JP2009017842A - Method for improving productivity - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method by which at least one kind of enzyme selected from the group comprising a γ-cyclodextrin synthase, a maltose phosphorylase and a trehalose phosphorylase can stably be mass-produced. <P>SOLUTION: The problems are solved by a host-vector system extracellularly and stably mass-producing at least one kind of enzyme selected from the group comprising the γ-cyclodextrin synthase, the maltose phosphorylase and the trehalose phosphorylase. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を工業的に生産する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、この方法に使用する、転写を調節する塩基配列、シグナルペプチドをコードする遺伝子、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される１種の酵素をコードする遺伝子、およびアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクターを導入した宿主細胞、ならびにγ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する方法に関する。   The present invention relates to a method for industrially producing at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. More specifically, the present invention is a method selected from the group consisting of a base sequence that regulates transcription, a gene encoding a signal peptide, γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. A recombinant vector comprising a gene encoding the enzyme and a gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase, a host cell introduced with the recombinant vector, and a group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase It relates to a method for producing at least one selected enzyme.

γ−シクロデキストリンの合成には、γ−シクロデキストリンを主生成物とするシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（以下、「γ−シクロデキストリン合成酵素」と呼ぶ）を澱粉等に作用させる方法が知られている（たとえば、特許文献１を参照）。特許文献１によれば、外来遺伝子を含む組換えベクターを宿主細胞に導入する宿主−ベクター系を利用してγ−シクロデキストリン合成酵素を取得している。具体的には、γ−シクロデキストリン合成酵素をコードする遺伝子をアンピシリン耐性遺伝子を含むＴ−ベクターにライゲーションし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を形質転換して培養することにより、γ−シクロデキストリン合成酵素を取得している。 For the synthesis of γ-cyclodextrin, there is known a method in which a cyclodextrin / glucanotransferase (hereinafter referred to as “γ-cyclodextrin synthase”) containing γ-cyclodextrin as a main product acts on starch or the like. (For example, see Patent Document 1). According to Patent Document 1, γ-cyclodextrin synthase is obtained using a host-vector system that introduces a recombinant vector containing a foreign gene into a host cell. Specifically, a gene encoding γ-cyclodextrin synthase is ligated to a T-vector containing an ampicillin resistance gene, and Escherichia coli is transformed and cultured to obtain γ-cyclodextrin synthase. Have acquired.

一方、トレハロースの合成には、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼをマルトースに作用させる方法が知られている（たとえば、特許文献２を参照）。特許文献２でも宿主−ベクター系を利用してマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを取得している。具体的には、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子を適当なベクターに挿入し、大腸菌または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を形質転換してアンピシリンまたはテトラサイクリンなどを含む培地で培養することにより、マルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを取得している。 On the other hand, for the synthesis of trehalose, a method of allowing maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase to act on maltose is known (see, for example, Patent Document 2). In Patent Document 2, maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase are obtained using a host-vector system. Specifically, by inserting a gene encoding maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase into an appropriate vector, transforming E. coli or Bacillus subtilis and culturing in a medium containing ampicillin or tetracycline, etc., maltose phosphorylase And have acquired trehalose phosphorylase.

上記のγ−シクロデキストリン合成酵素の生産方法とマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼの生産方法は、大腸菌を宿主細胞とする宿主−ベクター系を利用している（たとえば、特許文献１および２を参照）。大腸菌は、世代時間が約２０分と短く、様々な糖類を資化して増殖することができる。さらに大腸菌に適した多くのプラスミドベクターも開発されており、大腸菌を宿主細胞とする宿主−ベクター系は、実験室での組換えタンパク質の生産において一応の成果を期待できる。   The production method of γ-cyclodextrin synthase and the production method of maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase utilize a host-vector system using Escherichia coli as a host cell (see, for example, Patent Documents 1 and 2). E. coli has a generation time as short as about 20 minutes, and can grow by assimilating various sugars. Furthermore, many plasmid vectors suitable for E. coli have been developed, and a host-vector system using E. coli as a host cell can be expected to produce a temporary result in the production of recombinant proteins in the laboratory.

しかしながら、大腸菌の組換えタンパク質を菌体内に蓄積するという性質のために、大腸菌自体の生育が阻害され、さらに菌体内のタンパク質分解酵素の作用により組換えタンパク質の機能が失いやすいという、組換えタンパク質の大量かつ安定に生産する上で不利な点があった。さらに、組換えタンパク質を取得するためには菌体を回収して破砕し、かつ、発熱性物質の一種であるリポポリサッカライドを注意深く除去しなければならない。このために、組換えタンパク質の採取・精製のための工程が頻雑になるという問題も生じていた。   However, because of the property of accumulating the recombinant protein of E. coli in the cell, the growth of E. coli itself is inhibited, and the function of the recombinant protein is easily lost due to the action of proteolytic enzymes in the cell. There were disadvantages in producing a large amount and stable. Furthermore, in order to obtain a recombinant protein, the cells must be collected and crushed, and lipopolysaccharide, which is a kind of pyrogen, must be carefully removed. For this reason, the problem that the process for collection | purification and refinement | purification of a recombinant protein became complicated also had arisen.

そこで、これらの問題を解決する手段として、枯草菌を利用した宿主−ベクター系が知られている（たとえば、特許文献２および非特許文献３を参照）。特許文献２によれば、菌体内よりも菌体外の培養上清中に多くのマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼを得ている。しかし、取得される酵素量は少なく、大量生産にまでは至っていない。   Thus, host-vector systems using Bacillus subtilis are known as means for solving these problems (see, for example, Patent Document 2 and Non-Patent Document 3). According to Patent Document 2, more maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase are obtained in the culture supernatant outside the cell than in the cell. However, the amount of enzyme acquired is small and has not yet reached mass production.

一方、上記のγ−シクロデキストリン合成酵素の生産方法とマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼの生産方法は、それぞれの酵素遺伝子を抗生物質耐性遺伝子とともに挿入した組換えベクターを利用している。これにより、抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質を培養培地中に加えることで、抗生物質耐性遺伝子含有組換えベクターを維持する細胞は選択され、該組換えベクターを維持しない細胞は選択されず、したがって排除される。   On the other hand, the production method of γ-cyclodextrin synthase and the production method of maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase utilize a recombinant vector in which each enzyme gene is inserted together with an antibiotic resistance gene. Thereby, by adding an antibiotic corresponding to the antibiotic resistance gene to the culture medium, cells that maintain the antibiotic resistance gene-containing recombinant vector are selected, cells that do not maintain the recombinant vector are not selected, Therefore, it is eliminated.

すなわち、抗生物質耐性遺伝子を組換えベクターに挿入する方法は、組換えベクターを宿主細胞内に安定に維持させることができ、実験室で通常行なわれている。しかし、下記の理由により工業的スケールの生産では望ましくない。
（ｉ）抗生物質耐性菌株の使用は、環境に対して危険を呈する可能性がある。
（ｉｉ）培養中に必要な抗生物質の量は生産コストを有意に増加させる。
（ｉｉｉ）抗生物質の使用は、ヒト及び動物向けに用いられる物質の生産においては回避すべきである。 That is, the method of inserting an antibiotic resistance gene into a recombinant vector can stably maintain the recombinant vector in the host cell, and is usually performed in the laboratory. However, it is not desirable in industrial scale production for the following reasons.
(I) The use of antibiotic resistant strains can be dangerous for the environment.
(Ii) The amount of antibiotic required during culture significantly increases production costs.
(Iii) The use of antibiotics should be avoided in the production of substances used for humans and animals.

そこで、抗生物質耐性遺伝子を用いずに組換えベクターを安定化させる方法として、染色体の栄養要求突然変異を補う方法が知られている（非特許文献１および２）。しかしながら、染色体の栄養要求突然変異を補って組換えベクターを安定化させる方法は、宿主細菌が必要とする栄養を培地に加えずに発酵を行う必要があるため、発酵培地の組成を厳しく制限する必要がある。しかも、栄養共生によって、組換えベクターの消失後もなお細胞が増殖しうる可能性がある。
特開２００３−１０２４８９号公報 国際公開第０５／００３３４３号パンフレット Genetics. 1989 May;122(1):19-27 Curr Genet. 1989 Sep;16(3):159-63 Ohta Y, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004 ,68,1073-1081 Therefore, as a method for stabilizing a recombinant vector without using an antibiotic resistance gene, a method for compensating for a chromosomal auxotrophic mutation is known (Non-Patent Documents 1 and 2). However, methods that compensate for chromosomal auxotrophic mutations and stabilize recombinant vectors require fermentation without adding the nutrients required by the host bacteria to the medium, thus severely limiting the composition of the fermentation medium. There is a need. Moreover, due to symbiosis, the cells may still be able to grow after the disappearance of the recombinant vector.
JP 2003-102489 A International Publication No. 05/003343 Pamphlet Genetics. 1989 May; 122 (1): 19-27 Curr Genet. 1989 Sep; 16 (3): 159-63 Ohta Y, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004, 68,1073-1081

本発明者らは、枯草菌を宿主細胞として用いた宿主−ベクター系により、γ−シクロデキストリン合成酵素を大量に生産することを試みた。しかし、上記したマルトースホスホリラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼの生産と同じく、γ−シクロデキストリン合成酵素についても、枯草菌を宿主細胞として用いたこれまでの宿主−ベクター系では菌体外に大量に分泌することができないことを見出した。   The present inventors tried to produce a large amount of γ-cyclodextrin synthase by a host-vector system using Bacillus subtilis as a host cell. However, in the same manner as the production of maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase described above, γ-cyclodextrin synthase cannot be secreted in large amounts outside the cells by conventional host-vector systems using Bacillus subtilis as host cells. I found out.

そこで、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼまたはトレハロースホスホリラーゼを菌体外に大量に分泌することができる、新たな宿主−ベクター系の提供が強く望まれている。   Therefore, it is strongly desired to provide a new host-vector system capable of secreting a large amount of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase or trehalose phosphorylase outside the cells.

一方、組換えベクターを維持する宿主細胞を選択する方法について、抗生物質耐性遺伝子を組み込む方法および染色体の栄養要求突然変異を補う方法のいずれもが、培地の特殊な処理に依存している。かかる制約は、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼまたはトレハロースホスホリラーゼの生産において、発酵工程の費用の増大、および生産性向上のためにとり得る選択自由度の制限を招く。   On the other hand, as a method for selecting a host cell for maintaining a recombinant vector, both a method for incorporating an antibiotic resistance gene and a method for compensating for a chromosomal auxotrophic mutation depend on a special treatment of the medium. Such a restriction results in an increase in the cost of the fermentation process and a limitation in the degree of freedom of selection that can be taken to improve productivity in the production of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase or trehalose phosphorylase.

そこで、抗生物質を用いることなく、かつ培地組成に制約されずに組換えベクターを維持しうる、他の選択方法が強く望まれている。   Therefore, other selection methods that can maintain the recombinant vector without using antibiotics and without being restricted by the medium composition are strongly desired.

したがって、本発明の目的は、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼまたはトレハロースホスホリラーゼを菌体外に大量に分泌しうる、新たな宿主−ベクター系を提供することにある。   Accordingly, an object of the present invention is to provide a new host-vector system capable of secreting a large amount of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase or trehalose phosphorylase outside the cells.

さらに、抗生物質を用いることなく、かつ培地組成に制約されずに組換えベクターを維持する新たな手段を提供することにより、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼまたはトレハロースホスホリラーゼを大量かつ安定に生産しうる方法を提供することを目的とする。   In addition, γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase or trehalose phosphorylase can be produced in large quantities and stably by providing a new means to maintain the recombinant vector without using antibiotics and without being restricted by the medium composition. It aims to provide a possible method.

上記課題を解決するために種々検討を行い、宿主細胞をバチルス属細菌として、組換えベクターに組み込む最適な転写を調節する塩基配列（以下、「遺伝子調節領域」と呼ぶ）とシグナルペプチドをコードする遺伝子（以下、「シグナルペプチド遺伝子」と呼ぶ）の組み合わせを検討し、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を菌体外に大量に分泌することができる宿主−ベクター系を得ることができ、本発明を完成するに至った。   Various studies have been conducted to solve the above problems, and the host cell is a bacterium belonging to the genus Bacillus. Considering combinations of genes (hereinafter referred to as “signal peptide genes”), a large amount of at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase outside the cell A host-vector system that can be secreted can be obtained and the present invention has been completed.

さらに、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を保有する染色体外遺伝子と該アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性に欠損を生じさせた染色体変異宿主細胞との相補性に基づくことで、抗生物質を用いることなく、かつ培地組成に制約されずにγ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターを維持することに成功し、上記した酵素を大量かつ安定に生産しうる方法を見出し、本発明を完成させた。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を保有する染色体外遺伝子を含有した細胞のみが生存を確保されることに基づく。   Furthermore, it is based on the complementarity between the extrachromosomal gene carrying the aminoacyl-tRNA synthetase gene and the chromosomally mutated host cell that is defective in the aminoacyl-tRNA synthetase activity. Unrestricted, succeeded in maintaining a recombinant vector containing a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, A method capable of producing a large amount and stably has been found and the present invention has been completed. Only cells that contain extrachromosomal genes carrying the aminoacyl-tRNA synthetase gene are ensured to survive.

