プレート培地は上記液体培地に２％の寒天粉末を添加して作成した。なお、嫌気条件を得るために培地を１００℃、１５分煮沸した後、氷浴にて急冷しながら窒素ガスを吹き込み、脱気を行った。   The above liquid medium was used after sterilization with an autoclave at 120 ° C. for 15 minutes, but when autoclaving, if the carbon source, phosphate, and magnesium salt are simultaneously present in the medium, the medium browns. Acid salts and magnesium salts were prepared separately, and the synthetic medium shown in Table 1 except glycerol was sterilized and then mixed anaerobically with a syringe. The plate medium was prepared by adding 2% agar powder to the liquid medium. In order to obtain anaerobic conditions, the medium was boiled at 100 ° C. for 15 minutes, and then degassed by blowing nitrogen gas while quenching in an ice bath.

３７℃で５日間培養後、ロールチューブ法を用いてコロニーの形状、色等を確認した。ロールチューブ法は、ブチルゴム栓付きの試験管を用い、無酸素の混合ガス（水素：窒素：二酸化炭素など）を噴射させて、酸素を遮断しながら微生物を試験管などに分注し、検査する方法である（Hungate, R.E., Methods in Microbiology,Vol 3B, Academic Press, New York, 1969, p117）。   After culturing at 37 ° C. for 5 days, the shape, color, etc. of the colony were confirmed using a roll tube method. The roll tube method uses a test tube with a butyl rubber stopper, injects an oxygen-free mixed gas (hydrogen: nitrogen: carbon dioxide, etc.), dispenses microorganisms into the test tube while blocking oxygen, and inspects it. Method (Hungate, RE, Methods in Microbiology, Vol 3B, Academic Press, New York, 1969, p117).

候補となる微生物は、５０ｇ／ｌのグリセロール液体培地で増殖し、かつ水素を生成するものとした。従って、コロニーを取り、液体培地に接種し、回分培養を行った。回分培養液の一部を新たな液体培地に接種し、再び回分培養を行った。この作業を２回繰り返し、候補として２菌株を選択した。当該２菌株はそれぞれ単一菌であり、なおかつ５０ｇ／ｌのグリセロールの消費が見られ、高濃度下でのグリセロール資化性があることを確認した。また、16S rRNAの相同性より、これらの２菌株を、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株と命名した。   Candidate microorganisms were grown on 50 g / l glycerol liquid medium and produced hydrogen. Therefore, colonies were picked, inoculated into a liquid medium, and batch culture was performed. A part of the batch culture solution was inoculated into a new liquid medium, and batch culture was performed again. This operation was repeated twice and two strains were selected as candidates. The two strains were each a single bacterium, and consumption of 50 g / l of glycerol was observed, confirming that glycerol was assimilated at high concentrations. Further, from the homology of 16S rRNA, these two strains were named Enterobacter aerogenes HU201 strain and Enterobacter aerogenes HU202 strain.

なお、グリセロール資化性は、高速液体クロマトグラフィーを用いて、培養開始時と最終日におけるグリセロール量の差から残存グリセロール量を導き出すことによって判断した。   Glycerol assimilation was judged by deriving the amount of residual glycerol from the difference in amount of glycerol between the start of culture and the last day using high performance liquid chromatography.

（６）本発明に係る菌株の同定
市販グリセロールを炭素源とした上記液体培地にて対数増殖期まで培養した上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の培養液各１５ｍｌを３０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心分離して集菌し、上清を除去した。菌体を１．５ｍｌのＴＥ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、５ｍｇのリゾチーム（シグマ製）を加えた後、３７℃で３０分間ゆっくりと振盪した。溶菌液を２．５ｍｌ加え、静かに混合した後、５５℃で６０分間インキュベートした。次に、フェノールクロロホルム混液（東京化成工業製）を１．２５ｍｌ加えて１０分間振盪し、完全に混合した後、１１，０００ｒｐｍ、１５分間遠心して３層に分離し、上層を新しいチューブに移した。 (6) Identification of strains according to the present invention 15 ml each of the culture solution of the HU201 strain and HU202 strain cultured in the liquid medium using commercially available glycerol as a carbon source until the logarithmic growth phase is centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes at 4 ° C. The cells were collected and the supernatant was removed. The cells were suspended in 1.5 ml of TE buffer, 5 mg of lysozyme (manufactured by Sigma) was added, and then gently shaken at 37 ° C. for 30 minutes. After adding 2.5 ml of the lysate and mixing gently, the mixture was incubated at 55 ° C. for 60 minutes. Next, 1.25 ml of a phenol / chloroform mixture (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was added, shaken for 10 minutes, thoroughly mixed, then centrifuged at 11,000 rpm for 15 minutes to separate into 3 layers, and the upper layer was transferred to a new tube. .

もう一度フェノールクロロホルム混液を加え、上層を新しいチューブに移すまでの操作を行った。３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を上層の１／１０量、エタノールを上層の２．５倍量加えて静かに混合し、室温で１０分間静置した。次に、１１，０００ｒｐｍ、１５分間遠心してＤＮＡを沈殿させ、静かに上清を除去した。さらに、１１，０００ｒｐｍ、１分間遠心し、余分なエタノールを完全に除去した。次に、７０％エタノールを２０ｍｌ加え１３，２００ｒｐｍ、２分間遠心し、静かに上清を除去した。さらに、１３，２００ｒｐｍ、３０秒間遠心し、余分なエタノールを完全に除去した後、ｄＨ2Ｏを２００μｌ加えてＤＮＡを完全に溶解させ、−２０℃で保存した。その結果、２５μｇ以上のゲノムＤＮＡが得られた。 The phenol chloroform mixed solution was added once more, and the operation until the upper layer was transferred to a new tube was performed. A 1M amount of 3M sodium acetate solution was added to the upper layer and 2.5 times the amount of ethanol was added to the upper layer, and the mixture was gently mixed and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Next, the DNA was precipitated by centrifugation at 11,000 rpm for 15 minutes, and the supernatant was gently removed. Further, centrifugation was performed at 11,000 rpm for 1 minute to completely remove excess ethanol. Next, 20 ml of 70% ethanol was added and centrifuged at 13,200 rpm for 2 minutes, and the supernatant was gently removed. Further, after centrifugation at 13,200 rpm for 30 seconds to completely remove excess ethanol, 200 μl of dH 2 O was added to completely dissolve the DNA, and the solution was stored at −20 ° C. As a result, 25 μg or more of genomic DNA was obtained.

得られたゲノムを鋳型にPremix Taq kit、ＰＣＲ装置（PC808,ASTEC）を用いてＰＣＲを行い、16S rRNA遺伝子を増幅させた。ＰＣＲの反応液組成および反応条件は表４、表５に示すとおりである。   PCR was performed using the obtained genome as a template using a Premix Taq kit and a PCR device (PC808, ASTEC) to amplify the 16S rRNA gene. The reaction solution composition and reaction conditions for PCR are as shown in Tables 4 and 5.

なお、プライマーとしては、Forward Primer 27F（Escherichia coil,positions 8-27、配列番号４）およびReverse Primer 1492R（Escherichia coil,positions1510-1492、配列番号５）を用いた。   As primers, Forward Primer 27F (Escherichia coil, positions 8-27, SEQ ID NO: 4) and Reverse Primer 1492R (Escherichia coil, positions 1510-1492, SEQ ID NO: 5) were used.

ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルにて電気泳動し、目的物が増幅されていることを確認した。精製したFragmentをTAクローニングによってp GEM-T easy vectorに組み込み、E.coli DH5αに導入して形質転換させた。100μg/ml Ampicillin、80μg/ml Xgal、そして0.5mM IPTGを含むLB培地上に形質転換させたE.coliを培養し、青白選別法を行って組換えプラスミドを持つE.coliを選別した。選別したE.coliからプラスミドを回収し、精製した。   The PCR product was electrophoresed on a 0.8% agarose gel to confirm that the target product was amplified. The purified Fragment was incorporated into p GEM-T easy vector by TA cloning, introduced into E. coli DH5α, and transformed. E. coli transformed on LB medium containing 100 μg / ml Ampicillin, 80 μg / ml Xgal, and 0.5 mM IPTG was cultured, and blue-white selection was performed to select E. coli having a recombinant plasmid. The plasmid was recovered from the selected E. coli and purified.

回収後のプラスミドに含まれる16S rRNA遺伝子の塩基配列の決定は、自然科学研究支援開発センターに依頼した。得られた遺伝子配列を元に、DNA Data Bank of JapanのHP(http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html)のBLAST検索を行い、ホモロジー検索を行った。その結果、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株共にKlebsiella pneumoniaeと９９％、Enterobacter aerogenses（C1111株、C4-1株、An19-2株、An14-1株, An10-1株、An2-1株、A20-1株、 NCTC10006T株, C2111株, RW9516株, RW7M1株）と９８％、 Enterobacter amnigenseと９７％、Enterobacter asburiaeと９８％、Enterobacter gergoviaeと９６％、Enterobacter hormaechei と９７％、 Enterobacter intermedius と９７％、Enterobacter sakazakii と９６％の相同性があることが分かった。   We asked the Natural Science Research Support and Development Center to determine the base sequence of the 16S rRNA gene contained in the recovered plasmid. Based on the obtained gene sequence, a BLAST search was performed on the DNA Data Bank of Japan website (http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html) to perform a homology search. As a result, Enterobacter aerogenes (Enterobacter aerogenes) HU201 strain and HU202 strain were both Klebsiella pneumoniae and 99%, Enterobacter aerogenses (C1111 strain, C4-1 strain, An19-2 strain, An14-1 strain, An10-1 strain, An2 -1 strain, A20-1 strain, NCTC10006T strain, C2111 strain, RW9516 strain, RW7M1 strain) and 98%, Enterobacter amnigense and 97%, Enterobacter asburiae and 98%, Enterobacter gergoviae and 96%, Enterobacter hormaechei and 97%, Enterobacter It was found to have 97% homology with intermedius and 96% with Enterobacter sakazakii.

図４〜６は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とKlebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果を示すものである。図７〜９は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果を示すものである。   4 to 6 show the results of comparing the nucleotide sequences of 16S rRNA gene of Enterobacter aerogenes HU201 strain and Klebsiella pneumoniae. 7 to 9 show the results of comparing the nucleotide sequences of 16S rRNA gene of Enterobacter aerogenes HU202 and klebsiella pneumoniae.

また、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列番号１に、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列番号２に示し、対比したKlebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を配列番号３に示した。   The base sequence of 16S rRNA gene of Enterobacter aerogenes HU201 strain is shown in SEQ ID NO: 1, the base sequence of 16S rRNA gene of Enterobacter aerogenes HU202 strain is shown in SEQ ID NO: 2, The base sequence of the 16S rRNA gene of Klebsiella pneumoniae is shown in SEQ ID NO: 3.

エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とは、約１５００塩基中４塩基の違いが見られた。また、後述する実施例において説明する図１３に示したように生産物にも違いが見られる。したがって、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とは同一の菌株ではないと判断される。   Enterobacter aerogenes HU201 strain and Enterobacter aerogenes HU202 strain showed a difference of about 4 bases out of about 1500 bases. Further, as shown in FIG. 13 which will be described in an embodiment described later, there is a difference in the product. Therefore, it is determined that the Enterobacter aerogenes HU201 strain and the Enterobacter aerogenes HU202 strain are not the same strain.

〔２．本発明に係るグリセロール資化剤〕
本発明に係るグリセロール資化剤は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を含有する。なお、本明細書において、「資化」とは、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含む原料液を発酵させ、水素および／またはエタノールを生産することをいう。 [2. Glycerol associating agent according to the present invention]
The glycerol assimilation agent according to the present invention contains Enterobacter aerogenes HU201 strain and / or Enterobacter aerogenes HU202 strain. In the present specification, “assimilation” means fermenting a raw material liquid containing biodiesel waste liquid obtained by removing methyl ester from a product obtained by methyl esterification of fats and oils, and hydrogen and / or ethanol. It means to produce.

