JP2009171895A - Method for analyzing function of intranuclear non-coding rna - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for analyzing the function of a non-coding RNA (ncRNA) existing in a nucleus by destroying the ncRNA. <P>SOLUTION: The method for analyzing the function of a target ncRNA includes introducing an antisense oligo-molecule containing substantially the same sequence as a sequence complementary to a single-stranded region in the secondary structure of the target ncRNA to a cell nucleus and destroying the RNA molecule. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明はノンコーディングRNAの機能を解析する方法に関する。より詳細には、本発明は、細胞核内に存在するノンコーディングRNAの機能を解析する方法に関する。   The present invention relates to a method for analyzing the function of non-coding RNA. More specifically, the present invention relates to a method for analyzing the function of non-coding RNA present in the cell nucleus.

細胞の標的遺伝子の発現阻害方法のひとつとして2本鎖RNAを該細胞に導入することによりその配列に相同性を持つmRNAの分解を促進し、結果的にmRNAの鋳型となる遺伝子の発現を阻害する方法（以下、「RNAi法」とも称する）がある。細胞において発現している多くの遺伝子は未だその機能が未知であるものが多く、遺伝子発現阻害は遺伝子の機能解析において重要な方法である（非特許文献1）。   Introducing double-stranded RNA into the cell as one method of inhibiting the expression of the target gene in the cell promotes the degradation of mRNA that has homology to the sequence, and consequently inhibits the expression of the gene that serves as the template for the mRNA (Hereinafter, also referred to as “RNAi method”). Many genes expressed in cells still have unknown functions, and inhibition of gene expression is an important method in gene function analysis (Non-patent Document 1).

またRNAi法以前から用いられている遺伝子発現抑制方法として1本鎖のRNAを用いるアンチセンスRNA法やRNAとRNase耐性を有するヌクレオチドとのハイブリッド分子を用いるキメラオリゴ法が知られているが、これらの手法はキメラオリゴ分子の導入が細胞毒性を誘導すること（非特許文献2）や遺伝子破壊がより効率的なRNAi法の出現により利用されなくなっている。   In addition, antisense RNA methods using single-stranded RNA and chimeric oligo methods using hybrid molecules of RNA and RNase-resistant nucleotides are known as gene expression suppression methods used before the RNAi method. The method is not used due to the introduction of a chimeric oligo molecule that induces cytotoxicity (Non-Patent Document 2) and the emergence of RNAi methods that make gene disruption more efficient.

従来、遺伝子は主としてタンパク質の設計図であるとの認識から、タンパク質に翻訳されるmRNAを標的として機能解析技術が開発されていた。しかし、ヒトを含む多くの生物のゲノム解析や発現遺伝子解析の進展によりタンパク質に翻訳されないRNA分子（以下、「ncRNA」: non-coding RNAと称する）が非常に多く存在すること、これらのncRNAが細胞の遺伝子発現調節に関わることにより、細胞の分化や状態の維持に重要な役割を果たしていることが理解されてきた。   Conventionally, functional analysis techniques have been developed targeting mRNAs that are translated into proteins based on the recognition that genes are mainly blueprints for proteins. However, due to the progress of genome analysis and expression gene analysis of many organisms including humans, there are very many RNA molecules (hereinafter referred to as “ncRNA”: non-coding RNA), and these ncRNAs It has been understood that it plays an important role in cell differentiation and state maintenance by being involved in regulation of cellular gene expression.

これらのncRNA中で、細胞質に分泌されるタンパク質翻訳型のmRNAと異なり、細胞核の中で機能する分子が多数存在することが知られており、これらのncRNAが遺伝子の転写制御やRNA分子の成熟過程に関与することを示す文献や特定の疾患に関わることを示す報告がされているが、まだそのほとんどの分子は機能未知である。これら核内で機能するRNA分子の機能解析は生物の生体反応を理解する上で重要な標的分子であるが、現在までにこれらの効率的な破壊方法は報告されていない。   Among these ncRNAs, it is known that there are many molecules that function in the cell nucleus, unlike protein-translated mRNAs that are secreted into the cytoplasm. These ncRNAs regulate gene transcription and maturation of RNA molecules. There are reports that show that it is involved in the process and that it is related to specific diseases, but most of its molecules are still unknown in function. Functional analysis of RNA molecules that function in these nuclei is an important target molecule for understanding biological reactions of living organisms, but no efficient destruction method has been reported to date.

Fire et al., Nature. 391:806-811, 1998Fire et al., Nature. 391: 806-811, 1998 Drygin et al., Nucleic Acids Res., 32: 6585-6594, 2004Drygin et al., Nucleic Acids Res., 32: 6585-6594, 2004

従来の遺伝子機能解析は、タンパク質に翻訳されるmRNA、すなわち細胞質に分泌されるRNAをターゲットとして開発されている。例えば、近年頻繁に利用されているRNAi法は、細胞質に存在するRNA分解機構を利用したRNA破壊を用いて遺伝子発現を抑制する。   Conventional gene function analysis has been developed targeting mRNA that is translated into protein, that is, RNA that is secreted into the cytoplasm. For example, the RNAi method that has been frequently used in recent years suppresses gene expression using RNA destruction utilizing an RNA degradation mechanism existing in the cytoplasm.

一方、核内に存在するRNA分子に対しては、細胞質に存在するRNA分解機構が利用できないため、従来のRNAi法等では核内RNA分子の破壊による機能解析を実施し得ない。   On the other hand, for RNA molecules present in the nucleus, the RNA degradation mechanism present in the cytoplasm cannot be used, and therefore, functional analysis based on destruction of nuclear RNA molecules cannot be performed by the conventional RNAi method or the like.