すなわち、本発明は以下のとおりである。
＜１＞γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有し、かつ
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターであって、
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞において用いられる前記組換えベクター。
＜２＞下記（ａ）〜（ｃ）の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクター：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子；および
（ｃ）前記（ｂ）の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子。
＜３＞下記（ａ）〜（ｄ）の塩基配列または遺伝子を有し、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞において用いられる組換えベクター：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子；
（ｃ）前記（ｂ）の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子；および
（ｄ）発現可能な状態にあるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子。
＜４＞アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンｔＲＮＡ合成酵素、グルタメートｔＲＮＡ合成酵素、グリシンｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、リシンｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素、セリルｔＲＮＡ合成酵素、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素、またはバリルｔＲＮＡ合成酵素である、＜１＞または＜３＞に記載の組換えベクター。
＜５＞γ−シクロデキストリン合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の組換えベクター。
＜６＞マルトースホスホリラーゼをコードする遺伝子が、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の組換えベクター。
＜７＞トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子が、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の組換えベクター。
＜８＞組換えベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、またはレトロトランスポゾンの形態を有する＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の組換えベクター。
＜９＞アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞であって、
γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有し、かつ
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターで形質転換して用いられる前記宿主細胞。
＜１０＞下記（ａ）〜（ｃ）の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクターで形質転換して用いられる宿主細胞：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子；および
（ｃ）前記（ｂ）の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子。
＜１１＞アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞であって、
下記（ａ）〜（ｄ）の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクターで形質転換して用いられる前記宿主細胞：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子；
（ｃ）前記（ｂ）の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子；および
（ｄ）発現可能な状態にあるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子。
＜１２＞アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンｔＲＮＡ合成酵素、グルタメートｔＲＮＡ合成酵素、グリシンｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、リシンｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素、セリルｔＲＮＡ合成酵素、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素、またはバリルｔＲＮＡ合成酵素である、＜９＞または＜１１＞に記載の宿主細胞。
＜１３＞γ−シクロデキストリン合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、＜９＞〜＜１２＞のいずれかに記載の宿主細胞。
＜１４＞マルトースホスホリラーゼをコードする遺伝子が、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、＜９＞〜＜１２＞のいずれかに記載の宿主細胞。
＜１５＞トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子が、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、＜９＞〜＜１２＞のいずれかに記載の宿主細胞。
＜１６＞宿主細胞が細菌である＜９＞〜＜１５＞のいずれかに記載の宿主細胞。
＜１７＞細菌がバチルス属細菌である、＜１６＞に記載の宿主細胞。
＜１８＞下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を有する、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する方法：
（ｉ）γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有し、さらにアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターを用意する工程；
（ｉｉ）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞を用意する工程；
（ｉｉｉ）前記宿主細胞を前記組換えベクターで形質転換して形質転換体を得る工程；および
（ｉｖ）前記形質転換体を培養して、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する工程。
＜１９＞下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を有する、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する方法：
（ｉ）下記［ａ］〜［ｃ］の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクターを用意する工程、
［ａ］配列番号１に記載の塩基配列、
［ｂ］前記［ａ］の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、および
［ｃ］前記［ｂ］の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子；
（ｉｉ）前記組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を得る工程；および
（ｉｉｉ）前記形質転換体を培養して、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する工程。
＜２０＞下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を有する、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する方法：
（ｉ）下記［ａ］〜［ｄ］の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクターを用意する工程、
［ａ］配列番号１に記載の塩基配列、
［ｂ］前記［ａ］の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
［ｃ］前記［ｂ］の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子、および
［ｄ］発現可能な状態にあるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子；
（ｉｉ）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞を用意する工程；
（ｉｉｉ）前記宿主細胞を前記組換えベクターで形質転換して形質転換体を得る工程；および
（ｉｖ）前記形質転換体を培養して、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する工程。
＜２１＞アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンｔＲＮＡ合成酵素、グルタメートｔＲＮＡ合成酵素、グリシンｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、リシンｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素、セリルｔＲＮＡ合成酵素、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素、またはバリルｔＲＮＡ合成酵素である、＜１８＞または＜２０＞に記載の方法。
＜２２＞γ−シクロデキストリン合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、＜１８＞〜＜２１＞のいずれかに記載の方法。
＜２３＞マルトースホスホリラーゼをコードする遺伝子が、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、＜１８＞〜＜２１＞のいずれかに記載の方法。
＜２４＞トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子が、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、＜１８＞〜＜２１＞のいずれかに記載の方法。
＜２５＞宿主細胞が細菌である＜１８＞〜＜２４＞のいずれかに記載の方法。
＜２６＞細菌がバチルス属細菌である＜２５＞に記載の方法。
＜２７＞γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される１種の酵素の遺伝子が、前記遺伝子と９５％以上の相同性を有し、かつ、前記選択される酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、＜５＞〜＜８＞のいずれかに記載の組換えベクター。
＜２８＞γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される１種の酵素の遺伝子が、前記遺伝子と９５％以上の相同性を有し、かつ、前記選択される酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、＜１３＞〜＜１７＞のいずれかに記載の宿主細胞。
＜２９＞γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される１種の酵素の遺伝子が、前記遺伝子と９５％以上の相同性を有し、かつ、前記選択される酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、＜２２＞〜＜２６＞のいずれかに記載の方法。 That is, the present invention is as follows.
<1> a gene having an expressible gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, and encoding an aminoacyl-tRNA synthetase A recombinant vector having a state in which it can be expressed,
The host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is deleted or a host cell having a mutation in which the expression of a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is reduced to such an extent that the host cell cannot grow. Recombinant vector.
<2> Recombinant vector having the following base sequences or genes (a) to (c):
(A) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of (a); and (c) directly downstream of the gene of (b) A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase linked to.
<3> Expression of a chromosomal gene encoding a host cell having an aminoacyl-tRNA synthetase or a host cell having a mutation having a nucleotide sequence or gene of the following (a) to (d) and lacking a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase: Recombinant vector for use in a host cell having a mutation that has been reduced to such an extent that the host cell cannot grow:
(A) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of (a);
(C) a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase directly linked downstream of the gene of (b); and (D) a gene encoding an aminoacyl tRNA synthetase in an expressible state.
<4> Aminoacyl tRNA synthetase is tryptophanyl tRNA synthetase, alanyl tRNA synthetase, arginyl tRNA synthetase, asparginyl tRNA synthetase, aspartyl tRNA synthetase, cysteinyl tRNA synthetase, glutamine tRNA synthetase, glutamate tRNA synthetase, glycine tRNA synthetase, histidyl tRNA synthetase, isoleucyl tRNA synthetase, leucyl tRNA synthetase, lysine tRNA synthetase, methionyl tRNA synthetase, phenylalanine tRNA synthetase, prolyl tRNA synthetase, seryl tRNA synthetase, threonyl tRNA synthetase, tyrosyl The recombinant vector according to <1> or <3>, which is a tRNA synthetase or a valyl tRNA synthetase.
<5> The recombinant vector according to any one of <1> to <4>, wherein the gene encoding γ-cyclodextrin synthase is a gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3.
<6> The recombinant vector according to any one of <1> to <4>, wherein the gene encoding maltose phosphorylase is a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
<7> The recombinant vector according to any one of <1> to <4>, wherein the gene encoding trehalose phosphorylase is a gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5.
<8> The recombinant vector according to any one of <1> to <7>, wherein the recombinant vector has a form of a plasmid, bacteriophage, or retrotransposon.
<9> a host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is deleted or a host cell having a mutation in which the expression of a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is reduced to such an extent that the host cell cannot grow There,
A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase can be expressed, and a gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase can be expressed The host cell which is used after being transformed with a recombinant vector having a certain state.
<10> A host cell transformed and used with a recombinant vector having the following base sequences or genes (a) to (c):
(A) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of (a); and (c) directly downstream of the gene of (b) A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase linked to.
<11> a host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is deleted or a host cell having a mutation in which the expression of a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is reduced to such an extent that the host cell cannot grow There,
The host cell used by being transformed with a recombinant vector having the following base sequences or genes (a) to (d):
(A) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of (a);
(C) a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase directly linked downstream of the gene of (b); and (D) a gene encoding an aminoacyl tRNA synthetase in an expressible state.
<12> aminoacyl tRNA synthetase is tryptophanyl tRNA synthetase, alanyl tRNA synthetase, arginyl tRNA synthetase, asparginyl tRNA synthetase, aspartyl tRNA synthetase, cysteinyl tRNA synthetase, glutamine tRNA synthetase, glutamate tRNA synthetase, glycine tRNA synthetase, histidyl tRNA synthetase, isoleucyl tRNA synthetase, leucyl tRNA synthetase, lysine tRNA synthetase, methionyl tRNA synthetase, phenylalanine tRNA synthetase, prolyl tRNA synthetase, seryl tRNA synthetase, threonyl tRNA synthetase, tyrosyl The host cell according to <9> or <11>, which is a tRNA synthetase or a valyl tRNA synthetase.
<13> The host cell according to any one of <9> to <12>, wherein the gene encoding γ-cyclodextrin synthase is a gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3.
<14> The host cell according to any one of <9> to <12>, wherein the gene encoding maltose phosphorylase is a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
<15> The host cell according to any one of <9> to <12>, wherein the gene encoding trehalose phosphorylase is a gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5.
<16> The host cell according to any one of <9> to <15>, wherein the host cell is a bacterium.
<17> The host cell according to <16>, wherein the bacterium is a Bacillus bacterium.
<18> A method for producing at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, comprising the following steps (i) to (iv):
(I) a gene capable of expressing a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, and further encoding an aminoacyl-tRNA synthetase Preparing a recombinant vector having a state capable of expressing the gene;
(Ii) a host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is deleted or a host cell having a mutation in which the expression of a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is reduced to such an extent that the host cell cannot grow Preparing step;
(Iii) transforming the host cell with the recombinant vector to obtain a transformant; and (iv) culturing the transformant to produce γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. Producing at least one enzyme selected from the group consisting of:
<19> A method for producing at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, comprising the following steps (i) to (iii):
(I) a step of preparing a recombinant vector having the following base sequences or genes [a] to [c];
[A] the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
[B] a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of [a], and [c] directly downstream of the gene of [b] A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase linked to
(Ii) transforming a host cell with the recombinant vector to obtain a transformant; and (iii) culturing the transformant to comprise γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. Producing at least one enzyme selected from the group.
<20> A method for producing at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, comprising the following steps (i) to (iv):
(I) a step of preparing a recombinant vector having the following base sequences or genes [a] to [d],
[A] the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
[B] a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 directly or indirectly linked downstream of the base sequence of [a],
[C] a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, directly linked downstream of the gene of [b], and [D] a gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase in an expressible state;
(Ii) a host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is deleted or a host cell having a mutation in which the expression of a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is reduced to such an extent that the host cell cannot grow Preparing step;
(Iii) transforming the host cell with the recombinant vector to obtain a transformant; and (iv) culturing the transformant to produce γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. Producing at least one enzyme selected from the group consisting of:
<21> aminoacyl tRNA synthetase is tryptophanyl tRNA synthetase, alanyl tRNA synthetase, arginyl tRNA synthetase, asparginyl tRNA synthetase, aspartyl tRNA synthetase, cysteinyl tRNA synthetase, glutamine tRNA synthetase, glutamate tRNA synthetase, glycine tRNA synthetase, histidyl tRNA synthetase, isoleucyl tRNA synthetase, leucyl tRNA synthetase, lysine tRNA synthetase, methionyl tRNA synthetase, phenylalanine tRNA synthetase, prolyl tRNA synthetase, seryl tRNA synthetase, threonyl tRNA synthetase, tyrosyl The method according to <18> or <20>, which is a tRNA synthetase or a valyl tRNA synthetase.
<22> The method according to any one of <18> to <21>, wherein the gene encoding γ-cyclodextrin synthase is a gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3.
<23> The method according to any one of <18> to <21>, wherein the gene encoding maltose phosphorylase is a gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4.
<24> The method according to any one of <18> to <21>, wherein the gene encoding trehalose phosphorylase is a gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5.
<25> The method according to any one of <18> to <24>, wherein the host cell is a bacterium.
<26> The method according to <25>, wherein the bacterium is a Bacillus bacterium.
<27> a gene of one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase has 95% or more homology with the gene and is selected The recombinant vector according to any one of <5> to <8>, which is a gene encoding a protein having enzyme activity.
<28> a gene of one kind of enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase has 95% or more homology with the gene and is selected The host cell according to any one of <13> to <17>, which is a gene encoding a protein having enzyme activity.
<29> a gene of one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase has 95% or more homology with the gene and is selected The method according to any one of <22> to <26>, which is a gene encoding a protein having enzyme activity.

本発明によれば、最適な遺伝子調節領域およびシグナルペプチド遺伝子の組み合わせを組換えベクターに含めることで、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を菌体外に大量に分泌することができる。   According to the present invention, by including an optimal gene regulatory region and signal peptide gene combination in a recombinant vector, at least one selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. Enzymes can be secreted in large quantities outside the cells.

さらに、抗生物質を用いることなく、かつ特定成分を含有しないよう制限を加えた培地を用いることなくγ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターを維持することができ、その結果、工業的な生産においても、醗酵槽内での培養が終了するまで細胞中の組換えベクターを安定化させることができ、上記した酵素を工業的規模で大量かつ安定に生産することができる。   Further, at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase without using antibiotics and without using a medium that is not restricted to contain a specific component As a result, even in industrial production, the recombinant vector in the cell can be stabilized until the cultivation in the fermenter is completed, The above-mentioned enzyme can be produced in large quantities and stably on an industrial scale.

（Ａ）本発明の組換えベクター
本発明の組換えベクターの一つの形態は、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有し、かつアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターであって、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞において用いられる前記組換えベクター（以下、「組換えベクターＡ」と呼ぶ）である。 (A) Recombinant vector of the present invention One form of the recombinant vector of the present invention is a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. A host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is deleted, wherein the recombinant vector has a gene-expressing a gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase Or it is the said recombinant vector (henceforth "recombinant vector A") used in the host cell which has the variation | mutation which reduced the expression of the chromosomal gene which codes aminoacyl-tRNA synthetase to the grade which a host cell cannot grow.

本発明の組換えベクターの一つの形態は、下記（ａ）〜（ｃ）の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクター（以下、「組換えベクターＢ」と呼ぶ）である：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子；および
（ｃ）前記（ｂ）の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子。 One form of the recombinant vector of the present invention is a recombinant vector having the following base sequences or genes (a) to (c) (hereinafter referred to as “recombinant vector B”):
(A) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of (a); and (c) directly downstream of the gene of (b) A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase linked to.

本発明の組換えベクターの一つの形態は、下記（ａ）〜（ｄ）の塩基配列または遺伝子を有し、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞において用いられる組換えベクター（以下、「組換えベクターＣ」と呼ぶ）である：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子；
（ｃ）前記（ｂ）の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子；および
（ｄ）発現可能な状態にあるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子。 One form of the recombinant vector of the present invention is a host cell or aminoacyl tRNA having a mutation in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl tRNA synthetase is deleted, having the following base sequences or genes (a) to (d): A recombinant vector (hereinafter referred to as “recombinant vector C”) used in a host cell having a mutation that reduces the expression of a chromosomal gene encoding a synthase to such an extent that the host cell cannot grow:
(A) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of (a);
(C) a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase directly linked downstream of the gene of (b); and (D) a gene encoding an aminoacyl tRNA synthetase in an expressible state.

本発明の組換えベクターＡおよびＣは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子をコードする遺伝子を発現可能な状態で含有する。該組換えベクターＡおよびＣは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子をコードする遺伝子を、所望の宿主細胞内で発現可能な状態で含んでおり、当該宿主細胞を形質転換するために使用される。   Recombinant vectors A and C of the present invention contain a gene encoding an aminoacyl tRNA synthetase gene in an expressible state. The recombinant vectors A and C contain a gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase gene in a state capable of being expressed in a desired host cell, and are used for transforming the host cell.

アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、２０種類のアミノ酸に対応するよう、２０数種類（一部は数種類ある）存在し、例えばアラニンに対するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素はアラニルｔＲＮＡ合成酵素（ａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅまたはａｌａｎｉｎｅ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）と呼ばれている。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、具体的には、例えば、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンｔＲＮＡ合成酵素、グルタメートｔＲＮＡ合成酵素、グリシンｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、リシンｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素、セリルｔＲＮＡ合成酵素、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素、またはバリルｔＲＮＡ合成酵素である。   There are 20 aminoacyl-tRNA synthetases corresponding to 20 types of amino acids, and there are 20 (some are several) aminoacyl-tRNA synthetases. For example, aminoacyl-tRNA synthetase for alanine is alanyl-tRNA synthetase or alanine-tRNA synthetase. is called. Specifically, aminoacyl tRNA synthetase is, for example, tryptophanyl tRNA synthetase, alanyl tRNA synthetase, arginyl tRNA synthetase, asparginyl tRNA synthetase, aspartyl tRNA synthetase, cysteinyl tRNA synthetase, glutamine tRNA synthetase, glutamate tRNA Synthase, glycine tRNA synthetase, histidyl tRNA synthetase, isoleucine tRNA synthetase, leucyl tRNA synthetase, lysine tRNA synthetase, methionyl tRNA synthetase, phenylalanine tRNA synthetase, prolyl tRNA synthetase, seryl tRNA synthetase, threonyl tRNA Synthase, tyrosyl-tRNA synthetase, or valyl-tRNA synthetase.

トリプトファンに対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素と呼び、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素が欠失している細胞株は、トリプトファンを含むタンパクの合成を行うことができないため増殖することができないことになる。   The aminoacyl-tRNA synthetase corresponding to tryptophan is called tryptophanyl-tRNA synthetase, and cell lines lacking tryptophanyl-tRNA synthetase will not be able to grow because they cannot synthesize proteins containing tryptophan. .

アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子は原核生物から真核生物に至るあらゆる生物に含まれる。例えば、枯草菌には、ａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号６）、ａｒｇｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号７）、ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号８）、ａｓｐａｒｔｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号９）、ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号１０）、ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号１１）、ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔＲＮＡ ａｍｉｄｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ, ｓｕｂｕｎｉｔ ａ（配列番号１２）、ｇｌｙｃｉｎｅ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ（配列番号１３）、ｇｌｙｃｉｎｅ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ（配列番号１４）、ｈｉｓｔｉｄｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ， ｈｉｓＳ（配列番号１５）、ｉｓｏｌｅｕｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号１６）、ｌｅｕｃｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号１７）、ｌｙｓｉｎｅ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ（配列番号１８）、ｈｉｓｔｉｄｙｌ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，ｈｉｓＺ（配列番号１９）、ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号２０）、ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ（配列番号２１）、ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ（配列番号２２）、ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ， ｙｔｐＲ （配列番号２３）、ｐｒｏｌｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号２４）、ｓｅｒｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ａｌｓｏ ｃｈａｒｇｅｓ ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｗｉｔｈ ｓｅｒｉｎｅ（配列番号２５）、ｔｈｒｅｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ， ｍａｊｏｒ（配列番号２６）、ｔｈｒｅｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ｍｉｎｏｒ（配列番号２７）、ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号２８）、ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ, ｍａｊｏｒ（配列番号２９）、ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ， ｍｉｎｏｒ （配列番号３０）、ｖａｌｙｌ−ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（配列番号３１）、ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔＲＮＡ ａｍｉｄｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ, ｓｕｂｕｎｉｔ ｂ（配列番号３２）、ｇｌｕｔａｍｙｌ−ｔＲＮＡ ａｍｉｄｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ｓｕｂｕｎｉｔ ｃ（配列番号３３）などが含まれることが知られている。   The aminoacyl tRNA synthetase gene is contained in all living organisms ranging from prokaryotes to eukaryotes. For example, Bacillus subtilis includes alanyl-tRNA synthetase (SEQ ID NO: 6), arginyl-tRNA synthetase (SEQ ID NO: 7), asparaginyl-tRNA synthetase (SEQ ID NO: 8), aspartyl-tRNA synthetase (SEQ ID NO: 9), synthetase (SEQ ID NO: 10), glutamyl-tRNA synthetase (SEQ ID NO: 11), glutamyl-tRNA amidotransferase, subunit a (SEQ ID NO: 12), glycine tRNA synthetase, alpha Number 14 , Histidyl tRNA synthetase, hisS (SEQ ID NO: 15), isoleucyl-tRNA synthetase (SEQ ID NO: 16), leucyl-tRNA synthetase (SEQ ID NO: 17), lysine tRNA synthetase, vRNA No. 19), methionyl-tRNA synthetase (SEQ ID NO: 20), phenylalanine tRNA synthetase, alpha subunit (SEQ ID NO: 21), phenylalanine tRNA synthetase, beta subunit (SEQ ID NO: 22) l-tRNA synthetase, ytpR (SEQ ID NO: 23), polyryl-tRNA synthetase (SEQ ID NO: 24), seryl-tRNA synthetase, also charge selenium sequence-tRNA sequence (25) ), Threnyl-tRNA synthetase, minor (SEQ ID NO: 27), tryptophanyl-tRNA synthetase (SEQ ID NO: 28), tyrosyl-tRNA synthetase, major (SEQ ID NO: 29), tyrosyl-tRNA sequence, 30 tRNA s Nthetase (SEQ ID NO: 31), glutamyl-tRNA amidotransferase, subunit b (SEQ ID NO: 32), glutamyl-tRNA amidotransferase, it is known that the like subunit c (SEQ ID NO: 33).

本発明の組換えベクターＡおよびＣは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有するものである。したがって、該組換えベクターＡおよびＣについては、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子以外に、この遺伝子を発現可能な状態とするために、宿主として枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌を使用する場合は、たとえば、プロモーター、オペレーター領域（プロモーター、オペレーターおよびリボゾーム結合領域（ＳＤ領域）を含む）、開始コドン、選択マーカー遺伝子、終止コドン、ターミネーター領域、及びプラスミド複製可能単位などを有する。 The recombinant vectors A and C of the present invention have a gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase in a state where it can be expressed. Therefore, for the recombinant vectors A and C, in addition to the aminoacyl tRNA synthetase gene, in order to make this gene expressible, when a bacterium such as Bacillus subtilis is used as a host, , Promoter, operator region (including promoter, operator and ribosome binding region (SD region)), start codon, selectable marker gene, stop codon, terminator region, and plasmid replicable unit.

選択マーカー遺伝子としては、特に制限されず、たとえば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、またはたとえばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、シクロヘキシミド、テトラマイシン、ネオマイシンもしくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。   The selectable marker gene is not particularly limited, for example, a gene whose complement is lacking in the host cell such as dihydrofolate reductase (DHFR) gene or Schizosaccharomyces pombe TPI gene, or ampicillin, kanamycin, Mention may be made of drug resistance genes such as tetracycline, chloramphenicol, cycloheximide, tetramycin, neomycin or hygromycin.

本発明の組換えベクターＡおよびＣは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞において用いられる。この宿主細胞については後述する。   Recombinant vectors A and C of the present invention reduce the expression of a host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding aminoacyl tRNA synthetase is deleted or a chromosomal gene encoding aminoacyl tRNA synthetase to the extent that the host cell cannot grow. Used in host cells having the mutations made. This host cell will be described later.

本発明の組換えベクターは、ベクターの種類は特に限定されず、例えば、宿主細胞内で自立的に複製することが可能なもの（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、本発明で用いるベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、またはレトロトランスポゾンである。   The type of the vector of the recombinant vector of the present invention is not particularly limited, and may be, for example, a vector capable of autonomously replicating in a host cell (for example, a plasmid) or introduced into a host cell. In some cases, it may be integrated into the genome of the host cell and replicated together with the integrated chromosome. Preferably, the vector used in the present invention is a plasmid, bacteriophage, or retrotransposon.

