JP2009150829A - 生体試料の観察方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生体試料から発する発光または蛍光を観察する観察方法であって、前回取得した画像データを参照する参照工程S301と、前回取得した前記画像データの輝度が飽和しているか否か判断する輝度判断工程S302と、前記輝度判断工程において輝度が飽和していると判断された場合に、前回1回で取得した前記画像データの露光を複数回に分ける露光分割工程S303と、前記複数回に分けた回数だけ画像を取得する画像取得工程S304と、前記複数回に分けて取得した前記画像を1つの画像に積算する積算工程S306とを備えた生体試料の観察方法を提供する。
【選択図】図3
Description
本発明は、生体試料から発する発光または蛍光を観察する観察方法であって、前回取得した画像データを参照する参照工程と、前回取得した前記画像データの輝度が飽和しているか否か判断する輝度判断工程と、前記輝度判断工程において輝度が飽和していると判断された場合に、前回1回で取得した前記画像データの露光を複数回に分ける露光分割工程と、前記複数回に分けた回数だけ画像を取得する画像取得工程と、前記複数回に分けて取得した前記画像を1つの画像に積算する積算工程とを備えた生体試料の観察方法を提供する。
本発明によれば、複数図に分けて取得した画像を1つの画像に積算することによって生体試料を定量的に観察することができる。
本発明によれば、過去のデータを利用して生体試料を定量的に観察することができる。
本発明によれば、複数の条件で画像を取得することにより生体試料を定量的に観察することができる。
本発明に係る第1の実施形態は、蛍光タンパクで標識した腫瘍細胞を皮下に導入した生きた実験小動物において、その腫瘍の成長を蛍光観察する生体試料の観察方法である。図1は同軸照明を用いた観察装置の概略構成例、図2は斜照明を用いた観察装置の概略構成例である。
図1に示されるように、光源108から射出された光は、フィルタ109で蛍光タンパクを励起する波長の光のみを透過され、ダイクロイックミラー103で反射され、対物光学系104を通してステージ106上の標本105に照射される。標本105で発せられた蛍光は、対物光学系104を逆に進み、ダイクロイックミラー103を透過して、フィルタ102で不要な光がカットされて、CCDカメラ101で検出される。CCDカメラ101で検出された光は、コントローラ107に送られ画像化される。
上記実施形態では、飽和している画素があるか調べる場合、CCDカメラの特性上発生するホワイトノイズを飽和していると判断し、むやみに撮影回数が増えてしまうことがないよう、前回取得した画像に対し平均化フィルタやメディアンフィルタなどの画像処理を施した後、飽和した画素があるか調査してもよい。
上記実施形態では、小動物の蛍光観察を例として用いたが、生細胞や生体組織などを蛍光観察や発光観察する場合、小動物の発光観察などに適用してもよい。
細胞を培養しながら観察するためには生体内を真似た環境を用いる必要があり、図4に示されるように、標本410はステージ404上のインキュベータ403内に配置される。標本410は通常シャーレに入っており、ステージ404およびインキュベータ403には観察用の穴(図示せず)が開いている。
ルシフェラーゼで標識すると同時に蛍光タンパクや蛍光色素で標識する場合は、蛍光観察を行うこととしてもよい。蛍光観察の場合、光源409から射出された光は、フィルタ408で蛍光タンパク等を励起する波長の光のみを透過され、ステージ404上のインキュベータ403内の標本410に照射される。標本410で発せられた光は、対物光学系405を進み、フィルタ406で不要な光がカットされて、CCDカメラ407で検出される。CCDカメラ407で検出された光は、コントローラ411に送られて画像化される。
これら装置の一部または全体を、外部からの光を遮断するチャンバー等の遮光装置内に配置することによって、外部の光の影響を受けることなく精度よく安定して微弱光を検出することができる。例えば、図4の暗箱402と蓋401により標本を遮光された状態に置くことができる。
発光試料からの発光量は極めて少ないため、鮮明な画像を撮るために露出時間が長くなる傾向にある。また、生細胞を培養しながら経時的に観察したい場合は、数十時間に及んで観察を行うことがある。例えCCDカメラの撮影条件などの観察条件を一定にして観察を進めたとしても、細胞の変化によって取得した画像の輝度が飽和する程度変化してしまう場合がある。このように、輝度値が飽和状態となった場合、あるいは輝度値がほぼ無い状態になって変化がわからなくなった場合は、実験の一部が無駄になる恐れがある。
まず、標本を装置に設置した後、標本の種類や培養の条件に応じて、コントローラで保持している過去の解析データから同じ条件または近い条件の解析データを指定する(S501)。これにより、過去の解析データから例えば輝度値の最大値および最小値、最大値となる時期、最小値となる時期、あるいは1回の撮影での輝度の変化量等を予測することができる。
これらの撮影と条件確認とを繰り返し、以後撮影を続けた場合にも支障がないと判断された時点で、その観察条件で長時間の撮影を開始する(S507)。このようにすることで、輝度値が飽和状態または輝度値が無い状態になることなく、長時間の観察をすることができる。
上記実施形態では、生細胞の発光観察を例として用いたが、生細胞の生体組織あるいは小動物等について蛍光観察および発光観察する場合に適用することとしてもよい。
本実施形態では、同じ観察対象を同じ観察位置で、複数の観察条件で撮影する。例えば3パターンの露光時間を決めておき、その露光時間で全撮影をする。
このようにすれば、定量性を損なうことなく、画像を解析することができる。
また、上記3つの実施形態について説明したが、これらを組み合わせて使用することとしてもよい。蛍光観察および発光観察の装置構成についてはこれらに限られず、一般的な顕微鏡を用いてもよく、上記実施形態のコントローラ部を構成の一部として備えることで同様の制御を行うことや同様の機能を備えることが可能である。
S302 輝度判断工程
S303 露光分割工程
S304 画像取得工程
S306 積算工程
Claims (3)
- 生体試料から発する発光または蛍光を観察する観察方法であって、
前回取得した画像データを参照する参照工程と、
前回取得した前記画像データの輝度が飽和しているか否か判断する輝度判断工程と、
前記輝度判断工程において輝度が飽和していると判断された場合に、前回1回で取得した前記画像データの露光を複数回に分ける露光分割工程と、
前記複数回に分けた回数だけ画像を取得する画像取得工程と、
前記複数回に分けて取得した前記画像を1つの画像に積算する積算工程とを備えた生体試料の観察方法。 - 生体試料から発する発光または蛍光を観察する観察方法であって、
過去に取得した画像データの撮影条件を参照する参照工程と、
前記撮影条件で画像取得する画像取得工程と、
取得した前記画像と前記過去の画像データとの比較を行う比較工程と、
前記比較によって撮影開始から撮影終了時点まで有効な輝度値の範囲内で撮影を行うことができるか否かを判断する輝度判断工程と、
前記判断によって有効な輝度値の範囲内で撮影を行うことができないと判断された場合に撮影条件を調整する調整工程とを備えた生体試料の観察方法。 - 生体試料から発する発光または蛍光を観察する観察方法であって、
複数の観察条件で画像取得する画像取得工程と、
取得された前記画像の解析結果が適切な輝度値の範囲であるか否かを判断する輝度判断工程と、
前記判断工程において適切な輝度値の範囲外であると判断された場合に、不適切な輝度値のデータについて複数取得した別の解析データを用いて補間する補間工程とを備えた生体試料の観察方法。
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