そこで本発明は、核内に存在するncRNAを破壊することにより、該分子の機能を解析する方法を提供することを目的とする。   Therefore, an object of the present invention is to provide a method for analyzing the function of the molecule by destroying ncRNA present in the nucleus.

本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、核内に存在する標的ncRNAに対するアンチセンスオリゴ分子を細胞核内に導入することにより、該RNA分子を破壊できることを見出し、本発明を完成させるに至った。   As a result of intensive studies, the present inventors have found that an RNA molecule can be destroyed by introducing an antisense oligo molecule against a target ncRNA present in the nucleus into the cell nucleus, and the present invention has been completed. It was.

すなわち、本発明は以下の特徴を包含する：
(1) 細胞核内に存在するノンコーディングRNA（non-coding RNA）の機能を解析する方法であって、該RNA分子に対するアンチセンスオリゴ分子を細胞核内に導入して、該RNA分子を破壊することを含む、前記方法。 That is, the present invention includes the following features:
(1) A method for analyzing the function of non-coding RNA existing in the cell nucleus, which comprises introducing an antisense oligo molecule against the RNA molecule into the cell nucleus to destroy the RNA molecule. Said method.

(2) 前記アンチセンスオリゴ分子は、前記RNA分子の二次構造における一本鎖領域に相補的な配列と少なくとも80％の同一性を有する塩基配列を含むことを特徴とする、上記(1)記載の方法。   (2) The antisense oligo molecule comprises a base sequence having at least 80% identity with a sequence complementary to a single-stranded region in the secondary structure of the RNA molecule (1) The method described.

(3) 前記アンチセンスオリゴ分子は、前記RNA分子の二次構造における一本鎖領域に相補的な塩基配列を含むことを特徴とする上記(2)記載の方法。   (3) The method according to (2) above, wherein the antisense oligo molecule comprises a base sequence complementary to a single-stranded region in the secondary structure of the RNA molecule.

(4) 前記一本鎖領域は、前記RNA分子の二次構造解析により予め推定された領域であることを特徴とする上記(2)記載の方法。   (4) The method according to (2) above, wherein the single-stranded region is a region preliminarily estimated by secondary structure analysis of the RNA molecule.

(5) 前記一本鎖領域は、前記RNA分子に特異的な配列領域であることを特徴とする上記(2)記載の方法。   (5) The method according to (2) above, wherein the single-stranded region is a sequence region specific to the RNA molecule.

(6) 前記アンチセンスオリゴ分子は、核酸類似物質が導入されたキメラアンチセンスオリゴ分子であることを特徴とする上記(1)〜(5)のいずれか記載の方法。   (6) The method according to any one of (1) to (5) above, wherein the antisense oligo molecule is a chimeric antisense oligo molecule into which a nucleic acid analog is introduced.

(7) 核酸類似物質は、2'-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする上記(6)記載の方法。   (7) The method according to (6) above, wherein the nucleic acid analogue is 2′-O-methylribonucleotide.

(8) 前記アンチセンスオリゴ分子の細胞核内への導入をエレクトロポレーション法により実施することを特徴とする上記(1)〜(7)のいずれか記載の方法。   (8) The method according to any one of (1) to (7) above, wherein the antisense oligomolecule is introduced into the cell nucleus by electroporation.

本発明によれば、核内に存在する標的ncRNAを破壊することができ、該RNA分子を機能解析することができる。   According to the present invention, the target ncRNA present in the nucleus can be destroyed, and the RNA molecule can be functionally analyzed.

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、核内に存在するncRNAの機能を解析する方法に関する。より具体的に、本発明の方法は、細胞核内に存在する標的ncRNAを破壊することによって、該RNA分子を機能解析することを含む。ここで、ncRNAの機能解析としては、該RNA分子の機能を推定・同定すること等が挙げられる。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention relates to a method for analyzing the function of ncRNA present in the nucleus. More specifically, the method of the present invention includes functional analysis of the RNA molecule by destroying a target ncRNA present in the cell nucleus. Here, functional analysis of ncRNA includes estimation and identification of the function of the RNA molecule.

本発明の方法において、細胞核内に存在する標的ncRNAの破壊は、該RNA分子に対するアンチセンスオリゴ分子を細胞核内に導入することにより行う。   In the method of the present invention, the target ncRNA present in the cell nucleus is destroyed by introducing an antisense oligo molecule against the RNA molecule into the cell nucleus.

ここで、本明細書で使用する「細胞核内に存在するncRNA」又は「標的ncRNA」とは、タンパク質に翻訳されないncRNAのうち、細胞核の中で機能するRNA分子を指し、該分子が本発明のアンチセンスオリゴ分子と二重鎖を形成する一本鎖領域を構成するものであれば特に制限されない。換言すると、本発明に係る機能解析方法で使用するアンチセンスオリゴ分子は、標的ncRNAの二次構造における一本鎖領域に相補的な配列と実質的に同一の塩基配列を含む。   As used herein, “ncRNA present in the cell nucleus” or “target ncRNA” refers to an RNA molecule that functions in the cell nucleus among ncRNAs that are not translated into protein, and the molecule is the one of the present invention. There is no particular limitation as long as it constitutes a single-stranded region that forms a double strand with the antisense oligo molecule. In other words, the antisense oligo molecule used in the functional analysis method according to the present invention includes a base sequence substantially identical to a sequence complementary to a single-stranded region in the secondary structure of the target ncRNA.