宿主細胞内で自立的に複製することが可能なベクターの具体例としては、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６、ＹＣｐ５０、ｐＡＵＲ１１２またはｐＡＵＲ１２３などのＹＣｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター；ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＡＵＲ１０１またはｐＡＵＲ１３５などのＹＩｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター；大腸菌由来のプラスミド（たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９６またはｐＴｒｃ９９ＡなどのＣｏｌＥ系プラスミド；ｐＡＣＹＣ１７７またはｐＡＣＹＣ１８４などのｐ１Ａ系プラスミド；ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８またはｐＭＷ２１９などのｐＳＣ１０１系プラスミドなど）；枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５など）；ｐＨＹ３００ＰＬＫなどの大腸菌−枯草菌シャトルベクターを挙げることができる。またファージベクターとして、λファージ（たとえば、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１００、ｇｔ１１、ｚａｐ）、ψＸ１７４、Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９などを挙げることができる。レトロトランスポゾンとしてはＴｙ因子などを挙げることができる。また、融合タンパク質として発現する発現ベクター、例えばｐＧＥＸシリーズ（ファルマシア製）、ｐＭＡＬシリーズ（Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使用することもできる。   Specific examples of vectors capable of autonomously replicating in host cells include YCp type E. coli-yeast shuttle vectors such as pRS413, pRS415, pRS416, YCp50, pAUR112 or pAUR123; pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pAUR101 Or YIp-type E. coli-yeast shuttle vector such as pAUR135; E. coli-derived plasmid (eg, ColYC17C such as pBR322, pBR325, pUC18, pUC19, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript, pHY298, pHSG396, pTc99A, or pTrc99A; P1A-type plasmids; pMW118, pMW119, pMW2 Such pSC101-based plasmids such as 8 or pMW219); Bacillus subtilis-derived plasmid (e.g. pUB110, etc. pTP5); E. coli, such as pHY300PLK - may be mentioned Bacillus subtilis shuttle vectors. Examples of the phage vector include λ phage (for example, Charon 4A, Charon 21A, EMBL4, λgt100, gt11, zap), ψX174, M13mp18, M13mp19, and the like. Examples of the retrotransposon include Ty factor. In addition, an expression vector expressed as a fusion protein, for example, pGEX series (manufactured by Pharmacia), pMAL series (manufactured by Biolabs) can also be used.

本発明の組換えベクターは、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する。   The recombinant vector of the present invention has a state capable of expressing a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase.

本明細書でいう「遺伝子を発現可能な状態」、または単に「発現可能な状態」とは、遺伝子の情報がｍＲＮＡに転写されるためのＲＮＡポリメラーゼ認識部位およびｍＲＮＡの情報が該遺伝子の発現産物であるタンパク質等に翻訳されるためのリボゾーム結合領域が該遺伝子の開始コドンの上流に存在する状態を意味する。要するに、該遺伝子の開始コドンから終止コドンまでをｍＲＮＡに転写されるために必要な配列が開始コドンより上流に存在し、さらにそのｍＲＮＡの情報がタンパク質等に翻訳されるための配列が開始コドンより上流に存在するということになる。ここでいう「開始コドン」とは本来染色体上における該遺伝子の開始コドン配列に限らず、開始コドンとして機能するコドンであればいずれでもよい。またここでいうリボゾーム結合領域とは、例えば原核生物の５´−ａａａｇｇａｇｇ−３´からなるコンセンサス配列を有する配列に集約されることなく、リボゾームが認識できる配列であれば良く、本来染色体上で該遺伝子のリボゾーム結合領域としての配列に限らず、リボゾームが認識できる配列であれば用いることができる。   As used herein, “a state in which a gene can be expressed” or simply “a state in which expression can be performed” means that an RNA polymerase recognition site for transferring gene information to mRNA and information on the mRNA are expression products of the gene This means that a ribosome binding region to be translated into a protein or the like is present upstream of the initiation codon of the gene. In short, the sequence necessary for transcription from the start codon to the stop codon of the gene into mRNA is present upstream from the start codon, and further, the sequence for translating the mRNA information into a protein or the like is from the start codon. It means that it exists upstream. The “start codon” here is not limited to the start codon sequence of the gene on the chromosome, but may be any codon that functions as a start codon. The ribosome-binding region herein may be any sequence that can be recognized by a ribosome without being aggregated into a sequence having a consensus sequence consisting of, for example, a prokaryotic 5′-aaaggggg-3 ′. Not only the sequence as a ribosome binding region of a gene, but also a sequence that can be recognized by a ribosome can be used.

本明細書でいう「γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子」とは、γ−シクロデキストリン合成酵素をコードする遺伝子、マルトースホスホリラーゼをコードする遺伝子、またはトレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子の単一物だけでなく、各遺伝子を組み合わせた複合物も含む。   As used herein, “a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase” refers to a gene encoding γ-cyclodextrin synthase, It includes not only a gene encoding maltose phosphorylase, or a single gene encoding trehalose phosphorylase, but also a complex combining each gene.

本発明の組換えベクターの構築は、ＤＮＡ組換えの一般的な方法、たとえば、Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Lab.)に記載される方法にしたがって行うことができる。   The recombinant vector of the present invention can be constructed according to a general method of DNA recombination, for example, a method described in Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Lab.).

本発明の組換えベクターＢおよびＣは、遺伝子調節領域として配列番号１に記載の塩基配列を有し、シグナルペプチド遺伝子として配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する。   The recombinant vectors B and C of the present invention have the base sequence described in SEQ ID NO: 1 as a gene regulatory region and the gene encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 as a signal peptide gene.

配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ断片は、たとえば、バチルス・エスピー ＪＡＭＢ７５０（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＪＡＭＢ７５０）株の染色体ＤＮＡにランダム変異を導入することにより取得することができる。配列番号１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ断片を取得するその他の方法としては、たとえば、配列番号１に記載の塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの通常知られる任意の方法で作製することができる。 A DNA fragment containing the base sequence described in SEQ ID NO: 1 can be obtained, for example, by introducing a random mutation into the chromosomal DNA of Bacillus sp. JAMB750 ( Bacillus sp. JAMB750) strain. Other methods for obtaining a DNA fragment containing the base sequence described in SEQ ID NO: 1 include, for example, chemical synthesis, genetic engineering techniques or mutagenesis based on the information of the base sequence described in SEQ ID NO: 1. It can be produced by any commonly known method.

本明細書にいう「シグナルペプチド」とは、シグナルペプチドをコードする塩基配列の下流に存在する遺伝子の遺伝子産物のアミノ末端に付加して、該遺伝子産物を細胞外に分泌しうるペプチドを意味する。また、「遺伝子産物を細胞外に分泌しうる」とは、上記した通り、シグナルペプチドが遺伝子産物である組換えタンパク質のアミノ末端側に付加し、組換えタンパク質の小胞体膜への付着および膜通過等を導き、最終的に細胞外に組換えタンパク質を分泌しうる作用を意味する。   The term “signal peptide” as used herein means a peptide that can be added to the amino terminus of a gene product of a gene existing downstream of the base sequence encoding the signal peptide and secrete the gene product outside the cell. . In addition, “the gene product can be secreted out of the cell” means that, as described above, a signal peptide is added to the amino terminal side of the recombinant protein that is the gene product, and the attachment of the recombinant protein to the endoplasmic reticulum membrane and the membrane It means an action that can lead to passage and the like and finally secrete the recombinant protein outside the cell.

本明細書にいう「配列番号１の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された」とは、配列番号１に記載の塩基配列の３´末端側に０〜１０００程度の塩基を介して連結されることを意味する。   As used herein, “directly or indirectly linked to the downstream of the base sequence of SEQ ID NO: 1” means that the base sequence of SEQ ID NO: 1 has a base of about 0 to 1000 on the 3 ′ end side. Means that they are connected.

シグナルペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片は、たとえば、配列番号２に記載の塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの通常知られる任意の方法で作製することができる。化学合成法としては、たとえば、ホスホアミダイト法を応用することにより自動合成しうる。なお、配列番号２に記載のシグナルペプチドは、バチルス属細菌の分泌するタンパク質群のアミノ末端側のアミノ酸配列情報から統計処理してデザインして得られた数十候補のアミノ酸配列から、組換えタンパク質生産性を評価し選択したものである。本配列は１〜数個のアミノ酸残基を付加、欠失または置換しても利用できる。   A DNA fragment containing a signal peptide gene can be prepared by any generally known method such as chemical synthesis, genetic engineering techniques or mutagenesis based on the information of the base sequence described in SEQ ID NO: 2, for example. . As a chemical synthesis method, for example, automatic synthesis can be performed by applying a phosphoramidite method. In addition, the signal peptide described in SEQ ID NO: 2 is derived from the amino acid sequences of dozens of candidates obtained by statistical processing from amino acid sequence information on the amino terminal side of a protein group secreted by Bacillus bacteria, Productivity was evaluated and selected. This sequence can be used by adding, deleting or substituting one to several amino acid residues.

本発明の組換えベクターＢおよびＣは、遺伝子調節領域およびその下流に直接的または間接的に連結されたシグナルペプチド遺伝子、ならびにその下流に直接的に連結されたγ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を含み、該組換えベクターを宿主細胞として枯草菌に導入し形質転換することにより、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の発現を促進し、さらに発現する酵素を菌体外に分泌しうる。   Recombinant vectors B and C of the present invention comprise a gene regulatory region and a signal peptide gene linked directly or indirectly downstream thereof, and a γ-cyclodextrin synthase directly linked downstream thereof, maltose phosphorylase And a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of trehalose phosphorylase, and introducing the recombinant vector into Bacillus subtilis as a host cell for transformation, thereby converting γ-cyclodextrin synthase, maltose The expression of at least one enzyme selected from the group consisting of phosphorylase and trehalose phosphorylase can be promoted, and the expressed enzyme can be secreted outside the cell.

本明細書にいう「配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子」とは、上記したシグナルペプチド遺伝子の３´末端側に連結されたγ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子である。   As used herein, “at least one selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase linked directly downstream of the gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 “A gene encoding a kind of enzyme” means at least one kind of enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase linked to the 3 ′ end of the signal peptide gene. Is a gene encoding

本明細書にいう「γ−シクロデキストリン合成酵素をコードする遺伝子」は、特に限定されるものではないが、好ましくは配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子である。配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子は、たとえば、特許文献１の記載に基いてバチルス・クラーキ ７３６４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｒｋｉｉ ７３６４）株から取得される。配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子を取得するその他の方法としては、配列番号３に記載の塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの通常知られる任意の方法で作製することができる。 The “gene encoding γ-cyclodextrin synthase” referred to in the present specification is not particularly limited, but is preferably a gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, for example, is obtained from Bacillus Kuraki 7364 based on the description of Patent Document 1 (Bacillus clarkii 7364) strain. Other methods for obtaining a gene comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 3 are generally known, such as chemical synthesis, genetic engineering techniques or mutagenesis, based on the information of the base sequence described in SEQ ID NO: 3. It can be produced by any method.

本明細書にいう「γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される１種の酵素の遺伝子が、前記遺伝子と９５％以上の相同性を有し、かつ、前記選択される酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子」とは、たとえば、γ−シクロデキストリン合成酵素をコードする遺伝子を選択した場合に、γ−シクロデキストリン合成酵素をコードする遺伝子に１〜数個の塩基の欠失、置換、逆位、付加および／または挿入を有し、該遺伝子と９５％以上の相同性があり、かつ、発現産物がγ−シクロデキストリン合成酵素活性を有する酵素である遺伝子を意味する。   As used herein, “a gene of one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase has 95% or more homology with the gene, and “A gene encoding a protein having the activity of the selected enzyme” means, for example, when a gene encoding γ-cyclodextrin synthase is selected, 1 to several genes encoding γ-cyclodextrin synthase. A gene having a base deletion, substitution, inversion, addition and / or insertion, having a homology of 95% or more with the gene and an expression product having an activity of γ-cyclodextrin synthase Means.

本明細書にいう「γ−シクロデキストリン合成酵素」は、糖類に作用し主生成物としてγ−シクロデキストリンを生成するシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ活性を有する酵素であればよく、好ましくは配列番号３に記載の遺伝子が発現して得られる酵素である。   The “γ-cyclodextrin synthase” referred to in the present specification may be any enzyme having cyclodextrin / glucanotransferase activity that acts on a saccharide and generates γ-cyclodextrin as a main product, and preferably SEQ ID NO: 3 An enzyme obtained by expressing the gene described in 1.

本明細書にいう「マルトースホスホリラーゼをコードする遺伝子」は、特に限定されるものではないが、好ましくは配列番号４に記載の塩基配列からなる遺伝子である。配列番号４に記載の塩基配列からなる遺伝子は、たとえば、特許文献２の記載に基づいてパエニバチルス・エスピー ＳＨ−５５（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＳＨ−５５）株から取得される。配列番号４に記載の塩基配列からなる遺伝子を取得するその他の方法としては、配列番号４に記載の塩基配列に記載の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの通常知られる任意の方法で作製することができる。 The “gene encoding maltose phosphorylase” referred to in the present specification is not particularly limited, but is preferably a gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4. The gene consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 4 is obtained from, for example, Paenibacillus sp. SH-55 ( Paenibacillus sp. SH-55) strain based on the description in Patent Document 2. Other methods for obtaining the gene consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 4 are usually based on the information described in the base sequence described in SEQ ID NO: 4, such as chemical synthesis, genetic engineering techniques or mutagenesis. It can be made by any known method.

本明細書にいう「マルトースホスホリラーゼ」は、マルトース中のα−１，４−グルコピラノシド結合を可逆的に加リン酸分解し、グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸を生成することができればよく、好ましくは、配列番号４に記載の遺伝子が発現して得られる酵素である。   The “maltose phosphorylase” referred to in the present specification is that if α-1,4-glucopyranoside bond in maltose can be reversibly phosphorylated to produce glucose and β-D-glucose-1-phosphate. The enzyme obtained by expressing the gene shown in SEQ ID NO: 4 is preferable.

本明細書にいう「トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子」は、特に限定されるものではないが、好ましくは配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子である。配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子は、たとえば、特許文献２の記載に基いてパエニバチルス・エスピー ＳＨ−５５株から取得される。配列番号５に記載の塩基配列からなる遺伝子を取得するその他の方法としては、配列番号５に記載の塩基配列に記載の塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの通常知られる任意の方法で作製することができる。   The “gene encoding trehalose phosphorylase” referred to in the present specification is not particularly limited, but is preferably a gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5. The gene consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 5 is obtained from, for example, Paenibacillus sp. SH-55 strain based on the description in Patent Document 2. Other methods for obtaining the gene consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 5 include chemical synthesis, genetic engineering techniques or mutagenesis based on the information of the base sequence described in SEQ ID NO: 5. It can be produced by any commonly known method.

本明細書にいう「トレハロースホスホリラーゼ」は、トレハロース中のα−１，１−グルコピラノシド結合を可逆的に加リン酸分解し、グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸を生成すればよく、好ましくは、配列番号５に記載の遺伝子が発現して得られる酵素である。   The “trehalose phosphorylase” referred to in the present specification only needs to reversibly phosphorylate the α-1,1-glucopyranoside bond in trehalose to produce glucose and β-D-glucose-1-phosphate, Preferably, it is an enzyme obtained by expressing the gene shown in SEQ ID NO: 5.

本発明の組換えベクターＣの具体例を、図１〜３として示す。   Specific examples of the recombinant vector C of the present invention are shown in FIGS.

（Ｂ）本発明の宿主細胞
本発明の宿主細胞の一つの形態は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞であって、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有し、かつアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターで形質転換して用いられる前記宿主細胞（以下、「宿主細胞Ａ」と呼ぶ）である。 (B) Host Cell of the Present Invention One form of the host cell of the present invention is a host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding aminoacyl tRNA synthetase is deleted or expression of a chromosomal gene encoding aminoacyl tRNA synthetase. A host cell having a mutation reduced to such an extent that the host cell cannot grow, expressing a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase The host cell (hereinafter referred to as “host cell A”) that is used after being transformed with a recombinant vector that is in a possible state and has a gene that encodes an aminoacyl-tRNA synthetase in an expressible state.

本発明の宿主細胞の一つの形態は、下記（ａ）〜（ｃ）の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクターで形質転換して用いられる宿主細胞（以下、「宿主細胞Ｂ」と呼ぶ）である：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子；および
（ｃ）前記（ｂ）の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子。 One form of the host cell of the present invention is a host cell (hereinafter referred to as “host cell B”) used by being transformed with a recombinant vector having the following base sequences or genes (a) to (c). is there:
(A) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of (a); and (c) directly downstream of the gene of (b) A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase linked to.

本発明の宿主細胞の一つの形態は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞であって、下記（ａ）〜（ｄ）の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクターで形質転換して用いられる前記宿主細胞（以下、「宿主細胞Ｃ」と呼ぶ）である：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子；
（ｃ）前記（ｂ）の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子；および
（ｄ）発現可能な状態にあるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子。 One form of the host cell of the present invention is a host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding aminoacyl-tRNA synthetase is deleted or the expression of a chromosomal gene encoding aminoacyl-tRNA synthetase is reduced to such an extent that the host cell cannot grow. A host cell having a mutation as described above, wherein the host cell is used after being transformed with a recombinant vector having the nucleotide sequences or genes of (a) to (d) below (hereinafter referred to as “host cell C”): Is:
(A) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of (a);
(C) a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase directly linked downstream of the gene of (b); and (D) a gene encoding an aminoacyl tRNA synthetase in an expressible state.

一般に、細胞は、自己の増殖のためにアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を有している。それに対して、本発明の宿主細胞ＡおよびＣでは、細胞が本来有している、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させるか、あるいはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させる。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損または該遺伝子発現の低下は、以下の方法で行うことができる。   In general, cells have a chromosomal gene that encodes an aminoacyl-tRNA synthetase for self growth. On the other hand, in the host cells A and C of the present invention, the chromosomal gene encoding the aminoacyl tRNA synthetase inherent in the cell is deleted, or the expression of the chromosomal gene encoding the aminoacyl tRNA synthetase is hosted. Reduce to a point where cells cannot grow. Deletion of a chromosomal gene encoding aminoacyl-tRNA synthetase or reduction of the gene expression can be performed by the following method.

[遺伝子欠損（不活性化）]
不活性化の語は染色体遺伝子のうち１以上の機能発現を妨げる方法を含んでいる。不活性化は核酸遺伝子配列における欠失、置換（例えば変異）、阻害、及び／または挿入などによって行われる。いくつかの実施態様において、変異微生物は好ましくは安定かつ不可逆的な不活性化を生じる１以上の遺伝子の不活性化を含む。 [Gene deficiency (inactivation)]
The term inactivation includes methods that prevent functional expression of one or more of the chromosomal genes. Inactivation is accomplished by deletion, substitution (eg, mutation), inhibition, and / or insertion in the nucleic acid gene sequence. In some embodiments, the mutant microorganism preferably comprises an inactivation of one or more genes that results in a stable and irreversible inactivation.