すなわち、本発明に係るグリセロール資化剤は、上記ＨＵ２０１菌株のみからなるものであってもよいし、上記ＨＵ２０２菌株のみからなるものであってもよいし、上記ＨＵ２０１菌株および上記ＨＵ２０２菌株からなるものであってもよい。上記ＨＵ２０１菌株と上記ＨＵ２０２菌株とを併用する場合は、両者の混合比は任意である。   That is, the glycerol assimilating agent according to the present invention may be composed of only the HU201 strain, may be composed of only the HU202 strain, or may be composed of the HU201 strain and the HU202 strain. It may be. When the HU201 strain and the HU202 strain are used in combination, the mixing ratio of the two is arbitrary.

また、本発明に係るグリセロール資化剤は、上記ＨＵ２０１菌株および上記ＨＵ２０２菌株のグリセロール資化性を阻害するものでない限り、上記ＨＵ２０１菌株および上記ＨＵ２０２菌株以外の成分を含んでいてもよい。例えば、菌株の保護剤として、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム、アドニトール、システイン・ＨＣｌ、リン酸緩衝液等を含むことができる。上記保護剤の含有量は特に限定されるものではないが、菌株の重量に対してスキムミルクで１５重量％〜２５重量％、グルタミン酸ナトリウムで２〜４％、アドニトールで１〜２％であることが好ましい。   Moreover, the glycerol utilization agent which concerns on this invention may contain components other than the said HU201 strain and the said HU202 strain, unless the glycerol utilization property of the said HU201 strain and the said HU202 strain is inhibited. For example, skim milk, sodium glutamate, adonitol, cysteine / HCl, phosphate buffer and the like can be included as a protective agent for the strain. The content of the protective agent is not particularly limited, but may be 15 to 25% by weight for skim milk, 2 to 4% for sodium glutamate, and 1 to 2% for adonitol based on the weight of the strain. preferable.

上記グリセロール資化剤を製造する方法は特に限定されるものではないが、例えば殺菌した保護剤を上記ＨＵ２０１菌株および／または上記ＨＵ２０２菌株と混合し、定法に従って凍結乾燥する方法や、Ｌ−乾燥する方法等によって調製することができる。   The method for producing the glycerol assimilating agent is not particularly limited. For example, a sterilized protective agent is mixed with the HU201 strain and / or the HU202 strain and freeze-dried according to a conventional method, or L-dried. It can be prepared by a method or the like.

凍結乾燥またはＬ−乾燥したグリセロール資化剤は、例えば、３７℃で生理食塩水を適宜加えることによって復元することができる。   The lyophilized or L-dried glycerol assimilating agent can be reconstituted, for example, by appropriately adding physiological saline at 37 ° C.

上記ＨＵ２０１菌株および／または上記ＨＵ２０２菌株は、高濃度のグリセロール含有バイオディーゼル廃液から水素およびエタノールを生産することができる。よって、本発明に係るグリセロール資化剤は従来廃棄されていたバイオディーゼル廃液の有効利用を図ることができる。   The HU201 strain and / or the HU202 strain can produce hydrogen and ethanol from a high concentration glycerol-containing biodiesel waste liquid. Therefore, the glycerol assimilation agent according to the present invention can effectively utilize biodiesel waste liquid that has been conventionally discarded.

〔３．水素およびエタノールの製造方法〕
本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、上記原料液を、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株によって発酵させる発酵工程を含む。以下、構成ごとに分けて具体的に説明する。 [3. (Method for producing hydrogen and ethanol)
The method for producing hydrogen and ethanol according to the present invention uses, as a raw material liquid, a biodiesel waste liquid obtained by removing methyl ester from a product obtained by methyl esterification of fats and oils. A fermentation step comprising fermenting with the strains of Enterobacter aerogenes HU201 and / or Enterobacter aerogenes HU202. Hereinafter, specific description will be given separately for each configuration.

（バイオディーゼル廃液）
本発明の製造方法の原料液を構成するバイオディーゼル廃液は、バイオディーゼル燃料を製造する際に副生成物として得られるグリセロールを多量に含むものである。バイオディーゼル燃料の製造原理は、式Ｉに示す反応式に示すようにして行なわれる。 (Biodiesel waste liquid)
The biodiesel waste liquid constituting the raw material liquid of the production method of the present invention contains a large amount of glycerol obtained as a by-product when producing biodiesel fuel. The production principle of biodiesel fuel is performed as shown in the reaction formula shown in Formula I.

より具体的には、油脂（別名：トリグリセリド、トリアシルグリセロール）とメタノールとが化学反応（メチルエステル化）によりメチルエステルおよびグリセロールが生成する。この生成したメチルエステルがバイオディーゼル燃料であり、この反応液からメチルエステル（バイオディーゼル燃料）を除去したものがバイオディーゼル廃液である。   More specifically, methyl ester and glycerol are produced by a chemical reaction (methyl esterification) between fats and oils (also known as triglyceride and triacylglycerol) and methanol. The generated methyl ester is biodiesel fuel, and biodiesel waste liquid is obtained by removing methyl ester (biodiesel fuel) from the reaction liquid.

なおバイオディーゼル燃料を製造する際に油脂をメチルエステル化する方法としては、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いればよい。例えば、油脂とメタノールとをリパーゼ等の触媒存在下で反応させる方法、または超臨界メタノールと油脂とを反応させる方法（吉川 浩ら、「超臨界メタノールによる植物油からのバイオディーゼル燃料の製造」高圧討論会講演要旨集、ＶＯＬ．４２ｎｄ、ｐ１０９（２００１）、SAKA S, KUSDIANA D,「超臨界メタノールを利用した植物油廃棄物からバイオディーゼル燃料の生産」、資源処理技術、ＶＯＬ．４７、ＮＯ．２、ｐ９５−１０２）等を用いて行うことができる。   In addition, it does not specifically limit as a method of methyl-esterifying fats and oils when manufacturing biodiesel fuel, What is necessary is just to use a well-known method. For example, a method of reacting fats and methanol in the presence of a catalyst such as lipase, or a method of reacting supercritical methanol with fats and oils (Hiroyoshi Yoshikawa et al., “Production of biodiesel fuel from vegetable oil with supercritical methanol” Meeting Abstract, VOL.42nd, p109 (2001), SAKA S, KUSDIANA D, “Production of biodiesel fuel from vegetable oil waste using supercritical methanol”, Resource treatment technology, VOL.47, NO.2, p95-102) and the like.

このバイオディーゼル燃料を製造する際に用いる油脂としては特に限定されるものではなく、植物性油脂、動物性油脂またはその廃油等を油脂として用いることが可能である。上記植物性油脂としては、パーム油、ナタネ油、ゴマ油、オリーブ油等が挙げられ、動物性油脂としては、ラード、牛脂、魚油等が挙げられる。また上記油脂には、不純物等が含まれるものであっても、試薬グレードの油脂を用いてもよい。試薬グレードの油脂を用いた場合には、メチルエステル化後の反応液中に含まれる不純物が少なく、バイオディーゼル燃料の回収が容易であること、バイオディーゼル廃液を本発明に係る菌株によって発酵させる際の効率が高いという理由から、純度の高い油脂を用いることが好ましいといえる。   The fats and oils used in producing this biodiesel fuel are not particularly limited, and vegetable fats and oils, animal fats and oils or waste oils thereof can be used as fats and oils. Examples of the vegetable oil include palm oil, rapeseed oil, sesame oil, and olive oil. Examples of the animal oil include lard, beef tallow, and fish oil. Moreover, even if the said fats and oils contain impurities etc., reagent grade fats and oils may be used. When reagent grade fats and oils are used, there are few impurities contained in the reaction liquid after methyl esterification, biodiesel fuel can be easily recovered, and when biodiesel waste liquid is fermented by the strain according to the present invention. Therefore, it can be said that it is preferable to use a high-purity fat.

また油脂をメチルエステル化して得られた生成物から、メチルエステル（バイオディーゼル燃料）を除去する方法としては、デカンテーション等の公知の方法を用いればよい。より具体的には、メチルエステル化後（メタノリシス後）、反応液を静置することにより、生成されたバイオディーゼル燃料は上層に、グリセロールを含むバイオディーゼル廃液部分は下層に分かれる。よって、デカンテーション等の方法により容易にバイオディーゼル燃料とバイオディーゼル廃液とを分離できる。上記のようにしてメチルエステル（バイオディーゼル燃料）を反応液中から除去した残渣が、本発明の製造方法において利用するバイオディーゼル廃液である。   Moreover, what is necessary is just to use well-known methods, such as a decantation, as a method of removing methyl ester (biodiesel fuel) from the product obtained by methyl-esterifying fats and oils. More specifically, after the methyl esterification (after methanolysis), the produced biodiesel fuel is separated into an upper layer and the biodiesel waste liquid portion containing glycerol is divided into a lower layer by allowing the reaction solution to stand. Therefore, biodiesel fuel and biodiesel waste liquid can be easily separated by a method such as decantation. The residue obtained by removing methyl ester (biodiesel fuel) from the reaction liquid as described above is the biodiesel waste liquid used in the production method of the present invention.

かかるバイオディーゼル廃液には、主成分としてグリセロールが多量に含まれている。バイオディーゼル燃料の製造に用いる油脂に含まれる成分によって異なるが、バイオディーゼル廃液にはその他、乳酸、酢酸、エタノール等が含まれる場合がある。   Such biodiesel waste liquid contains a large amount of glycerol as a main component. The biodiesel waste liquid may contain lactic acid, acetic acid, ethanol and the like in addition to the above, depending on the components contained in the fats and oils used for the production of biodiesel fuel.

（原料液）
本発明の製造方法に用いる上記原料液は、上記バイオディーゼル廃液が含まれていれば特に限定されるものではなく、バイオディーゼル廃液そのものを原料液として用いても良く、また適宜、水等の溶媒を添加し原料液として用いてもよい。上記溶媒の添加率（換言すれば希釈率）は特に限定されるものではなく、後に行なう本発明に係る菌株による発酵工程に用いる原料液として好適なものとなるように適宜検討の上、決定すればよい。 (Raw material liquid)
The raw material liquid used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the biodiesel waste liquid is included, and the biodiesel waste liquid itself may be used as the raw material liquid, and a solvent such as water is appropriately used. May be used as a raw material liquid. The addition rate of the solvent (in other words, the dilution rate) is not particularly limited, and should be determined after appropriate consideration so as to be suitable as a raw material solution used in the fermentation process by the strain according to the present invention to be performed later. That's fine.

本発明に係る菌株、すなわちエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株は、いずれも高濃度のグリセロールを資化することができる。特許文献２に記載されているように、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株は、が処理できる原料液のグリセロール濃度は１０〜２０ｇ／ｌであったが、本発明に係る菌株は、後述するようにグリセロール濃度が７５ｇ／ｌの原料液まで処理可能であり、ＣＳＬを原料液に添加した場合はグリセロール濃度が９０ｇ／ｌの原料液まで処理可能であることを確認している。   The strains according to the present invention, that is, Enterobacter aerogenes HU201 strain and Enterobacter aerogenes HU202 strain can both assimilate a high concentration of glycerol. As described in Patent Document 2, Enterobacter aerogenes HU101 strain has a glycerol concentration of 10 to 20 g / l in a raw material solution that can be treated. Thus, it is confirmed that the raw material liquid having a glycerol concentration of 75 g / l can be processed, and when CSL is added to the raw material liquid, the raw material liquid having a glycerol concentration of 90 g / l can be processed.

それゆえ、上記原料液のグリセロール濃度は、２０ｇ／ｌを超えることが好ましい。これにより、上記希釈率を従来よりも大幅に低下させることができる。もちろん、２０g／ｌ以下の場合も問題なくグリセロールを資化することができる。   Therefore, the glycerol concentration of the raw material liquid is preferably over 20 g / l. Thereby, the said dilution rate can be reduced significantly compared with the past. Of course, glycerol can be assimilated without problems even at 20 g / l or less.

またその他、本発明に係る菌株の生育に必要な培地成分が含まれていてもよい。当該培地成分が含まれることによって、本発明に係る菌株の生育・増殖が活発になり、バイオディーゼル廃液からの水素・およびエタノールの発酵生産効率がさらに向上する。   In addition, medium components necessary for the growth of the strain according to the present invention may be contained. By including the medium component, the growth and proliferation of the strain according to the present invention becomes active, and the fermentation production efficiency of hydrogen and ethanol from the biodiesel waste liquid is further improved.

