JP2009109209A - High-density functional particles having suppressed nonspecific bonding - Google Patents
High-density functional particles having suppressed nonspecific bonding Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009109209A JP2009109209A JP2007278663A JP2007278663A JP2009109209A JP 2009109209 A JP2009109209 A JP 2009109209A JP 2007278663 A JP2007278663 A JP 2007278663A JP 2007278663 A JP2007278663 A JP 2007278663A JP 2009109209 A JP2009109209 A JP 2009109209A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- particles
- particle
- group
- substance
- target substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Description
本発明は、標的物質が結合できる実質的に金属または合金から成る高密度粒子であって、標的物質以外の物質の結合が抑えられた高密度粒子に関する。 The present invention relates to a high-density particle substantially made of a metal or an alloy that can bind to a target substance, in which binding of a substance other than the target substance is suppressed.
細胞、蛋白質、核酸または化学物質等の標的物質の定量、分離、精製および分析等の生化学用途に利用される機能材としては、特定の標的物質と特異的に結合または反応する複合粒子が従来より知られている（特許文献１参照）。かかる複合粒子は、一般的に磁性を帯びており、例えば非磁性のビーズ中に磁性体を含ませることによって形成される。標的物質の分離に際しては、まず、標的物質が含まれる試料中に複合粒子を供し、攪拌などを行って複合粒子の表面に標的物質を結合させる。次いで、磁場の印加により複合粒子を移動させて集合・凝集させ、その後、集合・凝集した複合粒子を回収することによって、複合粒子に結合した標的物質を回収している。このような磁場または磁気を用いた手法（以下では「磁気分離法」または単に「磁気分離」とも呼ぶ）は、遠心分離法、カラム分離法または電気泳動法などの手法に比べて、少量の試料に対しても実施することが可能であり、また、標的物質を変性させずに短時間で実施できる特徴を有している。しかしながら、用いる複合粒子の密度が１．０ｇ／ｃｍ３〜３．４ｇ／ｃｍ３と小さいので、効率的に凝集させる点では、かかる複合粒子は決して好ましいものではなかった。このように複合粒子の密度が比較的小さい理由は、密度の低い樹脂やシリカを母材とし、その内部に磁性粉材料を分散させて複合粒子化しているからである。つまり、複合粒子の密度は磁性粉材料の量に依存することになるところ、磁化量から計算すると磁性粉材料の含率は高々２０重量％程度にすぎず、複合粒子の密度は母材の低い材料密度に近い値となっている。 As functional materials used in biochemical applications such as quantification, separation, purification, and analysis of target substances such as cells, proteins, nucleic acids, and chemical substances, composite particles that specifically bind to or react with specific target substances are conventionally used. More known (see Patent Document 1). Such composite particles are generally magnetic and are formed, for example, by including a magnetic substance in non-magnetic beads. When separating the target substance, first, the composite particle is provided in a sample containing the target substance, and the target substance is bound to the surface of the composite particle by stirring or the like. Next, the target particles bound to the composite particles are recovered by moving the composite particles by application of a magnetic field to aggregate and aggregate them, and then recovering the aggregated and aggregated composite particles. Such a method using a magnetic field or magnetism (hereinafter also referred to as “magnetic separation method” or simply “magnetic separation”) requires a smaller amount of sample than methods such as centrifugation, column separation, or electrophoresis. In addition, it has a feature that it can be carried out in a short time without denaturing the target substance. However, the density of the composite particles used as small as 1.0g / cm 3 ~3.4g / cm 3 , in terms that efficiently agglomerated, such composite particles were not in any way desirable. The reason why the density of the composite particles is relatively small is that a resin or silica having a low density is used as a base material, and a magnetic powder material is dispersed therein to form composite particles. That is, the density of the composite particles depends on the amount of the magnetic powder material. When calculated from the amount of magnetization, the content of the magnetic powder material is only about 20% by weight, and the density of the composite particles is low in the base material. The value is close to the material density.
一方、密度の大きいジルコニア粒子を使用している例が特許文献２に記載されているものの、特許文献２に記載されているジルコニア粒子は、三次元内部貫通ネットワーク（即ち、貫通孔）を持つ多孔質から成るものであり、標的物質の分離に際して非特異結合が生じやすい。即ち、標的物質以外の物質が粒子に結合しやすく、所望の標的物質だけを粒子に結合させて分離することが困難であるという問題が懸念される。更に、特許文献２に記載されているジルコニア粒子は、多孔質であるために、かかる粒子を、標的物質を含んだ試料に供する際に空気などの気体が粒子内に取り込まれてしまう。その結果、取り込んだ気体の浮力などが作用して試料中で粒子を移動・凝集させにくくなり、標的物質の分離にとっては好ましくない（即ち、標的物質の分離に要する時間が長くなってしまう）。 On the other hand, although an example using zirconia particles having a high density is described in Patent Document 2, the zirconia particles described in Patent Document 2 are porous having a three-dimensional internal through network (that is, a through hole). It consists of a quality, and nonspecific binding is likely to occur during the separation of the target substance. That is, there is a concern that a substance other than the target substance is likely to bind to the particles, and it is difficult to separate only the desired target substance by binding to the particles. Furthermore, since the zirconia particles described in Patent Document 2 are porous, when such particles are used for a sample containing a target substance, a gas such as air is taken into the particles. As a result, the buoyancy of the taken-in gas acts to make it difficult for particles to move and aggregate in the sample, which is not preferable for target substance separation (that is, the time required for target substance separation becomes long).
また、従来技術においては、粒子の密度が極端に大きいと、標的物質を粒子に結合させる際に行う攪拌（例えば、容器内で攪拌翼を用いて行う攪拌）に要する操作および時間などの点で好ましくないと考えられていたため、標的物質の定量、分離、精製および分析等の生化学用途に対して「密度が極端に大きい粒子」を用いることは通常考えられていた。 Further, in the prior art, if the density of the particles is extremely large, in terms of operation and time required for stirring (for example, stirring performed using a stirring blade in a container) performed when the target substance is bound to the particles, Since it was considered unfavorable, it was usually considered to use “particles with extremely high density” for biochemical applications such as quantification, separation, purification and analysis of target substances.
尚、上記用途に用いられる金属酸化物粒子は存在するものの、実質的に金属から成る粒子を用いる例は少ない。主に用いられている金属酸化物粒子の粒径は数μｍ以下であり、このサイズで金属を粒子化すると場合によっては急激な酸化が発生し、発熱、発火の原因となる。このため、実質的に金属から成る粒子は安全上の理由から用いられることは少ない。
本発明は、上記事情に鑑みて為されたものである。つまり、本発明の課題は、標的物質の分離に好ましく、かつ、非特異結合が生じにくい金属または合金から成る粒子を提供することである。 The present invention has been made in view of the above circumstances. That is, an object of the present invention is to provide particles made of a metal or an alloy that is preferable for separation of a target substance and hardly causes nonspecific binding.
上記課題を解決するため、本発明は、標的物質が結合できる粒子であって、
「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」が粒子本体の表面に固定化されており、
粒子の比表面積が０．０００５ｍ２／ｇ〜１．０ｍ２／ｇであり、粒子の密度が９．０（９．０を除く）〜２３ｇ／ｃｍ３であり、
粒子本体が金属または合金を含んで成ることを特徴とする粒子を提供する。
In order to solve the above problems, the present invention is a particle to which a target substance can bind,
"Substance or functional group capable of binding the target substance" is immobilized on the surface of the particle body,
The specific surface area of the particles is that 0.0005m 2 /g~1.0m 2 / g, (excluding 9.0) density of the particles is 9.0 was ~23g / cm 3,
Provided is a particle characterized in that the particle body comprises a metal or an alloy.
本発明の粒子は、その表面に、「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」が固定化されている。換言すれば、「標的物質と結合する物質または官能基」が粒子本体に固定化されている。従って、標的物質と粒子とを共存させると、標的物質が粒子に結合することができるので、標的物質の分離、精製または抽出などの種々の用途に対して本発明の粒子を用いることができ、更にはテーラーメード医療技術の用途に対しても本発明の粒子を用いることができる。ここで、「標的物質」とは、分離のみならず、抽出、定量、精製または分析などの種々の対象になり得る物質を実質的に意味しており、粒子に直接的または間接的に結合できるものであれば、いずれの種類の物質であってもかまわない。具体的な標的物質としては、例えば、核酸、蛋白質（例えばアビジンおよびビオチン化ＨＲＰなども含む）、糖、脂質、ペプチド、細胞、真菌、細菌、酵母、ウィルス、糖脂質、糖蛋白質、錯体、無機物、ベクター、低分子化合物、高分子化合物、抗体または抗原等を挙げることができる。本発明の粒子は、このように種々の標的物質の分離、精製、抽出もしくは分析に用いることができる点で、種々の機能を奏するものといえる。従って、本発明の粒子は「機能性粒子」と呼ぶことができる。 The particles of the present invention have “substance or functional group capable of binding a target substance” immobilized on the surface thereof. In other words, the “substance or functional group that binds to the target substance” is immobilized on the particle body. Therefore, when the target substance and the particles coexist, the target substance can bind to the particles, so that the particles of the present invention can be used for various uses such as separation, purification or extraction of the target substance, Furthermore, the particles of the present invention can also be used for tailor-made medical technology. Here, the “target substance” substantially means a substance that can be various objects such as extraction, quantification, purification, or analysis as well as separation, and can be directly or indirectly bound to particles. Any substance can be used as long as it is a thing. Specific target substances include, for example, nucleic acids, proteins (including avidin and biotinylated HRP, etc.), sugars, lipids, peptides, cells, fungi, bacteria, yeasts, viruses, glycolipids, glycoproteins, complexes, inorganic substances. , Vectors, low molecular compounds, high molecular compounds, antibodies or antigens. The particles of the present invention can be said to exhibit various functions in that they can be used for separation, purification, extraction or analysis of various target substances. Therefore, the particles of the present invention can be referred to as “functional particles”.
本明細書において「粒子本体が金属または合金を含んで成る」とは、「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」が固定化されている粒子本体が金属または合金から成る態様を実質的に意味しているものの、その粒子本体の表層部が自然酸化もしくは耐蝕性の向上などの理由により酸化もしくは何らかの表面処理が行われているような態様も含んでいる。 In the present specification, “the particle body comprises a metal or an alloy” means that the “particle substance or functional group capable of binding a target substance” is composed of a metal or an alloy. Although it means substantially, the aspect which the surface layer part of the particle | grain main body is oxidized or some surface treatment is performed for reasons, such as improvement of natural oxidation or corrosion resistance, is also included.
本発明の粒子は、密度が９．０ｇ／ｃｍ３（９．０ｇ／ｃｍ３を除く）〜２３ｇ／ｃｍ３であり、標的物質の分離に一般的に用いられる粒子よりも密度（または比重）が相当に大きいという特徴を有している。また、本発明の粒子は、粒子本体に貫通孔が実質的に形成されておらず、多孔質の形態でないという特徴も有している。このため、一般的に、粒子の比表面積が０．０００５ｍ２／ｇ〜１．０ｍ２／ｇと比較的小さくなっている。ここで「粒子本体に貫通孔が実質的に形成されていない」とは、粒子本体が実質的に中実であり、粒子が内部貫通ネットワーク構造を有さないことを意味している。即ち、本明細書にいう「粒子本体に貫通孔が実質的に形成されていない」または「粒子本体が貫通孔を有さない」とは、「粒子本体または粒子本体コア部が中実である」、「粒子表面が凹凸状になっていても、凹部が粒子内部にまで存在しない」、及び「一般的な多孔質粒子と比べた場合、かさ密度がより大きいこと」と同義である。 The particles of the present invention have a density of 9.0 g / cm 3 (excluding 9.0 g / cm 3 ) to 23 g / cm 3 , and have a density (or specific gravity) higher than that of particles generally used for separation of target substances. Is considerably large. Moreover, the particle | grains of this invention also have the characteristics that the through-hole is not substantially formed in the particle | grain main body and it is not a porous form. Therefore, in general, the specific surface area of the particles is relatively small as 0.0005m 2 /g~1.0m 2 / g. Here, “the through hole is not substantially formed in the particle main body” means that the particle main body is substantially solid and the particle does not have an internal through network structure. That is, “the particle body has no through-hole substantially” or “the particle body does not have a through-hole” in this specification means that the particle body or the particle body core portion is solid. ”,“ Even if the particle surface is uneven, the recess does not exist even inside the particle ”, and“ the bulk density is larger when compared with general porous particles ”.