（挿入による不活性化）
ここで用いる“挿入配列”の語は微生物染色体内に導入されたＤＮＡ配列を言う。いくつかの実施態様において、挿入配列は形質転換される細胞のゲノム中に既に存在する、または存在しない配列であってもよい（すなわち、相同または異種配列である）。さらに別の実施態様において、挿入配列は選択マーカーを含むことがある。さらなる実施態様において、挿入配列は２つの相同ボックスを含むことがある。 (Inactivation by insertion)
As used herein, the term “insert sequence” refers to a DNA sequence that has been introduced into a microbial chromosome. In some embodiments, the inserted sequence may be a sequence that is already present or absent in the genome of the cell to be transformed (ie, is a homologous or heterologous sequence). In yet another embodiment, the insertion sequence may include a selectable marker. In a further embodiment, the insert sequence may contain two homology boxes.

ここで用いる“相同ボックス”とは微生物染色体の配列と相同な核酸配列をいう。より具体的には、相同ボックスは、本発明に従って不活性化される遺伝子に隣接するコード領域または遺伝子の一部と約８０〜１００％配列同一性、約９０〜１００％配列同一性または約９５％〜１００％配列同一性を有する上流または下流領域をいう。これらの配列は微生物染色体の一部が置換されることを目的とする。本発明を限定するものではないが、相同ボックスは約１塩基対（ｂｐ）〜２００キロ塩基（ｋｂ）を含む。好ましくは、相同ボックスは約１ｂｐ〜１０．０ｋｂ；１ｂｐ〜５．０ｋｂ；１ｂｐ〜２．５ｋｂ；１ｂｐ〜１．０ｋｂ及び０．２５ｋｂ〜２．５ｋｂを含む。また、相同ボックスは約１０．０ｋｂ、５．０ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂ、１．５ｋｂ、１．０ｋｂ、０．５ｋｂ、０．２５ｋｂ及び０．１ｋｂを含む。いくつかの実施態様において、選択マーカーの５’及び３’末端は相同ボックスに隣接し、ここで相同ボックスは当該遺伝子のコード領域にすぐ隣接した核酸配列を含む。   As used herein, “homology box” refers to a nucleic acid sequence that is homologous to the sequence of a microbial chromosome. More specifically, the homology box is about 80-100% sequence identity, about 90-100% sequence identity or about 95 with the coding region or portion of the gene adjacent to the gene that is inactivated according to the present invention. Refers to upstream or downstream regions with% to 100% sequence identity. These sequences are intended to replace part of the microbial chromosome. While not limiting the present invention, the homology box comprises from about 1 base pair (bp) to 200 kilobases (kb). Preferably, the homology box comprises about 1 bp to 10.0 kb; 1 bp to 5.0 kb; 1 bp to 2.5 kb; 1 bp to 1.0 kb and 0.25 kb to 2.5 kb. The homology box includes about 10.0 kb, 5.0 kb, 2.5 kb, 2.0 kb, 1.5 kb, 1.0 kb, 0.5 kb, 0.25 kb and 0.1 kb. In some embodiments, the 5 'and 3' ends of the selectable marker are flanked by homology boxes, where the homology box comprises a nucleic acid sequence immediately adjacent to the coding region of the gene.

ここで用いる“選択マーカー”の語は宿主細胞において発現できるヌクレオチド配列をいい、選択マーカーの発現により対応する選択因子の存在下、または必須栄養素の不存在下で発現遺伝子を含む細胞は成長できるようになる。ここで用いる“選択可能マーカー”及び“選択マーカー”の語は宿主細胞中で発現できる核酸（例えば遺伝子）を言い、ベクターを含むこれら宿主の選択が簡単にできるようにする。当該選択マーカーの例としては、限定されないが、抗微生物剤などがある。従って、“選択マーカー”とは、宿主細胞が目的の挿入ＤＮＡを取り込んだ、またはその他の反応が起こった印を与える遺伝子をいう。通常、選択マーカーは、形質転換時に外来配列を受け取らなかった細胞と外来ＤＮＡを含む細胞との区別を可能にするために宿主細胞に抗菌耐性または代謝利点を与える遺伝子をいう。選択マーカーは抗微生物耐性マーカーなどが挙げられる（例えば、ａｍｐＲ；ｐｈｌｅｏＲ；ｓｐｅｃＲ；ｋａｎＲ；ｅｒｙＲ；ｔｅｔＲ；ｃｍｐＲ；及びｎｅｏＲ；例えばＧｕｅｒｏｔ−Ｆｌｅｕｒｙ，Ｇｅｎｅ，１６７：３３５−３３７［１９９５］；Ｐａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ ２４７：２５５−２６４［２０００］；及びＴｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、２３：３３１₋３４１［１９８３］を参照）。いくつかの特に好ましい実施態様において、本発明はクロラムフェニコール耐性遺伝子を提供する（例えば、ｐＣ１９４上に存在する遺伝子、及びバチルス・リケニフォルミスゲノム中に存在する耐性遺伝子）。この耐性遺伝子は本発明及び染色体上統合されたカセット及び統合プラスミドの染色体増幅に関する実施態様において特に有用である。 As used herein, the term “selectable marker” refers to a nucleotide sequence that can be expressed in a host cell, so that expression of the selectable marker allows cells containing the expressed gene to grow in the presence of the corresponding selection factor or in the absence of essential nutrients. become. As used herein, the terms “selectable marker” and “selectable marker” refer to a nucleic acid (eg, a gene) that can be expressed in a host cell to facilitate selection of these hosts, including vectors. Examples of the selection marker include, but are not limited to, antimicrobial agents. Thus, a “selectable marker” refers to a gene that gives an indication that a host cell has taken up the desired insert DNA or that some other reaction has occurred. Typically, a selectable marker refers to a gene that confers antibacterial resistance or metabolic benefits to a host cell to allow differentiation between cells that did not receive the foreign sequence upon transformation and cells that contain foreign DNA. Selectable markers include antimicrobial resistance markers (eg, ampR; phleR; specR; kanR; eryR; tetR; cmpR; and neoR; eg Guerot-Fleury, Gene, 167: 335-337 [1995]; Palmeros et al. ., Gene 247: 255-264 [2000 ]; and _{Trieu-Cuot et al, Gene,} 23: 331 - see 341 [1983]).. In some particularly preferred embodiments, the present invention provides chloramphenicol resistance genes (eg, genes present on pC194 and resistance genes present in the Bacillus licheniformis genome). This resistance gene is particularly useful in the present invention and embodiments relating to chromosomal amplification of chromosomally integrated cassettes and integrated plasmids.

例えば、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子（ｔｒｐＳ）が不活性化される遺伝子である場合、ＤＮＡ構築体は選択マーカーを挿入配列として含みその活性を阻害されるｔｒｐＳ遺伝子を有する。選択マーカーはｔｒｐＳコード配列部分の内側に挿入する。ＤＮＡ構築体は宿主染色体中のｔｒｐＳ遺伝子に本質的に同一配列を有し、二重交差の場合、ｔｒｐＳ遺伝子は選択マーカーの挿入により不活性化される。   For example, when the tryptophanyl tRNA synthetase gene (trpS) is an inactivated gene, the DNA construct has a trpS gene containing a selectable marker as an insertion sequence and inhibiting its activity. A selectable marker is inserted inside the trpS coding sequence portion. The DNA construct has essentially the same sequence as the trpS gene in the host chromosome, and in the case of a double crossover, the trpS gene is inactivated by insertion of a selectable marker.

（欠失による不活性化）
いくつかの好ましい実施態様において、不活性化は欠失により達成される。いくつかの好ましい実施態様において、遺伝子は相同組換えにより欠失する。例えば、いくつかの実施態様において、欠失する遺伝子がｔｒｐＳの場合、相同ボックスの両側に隣接する選択マーカーを有する挿入配列を含むＤＮＡ構築体を用いる。相同ボックスは染色体ｔｒｐＳ遺伝子の核酸フランキング領域に相同なヌクレオチド配列を含む。ＤＮＡ構築体は微生物宿主染色体の相同配列と一致し、二重交差の場合、ｔｒｐＳ遺伝子は宿主染色体から切除される。 (Inactivation by deletion)
In some preferred embodiments, inactivation is achieved by deletion. In some preferred embodiments, the gene is deleted by homologous recombination. For example, in some embodiments, if the gene to be deleted is trpS, a DNA construct is used that includes an insertion sequence with a selectable marker flanking both sides of the homology box. The homology box contains a nucleotide sequence that is homologous to the nucleic acid flanking region of the chromosomal trpS gene. The DNA construct matches the homologous sequence of the microbial host chromosome, and in the case of a double crossover, the trpS gene is excised from the host chromosome.

ここで用いる遺伝子の“欠失”の語は、コード配列全体の欠失、コード配列の一部の欠失、またはフランキング領域を含むコード配列の欠失をいう。欠失は染色体に残った配列が欠失前の生物活性を発揮しないのであれば部分的であってもよい。コード配列のフランキング領域は約１ｂｐ〜約５００ｂｐを５´及び３´末端に含むことができる。フランキング領域は５００ｂｐよりも大きくてもよいが、好ましくは本発明に従って不活性化または欠失され得るその他の遺伝子を当該領域に含まない。最終的には、欠失遺伝子は事実上、非機能的である。簡単に言えば、“欠失”の語は１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基がそれぞれ除去された（すなわち、存在しない）、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化として定義される。   As used herein, the term “deletion” of a gene refers to a deletion of the entire coding sequence, a portion of the coding sequence, or a deletion of the coding sequence that includes the flanking region. Deletion may be partial as long as the sequence remaining in the chromosome does not exert biological activity prior to deletion. The flanking region of the coding sequence can include about 1 bp to about 500 bp at the 5 ′ and 3 ′ ends. The flanking region may be larger than 500 bp, but preferably does not include other genes that can be inactivated or deleted according to the present invention. Ultimately, the deleted gene is virtually non-functional. Briefly, the term “deletion” is defined as a change in nucleotide or amino acid sequence in which one or more nucleotides or amino acid residues have been removed (ie, absent), respectively.

ここで用いる“フランキング配列”とは対象の配列の上流または下流にある配列をいう（例えば、遺伝子Ａ−Ｂ−Ｃは、遺伝子ＢはＡ及びＣ遺伝子配列にフランキング（側面に位置）している）。好ましい実施態様において、挿入配列は相同ボックスの両側の側面に位置する。いくつかの実施態様において、フランキング配列は一方の側（３´または５´）にのみ存在するが、好ましい実施態様において、配列の両側の側面に位置する。各相同ボックスの配列は微生物染色体中の配列に相同である。これらの配列は微生物染色体に新しい構築体が統合されること、及び微生物染色体の一部が挿入配列により置換されることを目的とする。好ましい実施態様において、選択マーカーの５´及び３´末端は不活性化染色体断片の一部を含むポリヌクレオチド配列の側面に位置する。   As used herein, “flanking sequence” refers to a sequence upstream or downstream of a target sequence (for example, gene ABC is flanked (positioned laterally) by gene B in the A and C gene sequences. ing). In a preferred embodiment, the insert sequence is located on both sides of the homology box. In some embodiments, the flanking sequence is present only on one side (3 ′ or 5 ′), but in preferred embodiments it is located on the sides on either side of the sequence. The sequence in each homology box is homologous to the sequence in the microbial chromosome. These sequences are intended to integrate the new construct into the microbial chromosome and to replace part of the microbial chromosome with the inserted sequence. In a preferred embodiment, the 5 'and 3' ends of the selectable marker are located on the side of the polynucleotide sequence that includes a portion of the inactivated chromosomal fragment.

（変異による不活性化）
別の実施態様において、不活性化は遺伝子の変異により生じる。遺伝子を変異する方法はさまざまな方法があり、限定されないが、部位特異的変異、ランダム変異発生、及びｇａｐｐｅｄ−ｄｕｐｌｅｘ法が挙げられる（例えばＭｏｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈ．２：６４６［１９８４］；及びＫｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：９４４１［１９８４］を参照）。 (Inactivation by mutation)
In another embodiment, the inactivation is caused by a genetic mutation. There are a variety of methods for mutating genes, including but not limited to site-directed mutagenesis, random mutagenesis, and the gaped-duplex method (eg Moring et al., Biotech. 2: 646 [1984]; and Kramer et al., Nucleic Acids Res., 12: 9441 [1984]).

好ましい実施態様において、変異は少なくとも染色体上の１つのコドンにおいて突然変異誘発を用いて生じる。さらなる実施態様において、変異ＤＮＡ配列は野生型配列と４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上または９８％以上の相同性を有する。別の実施態様において、変異ＤＮＡは公知の変異誘発手順、例えば、ＵＶ照射、ニトロソグアニジン等の化学変異剤を用いてｉｎ ｖｉｖｏで生じる。   In a preferred embodiment, the mutation occurs using mutagenesis at least at one codon on the chromosome. In a further embodiment, the mutant DNA sequence is 40% or more, 45% or more, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85 with the wild type sequence. % Or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more homology. In another embodiment, the mutant DNA is generated in vivo using known mutagenesis procedures, eg, chemical mutagens such as UV irradiation, nitrosoguanidine.

アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素活性に欠損を生じさせる染色体変異の内でも、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子自体の欠損を用いることが望ましい。しかしアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素生合成を調節する他の遺伝子も、対応する遺伝子を保有する染色体外遺伝子を用いる限り使用できる。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子の欠損株の場合、染色体外遺伝子に挿入されるべき遺伝子は該当するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子が相応しい。   Among chromosomal mutations that cause a defect in aminoacyl tRNA synthetase activity, it is desirable to use a defect in the aminoacyl tRNA synthetase gene itself. However, other genes that regulate aminoacyl-tRNA synthetase biosynthesis can also be used as long as the extrachromosomal gene carrying the corresponding gene is used. In the case of a strain lacking the aminoacyl tRNA synthetase gene, the corresponding aminoacyl tRNA synthetase gene is suitable as the gene to be inserted into the extrachromosomal gene.

アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を有する染色体外遺伝子と染色体の変異されたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子との間の相同性組換えの可能性を回避するためには、目的のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を染色体から実質的に欠失させることが望ましい。   In order to avoid the possibility of homologous recombination between an extrachromosomal gene having an aminoacyl-tRNA synthetase and a mutated aminoacyl-tRNA synthetase gene, the target aminoacyl-tRNA synthetase gene is substantially removed from the chromosome. It is desirable to be deleted.

本発明の宿主細胞Ａを形質転換する際に用いられる組換えベクターは、上記した本発明の組換えベクターＡと同様のものである。一方、本発明の宿主細胞Ｃを形質転換する際に用いられる組換えベクターは、上記した本発明の組換えベクターＣと同様のものである。   The recombinant vector used when transforming the host cell A of the present invention is the same as the above-described recombinant vector A of the present invention. On the other hand, the recombinant vector used when transforming the host cell C of the present invention is the same as the above-described recombinant vector C of the present invention.

アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子が発現できない、あるいは発現量が不十分であるため、そのままではもはや増殖できない。   A host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is deleted or a host cell having a mutation in which the expression of a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is reduced to the extent that the host cell cannot grow is an aminoacyl-tRNA Since the chromosomal gene encoding the synthase cannot be expressed or the expression level is insufficient, it can no longer grow as it is.

それに対して、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクター（本発明の組換えベクターＡまたはＣ）を含むことで、増殖を維持できる。即ち、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の欠失は、染色体外遺伝子上に該アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を導入することにより相補することができる。しかし、もしも細胞が該染色体外遺伝子を失うと、該細胞はもはや増殖できなくなる。   In contrast, growth can be maintained by including a recombinant vector (recombinant vector A or C of the present invention) having a gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase in an expressible state. That is, the deletion of aminoacyl tRNA synthetase can be complemented by introducing the aminoacyl tRNA synthetase gene onto an extrachromosomal gene. However, if a cell loses the extrachromosomal gene, it can no longer grow.

したがって、本発明の宿主細胞ＡまたはＣは、上記関係の下に、培地に抗生物質や特定の栄養要求性を満たす栄養分を含めることなく組換えベクターＡまたはＣを安定して宿主細胞に維持することができる。そのため、本発明の宿主細胞ＡまたはＣは、工業的スケールの生産に使用される任意の培地に適用できるという利点を有する。   Therefore, the host cell A or C of the present invention stably maintains the recombinant vector A or C in the host cell without including antibiotics or nutrients satisfying specific auxotrophy in the medium under the above relationship. be able to. Therefore, the host cell A or C of the present invention has the advantage that it can be applied to any medium used for industrial scale production.

さらに、本発明の宿主細胞ＡおよびＣは、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現させるために用いられる。本発明の宿主細胞Ａは、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子およびγ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターを含むものであり、該組換えベクターを安定して宿主細胞に維持することができる。そして、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現させて、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素の生産に用いることができる。   Furthermore, the host cells A and C of the present invention are used to express a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. The host cell A of the present invention can express a gene encoding the aminoacyl-tRNA synthetase and a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase A recombinant vector having a stable state, and the recombinant vector can be stably maintained in a host cell. Then, by expressing a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, from γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase It can be used for the production of at least one enzyme selected from the group consisting of

本発明の宿主細胞Ｂは、本発明の組換えベクターＢを導入し形質転換して用いられる宿主細胞であり、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現させるために用いられる。   The host cell B of the present invention is a host cell used by introducing the recombinant vector B of the present invention and transformed, and is at least selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. Used to express a gene encoding one enzyme.

本発明の宿主細胞は細菌であればよく、好ましいのは枯草菌であり、さらに好ましくは枯草菌のＩＳＷ１２１４株、ＢＤ１７０株、または１６８株等である。しかし、本発明の組換えベクターを安定に保持し、複製することができるものであれば、枯草菌以外のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌などを使用してもよい。 The host cell of the present invention may be a bacterium, preferably Bacillus subtilis, more preferably Bacillus subtilis ISW1214 strain, BD170 strain, or 168 strain. However, bacteria that belong to the genus Bacillus other than Bacillus subtilis may be used as long as they can stably retain and replicate the recombinant vector of the present invention.