本明細書で使用する「実質的に同一」とは、標的ncRNAの二次構造における一本鎖領域に相補的な配列と、少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも97％、98％又は99％の同一性を有することを指す。なお、本明細書において「同一性」の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えばBLASTP、BLASTN、FASTAなど）をデフォルトの設定で使用することにより算出した値を意味する。本発明のアンチセンスオリゴ分子が、前記一本鎖領域に相補的な配列を含むことが最も好ましい。   As used herein, “substantially identical” means at least 80%, preferably at least 85%, more preferably at least 90%, with a sequence complementary to a single stranded region in the secondary structure of the target ncRNA. More preferably it refers to having at least 95% identity, most preferably at least 97%, 98% or 99% identity. In this specification, the value of “identity” means a value calculated by using software (for example, BLASTP, BLASTN, FASTA, etc.) that calculates the identity between a plurality of base sequences with default settings. . Most preferably, the antisense oligo molecule of the present invention comprises a sequence complementary to the single-stranded region.

本発明に用いるアンチセンスオリゴ分子において、標的ncRNAとの結合領域であるアンチセンス領域を構成する塩基数は特に制限されないが、該領域を構成する塩基数が少ないと標的ncRNAと二重鎖を形成することが困難になり、多すぎると非標的配列との非特異的結合が生じる点に留意すべきことは言うまでもない。最適なアンチセンス領域の長さは、当業者に公知であるか又は当業者が適宜設定することができ、これに限定されるものではないが、例えば10〜40塩基長、好ましくは15〜27塩基長、例えば20塩基長である。また上記アンチセンス領域は、アンチセンスオリゴ分子内において連続して存在する必要はない。すなわち上記アンチセンス領域は、標的ncRNAと二重鎖を形成することができる限り、1個又は数個の非相補的塩基を1又は数箇所に介在させてもよい。   In the antisense oligo molecule used in the present invention, the number of bases constituting the antisense region, which is a binding region with the target ncRNA, is not particularly limited, but if the number of bases constituting the region is small, a duplex is formed with the target ncRNA. Of course, it should be noted that non-specific binding to non-target sequences would be difficult to do. The optimal length of the antisense region is known to those skilled in the art or can be appropriately set by those skilled in the art, and is not limited thereto. For example, the length is 10 to 40 bases, preferably 15 to 27. The base length is, for example, 20 bases. The antisense region does not need to be continuously present in the antisense oligo molecule. That is, as long as the antisense region can form a duplex with the target ncRNA, one or several non-complementary bases may be interposed in one or several places.

かかるアンチセンスオリゴ分子は、標的ncRNAに特異的な配列領域として予め同定された領域と相補的な配列と実質的に又は完全に同一の配列を含むように設計することができる。これにより、本発明のアンチセンスオリゴ分子による標的ncRNAの特異的な破壊の精度を向上させることができる。このような特異的配列領域は、例えば設計対象とする配列領域を遺伝子データベースに登録されている当該生物のゲノム情報と比較することにより決定することができる。   Such an antisense oligo molecule can be designed to contain a sequence that is substantially or completely identical to a sequence that is complementary to a region previously identified as a sequence region specific for the target ncRNA. Thereby, the precision of the specific destruction of the target ncRNA by the antisense oligo molecule of the present invention can be improved. Such a specific sequence region can be determined, for example, by comparing the sequence region to be designed with the genome information of the organism registered in the gene database.

また本発明のアンチセンスオリゴ分子による標的ncRNAの特異的な破壊の精度を向上させるその他の方法として、これに限定されるものではないが、例えば特表2003-500064号などに開示される手法を挙げることができ、本発明においてこれらの手法を使用することもできる。   Further, as another method for improving the accuracy of specific destruction of the target ncRNA by the antisense oligo molecule of the present invention, the method disclosed in, for example, Special Table 2003-500064 is not limited thereto. These techniques can also be used in the present invention.

本発明のアンチセンスオリゴ分子は、当業者に周知の方法、例えば適当な配列のクローニング及び制限酵素による切断、ホスホトリエステル法（例えばNarangら，1979年，Meth.Enzymol.，第68巻，p90〜99参照）、ホスホジエステル法（例えばBrownら，1979年、Meth.Enzymol.，第68巻，p109〜151参照）、エチルホスホアミダイト法（例えばBeaucageら，1981年，Tetrahedron Lett.，第22巻，p1859〜1862参照）などの方法により、直接的に合成することができる。また市販の自動DNA合成装置を使用することによって合成してもよい。その際、機能解析の標的とするncRNAの塩基配列に基づいて、該ncRNAの二次構造における一本鎖領域を予め推定しておくことが好ましい。かかる二次構造解析は、これに限定されるものではないが、例えばRNAfold、RNAz、MFOLDなど、当業者に公知の二次構造予測プログラムを使用することによって行うことができる。   Antisense oligo molecules of the present invention can be prepared by methods well known to those skilled in the art, such as cloning of appropriate sequences and cleavage by restriction enzymes, phosphotriester methods (eg, Narang et al., 1979, Meth. Enzymol., 68, p90). -99), phosphodiester method (see, for example, Brown et al., 1979, Meth. Enzymol., Vol. 68, p109-151), ethyl phosphoramidite method (for example, Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett., Vol. 22). , P1859 to 1862), and the like. Moreover, you may synthesize | combine by using a commercially available automatic DNA synthesizer. At that time, it is preferable to preliminarily estimate a single-stranded region in the secondary structure of the ncRNA based on the base sequence of the ncRNA targeted for functional analysis. Such secondary structure analysis is not limited to this, but can be performed by using a secondary structure prediction program known to those skilled in the art, such as RNAfold, RNAz, and MFOLD.