本発明の粒子は、密度が９．０ｇ／ｃｍ３（９．０ｇ／ｃｍ３を除く）〜２３ｇ／ｃｍ３となっており、従来技術の粒子と比べて密度が相当に大きいだけでなく、貫通孔を有しておらず、比表面積が０．０００５ｍ２／ｇ〜１．０ｍ２／ｇと比較的小さくなっている。従って、本発明の粒子は、遠心分離法および磁気分離法を用いなくても、粒子の自然沈降による移動速度だけで十分な分離速度が得られる効果を有している。換言すれば、本発明の粒子は、密度のみならず比表面積の点でも自然沈降に好ましい粒子となっている。「比表面積」に関して説明すると、比表面積が大きい多孔質粒子の場合には、粒子内部に間隙部が多いので、標的物質を含んだ試料に粒子を供する際に空気などの気体が粒子内部に取り込まれた状態となり、結果的に、取り込んだ気体の浮力などが作用して沈降速度が遅くなり得るが、本発明の粒子は、貫通孔を有しておらず、比表面積が０．０００５ｍ２／ｇ〜１．０ｍ２／ｇと実質的に非多孔質であるために、そのような不利な気体の影響を排除することができる。ここで、本明細書に用いる「自然沈降」とは、重力の作用を受けて粒子が液体中を沈降することを指している。また、本明細書において「分離」とは、核酸、蛋白質、糖、脂質、ペプチド、細胞、真菌、細菌、酵母、ウィルス、糖脂質、糖蛋白質、錯体、無機物、ベクター、低分子化合物、高分子化合物、抗体または抗原等の標的物質を含んだ試料（例えば、ヒト又は動物の尿、血液、血清、血漿、***、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒト又は動物の臓器、毛髪、皮膚、粘膜、爪、骨、筋肉又は神経組織等の懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；便懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；培養細胞又は培養組織の懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；ウィルスの懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；菌体の懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；土壌懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；植物の懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；食品・加工食品懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；排水等）から標的物質を分離することを指しており、より具体的には、試料中に含まれる標的物質を粒子に結合させた後、標的物質が結合した粒子を移動させることによって標的物質を試料から選別することを実質的に意味している。そして、「分離速度」とは、標的物質が結合した粒子が試料中を移動する速度を実質的に指しており、自然沈降に対して用いる場合では粒子の沈降速度を実質的に意味している。分離速度が大きい場合では、試料からの標的物質の分離に要する時間が短くて済むことになる。なお、本発明の粒子が磁性を有する場合には、磁場の印加によって、分離速度を付加的に大きくできることを理解されよう。 Particles of the present invention has a density (excluding 9.0g / cm 3) 9.0g / cm 3 ~23g / cm 3 and has been in, not only considerably larger density than the prior art particles, does not have a through-hole, the specific surface area is relatively small as 0.0005m 2 /g~1.0m 2 / g. Therefore, the particles of the present invention have an effect that a sufficient separation speed can be obtained only by the moving speed by the natural sedimentation of the particles without using the centrifugal separation method and the magnetic separation method. In other words, the particles of the present invention are preferable for natural sedimentation not only in terms of density but also in terms of specific surface area. In terms of “specific surface area”, in the case of porous particles having a large specific surface area, since there are many gaps inside the particles, a gas such as air is taken into the particles when the particles are supplied to the sample containing the target substance. As a result, the buoyancy of the taken-in gas may act and the sedimentation speed may be slow, but the particles of the present invention do not have through holes and have a specific surface area of 0.0005 m 2 / Since it is substantially non-porous with g to 1.0 m 2 / g, such an adverse gas effect can be eliminated. Here, “natural sedimentation” used in the present specification refers to the sedimentation of particles in a liquid under the action of gravity. In this specification, “separation” means nucleic acid, protein, sugar, lipid, peptide, cell, fungus, bacteria, yeast, virus, glycolipid, glycoprotein, complex, inorganic substance, vector, low molecular weight compound, polymer Samples containing a target substance such as a compound, antibody or antigen (eg, human or animal urine, blood, serum, plasma, semen, saliva, sweat, tears, ascites, amniotic fluid, etc .; human or animal organs, hair Suspension of skin, mucous membrane, nail, bone, muscle or nerve tissue, extract, lysate or disrupted solution; stool suspension, extract, lysate or disrupted solution; suspension of cultured cells or tissue Liquid, extract, lysate or disrupted solution; virus suspension, extract, lysate or disrupted solution; cell suspension, extract, lysate or disrupted solution; soil suspension, extract, Dissolved solution or crushed solution; plant suspension, extract, dissolved solution or crushed solution; food / processed food This refers to the separation of target substances from turbid liquids, extract liquids, dissolved liquids or crushed liquids; wastewater, etc., and more specifically, after target substances contained in a sample are bound to particles, This means that the target substance is sorted out from the sample by moving the particles bound by. The “separation speed” substantially refers to the speed at which the particles to which the target substance is bound move in the sample, and in the case of being used for natural sedimentation, it substantially means the sedimentation speed of the particles. . When the separation speed is high, the time required for separating the target substance from the sample can be shortened. It should be understood that when the particles of the present invention have magnetism, the separation rate can be additionally increased by applying a magnetic field.
本発明の粒子は、自然沈降させるだけでも十分な分離速度を得ることができるので、本発明の粒子を用いると複雑な機構を用いずに標的物質の分離、抽出、精製または反応などを行うシステムが構築され得る。また、本発明の粒子は、そのようなシステムの小型化またはチップ化にとっても有効となり得る。 Since the particles of the present invention can obtain a sufficient separation rate only by natural sedimentation, the system for separating, extracting, purifying or reacting a target substance without using a complicated mechanism when the particles of the present invention are used. Can be built. The particles of the present invention can also be effective for downsizing or chipping of such systems.
尚、本発明に係る粒子のように密度が相当に大きい場合（即ち、従来技術の粒子と比べて密度が相当に大きい場合）であっても、複数のウェルを備えたウェルプレート（粒子は各ウェルに収容されている）に標的物質を含んだ試料を流し込むことによって、標的物質を粒子に結合させることができるので、本発明の粒子は「標的物質を粒子に結合させる操作」の点で特に問題はない。 Even when the density is considerably high as in the particles according to the present invention (that is, when the density is considerably higher than the particles of the prior art), a well plate having a plurality of wells (the particles are each Since the target substance can be bound to the particles by pouring the sample containing the target substance into the well (contained in the well), the particles of the present invention are particularly suitable in terms of the “operation for binding the target substance to the particles”. No problem.
本発明の粒子は、密度が９．０ｇ／ｃｍ３（９．０を除く）〜２３ｇ／ｃｍ３と大きいだけでなく、比表面積が０．０００５ｍ２／ｇ〜１．０ｍ２／ｇと比較的小さく、実質的に非多孔質とみなすことができるので、標的物質以外の物質が粒子に結合する非特異結合を抑えることができる。換言すれば、粒子の非多孔質（非多孔性）に起因して、標的物質以外の物質が吸収・吸着され得る粒子細孔または粒子表面が少なく又は実質的に存在しておらず、標的物質以外の物質が粒子に結合することを抑制することができる。このように、本発明の粒子は、非特異結合を抑えることができるので、簡易な操作だけで、高効率で標的物質の精製や分離を実施することができる。 The particles of the present invention compares a density (excluding 9.0) 9.0g / cm 3 ~23g / cm 3 and not only a large specific surface area and 0.0005m 2 /g~1.0m 2 / g Therefore, non-specific binding of substances other than the target substance to the particles can be suppressed. In other words, due to the non-porous (non-porous) nature of the particles, there are few or substantially no particle pores or particle surfaces on which substances other than the target substance can be absorbed and adsorbed, and the target substance. It is possible to suppress binding of substances other than those to the particles. As described above, since the particles of the present invention can suppress non-specific binding, the target substance can be purified and separated with high efficiency only by a simple operation.
以下にて、本発明の粒子を詳細に説明する。 Hereinafter, the particles of the present invention will be described in detail.
本発明の粒子は、標的物質の分離に好適な密度を有している。即ち、ヒト又は動物の尿、血液、血清、血漿、***、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒト又は動物の臓器、毛髪、皮膚、粘膜、爪、骨、筋肉又は神経組織等の懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；便懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；培養細胞又は培養組織の懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；ウィルスの懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；菌体の懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；土壌懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；植物の懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；食品・加工食品懸濁液、抽出液、溶解液又は破砕液；排水等の試料に粒子を分散させた際に粒子の沈降速度が比較的大きく／速くなるような密度を粒子は有している。 The particles of the present invention have a density suitable for separating target substances. That is, body fluids such as human or animal urine, blood, serum, plasma, semen, saliva, sweat, tears, ascites, amniotic fluid; human or animal organs, hair, skin, mucous membranes, nails, bones, muscles or nerve tissues, etc. Suspension, extract, lysate or disrupted solution of stool; Suspension suspension, extract, lysate or disrupted solution; Suspension, extract, lysate or disrupted solution of cultured cell or tissue; Suspended virus Suspended liquid, extract, lysate or crushed liquid; cell suspension, extract, lysate or crushed liquid; soil suspension, extract, lysate or crushed liquid; plant suspension, extract , Dissolved liquid or crushed liquid; food / processed food suspension, extract, dissolved liquid or crushed liquid; density at which the sedimentation rate of particles becomes relatively large / fast when dispersed in a sample such as waste water The particles have.
粒子の密度が３．５ｇ／ｃｍ３よりも小さくなると、自然沈降のみによる粒子の移動速度が実用上好ましくない。密度が２５ｇ／ｃｍ３よりも大きい粒子は、現存する物質の密度を考慮すると製造が現実的に困難である。従って、本発明の粒子の密度は、好ましくは３．５ｇ／ｃｍ３以上かつ２５ｇ／ｃｍ３以下であり、より好ましくは５．０ｇ／ｃｍ３以上かつ２５ｇ／ｃｍ３以下、更に好ましくは９．０ｇ／ｃｍ３より大きくかつ２５ｇ／ｃｍ３以下（例えば「１０ｇ／ｃｍ３以上かつ２０ｇ／ｃｍ３以下」または「１１ｇ／ｃｍ３以上かつ１９ｇ／ｃｍ３以下」）である。ここで、本明細書にいう「密度」とは、物質自身が占める体積だけを密度算定用の体積とする真密度を意味しており、ユアサアイオニクス社製真密度測定装置ウルトラピクノメーター１０００を使用することによって求めることができる。 When the density of the particles is smaller than 3.5 g / cm 3 , the moving speed of the particles only by spontaneous sedimentation is not preferable in practice. Particles with a density greater than 25 g / cm 3 are practically difficult to manufacture considering the density of existing materials. Thus, the density of the particles of the present invention is preferably not more than 3.5 g / cm 3 or more and 25 g / cm 3, more preferably 5.0 g / cm 3 or more and 25 g / cm 3 or less, more preferably 9. It is larger than 0 g / cm 3 and 25 g / cm 3 or less (for example, “10 g / cm 3 or more and 20 g / cm 3 or less” or “11 g / cm 3 or more and 19 g / cm 3 or less”). Here, “density” in this specification means a true density in which only the volume occupied by the substance itself is a volume for density calculation, and the true density measuring device UltraPycnometer 1000 manufactured by Yuasa Ionics Co., Ltd. is used. It can be determined by using it.