上記培地成分としては、本発明に係る菌株の培養に好適なものを適宜選択の上、添加すればよい。特に、酵母抽出液、およびカゼイン酵素分解物は、一般に微生物用培地に用いられている成分であり、本発明に用いる培地成分としては好適である。   What is necessary is just to add after selecting suitably what is suitable for culture | cultivation of the strain based on this invention as said culture medium component. In particular, yeast extract and casein enzyme degradation products are components that are generally used in microbial media, and are suitable as media components used in the present invention.

なお、酵母抽出液（別名：イーストエキス、酵母エキス）とは、ビール酵母（Saccharomyces cerevisiae ）等の酵母の内容物を抽出したものであり、一般に市販されているものである。本発明においてもかかる市販されているものを適宜利用すればよい。例えば、粉末酵母エキスＳ（日本製薬株式会社製）、Yeast Extract, Bact（Difco社製）等を用いればよい。上記酵母抽出物の添加量としては、原料液に０．０５重量％以上１重量％以下が好ましく、原料液に０．２５重量％以上０．５重量％以下がさらに好ましい。   The yeast extract (also known as yeast extract, yeast extract) is a product obtained by extracting yeast contents such as beer yeast (Saccharomyces cerevisiae) and is generally commercially available. In the present invention, such commercially available products may be used as appropriate. For example, powdered yeast extract S (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), Yeast Extract, Bact (manufactured by Difco) or the like may be used. The amount of the yeast extract added is preferably 0.05% by weight or more and 1% by weight or less in the raw material solution, and more preferably 0.25% by weight or more and 0.5% by weight or less in the raw material solution.

また、上記カゼイン酵素分解物とは、牛乳カゼイン等のカゼインをペプシン、トリプシン等のタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で処理したものであり、一般に市販されているものである。本発明においてもかかる市販されているものを適宜利用すればよい。例えば、ポリペプトン（日本製薬株式会社製）、Trypton, Bact（Difco社製）等を用いればよい。上記カゼイン酵素分解物の添加量としては、原料液に０．１重量％以上１重量％以下が好ましく、原料液に０．２５重量％以上０．０５重量％以下がさらに好ましい。   The casein enzymatic degradation product is a product obtained by treating casein such as milk casein with a protease (protease) such as pepsin or trypsin, and is generally commercially available. In the present invention, such commercially available products may be used as appropriate. For example, polypeptone (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), Trypton, Bact (manufactured by Difco) or the like may be used. The amount of the casein enzyme degradation product added is preferably 0.1% by weight or more and 1% by weight or less in the raw material solution, and more preferably 0.25% by weight or more and 0.05% by weight or less in the raw material solution.

その他の培地成分としては、（ＮＨ4）2ＳＯ4，ＭｇＳＯ4、Ｃｏ（ＮＯ3）2、Ｆｅ（ＮＨ4）2ＳＯ4、Ｎａ2ＭｏＯ4，ＣａＣｌ2，Ｎａ2ＳｅＯ3，ニコチン酸、ＮｉＣｌ2、その他ビタミン類等をミネラルとして添加してもよい。また、バッファー成分として、Ｋ2ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4等が含まれていてもよい。また微量元素としてＭｎＣｌ2、Ｈ3ＢＯ3、ＡｌＫ（ＳＯ4）、ＣｕＣｌ2、ＥＤＴＡ等が含まれていてもよい。上記化合物は市販されているものを使用することができる。 Other medium components include (NH 4 ) 2 SO 4 , MgSO 4 , Co (NO 3 ) 2 , Fe (NH 4 ) 2 SO 4 , Na 2 MoO 4 , CaCl 2 , Na 2 SeO 3 , nicotinic acid, NiCl 2 and other vitamins may be added as minerals. Further, as a buffer component, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 and the like may be contained. Further, MnCl 2 , H 3 BO 3 , AlK (SO 4 ), CuCl 2 , EDTA, or the like may be contained as a trace element. The said compound can use what is marketed.

（微生物）
本発明の製造方法における発酵工程に用いる微生物は、既に説明したように、通性嫌気性細菌のエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株である。エンテロバクター(Enterobacter)属細菌のグリセロールの代謝経路について図１０に示す。 (Microorganism)
As already described, the microorganism used in the fermentation process in the production method of the present invention is the facultative anaerobic bacterium Enterobacter aerogenes HU201 and / or Enterobacter aerogenes HU202. . The metabolic pathway of glycerol in Enterobacter bacteria is shown in FIG.

エンテロバクター(Enterobacter)属細菌は、ブドウ糖などの解糖系で得られた余剰なＮＡＤＨを２,３−ブタンジオール、エタノール、乳酸および酢酸などに配分することにより還元当量のバランスを保つ、いわゆる混合有機酸発酵を行なって生育する。この中で水素（図１０中、Ｈ2）は、以下の経路によって生成される。(1)エタノール（図１０中、Ethanol）および酢酸（図１０中、Acetate）生成の中間生成物であるピルビン酸（図１０中、Pyruvate）がアセチルＣｏＡ（図１０中、Acetyl-CoA）へと代謝される際に、ピルビン酸−ギ酸リアーゼによりギ酸（図１０中、Formate）が生成される。(2)当該ギ酸（図１０中、Formate）からヒドロゲナーゼの作用により水素（図１０中、Ｈ2）が生成される。 Enterobacter bacteria are a so-called mixture that maintains the balance of reducing equivalents by allocating excess NADH obtained from glycolysis such as glucose to 2,3-butanediol, ethanol, lactic acid, and acetic acid. Grows through organic acid fermentation. Among them, hydrogen (H 2 in FIG. 10) is generated by the following route. (1) Pyruvate (Pyruvate in FIG. 10), which is an intermediate product of ethanol (Ethanol in FIG. 10) and acetic acid (Acetate in FIG. 10), is converted to acetyl CoA (Acetyl-CoA in FIG. 10). When metabolized, formic acid (Formate in FIG. 10) is generated by pyruvate-formate lyase. (2) Hydrogen (H 2 in FIG. 10) is generated from the formic acid (Formate in FIG. 10) by the action of hydrogenase.

よって、本発明の製造方法にエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を用いることによって、バイオディーゼル廃液に含まれるグリセロールを利用して水素およびエタノールを発酵生産することができる。   Accordingly, by using the Enterobacter aerogenes HU201 strain and / or the Enterobacter aerogenes HU202 strain in the production method of the present invention, hydrogen and ethanol are utilized using glycerol contained in the biodiesel wastewater. Can be fermented.

（発酵工程）
本発明にかかる製造方法は、既述の原料液を、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株によって発酵させる発酵工程を含んでいる。かかる発酵工程は、本発明に係る菌株が原料液から水素およびエタノールを発酵生産する工程である。その発酵条件としては、本発明に係る菌株が水素およびエタノールを発酵生産する条件として好ましい条件であれば特に限定されるものではなく、その発酵方法は連続培養であっても回分培養（バッチ培養）であっても半回分培養であってもよい。 (Fermentation process)
The production method according to the present invention includes a fermentation step in which the above-described raw material liquid is fermented by Enterobacter aerogenes HU201 strain and / or Enterobacter aerogenes HU202 strain. This fermentation process is a process in which the strain according to the present invention fermentatively produces hydrogen and ethanol from the raw material liquid. The fermentation conditions are not particularly limited as long as the strain according to the present invention is preferable as a condition for fermentative production of hydrogen and ethanol, and the fermentation method is batch culture (batch culture) even if it is continuous culture. Or semi-batch culture.

回分培養は、発酵槽に原料と微生物を仕込み発酵終了後に発酵液を抜き出すという培養方法であり、連続培養は微生物を固定化等により発酵槽の中に閉じ込め、原料の流入と発酵液の流出を連続的に行なう培養方法である。半回分培養は、流加培養ともいい、培養中に、培地自体や培地中の特定の成分を添加する方法である。連続培養は、長期間連続的に発酵することにより、発酵槽の単位体積あたりの生産性が回分培養に比して高いというメリットがあるためにより好ましいといえるが、本発明に係る菌株は、担体に固定化せずとも高濃度のグリセロールを資化し、水素およびエタノールを発酵生産することができるため、半回分培養であっても効率よく水素およびエタノールの生産を行うことができる。   Batch culture is a culture method in which raw materials and microorganisms are charged into a fermentor and the fermentation liquid is extracted after the fermentation is complete.Continuous culture is confined in the fermenter by immobilizing microorganisms, etc. This is a continuous culture method. Semi-batch culture is also referred to as fed-batch culture, and is a method of adding the medium itself or specific components in the medium during the culture. Continuous culture is more preferable because it has a merit that productivity per unit volume of the fermenter is higher than batch culture by continuous fermentation for a long period of time, but the strain according to the present invention is a carrier. Therefore, hydrogen and ethanol can be fermented and produced by assimilating high-concentration glycerol without immobilizing them, so that hydrogen and ethanol can be efficiently produced even in a semi-batch culture.

また本発明における発酵工程は、通気培養であっても、静置培養であっても、攪拌培養であっても振盪培養であってもよい。   The fermentation step in the present invention may be aeration culture, static culture, stirring culture, or shaking culture.

また培養温度については本発明に係る菌株の生育に好適な条件を採用すれば良く、２８℃〜４０℃が好ましく、３０℃〜３７℃がさらに好ましく、３７℃が最も好ましい。   Moreover, about culture | cultivation temperature, what is necessary is just to employ | adopt conditions suitable for the growth of the strain based on this invention, 28 to 40 degreeC is preferable, 30 to 37 degreeC is more preferable, and 37 degreeC is the most preferable.

回分培養を行う場合は、原料液を試験管等の反応容器中に入れ、本発明に係る菌株を接種した後、振盪培養等を行えばよい。本発明に係る菌株は、担体に固定せずとも高濃度のグリセロールを資化できるので、回分培養であっても水素およびエタノールを生産することができるが、図１０に示すように、グリセロールの代謝中には、水素およびエタノール以外に、１，３−プロパンジオール、酢酸、２，３−ブタンジオール、乳酸等の有機酸が多量に発生するため、上記発酵によって得られた発酵液のｐＨは、発酵工程の進行に連れて低下し、酸性となる。   When batch culture is performed, the raw material solution is placed in a reaction container such as a test tube and the strain according to the present invention is inoculated, followed by shaking culture or the like. Since the strain according to the present invention can assimilate glycerol at a high concentration without being fixed to a carrier, hydrogen and ethanol can be produced even in batch culture. As shown in FIG. In addition to hydrogen and ethanol, a large amount of organic acids such as 1,3-propanediol, acetic acid, 2,3-butanediol, and lactic acid are generated, so the pH of the fermentation broth obtained by the fermentation is It decreases with the progress of the fermentation process and becomes acidic.

一方、本発明に係る菌株の至適ｐＨは中性付近（ｐＨ６．５以上７．５以下）であるため、回分培養反応では、発酵生産の速度が低下し、原料液中のグリセロール濃度に関わらず、ある程度の量以上のグリセロールを利用できなくなるという問題がある。   On the other hand, since the optimum pH of the strain according to the present invention is near neutral (pH 6.5 or more and 7.5 or less), the rate of fermentation production is reduced in the batch culture reaction, and the glycerol concentration in the raw material liquid is affected. However, there is a problem that a certain amount or more of glycerol cannot be used.

それゆえ、上記発酵工程においては、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．５以上７．５以下に保持することが好ましい。これによって、発酵液のｐＨが本発明に係る菌株の至適ｐＨに保持されるので、効率よくグリセロールを資化し、水素およびエタノールを生産することができる。   Therefore, in the fermentation step, it is preferable to maintain the pH of the raw material liquid and / or the fermentation liquid obtained by the fermentation at 6.5 to 7.5. Thereby, since the pH of the fermentation broth is maintained at the optimum pH of the strain according to the present invention, glycerol can be efficiently assimilated and hydrogen and ethanol can be produced.