本発明のアンチセンスオリゴ分子は、核酸類似物質の導入、ヘアピンループ構造を形成する塩基の導入等により、核内に存在する核酸分解酵素に対する耐性が付与されたものであることが好ましい。これにより、核内に存在する種々の核酸分解酵素による分解により本発明のアンチセンスオリゴ分子が標的ncRNAと結合する前に消失してしまうのを回避し、より効率的に標的ncRNAを破壊することができる。   It is preferable that the antisense oligomolecule of the present invention has been given resistance to a nucleolytic enzyme present in the nucleus by introduction of a nucleic acid analog or a base that forms a hairpin loop structure. This prevents the antisense oligo molecule of the present invention from disappearing before binding to the target ncRNA due to degradation by various nucleolytic enzymes present in the nucleus, and destroys the target ncRNA more efficiently. Can do.

本発明のアンチセンスオリゴ分子は、核酸類似物質の導入により核酸分解酵素に対する耐性が付与されたキメラアンチセンスオリゴ分子であることが好ましい。具体的に、本発明のキメラアンチセンスオリゴ分子とは、アンチセンスオリゴ分子内の塩基の一部が核酸類似物質で置き換えられたものを指す。   The antisense oligo molecule of the present invention is preferably a chimeric antisense oligo molecule to which resistance to a nucleolytic enzyme is imparted by introduction of a nucleic acid analog. Specifically, the chimeric antisense oligo molecule of the present invention refers to one in which a part of the base in the antisense oligo molecule is replaced with a nucleic acid analog.

本発明に使用できる核酸類似物質として、これに限定されるものではないが、例えば2’-O-メチルリボヌクレオチド、モルフォリノオリゴ、2’-4’-BNA、Locked nucleic acid (LNA)などを挙げることができる。本発明では、核酸類似物質として2'-O-メチルリボヌクレオチドを使用することが好ましい。   Examples of nucleic acid analogs that can be used in the present invention include, but are not limited to, 2′-O-methylribonucleotide, morpholino oligo, 2′-4′-BNA, Locked nucleic acid (LNA) and the like. Can be mentioned. In the present invention, 2′-O-methyl ribonucleotide is preferably used as the nucleic acid analog.

本発明のキメラアンチセンスオリゴ分子は当業者に公知の方法を用いて合成することができる。例えば、核酸類似物質として2’-O-メチルリボヌクレオチドを使用する場合には、5'-ジメトキシトリチル-2’-O-メチルリボヌクレオシド-3’-〔(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)〕-ホスホロアミダイトユニットを用いて、ホスホロアミダイト法によるDNA/RNA自動合成機を利用して目的のキメラアンチセンスオリゴ分子を合成することができる。   The chimeric antisense oligo molecule of the present invention can be synthesized using methods known to those skilled in the art. For example, when 2′-O-methyl ribonucleotide is used as a nucleic acid analog, 5′-dimethoxytrityl-2′-O-methyl ribonucleoside-3 ′-[(2-cyanoethyl)-(N, N -Diisopropyl)]-phosphoramidite units can be used to synthesize target chimeric antisense oligo molecules using an automated DNA / RNA synthesizer by the phosphoramidite method.

核酸類似物質を導入するアンチセンスオリゴ分子内の塩基の最適な位置及び数は、アンチセンスオリゴ分子の全長及び配列に依存する二次構造やGC含量などによって変化するものであるが、標的ncRNAとの二重鎖形成前の分解を回避でき、かつ標的ncRNAとの二重鎖形成後に核酸分解酵素による分解が生じる限り特に限定されず、当業者は適宜導入塩基の位置及び数を決定することができる。本発明のキメラアンチセンスオリゴ分子の一例として、図1にその両末端の各5塩基に核酸類似物質を導入した20塩基長のアンチセンス領域からなる分子を示す。図中、Xは標的とする遺伝子に応じて設計される任意の塩基を表し、両末端各5塩基に核酸分解酵素に対する抵抗性付与を目的として2’-O-メチルリボヌクレオチドを用いている。かかる構造を有する例示の分子は、下記の実施例において、特定の標的ncRNAを特異的に破壊する分子として有効であることが示されている。   The optimal position and number of bases in an antisense oligo molecule into which a nucleic acid analog is introduced varies depending on the total length and sequence of the antisense oligo molecule, such as the secondary structure and GC content. Is not particularly limited as long as degradation by nucleolytic enzymes occurs after duplex formation with the target ncRNA, and those skilled in the art can appropriately determine the position and number of the introduced base. it can. As an example of the chimeric antisense oligo molecule of the present invention, FIG. 1 shows a molecule composed of a 20-base long antisense region into which a nucleic acid analog is introduced at each of the 5 bases at both ends. In the figure, X represents an arbitrary base designed according to the target gene, and 2'-O-methylribonucleotide is used for the purpose of imparting resistance to nucleolytic enzyme at each of the 5 bases at both ends. Exemplary molecules having such a structure have been shown to be effective as molecules that specifically destroy specific target ncRNAs in the examples below.

上記のようにして合成した本発明のアンチセンスオリゴ分子を細胞核内に導入すると、核内に存在する標的ncRNAと該アンチセンスオリゴ分子とが二重鎖を形成し、核内に存在する核酸分解酵素（例えばRNAse）によって該二重鎖が分解されることで、標的ncRNAを破壊することができる。   When the antisense oligo molecule of the present invention synthesized as described above is introduced into the cell nucleus, the target ncRNA present in the nucleus and the antisense oligo molecule form a duplex, and the nucleic acid degradation present in the nucleus is degraded. The target ncRNA can be destroyed by degrading the duplex by an enzyme (for example, RNAse).