本発明の粒子の比表面積は、０．０００５ｍ２／ｇ〜１．０ｍ２／ｇである。ここで、本発明の粒子の比表面積は、０．０００５ｍ２／ｇ〜１．０ｍ２／ｇの範囲内であれば特に制限はなく、例えば「０．００５ｍ２／ｇ〜０．５ｍ２／ｇ」、「０．００１ｍ２／ｇ〜０．２ｍ２／ｇ」、「０．０００６ｍ２／ｇ〜０．００４ｍ２／ｇ」あるいは「０．０００５ｍ２／ｇ〜０．００５ｍ２／ｇ」であり得る。このように本発明の粒子の比表面積は比較的小さくなっている。従って、本発明の粒子は、実質的に非多孔質とみなすことができ、標的物質以外の物質が粒子に結合する可能性（即ち、「非特異結合の可能性」）が抑えられている。なお、本明細書にいう「比表面積」は、比表面積細孔分布測定装置Ｂｅｌｌｓｏｒｐ−ｍｉｎｉ（日本ベル社製）を使用することによって求めた比表面積である。 The specific surface area of the particles of the present invention is a 0.0005m 2 /g~1.0m 2 / g. Here, the specific surface area of the particles of the present invention is not particularly limited as long as it is within the range of 0.0005m 2 /g~1.0m 2 / g, for example, "0.005m 2 /g~0.5m 2 / g "," 0.001m 2 /g~0.2m 2 /G',`0.0006M 2 /g~0.004m 2 / g "or" 0.0005m 2 /g~0.005m 2 / g. " It can be. Thus, the specific surface area of the particles of the present invention is relatively small. Therefore, the particle of the present invention can be regarded as substantially non-porous, and the possibility that a substance other than the target substance binds to the particle (ie, “possibility of non-specific binding”) is suppressed. The “specific surface area” referred to in the present specification is a specific surface area obtained by using a specific surface area pore distribution measuring device Bellsorb-mini (manufactured by Nippon Bell Co., Ltd.).
本発明の粒子本体の材質は、上述のような密度および比表面積を有する粒子の製造に資するものであれば、特に限定されるものではない。例えば、本発明の粒子本体は、Ａｇ（銀）、Ａｕ（金）、Ｐｔ（白金）、Ｐｄ（パラジウム）、Ｗ（タングステン）、Ｒｈ（ロジウム）、Ｏｓ（オスミウム）、Ｒｅ（レニウム）、Ｉｒ（イリジウム）、Ｒｕ（ルテニウム）、Ｍｏ（モリブデン）、Ｈｆ（ハフニウム）、およびＴａ（タンタル）から成る群から選択される少なくとも１種類以上の遷移金属元素を含んで成る。あるいは、本発明の粒子本体は、例えば、Ｐｂ（鉛）、Ｂｉ（ビスマス）およびＴｌ（タリウム）から成る群から選択される少なくとも１種類以上の典型金属元素を含んで成る。上記遷移金属元素のなかでも、特に、Ｒｅ（金属単体の密度：２１．２ｇ／ｃｍ３）、Ｏｓ（金属単体の密度：２２．５ｇ／ｃｍ３）、Ｉｒ（金属単体の密度：２２．５ｇ／ｃｍ３）、Ｐｔ（金属単体の密度：２１．４ｇ／ｃｍ３）などを粒子本体の材質として用いることで、密度２０ｇ／ｃｍ３を超える粒子を得ることができる。また、上記典型金属元素のなかでも、Ｐｂ（金属単体の密度：１１．３４ｇ／ｃｍ３）も比較的高い密度の粒子の製造に資するものである。尚、本発明の粒子本体は、かかる遷移金属元素と典型金属元素とが混在して成るものであってもかまわないことに留意されたい。 The material of the particle body of the present invention is not particularly limited as long as it contributes to the production of particles having the above-described density and specific surface area. For example, the particle body of the present invention is composed of Ag (silver), Au (gold), Pt (platinum), Pd (palladium), W (tungsten), Rh (rhodium), Os (osmium), Re (rhenium), Ir. (Iridium), Ru (ruthenium), Mo (molybdenum), Hf (hafnium), and at least one transition metal element selected from the group consisting of Ta (tantalum). Alternatively, the particle body of the present invention comprises at least one or more typical metal elements selected from the group consisting of Pb (lead), Bi (bismuth) and Tl (thallium), for example. Among the above transition metal elements, in particular, Re (density of simple metal: 21.2 g / cm 3 ), Os (density of simple metal: 22.5 g / cm 3 ), Ir (density of simple metal: 22.5 g) / Cm 3 ), Pt (the density of a single metal: 21.4 g / cm 3 ) or the like is used as the material of the particle body, whereby particles having a density exceeding 20 g / cm 3 can be obtained. Among the above typical metal elements, Pb (metal single body density: 11.34 g / cm 3 ) also contributes to the production of relatively high density particles. It should be noted that the particle body of the present invention may be a mixture of such a transition metal element and a typical metal element.
本発明の粒子は、磁性を帯びていることが好ましい（以下、磁性を帯びている本発明の粒子を「磁性粒子」とも呼ぶ）。なぜなら、粒子の自然沈降に対して磁気分離操作を補助的に行うことができるからである。その結果、粒子をより速く移動させることができ、標的物質（より具体的には「粒子に結合した標的物質」）をより短時間で分離することが可能となる。 The particles of the present invention are preferably magnetized (hereinafter, the particles of the present invention having magnetism are also referred to as “magnetic particles”). This is because the magnetic separation operation can be supplementarily performed for spontaneous sedimentation of particles. As a result, the particles can be moved faster, and the target substance (more specifically, “target substance bound to the particles”) can be separated in a shorter time.
磁性粒子の材質は、粒子が磁性を帯びることになる限り、特に限定されるものではない。例えば、粒子本体が、フェライト、マグネタイト、γ−酸化鉄、遷移金属および鉄を含んで成る酸化物から成る群から選択される少なくとも１種以上の鉄酸化物を含んで成ることが好ましい。あるいは、粒子本体が、ニッケル、コバルト、鉄およびそれらの金属を含んで成る合金から成る群から選択される少なくとも１種以上の金属材料を含んで成ることが好ましい。上記の「遷移金属および鉄を含んで成る酸化物」は、ガーネット構造を有するものが好ましい。このような「遷移金属および鉄を含んで成るガーネット構造の酸化物」は、一般的にＹＩＧと呼されるものであり、例えば、Ｙ３Ｆｅ５Ｏ１２の組成式で表される化合物やこの化合物のＹの一部をビスマスで置換したＢｉｘＹ３−ｘＦｅ５Ｏ１２（０＜Ｘ＜３）である。 The material of the magnetic particles is not particularly limited as long as the particles are magnetized. For example, the particle body preferably comprises at least one or more iron oxides selected from the group consisting of oxides comprising ferrite, magnetite, γ-iron oxide, transition metals and iron. Alternatively, it is preferred that the particle body comprises at least one metal material selected from the group consisting of nickel, cobalt, iron, and alloys comprising these metals. The above-mentioned “oxide containing transition metal and iron” preferably has a garnet structure. Such “an oxide having a garnet structure including a transition metal and iron” is generally called YIG. For example, a compound represented by a composition formula of Y 3 Fe 5 O 12 and this Bi x Y 3-x Fe 5 O 12 (0 <X <3) in which a part of Y of the compound is substituted with bismuth.
磁性粒子の粒子本体は、磁性を帯びていない粒子を磁性物質で被覆することによって形成してもよい。磁性物質の被覆に際しては、無電解めっき法、電気めっき法、スパッタリング法、真空蒸着法、イオンプレーティング法または化学蒸着法などを用いることができる。なお、ここでいう「磁性を帯びていない粒子」とは、例えば、Ｃｕ，Ａｕ等から成る粒子を意味しており、「磁性物質」としては、上述の磁性を有する粒子の材質と同様、フェライト、マグネタイト、γ−酸化鉄、または、遷移金属および鉄を含んで成るガーネット構造の酸化物などの鉄酸化物を挙げることができるだけでなく、ニッケル、コバルト、鉄、または、それらの金属を含んで成る合金も挙げることができる。 The particle body of the magnetic particles may be formed by coating particles that are not magnetic with a magnetic substance. In coating the magnetic substance, an electroless plating method, an electroplating method, a sputtering method, a vacuum deposition method, an ion plating method, a chemical vapor deposition method, or the like can be used. Here, “non-magnetic particles” means, for example, particles made of Cu, Au, etc., and “magnetic substance” is the same as the material of particles having magnetism described above. And iron oxides such as magnetite, gamma-iron oxide, or oxides of garnet structure comprising transition metal and iron, as well as nickel, cobalt, iron, or those metals An alloy consisting of:
粒子本体表面に形成される磁性物質被膜が少なすぎると、得られる粒子の磁化の値が小さくなり、磁気分離に際して好ましくない。従って、磁性物質被膜の体積が、粒子の体積に対して５％以上であることが好ましい。磁性物質被膜の厚さは、粒子の直径に対して１．７％以上であることが好ましい。ちなみに、磁性物質被膜を「磁性を帯びていない粒子」に供する態様のみならず、「磁性を帯びていない粒子」の中に磁性物質を含ませる態様であってもよい。 If the magnetic substance film formed on the surface of the particle main body is too small, the value of magnetization of the obtained particle becomes small, which is not preferable for magnetic separation. Therefore, the volume of the magnetic material coating is preferably 5% or more with respect to the volume of the particles. The thickness of the magnetic substance film is preferably 1.7% or more with respect to the diameter of the particles. Incidentally, not only an embodiment in which the magnetic material coating is used for “non-magnetic particles”, but also an embodiment in which a magnetic material is included in “non-magnetic particles”.
粒子の磁気特性としては、例えば飽和磁化および保磁力がある。一般に、飽和磁化の値が大きいほど磁界に対する粒子の応答性が向上する。ここで、本発明のような密度が比較的大きい粒子を製造するには、磁性を帯びていない粒子の表面もしくは内部に磁性物質を持たす必要がある。この方法では磁性物質は磁性を帯びていない粒子よりも密度が小さいために、供する磁性物質の量を制限することによって必要な密度を維持しなければならず、８５Ａ・ｍ２／ｋｇよりも大きい飽和磁化を得ることは実際には困難である。その一方、飽和磁化が０．５Ａ・ｍ２／ｋｇよりも小さいと磁界に対する粒子の応答性が必要以上に低下するために好ましくない。従って、本発明の粒子の飽和磁化は、好ましくは０．５Ａ・ｍ２／ｋｇ〜８５Ａ・ｍ２／ｋｇ（０．５ｅｍｕ／ｇ〜８５ｅｍｕ／ｇ）であり、より好ましくは３Ａ・ｍ２／ｋｇ〜１０Ａ・ｍ２／ｋｇ（３ｅｍｕ／ｇ〜１０ｅｍｕ／ｇ）である。また、一般に、保磁力の値が大きいほど、飽和磁化の値が大きいほど凝集する力は強くなる。しかし、大きすぎると凝集が強くなりすぎ、分散しなくなってしまう。そのため、保磁力は、好ましくは、０ｋＡ／ｍ〜２３ＫＡ／ｍ（０〜３００エルステッド）であり、より好ましくは０ｋＡ／ｍ〜１５．９５ｋＡ／ｍ（０〜２００エルステッド）であり、更に好ましくは０ｋＡ／ｍ〜７．９７ｋＡ／ｍ（０〜１００エルステッド）である。 Examples of magnetic properties of particles include saturation magnetization and coercivity. In general, the larger the saturation magnetization value, the better the responsiveness of particles to a magnetic field. Here, in order to produce particles having a relatively high density as in the present invention, it is necessary to have a magnetic substance on the surface or inside of particles that are not magnetic. In this method, the magnetic material is less dense than non-magnetic particles, so the required density must be maintained by limiting the amount of magnetic material provided, and is greater than 85 A · m 2 / kg. It is actually difficult to obtain saturation magnetization. On the other hand, if the saturation magnetization is smaller than 0.5 A · m 2 / kg, the responsiveness of the particles to the magnetic field is undesirably lowered. Therefore, the saturation magnetization of the particles of the present invention is preferably 0.5 A · m 2 / kg to 85 A · m 2 / kg (0.5 emu / g to 85 emu / g), more preferably 3 A · m 2 / kg. kg to 10 A · m 2 / kg (3 emu / g to 10 emu / g). In general, the greater the coercive force value and the greater the saturation magnetization value, the stronger the cohesive force. However, if it is too large, the agglomeration becomes too strong and it will not be dispersed. Therefore, the coercive force is preferably 0 kA / m to 23 KA / m (0 to 300 oersted), more preferably 0 kA / m to 15.95 kA / m (0 to 200 oersted), and further preferably 0 kA. / M to 7.97 kA / m (0 to 100 oersted).