そのため、上記発酵工程においては、回分培養よりも半回分培養または連続培養を行うことが好ましい。半回分培養を行うための培養装置としては特に限定されるものではなく、公知の培養装置を適宜選択の上、利用が可能である。図１１に半回分培養を行なうための培養装置の模式図を示す。半回分培養装置１１は、発酵槽１２、アルカリ液貯留槽１３、アルカリ液流入孔１４、サンプリング孔１５、ｐＨ測定装置１６、電極１７、ポンプ１８、排気口１９、とからなっている。発酵槽１２には原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液２０（以下「発酵液２０」という）が入っている。また、発酵液２０の温度は、発酵槽１２を恒温槽（図示せず）に載置すること等により、一定に保たれている。   Therefore, in the fermentation step, it is preferable to perform semi-batch culture or continuous culture rather than batch culture. The culture apparatus for performing semi-batch culture is not particularly limited, and a known culture apparatus can be appropriately selected and used. FIG. 11 shows a schematic diagram of a culture apparatus for performing semi-batch culture. The semi-batch culture apparatus 11 includes a fermentation tank 12, an alkaline liquid storage tank 13, an alkaline liquid inflow hole 14, a sampling hole 15, a pH measuring device 16, an electrode 17, a pump 18, and an exhaust port 19. The fermenter 12 contains a raw material liquid and / or a fermented liquid 20 obtained by the above fermentation (hereinafter referred to as “fermented liquid 20”). Moreover, the temperature of the fermented liquid 20 is kept constant by mounting the fermenter 12 in a thermostat (not shown).

ｐＨ測定装置１６が電極１７によって、発酵液２０のｐＨを測定し、ｐＨが６．５未満であることを検知すると、ｐＨ測定装置はコンピュータ２１に指示を送り、コンピュータ２１は、ポンプ１８を起動する。そして、アルカリ液がアルカリ液貯留槽１３からポンプ１８によって、アルカリ液流入孔１４を通って発酵槽１２に供給され、発酵液２０のｐＨが６．５以上７．５以下に保持される。   When the pH measurement device 16 measures the pH of the fermentation broth 20 with the electrode 17 and detects that the pH is less than 6.5, the pH measurement device sends an instruction to the computer 21, and the computer 21 activates the pump 18. To do. Then, the alkaline liquid is supplied from the alkaline liquid storage tank 13 to the fermentation tank 12 through the alkaline liquid inflow hole 14 by the pump 18, and the pH of the fermentation liquid 20 is maintained at 6.5 or more and 7.5 or less.

上記「アルカリ液」としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水溶液を用いることができ、有機酸を中和できるものであれば特に限定されるものではない。   The “alkaline solution” is not particularly limited as long as an aqueous solution of sodium hydroxide, potassium hydroxide or the like can be used, for example, as long as the organic acid can be neutralized.

一方、発酵生産された水素ガスを含む気体成分は、排気口１９を通って発酵槽１２外へと排出され、ガス回収槽（図示せず）において回収されるようになっている。サンプリングは、サンプリング孔１５から適宜行えるようになっている。例えば、サンプリング孔１５からサンプルを採取し、高速液体クロマトグラフィーを用いてグリセロール量を分析することにより、発酵の進捗状況を確認することができる。   On the other hand, the gaseous component containing hydrogen gas produced by fermentation passes through the exhaust port 19 and is discharged out of the fermentation tank 12 and is recovered in a gas recovery tank (not shown). Sampling can be appropriately performed from the sampling hole 15. For example, the progress of fermentation can be confirmed by collecting a sample from the sampling hole 15 and analyzing the amount of glycerol using high performance liquid chromatography.

このように、本発明に係る菌株は、担体に固定しなくてもグリセロールを効率よく資化することができるが、もちろん担体を用い、連続培養を行ってもよい。   As described above, the strain according to the present invention can efficiently assimilate glycerol without being immobilized on a carrier, but of course, continuous culture may be performed using the carrier.

原料の流入と発酵液の流出を行なう連続培養では、その発酵液の流出の際に微生物が一緒に流出することを防止する必要がある。このために微生物の固定化等を行なって、発酵槽からの流出を防いでいる。上記微生物の流出を防ぐ方法としては、固定化担体を用いて発酵槽内に微生物を固定化してもよいし、特に固定化担体を用いることなく増殖した微生物同士が自己凝集体（フロック）を形成して発酵槽内に留まるという方法であってもよい。ただし、固定化担体の自重により固定化担体に固定化された微生物が発酵液の表層に浮遊することがなく、確実に発酵槽内に留まることができるということ、浮遊することが無いために原料液と微生物が接触する頻度が高まり発酵生産効率が向上すること、および発酵槽内の微生物の菌体密度を向上させることができる等の理由から、固定化担体を用いる方法が好ましいといえる。   In continuous culture in which the inflow of the raw material and the outflow of the fermentation liquid are performed, it is necessary to prevent the microorganisms from flowing out together when the fermentation liquid flows out. For this purpose, microorganisms are immobilized to prevent outflow from the fermenter. As a method for preventing the outflow of microorganisms, microorganisms may be immobilized in a fermenter using an immobilized carrier, and microorganisms grown without using an immobilized carrier form self-aggregates (floc). And the method of staying in a fermenter may be sufficient. However, the microorganisms immobilized on the immobilization carrier by its own weight do not float on the surface layer of the fermentation broth and can stay in the fermenter without fail, and the raw material does not float A method using an immobilization carrier is preferable because the frequency of contact between the liquid and the microorganism is increased and fermentation production efficiency is improved, and the cell density of the microorganism in the fermenter can be improved.

上記担体としては、少なくともその表面に、（より好ましくは、その表面および内部に）微生物を固定することが可能な担体であれば限定されるものではない。ただし、微生物が固定化しやすく、その微生物の固定量が増加するという理由から、上記担体は多孔質であることが好ましい。上記多孔質である担体（以下、「多孔質担体」という）は、文字通りその表面に多数の孔があり、その孔内部および表面に微生物、すなわち本発明に係る菌株が吸着し、本発明に係る菌株を固定化することができる。   The carrier is not limited as long as it is capable of immobilizing microorganisms at least on the surface (more preferably, on the surface and inside). However, the carrier is preferably porous because the microorganisms are easily immobilized and the amount of the microorganisms to be immobilized increases. The porous carrier (hereinafter referred to as “porous carrier”) literally has a large number of pores on its surface, and microorganisms, that is, the strain according to the present invention are adsorbed inside and on the surface of the porous carrier. The strain can be immobilized.

担体（より好ましくは多孔質担体）に本発明に係る菌株を固定化する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば発酵槽内に原料液と担体（より好ましくは多孔質担体）を仕込み、そこに本発明に係る菌株を接種し培養する方法が挙げられる。すなわち特に、固定化操作を別途行なうのではなく、発酵工程によって増殖してきた本発明に係る菌株の培養液が担体（より好ましくは多孔質担体）と接触することにより、その表面および内部に固定化されるという方法である。   A method for immobilizing the strain according to the present invention on a carrier (more preferably a porous carrier) is not particularly limited. For example, a raw material solution and a carrier (more preferably a porous carrier) are placed in a fermenter. A method of inoculating and culturing the strain according to the present invention there is mentioned. That is, in particular, the immobilization operation is not performed separately, but the culture solution of the strain according to the present invention grown by the fermentation process is immobilized on the surface and inside by contacting with the carrier (more preferably a porous carrier). It is a method of being done.

なお、本発明の製造方法の発酵工程とは別に本発明に係る菌株を培養し、担体（より好ましくは多孔質担体）に固定化するという操作を行ない、本発明に係る菌株が固定化された担体（より好ましくは多孔質担体）を発酵工程に導入するというものであってもよい。   In addition, the strain according to the present invention was immobilized separately from the fermentation step of the production method of the present invention, and the strain according to the present invention was immobilized by culturing the strain according to the present invention and immobilizing it on a carrier (more preferably a porous carrier). A carrier (more preferably a porous carrier) may be introduced into the fermentation process.

本発明の製造方法において使用する上記多孔質担体は、特に限定されるものではなく、連続培養用に市販されている固定化担体を適宜利用可能である。例えば、ナガオ株式会社製: ペレット状セラミックスSP1-4、協和エンジニアリング株式会社製: クラゲール、株式会社サンバイオ社製：バイオポーラスなどが利用可能である。   The porous carrier used in the production method of the present invention is not particularly limited, and an immobilization carrier commercially available for continuous culture can be appropriately used. For example, Nagao Co., Ltd .: Pellet Ceramics SP1-4, Kyowa Engineering Co., Ltd .: Kragale, Sun Bio Co., Ltd .: Bioporous etc. can be used.

なお本発明に使用する担体（より好ましくは多孔質担体）は、粒子状であることが好ましく、その平均粒子径が３ｍｍ以上２０ｍｍ以下であることが好ましい。上記担体（より好ましくは多孔質担体）は、既述の通り表面および内部に微生物が固定されることにより、菌体密度を向上させるための部材である。したがって菌体密度をさらに向上させるためには、担体（より好ましくは多孔質担体）は粒子状であり、その粒子径はできるだけ小さいことが好ましいといえる。   The carrier used in the present invention (more preferably a porous carrier) is preferably in the form of particles, and the average particle diameter is preferably 3 mm or more and 20 mm or less. The carrier (more preferably a porous carrier) is a member for improving the cell density by fixing microorganisms on the surface and inside as described above. Therefore, in order to further improve the cell density, it can be said that the carrier (more preferably a porous carrier) is in the form of particles and the particle diameter is preferably as small as possible.

ただし、過度に粒子径が小さくなると原料液表面に浮遊してしまい、菌体密度を向上させることができなくなる。よって担体（より好ましくは多孔質担体）の平均粒子径を上記のごとく３ｍｍ以上２０ｍｍ以下にすることが好ましいといえ、３ｍｍ以上１０ｍｍ以下にすることがさらに好ましいといえる。平均粒子径が上記の範囲の担体（より好ましくは多孔質担体）を用いることで、菌体密度をさらに向上させることができ、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。   However, if the particle size becomes excessively small, it floats on the surface of the raw material liquid, making it impossible to improve the cell density. Therefore, it can be said that the average particle diameter of the carrier (more preferably a porous carrier) is preferably 3 mm or more and 20 mm or less, and more preferably 3 mm or more and 10 mm or less. By using a carrier having an average particle diameter in the above range (more preferably a porous carrier), the cell density can be further improved, and the production of hydrogen and ethanol can be further improved.

また本発明の製造方法は、上記多孔質担体が、貫通孔を有する多孔質担体であることが好ましい。多孔質担体に貫通孔がない場合、本発明に係る菌株の培養液が、多孔質体の孔の内部まで入り込むことができないのに対し、多孔質担体に貫通孔がある場合は、当該多孔質担体の貫通孔を本発明に係る菌株の培養液の培養液が通過することができ、多孔質担体のさらに内部まで本発明に係る菌株が入り込むことができる。それゆえ、本発明に係る菌株の多孔質担体に対する固定化量を向上させることができ、水素およびエタノール生産量をさらに向上させることができるという効果を奏する。上記貫通孔を有する多孔質担体は、既述のナガオ株式会社製: ペレット状セラミックスSP1-4、協和エンジニアリング株式会社製: クラゲール、株式会社サンバイオ社製：バイオポーラスなどが利用可能である。   In the production method of the present invention, the porous carrier is preferably a porous carrier having through holes. When the porous carrier has no through-holes, the culture solution of the strain according to the present invention cannot enter the pores of the porous body, whereas when the porous carrier has through-holes, the porous carrier The culture solution of the culture solution of the strain according to the present invention can pass through the through-hole of the support, and the strain according to the present invention can enter further inside the porous support. Therefore, the amount of the strain according to the present invention immobilized on the porous carrier can be improved, and the production of hydrogen and ethanol can be further improved. As the porous carrier having the above-mentioned through-holes, the aforementioned Nagao Co., Ltd .: Pellet Ceramics SP1-4, Kyowa Engineering Co., Ltd .: Kragale, Sun Bio Co., Ltd .: Bioporous, etc. can be used.

なお使用する担体の材質は、特に限定されるものではなく、例えばレンガ様の素焼き材；セラミックス、ポリビニルアルコール等の高分子材料；木材チップ、セルロース等の生体高分子化合物が利用可能である。   The material of the carrier to be used is not particularly limited, and for example, a brick-like unglazed material; a polymer material such as ceramics and polyvinyl alcohol; and a biopolymer compound such as wood chip and cellulose can be used.