本発明のアンチセンスオリゴ分子の導入の対象となる細胞としては、これに限定されるものではないが、例えば動物(例えばヒト)又は植物由来の生細胞、或いはそれらの培養細胞などを挙げることができ、該細胞が由来する器官、組織等も制限されない。   The cells to which the antisense oligomolecule of the present invention is to be introduced are not limited to these, but examples include living cells derived from animals (for example, humans) or plants, or cultured cells thereof. The organs and tissues from which the cells are derived are not limited.

本発明のアンチセンスオリゴ分子の細胞核内への導入は、核酸分子を細胞内に導入することができる当業者に公知の方法を用いて実施することができる。かかる方法として、これに限定されるものではないが、例えばエレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、ウイルスベクター法等を挙げることができる。   Introduction of the antisense oligomolecule of the present invention into the cell nucleus can be carried out using methods known to those skilled in the art that can introduce nucleic acid molecules into cells. Examples of such methods include, but are not limited to, electroporation method, lipofection method, calcium phosphate method, microinjection method, and viral vector method.

アンチセンスオリゴ分子の細胞核内への導入を、エレクトロポレーション法を用いて実施する（本明細書中、「ヌクレオフェクション」ともいう）ことが特に好ましい。エレクトロポレーション法は、高電圧パルスで一時的に脂質二重層の細胞膜構造を不安定化して孔を生じさせ、そこから核酸分子を取り込ませる方法であり、一般的に、導入効率に優れ、導入が困難な細胞にも導入が可能であるという利点を有する。本発明においても、エレクトロポレーション法を用いた細胞へのアンチセンスオリゴ分子の導入は、細胞種を問わず核内標的ncRNAの高い破壊効率を達成していることから（例えば図5、図7参照）、アンチセンスオリゴ分子の核内への効率的な導入にエレクトロポレーションが有効であることが示されている。またエレクトロポレーションによるアンチセンスオリゴ分子の導入は、導入後の高い細胞生存率をも実現しており（下記実施例参照）、細胞毒性の観点からも好ましい手法であることが示されている。またエレクトロポレーションに採用されるべき電圧、パルスの長さは、標的細胞の種類、培養条件、エレクトロポレーションに用いる溶液の組成などに応じて当業者が適宜設定することができ、これに限定されるものではないが、それぞれ500〜800V/cm、10〜25ミリ秒、例えば550V/cm、25ミリ秒で行うことができる。本発明において、エレクトロポレーションに使用する培養条件、エレクトロポレーション用溶液の組成は、細胞内への核酸の導入の際に当業者に一般的に使用されているものを用いればよく、特別な条件及び組成を用いる必要はない。   It is particularly preferable to introduce the antisense oligo molecule into the cell nucleus using an electroporation method (also referred to herein as “nucleofection”). The electroporation method is a method in which the lipid bilayer's cell membrane structure is temporarily destabilized with a high voltage pulse to create pores, and nucleic acid molecules are taken in from the pores. However, it has the advantage that it can be introduced even into difficult cells. Also in the present invention, introduction of antisense oligo molecules into cells using electroporation achieves high destruction efficiency of nuclear target ncRNA regardless of cell type (for example, FIG. 5 and FIG. 7). (See, for example), electroporation has been shown to be effective for the efficient introduction of antisense oligomolecules into the nucleus. In addition, introduction of antisense oligo molecules by electroporation also realizes a high cell viability after introduction (see Examples below), which is a preferable technique from the viewpoint of cytotoxicity. The voltage and pulse length to be employed for electroporation can be appropriately set by those skilled in the art depending on the type of target cell, culture conditions, composition of the solution used for electroporation, and the like. Although not, it can be performed at 500 to 800 V / cm and 10 to 25 milliseconds, for example, 550 V / cm and 25 milliseconds, respectively. In the present invention, the culture conditions used for electroporation and the composition of the electroporation solution may be those commonly used by those skilled in the art when introducing nucleic acids into cells. It is not necessary to use conditions and compositions.

本発明において、エレクトロポレーションに当業者に公知の核酸導入装置を使用することができる。かかる核酸導入装置として、これに限定されるものではないが、例えばヌクレオフェクター（アマクサ社製）、ジーンパルサー（バイオラッド社製）などを使用することができる。   In the present invention, a nucleic acid introduction apparatus known to those skilled in the art can be used for electroporation. Examples of such a nucleic acid introduction device include, but are not limited to, a nucleofecter (manufactured by Amakusa), a gene pulser (manufactured by Bio-Rad), and the like.

図2に、エレクトロポレーションの原理を利用する核酸導入装置を用いた、培養細胞に対する核酸分子導入方法の概略図を示す。培養細胞が接着性を有する場合はトリプシン処理等によって細胞を浮遊化したのち、核酸導入装置を用いて本発明のアンチセンスオリゴ分子を細胞に導入し、その後、導入処理を行った細胞を細胞種に適した培地上で培養して、標的ncRNAの機能解析を行う。   FIG. 2 shows a schematic diagram of a method for introducing nucleic acid molecules into cultured cells using a nucleic acid introduction device utilizing the principle of electroporation. When the cultured cells have adhesiveness, the cells are suspended by trypsin treatment or the like, and then the antisense oligo molecule of the present invention is introduced into the cells using a nucleic acid introduction device. Cultivate on a suitable medium for functional analysis of the target ncRNA.