本明細書でいう「バチルス属」とは、通常知られるバチルス属に含まれるすべての種類を含み限定されないが、たとえば、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ)、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ)、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ)、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ)、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ)、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ)、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ)、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ)、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ)などを意味する。なお、バチルス属は分類上再編成を受け続けており、当該属は再分類された種も含むものとする。たとえば、ジオバチルス(Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ)属、アルカリバチルス（Ａｌｋａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属 、アミロバチルス（Ａｍｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）属 、ゴリバチルス（Ｇｏｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、セラシバチルス（Ｃｅｒａｓｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ハロバチルス（Ｈａｌｏｌａｃｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ハロアルカリバチルス（Ｈａｌａｌｋａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ジョーガリバチルス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、オーシャノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、マリニバチルス（Ｍａｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リシニバチルス（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、レンチバチルス（Ｌｅｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ウレーバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サリニバチルス（Ｓａｌｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ポンチバチルス（Ｐｏｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ピシバチルス（Ｐｉｓｃｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パラリオバチルス（Ｐａｒａｌｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ヴァージバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サルシューギニバチルス(Ｓａｌｓｕｇｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ)属、テニューイバチルス(Ｔｅｎｕｉｂａｃｉｌｌｕｓ)属、タラソバチルス(Ｔｈａｌａｓｓｏｂａｃｉｌｌｕｓ)属、サームアルカリバチルス(Ｔｈｅｒｍａｌｋａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ)属、チューメバチルス(Ｔｕｍｅｂａｃｉｌｌｕｓ)属などがあり、これらもまた本明細書にいうバチルス属に含まれるものとする。 As used herein, “genus Bacillus” includes, but is not limited to, all kinds of commonly known genera of Bacillus, such as Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis , Bacillus lentus. (Bacillus lentus), Bacillus stearothermophilus (Bacillus stearothermophilus), Bacillus alkalophilus (Bacillus alkalophilus), Bacillus amyloliquefaciens (Bacillus amyloliquefaciens), Bacillus cereus (Bacillus cereus), Bacillus pumilus (Bacillus pumilus ), Bacil Scan clausii (Bacillus clausii), Bacillus halodurans (Bacillus halodurans), Bacillus megaterium (Bacillus megaterium), Bacillus coagulans (Bacillus coagulans), Bacillus circulans (Bacillus circulans), and Bacillus thuringiensis (Bacillus thuringiensis ) Etc. The genus Bacillus continues to undergo reorganization for classification, and the genus also includes reclassified species. For example, Geobacillus (Geobacillus) genus, alkaline Bacillus (Alkalibacillus) genus amphiphiles Bacillus (Amphibacillus) genus Amirobachirusu (Amylobacillus) genus, Ano carboxymethyl Bacillus (Anoxybacillus) genus Goribachirusu (Goribacillus) genus Serashibachirusu (Cerasibacillus) genus, Gras Shiribachirusu (Gracilibacillus) genus, Harobachirusu (Halolactibacillus) genus, halo alkaline Bacillus (Halalkalibacillus) genus, Philo Bacillus (Filobacillus) genus, Joe Galli Bacillus (Jeotgalibacillus) genus, Saribachirusu (Salibaci lus) genus, O Shah Roh Bacillus (Oceanobacillus) genus, Marinibachirusu (Marinibacillus) genus, Rishinibachirusu (Lysinibacillus) genus, wrench Bacillus (Lentibacillus) genus, Urebachirusu (Ureibacillus) genus, Sarinibachirusu (Salinibacillus) genus, punch Bacillus (Pontibacillus) genus, Pishibachirusu (Piscibacillus) genus, para Rio Bacillus (Paraliobacillus) genus, Vernon di Bacillus (Virgibacillus) genus, the monkey shoe Guinea Bacillus (Salsuginibacillus) genus, Te Newey Bacillus (Tenuibacillus) genus, Thalasso Bacillus (Thalass bacillus) genus Therm alkaline Bacillus (Thermalkalibacillus) genus include Chu main Bacillus (Tumebacillus) genus, it is assumed that they are also included in the genus Bacillus in the present specification.

本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入する方法はとくに限定されないが、たとえば、コンピテントセル法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、カルシウムイオン法、リポフェクション法等を用いることができる。宿主細胞が枯草菌である場合は、コンピテントセル法またはプロトプラスト法が好ましい。   A method for introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell is not particularly limited. For example, a competent cell method, a protoplast method, an electroporation method, a calcium ion method, a lipofection method and the like can be used. When the host cell is Bacillus subtilis, the competent cell method or the protoplast method is preferred.

（Ｃ）γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する方法。 (C) A method for producing at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase.

本発明のγ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する方法の一つの態様は、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を有する方法（以下、「酵素生産方法Ａ」と呼ぶ）である：
（ｉ）γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有し、さらにアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターを用意する工程；
（ｉｉ）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異宿主細胞を用意する工程；
（ｉｉｉ）前記変異宿主細胞を前記組換えベクターで形質転換して形質転換体を得る工程；および
（ｉｖ）前記形質転換体を培養して、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する工程。 One aspect of the method for producing at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase of the present invention includes the following steps (i) to (iv): Method (hereinafter referred to as “enzyme production method A”):
(I) a gene capable of expressing a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, and further encoding an aminoacyl-tRNA synthetase Preparing a recombinant vector having a state capable of expressing the gene;
(Ii) providing a mutant host cell in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is deleted or a mutant host cell in which the expression of a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is reduced to such an extent that the host cell cannot grow;
(Iii) transforming the mutant host cell with the recombinant vector to obtain a transformant; and (iv) culturing the transformant to produce γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. Producing at least one enzyme selected from the group consisting of:

本発明のγ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する方法の一つの態様は、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を有する方法（以下、「酵素生産方法Ｂ」と呼ぶ）である：
（ｉ）下記［ａ］〜［ｃ］の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクターを用意する工程、
［ａ］配列番号１に記載の塩基配列、
［ｂ］前記［ａ］の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、および
［ｃ］前記［ｂ］の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子；
（ｉｉ）前記組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を得る工程；および
（ｉｉｉ）前記形質転換体を培養して、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する工程。 One aspect of the method for producing at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase of the present invention includes the following steps (i) to (iii): Method (hereinafter referred to as “enzyme production method B”):
(I) a step of preparing a recombinant vector having the following base sequences or genes [a] to [c];
[A] the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
[B] a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of [a], and [c] directly downstream of the gene of [b] A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase linked to
(Ii) transforming a host cell with the recombinant vector to obtain a transformant; and (iii) culturing the transformant to comprise γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. Producing at least one enzyme selected from the group.

本発明のγ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する方法の一つの態様は、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を有する方法（以下、「酵素生産方法Ｃ」と呼ぶ）である：
（ｉ）下記［ａ］〜［ｄ］の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクターを用意する工程、
［ａ］配列番号１に記載の塩基配列、
［ｂ］前記［ａ］の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
［ｃ］前記［ｂ］の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子、および
［ｄ］発現可能な状態にあるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子；
（ｉｉ）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞を用意する工程；
（ｉｉｉ）前記宿主細胞を前記組換えベクターで形質転換して形質転換体を得る工程；および
（ｉｖ）前記形質転換体を培養して、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する工程。 One aspect of the method for producing at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase of the present invention includes the following steps (i) to (iv): Method (hereinafter referred to as “enzyme production method C”):
(I) a step of preparing a recombinant vector having the following base sequences or genes [a] to [d],
[A] the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
[B] a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 directly or indirectly linked downstream of the base sequence of [a],
[C] a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, directly linked downstream of the gene of [b], and [D] a gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase in an expressible state;
(Ii) a host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is deleted or a host cell having a mutation in which the expression of a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is reduced to such an extent that the host cell cannot grow Preparing step;
(Iii) transforming the host cell with the recombinant vector to obtain a transformant; and (iv) culturing the transformant to produce γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. Producing at least one enzyme selected from the group consisting of:

酵素生産方法Ａにおける組換えベクターを用意する工程では、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で挿入し、かつ、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で挿入した組換えベクターを用意する。さらに、酵素生産方法Ｃにおける組換えベクターを用意する工程では、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で挿入し、かつ、配列番号１に記載の塩基配列、その塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子およびその遺伝子の下流に直接的に連結されたγ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を挿入した組換えベクターを用意する。上記組換えベクターは、先に説明した本願発明の組換えベクターＡまたはＣである。一方、酵素生産方法Ｂにおける組換えベクターを用意する工程では、配列番号１に記載の塩基配列、その塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子およびその遺伝子の下流に直接的に連結されたγ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を挿入した組換えベクターを用意する。   In the step of preparing a recombinant vector in the enzyme production method A, a gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is inserted in an expressible state, and from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase A recombinant vector into which a gene encoding at least one selected enzyme is inserted is prepared. Furthermore, in the step of preparing a recombinant vector in enzyme production method C, a gene encoding an aminoacyl tRNA synthetase is inserted in an expressible state, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is located downstream of the base sequence. From the group consisting of a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly and γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase linked directly downstream of the gene A recombinant vector into which a gene encoding at least one selected enzyme is inserted is prepared. The recombinant vector is the above-described recombinant vector A or C of the present invention. On the other hand, in the step of preparing a recombinant vector in enzyme production method B, the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence are encoded. A recombinant vector in which a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of a gene to be ligated and γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase linked directly downstream of the gene is inserted prepare.

遺伝子の挿入は常法によって行うことができ、たとえば、Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Lab.)に記載される方法に従って行うことができる。いずれの遺伝子も発現可能な状態で挿入する。そのため、各々の遺伝子の組換えベクターへの挿入位置は組換えベクターの複製に関与していない場所であれば基本的にはどこでも良く、使用するベクターによって挿入位置は異なる。使用できる組換えベクターは上記に挙げた通りであり、たとえば、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５など）；ｐＨＹ３００ＰＬＫなどの大腸菌−枯草菌シャトルベクターを挙げることができる。   The gene can be inserted by a conventional method, for example, according to the method described in Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Lab.). Either gene is inserted in an expressible state. Therefore, the insertion position of each gene into the recombinant vector may be basically anywhere as long as it is not involved in the replication of the recombinant vector, and the insertion position differs depending on the vector used. Recombinant vectors that can be used are as described above, and examples include plasmids derived from Bacillus subtilis (for example, pUB110 and pTP5); and Escherichia coli-Bacillus subtilis shuttle vectors such as pHY300PLK.

例えば大腸菌−枯草菌のシャトルベクターであるｐＨＹ３００ＰＬＫプラスミドを例に取れば、マルチクローニング部位であるＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ間に配列番号１のＤＮＡ断片と配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を連結させたＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ部位にアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を、同じくマルチクローニング部位ＢａｍＨＩ部位にγ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を挿入することなどが可能である。以下に、本発明の組換えベクターＣを用意する工程を簡単に説明する。 For example, in the case of the pHY300PLK plasmid, which is an E. coli-B. Subtilis shuttle vector, the DNA fragment of SEQ ID NO: 1 and the DNA fragment encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are ligated between Eco RI- Bam HI, which is a multiple cloning site. at least one enzyme selected DNA fragments were, the aminoacyl-tRNA synthetase gene into Eco RI site, also γ- cyclodextrin synthetase into the multiple cloning site Bam HI site from the group consisting of maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase, It is possible to insert a gene coding for. Below, the process of preparing the recombinant vector C of this invention is demonstrated easily.

配列番号１のＤＮＡ断片と配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を連結させたＤＮＡ断片をｐＨＹ３００ＰＬＫのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ間に挿入したプラスミドを構築する。次に、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を有する生物の染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲ増幅を用いて該酵素の活性や安定性に欠かせない領域をコードするＤＮＡ断片を増幅し、これを上記した構築済みプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化することによって得られたＤＮＡ 断片とライゲーション反応を行い、得られたライゲーション反応混合物を用いて大腸菌を形質転換してｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ部位に目的の通りプロモーター部位から終止コドンまでを含む該遺伝子が挿入されているプラスミドを含む形質転換体を選択し、この形質転換体からプラスミドを調製する。続いて上記の通り調製できたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、本プラスミドを切断する。枯草菌１６８（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８）株の染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲ増幅を用いてプロモーター部位から終止コドンまでを含むアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を増幅し、ＥｃｏＲＩで切断された構築済みプラスミド由来ＤＮＡ断片とライゲーション反応を行い、得られたライゲーション反応混合物を用いて大腸菌を形質転換して構築済みプラスミドのＥｃｏＲＩ部位に目的の通りアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子が挿入されているプラスミドを含む形質転換体を選択し、この形質転換体から目的プラスミドを調製することができる。 A plasmid is constructed in which a DNA fragment obtained by ligating the DNA fragment of SEQ ID NO: 1 and the DNA fragment encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is inserted between Eco RI- Bam HI of pHY300PLK. Next, the activity of the enzyme using PCR amplification with a chromosomal DNA of an organism having a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase as a template And ligation reaction with the DNA fragment obtained by amplifying a DNA fragment encoding a region indispensable for stability and digesting the constructed plasmid with the restriction enzyme Bam HI, and the resulting ligation reaction Using the mixture, E. coli is transformed to select a transformant containing a plasmid in which the gene containing the promoter site to the stop codon as desired is inserted into the Bam HI site of pHY300PLK. From this transformant, a plasmid is selected. To prepare. Subsequently, the plasmid prepared as described above is digested with the restriction enzyme Eco RI to cleave this plasmid. An aminoacyl-tRNA synthetase gene containing from the promoter site to the stop codon was amplified by PCR amplification using the chromosomal DNA of Bacillus subtilis 168 as a template, and a DNA fragment derived from the constructed plasmid cleaved with Eco RI. Perform a ligation reaction, transform E. coli using the resulting ligation reaction mixture, and select a transformant containing a plasmid in which the aminoacyl-tRNA synthetase gene is inserted as desired at the Eco RI site of the constructed plasmid. From this transformant, the target plasmid can be prepared.

酵素生産方法ＡおよびＣにおける宿主細胞を用意する工程では、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞を用意する。この宿主細胞は、前記で説明した本発明の宿主細胞ＡまたはＣである。その調製方法は、以下のとおりである。   In the step of preparing a host cell in enzyme production methods A and C, the host cell grows to express a host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding aminoacyl tRNA synthetase is deleted or a chromosomal gene encoding aminoacyl tRNA synthetase. A host cell having a mutation reduced to an extent that cannot be reduced is prepared. This host cell is the host cell A or C of the present invention described above. The preparation method is as follows.

宿主細胞の調製の手順としては、宿主染色体上に存在する標的遺伝子を計画的に削除又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の削除又は不活性化変異を与え、その後適当な方法により遺伝子解析またはタンパク質生産性の評価を行う方法が挙げられる。   As a procedure for preparing a host cell, in addition to a method that systematically deletes or inactivates a target gene present on a host chromosome, random gene deletion or inactivation mutation is given, and then the gene is obtained by an appropriate method. Examples include analysis or evaluation of protein productivity.

標的とする遺伝子を削除又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドまたは直鎖上のＤＮＡ断片を宿主細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。あるいは、塩基置換や塩基挿入等による不活性化変異を導入した標的遺伝子、又は標的遺伝子の外側領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側２ヶ所、又は標的遺伝子外側の２ヶ所の領域で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を削除或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。   In order to delete or inactivate the target gene, for example, a method by homologous recombination may be used. In other words, a circular recombinant plasmid obtained by cloning a DNA fragment containing a part of the target gene into an appropriate plasmid vector or a linear DNA fragment is taken into the host cell, and in a partial region of the target gene. It is possible to disrupt and inactivate the target gene on the parental microbial genome by homologous recombination. Alternatively, a target gene into which an inactivating mutation due to base substitution or base insertion has been introduced, or a linear DNA fragment containing an outer region of the target gene but not including the target gene is constructed by a method such as PCR. Is introduced into the parental microbial cell, and homologous recombination is performed twice in the two regions outside the mutation site in the target gene of the parental microbial genome or in the two regions outside the target gene. It is possible to replace the target gene with a deleted or inactivated gene fragment.

本発明の酵素生産方法の形質転換体を得る工程は、上記した組換えベクターを用意する工程で調製した組換えベクターを用いて、宿主細胞または上記した宿主細胞を得る工程で調製した宿主細胞を形質転換する。組換えベクターによる宿主細胞の形質転換も常法により実施できる。   The step of obtaining the transformant of the enzyme production method of the present invention comprises the step of obtaining a host cell or a host cell prepared in the step of obtaining the host cell using the recombinant vector prepared in the step of preparing the recombinant vector. Transform. Transformation of host cells with recombinant vectors can also be performed by conventional methods.

組換えベクターの宿主細胞への導入（形質転換）方法は、特に制限されず、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、コンピテント細胞法、エレクトロポレーションなど、導入する宿主細胞の種類や組換えベクターの形態に応じて、適宜選択することができる。   The method of introducing (transforming) a recombinant vector into a host cell is not particularly limited, and the type of host cell to be introduced and the type of recombinant vector such as transformation method, transfection method, competent cell method, electroporation, etc. It can select suitably according to a form.

ここで用いる、“宿主細胞”とは新しく導入するＤＮＡ配列のための宿主または発現媒体として作用する能力を有する細胞をいう。   As used herein, “host cell” refers to a cell that has the ability to act as a host or expression medium for newly introduced DNA sequences.

なお、組換えベクターの宿主細胞内での存在様式は、特に制限されず、染色体中に挿入されて、あるいは置換されて組み込まれてもよいし、またプラスミド状態で存在していてもよい。   The mode of presence of the recombinant vector in the host cell is not particularly limited, and it may be inserted into the chromosome or substituted and integrated, or may exist in the form of a plasmid.

なお、本発明の組換えベクターＡまたはＣに含まれるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子は、本発明の宿主細胞ＡまたはＣにおいて、欠損させられたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子、または宿主細胞が成育できない程度に発現を低下させられたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子と同種の遺伝子である。例えば、本発明の宿主細胞Ａにおいて、欠損させられたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子、または宿主細胞が成育できない程度に発現を低下させられたアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子が、アラニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子である場合、本発明の組換えベクターＡに含まれるのもアラニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子である。   The chromosomal gene encoding the aminoacyl-tRNA synthetase contained in the recombinant vector A or C of the present invention is a chromosomal gene encoding the aminoacyl-tRNA synthetase deleted in the host cell A or C of the present invention, or It is a gene of the same kind as a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase whose expression is reduced to such an extent that the host cell cannot grow. For example, in the host cell A of the present invention, a chromosomal gene encoding a defective aminoacyl tRNA synthetase, or a chromosomal gene encoding an aminoacyl tRNA synthetase whose expression has been reduced to an extent that the host cell cannot grow is alanyl. In the case of a tRNA synthetase gene, the alanyl tRNA synthetase gene is also included in the recombinant vector A of the present invention.

本発明の酵素生産方法におけるγ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する工程では、上記した形質転換体を得る工程で得られる形質転換体を培養して、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子がコードする酵素を生産する。   In the step of producing at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase in the enzyme production method of the present invention, the traits obtained in the step of obtaining the transformant described above The transformant is cultured to produce an enzyme encoded by a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase.

形質転換体の培養は、宿主細胞の種類に応じて、適切な培地を用い、適切な培養条件の下で実施される。宿主細胞としては、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子がコードする酵素の生産が可能なものであればよく、野生型のものでも変異を施したものでものよい。好ましくは、枯草菌などのバチルス属細菌である。   The transformant is cultured under an appropriate culture condition using an appropriate medium depending on the type of host cell. Any host cell may be used as long as it can produce an enzyme encoded by a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. It can be of type or mutated. Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis are preferable.