連続培養に使用する装置としては、特に限定されるものではなく、公知の培養装置を適宜選択の上、利用が可能である。図１２に連続培養を行なうための連続培養装置の模式図を示す。連続培養装置１は、発酵槽２、恒温ジャケット３、恒温水流出孔３ａ、恒温水流入孔３ｂ、恒温水槽３ｃ、細菌固定化多孔質担体４、原料液流入孔５、発酵液流出孔６、原料液タンク７、ポンプ８、排気口９、ガス回収槽１０とからなっている。   The apparatus used for continuous culture is not particularly limited, and a known culture apparatus can be appropriately selected and used. FIG. 12 shows a schematic diagram of a continuous culture apparatus for performing continuous culture. The continuous culture apparatus 1 includes a fermentation tank 2, a constant temperature jacket 3, a constant temperature water outflow hole 3a, a constant temperature water inflow hole 3b, a constant temperature water tank 3c, a bacteria-immobilized porous carrier 4, a raw material liquid inflow hole 5, a fermentation liquid outflow hole 6, It consists of a raw material liquid tank 7, a pump 8, an exhaust port 9, and a gas recovery tank 10.

原料液は原料液タンク７からポンプ８によって、原料液流入孔５を通って発酵槽２に供給される。原料液は、細菌固定化多孔質担体４に固定化されたエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株によって発酵する。発酵後のエタノールを含む発酵液は、原料液の供給に伴い発酵液流出孔６を通って発酵槽２外へと流出し回収される。   The raw material liquid is supplied from the raw material liquid tank 7 to the fermenter 2 by the pump 8 through the raw material liquid inflow hole 5. The raw material solution is fermented by Enterobacter aerogenes HU201 strain and / or Enterobacter aerogenes HU202 strain immobilized on the bacteria-immobilized porous carrier 4. The fermented liquid containing ethanol after fermentation flows out of the fermenter 2 through the fermented liquid outflow hole 6 and is collected along with the supply of the raw material liquid.

一方、発酵生産された水素ガスを含む気体成分は、排気口９を通って発酵槽２外へと排出され、ガス回収槽１０において回収されるようになっている。なお発酵槽２内の温度は、発酵槽の外側面を覆うように設けられた恒温ジャケット３内に恒温水槽３ｃから供給される恒温水によって、一定に保たれている。恒温水は、恒温水槽３ｃから恒温水流入孔３ｂを通って恒温ジャケット３内に供給され、恒温水流出孔３ａから再び恒温水槽３ｃに戻るという要領により循環している。   On the other hand, the gaseous component containing hydrogen gas produced by fermentation is discharged to the outside of the fermentation tank 2 through the exhaust port 9 and is recovered in the gas recovery tank 10. In addition, the temperature in the fermenter 2 is kept constant by the constant temperature water supplied from the constant temperature water tank 3c in the constant temperature jacket 3 provided so that the outer surface of a fermenter may be covered. The constant temperature water is circulated in such a manner that the constant temperature water tank 3c is supplied into the constant temperature jacket 3 through the constant temperature water inflow hole 3b and returns to the constant temperature water tank 3c from the constant temperature water outflow hole 3a.

上記の連続培養において、発酵槽２内への原料液の供給量（以下、原料液希釈率という）の好適な条件は、用いる原料液の組成，多孔質担体の種類，本発明に係る菌株の状態，培養条件等によって異なるために、限定されるものではないが、０．６ｈ-1以上１．２ｈ-1以下が好ましく、０．７ｈ-1以上１．２ｈ-1以下がさらに好ましい。上記好ましい範囲以上の希釈率で原料液を供給すると、本発明に係る菌株の発酵能力を原料供給量が上まり、十分発酵していないにもかかわらず発酵槽２外へ流出してしまう状態となり、発酵効率が下がり、水素およびエタノールの回収量が少なくなってしまう。 In the above-mentioned continuous culture, suitable conditions for the amount of the raw material liquid supplied into the fermenter 2 (hereinafter referred to as the raw material liquid dilution rate) include the composition of the raw material liquid used, the type of the porous carrier, and the strain according to the present invention. state, in order to vary depending culturing conditions and the like, but are not limited to, preferably 0.6 h -1 or 1.2 h -1 or less, more preferably 0.7 h -1 or 1.2 h -1 or less. When the raw material liquid is supplied at a dilution ratio of the above preferred range or more, the raw material supply amount increases the fermentation capacity of the strain according to the present invention, and it flows out of the fermenter 2 despite not being fully fermented. Fermentation efficiency decreases, and the amount of hydrogen and ethanol recovered decreases.

一方、上記好ましい範囲以下の希釈率で原料液を供給すると、発酵は十分に進むが生成物であるエタノール等によって菌体が死滅したり、雑菌の汚染の危険性が高くなるために好ましくない。なお「原料液希釈率」とは、１時間当たりに供給される原料液量の全原料液量に対する割合のことである。   On the other hand, if the raw material liquid is supplied at a dilution rate less than the above preferable range, fermentation proceeds sufficiently, but the cells are killed by the product ethanol or the like, and the risk of contamination with various bacteria increases, which is not preferable. The “raw material liquid dilution ratio” is the ratio of the amount of raw material liquid supplied per hour to the total amount of raw material liquid.

（コーンスティープリカー（ＣＳＬ）の使用）
ＣＳＬは、コーンスターチ製造工業でコーンスターチを生産する際に生じる副産物である。ＣＳＬは、コーンスターチ製造過程で、とうもろこし粒を０．１〜０．３％の亜硫酸液に４５〜５０℃、約４０〜４８時間乳酸発酵させながら浸漬する工程があり、浸漬を終わった後、浸漬槽から抜液され、真空蒸発装置によって固形分５０％前後まで濃縮されることによって生成される。ＣＳＬは、酵母エキスに替わる安価な炭素源の候補物質として用いられている。 (Use of corn steep liquor (CSL))
CSL is a by-product generated when corn starch is produced in the corn starch manufacturing industry. CSL is a corn starch manufacturing process in which corn grains are immersed in a sulfite solution of 0.1 to 0.3% while lactic acid fermentation is performed at 45 to 50 ° C. for about 40 to 48 hours. It is produced by draining from the tank and concentrating to around 50% solids with a vacuum evaporator. CSL is used as an inexpensive carbon source candidate substance to replace yeast extract.

本発明者は、ＣＳＬを原料液に含有させることによって、グリセロール濃度９０ｇ／ｌという、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌の生育が通常確認できなかった高濃度であっても本発明に係る菌株を生育させることができることを確認した。   By including CSL in the raw material liquid, the present inventor can grow the strain according to the present invention even at a high concentration of 90 g / l of glycerol, which was not normally confirmed to grow Enterobacter bacteria. It was confirmed that it can be made.

よって、本発明に係る水素およびエタノールの製造方法は、上記原料液がＣＳＬを含有することが好ましい。   Therefore, in the method for producing hydrogen and ethanol according to the present invention, the raw material liquid preferably contains CSL.

ＣＳＬには、とうもろこし粒から溶出された可溶性タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖類、ビタミン類が含まれる他、多量の乳酸、アミノ酸およびペプチドが含まれるきわめて粘稠な液体である。また、ＣＳＬは、原料とうもろこしの品種、産地、浸漬条件などによって成分比にかなり差異があるが、濃縮前の組成として、総固形分含量が６．０〜７．０％、乳酸が１．６〜２．０％、還元糖が０．４〜０．５％、総窒素０．４〜０．６％、灰分１．１〜１．３％、ｐＨ３．６〜３．８が標準とされている（滝昭夫ら、三重大学農学部学術報告７５号、ｐ５９~６７、１９８７）。   CSL is a very viscous liquid containing a large amount of lactic acid, amino acids and peptides in addition to soluble proteins, peptides, amino acids, sugars and vitamins eluted from corn grains. Moreover, although CSL has a considerable difference in the component ratio depending on the raw material corn varieties, production areas, soaking conditions, etc., the composition before concentration is 6.0 to 7.0%, and lactic acid is 1.6%. -2.0%, reducing sugar 0.4-0.5%, total nitrogen 0.4-0.6%, ash 1.1-1.3%, pH 3.6-3.8 (Akio Taki et al., Mie University Agricultural Report 75, p59-67, 1987).

本発明で用いるＣＳＬは、上記組成を満たしていれば特に限定されるものではない。ＣＳＬを原料液に添加する時期は、特に限定されるものではないが、本発明の菌株の生育性を高め、グリセロール資化性を向上させる観点から、予め原料液に混合しておくことが好ましい。ＣＳＬの原料液への添加量は、特に限定されるものではないが、濃度０．１〜２ｇ／ｌであることが好ましく、０．１〜０．４ｇ／ｌであることがより好ましい。   The CSL used in the present invention is not particularly limited as long as it satisfies the above composition. The timing of adding CSL to the raw material solution is not particularly limited, but it is preferable to mix it with the raw material solution in advance from the viewpoint of enhancing the growth of the strain of the present invention and improving the glycerol utilization. . The amount of CSL added to the raw material liquid is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 2 g / l, more preferably 0.1 to 0.4 g / l.

（その他の工程）
本発明にかかる製造方法は、上記発酵工程のほかに、本発明に係る菌株を予め増殖させておく前培養工程、多孔質担体に予め本発明に係る菌株を固定化しておく固定化工程、生成した水素またはエタノールを精製する精製工程、生成した水素またはエタノールをガスクロマトグラフィー等で分析する工程、バイオディーゼル燃料の製造工程等の工程が含まれていてもよい。 (Other processes)
In addition to the fermentation step, the production method according to the present invention includes a pre-culture step in which the strain according to the present invention is preliminarily grown, an immobilization step in which the strain according to the present invention is immobilized in advance on a porous carrier, and generation Steps such as a purification step for purifying the produced hydrogen or ethanol, a step for analyzing the produced hydrogen or ethanol by gas chromatography, a biodiesel fuel production step, or the like may be included.

〔４．本発明に係るキット〕
本発明に係るキットは、上記本発明にかかる水素およびエタノールの製造方法を行うためのキットであって、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株および／またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株並びに上記菌株を培養可能な培地が含まれる。 [4. Kit according to the present invention]
The kit according to the present invention is a kit for carrying out the above-described method for producing hydrogen and ethanol according to the present invention, and is Enterobacter aerogenes HU201 strain and / or Enterobacter aerogenes HU202 strain Moreover, the culture medium which can culture the said strain is contained.

上記培地としては、本発明に係る菌株の培養に好適な成分を適宜選択し、適用したものであればよい。上記成分としては、例えば酵母抽出液、カゼイン酵素分解物、ビタミン類、バッファー成分、微量元素等を挙げることができる。また、培地の一例としては、例えば表１に挙げたグリセロール培地を好適に用いることができる。   The medium may be any medium that is appropriately selected and applied to components suitable for culturing the strain according to the present invention. As said component, a yeast extract, a casein enzyme degradation product, vitamins, a buffer component, a trace element etc. can be mentioned, for example. Moreover, as an example of the medium, for example, the glycerol medium listed in Table 1 can be suitably used.

さらに、本発明に係るキットには、例えば図１１または図１２に示すような培養装置（バイオリアクター）が含まれていてもよい。   Furthermore, the kit according to the present invention may include a culture apparatus (bioreactor) as shown in FIG. 11 or FIG.

以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。   Embodiments will be described below in more detail with reference to the accompanying drawings. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible in detail. Further, the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made within the scope shown in the claims, and the present invention is also applied to the embodiments obtained by appropriately combining the disclosed technical means. It is included in the technical scope of the invention.

＜実施例１：グリセロール濃度２５ｇ／ｌの原料液を用いたエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株による水素の発酵生産＞
試験管に、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの８ｍｌに、グリセロール濃度が原料液に対して２５ｇ／ｌとなるようにリン酸バッファーで希釈した炭素源を加えて原料液を調製し、これにエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の１白金耳を１ｍｌリン酸バッファーに懸濁した液１ｍｌをそれぞれ接種し、ｐＨをリン酸バッファーによって７．０に調整し、３７℃、５日間暗所にて静置培養を行い、ガス量測定、ガス組成測定、サンプリングを適時行った。 <Example 1: Fermentative production of hydrogen by Enterobacter aerogenes HU201 strain or Enterobacter aerogenes HU202 strain using a raw material solution having a glycerol concentration of 25 g / l>
Prepare a raw material solution by adding a carbon source diluted with a phosphate buffer so that the glycerol concentration is 25 g / l with respect to the raw material solution in 8 ml of the synthetic medium shown in Table 1 except glycerol. Inoculated with 1 ml of a solution obtained by suspending 1 platinum loop of Enterobacter aerogenes HU201 strain or Enterobacter aerogenes HU202 strain in 1 ml phosphate buffer, and adjusting the pH with phosphate buffer After adjusting to 7.0, static culture was performed in a dark place at 37 ° C. for 5 days, and gas amount measurement, gas composition measurement, and sampling were performed in a timely manner.