標的ncRNAの機能は、本発明のアンチセンスオリゴ分子の細胞核内への導入後、例えば導入していない細胞に比較して発現量が増加した遺伝子を同定すること、該細胞に現れる表現形の変化を解析すること、顕微鏡等を用いて細胞の構造等を観察すること等によって同定・推定することができる。   The function of the target ncRNA is to identify a gene whose expression level is increased after introduction of the antisense oligo molecule of the present invention into the cell nucleus, for example, compared to a non-introduced cell, and to change the phenotype appearing in the cell. And the like can be identified and estimated by observing the cell structure using a microscope or the like.

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこの実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, the scope of the present invention is not limited to this Example.

（１）アンチセンスオリゴ分子の設計と合成
核内で機能するncRNAであるU7 RNAを破壊の標的分子とした。U7 RNAの塩基配列情報を用いて該RNA分子の二次構造解析をMFOLDを用いて行い、機能部位である1本鎖領域を算出した。U7 RNAの1本鎖領域に対して相補的な20塩基のアンチセンスオリゴ配列を設計した。このアンチセンスオリゴ配列に基づいて、細胞内における非特異的な分解に抵抗性を持たせる目的で両末端の各5塩基に2’-O-メチルリボヌクレオチドを持つキメラアンチセンスオリゴ核酸を化学合成した。合成したオリゴ配列は以下の通りである：
U7用キメラオリゴ：5'-mUmUmCmUmAAAAGAGCTGTmAmAmCmAmC-3'
次にU7 RNA同様に核内で機能するncRNAとして知られるU84 RNA、及び対照実験用としてヒトには存在しないGFP RNAに対しても同様にキメラアンチセンスオリゴ核酸の合成を行った。合成したキメラアンチセンスオリゴ核酸の配列を以下に示す：
U84用キメラオリゴ：5'-mCmAmAmGmGGTGATAGATGmAmGmGmGmU-3'
GFP用キメラオリゴ：5'-mUmCmAmCmCTTCACCCTCTmCmCmAmCmU-3' (1) Design and synthesis of antisense oligo molecules U7 RNA, an ncRNA that functions in the nucleus, was used as a target molecule for destruction. The secondary structure analysis of the RNA molecule was performed using MFOLD using the base sequence information of U7 RNA, and the single-stranded region that was a functional site was calculated. A 20-base antisense oligo sequence complementary to the single-stranded region of U7 RNA was designed. Based on this antisense oligo sequence, chemically synthesized a chimeric antisense oligonucleic acid with 2'-O-methylribonucleotides at each of the 5 bases at both ends for the purpose of resisting nonspecific degradation in the cell. did. The synthesized oligo sequences are as follows:
Chimera oligo for U7: 5'-mUmUmCmUmAAAAGAGCTGTmAmAmCmAmC-3 '
Next, chimeric antisense oligonucleic acids were similarly synthesized for U84 RNA known as ncRNA functioning in the nucleus like U7 RNA and GFP RNA not present in humans for control experiments. The sequence of the synthesized chimeric antisense oligonucleic acid is shown below:
Chimeric oligo for U84: 5'-mCmAmAmGmGGTGATAGATGmAmGmGmGmU-3 '
Chimeric oligo for GFP: 5'-mUmCmAmCmCTTCACCCTCTmCmCmAmCmU-3 '

（２）U7 RNAの破壊実験
培養して得たヒト由来の培養細胞であるHeLa細胞にトリプシン処理を行って細胞を浮遊化し、約百万個の細胞群を得た。これらの細胞群に対して合成したU7 RNAに相補的な塩基配列を有するキメラアンチセンスオリゴ核酸を、上記非特許文献2に記載の遺伝子破壊に必要なオリゴヌクレオチドの50％有効量（2.2μM）より低濃度の1μMの濃度で添加し、エレクトロポレーション法を用いた核酸導入装置であるヌクレオフェクター（アマクサ社製）を説明書にしたがって使用し核酸導入を行った。核酸導入を行った細胞を引き続いて培地上で培養を行い、これらの細胞中に存在するU7 RNA分子の量をRNaseプロテクションアッセイ法(例えばHirose & Steitz, PNAS 98: 12914-12919, 2001参照)によって観察した。対照実験として行ったキメラオリゴを加えなかった実験区（-oligo）及びGFP用キメラオリゴを加えた実験区では核酸導入処理後48時間経過した時点においてU7 RNAの存在が確認された。しかし、U7 RNA用キメラオリゴを加えた実験区では培養時間24時間及び48時間のいずれの時間においてもU7 RNAの顕著な減少が確認された（図3）。本結果から本発明者らの合成したU7用キメラオリゴをヌクレオフェクターによってHeLa細胞に導入することにより、低濃度のキメラオリゴ分子でも効率的にU7 RNAの破壊が誘導されることが明らかになった。また本RNaseプロテクションアッセイ法でU7 RNAの顕著な減少が観察された事実から、本発明者らの開発したncRNAの破壊方法によって、細胞内に存在する標的ncRNAが破壊されること、また標的ncRNA破壊処理を行った細胞群の全体にその効果が見られることが確認された。 (2) U7 RNA destruction experiment HeLa cells, which are human-derived cultured cells obtained by culturing, were trypsinized to float the cells, and about 1 million cell groups were obtained. A chimeric antisense oligonucleic acid having a base sequence complementary to U7 RNA synthesized for these cell groups, 50% effective amount (2.2 μM) of the oligonucleotide required for gene disruption described in Non-Patent Document 2 above Nucleofector (manufactured by Amakusa Co., Ltd.), which is a nucleic acid introduction apparatus using electroporation method, was added according to the instructions and added at a lower concentration of 1 μM. The cells into which the nucleic acid has been introduced are subsequently cultured on a medium, and the amount of U7 RNA molecules present in these cells is determined by RNase protection assay (see, for example, Hirose & Steitz, PNAS 98: 12914-12919, 2001). Observed. The presence of U7 RNA was confirmed at 48 hours after the nucleic acid introduction treatment in the experimental group where the chimeric oligo was not added (-oligo) and the experimental group where the chimeric oligo for GFP was added. However, in the experimental group to which the chimeric oligo for U7 RNA was added, a significant decrease in U7 RNA was confirmed at both the culture time of 24 hours and 48 hours (FIG. 3). From these results, it has been clarified that the introduction of the chimeric oligo for U7 synthesized by the present inventors into HeLa cells using a nucleofector efficiently induces destruction of U7 RNA even with a low concentration of the chimeric oligo molecule. In addition, due to the fact that a significant decrease in U7 RNA was observed in this RNase protection assay, the ncRNA destruction method developed by the present inventors destroyed target ncRNA present in cells, and also destroyed target ncRNA. It was confirmed that the effect was observed in the whole treated cell group.