例えば、宿主細胞が枯草菌の場合、培養に用いる培地の種類としては、適当な窒素源、炭素源、ミネラルを含み、本発明の枯草菌宿主が生育し、目的タンパク質を生産することができるものであればよい。例えば、組換え枯草菌１６８株によって、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子がコードする酵素を生産する場合、炭素源として、ぶどう糖や果糖等の単糖類、しょ糖、麦芽糖等の二糖類又は可溶性澱粉等の多糖類等を配合した培地や、窒素源として、ペプトン類、大豆エキス、酵母エキス、魚肉エキス、コーンスティープリカー（ Ｃ Ｓ Ｌ ）、金属塩等を配合した培地等を用いることができる。   For example, when the host cell is Bacillus subtilis, the culture medium used for the culture includes an appropriate nitrogen source, carbon source and mineral, and the Bacillus subtilis host of the present invention can grow and produce the target protein. If it is. For example, when the recombinant Bacillus subtilis 168 strain produces an enzyme encoded by a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, As a medium containing monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as sucrose and maltose, or polysaccharides such as soluble starch, and as nitrogen sources, peptones, soybean extract, yeast extract, fish extract, corn steep liquor A medium containing (CSL), a metal salt, or the like can be used.

また、培地のｐＨ は、用いる組換え生物体が生育しうる範囲のｐＨであれば良いが、例えば枯草菌の場合ｐＨ ６．０〜８．０に調整するのが好適であり、培養条件は、１５〜４２℃ 、好ましくは２８〜３７℃で２〜７日間振盪または、通気撹拌培養すればよい。   The pH of the medium may be in the range where the recombinant organism to be used can grow. For example, in the case of Bacillus subtilis, the pH is preferably adjusted to 6.0 to 8.0. The culture may be performed at 15 to 42 ° C., preferably 28 to 37 ° C. for 2 to 7 days with shaking or aeration and stirring.

このようにして得られた培養物から、本発明の組換えベクターに挿入された酵素遺伝子が発現した組換えタンパク質を採取する。該組換えタンパク質は通常形質転換体外に蓄積される。そこで、形質転換体外に蓄積された該組換えタンパク質を培養上清から一般のタンパク質の採取の手段に準じて採取する。たとえば、通常知られる手段によって形質転換体を除いた後に培養上清を組換えタンパク質含有物として用いることができる。   A recombinant protein expressing the enzyme gene inserted into the recombinant vector of the present invention is collected from the culture thus obtained. The recombinant protein is usually accumulated outside the transformant. Therefore, the recombinant protein accumulated outside the transformant is collected from the culture supernatant according to a general method for collecting proteins. For example, the culture supernatant can be used as a recombinant protein-containing material after removing the transformant by a generally known means.

ただし、宿主細胞の種類によっては組換えタンパク質を形質転換体内または形質転換体の細胞膜内に蓄積する場合もあり得る。その場合は、特に限定はされないが、たとえば、有機溶剤やリゾチームのような酵素によって形質転換体を溶解する方法、および、超音波破砕法、フレンチプレス法、ガラスビーズ破砕法、ダイノミル破砕法等の細胞破砕法で得られた形質転換体の細胞破砕物および／または培養物を遠心分離法、ろ過法等の操作によって形質転換体と培養上清に分離する。このようにして得られた培養上清を、組換えタンパク質含有物として用いることができる。また、分離した形質転換体をそのまま組換えタンパク質含有物とすることもできる。   However, depending on the type of host cell, the recombinant protein may accumulate in the transformant or in the cell membrane of the transformant. In that case, although not particularly limited, for example, a method of dissolving a transformant with an enzyme such as an organic solvent or lysozyme, and an ultrasonic crushing method, a French press method, a glass bead crushing method, a dynomill crushing method, etc. A cell disrupted product and / or culture of the transformant obtained by the cell disruption method is separated into a transformant and a culture supernatant by an operation such as centrifugation or filtration. The culture supernatant thus obtained can be used as a recombinant protein-containing material. In addition, the separated transformant can be used as it is as a recombinant protein-containing product.

上記組換えタンパク質含有物は、そのままで使用することもできるが、必要に応じて、たとえば塩析法、沈澱法、透析法、限外濾過法等の通常知られる方法を単独または組み合わせることにより工業用途の濃縮組換えタンパク質含有物を調製できる。   The recombinant protein-containing material can be used as it is, but if necessary, it can be used by combining known methods such as salting-out method, precipitation method, dialysis method, ultrafiltration method alone or in combination. Concentrated recombinant protein content for use can be prepared.

さらに前記濃縮組換えタンパク質含有物を、たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レジンカラム法等の通常知られる単離・精製法の組合せに供すことにより、精製組換えタンパク質を得ることができる。   Further, the concentrated recombinant protein-containing material is obtained, for example, by ion exchange chromatography, isoelectric point chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, resin column method, etc. The purified recombinant protein can be obtained by subjecting it to a combination of commonly known isolation and purification methods.

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.

［実施例１］枯草菌へのトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を有するプラスミドの導入
トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を保有する染色体外遺伝子であるプラスミドｐＤＡＴＳ１４を以下の方法で構築した。まず、汎用枯草菌−大腸菌のシャトルプラスミドであるｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト社製）を鋳型として、プライマーＡ（配列番号３４）とＢ（配列番号３５）を用いてＰＣＲによる増幅を行った。得られた増幅断片を制限酵素ＸｈｏＩで消化した後、両末端を連結することにより環状プラスミドとした。本プラスミドを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製しｐＤＡ２とした。一方、枯草菌ＩＳＷ１２１４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４）株の染色体を鋳型とし、プライマーＣ（配列番号３６）とＤ（配列番号３７）を用いてトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子とその近傍の領域を含むＤＮＡ断片を得た。本ＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、予め制限酵素ＸｈｏＩで消化したｐＤＡ２と連結した。これを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを調製し、ｐＤＡＴＳ１４と命名した。次にｐＤＡＴＳ１４を用いて、２種のプロテアーゼ（アルカリプロテアーゼＥ、中性プロテアーゼＥ）に欠陥を有する枯草菌ＩＳＷ１２１４株由来変異株（参考文献 Appl.Microbiol. Biotechnol 65:583-592 (2004)Hatada,Y.ら）を、プロトプラスト形質転換法（参考文献Mol. Gen. Genet. 168:111-115 （1979） Chang, S.とCohen, S. N.）により形質転換し、染色体外にトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を保有する枯草菌形質転換体を得た。 [Example 1] Introduction of plasmid having tryptophanyl tRNA synthetase gene into Bacillus subtilis Plasmid pDATS14, an extrachromosomal gene having a tryptophanyl tRNA synthetase gene, was constructed by the following method. First, amplification by PCR was performed using primers Y (SEQ ID NO: 34) and B (SEQ ID NO: 35) using pHY300PLK (manufactured by Yakult), which is a general purpose Bacillus subtilis-E. Coli shuttle plasmid. The obtained amplified fragment was digested with the restriction enzyme Xho I and then ligated at both ends to obtain a circular plasmid. Escherichia coli HB101 strain was transformed with this plasmid. A plasmid was prepared from the transformant and designated as pDA2. On the other hand, using the chromosome of Bacillus subtilis ISW1214 strain as a template, primers C (SEQ ID NO: 36) and D (SEQ ID NO: 37) are used to obtain a DNA fragment containing the tryptophanyl tRNA synthetase gene and its neighboring region. It was. Digesting this DNA fragment with restriction enzymes Xho I, and ligated with pDA2 previously digested with restriction enzymes Xho I. This was used to transform E. coli strain HB101. A plasmid was prepared from the obtained transformant and designated as pDATS14. Next, using pDATS14, a mutant derived from Bacillus subtilis ISW1214 strain defective in two proteases (alkaline protease E and neutral protease E) (reference document Appl. Microbiol. Biotechnol 65: 583-592 (2004) Hatada, Y. et al.) Was transformed by protoplast transformation method (reference Mol. Gen. Genet. 168: 111-115 (1979) Chang, S. and Cohen, SN), and tryptophanyl tRNA synthetase gene was extrachromosomally transferred. A Bacillus subtilis transformant was obtained.

［実施例２］枯草菌の染色体トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を破壊するためのＤＮＡ断片の構築
枯草菌ＩＳＷ１２１４株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＥ（配列番号３８）とＦ（配列番号３９）を用いてトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子とその近傍の領域を含む約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化した。ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで予め消化した汎用性プラスミドｐＵＣ１８に連結し、プラスミドｐＴＳＡＦを得た。一方、汎用性プラスミドであるｐＣ１９４を鋳型として、プライマーＧ（配列番号４０）とＨ（配列番号４１）を用いてスタフィロコッカス由来クロラムフェニコール耐性遺伝子とその近傍領域を含む約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を得た。さらに、ｐＴＳＡＦを鋳型としてプライマーＩ（配列番号４２）とＪ（配列番号４３）を用いてＰＣＲ反応を行いＤＮＡ断片を得た。本ＤＮＡ断片とクロラムフェニコール耐性遺伝子とその近傍領域を含む約１．６ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化した後連結し、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製し、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子破壊用プラスミドｐＩＮＴＴＳとした。ｐＩＮＴＴＳを鋳型としてプライマーＫ（配列番号４４）とＬ（配列番号４５）を用いてＰＣＲ反応を行い直鎖状のトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を得た。 [Example 2] Construction of a DNA fragment for disrupting the chromosomal tryptophanyl tRNA synthetase gene of Bacillus subtilis Using the chromosomal DNA of Bacillus subtilis ISW1214 as a template, using primers E (SEQ ID NO: 38) and F (SEQ ID NO: 39) Thus, a DNA fragment of about 2.5 kb containing a tryptophanyl tRNA synthetase gene and a region in the vicinity thereof was obtained. This was digested with restriction enzymes Eco RI and Sal I. Ligation into the universal plasmid pUC18 previously digested with Eco RI and Sal I gave the plasmid pTSAF. On the other hand, about 1.6 kb including the Staphylococcus-derived chloramphenicol resistance gene and its neighboring region using primers G (SEQ ID NO: 40) and H (SEQ ID NO: 41) using pC194, which is a universal plasmid, as a template. A DNA fragment was obtained. Further, a PCR reaction was carried out using primers I (SEQ ID NO: 42) and J (SEQ ID NO: 43) using pTSAF as a template to obtain a DNA fragment. This DNA fragment, a chloramphenicol resistance gene and a DNA fragment of about 1.6 kb including its neighboring region were digested with restriction enzymes Bam HI and Xba I and ligated to transform Escherichia coli HB101. A plasmid was prepared from the transformant and used as a plasmid pINTTS for tryptophanyl tRNA synthetase gene disruption. PCR reaction was performed using pINTTS as a template and primers K (SEQ ID NO: 44) and L (SEQ ID NO: 45) to obtain a linear DNA fragment for tryptophanyl tRNA synthetase gene disruption.

［実施例３］枯草菌の染色体トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子の破壊
上記トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子破壊用ＤＮＡ断片を用いて、コンピテントセル法を用いて実施例１で得た染色体外にトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子を保有する形質転換体をさらに形質転換し、クロラムフェニコール耐性を獲得した形質転換体を得た。得られた形質転換体から染色体ＤＮＡを調製した。本染色体ＤＮＡに対して、プライマーＭ（配列番号４６）とＮ（配列番号４７）、あるいはＯ（配列番号４８）とＰ（配列番号４９）を用いてＰＣＲ反応を行い、染色体のトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子がコードされていた領域がトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子破壊用ＤＮＡ断片由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換されていることを確認し、本菌株をトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子欠損株であるＤＴＳ１４５１（ｐＤＡＴＳ１４）株とした。 [Example 3] Disruption of Bacillus subtilis chromosomal tryptophanyl tRNA synthetase gene Tryptophanyl tRNA synthetase outside the chromosome obtained in Example 1 using the competent cell method using the DNA fragment for disrupting the tryptophanyl tRNA synthetase gene. The transformant carrying the gene was further transformed to obtain a transformant that acquired chloramphenicol resistance. Chromosomal DNA was prepared from the obtained transformant. A PCR reaction is performed on this chromosomal DNA using primers M (SEQ ID NO: 46) and N (SEQ ID NO: 47), or O (SEQ ID NO: 48) and P (SEQ ID NO: 49), and chromosomal tryptophanyl tRNA synthetase. It was confirmed that the region where the gene was encoded was replaced with a chloramphenicol resistance gene derived from a DNA fragment for disruption of tryptophanyl tRNA synthetase gene, and this strain was identified as DTS1451 (pDATS14) which is a tryptophanyl tRNA synthetase gene deficient strain. ) Stock.

［実施例４］ＤＴＳ１４５１株へのカナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドの導入
枯草菌ＩＳＷ１２１４株の染色体を鋳型とし、プライマーＣとＤを用いてトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子とその近傍の領域を含むＤＮＡ断片を得た。本ＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩで消化し、予め制限酵素ＸｈｏＩで消化したｐＤＡ２と連結した。これを用いて、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを調製し、ｐＤＡＴＳ１３と命名した。汎用性プラスミドｐＵＢ１１０を鋳型とし、プライマーＱ（配列番号５０）とＲ（配列番号５１）を用いてカナマイシン耐性遺伝子とその近傍の領域を含むＤＮＡ断片を得た。本ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化し、ｐＤＡＴＳ１４を鋳型としてプライマーＳ（配列番号５２）とＴ（配列番号５３）を用いてＰＣＲで増幅して、さらにＥｃｏＲＩで消化することにより得られたＤＮＡ断片と連結した。これを用いて、大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られたカナマイシン耐性を有する形質転換体からプラスミドを調製し、プラスミドをｐＤＡＴＳＫと命名した。ｐＤＡＴＳＫを用いてｐＤＡＴＳ１４を有するＤＴＳ１４５１株をプロトプラスト形質転換法を用いて形質転換し、カナマイシン３０μｇ／ｍＬを含む再生培地（組成：コハク酸ナトリウム ８％、寒天 １％、カザミノ酸 ０．５％、酵母エキス ０．５％、リン酸２水素カリウム ０．１５％、リン酸水素２カリウム ０．３５％、グルコース ０．５％、硫酸マグネシウム ０．４％、牛血清アルブミン ０．０１％、メチオニン ０．００１％、およびロイシン ０．００１％）による選抜を行った。得られた形質転換体をカナマイシン入りＬＢ寒天培地およびテトラサイクリン７．５μｇ／ｍＬを含む再生培地に植菌し、カナマイシン耐性かつテトラサイクリン感受性となった株をＤＴＳ１４５１（ｐＤＡＴＳＫ）と命名した。 [Example 4] Introduction of plasmid having kanamycin resistance gene into DTS1451 strain Using a chromosome of Bacillus subtilis ISW1214 as a template, primers C and D are used to obtain a DNA fragment containing the tryptophanyl tRNA synthetase gene and its neighboring region. It was. Digesting this DNA fragment with restriction enzymes Xho I, and ligated with pDA2 previously digested with restriction enzymes Xho I. Using this, Escherichia coli HB101 strain was transformed. A plasmid was prepared from the obtained transformant and designated as pDATS13. A DNA fragment containing the kanamycin resistance gene and its neighboring region was obtained using the universal plasmid pUB110 as a template and primers Q (SEQ ID NO: 50) and R (SEQ ID NO: 51). This DNA fragment was digested with Eco RI, amplified by PCR using pDATS14 as a template with primers S (SEQ ID NO: 52) and T (SEQ ID NO: 53), and further digested with Eco RI And linked. Using this, Escherichia coli HB101 strain was transformed. A plasmid was prepared from the obtained transformant having kanamycin resistance, and the plasmid was designated as pDATSK. A DTS1451 strain having pDATS14 using pDATSK was transformed using the protoplast transformation method, and a regeneration medium containing 30 μg / mL kanamycin (composition: sodium succinate 8%, agar 1%, casamino acid 0.5%, yeast Extract 0.5%, potassium dihydrogen phosphate 0.15%, dipotassium hydrogen phosphate 0.35%, glucose 0.5%, magnesium sulfate 0.4%, bovine serum albumin 0.01%, methionine 0. (001% and leucine 0.001%). The obtained transformant was inoculated in a regeneration medium containing kanamycin-containing LB agar medium and tetracycline 7.5 μg / mL, and the strain that became kanamycin resistant and tetracycline sensitive was named DTS1451 (pDATSK).

［実施例５］遺伝子調節領域ＤＮＡ断片の探索用プラスミドの構築
遺伝子調節領域ＤＮＡ断片検索用ベクターｐＰＴＣＦを以下の方法で構築した。
寄託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−８３２０である、マイクロバルバイファー・エスピー ＪＡＭＢ−Ａ７（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ． ＪＡＭＢ−Ａ７）株由来の染色体ＤＮＡを鋳型に用いて、プライマーＵ（配列番号５４）およびプライマーＷ（配列番号５５）を用いてＰＣＲによる増幅を行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素、ＥｃｏＲＩで消化した後、予めＥｃｏＲＩで消化したｐＨＹ３００ＰＬＫと連結することにより環状プラスミドを構築した。本プラスミドを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製し、寒天分解酵素遺伝子の上流にｐＨＹ３００ＰＬＫ由来のポリリンカー部位を有するプラスミドをｐＰＴＣＦと命名した。 [Example 5] Construction of a plasmid for searching for a gene regulatory region DNA fragment A vector pPTCF for searching a gene regulatory region DNA fragment was constructed by the following method.
Primer U (SEQ ID NO: 54) and Primer W (SEQ ID NO: 54) were prepared using a chromosomal DNA derived from Microbarbifer sp. JAMB-A7 ( Microbulbifer sp. JAMB-A7) strain having a deposit number of FERM BP-8320 as a template. 55) was used for amplification by PCR. The obtained DNA fragment was digested with a restriction enzyme, Eco RI, and then ligated with pHY300PLK previously digested with Eco RI to construct a circular plasmid. Escherichia coli HB101 strain was transformed with this plasmid. A plasmid was prepared from the transformant, and a plasmid having a polylinker site derived from pHY300PLK upstream of the agar degrading enzyme gene was named pPTCF.