なお、ガス組成は、ガスタイトシリンジを用いてサンプルを抜き取り、ガスクロマトグラフィー（GC-8A：Shimazu；TCD：Thermal Conductivity Detector）で分析した。分析条件は表６に示すとおりである。   The gas composition was analyzed by gas chromatography (GC-8A: Shimazu; TCD: Thermal Conductivity Detector) by extracting a sample using a gas tight syringe. The analysis conditions are as shown in Table 6.

炭素源としては、表７に示すバイオディーゼル廃液、減圧蒸留でメタノールを除去したバイオディーゼル廃液または市販グリセロールを用いた。なお、表７に示すバイオディーゼル廃液は、広島県大朝町で回収されたものを使用した。   As the carbon source, biodiesel waste liquid shown in Table 7, biodiesel waste liquid from which methanol was removed by distillation under reduced pressure, or commercially available glycerol was used. In addition, the biodiesel waste liquid shown in Table 7 used what was collect | recovered in Hiroshima Prefecture Oasamachi.

水素生成量を測定した結果を、図１３に示した。図１３（ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株を用い、３種類の炭素源を発酵させた場合の水素生成量を示すものである。図１３（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株を用い、３種類の炭素源を発酵させた場合の水素生成量を示すものである。図中、白抜きのひし形のシンボルは、炭素源としてバイオディーゼル廃液を用いた場合（「２５ｇＢＷ」と表示）、白抜き四角形のシンボルは、炭素源としてメタノールを除去したバイオディーゼル廃液を用いた場合（「２５ｇＢＭ」と表示）、白抜き三角形のシンボルは、炭素源として市販グリセロールを用いた場合（「２５ｇ純グリ」と表示）の水素生成量を示している。   The results of measuring the amount of hydrogen produced are shown in FIG. FIG. 13 (a) shows the amount of hydrogen produced when the above HU201 strain is used to ferment three types of carbon sources. FIG. 13 (b) shows the amount of hydrogen produced when three types of carbon sources are fermented using the HU202 strain. In the figure, the white diamond symbol indicates that biodiesel waste liquid is used as the carbon source (indicated as “25 gBW”), and the white square symbol indicates that the biodiesel waste liquid from which methanol has been removed is used as the carbon source. (Indicated as “25 gBM”), the symbol of the open triangle indicates the amount of hydrogen produced when commercially available glycerol is used as the carbon source (indicated as “25 g pure gly”).

図１３より、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株は、グリセロールがどのような炭素源として供給されるかに関わらず、安定した水素生成を行うことが確認された。   From FIG. 13, it was confirmed that the HU201 strain and the HU202 strain perform stable hydrogen generation regardless of what carbon source glycerol is supplied as.

＜実施例２：グリセロール濃度５０ｇ／ｌの原料液を用いた場合における水素の発酵生産＞
そこで、次に、原料液のグリセロール濃度を５０ｇ／ｌに引き上げ、様々な土地から採取したサンプル菌（１０種類）を用いて、実施例１と同様の実験を行った。結果は図１４に示した。図１４の横軸は、サンプル番号と、実施例１に示した炭素源の種類の組み合わせになっており、例えば、「１−ＢＭ」はサンプル１に、メタノールを除去したバイオディーゼル廃液を５０ｇ／ｌで供したことを示し、「１−ＢＷ」は、サンプル１に、表７に示すバイオディーゼル廃液を５０ｇ／ｌで供したことを示す。図１４には、１０種類のサンプル菌のうち、水素生成を行ったもののみを表示している。このうち、サンプル１が上記ＨＵ２０１菌株であり、サンプル２が上記ＨＵ２０２菌株である。なお、サンプル４，５，６はそれぞれ未同定の細菌である。 <Example 2: Fermentative production of hydrogen when a raw material liquid having a glycerol concentration of 50 g / l is used>
Therefore, next, the glycerol concentration of the raw material liquid was increased to 50 g / l, and experiments similar to those in Example 1 were performed using sample bacteria (10 types) collected from various lands. The results are shown in FIG. The horizontal axis of FIG. 14 is a combination of the sample number and the type of carbon source shown in Example 1. For example, “1-BM” is 50 g / w of biodiesel waste liquid from which methanol is removed from sample 1. “1-BW” indicates that the biodiesel waste liquid shown in Table 7 was supplied to Sample 1 at 50 g / l. FIG. 14 shows only hydrogen bacteria that have been generated among the 10 types of sample bacteria. Among these, sample 1 is the HU201 strain, and sample 2 is the HU202 strain. Samples 4, 5, and 6 are unidentified bacteria.

図１４に示すように、グリセロール濃度を５０ｇ／ｌとした場合は、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株のみが安定に生育し、安定した水素生産を行うことができることが確認された。水素生成量は、グリセロール濃度２５ｇ／ｌのときと大きな差は見られなかった。   As shown in FIG. 14, when the glycerol concentration was 50 g / l, it was confirmed that only the HU201 strain and HU202 strain grew stably and stable hydrogen production was possible. The amount of hydrogen produced was not significantly different from that at the glycerol concentration of 25 g / l.

続いて、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株による発酵生産の結果生成したガス以外の生産物を、５日間培養後の原料液を高速液体クロマトグラフィー（HPLC : High Performance Liquid Chromatography；JASCO Gulliver series UV-910＆PU-980, JASCO）に供することによって分析した。分析条件は表８に示すとおりである。なお、残存グリセロールは、生産物の分析と同様、高速液体クロマトグラフィーを用いて、培養開始時と最終日におけるグリセロールの差から導き出した。   Subsequently, high-performance liquid chromatography (HPLC: High Performance Liquid Chromatography; JASCO Gulliver series UV-910 & PU- 980, JASCO). The analysis conditions are as shown in Table 8. Residual glycerol was derived from the difference between glycerol at the start of culture and the last day using high performance liquid chromatography, as in the analysis of the product.

結果を図１５に示した。図１５（ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株による発酵生産後の残存グリセロールおよびガス以外の最終生産物の変化を示すものであり、図１５（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株による発酵生産後の残存グリセロールおよびガス以外の最終生産物の変化を示すものである。図１５中、「残存Ｇｌｙｃｅｒｏｌ」は５日間培養後の残存グリセロール量を示し、「１３−ＰＤ」は１，３−プロパンジオールを、「Ｅｔｈａｎｏｌ」はエタノールを、「Ｌａｃｔａｔｅ」は乳酸を、「Ａｃｅｔａｔｅ」は酢酸を表している。   The results are shown in FIG. FIG. 15 (a) shows changes in the final product other than residual glycerol and gas after fermentation production by the HU201 strain, and FIG. 15 (b) shows the residual glycerol after fermentation production by the HU202 strain and It shows changes in the final product other than gas. In FIG. 15, “Residual Glycerol” indicates the amount of residual glycerol after 5 days of culture, “13-PD” indicates 1,3-propanediol, “Ethanol” indicates ethanol, “Lactate” indicates lactic acid, and “Acetate”. "Represents acetic acid.

図１４、１５より、上記ＨＵ２０１菌株、ＨＵ２０２菌株のいずれもが、５０ｇ／ｌという高濃度のグリセロール存在下でも生育でき、目的産物である水素およびエタノールを生産していることが明らかとなった。   14 and 15, it was revealed that both the HU201 strain and the HU202 strain can grow in the presence of glycerol having a high concentration of 50 g / l and produce the target products, hydrogen and ethanol.

図１４、１５に示すように、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株は、ともにグリセロールを約２０g／ｌ消費（つまり資化）し、水素を約３５ｍｍｏｌ／ｌ生成した。また、上記ＨＵ２０１菌株はエタノールを約８０ｍｍｏｌ／ｌ、ＨＵ２０２菌株は約５０ｍｍｏｌ／ｌ生成した。この実験において、バイオディーゼル廃液に含まれている塩などの培養阻害物質の影響は見られなかった。   As shown in FIGS. 14 and 15, both the HU201 strain and the HU202 strain consumed about 20 g / l of glycerol (that is, assimilated) and produced about 35 mmol / l of hydrogen. The HU201 strain produced about 80 mmol / l ethanol and the HU202 strain produced about 50 mmol / l. In this experiment, the influence of culture inhibitors such as salts contained in the biodiesel waste liquid was not observed.

コスト面、発酵後の処理の手間を少なくすることなどの実用性を考えた場合、バイオディーゼル廃液は、できるだけ添加物を加えず、しかもできるだけ希釈せずに発酵に供することが望ましい。本発明に係る菌株によれば、５０ｇ／ｌという高濃度でグリセロールを含有する原料液を資化することができた。よって、本発明に係る菌株によれば、バイオディーゼル廃液の効率的な利用を行うことができる。   In view of practicality such as cost and reducing the processing effort after fermentation, it is desirable that the biodiesel waste liquid be subjected to fermentation without adding as much additive as possible and without diluting as much as possible. According to the strain of the present invention, a raw material liquid containing glycerol at a high concentration of 50 g / l could be assimilated. Therefore, according to the strain according to the present invention, the biodiesel waste liquid can be efficiently used.

＜実施例３：エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株が生育可能なグリセロール濃度の検討＞
表７に示すバイオディーゼル廃液の濃度をさらに上げ、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育可能な最大グリセロール濃度を検討した。試験管に、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの８ｍｌに、グリセロール濃度が原料液に対して５０、６０，７０，８０，９０ｇ／ｌとなるようにリン酸バッファーで希釈したバイオディーゼル廃液を加えて原料液を調製し、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の１白金耳を１ｍｌリン酸バッファーに懸濁した液を１ｍｌそれぞれ接種し、ｐＨをリン酸バッファーによって７．０に調整し、３７℃、５日間暗所にて静置培養を行った。５日間培養後の水素生成量を、実施例１と同様にガスクロマトグラフィーを用いて測定した。 <Example 3: Examination of glycerol concentration at which Enterobacter aerogenes HU201 strain or Enterobacter aerogenes HU202 strain can grow>
The concentration of the biodiesel waste liquid shown in Table 7 was further increased, and the maximum glycerol concentration at which the HU201 strain and HU202 strain could grow was examined. In a test tube, biodiesel diluted with phosphate buffer so that the glycerol concentration is 50, 60, 70, 80, 90 g / l in 8 ml of the synthetic medium shown in Table 1 except glycerol. Prepare a raw material solution by adding waste liquid, and inoculate 1 ml each of a suspension of 1 platinum loop of Enterobacter aerogenes HU201 strain or Enterobacter aerogenes HU202 strain in 1 ml phosphate buffer. The pH was adjusted to 7.0 with a phosphate buffer, and static culture was performed in a dark place at 37 ° C. for 5 days. The amount of hydrogen produced after culturing for 5 days was measured using gas chromatography in the same manner as in Example 1.

図１６は、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育可能なグリセロール濃度を検討した結果を示すものである。図１６より、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育できる最大グリセロール濃度は、共に７５ｇ／ｌ付近（約75,000ppm）であると考えられる。これは表７に示すバイオディーゼル廃液を約５〜６倍希釈したものに相当する。上述のように、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ１０１株で処理するためには、バイオディーゼル廃液を４０倍近く希釈しなければならないことに鑑みると、本発明に係る菌株は、上記ＨＵ１０１株に比べて非常に高度なグリセロール資化力を有することが分かる。   FIG. 16 shows the results of examining the glycerol concentration at which the HU201 strain and HU202 strain can grow. From FIG. 16, it is considered that the maximum glycerol concentration at which the HU201 strain and HU202 strain can grow is around 75 g / l (about 75,000 ppm). This corresponds to the biodiesel waste liquid shown in Table 7 diluted about 5 to 6 times. In view of the fact that biodiesel effluent must be diluted nearly 40 times in order to treat with Enterobacter aerogenes HU101 strain as described above, the strain according to the present invention is It can be seen that it has a very high glycerol utilization ability.

