JP2009112277A - 三次元培養弾性線維組織及び三次元培養弾性線維組織の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】コラーゲンからなる平均孔径が1〜30μmである多孔性基材に対して、1×103/cm2以上の密度で線維芽細胞を播種する工程1と、前記工程1で得られた線維芽細胞が播種された多孔性基材を血清添加培地中で培養する工程2とを有する製造方法により製造される三次元培養弾性線維組織であって、厚さが5μm以上であり、エラスチン及びフィブリリンを含有する三次元培養弾性線維組織。
【選択図】図1
Description
これに対して、感温性応答培養皿等の特殊な培養基材を用いて、培養された組織をシート状に剥離する方法が提案されている(特許文献1等)。この方法を応用すれば、シャーレ上に形成された弾性線維組織をシート状に剥離することができる。
以下に本発明を詳述する。
これに対して、平均孔径が1〜30μmである多孔性基材は、スポンジの性質とフィルムの性質を有するものである。即ち、平均孔径が1〜30μmである多孔性基材に線維芽細胞を播種した場合、フィルム上(シャーレ上)に細胞を播種した場合と同様に、線維芽細胞同士が充分に近接した高密度な状態で培養することができ、弾性線維組織が形成される。一方、細胞自身が分泌する分解酵素により基材が分解されて基材の孔が徐々に大きくなり、播種された線維芽細胞の一部が分解により大きくなった多孔性基材の孔に侵入して三次元的に広がっていくこともできる。更に多孔性基材は、培地成分の透過性に優れることから、高密度に大量に培養されている線維芽細胞に充分に栄養を供給することができる。かくして、培養を継続すると、三次元的な厚みを持った弾性線維組織が形成される。
また、上記多孔性基材としては線維芽細胞が接着する材料であればよく、コラーゲン以外にも、例えば、ゼラチン等のタンパク質、ヒアルロン酸等の多糖類等の天然高分子;脂肪族ポリエルテル等生体内で分解吸収され得る合成高分子等も用いることができる。
なお、本明細書において重量残存率とは、コラゲナーゼ水溶液に浸漬後に残存した多孔性基材をフィルターを用いて濾取し、これを充分に乾燥させた後に測定した重量を、コラゲナーゼ水溶液浸漬前に予め測定しておいた多孔性基材の重量に対する割合として算出したものである。
上記血清添加培地としては特に限定されず、例えば、MEM、DMEM等の一般的な培養液に、1〜10重量%程度のウシ胎児血清を添加したもの等が挙げられる。
培養期間については、多孔性基材の孔径、細胞の播種密度、血清添加培地の種類等により異なり特に限定されないが、1〜4週間程度の期間培養することにより弾性線維組織が形成される。
本発明の三次元培養弾性線維組織を製造する製造方法もまた、本発明の1つである。
上記補強材としては、ポリ−L−ラクチド、ポリグリコリド、L−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体等の合成生体吸収性高分子、特に脂肪族ポリエステルやコラーゲン、ゼラチン等の天然高分子からなる不織布、スポンジ等が挙げられる。
(1)多孔性基材の調製
0.3%水溶液(pH3)のTypeIコラーゲンを、15%エタノールで3倍希釈し、0.1%コラーゲン、10%エタノール水溶液とした。更にこの溶液を直径9cmのシャーレに15g流し込み、−135℃で凍結し、真空度:0.1、乾燥温度:40℃、乾燥時間:24時間の条件で凍結乾燥を行い、コラーゲンスポンジを得た。その後、真空下で105℃、24時間熱架橋を行うことにより、多孔性基材を得た。
得られた多孔性基材の平均孔径は15μm、厚さは1mmであった。
トリスバッファー(pH7.4)にコラゲナーゼを0.5units/mLとなるように加えた溶液に、作製した多孔性基材を37℃にて浸漬させた。一定時間後に多孔性基材を取り出して蒸留水で洗浄して乾燥させた。乾燥させた多孔性基材の重量を測定し、試験前の重量と比較することにより重量残存率を計算した。
試験結果を図5に示した。得られた多孔性基材は本試験条件においては直線的に重量減少が観察され、100分後の重量残存率は約50%であった。
得られた多孔性基材上に1×105/cm2の播種密度となるようにヒト***由来線維芽細胞を播種し、その後10%ウシ血清添加DMEM/F12培地中で培養した。培養開始後4週間培養を続けた。
培養開始後4週間後に培養組織をホルマリン固定し、パラフィンブロックを作製した。得られたパラフィン切片を用いて、免疫染色法によりエラスチン、フィブリリン1の存在を確認した。各々の免疫染色像を図1、2に示した。図1、2より、弾性線維組織が約50μmの厚さで形成されていることが確認された。
(1)多孔性基材の調製
0.3%水溶液(pH3)のTypeIコラーゲンをホモジナイザーで攪拌した後に、−40℃にて凍結した。更に真空度:0.1、乾燥温度:40℃、乾燥時間:24時間の条件で凍結乾燥を行い、コラーゲンスポンジを得た。その後、真空下で105℃、24時間熱架橋を行い、更に0.2%グルタルアルデヒド水溶液中で24時間化学架橋反応を行った。得られた架橋コラーゲンスポンジを水で充分に洗浄してグルタルアルデヒドを除去した後に15%エタノール中に浸漬し、−135℃にて凍結した。更に真空度:0.1、乾燥温度:40℃、乾燥時間:24時間の条件で凍結乾燥を行い、多孔質基材を得た。
得られた多孔性基材の平均孔径は90μm、厚さは3mmであった。
得られた多孔性基材上に1×105/cm2の播種密度となるようにヒト***由来線維芽細胞を播種し、その後10%ウシ血清添加DMEM/F12培地中で培養した。培養開始後4週間培養を続けた。
培養開始後4週間後に培養組織をホルマリン固定し、パラフィンブロックを作製した。得られたパラフィン切片を用いて、免疫染色法によりエラスチン、フィブリリン1の存在を確認した。各々の免疫染色像を図3、4に示した。図3、4より、本比較例においては、弾性線維組織は形成されていないことを確認した。
Claims (4)
- コラーゲンからなる平均孔径が1〜30μmである多孔性基材に対して、1×103/cm2以上の密度で線維芽細胞を播種する工程1と、前記工程1で得られた線維芽細胞が播種された多孔性基材を血清添加培地中で培養する工程2とを有する製造方法により製造される三次元培養弾性線維組織であって、
厚さが5μm以上であり、エラスチン及びフィブリリンを含有する
ことを特徴とする三次元培養弾性線維組織。 - 多孔性基材は、濃度0.5units/mLのコラゲナーゼ水溶液中に37℃、100分間浸漬した後の重量残存率が40〜60%であることを特徴とする請求項1記載の三次元培養弾性線維組織。
- コラーゲンからなる平均孔径が1〜30μmである多孔性基材に対して、1×103/cm2以上の密度で線維芽細胞を播種する工程1と、
前記工程1で得られた線維芽細胞が播種された多孔性基材を血清添加培地中で培養する工程2とを有する
ことを特徴とする三次元培養弾性線維組織の製造方法。 - 多孔性基材は、濃度0.5units/mLのコラゲナーゼ水溶液中に37℃、100分間浸漬した後の重量残存率が40〜60%であることを特徴とする請求項3記載の三次元培養弾性線維組織の製造方法。
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