［実施例６］遺伝子調節領域ＤＮＡ断片の取得
Ｓａｕ３ＡＩを用いて、寄託番号がＦＥＲＭ ＡＰ−２０２２７である、バチルス・エスピー ＪＡＭＢ７５０（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＪＡＭＢ７５０）株の染色体ＤＮＡを消化後、これをＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＰＴＣＦと混ぜてＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーション反応を行った。得られたライゲーション液を用いて枯草菌を形質転換した。再生培地にはＤＭ３培地（組成：コハク酸ナトリウム ８％、寒天 １％、カザミノ酸 ０．５％、酵母エキス ０．５％、リン酸２水素カリウム ０．１５％、リン酸水素２カリウム ０．３５％、グルコース ０．５％、硫酸マグネシウム ０．４％、牛血清アルブミン ０．０１％、メチオニン ０．００１％、ロイシン ０．００１％、テトラサイクリン ７．５μｇ／ｍｌ）を用いた。形質転換体の周囲に寒天の窪みを形成した形質転換体を選び、約２，０００個の形質転換体を液体培地にて培養（培地組成はポリペプトンＳ ３％、魚肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．０５％、リン酸２水素カリウム ０．１％、マルトース ４％、硫酸マグネシウム ０．０２％、塩化カルシウム ０．０５％、テトラサイクリン ７．５μｇ／ｍｌ、３０℃で４８時間振とう）した。得られた培養液毎に超音波破砕（Ｈａｎｄｙ ｓｏｎｉｃ ｍｏｄｅｌ ＵＲ−２０Ｐ、ＴＯＭＹ ＳＥＩＫＯ ＣＯ．使用）を行い、取得された超音波破砕物の寒天分解酵素活性を測定した。その中で最も活性の高かったものを選択し、この形質転換体の持つプラスミドをｐＣＤＡＧ１と命名した。 [Example 6] Acquisition of DNA fragment of gene regulatory region
Using Sau3 AI, the chromosomal DNA of Bacillus sp. JAMB750 ( Bacillus sp. JAMB750), whose deposit number is FERM AP-20227, is digested and mixed with plasmid pPTCF cleaved with Bam HI to obtain T4 DNA ligase. The ligation reaction was performed using this. Bacillus subtilis was transformed using the obtained ligation solution. DM3 medium (composition: sodium succinate 8%, agar 1%, casamino acid 0.5%, yeast extract 0.5%, potassium dihydrogen phosphate 0.15%, dipotassium hydrogen phosphate 35%, glucose 0.5%, magnesium sulfate 0.4%, bovine serum albumin 0.01%, methionine 0.001%, leucine 0.001%, tetracycline 7.5 μg / ml). A transformant having an agar depression formed around the transformant was selected, and about 2,000 transformants were cultured in a liquid medium (medium composition: polypeptone S 3%, fish meat extract 0.5%, yeast Extract 0.05%, potassium dihydrogen phosphate 0.1%, maltose 4%, magnesium sulfate 0.02%, calcium chloride 0.05%, tetracycline 7.5 μg / ml, shaken at 30 ° C. for 48 hours) . Each culture broth was subjected to ultrasonic disruption (using Handy sonic model UR-20P, TOMY SEIKO CO.), And the agar-degrading enzyme activity of the obtained ultrasonic disruption was measured. Among them, the one with the highest activity was selected, and the plasmid possessed by this transformant was named pCDAG1.

［実施例７］プラスミドｐＪＥＸＯＰＴ２の構築
寄託番号がＤＳＭ１７２９７である、サラッソモナス・エスピー ＪＡＭＢ−Ａ３３（Ｔｈａｌａｓｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＡＭＢ−Ａ３３）株由来の染色体ＤＮＡを鋳型にプライマーＸ（配列番号５６）とプライマーＹ（配列番号５７）を用いてＰＣＲ増幅を行い約０．３ｋｂｐから成るＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。続いて枯草菌−大腸菌のシャトルプラスミドであるｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト社製）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上記のＤＮＡ断片とリガーゼ反応により連結した。本プラスミドを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。形質転換体からプラスミドを調製しｐＨＹＴＥＲと命名した。 [Example 7] Construction of plasmid pJEXOPT2 Primer X (SEQ ID NO: 56) and primer Y (SEQ ID NO: 56) using chromosomal DNA derived from the Salassomonas sp. JAMB-A33 ( Thalassomonas sp. JAMB-A33) strain having a deposit number of DSM17297 PCR amplification was performed using No. 57) to obtain a DNA fragment consisting of about 0.3 kbp. This DNA fragment was cleaved with restriction enzyme Hin dIII. Subsequently Bacillus subtilis - E. coli is a shuttle plasmid pHY300PLK (manufactured by Yakult Co.) was digested with restriction enzyme Hin dIII, ligated with the above DNA fragment and ligase reactions. Escherichia coli HB101 strain was transformed with this plasmid. A plasmid was prepared from the transformant and named pHYTER.

プラスミドｐＪＥＸＯＰＴ２を以下の方法で構築した。プラスミドｐＣＤＡＧ１を鋳型にしてリン酸化プライマーＺ（配列番号５８）およびリン酸化プライマーＡ１（配列番号５９）を用いてＰＣＲによる増幅を行った。得られたＰＣＲ断片をｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位に導入した。構築されたプラスミドを鋳型にして、プライマーＺおよびプライマーＡ１を用いてＤｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ クロンテック社）を用い、キットのプロトコールにしたがって、ＰＣＲ増幅断片中にランダムに変異を導入した。このランダム変異操作を５回繰り返した。得られたＰＣＲ産物を鋳型にプライマーＺおよびリン酸化プライマーＡ１を用いてＰＣＲ増幅を行った。その後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ産物の末端の平滑化を行った。一方、合成一本鎖ＤＮＡ断片Ａ（配列番号７４）と合成一本鎖ＤＮＡ断片Ｂ（配列番号７５）とをアニーリングさせ二本鎖ＤＮＡを形成させた。得られたＤＮＡ断片をリン酸化した後に、上記のＰＣＲ増幅断片とリガーゼ反応により結合した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで消化した後、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したｐＨＹＴＥＲと連結することにより環状プラスミド群を構築した。本プラスミド群を用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた数千あまりの形質転換体からまとめてプラスミド群を調製した。これをプラスミド群Ａとした。 Plasmid pJEXOPT2 was constructed by the following method. Amplification by PCR was carried out using phosphorylated primer Z (SEQ ID NO: 58) and phosphorylated primer A1 (SEQ ID NO: 59) using plasmid pCDAG1 as a template. The obtained PCR fragment was introduced into the Sma I site of pUC18. Using the constructed plasmid as a template, a mutation was randomly introduced into the PCR amplified fragment according to the protocol of the kit using Diversity PCR Random Mutagenesis Kit (Clontech) using Primer Z and Primer A1. This random mutation operation was repeated 5 times. PCR amplification was performed using the obtained PCR product as a template and primer Z and phosphorylated primer A1. Thereafter, the end of the PCR product was blunted using T4 DNA polymerase. On the other hand, the synthetic single-stranded DNA fragment A (SEQ ID NO: 74) and the synthetic single-stranded DNA fragment B (SEQ ID NO: 75) were annealed to form double-stranded DNA. The obtained DNA fragment was phosphorylated and then combined with the PCR amplified fragment by ligase reaction. The obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes Eco RI and Bam HI, and then ligated with pHYTER digested with Eco RI and Bam HI to construct a circular plasmid group. Escherichia coli HB101 strain was transformed with this plasmid group. The plasmid group was prepared from several thousand transformants obtained. This was designated as plasmid group A.

次にβアガラーゼ生産菌である、寄託番号がＦＥＲＭ ＢＰ−８３２１である、マイクロバルバイファー・エスピー ＪＡＭＢ−Ａ９４（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ． ＪＡＭＢ−Ａ９４）株の染色体を鋳型とし、プライマーＢ１（配列番号６０）およびＣ１（配列番号６１）を用いてβアガラーゼ酵素遺伝子ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。これを制限酵素ＢａｍＨＩで消化した。プラスミド群Ａを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、リガーゼによってβアガラーゼ酵素遺伝子と連結した。これらを大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。βアガラーゼ活性を示す形質転換体からプラスミドを調製し、これらのプラスミドを用いて枯草菌ＩＳＷ１２１４株を形質転換し、テトラサイクリン入り再生培地による選抜を行った。得られた形質転換体を液体培地（ポリペプトンＳ ３％、魚肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．０５％、リン酸水素カリウム ０．１％、マルトース ４％、塩化マグネシウム ０．０２％、塩化カルシウム ０．０５％、テトラサイクリン １５μｇ／ｍｌ）中で３０℃、７２時間、１３０ｒｐｍにて撹拌培養を行い、得られた培養上清に含まれるβアガラーゼ活性を測定した。その結果、著量のβアガラーゼを生産できるプラスミドｐＪＥＸＯＰＴ２を取得できた。 Next, a chromosome of a microbarbifer SP JAMB-A94 ( Microbulbifer sp. JAMB-A94) strain having a deposit number of FERM BP-8321, which is a β agarase-producing bacterium, is used as a template, primer B1 (SEQ ID NO: 60) and A β-agarase enzyme gene DNA fragment was PCR amplified using C1 (SEQ ID NO: 61). This was digested with the restriction enzyme Bam HI. Plasmid group A was cleaved with the restriction enzyme Bam HI and ligated with the β-agarase enzyme gene by ligase. These were transformed into Escherichia coli HB101 strain. Plasmids were prepared from transformants exhibiting β-agarase activity, Bacillus subtilis ISW1214 strain was transformed with these plasmids, and selection was performed using a regeneration medium containing tetracycline. The obtained transformant was treated with a liquid medium (polypeptone S 3%, fish extract 0.5%, yeast extract 0.05%, potassium hydrogen phosphate 0.1%, maltose 4%, magnesium chloride 0.02%, chloride) The mixture was stirred at 130 rpm for 30 hours at 30 ° C. in calcium 0.05%, tetracycline 15 μg / ml, and β-agarase activity contained in the obtained culture supernatant was measured. As a result, a plasmid pJEXOPT2 capable of producing a significant amount of β-agarase was obtained.

［実施例８］発現ベクターによるγ−ＣＧＴａｓｅの分泌生産
γ−ＣＧＴａｓｅ生産菌であるバチルス・クラーキー ７３６４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ clarkii ７３６４）株由来のγ−ＣＧＴａｓｅ遺伝子（J Biochem(Tokyo). 2003 133:317-324. Takada, M.）をコードする遺伝子配列を含むプラスミドｐＧＦＴ−０１（特許公開番号２００３−１０２４８９）を鋳型として、プライマーＤ１（配列番号６２）およびＥ１（配列番号６３）を用いてＰＣＲ反応を行い、該酵素をコードするＤＮＡ断片を得て、これを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化した。ｐＪＥＸＯＰＴ２を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、プラスミドのオリジンを有する方のＤＮＡ断片と、リガーゼによってγ−ＣＧＴａｓｅ遺伝子と連結した。これらを大腸菌ＨＢ１０１株に導入して形質転換させた。γ−ＣＧＴａｓｅ活性を示す形質転換体からプラスミドを調製し、ｐＪＥＸＯＰＴ２Ｇと命名した。次に、枯草菌ＩＳＷ１２１４株の染色体を鋳型とし、プライマーＦ１（配列番号６４）とＧ１（配列番号６５）を用いてトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子とその近傍の領域を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を得た。本ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したｐＪＥＸＯＰＴ２Ｇと連結した。これを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを調製し、ｐＪＥＸＯＰＴ２ＧＳと命名した。ｐＪＥＸＯＰＴ２ＧＳを用いてＤＴＳ１４５１（ｐＤＡＴＳＫ）を形質転換し、テトラサイクリン ７．５μｇ／ｍＬ再生培地による選抜を行った。得られた形質転換体をカナマイシン入りＬＢ寒天培地およびテトラサイクリン ７．５μｇ／ｍＬを含む再生培地に植菌し、γ−ＣＧＴａｓｅ活性を示し、さらにカナマイシン感受性かつテトラサイクリン耐性となった株をＤＴＳ１４５１（ｐＪＥＸＯＰＴ２ＧＳ）と命名した。ＤＴＳ１４５１（ｐＪＥＸＯＰＴ２ＧＳ）を液体培地中（ポリペプトンS ５％、魚肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．０５％、リン酸水素カリウム ０．１％、マルトース ４％、塩化マグネシウム ０．０１％、塩化カルシウム ０．１％、抗生物質を含有しない）で３０℃、９６時間、１３０ｒｐｍにて撹拌培養を行い、得られた培養上清に含まれるγ−ＣＧＴａｓｅ活性を測定した。その結果、培養液１Ｌあたり約１．４ｇのγ−ＣＧＴａｓｅ酵素の生産が確認できた。 [Example 8] Secretion production of γ-CGTase by an expression vector γ-CGTase gene derived from Bacillus clarkii 7364 strain (J Biochem (Tokyo). 2003 133: 317-324) A PCR reaction was performed using primers p1 (SEQ ID NO: 62) and E1 (SEQ ID NO: 63) using plasmid pGFT-01 (Patent Publication No. 2003-102489) containing the gene sequence encoding Takada, M.) as a template. A DNA fragment encoding the enzyme was obtained and digested with restriction enzymes Bam HI and Sal I. pJEXOPT2 was cleaved with restriction enzymes Bam HI and Sal I, and ligated with the DNA fragment having the origin of the plasmid and ligase with the γ-CGTase gene. These were introduced into E. coli strain HB101 for transformation. A plasmid was prepared from a transformant exhibiting γ-CGTase activity and named pJEXOPT2G. Next, a PCR-amplified DNA fragment containing the tryptophanyl tRNA synthetase gene and its neighboring region was obtained using the chromosome of Bacillus subtilis strain ISW1214 as a template and using primers F1 (SEQ ID NO: 64) and G1 (SEQ ID NO: 65). Digesting this DNA fragment with restriction enzymes Eco RI, and ligated with pJEXOPT2G previously digested with restriction enzyme Eco RI. This was used to transform E. coli strain HB101. A plasmid was prepared from the obtained transformant and named pJEXOPT2GS. pJEXOPT2GS was used to transform DTS1451 (pDATSK), and selection with tetracycline 7.5 μg / mL regeneration medium was performed. The obtained transformant was inoculated into a regeneration medium containing kanamycin-containing LB agar medium and tetracycline 7.5 μg / mL, and a strain which showed γ-CGTase activity and became kanamycin sensitive and tetracycline resistant was DTS1451 (pJEXOPT2GS). Named. DTS1451 (pJEXOPT2GS) in liquid medium (polypeptone S 5%, fish extract 0.5%, yeast extract 0.05%, potassium hydrogen phosphate 0.1%, maltose 4%, magnesium chloride 0.01%, calcium chloride The mixture was incubated at 130 ° C. for 96 hours at 130 rpm, and the γ-CGTase activity contained in the obtained culture supernatant was measured. As a result, it was confirmed that about 1.4 g of γ-CGTase enzyme was produced per liter of culture solution.

［実施例９］発現ベクターによるマルトースホスホリラーゼ生産
マルトースホスホリラーゼ生産菌である寄託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ８４２０のパエニバチルス・エスピーＳＨ−５５（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＳＨ−５５）株由来のマルトースホスホリラーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＲＳＭＰ１（国際公開番号ＷＯ２００５／００３４３号公報記載）を組換え大腸菌からＧＦＸＰｌａｓｍｉｄ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いることにより精製した。得られた組換え体プラスミドを鋳型として、プライマーＨ１（配列番号６６）とプライマーＩ１（配列番号６７）を用い、ＰＣＲを行い、マルトースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。これを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化した。ｐＪＥＸＯＰＴ２を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、プラスミドのオリジンを有する方のＤＮＡ断片とリガーゼによってマルトースホスホリラーゼ遺伝子と連結した。これらを大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。マルトースホスホリラーゼ活性を示す形質転換体からプラスミドを調製し、ｐＪＥＸＯＰＴ２Ｍと命名した。枯草菌株ＩＳＷ１２１４株の染色体を鋳型とし、プライマーＪ１（配列番号６８）とＫ１（配列番号６９）を用いてトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子とその近傍の領域を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を得た。本ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したｐＪＥＸＯＰＴ２Ｍと連結した。これを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを調製し、ｐＪＥＸＯＰＴ２ＭＳと命名した。ｐＪＥＸＯＰＴ２ＭＳを用いてＤＴＳ１４５１（ｐＤＡＴＳＫ）を形質転換し、テトラサイクリン ７．５μｇ／ｍＬ再生培地による選抜を行った。得られた形質転換体をカナマイシン入りＬＢ寒天培地およびテトラサイクリン ７．５μｇ／ｍＬを含む再生培地に植菌し、マルトースホスホリラーゼ活性を示し、さらにカナマイシン感受性かつテトラサイクリン耐性となった株をＤＴＳ１４５１（ｐＪＥＸＯＰＴ２ＭＳ）と命名した。ＤＴＳ１４５１（ｐＪＥＸＯＰＴ２ＭＳ）を液体培地中（ポリペプトンＳ ５％、魚肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．０５％、リン酸水素カリウム ０．１％、マルトース ４％、塩化マグネシウム ０．０１％、塩化カルシウム ０．１％、抗生物質を含有しない）で３０℃、９６時間、１３０ｒｐｍにて撹拌培養を行い、得られた培養上清に含まれるマルトースホスホリラーゼ活性を測定した。その結果、培養液１Ｌあたり約０．５ｇのマルトースホスホリラーゼの生産が確認できた。 [Example 9] Maltose phosphorylase production by expression vector Recombinant plasmid pRSMP1 containing a maltose phosphorylase gene derived from the Paenibacillus sp. SH-55 strain of deposit number FERM-BP8420 which is a maltose phosphorylase producing bacterium (Described in International Publication No. WO2005 / 00343) was purified from recombinant Escherichia coli by using GFXPplasmid prep Kit (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.). Using the obtained recombinant plasmid as a template, PCR was performed using primer H1 (SEQ ID NO: 66) and primer I1 (SEQ ID NO: 67) to obtain a DNA fragment containing a maltose phosphorylase gene. This was digested with restriction enzymes Bam HI and Xho I. pJEXOPT2 was cleaved with restriction enzymes Bam HI and Sal I, and ligated with the maltose phosphorylase gene by the DNA fragment having the origin of the plasmid and ligase. These were transformed into Escherichia coli HB101 strain. A plasmid was prepared from a transformant exhibiting maltose phosphorylase activity and named pJEXOPT2M. Using the chromosome of Bacillus subtilis strain ISW1214 as a template, a PCR-amplified DNA fragment containing a tryptophanyl tRNA synthetase gene and its neighboring region was obtained using primers J1 (SEQ ID NO: 68) and K1 (SEQ ID NO: 69). Digesting this DNA fragment with restriction enzymes Eco RI, and ligated with pJEXOPT2M previously digested with restriction enzyme Eco RI. This was used to transform E. coli strain HB101. A plasmid was prepared from the obtained transformant and named pJEXOPT2MS. DTS1451 (pDATSK) was transformed using pJEXOPT2MS, and selection was performed with a tetracycline 7.5 μg / mL regeneration medium. The obtained transformant was inoculated into a regeneration medium containing LB agar medium containing kanamycin and 7.5 μg / mL of tetracycline, and a strain that exhibited maltose phosphorylase activity and became kanamycin sensitive and tetracycline resistant was designated as DTS1451 (pJEXOPT2MS). Named. DTS1451 (pJEXOPT2MS) in liquid medium (polypeptone S 5%, fish extract 0.5%, yeast extract 0.05%, potassium hydrogen phosphate 0.1%, maltose 4%, magnesium chloride 0.01%, calcium chloride The mixture was cultured at 30 ° C. for 96 hours at 130 rpm, and the maltose phosphorylase activity contained in the obtained culture supernatant was measured. As a result, it was confirmed that about 0.5 g of maltose phosphorylase was produced per liter of the culture solution.

［実施例１０］発現ベクターによるトレハロースホスホリラーゼ生産
トレハロースホスホリラーゼ生産菌であるパエニバチルス・エスピーＳＨ−５５株由来のトレハロースホスホリラーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミドｐＲＳＴＰ１（国際公開番号ＷＯ２００５／００３４３号公報記載）を組換え大腸菌からＧＦＸＰｌａｓｍｉｄ ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いることにより精製した。得られた組換え体プラスミドを鋳型として、プライマーＬ１（配列番号７０）とプライマーＭ１（配列番号７１）を用い、ＰＣＲを行い、トレハロースホスホリラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。これを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化した。ｐＪＥＸＯＰＴ２を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、プラスミドのオリジンを有する方のＤＮＡ断片とリガーゼによってトレハロースホスホリラーゼ遺伝子と連結した。これらを大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。トレハロースホスホリラーゼ活性を示す形質転換体からプラスミドを調製し、ｐＪＥＸＯＰＴ２Ｔと命名した。枯草菌ＩＳＷ１２１４株の染色体を鋳型とし、プライマーＮ１（配列番号７２）とＯ１（配列番号７３）を用いてトリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素遺伝子とその近傍の領域を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を得た。本ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、予め制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したｐＪＥＸＯＰＴ２Ｔと連結した。これを用いて大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを調製し、ｐＪＥＸＯＰＴ２ＴＳと命名した。ｐＪＥＸＯＰＴ２ＴＳを用いてＤＴＳ１４５１（ｐＤＡＴＳＫ）を形質転換し、テトラサイクリン ７．５μｇ／ｍＬ再生培地による選抜を行った。得られた形質転換体をカナマイシン入りＬＢ寒天培地およびテトラサイクリン ７．５μｇ／ｍＬを含む再生培地に植菌し、トレハロースホスホリラーゼ活性を示し、さらにカナマイシン感受性かつテトラサイクリン耐性となった株をＤＴＳ１４５１（ｐＪＥＸＯＰＴ２ＴＳ）と命名した。ＤＴＳ１４５１（ｐＪＥＸＯＰＴ２ＴＳ）を液体培地中（ポリペプトンS ５％、魚肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．０５％、リン酸水素カリウム ０．１％、マルトース ４％、塩化マグネシウム ０．０１％、塩化カルシウム ０．１％、抗生物質を含有しない）で３０℃、９６時間、１３０ｒｐｍにて撹拌培養を行い、得られた培養上清に含まれるトレハロースホスホリラーゼ活性を測定した。その結果、培養液１Ｌあたり約１．２ｇのトレハロースホスホリラーゼの生産が確認できた。 [Example 10] Production of trehalose phosphorylase by expression vector Recombinant recombinant plasmid pRSTP1 (described in International Publication No. WO2005 / 00343) containing the trehalose phosphorylase gene derived from Paenibacillus sp. It refine | purified by using GFXplasmid prep Kit (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.) from colon_bacillus | E._coli. Using the obtained recombinant plasmid as a template, PCR was performed using primer L1 (SEQ ID NO: 70) and primer M1 (SEQ ID NO: 71) to obtain a DNA fragment containing the trehalose phosphorylase gene. This was digested with restriction enzymes Bam HI and Xho I. pJEXOPT2 was cleaved with restriction enzymes Bam HI and Sal I and ligated with the DNA fragment having the origin of the plasmid and ligase to the trehalose phosphorylase gene. These were transformed into Escherichia coli HB101 strain. A plasmid was prepared from a transformant exhibiting trehalose phosphorylase activity and named pJEXOPT2T. A PCR-amplified DNA fragment containing the tryptophanyl tRNA synthetase gene and its neighboring region was obtained using the chromosome of Bacillus subtilis ISW1214 strain as a template and primers N1 (SEQ ID NO: 72) and O1 (SEQ ID NO: 73). Digesting this DNA fragment with restriction enzymes Eco RI, and ligated with pJEXOPT2T previously digested with restriction enzyme Eco RI. This was used to transform E. coli strain HB101. A plasmid was prepared from the obtained transformant and named pJEXOPT2TS. pJEXOPT2TS was used to transform DTS1451 (pDATSK), and selection with tetracycline 7.5 μg / mL regeneration medium was performed. The obtained transformant was inoculated into a regeneration medium containing LB agar medium containing kanamycin and 7.5 μg / mL of tetracycline, and a strain that exhibited trehalose phosphorylase activity and became kanamycin sensitive and tetracycline resistant was designated as DTS1451 (pJEXOPT2TS). Named. DTS1451 (pJEXOPT2TS) in liquid medium (polypeptone S 5%, fish extract 0.5%, yeast extract 0.05%, potassium hydrogenphosphate 0.1%, maltose 4%, magnesium chloride 0.01%, calcium chloride The mixture was stirred and cultured at 30 ° C. for 96 hours at 130 rpm, and the trehalose phosphorylase activity contained in the obtained culture supernatant was measured. As a result, it was confirmed that about 1.2 g of trehalose phosphorylase was produced per liter of the culture solution.

γ−シクロデキストリン合成酵素（γ−ＣＧＴａｓｅ）発現ベクターの具体例。Specific examples of γ-cyclodextrin synthase (γ-CGTase) expression vectors. マルトースホスホリラーゼ発現ベクターの具体例。Specific examples of maltose phosphorylase expression vectors. トレハロースホスホリラーゼ発現ベクターの具体例。Specific examples of trehalose phosphorylase expression vectors.

Claims (29)

γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有し、かつ
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターであって、
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞において用いられる前記組換えベクター。 A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase can be expressed, and a gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase can be expressed A recombinant vector having
The host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is deleted or a host cell having a mutation in which the expression of a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is reduced to such an extent that the host cell cannot grow. Recombinant vector. 下記（ａ）〜（ｃ）の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクター：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子；および
（ｃ）前記（ｂ）の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子。 A recombinant vector having the following base sequences or genes (a) to (c):
(A) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of (a); and (c) directly downstream of the gene of (b) A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase linked to. 下記（ａ）〜（ｄ）の塩基配列または遺伝子を有し、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞において用いられる組換えベクター：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子；
（ｃ）前記（ｂ）の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子；および
（ｄ）発現可能な状態にあるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子。 A host cell having a mutation having a nucleotide sequence or gene of the following (a) to (d) and lacking a chromosomal gene encoding an aminoacyl tRNA synthetase or expressing a chromosomal gene encoding an aminoacyl tRNA synthetase: Recombinant vector used in a host cell having a mutation reduced to such an extent that it cannot grow:
(A) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of (a);
(C) a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase directly linked downstream of the gene of (b); and (D) a gene encoding an aminoacyl tRNA synthetase in an expressible state. アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンｔＲＮＡ合成酵素、グルタメートｔＲＮＡ合成酵素、グリシンｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、リシンｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素、セリルｔＲＮＡ合成酵素、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素、またはバリルｔＲＮＡ合成酵素である、請求項１または３に記載の組換えベクター。   Aminoacyl tRNA synthetase is tryptophanyl tRNA synthetase, alanyl tRNA synthetase, arginyl tRNA synthetase, asparginyl tRNA synthetase, aspartyl tRNA synthetase, cysteinyl tRNA synthetase, glutamine tRNA synthetase, glutamate tRNA synthetase, glycine tRNA synthetase Histidyl tRNA synthetase, isoleucyl tRNA synthetase, leucyl tRNA synthetase, lysine tRNA synthetase, methionyl tRNA synthetase, phenylalanine tRNA synthetase, prolyl tRNA synthetase, seryl tRNA synthetase, threonyl tRNA synthetase, tyrosyl tRNA synthetase Or the recombinant vector according to claim 1 or 3, which is a valyl-tRNA synthetase. γ−シクロデキストリン合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えベクター。   The recombinant vector according to any one of claims 1 to 4, wherein the gene encoding γ-cyclodextrin synthase is a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. マルトースホスホリラーゼをコードする遺伝子が、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えベクター。   The recombinant vector according to any one of claims 1 to 4, wherein the gene encoding maltose phosphorylase is a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子が、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えベクター。   The recombinant vector according to any one of claims 1 to 4, wherein the gene encoding trehalose phosphorylase is a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5. 組換えベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、またはレトロトランスポゾンの形態を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換えベクター。   The recombinant vector according to any one of claims 1 to 7, wherein the recombinant vector has the form of a plasmid, bacteriophage, or retrotransposon. アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞であって、
γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有し、かつ
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターで形質転換して用いられる前記宿主細胞。 A host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is deleted or a host cell having a mutation in which the expression of a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is reduced to such an extent that the host cell cannot grow,
A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase can be expressed, and a gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase can be expressed The host cell which is used after being transformed with a recombinant vector having a certain state. 下記（ａ）〜（ｃ）の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクターで形質転換して用いられる宿主細胞：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子；および
（ｃ）前記（ｂ）の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子。 Host cells used by transformation with a recombinant vector having the following base sequences or genes (a) to (c):
(A) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of (a); and (c) directly downstream of the gene of (b) A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase linked to. アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞であって、
下記（ａ）〜（ｄ）の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクターで形質転換して用いられる前記宿主細胞：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子；
（ｃ）前記（ｂ）の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子；および
（ｄ）発現可能な状態にあるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子。 A host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is deleted or a host cell having a mutation in which the expression of a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is reduced to such an extent that the host cell cannot grow,
The host cell used by being transformed with a recombinant vector having the following base sequences or genes (a) to (d):
(A) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1;
(B) a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of (a);
(C) a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase directly linked downstream of the gene of (b); and (D) a gene encoding an aminoacyl tRNA synthetase in an expressible state. アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンｔＲＮＡ合成酵素、グルタメートｔＲＮＡ合成酵素、グリシンｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、リシンｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素、セリルｔＲＮＡ合成酵素、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素、またはバリルｔＲＮＡ合成酵素である、請求項９または１１に記載の宿主細胞。   Aminoacyl tRNA synthetase is tryptophanyl tRNA synthetase, alanyl tRNA synthetase, arginyl tRNA synthetase, asparginyl tRNA synthetase, aspartyl tRNA synthetase, cysteinyl tRNA synthetase, glutamine tRNA synthetase, glutamate tRNA synthetase, glycine tRNA synthetase Histidyl tRNA synthetase, isoleucyl tRNA synthetase, leucyl tRNA synthetase, lysine tRNA synthetase, methionyl tRNA synthetase, phenylalanine tRNA synthetase, prolyl tRNA synthetase, seryl tRNA synthetase, threonyl tRNA synthetase, tyrosyl tRNA synthetase Or a host cell according to claim 9 or 11, which is a valyl-tRNA synthetase. γ−シクロデキストリン合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の宿主細胞。   The host cell according to any one of claims 9 to 12, wherein the gene encoding γ-cyclodextrin synthase is a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. マルトースホスホリラーゼをコードする遺伝子が、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の宿主細胞。   The host cell according to any one of claims 9 to 12, wherein the gene encoding maltose phosphorylase is a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子が、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の宿主細胞。   The host cell according to any one of claims 9 to 12, wherein the gene encoding trehalose phosphorylase is a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5. 宿主細胞が細菌である請求項９〜１５のいずれか１項に記載の宿主細胞。   The host cell according to any one of claims 9 to 15, wherein the host cell is a bacterium. 細菌がバチルス属細菌である、請求項１６に記載の宿主細胞。   The host cell according to claim 16, wherein the bacterium is a Bacillus bacterium. 下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を有する、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する方法：
（ｉ）γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有し、さらにアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子を発現可能な状態で有する組換えベクターを用意する工程；
（ｉｉ）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞を用意する工程；
（ｉｉｉ）前記宿主細胞を前記組換えベクターで形質転換して形質転換体を得る工程；および
（ｉｖ）前記形質転換体を培養して、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する工程。 A method for producing at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, comprising the following steps (i) to (iv):
(I) a gene capable of expressing a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, and further encoding an aminoacyl-tRNA synthetase Preparing a recombinant vector having a state capable of expressing the gene;
(Ii) a host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is deleted or a host cell having a mutation in which the expression of a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is reduced to such an extent that the host cell cannot grow Preparing step;
(Iii) transforming the host cell with the recombinant vector to obtain a transformant; and (iv) culturing the transformant to produce γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. Producing at least one enzyme selected from the group consisting of: 下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を有する、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する方法：
（ｉ）下記［ａ］〜［ｃ］の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクターを用意する工程、
［ａ］配列番号１に記載の塩基配列、
［ｂ］前記［ａ］の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、および
［ｃ］前記［ｂ］の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子；
（ｉｉ）前記組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を得る工程；および
（ｉｉｉ）前記形質転換体を培養して、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する工程。 A method for producing at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, comprising the following steps (i) to (iii):
(I) a step of preparing a recombinant vector having the following base sequences or genes [a] to [c];
[A] the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
[B] a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 linked directly or indirectly downstream of the base sequence of [a], and [c] directly downstream of the gene of [b] A gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase linked to
(Ii) transforming a host cell with the recombinant vector to obtain a transformant; and (iii) culturing the transformant to comprise γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. Producing at least one enzyme selected from the group. 下記（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を有する、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する方法：
（ｉ）下記［ａ］〜［ｄ］の塩基配列または遺伝子を有する組換えベクターを用意する工程、
［ａ］配列番号１に記載の塩基配列、
［ｂ］前記［ａ］の塩基配列の下流に直接的または間接的に連結された配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、
［ｃ］前記［ｂ］の遺伝子の下流に直接的に連結された、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子、および
［ｄ］発現可能な状態にあるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする遺伝子；
（ｉｉ）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子を欠損させた変異を有する宿主細胞またはアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードする染色体遺伝子の発現を宿主細胞が成育できない程度に低下させた変異を有する宿主細胞を用意する工程；
（ｉｉｉ）前記宿主細胞を前記組換えベクターで形質転換して形質転換体を得る工程；および
（ｉｖ）前記形質転換体を培養して、γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される少なくとも１種の酵素を生産する工程。 A method for producing at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, comprising the following steps (i) to (iv):
(I) a step of preparing a recombinant vector having the following base sequences or genes [a] to [d],
[A] the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
[B] a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 directly or indirectly linked downstream of the base sequence of [a],
[C] a gene encoding at least one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase, directly linked downstream of the gene of [b], and [D] a gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase in an expressible state;
(Ii) a host cell having a mutation in which a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is deleted or a host cell having a mutation in which the expression of a chromosomal gene encoding an aminoacyl-tRNA synthetase is reduced to such an extent that the host cell cannot grow Preparing step;
(Iii) transforming the host cell with the recombinant vector to obtain a transformant; and (iv) culturing the transformant to produce γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase. Producing at least one enzyme selected from the group consisting of: アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が、トリプトファニルｔＲＮＡ合成酵素、アラニルｔＲＮＡ合成酵素、アルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルギニルｔＲＮＡ合成酵素、アスパルチルｔＲＮＡ合成酵素、システイニルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンｔＲＮＡ合成酵素、グルタメートｔＲＮＡ合成酵素、グリシンｔＲＮＡ合成酵素、ヒスチジルｔＲＮＡ合成酵素、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素、ロイシルｔＲＮＡ合成酵素、リシンｔＲＮＡ合成酵素、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素、フェニルアラニンｔＲＮＡ合成酵素、プロリルｔＲＮＡ合成酵素、セリルｔＲＮＡ合成酵素、トレオニルｔＲＮＡ合成酵素、チロシルｔＲＮＡ合成酵素、またはバリルｔＲＮＡ合成酵素である、請求項１８または２０に記載の方法。   Aminoacyl tRNA synthetase is tryptophanyl tRNA synthetase, alanyl tRNA synthetase, arginyl tRNA synthetase, asparginyl tRNA synthetase, aspartyl tRNA synthetase, cysteinyl tRNA synthetase, glutamine tRNA synthetase, glutamate tRNA synthetase, glycine tRNA synthetase Histidyl tRNA synthetase, isoleucine tRNA synthetase, leucyl tRNA synthetase, lysine tRNA synthetase, methionyl tRNA synthetase, phenylalanine tRNA synthetase, prolyl tRNA synthetase, seryl tRNA synthetase, threonyl tRNA synthetase, tyrosyl tRNA synthetase The method according to claim 18 or 20, which is a valyl tRNA synthetase. γ−シクロデキストリン合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 18 to 21, wherein the gene encoding γ-cyclodextrin synthase is a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3. マルトースホスホリラーゼをコードする遺伝子が、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 18 to 21, wherein the gene encoding maltose phosphorylase is a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4. トレハロースホスホリラーゼをコードする遺伝子が、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 18 to 21, wherein the gene encoding trehalose phosphorylase is a gene encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5. 宿主細胞が細菌である請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 18 to 24, wherein the host cell is a bacterium. 細菌がバチルス属細菌である請求項２５に記載の方法。   The method according to claim 25, wherein the bacterium is a Bacillus bacterium. γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される１種の酵素の遺伝子が、前記遺伝子と９５％以上の相同性を有し、かつ、前記選択される酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の組換えベクター。   The gene of one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase has a homology of 95% or more with the gene, and the activity of the selected enzyme The recombinant vector according to any one of claims 5 to 8, which is a gene encoding a protein having γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される１種の酵素の遺伝子が、前記遺伝子と９５％以上の相同性を有し、かつ、前記選択される酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。   The gene of one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase has a homology of 95% or more with the gene, and the activity of the selected enzyme The host cell according to any one of claims 13 to 17, which is a gene encoding a protein comprising γ−シクロデキストリン合成酵素、マルトースホスホリラーゼ、およびトレハロースホスホリラーゼからなる群から選択される１種の酵素の遺伝子が、前記遺伝子と９５％以上の相同性を有し、かつ、前記選択される酵素の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。   The gene of one enzyme selected from the group consisting of γ-cyclodextrin synthase, maltose phosphorylase, and trehalose phosphorylase has a homology of 95% or more with the gene, and the activity of the selected enzyme 27. The method according to any one of claims 22 to 26, which is a gene encoding a protein comprising