＜実施例４：流加培養実験＞
これまでは、培養開始時の減量液のｐＨを７．０に調整し、試験管内で回分培養を行ってきたが、発酵に伴って産生される有機酸の影響によって原料液のｐＨが低下すると、図１５に示すようにグリセロールの消費が停止する。 <Example 4: Fed-batch culture experiment>
So far, the pH of the weight reduction solution at the start of culture has been adjusted to 7.0 and batch culture has been carried out in a test tube. However, when the pH of the raw material solution decreases due to the influence of organic acids produced during fermentation. As shown in FIG. 15, the consumption of glycerol is stopped.

そこで、次に、リアクターを用い、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．７５〜７．０に保ちながら、発酵工程を行った。リアクターの概略は図１１に示すとおりである。   Then, next, using the reactor, the fermentation process was performed while maintaining the pH of the raw material liquid and / or the fermentation liquid obtained by the above fermentation at 6.75 to 7.0. The outline of the reactor is as shown in FIG.

上記リアクターに、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの５００ｍｌに、グリセロール濃度が原料液に対して４０ｇ／ｌとなるようにリン酸バッファーで希釈した炭素源（表７に示すバイオディーゼル廃液）を加えて原料液を調製し、同一培地で前もって２日間前培養したエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の培養液５０ｍｌをそれぞれ接種し、ｐＨを５Ｎ水酸化ナトリウムの水溶液によって７．０に調整し、３７℃、５日間暗所にて静置培養を行った。原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨが６．７５未満になった場合、水酸化ナトリウムの水溶液（濃度５Ｎ）をリアクター内に添加することにより、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．７５〜７．０に保った。   In the above reactor, a carbon source (biodiesel waste solution shown in Table 7) diluted with a phosphate buffer so that the glycerol concentration is 40 g / l with respect to the raw material solution in 500 ml of the synthetic medium shown in Table 1 except for glycerol. ) To prepare a raw material solution, inoculated with 50 ml of Enterobacter aerogenes HU201 strain or Enterobacter aerogenes HU202 strain previously cultured in the same medium for 2 days in advance, respectively. Was adjusted to 7.0 with an aqueous solution of 5N sodium hydroxide, and static culture was performed in a dark place at 37 ° C. for 5 days. When the pH of the raw material liquid and / or the fermented liquid obtained by the fermentation is less than 6.75, an aqueous solution of sodium hydroxide (concentration 5N) is added into the reactor, whereby the raw material liquid and / or the fermentation is The pH of the fermentation broth obtained by the above was kept at 6.75 to 7.0.

なお、「原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液」とは、まだ発酵が開始されていない原料液、発酵途中の、原料液および発酵によって得られた発酵液の混合物、発酵が完了した後の発酵液のいずれもが含まれる。   In addition, “the raw material liquid and / or the fermented liquid obtained by the fermentation” means a raw material liquid that has not yet been fermented, a mixture of the raw material liquid and the fermented liquid obtained by the fermentation, and the fermentation is completed. Any of the fermented liquors after being included.

図１７（ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株を用い、半回分培養（流加培養）による発酵生産後の残存グリセロールおよび最終生産物の変化を示すものであり、図１７（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株を用い、半回分培養（流加培養）による発酵生産後の残存グリセロールおよび最終生産物の変化を示すものである。   FIG. 17 (a) shows changes in residual glycerol and final product after fermentation production by half-batch culture (fed-batch culture) using the HU201 strain. FIG. 17 (b) shows the HU202 strain. Is used to show changes in residual glycerol and final product after fermentation production by semi-batch culture (fed-batch culture).

図１７（ａ）および（ｂ）に示すように、ｐＨを７付近に保持することにより全てのグリセロールを消費させることができた。またｐＨを７付近に保持することによって、１,３−プロパンジオールの生産量を、回分培養の場合に比べ、約１／８に抑えることが出来た。そしてエタノール生産量も２倍近く向上させることができた。   As shown in FIGS. 17 (a) and 17 (b), all glycerol could be consumed by maintaining the pH around 7. Further, by maintaining the pH in the vicinity of 7, the production amount of 1,3-propanediol could be suppressed to about 1/8 compared to the case of batch culture. And the ethanol production was able to improve nearly 2 times.

＜実施例５：ＣＳＬの添加＞
試験管に、表１に示す合成培地からグリセロールを除いたもの８ｍｌに、グリセロール濃度が原料液に対して９０ｇ／ｌとなるようにリン酸バッファーで希釈したバイオディーゼル廃液を加えて原料液を調製し、当該原料液に、ＣＳＬ（ヤエガキ醗酵技研（株）より提供）を０．１ｍｌ、０．４ｍｌ，０．７ｍｌまたは１．０ｍｌ加えた。次に、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株またはエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の１白金耳をリン酸バッファー１ｍｌに懸濁した液１ｍｌを接種しｐＨをリン酸バッファーによって７．０に調整した。３７℃、５日間暗所にて静置培養を行った後の水素生成量を、実施例１と同様にガスクロマトグラフィーを用いて測定した。 <Example 5: Addition of CSL>
Prepare a raw material liquid by adding biodiesel waste liquid diluted with phosphate buffer to a test tube so that the glycerol concentration is 90 g / l with respect to the raw material liquid in 8 ml of the synthetic medium shown in Table 1 except glycerol. Then, 0.1 ml, 0.4 ml, 0.7 ml or 1.0 ml of CSL (provided by Yaegaki Fermentation Engineering Co., Ltd.) was added to the raw material solution. Next, 1 ml of a suspension of 1 platinum loop of Enterobacter aerogenes HU201 strain or Enterobacter aerogenes HU202 strain in 1 ml of phosphate buffer was inoculated, and pH was adjusted with phosphate buffer. Adjusted to zero. The amount of hydrogen produced after static culture at 37 ° C. for 5 days in the dark was measured using gas chromatography in the same manner as in Example 1.

図１８は、ＣＳＬの添加量と水素生成量との関係を示すグラフである。図１８において、白抜きの四角形のシンボルはＨＵ２０１を、黒い三角形のシンボルはＨＵ２０２を用いた場合の結果を表している。図１６に示すように、ＣＳＬを添加しない場合は、上記ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育できる最大のグリセロール濃度は７５ｇ／ｌ付近であったが、ＣＳＬを添加することによって、９０ｇ／ｌという、非常に高濃度のグリセロール存在下であっても安定に生育し、水素を生産することができることが分かった。特に、ＣＳＬの添加量が０．４ｍｌまでの範囲においては、３０ｍｍｏｌ／ｌ以上の水素を生成した。   FIG. 18 is a graph showing the relationship between the amount of CSL added and the amount of hydrogen produced. In FIG. 18, white square symbols represent the results when HU 201 is used, and black triangle symbols represent the results when HU 202 is used. As shown in FIG. 16, when CSL was not added, the maximum glycerol concentration at which the HU201 and HU202 strains could grow was around 75 g / l. However, by adding CSL, It was found that even in the presence of a high concentration of glycerol, it can grow stably and produce hydrogen. In particular, when the amount of CSL added was in the range up to 0.4 ml, 30 mmol / l or more of hydrogen was generated.

本発明に係る菌株は、非常に高濃度のグリセロール存在下でも安定に生育し、水素およびエタノールを生産することができるため、バイオディーゼル廃液の有効利用に資することができる。したがって、本発明は、食品工業、化学工業、エネルギー産業等広範な産業において廃水、廃液処理の工程として利用が可能である。   Since the strain according to the present invention can stably grow even in the presence of a very high concentration of glycerol and can produce hydrogen and ethanol, it can contribute to the effective use of biodiesel waste liquid. Therefore, the present invention can be used as a wastewater and wastewater treatment process in a wide range of industries such as the food industry, the chemical industry, and the energy industry.

図１（ａ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株の形態を撮影した写真であり、図１（ｂ）はエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株の形態を撮影した写真である。FIG. 1 (a) is a photograph of the morphology of Enterobacter aerogenes HU201 strain, and FIG. 1 (b) is a photograph of the morphology of Enterobacter aerogenes HU202 strain. . エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株の比増殖速度を解析した結果を示すものである。The result of having analyzed the specific growth rate of Enterobacter aerogenes (Enterobacter aerogenes) HU201 strain and HU202 strain is shown. 図２に示す結果を基に、対数増殖期におけるOD値の対数を取りプロットした結果を示すものである。FIG. 3 shows the results of plotting the logarithm of the OD value in the logarithmic growth phase based on the results shown in FIG. 2. エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０１菌株の１４９８塩基配列中1番目〜５４０番目の配列に関する結果を示すものである。Of the results of comparing the base sequence of the 16S rRNA gene of Enterobacter aerogenes HU201 and klebsiella pneumoniae, the results for the 1st to 540th sequences of the 1498 base sequence of the HU201 strain are shown. エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０１菌株の１４９８塩基配列中５４１番目〜１０８０番目の配列に関する結果を示すものである。Of the results of comparing the base sequence of 16S rRNA gene of Enterobacter aerogenes HU201 and klebsiella pneumoniae, the results for the 541st to 1080th sequences of the 1498 base sequence of the HU201 strain are shown. エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０１菌株の１４９８塩基配列中１０８１番目〜１４９８番目の配列に関する結果を示すものである。Of the results of comparing the base sequence of 16S rRNA gene of Enterobacter aerogenes HU201 and klebsiella pneumoniae, the results for the 1081st to 1498th sequences of the 1498 base sequence of the HU201 strain are shown. エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０２菌株の１４８１塩基配列中２０番目〜５５９番目の配列に関する結果を示すものである。Of the results obtained by comparing the enterobacter aerogenes HU202 strain and the base sequence of the 16S rRNA gene of klebsiella pneumoniae, the results for the 20th to 559th sequences of the 1481 base sequence of the HU202 strain are shown. エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０２菌株の１４８１塩基配列中５６０番目〜１０９９番目の配列に関する結果を示すものである。Of the results of comparing the base sequence of 16S rRNA gene of Enterobacter aerogenes HU202 and klebsiella pneumoniae, the results for the 560th to 1099th sequences in the 1481 base sequence of the HU202 strain are shown. エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株とklebsiella pneumoniaeの16S rRNA遺伝子の塩基配列を対比した結果のうち、上記ＨＵ２０２菌株の１４８１塩基配列中１１００番目〜１４８１番目の配列に関する結果を示すものである。Of the results of comparing the base sequence of the 16S rRNA gene of Enterobacter aerogenes HU202 and klebsiella pneumoniae, the results for the 1100th to 1481th sequences of the 1481 base sequence of the HU202 strain are shown. エンテロバクター(Enterobacter)属細菌のグリセロールの代謝経路を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the metabolic pathway of glycerol of Enterobacter genus bacteria. 半回分培養を行なうための培養装置の模式図である。It is a schematic diagram of the culture apparatus for performing semibatch culture. 連続培養を行なうための連続培養装置の模式図である。It is a schematic diagram of the continuous culture apparatus for performing continuous culture. （ａ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株を用い、３種類の炭素源を発酵させた場合の水素生成量を示すものである。（ｂ）は、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株を用い、３種類の炭素源を発酵させた場合の水素生成量を示すものである。(A) shows the amount of hydrogen produced when three types of carbon sources are fermented using Enterobacter aerogenes HU201 strain. (B) shows the amount of hydrogen produced when three types of carbon sources are fermented using Enterobacter aerogenes HU202 strain. 原料液のグリセロール濃度を５０ｇ／ｌとした場合における、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株による水素生産量を示すものである。It shows the amount of hydrogen produced by Enterobacter aerogenes HU201 strain and Enterobacter aerogenes HU202 strain when the glycerol concentration of the raw material liquid is 50 g / l. （ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株による発酵生産後の残存グリセロールおよびガス以外の最終生産物の変化を示すものであり、（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株による発酵生産後の残存グリセロールおよびガス以外の最終生産物の変化を示すものである。(A) shows changes in final products other than residual glycerol and gas after fermentation production by the HU201 strain, and (b) shows final changes other than residual glycerol and gas after fermentation production by the HU202 strain. It shows the change of the product. エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株およびＨＵ２０２菌株が生育可能なグリセロール濃度を検討した結果を示すものである。The result of having examined the glycerol density | concentration in which Enterobacter aerogenes (Enterobacter aerogenes) HU201 strain and HU202 strain can be grown is shown. （ａ）は、上記ＨＵ２０１菌株を用い、流加培養による発酵生産後の残存グリセロールおよび最終生産物の変化を示すものであり、（ｂ）は、上記ＨＵ２０２菌株を用い、流加培養による発酵生産後の残存グリセロールおよび最終生産物の変化を示すものである。(A) shows changes in residual glycerol and final product after fermentation production by fed-batch culture using the HU201 strain, and (b) shows fermentation production by fed-batch culture using the HU202 strain. The remaining residual glycerol and the final product changes are shown. ＣＳＬの添加量と水素生成量との関係を示すグラフである。It is a graph which shows the relationship between the addition amount of CSL, and the amount of hydrogen production.