本明細書の「飽和磁化」および「保磁力」の値は、振動試料型磁力計（東英工業製、型式ＶＳＭ−５）を用いて測定される値である。具体的には、「飽和磁化」は、７９７ｋＡ／ｍ（１０キロエルステッド）の磁界を印加した際の磁化量から求められる飽和磁化の値である。「保磁力」は、７９７ｋＡ／ｍの磁界を印加した後、磁界をゼロに戻し、更に、磁界を逆方向に徐々に増加させた場合において、磁化量がゼロになる印加磁界の値である。 The values of “saturation magnetization” and “coercive force” in this specification are values measured using a vibrating sample magnetometer (manufactured by Toei Kogyo Co., Ltd., model VSM-5). Specifically, the “saturation magnetization” is a saturation magnetization value obtained from a magnetization amount when a magnetic field of 797 kA / m (10 kilo-Oersted) is applied. The “coercive force” is a value of an applied magnetic field at which the amount of magnetization becomes zero when a magnetic field of 797 kA / m is applied, the magnetic field is returned to zero, and the magnetic field is gradually increased in the opposite direction.
本発明の粒子の形状は特に制限はなく、例えば、球形状、楕円体形状、粒形状、板形状、針形状または多面体形状（例えば立方体形状）等であってよい。但し、磁性を帯びていない粒子に磁性物質被膜を形成する場合には、「磁性を帯びていない粒子」が球形状または楕円体形状を有していることが好ましい。 The shape of the particle of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, a spherical shape, an ellipsoidal shape, a particle shape, a plate shape, a needle shape, a polyhedral shape (for example, a cubic shape), or the like. However, when the magnetic substance film is formed on the non-magnetic particles, it is preferable that the “non-magnetic particles” have a spherical shape or an ellipsoidal shape.
本発明の粒子の平均サイズ（即ち「平均粒子サイズ」）は５μｍ〜１ｍｍであることが好ましい。平均粒子サイズが５μｍよりも小さいと、標的物質の分離に際して粒子の自然沈降による移動速度を十分に大きくすることができない一方、平均粒子サイズが１ｍｍよりも大きいと、標的物質を結合させるよりも早く沈降してしまい、標的物質が十分に結合できなくなるからである。より好ましくは１０μｍ〜５００μｍの平均粒子サイズであり、更に好ましくは２０μｍ〜１００μｍの平均粒子サイズである。ここでいう「粒子サイズ」とは、粒子のあらゆる方向における長さのうち最大となる長さを実質的に意味しており、「平均粒子サイズ」とは、粒子の電子顕微鏡写真または光学顕微鏡写真に基づいて例えば３００個の粒子のサイズを測定し、その数平均として算出した粒子サイズを実質的に意味している。ちなみに、純金属から成る粒子はサイズが小さくなると、急激な酸化が生じやすく、場合によっては粒子が発火する危険性があるが、本発明のような比較的大きい粒子サイズでは、急激な酸化が生じにくく、粒子が発火する危険性は低減されている。 The average size of the particles of the present invention (ie, “average particle size”) is preferably 5 μm to 1 mm. When the average particle size is smaller than 5 μm, the moving speed due to the natural sedimentation of the particles cannot be sufficiently increased during the separation of the target substance. On the other hand, when the average particle size is larger than 1 mm, it is faster than binding the target substance. This is because the target substance cannot be sufficiently bound due to settling. An average particle size of 10 μm to 500 μm is more preferable, and an average particle size of 20 μm to 100 μm is still more preferable. As used herein, “particle size” means substantially the maximum length of particles in all directions, and “average particle size” means an electron micrograph or optical micrograph of the particles. For example, the size of 300 particles is measured based on the above, and the particle size calculated as the number average is substantially meant. By the way, when particles made of pure metal are reduced in size, rapid oxidation is likely to occur, and in some cases there is a risk of ignition of the particles. However, with relatively large particle sizes as in the present invention, rapid oxidation occurs. The risk of ignition of particles is reduced.
本発明の粒子の表面に固定化されている「標的物質を結合させることが可能な物質」（以下では「標的物質が結合可能な物質」ともいう）は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジンから成る群から選択される少なくとも１種以上の物質であることが好ましい。また、本発明の粒子の表面に固定化されている「標的物質を結合させることが可能な官能基」（以下では「標的物質が結合可能な官能基」ともいう）は、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、トシル基、スクシンイミド基、マレイミド基、チオール基、チオエーテル基およびジスルフィド基などの硫化物官能基、アルデヒド基、アジド基、ヒドラジド基、一級アミノ基、二級アミノ基、三級アミノ基、イミドエステル基、カルボジイミド基、イソシアネート基、ヨードアセチル基、アシル基、ならびに、二重結合から成る群から選択される少なくとも１種以上の官能基であることが好ましい。なお、「標的物質が結合可能な官能基」は、上述した官能基の誘導体であってもかまわない。 The “substance capable of binding the target substance” (hereinafter also referred to as “substance capable of binding the target substance”) immobilized on the surface of the particle of the present invention is biotin, avidin, streptavidin and neutravidin. It is preferably at least one substance selected from the group consisting of: Further, the “functional group capable of binding the target substance” (hereinafter also referred to as “functional group capable of binding the target substance”) immobilized on the surface of the particle of the present invention is a carboxyl group, a hydroxyl group, Sulfide functional groups such as epoxy group, tosyl group, succinimide group, maleimide group, thiol group, thioether group and disulfide group, aldehyde group, azide group, hydrazide group, primary amino group, secondary amino group, tertiary amino group, It is preferably at least one functional group selected from the group consisting of an imide ester group, a carbodiimide group, an isocyanate group, an iodoacetyl group, an acyl group, and a double bond. The “functional group to which the target substance can bind” may be a derivative of the above-described functional group.
本明細書において「固定化」とは、一般的に、粒子本体の表面付近に「標的物質が結合可能な物質」または「標的物質が結合可能な官能基」が存在している態様を実質的に意味しており、必ずしも「標的物質が結合可能な物質」または「標的物質が結合可能な官能基」が粒子本体の表面に直接取り付けられている態様のみを意味するものではない。なお、本明細書において「標的物質が結合」という用語は、粒子に対して標的物質が「吸着」または「吸収」される態様をも包含している。 In the present specification, the term “immobilization” generally refers to an embodiment in which a “substance that can bind to a target substance” or a “functional group that can bind to a target substance” exists in the vicinity of the surface of the particle body. It does not necessarily mean only the mode in which the “substance capable of binding the target substance” or the “functional group to which the target substance can bind” is directly attached to the surface of the particle body. In the present specification, the term “target substance binds” includes an aspect in which the target substance is “adsorbed” or “absorbed” with respect to the particles.
本発明の粒子には「標的物質が結合可能な物質」または「標的物質が結合可能な官能基」が固定化されているので、かかる物質または官能基を介して標的物質を粒子に結合させることができる。 Since the particle of the present invention has a “substance that can bind to the target substance” or “functional group that can bind the target substance” immobilized thereon, the target substance can be bound to the particle via the substance or functional group. Can do.
「標的物質が結合可能な物質」を粒子に固定化させる手法は、特に制限されるものではなく、「標的物質が結合可能な物質」を粒子に結合または付着させることができるものであれば、いずれの手法を用いてもよい。「標的物質が結合可能な物質」を粒子に直接的に結合または付着させることに限らず、必要に応じて、珪素含有物質（例えばシロキサン、シランカップリング剤およびケイ酸ナトリウムなど）、標的物質が結合もしくは付着可能な官能基を有する樹脂、または粒子表面に貴金属被着処理を施した上で標的物質が結合もしくは付着可能な官能基を有する含硫黄化合物等の他の物質または官能基を予め粒子に付着または導入し、「標的物質が結合可能な物質」を粒子に固定化し易くしてもよい。例えば、珪素含有物質を用いた場合では、粒子の表面には「標的物質が結合可能な物質」が固定化されていると共に、かかる珪素含有物質が存在することになる。 The method for immobilizing the “substance that can be bound by the target substance” to the particle is not particularly limited, as long as it can bind or attach the “substance that can bind the target substance” to the particle. Any method may be used. It is not limited to directly binding or attaching the “substance to which the target substance can bind” to the particles, but if necessary, a silicon-containing substance (for example, siloxane, silane coupling agent and sodium silicate), Resin having a functional group capable of binding or adhering, or other substance or functional group such as a sulfur-containing compound having a functional group capable of binding or adhering to a target substance after precious metal deposition treatment on the particle surface It may be attached to or introduced into the particle so that the “substance capable of binding to the target substance” can be easily immobilized on the particles. For example, when a silicon-containing substance is used, a “substance that can bind to the target substance” is immobilized on the surface of the particle, and the silicon-containing substance is present.
「標的物質が結合可能な物質」を粒子に固定化させる手法の一例を説明すると、例えば、本発明の粒子の表面にエポキシ基やアミノ基を有するシランカップリング剤を反応させることによって、「標的物質が結合可能な物質」を粒子に固定化させる。 An example of a technique for immobilizing a “substance that can bind to a target substance” on a particle is described by, for example, reacting a silane coupling agent having an epoxy group or an amino group on the surface of the particle of the present invention with a “target”. The substance that can bind to the substance is immobilized on the particle.
同様に、「標的物質が結合可能な官能基」を粒子に固定化させる手法は、特に制限されるものではなく、「標的物質が結合可能な官能基」を粒子に結合または付着させることができるものであれば、いずれの手法を用いてもよい。同様に、「標的物質が結合可能な官能基」を粒子に直接的に結合または付着させるだけでなく、必要に応じて、珪素含有物質（例えばシロキサン、シランカップリング剤およびケイ酸ナトリウムなど）、標的物質が結合もしくは付着可能な官能基を有する樹脂、または粒子表面に貴金属被着処理を施した上で標的物質が結合もしくは付着可能な官能基を有する含硫黄化合物等の他の物質または官能基を予め粒子に付着または導入し、「標的物質が結合可能な官能基」を粒子に固定化し易くしてもよい。例えば、珪素含有物質を用いた場合では、粒子の表面には「標的物質が結合可能な官能基」が固定化されていると共に、かかる珪素含有物質が存在することになる。 Similarly, the method for immobilizing the “functional group to which the target substance can bind” is not particularly limited, and the “functional group to which the target substance can bind” can be bound or attached to the particle. Any method may be used as long as it is suitable. Similarly, in addition to directly attaching or attaching a “functional group to which a target substance can bind” to a particle, a silicon-containing substance (for example, siloxane, a silane coupling agent and sodium silicate), if necessary, Other substances or functional groups such as a resin having a functional group to which the target substance can be bonded or attached, or a sulfur-containing compound having a functional group to which the target substance can be bonded or attached after the noble metal deposition treatment on the particle surface May be previously attached to or introduced into the particle to facilitate immobilization of the “functional group to which the target substance can bind” to the particle. For example, when a silicon-containing substance is used, a “functional group to which the target substance can bind” is immobilized on the surface of the particle, and the silicon-containing substance is present.
以下では、「標的物質が結合可能な官能基」を粒子に固定化する手法の一例として、シロキサンを用いた手法を説明する。 Hereinafter, a technique using siloxane will be described as an example of a technique for immobilizing a “functional group to which a target substance can bind” to particles.
《シロキサンを用いた官能基の固定化》
この手法は、化学蒸着法（以下では「ＣＶＤ法」と略称する）によって1,3,5,7-テトラメチルシクロテトラシロキサン（以下では「ＴＭＣＴＳ」と略称する）で粒子表面を予め被覆する手法である。かかる手法は、ＴＭＣＴＳ膜が粒子表面に一層だけ形成された時点で、反応を終了する特徴を有している。
<< Immobilization of functional groups using siloxane >>
This method involves pre-coating the particle surface with 1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane (hereinafter abbreviated as “TMCTS”) by chemical vapor deposition (hereinafter abbreviated as “CVD method”). It is. This technique has a feature that the reaction is terminated when only one TMCTS film is formed on the particle surface.
（前処理工程）
まず、有機溶剤中に粒子を分散させることによって得られる分散液にＴＭＣＴＳを加える。この際、粒子表面にＴＭＣＴＳが１層形成されるのに充分な量のＴＭＣＴＳを加える。次いで、分散液をエバポレートして分散液から溶媒を除去し、真空デシケーター中で粒子を加熱乾燥させ、その後、１５０℃の恒温槽中にて加熱する。用いる有機溶剤は、エバポレータで蒸発しやすい沸点の低いものであれば、いずれの種類の有機溶剤でもよく、例えば、トルエン、ヘキサンまたはベンゼン等を挙げることができる。なお、真空デシケーター内が加熱乾燥に付されると、ＣＶＤ法と同じ効果がもたらされるので、加熱温度はＴＭＣＴＳが蒸発し、かつ分解等起きない範囲にすることが必要となる。具体的には３０〜８０℃程度の加熱温度が好ましい。最後に行う恒温槽中での加熱工程は、表面に付いたＴＭＣＴＳ同士の反応を進める過程である。温度が高くなりすぎると、ＴＭＣＴＳの分解が生じやすくなると共に、長時間実施すると、引き続いて行う官能基の固定化工程で必要とされる反応点がなくなってしまうので、１００〜２００℃の加熱温度および２時間以内の反応時間が好ましい。なお、粒子が疎水性となることから、粒子表面にＴＭＣＴＳ膜が形成されたことを確認できる。
(Pretreatment process)
First, TMCTS is added to a dispersion obtained by dispersing particles in an organic solvent. At this time, a sufficient amount of TMCTS is added to form one layer of TMCTS on the particle surface. Next, the dispersion is evaporated to remove the solvent from the dispersion, and the particles are heated and dried in a vacuum desiccator, and then heated in a thermostatic bath at 150 ° C. The organic solvent to be used may be any kind of organic solvent as long as it is easily evaporated by an evaporator and has a low boiling point, and examples thereof include toluene, hexane, and benzene. Note that, when the inside of the vacuum desiccator is subjected to heat drying, the same effect as that of the CVD method is brought about. Therefore, the heating temperature needs to be in a range where TMCTS evaporates and decomposition does not occur. Specifically, a heating temperature of about 30 to 80 ° C. is preferable. The heating process in the thermostat performed last is a process of advancing the reaction between TMCTS attached to the surface. If the temperature becomes too high, TMCTS is likely to be decomposed, and if it is carried out for a long time, there will be no reactive sites required in the subsequent functional group immobilization step, so a heating temperature of 100 to 200 ° C. And reaction times within 2 hours are preferred. Since the particles are hydrophobic, it can be confirmed that a TMCTS film is formed on the particle surface.
（官能基の固定化工程）
上述の前処理工程に引き続いて、官能基の固定化工程を実施する。固定化する官能基を含んだ化合物は、その末端に二重結合が存在することが必要であるが、それ以外は特に制限はない。例えば、用いる化合物において官能基と二重結合部位との間がどのような構造であってもよい。なお、官能基は一つとは限らず、複数であってもかまわない。また、複数の異なる種類の官能基を固定化してもかまわない。
(Functional group immobilization process)
Subsequent to the above pretreatment step, a functional group immobilization step is performed. A compound containing a functional group to be immobilized needs to have a double bond at its end, but there is no particular limitation other than that. For example, the structure used may have any structure between the functional group and the double bond site. In addition, the functional group is not limited to one and may be plural. A plurality of different types of functional groups may be immobilized.
例えばエポキシ基等の官能基を含む化合物が固定化される反応過程では、ＴＭＣＴＳに含まれるＳｉ−Ｈの部分と官能基を含む化合物の二重結合部とが相互に反応して官能基が粒子表面に導入されることになる。具体的な操作としては、粒子を溶媒中に分散させ、加温状態で、反応触媒と固定化すべき官能基を持つ化合物とを添加し、数時間反応させる。用いる溶媒は、固定化すべき官能基を持つ化合物が溶解できると共に、６０℃以上に加温でも安定した反応速度が得られるものであれば、いずれの種類の溶媒であってもよく、例えば、水、エチレングリコールなどが挙げられる。同様に、反応触媒も上述の反応を促進させるものであれば、いずれの種類の触媒であってもよく、例えば、塩化白金酸などを挙げることができる。 For example, in a reaction process in which a compound containing a functional group such as an epoxy group is immobilized, the Si-H part contained in TMCTS and the double bond part of the compound containing the functional group react with each other to form functional groups. Will be introduced to the surface. As a specific operation, particles are dispersed in a solvent, and a reaction catalyst and a compound having a functional group to be immobilized are added in a heated state and reacted for several hours. The solvent to be used may be any type of solvent as long as it can dissolve the compound having the functional group to be immobilized and can obtain a stable reaction rate even when heated to 60 ° C. or higher. And ethylene glycol. Similarly, the reaction catalyst may be any type of catalyst as long as it promotes the above-described reaction, and examples thereof include chloroplatinic acid.
以上、本発明の実施形態について説明してきたが、本発明はこれに限定されず、種々の改変を施してもよい。 As mentioned above, although embodiment of this invention has been described, this invention is not limited to this, You may give a various change.
例えば、標的物質の分離に際して粒子への非特異結合または非特異吸着をより抑えるために、ポリエチレングリコール、正常血清、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、カゼイン及び脱脂粉乳から成る群から選択される少なくとも１種以上の物質を粒子本体の表面に付着させてもよい。付着方法としては、特に限定されるものではなく、粒子の一般的な被覆法を用いてよい。 For example, at least one selected from the group consisting of polyethylene glycol, normal serum, bovine serum albumin, human serum albumin, casein, and nonfat dry milk in order to further suppress nonspecific binding or nonspecific adsorption to the particles during separation of the target substance. More than one species of substance may be attached to the surface of the particle body. The attachment method is not particularly limited, and a general particle coating method may be used.
尚、本発明の粒子の本体表面にはポリマーが被着していてもよい。この場合、その被着しているポリマー（「被着ポリマー」とも称す）の表面に「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」を固定化させることができる。これによって、「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」を粒子本体に共有結合させることが困難な場合であっても、「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」を粒子表面に固定化できる。また、粒子本体表面に固定化された「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」が、種々の使用条件下の用途において粒子本体表面から分離してしまうことが懸念される用途では、「標的物質を結合させることが可能な物質または官能基」を被着ポリマーに固定化させることによって粒子本体からの分離を防止することができる。更に、被着させるポリマーとして、各種分子または金属イオン等が透過しにくいポリマーを選択すると、粒子本体表面または粒子内部からの金属イオン（即ち、粒子本体の構成成分たる金属のイオン）の溶出を抑えることができ、粒子の種々の用途において金属イオン等に起因した不要な反応を抑えることもできる。ここで、被着ポリマーを例示すれば、ポリスチレンまたはその誘導体、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリビニルエーテル、ポリウレタン、ポリアミド、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリアリルアミンおよびポリエチレンイミンから成る群から選択される少なくとも１種以上の合成高分子化合物を挙げることができる。なお、このような合成高分子化合物に限定されず、これらの変性物または共重合体であってもかまわない。更には、ヒドロキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロースもしくはアルギン酸ナトリウム等の半合成高分子化合物、または、キトサン、キチン、デンプン、ゼラチンもしくはアラビアゴム等の天然高分子化合物等のポリマーであってもかまわない。 In addition, the polymer may adhere to the main body surface of the particle | grains of this invention. In this case, a “substance or functional group capable of binding a target substance” can be immobilized on the surface of the attached polymer (also referred to as “attached polymer”). Thus, even if it is difficult to covalently bond the “substance or functional group capable of binding the target substance” to the particle body, the “substance or functional group capable of binding the target substance” Can be immobilized on the particle surface. In applications where the “substance or functional group capable of binding the target substance” immobilized on the surface of the particle body is likely to be separated from the surface of the particle body in applications under various conditions of use. , Separation from the particle body can be prevented by immobilizing the “substance or functional group capable of binding the target substance” to the adherend polymer. Further, when a polymer that is difficult to transmit various molecules or metal ions is selected as the polymer to be deposited, elution of metal ions from the surface of the particle main body or inside the particle (that is, metal ions that are constituent components of the particle main body) is suppressed. It is also possible to suppress unnecessary reactions caused by metal ions and the like in various uses of the particles. Here, as examples of the polymer to be deposited, polystyrene or derivatives thereof, poly (meth) acrylic acid, poly (meth) acrylic acid ester, polyvinyl ether, polyurethane, polyamide, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol, polyallylamine and polyethyleneimine And at least one synthetic polymer compound selected from the group consisting of: In addition, it is not limited to such a synthetic polymer compound, These modified products or copolymers may be used. Furthermore, it may be a polymer such as a semi-synthetic polymer compound such as hydroxyalkyl cellulose, carboxyalkyl cellulose or sodium alginate, or a natural polymer compound such as chitosan, chitin, starch, gelatin or gum arabic.
粒子の分離速度および非特異結合特性を確認するために、以下に示す実施例および比較例を実施した。 In order to confirm the separation rate and nonspecific binding characteristics of the particles, the following examples and comparative examples were carried out.
《粒子の調製》
実施例１〜４および比較例１,２で用いた粒子を以下のように調製した。
（実施例１）
実施例１で調製した粒子は、アビジンが固定化されたタングステン粒子P１である。
<Preparation of particles>
The particles used in Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 and 2 were prepared as follows.
Example 1
The particles prepared in Example 1 are tungsten particles P 1 on which avidin is immobilized.
まず、日立金属製のタングステン粒子ｐ１を用意した。かかる粒子ｐ１は、粒径１００μｍ、比表面積０．００３ｍ２／ｇ、密度１９．１ｇ／ｃｍ３であった。１ｇの粒子ｐ１をトルエン中に分散させ、得られる分散液に対して1,3,5,7-テトラメチルシクロテトラシロキサン（信越化学工業製、ＬＳ−８６００）を０．５ｇ加えた。分散液をエバポレートに付してトルエンを蒸発させた後で、真空デシケーター中で粒子を５０℃にて４時間放置した。その後、１５０℃の恒温槽中で粒子を１．５時間加熱した。かかる処理によって、粒子ｐ１が疎水性を持つように変化し、粒子が1,3,5,7-テトラメチルシクロテトラシロキサンで被覆されたことを確認した。 First of all, we were prepared tungsten particles p 1 made of Hitachi Metals. The particles p 1 had a particle size of 100 μm, a specific surface area of 0.003 m 2 / g, and a density of 19.1 g / cm 3 . 1g of particles p 1 were dispersed in toluene, 1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane against dispersion obtained (manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., LS-8600) was added 0.5 g. After the dispersion was evaporated to evaporate toluene, the particles were allowed to stand at 50 ° C. for 4 hours in a vacuum desiccator. Thereafter, the particles were heated in a constant temperature bath at 150 ° C. for 1.5 hours. By this treatment, it was confirmed that the particles p 1 were changed to have hydrophobicity and the particles were coated with 1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane.
引き続いて、得られた粒子を水中に分散させて８０℃に加熱した。これにより得られた分散液に対して、１０ｍｇの塩化白金酸および０．５ｇの共栄社化学製ライトエステルを加えて、８０℃にて４時間攪拌した。次いで、粒子を水洗した後、粒子に対して１０ｗｔ％エタノールアミン１０ｍｌを供することによって得られる分散液を室温下で１２時間攪拌した。次いで、粒子を洗浄・濾過・乾燥に付すことによって、表面に水酸基が固定化されたタングステン粒子ｐ１を得た。かかる粒子ｐ１は親水性であった。 Subsequently, the obtained particles were dispersed in water and heated to 80 ° C. 10 mg of chloroplatinic acid and 0.5 g of Kyoeisha Chemical Light Ester were added to the resulting dispersion and stirred at 80 ° C. for 4 hours. Next, after the particles were washed with water, the dispersion obtained by supplying 10 ml of 10 wt% ethanolamine to the particles was stirred at room temperature for 12 hours. Next, the particles were subjected to washing, filtration, and drying to obtain tungsten particles p 1 having hydroxyl groups immobilized on the surface. Such particles p 1 was hydrophilic.
引き続いて、得られた粒子２００ｍｇに対して、１００ｍｇのアビジンが１０ｍＭＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）２０ｍｌに溶解している水溶液を加え、一晩攪拌した。その後、１０ｍＭＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）および水で粒子を洗浄した後、粒子を真空乾燥に付すことによって、アビジンが固定化されたタングステン粒子Ｐ１を得た。粒子Ｐ１の比表面積は０．００３ｍ２／ｇであって、密度は１９．１ｇ／ｃｍ３、粒子径は約１００μｍであった。 Subsequently, an aqueous solution in which 100 mg of avidin was dissolved in 20 ml of 10 mM PBS solution (pH 7.2) was added to 200 mg of the obtained particles, and the mixture was stirred overnight. Thereafter, the particles were washed with a 10 mM PBS solution (pH 7.2) and water, and then subjected to vacuum drying to obtain tungsten particles P 1 having avidin immobilized thereon. The specific surface area of the particles P 1 was 0.003 m 2 / g, the density was 19.1 g / cm 3 , and the particle diameter was about 100 μm.
（実施例２）
実施例２で調製した粒子は、アビジンが固定化された鉛粒子Ｐ２である。実施例１とは原料粒子のみが異なっている。
(Example 2)
Particles prepared in Example 2 is a lead particle P 2 which avidin is immobilized. Only the raw material particles are different from Example 1.
まず、大橋鋼球製の鉛粒子ｐ２を用意した。かかる粒子ｐ２は、粒径８００μｍ、比表面積０．０００６６ｍ２／ｇ、密度１１．３６ｇ／ｃｍ３であった。１ｇの粒子ｐ２をトルエン中に分散させ、得られる分散液に対して1,3,5,7-テトラメチルシクロテトラシロキサン（信越化学工業製、ＬＳ−８６００）を０．５ｇ加えた。分散液をエバポレートに付してトルエンを蒸発させた後で、真空デシケーター中で粒子を５０℃にて４時間放置した。その後、１５０℃の恒温槽中で粒子を１．５時間加熱した。かかる処理によって、粒子ｐ２が疎水性を持つように変化し、粒子が1,3,5,7-テトラメチルシクロテトラシロキサンで被覆されたことを確認した。 First of all, were prepared lead particles p 2 made of Ohashi steel balls. The particles p 2 had a particle size of 800 μm, a specific surface area of 0.00066 m 2 / g, and a density of 11.36 g / cm 3 . 1g of particles p 2 were dispersed in toluene, 1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane against dispersion obtained (manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., LS-8600) was added 0.5 g. After the dispersion was evaporated to evaporate toluene, the particles were allowed to stand at 50 ° C. for 4 hours in a vacuum desiccator. Thereafter, the particles were heated in a constant temperature bath at 150 ° C. for 1.5 hours. By such processing, change as the particle p 2 having a hydrophobic, it was confirmed that particles coated with 1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane.
引き続いて、得られた粒子を水中に分散させて８０℃に加熱した。これにより得られた分散液に対して、１０ｍｇの塩化白金酸および０．５ｇの共栄社化学製ライトエステルを加えて、８０℃にて４時間攪拌した。次いで、粒子を水洗した後、粒子に対して１０ｗｔ％エタノールアミン１０ｍｌを供することによって得られる分散液を室温下で１２時間攪拌した。次いで、粒子を洗浄・濾過・乾燥に付すことによって、表面に水酸基が固定化された鉛粒子ｐ２を得た。かかる粒子ｐ２は親水性であった。 Subsequently, the obtained particles were dispersed in water and heated to 80 ° C. 10 mg of chloroplatinic acid and 0.5 g of Kyoeisha Chemical Light Ester were added to the resulting dispersion and stirred at 80 ° C. for 4 hours. Next, after the particles were washed with water, the dispersion obtained by supplying 10 ml of 10 wt% ethanolamine to the particles was stirred at room temperature for 12 hours. Then, by subjecting the particles to washed, filtered and dried, hydroxyl group to give the lead particles p 2 immobilized on the surface. Such particles p 2 was hydrophilic.
引き続いて、得られた粒子２００ｍｇに対して、１００ｍｇのアビジンが１０ｍＭＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）２０ｍｌに溶解している水溶液を加え、一晩攪拌した。その後、１０ｍＭＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）および水で粒子を洗浄した後、粒子を真空乾燥に付すことによって、アビジンが固定化された鉛粒子Ｐ２を得た。粒子Ｐ２の比表面積は０．０００６６ｍ２／ｇであって、密度は１１．３ｇ／ｃｍ３、粒子径は約８００μｍであった。 Subsequently, an aqueous solution in which 100 mg of avidin was dissolved in 20 ml of 10 mM PBS solution (pH 7.2) was added to 200 mg of the obtained particles, and the mixture was stirred overnight. After washing the particles with 10mMPBS solution (pH 7.2) and water, by subjecting the particles to vacuum drying, avidin was obtained lead particles P 2 immobilized. The specific surface area of the particles P 2 was 0.00066 m 2 / g, the density was 11.3 g / cm 3 , and the particle diameter was about 800 μm.
（実施例３）
実施例３で調製した粒子は、アビジンが固定化されたタングステン粒子Ｐ３である。実施例１とは粒子の調整法が異なっている。
(Example 3)
Particles prepared in Example 3 is a tungsten particles P 3 which avidin is immobilized. The particle adjustment method is different from that in Example 1.
まず、日立金属製のタングステン粒子ｐ３を用意した。かかる粒子ｐ３は、粒径１００μｍ、比表面積０．００３ｍ２／ｇ、密度１９．１ｇ／ｃｍ３であった。１０ｇの粒子ｐ３を純水２５ｇに分散させ、得られる分散液を攪拌しながら、末端にエポキシ基を有する３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン３ｇを分散液に添加して更に４時間攪拌した。次いで、アセトンで粒子を洗浄した後、粒子を真空乾燥に付すことによって、エポキシ基を有するタングステン粒子ｐ３を得た。 First of all, we were prepared tungsten particles p 3 manufactured by Hitachi Metals. The particle p 3 had a particle size of 100 μm, a specific surface area of 0.003 m 2 / g, and a density of 19.1 g / cm 3 . While dispersing 10 g of particles p3 in 25 g of pure water and stirring the resulting dispersion, 3 g of 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane having an epoxy group at the end was added to the dispersion and further stirred for 4 hours. . Then, after washing the particles with acetone, by subjecting the particles to vacuum drying, to obtain a tungsten particles p 3 having an epoxy group.
引き続いて、得られた粒子２００ｍｇに対して、１００ｍｇのアビジンが１０ｍＭＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）２０ｍｌに溶解している水溶液を供し、一晩攪拌した。その後、１０ｍＭＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）および水で粒子を洗浄した後、粒子を真空乾燥に付すことによって、アビジンが固定化されたタングステン粒子Ｐ３を得た。粒子Ｐ３の比表面積は０．００３ｍ２／ｇであって、密度は１９．１ｇ／ｃｍ３、粒子径は約１００μｍであった。 Subsequently, an aqueous solution in which 100 mg of avidin was dissolved in 20 ml of 10 mM PBS solution (pH 7.2) was applied to 200 mg of the obtained particles, and stirred overnight. After washing the particles with 10mMPBS solution (pH 7.2) and water, by subjecting the particles to vacuum drying, avidin was obtained tungsten particles P 3 immobilized. The specific surface area of the particles P 3 was 0.003 m 2 / g, the density was 19.1 g / cm 3 , and the particle size was about 100 μm.
（実施例４）
実施例４で調製した粒子は、アビジンが固定化されたタングステン粒子Ｐ４である。粒子Ｐ４が磁性を有している点で実施例１の粒子Ｐ１と異なっている。
Example 4
Particles prepared in Example 4 is tungsten particles P 4 with avidin immobilized. The particle P 4 is different from the particle P 1 of Example 1 in that the particle P 4 has magnetism.
まず、日立金属製のタングステン粒子ｐ４を用意した。かかる粒子ｐ４は、粒径１００μｍ、比表面積０．００３ｍ２／ｇ、密度１９．１ｇ／ｃｍ３であった。１ｇの粒子ｐ４を水中に分散させ、得られる分散液に対してシランカップリング剤（信越化学工業製、ＫＢＭ−９０３）を添加することによって、粒子ｐ４の表面にシランカップリング剤を被着させた。次いで、シプレーファーイスト製Ｐｄ触媒Ｃａｔａｌｙｓｔ−６Ｆを加えて粒子の表面にメッキ核を生成させた。得られた粒子を１．２Ｎ塩酸を用いて洗浄した後、奥野製薬製ニッケルメッキ液トップニコロンＬＰＨを用いて、粒子表面にてニッケルメッキ層を生成させ、粒子を洗浄・濾過・乾燥に付した。これ以降は、実施例１と同様の処理を実施して、水酸基が固定化された粒子ｐ４を得た。つまり、得られた粒子を水中に分散させて８０℃に加熱した。これにより得られた分散液に対して、１０ｍｇの塩化白金酸および０．５ｇの共栄社化学製ライトエステルを加えて、８０℃にて４時間攪拌した。次いで、粒子を水洗した後、粒子に対して１０ｗｔ％エタノールアミン１０ｍｌを供することによって得られる分散液を室温下で１２時間攪拌した。その後、粒子を洗浄・濾過・乾燥に付すことによって、表面に水酸基が固定化されたタングステン粒子ｐ４を得た。かかる粒子ｐ４は親水性であった。 First of all, we were prepared tungsten particles p 4 made of Hitachi Metals. The particle p 4 had a particle size of 100 μm, a specific surface area of 0.003 m 2 / g, and a density of 19.1 g / cm 3 . 1g of particles p 4 are dispersed in water, the silane coupling agent to the resultant dispersion (available from Shin-Etsu Chemical Co., KBM-903) by the addition of a silane coupling agent to the surface of the particle p 4 under I wore it. Next, a Pd catalyst Catalyst-6F manufactured by Shipleyfarist was added to generate plating nuclei on the surface of the particles. After the obtained particles are washed with 1.2N hydrochloric acid, a nickel plating layer is formed on the particle surface using the nickel plating solution Top Nicolon LPH manufactured by Okuno Pharmaceutical, and the particles are subjected to washing, filtration and drying. did. After this, by carrying out the same treatment as in Example 1, hydroxyl group to obtain particles p 4 immobilized. That is, the obtained particles were dispersed in water and heated to 80 ° C. 10 mg of chloroplatinic acid and 0.5 g of Kyoeisha Chemical Light Ester were added to the resulting dispersion and stirred at 80 ° C. for 4 hours. Next, after the particles were washed with water, a dispersion obtained by supplying 10 ml of 10 wt% ethanolamine to the particles was stirred at room temperature for 12 hours. Then, by subjecting the particles to washed, filtered and dried, hydroxyl groups on the surface to obtain a tungsten particles p 4 immobilized. Such particles p 4 were hydrophilic.
引き続いて、得られた粒子２００ｍｇに対して、１００ｍｇのアビジンが１０ｍＭＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）２０ｍｌに溶解している水溶液を供し、一晩攪拌した。その後、１０ｍＭＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）および水で粒子を洗浄した後、粒子を真空乾燥に付すことによって、アビジンが固定化されたタングステン粒子Ｐ４を得た。粒子Ｐ４の比表面積は０．００３ｍ２／ｇであって、密度は１９．１ｇ／ｃｍ３、粒子径は約１００μｍであった。尚、この粒子Ｐ４の飽和磁化量を測定したところ１３Ａ・ｍ２／ｋｇであった。 Subsequently, an aqueous solution in which 100 mg of avidin was dissolved in 20 ml of 10 mM PBS solution (pH 7.2) was applied to 200 mg of the obtained particles, and stirred overnight. After washing the particles with 10mMPBS solution (pH 7.2) and water, by subjecting the particles to vacuum drying, avidin was obtained tungsten particles P 4 immobilized. The specific surface area of the particles P 4 was 0.003 m 2 / g, the density was 19.1 g / cm 3 , and the particle size was about 100 μm. The saturation magnetization of the particle P 4 was measured and found to be 13 A · m 2 / kg.
ちなみに、上述の実施例には、エポキシ基を有したシランカップリング剤を用いた例が含まれているが、シランカップリング剤として、メルカプト基、二重結合を有する官能基などを有したものを用いてもよいことに留意されたい。 Incidentally, in the above-mentioned examples, an example using a silane coupling agent having an epoxy group is included. As the silane coupling agent, a compound having a mercapto group, a functional group having a double bond, etc. Note that may be used.
（比較例１）
比較例１で用いた粒子は、水酸基が固定化された架橋アクリル粒子Ｒ１である。
(Comparative Example 1)
Particles used in Comparative Example 1 is a cross-linked acrylic particles hydroxyl group is immobilized R 1.
まず、綜研化学（株）製の架橋アクリル粒子ｒ１を用意した。かかる粒子ｒ１は、粒径３０μｍ、比表面積０．０３３ｍ２／ｇ、密度１．１９ｇ／ｃｍ３であった。１ｇの粒子ｒ１をトルエン中に分散させ、得られる分散液に対して1,3,5,7-テトラメチルシクロテトラシロキサン（信越化学工業製、ＬＳ−８６００）を１ｇ加えた。分散液をエバポレートに付してトルエンを蒸発させた後で、真空デシケーター中で粒子を５０℃にて４時間放置した。次いで、１５０℃の恒温槽中で粒子を１．５時間加熱した。かかる処理によって、粒子ｒ１が疎水性を帯びるように変化し、粒子が1,3,5,7-テトラメチルシクロテトラシロキサンで被覆されたことを確認した。 First, it was prepared a cross-linked acrylic particles r 1 manufactured by Soken Chemical & Engineering Co., Ltd.. The particles r 1 had a particle size of 30 μm, a specific surface area of 0.033 m 2 / g, and a density of 1.19 g / cm 3 . 1 g of particles r1 were dispersed in toluene, and 1 g of 1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane (manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., LS-8600) was added to the resulting dispersion. After the dispersion was evaporated to evaporate toluene, the particles were allowed to stand at 50 ° C. for 4 hours in a vacuum desiccator. The particles were then heated for 1.5 hours in a constant temperature bath at 150 ° C. By this treatment, it was confirmed that the particle r 1 was changed to be hydrophobic and the particle was coated with 1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane.
引き続いて、得られた粒子を水中に分散させて８０℃に加熱した。これにより得られた分散液に対して、２０ｍｇの塩化白金酸および１ｇの共栄社化学製ライトエステルを加えて、８０℃にて４時間攪拌した。次いで、粒子を水洗した後、粒子に対して１０ｗｔ％エタノールアミン２０ｍｌを供することによって得られる分散液を室温下で１２時間攪拌した。その後、粒子を洗浄・濾過・乾燥に付すことによって、表面に水酸基が固定化された架橋アクリル粒子Ｒ１を得た。かかる粒子Ｒ１は親水性であった。粒子Ｒ１の比表面積は０．０３３ｍ２／ｇであって、密度は１．１９ｇ／ｃｍ３、粒径は約３０μｍであった（粒子Ｒ１の粒径と粒子ｒ１の粒径との差は測定誤差範囲内）。 Subsequently, the obtained particles were dispersed in water and heated to 80 ° C. 20 mg of chloroplatinic acid and 1 g of Kyoeisha Chemical Light Ester were added to the resulting dispersion and stirred at 80 ° C. for 4 hours. Next, the particles were washed with water, and then the dispersion obtained by supplying 20 ml of 10 wt% ethanolamine to the particles was stirred at room temperature for 12 hours. Then, by subjecting the particles to washed, filtered and dried, hydroxyl groups on the surface to obtain an immobilized crosslinked acrylic particles R 1. Such particles R 1 was hydrophilic. The specific surface area of the particle R 1 was 0.033 m 2 / g, the density was 1.19 g / cm 3 , and the particle size was about 30 μm (the particle size of the particle R 1 and the particle size of the particle r 1 The difference is within the measurement error range).
（比較例２）
比較例２で用いた粒子は、アビジンが固定化された多孔質ゼオライト粒子Ｒ２である。
(Comparative Example 2)
The particles used in Comparative Example 2 are porous zeolite particles R 2 on which avidin is immobilized.
まず、東ソー（株）製（ＨＳＺ−７００）のゼオライトｒ２を用意した。かかるｒ２は、粒径１８μｍ、比表面積１７０ｍ２／ｇ、密度２．３ｇ／ｃｍ３であった。１ｇの粒子ｒ２をトルエン中に分散させ、得られる分散液に対して1,3,5,7-テトラメチルシクロテトラシロキサン（信越化学工業製、ＬＳ−８６００）を２ｇ加えた。分散液をエバポレートに付してトルエンを蒸発させた後で、真空デシケーター中で粒子を５０℃にて４時間放置した。次いで、１５０℃の恒温槽中で粒子を１．５時間加熱した。かかる処理によって、粒子ｒ２が疎水性に変化し、粒子が1,3,5,7-テトラメチルシクロテトラシロキサンで被覆されたことを確認した。 First of all, we were prepared zeolite r 2 of Tosoh Co., Ltd. (HSZ-700). The r 2 had a particle size of 18 μm, a specific surface area of 170 m 2 / g, and a density of 2.3 g / cm 3 . 1 g of particles r2 was dispersed in toluene, and 2 g of 1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane (manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., LS-8600) was added to the resulting dispersion. After the dispersion was evaporated to evaporate toluene, the particles were allowed to stand at 50 ° C. for 4 hours in a vacuum desiccator. The particles were then heated for 1.5 hours in a constant temperature bath at 150 ° C. By such processing, the particle r 2 vary in hydrophobicity, it was confirmed that particles coated with 1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane.
得られた粒子を水中に分散させて８０℃に加熱した。これにより得られた分散液に対して、２０ｍｇの塩化白金酸および２ｇの共栄社化学製ライトエステルを加えて、８０℃にて４時間攪拌した。そして、粒子を水洗した後、粒子に対して１０ｗｔ％エタノールアミン２０ｍｌを供することによって得られる分散液を室温下で１２時間攪拌した。その後、粒子を洗浄・濾過・乾燥に付すことによって、表面に水酸基が固定化された多孔質ゼオライト粒子ｒ２を得た。かかる粒子ｒ２は親水性であった。 The obtained particles were dispersed in water and heated to 80 ° C. 20 mg of chloroplatinic acid and 2 g of Kyoeisha Chemical Light Ester were added to the resulting dispersion and stirred at 80 ° C. for 4 hours. And after washing | cleaning particle | grains with water, the dispersion liquid obtained by providing 20 ml of 10 wt% ethanolamine with respect to particle | grains was stirred at room temperature for 12 hours. Then, by subjecting the particles to washed, filtered and dried, hydroxyl groups on the surface to obtain an immobilized porous zeolite particles r 2. Such particles r 2 was hydrophilic.
引き続いて、得られた粒子２００ｍｇに対して、１００ｍｇのアビジンが１０ｍＭＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）２０ｍｌに溶解している水溶液を加え、一晩攪拌した。その後、１０ｍＭＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）および水で粒子を洗浄した後、粒子を真空乾燥に付すことによって、アビジンが固定化された多孔質ゼオライト粒子Ｒ２を得た。得られた粒子Ｒ２の比表面積は１７０ｍ２／ｇであって、密度は２．３ｇ／ｃｍ３、粒径は約１８μｍであった（粒子Ｒ２の粒径と粒子ｒ２の粒径との差は測定誤差範囲内）。 Subsequently, an aqueous solution in which 100 mg of avidin was dissolved in 20 ml of 10 mM PBS solution (pH 7.2) was added to 200 mg of the obtained particles, and the mixture was stirred overnight. Thereafter, the particles were washed with a 10 mM PBS solution (pH 7.2) and water, and then subjected to vacuum drying to obtain porous zeolite particles R 2 having avidin immobilized thereon. The obtained particle R 2 had a specific surface area of 170 m 2 / g, a density of 2.3 g / cm 3 , and a particle size of about 18 μm (the particle size of the particle R 2 and the particle size of the particle r 2 The difference is within the measurement error range).
《粒子の分離速度の確認試験》
実施例および比較例で得られた粒子の分離速度を確認するために、以下のような試験を実施した。
<Confirmation test of particle separation speed>
In order to confirm the separation rate of the particles obtained in Examples and Comparative Examples, the following tests were conducted.
まず、実施例および比較例で得られた粒子１ｇをそれぞれ試験管内の５ｍｌの水に分散させて静置させた。そして、静置後から透明な上澄みが得られるまでの時間（以下「分離時間」と呼ぶ）を測定した。分離時間からは、粒子の自然沈降による移動速度（即ち、自然沈降速度）が間接的に把握できる。また、同様な操作を試験管の底付近に磁石を配置した状態で行った。結果を表１に示す。
表１に示す結果から、以下の事項を把握することができる。
（イ）より高密度である実施例の粒子の分離時間の方が比較例の粒子の分離時間よりも相当短いことが確認された。つまり、本発明の粒子の分離速度は比較例の粒子の分離速度よりも速く、本発明の粒子を用いると、より速く標的物質を試料から分離できる。
From the results shown in Table 1, the following matters can be grasped.
(A) It was confirmed that the separation time of the particles of the example having a higher density was considerably shorter than the separation time of the particles of the comparative example. That is, the separation speed of the particles of the present invention is faster than the separation speed of the comparative particles, and the target substance can be separated from the sample more quickly by using the particles of the present invention.
（ロ）粒子密度が比較的近い比較例１（１．１９ｇ／ｃｍ３）と比較例２（２．３ｇ／ｃｍ３）との間で自然沈降速度を比べると、比表面積が大きい比較例２の方が自然沈降速度がより遅くなっている。比較例２の原料粒子は多孔質粒子であるが、そのような比表面積が大きい多孔質粒子（即ち、内部貫通ネットワーク構造を持っている粒子）は、空隙部が多く、気体が粒子内部に存在し、沈降しにくくなったと推測される。つまり、比表面積が大きい多孔質粒子などでは分離速度が遅くなる。 (B) Comparing Comparative Example 2 with a large specific surface area when comparing the natural sedimentation rate between Comparative Example 1 (1.19 g / cm 3 ) and Comparative Example 2 (2.3 g / cm 3 ) having relatively close particle densities. Has a slower natural sedimentation rate. The raw material particles of Comparative Example 2 are porous particles, but such porous particles having a large specific surface area (that is, particles having an internal penetrating network structure) have many voids and gas is present inside the particles. It is estimated that it became difficult to settle. That is, the separation rate is slow for porous particles having a large specific surface area.
（ハ）実施例１と実施例４とを比較すると、磁性を有する粒子に対しては、自然沈降に加えて磁気分離操作を補助的に行うことよって、粒子の分離速度をより速くできる。 (C) Comparing Example 1 and Example 4, for particles having magnetism, the magnetic separation operation can be performed in addition to natural sedimentation, whereby the particle separation rate can be further increased.
《粒子の非特異結合特性の確認試験》
実施例１で得られたアビジンが固定化されたタングステン粒子Ｐ１および比較例２で得られたアビジンが固定化されたゼオライト粒子Ｒ２を用いて、粒子の非特異結合特性を確認した。ここで、タングステン粒子Ｐ１の比表面積が０．００３ｍ２／ｇであり、ゼオライト粒子Ｒ２の比表面積が１７０ｍ２／ｇであるので、粒子Ｐ１を非多孔質粒子とみなし、粒子Ｒ２を多孔質粒子とみなすことができることに留意されたい。標的物質としては、ＨＲＰおよびビオチン化ＨＲＰの２種類の物質を用いた（両者の酵素活性は略同等である）。粒子に固定化されているアビジンは、ビオチン化ＨＲＰと特異的に結合するが、ＨＲＰとは特異的に結合しない。つまり、ビオチン化ＨＲＰは粒子に特異的（優先的）に結合し、一方、ＨＲＰは、粒子の細孔領域などに吸着され得、粒子に対しては非特異的に結合することになる。
<Confirmation test of non-specific binding properties of particles>
The non-specific binding characteristics of the particles were confirmed using the tungsten particles P 1 immobilized with avidin obtained in Example 1 and the zeolite particles R 2 immobilized with avidin obtained in Comparative Example 2. Here, the specific surface area of tungsten particles P 1 is 0.003 m 2 / g, and the specific surface area of the zeolite particles R 2 is a 170m 2 / g, considers the particles P 1 and the non-porous particles, the particles R 2 Note that can be regarded as porous particles. As target substances, two kinds of substances, HRP and biotinylated HRP, were used (both enzyme activities are substantially equivalent). Avidin immobilized on the particles specifically binds to biotinylated HRP, but does not specifically bind to HRP. That is, biotinylated HRP binds specifically (preferentially) to the particles, while HRP can be adsorbed to the pore region of the particles and binds non-specifically to the particles.
実施例１の粒子Ｐ１および比較例２の粒子Ｒ２に対してはそれぞれ同様の操作を行ったため、以下では、実施例１の粒子Ｐ１に対する操作を中心に説明する。
まず、１．５ｍｌチューブを２つ用意し、それぞれに２ｍｇの粒子Ｐ１を仕込んだ。一方のチューブには、濃度２０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＨＲＰを１００μｌ加え、もう一方のチューブには、濃度２０ｎｇ／ｍｌのＨＲＰを１００μｌ加えた後、ボルテックスミキサーで３０分間攪拌した。その後、１０ｍＭＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）４００μｌで、それぞれのチューブに仕込まれた粒子Ｐ１を洗浄し遠心分離に付した。この洗浄および遠心分離を４回行った。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）を除去した後、粒子Ｐ１が含まれるそれぞれのチューブに２００μｌのＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を加えて３０分間静置させることによって、粒子Ｐ１を発色させた。次いで、１Ｎ硫酸を２００μｌ加えて、反応を停止させた。そして、ＴＥＣＡＮ社製プレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ２００で吸光度（４５０ｎｍ）を測定することによって、それぞれのチューブに仕込まれた粒子Ｐ１の発色量を求めた。ビオチン化ＨＲＰが供された粒子Ｐ１に対する発色量およびＨＲＰが供された粒子Ｐ１に対する発色量は、それぞれ、粒子Ｐ１に対して特異的に結合するビオチン化ＨＲＰの量および粒子Ｐ１に対して非特異的に結合するＨＲＰの量に比例するものである。従って、非特異的に結合するＨＲＰに対する発色量Ｉ非特異に対する特異的に結合するビオチン化ＨＲＰの発色量Ｉ特異の比（Ｉ特異／Ｉ非特異）が大きい場合では粒子の非特異結合特性がより少なく、逆に、かかる比（Ｉ特異／Ｉ非特異）が小さい場合では粒子の非特異結合特性がより大きいことになる。
Since For particles R 2 particles P 1 and Comparative Example 2 Example 1 was respectively subjected to the same operations, the following description will mainly operations on particles P 1 of the first embodiment.
First, 1.5ml tube 2 was prepared and charged particles P 1 of 2mg each. 100 μl of biotinylated HRP with a concentration of 20 ng / ml was added to one tube, and 100 μl of HRP with a concentration of 20 ng / ml was added to the other tube, followed by stirring with a vortex mixer for 30 minutes. Thereafter, the particles P 1 charged in each tube were washed with 400 μl of 10 mM PBS buffer (pH 7.2) and centrifuged. This washing and centrifugation were performed 4 times. After removal of the PBS buffer (pH 7.2), by standing by adding 200μl of TMB (tetramethylbenzidine) to each tube containing the particles P 1 30 minutes to develop the particles P 1. Subsequently, 200 μl of 1N sulfuric acid was added to stop the reaction. The absorbance (450 nm) was measured with a TECAN plate reader Infinite 200 to determine the color development amount of the particles P 1 charged in each tube. Coloring amount for particles P 1 of coloring level and HRP was subjected to particle P 1 biotinylated HRP is subjected, respectively, to the amount and particle P 1 of biotinylated HRP specifically binding to the particles P 1 It is proportional to the amount of HRP that binds non-specifically. Therefore, the non-specific binding characteristics in case where the ratio of the coloring level I specificity of biotinylated HRP that binds specifically for coloring level I unspecific for HRP to bind nonspecifically (I specificity / I nonspecific) is large particles Less and conversely, when such a ratio (I- specific / I non-specific ) is small, the non-specific binding properties of the particles will be greater.
同様の操作を、比較例２の粒子Ｒ２に対しても行い、粒子Ｒ２に対して特異的に結合するビオチン化ＨＲＰの発色量Ｉ特異および粒子Ｒ２に対して非特異的に結合するＨＲＰの発色量Ｉ非特異を求めた。 The same operation is performed even for particles R 2 of Comparative Example 2, non-specifically bind to coloring level I-specific and particles R 2 biotinylated HRP to bind specifically to particles R 2 The color development amount I non-specificity of HRP was determined.
結果を表２に示す。表２の結果から分かるように、実施例１の粒子Ｐ１の方が比較例２の粒子Ｒ２よりもＩ特異／Ｉ非特異の値が大きく非特異結合が抑えられていることが分かった。つまり、比表面積が小さく実質的に非多孔質の本発明の粒子では、標的物質以外の物質が結合する非特異結合を抑えることができることを理解できよう。
《まとめ》
以上の「粒子の分離速度の確認試験」および「粒子の非特異結合特性の確認試験」から、本発明の粒子は、自然沈降による移動速度だけでも十分な分離速度を得ることができると共に、標的物質以外の物質が結合する非特異結合を抑えることができることが分かった。
<Summary>
From the above “Particle Separation Rate Confirmation Test” and “Particle Nonspecific Binding Property Confirmation Test”, the particles of the present invention can obtain a sufficient separation rate only by the moving speed by natural sedimentation, It was found that non-specific binding of substances other than substances can be suppressed.
本発明の粒子は、細胞、蛋白質、核酸または化学物質等の標的物質の定量、分離、精製および分析等に利用できる。例えば、本発明の粒子は、ＤＮＡ等の核酸を結合させることができ、結果的にＤＮＡの塩基配列の解析に用いることができるので、テーラーメード医療技術に資するものである。 The particles of the present invention can be used for quantification, separation, purification and analysis of target substances such as cells, proteins, nucleic acids or chemical substances. For example, the particles of the present invention can bind nucleic acids such as DNA, and as a result, can be used for analysis of DNA base sequences, which contributes to tailor-made medical technology.
Claims (10)
前記標的物質を結合させることが可能な物質または官能基が粒子本体の表面に固定化されており、
比表面積が０．０００５ｍ２／ｇ〜１．０ｍ２／ｇであって、密度が９．０（９．０を除く）〜２３ｇ／ｃｍ３であり、
前記粒子本体が金属または合金を含んで成ることを特徴とする、粒子。 A particle to which a target substance can bind,
A substance or functional group capable of binding the target substance is immobilized on the surface of the particle body,
The specific surface area is a 0.0005m 2 /g~1.0m 2 / g, a density (excluding 9.0) 9.0 was ~23g / cm 3,
Particles characterized in that the particle body comprises a metal or an alloy.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007278663A JP2009109209A (en) | 2007-10-26 | 2007-10-26 | High-density functional particles having suppressed nonspecific bonding |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007278663A JP2009109209A (en) | 2007-10-26 | 2007-10-26 | High-density functional particles having suppressed nonspecific bonding |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009109209A true JP2009109209A (en) | 2009-05-21 |
Family
ID=40777854
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007278663A Withdrawn JP2009109209A (en) | 2007-10-26 | 2007-10-26 | High-density functional particles having suppressed nonspecific bonding |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2009109209A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016180716A (en) * | 2015-03-25 | 2016-10-13 | 住友ベークライト株式会社 | Affinity bead |
-
2007
- 2007-10-26 JP JP2007278663A patent/JP2009109209A/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016180716A (en) * | 2015-03-25 | 2016-10-13 | 住友ベークライト株式会社 | Affinity bead |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| He et al. | Magnetic separation techniques in sample preparation for biological analysis: a review | |
| CA2493367C (en) | Methods and reagents for improved selection of biological materials | |
| JP6452704B2 (en) | Production of magnetic particles | |
| US4687748A (en) | Magnetic carbohydrate particles as carriers for affinity separation purposes | |
| JP5009125B2 (en) | Microdevice using functional particles and processing method using the same | |
| US4672040A (en) | Magnetic particles for use in separations | |
| US8288169B2 (en) | Surface mediated self-assembly of nanoparticles | |
| CN106457196B (en) | The operating method and magnetisable material particle manipulation device of magnetisable material particle | |
| EP1748072A1 (en) | Hydroxysilane functionalized magnetic particles and nucleic acid separation method | |
| JP2010000409A (en) | Surface-roughened high-density functional particle, method for producing the same and method for treating target substance by using the same | |
| JPH05507792A (en) | Method for removing ligands from particle surfaces | |
| US20090029482A1 (en) | Functional particle, and method for separation of target substance using the same | |
| JP2009109214A (en) | Functional particle having particle size distribution allowing measurement of single particle, and separation method of target material using it | |
| JP2005069955A (en) | Magnetic carrier for combining biological matter | |
| JP2009109209A (en) | High-density functional particles having suppressed nonspecific bonding | |
| JP2007078595A (en) | Functional particle and its manufacturing method | |
| JP2010249729A (en) | Functional particle containing gold component | |
| JP2006508667A (en) | Magnetic-based nucleic acid amplification | |
| JP2002090366A (en) | Biologically specific affinity carrier with immobilized ferrite and its manufacturing method | |
| JP2009106797A (en) | Surface-roughened high-density functional particle, method for producing the same, and method for treating target substance with the same | |
| JP2011007543A (en) | Functional particle | |
| JP2006225744A (en) | Functional particle and method for producing the same | |
| JP2011027552A (en) | Method for inhibition of fine particle aggregation, and preservative solution | |
| JP2009106798A (en) | Surface-roughened high-density functional particle, method for producing the same, and method for treating target substance with the same | |
| JP2006169623A (en) | Functional particle and its production method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20110104 |