（３）U7 RNAの機能解析実験
機能解析手法として標的ncRNAの破壊が細胞の遺伝子発現に与える影響を解析する目的でマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析を行った。U7用キメラオリゴの導入によってU7 RNAの破壊を行ったHeLa細胞より全RNAを抽出精製してAgilent社製のマイクロアレイ（44k Whole Human Genome Oligo Microarray）を用いて遺伝子発現解析を行い、対象実験としてGFP用キメラオリゴの導入を行ったHeLa細胞の発現遺伝子と比較し、U7 RNAの破壊の影響を観察した。解析を行ったヒト遺伝子22,833遺伝子中、U7 RNAの遺伝子破壊によって細胞内に遺伝子量に2倍以上の変化が観察された遺伝子は93遺伝子であった（図4）。この93遺伝子の内50遺伝子は細胞内においてヒストン遺伝子の合成に関連がある遺伝子群であったことから、U7 RNAは核内においてヒストン遺伝子合成に関連する機能を有することが推察された。 (3) U7 RNA functional analysis experiment As a functional analysis method, gene expression analysis was performed using a microarray for the purpose of analyzing the effect of target ncRNA destruction on cellular gene expression. Extract and purify total RNA from HeLa cells that had been disrupted by U7 RNA by introducing a chimeric oligo for U7, and performed gene expression analysis using an Agilent microarray (44k Whole Human Genome Oligo Microarray). The effect of U7 RNA disruption was observed in comparison with the expressed gene of HeLa cells into which the chimeric oligo was introduced. Among the analyzed human genes 22,833, 93 genes were observed to have a change of more than twice in the amount of genes in the cells due to U7 RNA gene disruption (FIG. 4). Of these 93 genes, 50 genes were a group of genes related to histone gene synthesis in the cells, so it was speculated that U7 RNA has a function related to histone gene synthesis in the nucleus.

（４）核酸導入方法の比較
核酸導入方法の比較として、既知の遺伝子導入方法であるエレクトロポレーション法とリポフェクタミン法とを比較した。標的ncRNA分子としてU84分子を選択し、先に合成したU84用キメラオリゴを用いて実験を行った。エレクトロポレーション法を用いた方法は標的ncRNA分子及び使用したキメラオリゴを除き、上記（２）と同様に行った。リポフェクタミンを用いた方法は、Invitogen社製Lipofectamine2000試薬をマニュアルに従いキメラオリゴと混合したものを細胞培養液に加えることにより行った。エレクトロポレーション法を用いた方法では核酸導入処理後3時間から72時間に至るまでU84分子が破壊されていることがRNaseプロテクションアッセイ法で確認されたが、リポフェクタミン法を用いた方法では十分なU84分子破壊が観察されなかった（図5）。また、エレクトロポレーション法を用いた方法では核酸導入処理後の培養において細胞はほぼ100％の生存率が観察されたが、リポフェクタミン法を用いた方法では一部の細胞が死滅する減少が観察された。この比較により、アンチセンスオリゴ分子の導入におけるエレクトロポレーションの使用は、細胞毒性が低く、効率的な標的分子の破壊を実現する有効な方法であることがわかった。 (4) Comparison of nucleic acid introduction methods As a comparison of nucleic acid introduction methods, the electroporation method, which is a known gene introduction method, and the lipofectamine method were compared. The U84 molecule was selected as the target ncRNA molecule, and experiments were performed using the previously synthesized chimeric oligo for U84. The method using the electroporation method was carried out in the same manner as in the above (2) except for the target ncRNA molecule and the used chimeric oligo. The method using Lipofectamine was performed by adding Lipofectamine 2000 reagent manufactured by Invitogen and chimera oligo according to the manual to the cell culture medium. In the method using the electroporation method, it was confirmed by the RNase protection assay that the U84 molecule was destroyed from 3 hours to 72 hours after the nucleic acid introduction treatment, but the method using the lipofectamine method is sufficient. No molecular breakdown was observed (Figure 5). In the method using the electroporation method, almost 100% of the cells were observed in the culture after the nucleic acid introduction treatment, but in the method using the lipofectamine method, a decrease in which some cells were killed was observed. It was. This comparison indicated that the use of electroporation in the introduction of antisense oligo molecules is an effective way to achieve efficient target molecule destruction with low cytotoxicity.

（５）導入する核酸構造の比較
遺伝子破壊を目的とする実験において多用される2重鎖RNA分子（siRNA）を比較対象として、ncRNA破壊効率の比較を行った。なお、本実験は、核内への導入に使用した核酸分子を除き、上記（４）と同様に行った。siRNAは細胞質に存在する遺伝子を標的としたRNAの破壊に効果的であるが、本実験の標的としたU84 RNAでは破壊の誘導が観察されなかった（図６）。本結果からキメラアンチセンスオリゴの利用が効果的であることが確認された。 (5) Comparison of Nucleic Acid Structures to be Introduced Comparison of ncRNA destruction efficiency was conducted using double-stranded RNA molecules (siRNA) frequently used in experiments aimed at gene destruction. This experiment was performed in the same manner as (4) except for the nucleic acid molecule used for introduction into the nucleus. siRNA is effective in destroying RNA targeting genes in the cytoplasm, but no induction of destruction was observed with U84 RNA targeted in this experiment (FIG. 6). From this result, it was confirmed that the use of the chimeric antisense oligo was effective.

（６）種々の培養細胞を用いたncRNA破壊実験
本発明のncRNA破壊方法をT細胞白血病由来のJurkat細胞、肺がん由来のMCR5、膀胱ガン由来のT24細胞に対して実施し、破壊の効果を検証した。Jurkat細胞ではU7 RNA、その他の細胞種ではHBII295 RNAを破壊の標的分子とし、上記（２）と同様の方法で行った。この検証実験により、本発明の方法は細胞種と標的分子とを限定することなく用いることが可能であることが確認された（図7）。 (6) ncRNA destruction experiment using various cultured cells The ncRNA destruction method of the present invention was performed on Jurkat cells derived from T cell leukemia, MCR5 derived from lung cancer, and T24 cells derived from bladder cancer to verify the destruction effect. did. In the same manner as in (2) above, U7 RNA was used for Jurkat cells, and HBII295 RNA was used as the target molecule for other cell types. From this verification experiment, it was confirmed that the method of the present invention can be used without limiting the cell type and the target molecule (FIG. 7).

図１は、本発明に用いるキメラアンチセンスオリゴ分子の構造の一例を示す。FIG. 1 shows an example of the structure of a chimeric antisense oligo molecule used in the present invention. 図２は、エレクトロポレーションの原理を利用する核酸導入装置を用いた、核酸分子導入方法の概略図を示す。FIG. 2 shows a schematic diagram of a method for introducing a nucleic acid molecule using a nucleic acid introduction device utilizing the principle of electroporation. 図３は、U7 RNA分子破壊実験の結果を示す。FIG. 3 shows the results of the U7 RNA molecule disruption experiment. 図４は、U7 RNA分子の破壊が及ぼす影響の解析結果を示す。FIG. 4 shows the results of analysis of the effect of destruction of U7 RNA molecules. 図５は、核酸導入方法による効果の比較を示す。FIG. 5 shows a comparison of the effects of the nucleic acid introduction method. 図６は、導入する核酸構造による効果の比較を示す。FIG. 6 shows a comparison of effects due to the introduced nucleic acid structure. 図７は、種々の細胞種に対するncRNA破壊の検証結果を示す。FIG. 7 shows the verification results of ncRNA destruction for various cell types.

Claims (8)

細胞核内に存在するノンコーディングRNA（non-coding RNA）の機能を解析する方法であって、該RNA分子に対するアンチセンスオリゴ分子を細胞核内に導入して、該RNA分子を破壊することを含む、前記方法。   A method for analyzing the function of a non-coding RNA present in a cell nucleus, comprising introducing an antisense oligo molecule against the RNA molecule into the cell nucleus to destroy the RNA molecule, Said method. 前記アンチセンスオリゴ分子は、前記RNA分子の二次構造における一本鎖領域に相補的な配列と少なくとも80％の同一性を有する塩基配列を含むことを特徴とする、請求項1記載の方法。   2. The method according to claim 1, wherein the antisense oligo molecule comprises a base sequence having at least 80% identity with a sequence complementary to a single-stranded region in the secondary structure of the RNA molecule. 前記アンチセンスオリゴ分子は、前記RNA分子の二次構造における一本鎖領域に相補的な塩基配列を含むことを特徴とする請求項2記載の方法。   3. The method according to claim 2, wherein the antisense oligo molecule comprises a base sequence complementary to a single-stranded region in the secondary structure of the RNA molecule. 前記一本鎖領域は、前記RNA分子の二次構造解析により予め推定された領域であることを特徴とする請求項2記載の方法。   3. The method according to claim 2, wherein the single-stranded region is a region preliminarily estimated by secondary structure analysis of the RNA molecule. 前記一本鎖領域は、前記RNA分子に特異的な配列領域であることを特徴とする請求項2記載の方法。   3. The method according to claim 2, wherein the single-stranded region is a sequence region specific to the RNA molecule. 前記アンチセンスオリゴ分子は、核酸類似物質が導入されたキメラアンチセンスオリゴ分子であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。   6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the antisense oligo molecule is a chimeric antisense oligo molecule into which a nucleic acid analog is introduced. 核酸類似物質は、2'-O-メチルリボヌクレオチドであることを特徴とする請求項6記載の方法。   7. The method according to claim 6, wherein the nucleic acid analog is 2′-O-methyl ribonucleotide. 前記アンチセンスオリゴ分子の細胞核内への導入をエレクトロポレーション法により実施することを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the antisense oligomolecule is introduced into the cell nucleus by electroporation.

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