符号の説明Explanation of symbols

１ 連続培養装置
２ 発酵槽
３ 恒温ジャケット
３ａ 恒温水流出孔
３ｂ 恒温水流入孔
３ｃ 恒温水槽
４ 細菌固定化多孔質担体
５ 原料液流入孔
６ 発酵液流出孔
７ 原料液タンク
８ ポンプ
９ 排気口
１０ ガス回収槽
１１ 半回分培養装置
１２ 発酵槽
１３ アルカリ液貯留槽
１４ アルカリ液流入孔
１５ サンプリング孔
１６ ｐＨ測定装置
１７ 電極
１８ ポンプ
１９ 排気口
２０ 発酵液
２１ コンピュータ DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Continuous culture apparatus 2 Fermenter 3 Constant temperature jacket 3a Constant temperature water outflow hole 3b Constant temperature water inflow hole 3c Constant temperature water tank 4 Bacteria fixed porous carrier 5 Raw material liquid inflow hole 6 Fermentation liquid outflow hole 7 Raw material liquid tank 8 Pump 9 Exhaust port 10 Gas recovery tank 11 Semi-batch culture apparatus 12 Fermenter 13 Alkaline liquid storage tank 14 Alkaline liquid inflow hole 15 Sampling hole 16 pH measuring device 17 Electrode 18 Pump 19 Exhaust port 20 Fermentation liquid 21 Computer

Claims (9)

エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０１菌株。   Enterobacter aerogenes HU201 strain. エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＨＵ２０２菌株。   Enterobacter aerogenes HU202 strain. 油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含み、グリセロール濃度が５０ｇ／ｌである原料液中のグリセロールを１５g／ｌ以上資化できることを特徴とする請求項１または２に記載の菌株。   It includes biodiesel waste liquid obtained by removing methyl ester from a product obtained by methyl esterification of fats and oils, and can assimilate 15 g / l or more of glycerol in a raw material liquid having a glycerol concentration of 50 g / l The strain according to claim 1 or 2. 請求項１に記載の菌株および／または請求項２に記載の菌株を含有することを特徴とするグリセロール資化剤。   A glycerol utilization agent comprising the strain according to claim 1 and / or the strain according to claim 2. 原料液として、油脂をメチルエステル化して得られる生成物からメチルエステルを除去して得られるバイオディーゼル廃液を含むものを用い、上記原料液を、請求項１に記載の菌株および／または請求項２に記載の菌株によって発酵させる発酵工程を含むことを特徴とする水素およびエタノールの製造方法。   As a raw material liquid, what contains the biodiesel waste liquid obtained by removing methyl ester from the product obtained by methyl esterifying fats and oils, the said raw material liquid is the strain and / or claim 2 of Claim 1. The manufacturing method of hydrogen and ethanol characterized by including the fermentation process fermented with the strain described in 1 .. 上記原料液がコーンスティープリカーを含有することを特徴とする請求項５に記載の水素およびエタノールの製造方法。   6. The method for producing hydrogen and ethanol according to claim 5, wherein the raw material liquid contains corn steep liquor. 上記原料液のグリセロール濃度が２０ｇ／ｌを超えることを特徴とする請求項５または６に記載の水素およびエタノールの製造方法。   The method for producing hydrogen and ethanol according to claim 5 or 6, wherein the glycerol concentration of the raw material liquid exceeds 20 g / l. 上記発酵工程において、原料液および／または上記発酵によって得られた発酵液のｐＨを６．５以上７．５以下に保持することを特徴とする請求項５から７のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法。   In the said fermentation process, pH of the raw material liquid and / or the fermented liquid obtained by the said fermentation is hold | maintained at 6.5 or more and 7.5 or less, The any one of Claim 5 to 7 characterized by the above-mentioned. Method for producing hydrogen and ethanol. 請求項５から８のいずれか１項に記載の水素およびエタノールの製造方法を行うためのキットであって、請求項１に記載の菌株および／または請求項２に記載の菌株、並びに上記菌株を培養可能な培地が含まれることを特徴とするキット。   A kit for carrying out the method for producing hydrogen and ethanol according to any one of claims 5 to 8, comprising the strain according to claim 1 and / or the strain according to claim 2, and the strain. A kit comprising a culture medium capable of being cultured.
JP2008024018A 2008-02-04 2008-02-04 New Enterobacter aerogenes strains and their use Expired - Fee Related JP5196423B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008024018A JP5196423B2 (en) 2008-02-04 2008-02-04 New Enterobacter aerogenes strains and their use

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008024018A JP5196423B2 (en) 2008-02-04 2008-02-04 New Enterobacter aerogenes strains and their use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2009183162A true JP2009183162A (en) 2009-08-20
JP5196423B2 JP5196423B2 (en) 2013-05-15

Family

ID=41067139

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008024018A Expired - Fee Related JP5196423B2 (en) 2008-02-04 2008-02-04 New Enterobacter aerogenes strains and their use

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP5196423B2 (en)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101824437A (en) * 2010-03-02 2010-09-08 东南大学 Method for producing hydrogen by utilizing facultative anaerobe fermentation
JP2012139216A (en) * 2010-12-14 2012-07-26 Tokyo Gas Co Ltd New microorganism, and waste water disposal method and waste water disposal apparatus using the new microorganism
JP2012179003A (en) * 2011-03-01 2012-09-20 Institute Of National Colleges Of Technology Japan Method of producing biodiesel fuel
JP2014158438A (en) * 2013-02-19 2014-09-04 Central Research Institute Of Electric Power Industry Method for producing ethanol from waste glycerol
JP5667174B2 (en) * 2010-04-19 2015-02-12 サッポロビール株式会社 Novel microorganism, hydrogen production method using the same, 1,3-propanediol production method and biodiesel waste liquid treatment method
CN109321490A (en) * 2018-09-30 2019-02-12 浙江工业大学 Clostridium perfringen ZJB-17003 and its application
WO2019097921A1 (en) * 2017-11-17 2019-05-23 大成建設株式会社 Dioxane-degrading bacteria-immobilized carrier, biodegradation treatment method, and biodegradation treatment device
CN115305227A (en) * 2022-09-22 2022-11-08 郑州轻工业大学 Enterobacter hollisae ZJ-21 for degrading waste tobacco leaves and producing hydrogen and application thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004209415A (en) * 2003-01-07 2004-07-29 Tokyo Elex Kk Waste treatment system
JP2006180782A (en) * 2004-12-27 2006-07-13 Hiroshima Univ Method for producing hydrogen and ethanol from biodiesel waste liquid and kit for performing the method

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004209415A (en) * 2003-01-07 2004-07-29 Tokyo Elex Kk Waste treatment system
JP2006180782A (en) * 2004-12-27 2006-07-13 Hiroshima Univ Method for producing hydrogen and ethanol from biodiesel waste liquid and kit for performing the method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6012064747; 谷生重晴　他: 'Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ　の発酵水素発生と利用基質について' 醗酵工学会誌 第６７巻、第１号, 1989, ｐ．　２９-３４ *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101824437A (en) * 2010-03-02 2010-09-08 东南大学 Method for producing hydrogen by utilizing facultative anaerobe fermentation
JP5667174B2 (en) * 2010-04-19 2015-02-12 サッポロビール株式会社 Novel microorganism, hydrogen production method using the same, 1,3-propanediol production method and biodiesel waste liquid treatment method
US9303274B2 (en) 2010-04-19 2016-04-05 Sapporo Breweries Limited Microorganism, and hydrogen production process, 1,3-propanediol production process and biodiesel liquid waste treatment method each using the microorganism
JP2012139216A (en) * 2010-12-14 2012-07-26 Tokyo Gas Co Ltd New microorganism, and waste water disposal method and waste water disposal apparatus using the new microorganism
JP2012179003A (en) * 2011-03-01 2012-09-20 Institute Of National Colleges Of Technology Japan Method of producing biodiesel fuel
JP2014158438A (en) * 2013-02-19 2014-09-04 Central Research Institute Of Electric Power Industry Method for producing ethanol from waste glycerol
WO2019097921A1 (en) * 2017-11-17 2019-05-23 大成建設株式会社 Dioxane-degrading bacteria-immobilized carrier, biodegradation treatment method, and biodegradation treatment device
JPWO2019097921A1 (en) * 2017-11-17 2020-12-17 大成建設株式会社 Dioxane-degrading bacterium-fixed carrier, biodegradation method, and biodegradation device
JP7219225B2 (en) 2017-11-17 2023-02-07 大成建設株式会社 Dioxane-degrading bacteria fixed carrier, biodegradation method, and biodegradation device
US11618699B2 (en) 2017-11-17 2023-04-04 Taisei Corporation Dioxane-degrading bacteria-immobilized carrier, biodegradation treatment method, and biodegradation treatment apparatus
CN109321490A (en) * 2018-09-30 2019-02-12 浙江工业大学 Clostridium perfringen ZJB-17003 and its application
CN115305227A (en) * 2022-09-22 2022-11-08 郑州轻工业大学 Enterobacter hollisae ZJ-21 for degrading waste tobacco leaves and producing hydrogen and application thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP5196423B2 (en) 2013-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5196423B2 (en) New Enterobacter aerogenes strains and their use
Sinha et al. Biohydrogen production from various feedstocks by Bacillus firmus NMBL-03
Saripan et al. Biohydrogen production by Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum KKU-ED1: Culture conditions optimization using mixed xylose/arabinose as substrate
CN113481118B (en) Acid-resistant, salt-resistant, heat-resistant and organic matter degradation bacillus subtilis and application thereof in kitchen waste recycling
US10301652B2 (en) Process for hydrogen production from glycerol
Guevara-López et al. Evaluation of different support materials used with a photo-fermentative consortium for hydrogen production
Liu et al. Characteristics for production of hydrogen and bioflocculant by Bacillus sp. XF-56 from marine intertidal sludge
Li et al. Screening, purification and characterization of lipase from Burkholderia pyrrocinia B1213
Zheng Screening and identification of lipase producing bacterium
JP4665157B2 (en) Process for producing hydrogen and ethanol from biodiesel wastewater
Chaturvedi et al. Isolation of lipase producing bacteria from oil contaminated soil for the production of lipase by solid state fermentation using coconut oil cake
Liu et al. Optimization of photo-hydrogen production by immobilized Rhodopseudomonas faecalis RLD-53
CN105861373B (en) It is a kind of produce keratinase pseudomonas aeruginosa and its application
WO2021056683A1 (en) Strain for producing lipase and application thereof
CN104561059B (en) Cold esterase and its encoding gene E40 are fitted with application in a kind of ocean
WO2022262874A1 (en) Burkholderia sp. and method for producing fr901464 by fermentation thereof
CN113913347B (en) Paenibacillus balun TZ-1 and application thereof
JP5219050B2 (en) Oil-degrading bacteria and oil-degrading agents
CA2945507C (en) Process for hydrogen production from glycerol
CN102174422B (en) Organic solvent-resistant lipase production strain, gene of lipase and application of lipase
JP5667174B2 (en) Novel microorganism, hydrogen production method using the same, 1,3-propanediol production method and biodiesel waste liquid treatment method
Mohseni et al. Isolation and optimization of ethanol producing bacteria from natural environments of mazandaran province in Iran
CN114891706B (en) High acid-resistant acetobacter and application thereof
JP5521146B2 (en) Oil-degrading bacteria and oil-degrading agents
CN113512512B (en) Seawater nitrate reducing bacteria and application thereof in PHA production

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20101014

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20121002

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20121116

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20121211

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20121220

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20130122

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20130130

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160215

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees