JP2008546408A - 異種プロテアーゼを発現させるための方法および組成物 - Google Patents

異種プロテアーゼを発現させるための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、プロテアーゼおよびプロテアーゼ前駆体を自然には発現しない細胞内で、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現させるための方法および組成物を提供する。さらに、本発明は、そのような細胞内で、ウイルス、例えば、インフルエンザウイルスを産生する方法も提供する。また、本発明は、そのような異種プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する細胞内で生育したインフルエンザウイルスの力価を増加させるための方法も提供する。その上、本発明は、本方法および本組成物に有用な、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)からのプロテアーゼも提供する。
【選択図】図６Ｃ

Description

一態様では、本発明は、プロテアーゼおよびプロテアーゼ前駆体を自然には発現しない細胞内で、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現させるための方法および組成物を提供する。別の態様では、本発明は、そのような細胞内で、ウイルス、例えば、インフルエンザウイルスを産生する方法を提供する。別の態様では、本発明は、そのような異種プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する細胞内で生育したインフルエンザウイルスの力価を増加させるための方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、本方法および本組成物に有用な、ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)からの異種プロテアーゼを提供する。
インフルエンザ大流行は、インフルエンザ疾患による罹患率および死亡率の地球的規模での劇的な増加によって定義される。幾つかの要因が組み合わさって大流行の重症度および範囲を調節し、それらの要因には、集団内の低い免疫度およびウイルスがヒトの間で伝染することができる効率が含まれる。後者は、一般的に、ウイルス自体だけでなく、集団の密度ならびにある地域へのおよびそこからの移動の容易さにも左右される。大流行の原因となるウイルスは、一般的に、最近出現した抗原性変異株であり、集団の大部分は、この変異株を以前に体験したことがなく、したがって、それに対する免疫がほとんどまたは全くない。その上、効率的なヒト対ヒトの伝染が、急速な伝播の必要条件であり、動物ウイルスのヒト集団への動物由来感染症の導入の場合には、ウイルスはヒト内で複製するように適応して、効率的に伝染できることが必要になる。
大流行するインフルエンザは、極めて急速に伝播し、壊滅的な影響を及ぼす恐れがある。20世紀の最も猛烈な大流行は、1918年の大流行であり、50万人以上の米国市民および全世界で2千万〜4千万人が死亡した。大流行では、疾患が起伏を示して流行し、発生率のピークが、数週間から数カ月の間隔を置いて現われる場合がある。大流行するインフルエンザの比較的急速な発生および伝播は、この規模の全世界に及ぶ攻撃への応答に対して幾つかの問題を提示し、救急隊員および医療従事者に圧倒的な負担を課す。出現しつつある大流行を迅速に見極め、それに応答することが、明らかに、解決に必要な要素である。稀にヒトに疾患を起こすトリインフルエンザウイルスを含む、インフルエンザウイルスの出現をモニターするための幾つかのプログラムが、現在全世界に設置されている。脅威の可能性を見極め、効果的な応答のためのガイダンスを提供するために、これらの監視データが、あらかじめ設定した大流行の警告レベルと組み合わせて使用される。
ワクチン接種は、インフルエンザの例年の流行によって生じる疾患を予防するための最も重要な公衆衛生の方策である。心配される大流行の見極めと、疾患のレベルの顕著な増加の始まりとの間の短い間隔は、集団の大部分を保護するのに十分なワクチンを生産するにあたって、重大な課題を提示する。次の大流行の出現に先立って、ワクチンの技術および製造の基盤を用意することは、顕著な数の疾患および死亡を緩和するために非常に重要である。「大流行ワクチン(pandemic vaccine)」を生産するのに必要な短い応答期間では、効果的な応答を提供するために、長期の研究および工程開発を行うことは不可能である。
今日まで、米国で市販され入手可能なインフルエンザワクチンは全て、有胚の雌鳥の卵中で増殖させている。インフルエンザワクチンは、雌鳥の卵中で順調に生育するが、ワクチンの生産は、卵の入手可能性いかんによる。あらかじめ次のインフルエンザの季節のために、卵の供給を整え、ワクチン製造のための株を選択しなければならないことから、このアプローチの柔軟性は制限されており、その結果、しばしば生産および配給が遅れたり不足したりする場合がある。残念なことに、2003〜2004年の季節に循環した新型A/Fujian/411/02株等、一部のインフルエンザワクチン株は、有胚の鶏卵中では順調に複製せず、細胞培養によって高価で時間のかかる手順で単離しなければならない。
また、近年になって、細胞培養でインフルエンザウイルスを産生するための系も開発されている(例えば、Furminger. Vaccine Production, in Nicholson et al. (eds) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, in Cohen & Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151を参照)。典型的には、これらの方法では、適切な固定化した宿主細胞を、ウイルスの選択した株に感染させることになる。雌鳥の卵中でのワクチン生産に関連する困難の多くを取り除いても、インフルエンザの病原性株の全てが順調に生育するとは限らないし、それらが確立された組織培養の方法によって産生できるとも限らない。その上、望ましい特徴、例えば、弱毒化、温度感受性および寒冷適応、弱毒化生ワクチン生産適性を有する多くの株は、確立された方法を使用する組織培養では良好に生育していない。
したがって、(1)細胞培養からインフルエンザワクチンを生産するのに必要な製造の施設および手順、ならびに(2)インフルエンザの季節的な流行によって生じる疾患を予防するために、細胞培養からの効果的なワクチンの技術の開発の必要性が存在する。これらの手順および技術は、切迫した大流行の場合には、大流行ワクチンの生産および配給に容易に応用することができる。
細胞培養に基づくインフルエンザワクチンの認可において克服すべき多くの障害の1つとして、新たに形成されたウイルスが生産的に新しい細胞に感染するために、赤血球凝集素(HA)タンパク質を、タンパク質を分解して切断する必要がある。動物に感染する場合、HAタンパク質は、動物に内在するトリプシン様セリンプロテアーゼによって切断される。培養する場合、エンドペプチダーゼ活性は、しばしばインフルエンザウイルスを活発に複製させるには不十分である。したがって、培養細胞を目的のインフルエンザウイルスに感染させた後、しばしばトリプシン等のプロテアーゼを培地に添加して、ウイルスの収率を向上させる。例えば、米国特許第5,698,433号を参照されたい。しかし、外因性のプロテアーゼを細胞培養の培地に添加することは、追加の成分を培地に導入させることになり、より複雑になり、追加の規制審査の必要性が加わる。その上、外因性トリプシンの添加は、細胞培養法を使用してワクチンを作るのに伴うコストを上昇させる。したがって、インフルエンザウイルスを外因性プロテアーゼの添加の必要性なしに培養して生育させるために、新たな方法および組成物が求められている。さらに、そのような方法および組成物は、細胞内で活性のあるプロテアーゼを発現させるのにつきまとう毒性も克服しなければならない。本発明は、これらおよびその他のまだ対処されていない必要性を満たすものである。
本明細書における参考文献の引用または議論は、それらが本発明の先行技術であると認めるものであると解釈してはならない。その上、特許の引用は、その正当性を認めるものであると解釈してはならない。
本発明は、本明細書では、「本発明の細胞」と呼ぶ細胞を提供し、本細胞は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を含み、その結果、本細胞は、当該核酸が存在しない場合に当該細胞内で通常発現するレベルより高いレベルのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、通常は、プロテアーゼもプロテアーゼ前駆体も発現しない。特定の実施形態では、細胞は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を、低いレベルで発現し、その例として、インフルエンザウイルス等のウイルスの培養等、特定の生物学的活動に最適なまたは望ましいレベルより低いレベルがあげられる。特定の態様では、本発明は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を含む細胞を提供し、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸は、細胞のゲノム内に安定に組み込まれる。別の態様では、本発明は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を含む細胞を提供し、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸は、染色体外に維持される。別の態様では、本発明は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を含む細胞を提供し、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸は、細胞内で一過性に発現する。特定の実施形態では、細胞は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を恒常的に発現する。特定の実施形態では、細胞は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を誘導性に発現する。特定の実施形態では、細胞は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を分泌する。特定の実施形態では、細胞は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を細胞のサイトゾル中に発現する。
特定の実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである。特定の実施形態では、セリンプロテアーゼは、S1ファミリーのプロテアーゼである。特定の実施形態では、プロテアーゼは、トリプシンである。特定の実施形態では、セリンプロテアーゼは、細菌のサブチリシンである。特定の実施形態では、プロテアーゼは、ストレプトマイセス・グリセウスからのSPRTである。特定の実施形態では、プロテアーゼは、表1に列挙するプロテアーゼである。特定の実施形態では、プロテアーゼは、プロテアーゼ前駆体である。特定の実施形態では、プロテアーゼ前駆体は、トリプシノーゲンである。特定の実施形態では、プロテアーゼ前駆体は、処理されて活性のあるプロテアーゼになる。
特定の実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、インターフェロンによってまたはインターフェロンが誘導する下流のシグナル分子によって誘導される。特定の実施形態では、誘導性プロモーターは、テトラサイクリン調節性発現系によって誘導される。特定の実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現は、恒常的に活性を示すプロモーターの制御下にある。特定の実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の分泌を指示する分泌シグナルをコードする配列を含む。
特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり約0.1ngから約50μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり約1ngから約50μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり約10ngから約50μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり約100ngから約50μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり約1μgから約50μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり約0.1ngから約5μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり約0.1ngから約100ngのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり約0.1ngから約10ngのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり約0.1ngから約1ngのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する細胞の培養で生育したウイルスの力価を上昇させるのに十分な量のプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の分子量は、当該酵素のプロテアーゼ前駆体の形態に基づいて計算される。特定の実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の分子量は、当該プロテアーゼの成熟した、活性を示す形態に基づいて計算される。
特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり少なくとも約0.1ngのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり少なくとも約1ngのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり少なくとも約10ngのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり少なくとも約100ngのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり少なくとも約1μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり少なくとも約10μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり少なくとも約20μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり少なくとも約30μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり少なくとも約40μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり少なくとも約50μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。
特定の実施形態では、細胞は、細菌細胞である。特定の実施形態では、細菌細胞は、大腸菌(E. coli)細胞である。特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、イヌ細胞である。特定の実施形態では、イヌ細胞は、MDCK細胞である。特定の実施形態では、MDCK細胞は、非腫瘍形成性である。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、霊長類細胞である。特定の実施形態では、霊長類細胞は、アフリカミドリザル細胞またはヒト細胞である。特定の実施形態では、細胞は、鳥類細胞である。特定の実施形態では、鳥類細胞は、ニワトリ細胞である。
別の態様では、本発明は、ウイルスを産生する方法を提供し、本方法は、本発明の細胞をウイルスに感染させるステップ、本細胞をウイルスの複製を可能にする条件下で培養するステップ、およびウイルスを細胞培養から収集するステップを含む。特異的な実施形態では、当該ウイルスは、インフルエンザウイルスである。
別の態様では、本発明は、ウイルスを産生する方法を提供し、本方法は、本発明の細胞にウイルスゲノムを含む核酸をトランスフェクションするステップ、本細胞をウイルスの複製を可能にする条件下で培養するステップ、およびウイルスを細胞培養から収集するステップを含む。特異的な実施形態では、ウイルスゲノムは、インフルエンザゲノムであり、ウイルスはインフルエンザウイルスである。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスは、B型インフルエンザウイルスに相当する。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスは、A型インフルエンザウイルスに相当する。特定の実施形態では、ウイルスは、弱毒化インフルエンザウイルス、寒冷適応インフルエンザウイルス、温度感受性インフルエンザウイルス、またはこれらの望ましい特性のいずれかの組合せを含む。一実施形態では、インフルエンザウイルスは、インフルエンザB/Ann Arbor/1/66株ウイルス、例えば、B/Ann Arbor/1/66の寒冷適応、温度感受性、弱毒化株である。別の実施形態では、インフルエンザウイルスは、インフルエンザA/Ann Arbor/6/60株ウイルス、例えば、A/Ann Arbor/6/60の寒冷適応、温度感受性、弱毒化株である。
特定の実施形態では、本方法は、インフルエンザウイルスを回収するステップおよび当該ウイルスを免疫原性組成物、例えば、ワクチンの調製に使用するステップを含む。一実施形態では、ウイルスは、対象への投与、例えば、鼻腔内投与によって、免疫応答を惹起することができる。幾つかの実施形態では、ワクチンを調製するために使用するウイルスは、投与前に不活性化され、その他の実施形態では、弱毒化生ワクチンが、ワクチンを調製するために使用される。特定の実施形態では、本発明の方法に従って、組換えのA型インフルエンザウイルスおよびB型インフルエンザウイルス、ならびに再集合体のA型インフルエンザウイルスおよびB型インフルエンザウイルスを産生する。一実施形態では、本発明の方法によって産生したウイルスに由来する生ウイルス、不活性化ウイルスまたは不活化ウイルスを含むワクチンを調製する。一実施形態では、本発明の方法によって産生したウイルスを使用して、その他のウイルスを細胞培養または卵中で複製させる。一実施形態では、本発明の方法によって産生したウイルスに由来する免疫原性ポリペプチドを含むワクチンを提供する。
一実施形態では、細胞は、プロテアーゼ前駆体を発現し、本方法は、外因性プロテアーゼを培地に添加するステップをさらに含む。特定の実施形態では、外因性プロテアーゼを、約0.1μg/mlの最大濃度まで添加する。特定の実施形態では、外因性プロテアーゼは、トリプシンである。
特定の実施形態では、ウイルスは、DNAウイルスである。特定の実施形態では、ウイルスは、RNAウイルスである。特定の実施形態では、ウイルスは、一本鎖DNAウイルスである。特定の実施形態では、ウイルスは、二本鎖DNAウイルスである。特定の実施形態では、ウイルスは、ポジティブセンス一本鎖RNAウイルスである。特定の実施形態では、ウイルスは、ネガティブセンスセンス一本鎖RNAウイルスである。特定の実施形態では、ウイルスは、二本鎖RNAウイルスである。特定の実施形態では、ウイルスは、逆転写ウイルスである。
別の態様では、本発明は、インフルエンザウイルスを複製させる方法を提供し、本方法は、本発明の細胞をインフルエンザウイルスに感染させるステップ、本細胞をインフルエンザウイルスの複製を可能にする条件下で培養するステップ、およびインフルエンザウイルスを細胞培養から収集するステップを含む。特定の実施形態では、そのような条件は、外因的に添加するプロテアーゼおよびプロテアーゼ前駆体、例えば、トリプシンおよびトリプシノーゲンを含まない。
さらに別の態様では、本発明は、インフルエンザウイルスを複製させる方法を提供し、本方法は、細胞にインフルエンザゲノムをコードする核酸をトランスフェクションするステップ、本細胞をインフルエンザウイルスの複製を可能にする条件下で培養するステップ、およびインフルエンザウイルスを細胞培養から収集するステップを含む。特定の実施形態では、そのような条件は、外因的に添加するプロテアーゼおよびプロテアーゼ前駆体、例えば、トリプシンおよびトリプシノーゲンを含まない。
特定の実施形態では、細胞が通常は発現しないプロテアーゼ前駆体または酵素活性を示すプロテアーゼを、細胞は発現する。特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、細胞は、鳥類細胞である。特定の実施形態では、細胞は、霊長類細胞、イヌ細胞、ハムスター細胞、マウス細胞またはラット細胞である。特定の実施形態では、細胞は、MDCK細胞である。特定の実施形態では、細胞は、ベロ細胞である。特定の実施形態では、細胞は、ニワトリ細胞である。
さらに別の実施形態では、本発明は、細胞培養で生育したインフルエンザウイルスの力価を上昇させる方法を提供し、本方法は、インフルエンザウイルスを細胞培養で培養するステップを含み、細胞培養の細胞は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現し、当該のプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体は、(i)当該細胞と異種であり、かつ(ii)インフルエンザウイルスの赤血球凝集素を切断し、それによって、異種プロテアーゼおよびプロテアーゼ前駆体を発現しない細胞内でインフルエンザウイルスを培養することよって得た力価と比較して、細胞培養で生育したインフルエンザウイルスの力価を上昇させる。
特定の実施形態では、細胞は、異種プロテアーゼを安定して発現する。特定の実施形態では、細胞は、異種プロテアーゼを恒常的に発現する。特定の実施形態では、細胞は、異種プロテアーゼを誘導性に発現する。特定の実施形態では、異種プロテアーゼは、トリプシンである。特定の実施形態では、細胞は、異種プロテアーゼ前駆体を恒常的に発現する。特定の実施形態では、細胞は、異種プロテアーゼ前駆体を誘導性に発現する。特定の実施形態では、異種プロテアーゼ前駆体は、トリプシノーゲンである。特定の実施形態では、プロテアーゼは、ストレプトマイセス・グリセウスからのSPRTプロテアーゼである。特定の実施形態では、プロテアーゼ前駆体は、ストレプトマイセス・グリセウスからのプレプロSPRTプロテアーゼである。
細胞のウイルス複製を支援する能力の1つの指標は、感染させた細胞の培養から得られるウイルスの収率である。ウイルスの収率は、当業者に周知の多数の方法によって決定することができる。例えば、ウイルスの収率を、感染性ウイルス粒子を測定する50％組織培養感染量(TCID50)アッセイに従って検体中に存在するウイルスの濃度を決定することによって定量化することができる。TCID50値は、しばしばlog10 TCID50/mLとして報告される。一実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞は、インフルエンザウイルス(例えば、ca/ts株)の複製を、少なくとも6.0、または少なくとも6.2、または少なくとも6.4、または少なくとも6.6、または少なくとも6.8、または少なくとも7.0、または少なくとも7.2、または少なくとも7.4、または少なくとも7.6、または少なくとも7.8、または少なくとも8.0、または少なくとも8.2、または少なくとも8.4、または少なくとも8.6、または少なくとも8.8、または少なくとも9.0、または少なくとも9.2、または少なくとも9.4、または少なくとも9.6、または少なくとも9.8のlog10 TCID50/mLまで支援する。特定の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞は、インフルエンザウイルス(例えば、ca/ts株)の複製を、商業的に妥当な力価(>107 Log TCID50/mL)まで支援する。
特定の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価は、異種プロテアーゼを発現せず、かつ外因性のプロテアーゼ、例えば、トリプシンが添加されていない対応する細胞の培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価と比較して、少なくとも約0.1、または少なくとも約0.2、または少なくとも約0.3、または少なくとも約0.4、または少なくとも約0.5、または少なくとも約0.6、または少なくとも約0.7、または少なくとも約0.8、または少なくとも約0.9、または少なくとも約1.0、または少なくとも約1.2、または少なくとも約1.4、または少なくとも約1.6、または少なくとも約1.8、または少なくとも約2.0、または少なくとも約2.2、または少なくとも約2.4、または少なくとも約2.6、または少なくとも約2.6、または少なくとも約2.8、または少なくとも約3.0、または少なくとも約3.2、または少なくとも約3.4、または少なくとも約3.6、または少なくとも約3.8、または少なくとも約4.0、または少なくとも約4.2、または少なくとも約4.4、または少なくとも約4.6、または少なくとも約4.8、または少なくとも約5.0のlog10 TCID50/mLだけ増加する。
特定の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価は、異種プロテアーゼを発現せず、かつ外因性のプロテアーゼ、例えば、トリプシンが添加されていない対応する細胞の培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価と比較して、少なくとも約10％増加する。特定の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価は、少なくとも約25％増加する。特定の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価は、少なくとも約50％増加する。特定の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価は、少なくとも約100％増加する。特定の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価は、少なくとも約500％増加する。特定の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価は、少なくとも約1000％増加する。特定の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価は、少なくとも約5000％増加する。特定の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価は、少なくとも約10,000％増加する。特定の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価は、少なくとも約30,000％増加する。特定の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価は、少なくとも約50,000％増加する。特定の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価は、少なくとも約70,000％増加する。特定の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養液中に産生されるインフルエンザウイルスの力価は、少なくとも約100,000％増加する。
特定の実施形態では、本発明の細胞を培養する細胞培養の培地は、無血清である。特定の実施形態では、本発明の細胞を培養する細胞培養の培地は、血清(例えば、ウシ胎仔血清)を含有する。特定の実施形態では、本発明の細胞を培養する細胞培養の培地は、外因的に添加する動物タンパク質を含有せず、そのような培地は、しばしば「無動物タンパク質」培地または「APF」培地と呼ばれる。特定の実施形態では、本発明の細胞を培養する細胞培養の培地は、外因性のプロテアーゼ(例えば、ブタトリプシン)を含有する。
さらに別の態様では、本発明は、細胞内で異種プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を産生するための方法を提供し、当該細胞は、インフルエンザの複製を支援することができ、本方法は、通常は細胞内で発現しないプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を含む細胞を、当該のプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現を可能にする条件下で培養するステップを含み、それによって、細胞内でプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を産生する。
特定の実施形態では、細胞は、プロテアーゼを発現する。特定の実施形態では、細胞は、プロテアーゼを安定して発現する。特定の実施形態では、細胞は、プロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、プロテアーゼ前駆体を安定して発現する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養の培地中にプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を分泌する。特定の実施形態では、細胞は、細胞培養液1ml当たり約0.1ngから約50μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、細胞は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する細胞の培養で生育したウイルスの力価を増加させるのに十分な量のプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する。特定の実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現は、誘導性である。特定の実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現は、恒常的である。
さらに別の態様では、本発明は、細胞が通常発現しないプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する細胞を作るための方法を提供し、本方法は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現させる効果がある調節因子に操作可能に連結した、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を細胞内に導入する(プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体は、細胞から、分泌または放出される場合もあれば、そうでない場合もある)ステップを含み、それによって、細胞が通常発現しないプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する細胞を作る。
当業者に既知の適切な手法および/またはベクターであればいずれも、制限なく、使用して、細胞内に核酸を導入することができる。特定の実施形態では、核酸を、プラスミド、コスミド、ウイルスベクター、バクテリオファージ、ファージミド、トランスポゾンまたは人工染色体として細胞内に導入する。特定の実施形態では、核酸を、レトロウイルスベクターとして細胞内に導入する。特定の実施形態では、核酸を、細胞内に安定して維持する。その他の実施形態では、核酸を一過性で維持する。
特定の実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸は、選択マーカーをさらに含む。プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を安定して発現する細胞を選択するために選択マーカーを利用する方法は、当業者に既知である。そのような実施形態では、核酸を導入する細胞内で効果があると当業者に知られているいずれかの選択マーカーを使用することができる。したがって、特定の実施形態では、選択マーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。特定の実施形態では、選択マーカーは、細胞内の欠損を補完する、同化経路の遺伝子である。例えば、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を、例えば、あるアミノ酸の合成を欠損した細胞に導入することができる。核酸は、細胞の欠損を補完する遺伝子を含むことができる。細胞を当該アミノ酸を含まない培地中で培養することによって、当該合成遺伝子を含む核酸の存在が選択される。当業者に既知のそのような遺伝子であればいずれも、制限なく、本発明に従って使用することができる。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号1と少なくとも約90％同一である単離核酸を提供する。特定の実施形態では、単離核酸は、配列番号1を含む、あるいは配列番号1からなる。特定の実施形態では、単離核酸は、ハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1(またはその相補配列)をコードする核酸とハイブリダイズする。特定の実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件である。特定の実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件である。
さらに別の態様では、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列を含むまたは配列番号2のアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドを提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列を含むまたは配列番号2のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の核酸を含む発現ベクターを提供する。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の発現ベクターをトランスフェクションした細胞を提供する。
5.1 定義
別途定義しない限り、科学技術用語は全て、関係する分野で通常使用される場合と同一の意味を有するものであると理解する。本発明のために、以下の用語は、以下に定義する。
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「核酸配列」という用語は、一本鎖もしくは二本鎖のデオキシリボヌクレオチドポリマーまたは一本鎖もしくは二本鎖のリボヌクレオチドポリマーあるいはそれらのキメラまたは類似体を指す。本明細書で使用する場合には、自然に存在するヌクレオチドの類似体のポリマーが、自然に存在するヌクレオチドと同様の形態で、一本鎖核酸とハイブリダイズするという点で、自然のヌクレオチドに必須の性質を有する場合、この用語は、所望によりそのようなポリマーも含む(例えば、ペプチド核酸)。別段の記載がない限り、本発明の特定の核酸配列は、明示的に記載する配列に加えて、相補配列も包含する。
「遺伝子」という用語は、生物学的機能に関連する核酸のいずれをも指し、広義に使用される。したがって、遺伝子は、コード配列および/またはコード配列の発現に必要な調節配列を含む。「遺伝子」という用語は、特定のゲノム配列およびそのゲノム配列がコードするcDNAまたはmRNAに適用される。
また、遺伝子は、非発現性の核酸のセグメントも含み、そのようなセグメントは、例えば、その他のタンパク質の認識配列を形成する。非発現性の調節配列は、「プロモーター」および「エンハンサー」を含み、これらには転写因子等の調節タンパク質が結合し、その結果、隣接しているまたは付近の配列の転写が生じる。「組織特異的な」プロモーターまたはエンハンサーは、1種または複数の特異的な組織型または細胞型において転写を調節するプロモーターまたはエンハンサーである。
「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルスベクター、組換え核酸およびcDNAを指す。また、ベクターは、自律的に複製しない、裸のRNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同一の鎖内でDNAおよびRNAの両方からなるポリヌクレオチド、ポリリジン結合DNAまたはポリリジン結合RNA、ペプチド結合DNAまたはペプチド結合RNA、リポソーム結合DNA、あるいはその他であることもできる。最も一般的には、本発明のベクターは、プラスミドである。
「発現ベクター」は、プラスミド等のベクターであり、これは、ベクター内に組み入れた核酸の発現および複製を促進することができる。典型的には、発現させようとする核酸は、プロモーターおよび/またはエンハンサーに「操作可能に連結し」ており、プロモーターおよび/またはエンハンサーによる転写の調節制御を受ける。
「双方向性発現ベクター」は、典型的には、2つの別のプロモーターの間に位置している核酸に対して反対の方向に向かう2つのプロモーターによって特徴付けられ、それによって、発現を両方の方向に向けて開始することができ、その結果、例えば、プラス(+)またはセンス鎖RNAおよびネガティブ(-)またはアンチセンス鎖RNAの両方の転写が生じる。または、双方向性発現ベクターを、アンビセンスベクターとして使用することもでき、この場合、ウイルスmRNAおよびウイルスゲノムRNA(cRNAとして)が、同一の鎖から発現する。
本発明に関しては、「単離」という用語は、自然に存在する環境では、それに通常付随または相互作用する成分を実質的に有しない、核酸またはタンパク質等の生物学的物質を指す。単離物質は、所望により、自然環境では当該物質と共には存在しない物質、例えば、細胞を含む。例えば、当該物質が、細胞等のそれにとって自然な環境中に存在する場合、当該物質は、細胞内のある位置(例えば、ゲノムまたは遺伝因子)であるが、そのような環境に存在する物質にとって自然ではない位置に置かれている。例えば、自然に存在する核酸(例えば、コード配列、プロモーター、エンハンサー等)が、自然に存在しない手段(例えば、プラスミドまたはウイルスベクター等のベクターあるいは単位複製配列)によって、ゲノムのある座位であるが、そのような核酸にとって自然ではない座位に導入される場合、その核酸は、単離されていることになる。また、そのような核酸を、「異種」核酸とも呼ぶ。
「組換えの」という用語は、物質(例えば、核酸またはタンパク質)が、人為的介入によって人工的または合成的(非自然的)に変化していることを示す。変化を、物質の自然の環境または状態内の物質上で起こすこともできるし、物質の自然の環境または状態から取り除くこともできる。具体的には、ウイルス、例えば、インフルエンザウイルスについていえば、ウイルスが組換えの核酸の発現によって産生される場合、このウイルスは組換えである。
「再集合体」（reassortant；リアソータント、合併結合変異）は、ウイルスについていえば、ウイルスが、2種以上のウイルスの親株または源に由来する遺伝子成分および/またはポリペプチド成分を含むことを示す。例えば、7:1再集合体ウイルスは、第1の親ウイルスに由来する7つのウイルスゲノムのセグメント(または遺伝子のセグメント)、および第2の親ウイルスからの単一の補完的なウイルスゲノムのセグメント、例えば、赤血球凝集素またはノイラミニダーゼをコードするセグメントを含む。6:2再集合体ウイルスは、6つのゲノムのセグメント、これは最も一般的には、第1の親ウイルスからの6つの内部遺伝子であり、および異なる親ウイルスからの2つの補完的なセグメント、例えば、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む。
異種または単離核酸についていう「導入した」という用語は、核酸の真核細胞または原核細胞内への組入れを指し、その場合、核酸が、細胞のゲノム(例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアDNA)内に取り込まれる場合、自律的なレプリコンに変換される場合、または一過性に発現する場合(例えば、トランスフェクションしたmRNA)がある。この用語は、「感染」、「トランスフェクション」、「形質転換」および「形質導入」等の方法を含む。本発明に関しては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、脂質の仲介によるトランスフェクション法(リポフェクション法)等を含む、多様な方法を利用して、核酸を原核細胞内に導入することができる。
「宿主細胞」という用語は、ベクター等の異種核酸を含有し、当該核酸の複製および/または発現、さらに、所望により、ポリペプチドおよび/またはウイルスを含む、1種または複数のコードされた産物の産生を支援する細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌等の原核細胞であってもよいし、酵母、昆虫、両生類、鳥類、またはヒトを含む哺乳動物等の真核細胞であってもよい。本発明に関しての例示的な宿主細胞として、ベロ(アフリカミドリザルの腎臓)細胞、Per.C6細胞(ヒト胚性網膜細胞)、BHK(ベビーハムスター腎臓)細胞、初代ニワトリ腎臓(PCK)細胞、メイディン-ダービー-イヌ腎臓(MDCK)細胞、メイディン-ダービー-ウシ腎臓(MDBK)細胞、293細胞(例えば、293T細胞)、およびCOS細胞(例えば、COS1細胞、COS7細胞)があげられる。宿主細胞という用語は、例えば、異なる細胞型または細胞株の混合培養(例えば、ベロ細胞とCEK細胞)を含む、細胞の組合せまたは混合物を包含する。エレクトロポレーションを行ったsfベロ細胞の同時培養が、例えば、2004年12月22日に出願された国際公開第US04/42669号に記載されており、これは、参照によってその全体が本明細書に組み入れられている。
「人工的に操作した」という表現を、本明細書では、ウイルス、ウイルスの核酸またはポリペプチド、ワクチン等のウイルスコード化産物が、部位特異的変異誘発、PCR変異誘発等の組換え法によって導入された、少なくとも1つの変異を含むこと示すために使用する。1つまたは複数のヌクレオチドの変異および/または1つまたは複数のアミノ酸の置換を含むウイルス(またはウイルスの成分もしくは産物)についていう「人工的に操作した」という表現は、ウイルス(またはウイルスの成分もしくは産物)をコードするウイルスゲノムまたはゲノムのセグメントが、自然に存在する源、具体的には、自然に存在する株または以前から存在するウイルスの非組換え法(例えば、25℃における連続継代)によって産生された実験室株、例えば、野性型または寒冷適応のA/Ann Arbor/6/60株またはB/Ann Arbor/1/66株に由来しないことを示す。
「％配列同一性」という用語は、本明細書では、「％同一性」という用語と区別なく使用し、配列アライメントのプログラムを使用して配列を比較した場合の、2つ以上のペプチド配列間のアミノ酸配列の同一性の程度、または2つ以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列の同一性の程度を指す。例えば、本明細書で使用する場合、80％の同一性とは、定義されたアルゴリズムによって決定された配列が80％同一であることと同じことを意味し、所与の配列が別の長さの別の配列と少なくとも80％同一であることを意味する。配列同一性の例示的な程度として、これらに限定されないが、所与の配列と、60、70、80、85、90、95、98％またはそれを超える配列同一性があげられる。
「％配列相同性」という用語は、本明細書では、「％相同性」という用語と区別なく使用し、配列アライメントのプログラムを使用して配列を比較した場合の、2つ以上のペプチド配列間のアミノ酸配列の相同性の程度、または2つ以上のヌクレオチド配列間のヌクレオチド配列の相同性の程度を指す。例えば、本明細書で使用する場合、80％の相同性とは、定義されたアルゴリズムによって決定された配列が80％相同であることと同じことを意味し、したがって、所与の配列の相同体が、当該の所与の配列の長さにわたり80％超の配列相同性を有する。配列相同性の例示的な程度として、これらに限定されないが、所与の配列と、60、70、80、85、90、95、98％またはそれを超える配列相同性があげられる。
2つの配列間の同一性を決定するために使用することができる例示的なコンピュータプログラムとして、これらに限定されないが、一連のBLASTプログラム、例えば、BLASTNおよびBLASTX、ならびにTBLASTX、BLASTPおよびTBLASTNがあげられ、これらは、インターネット上のNCBIのウェブサイトで一般に公開されている。また、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403 10(特に、公開されているデフォルト設定、すなわち、パラメータ: w=4、t=17に関して)、およびAltschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389 3402も参照されたい。配列検索は、所与のアミノ酸配列をGenBank Protein Sequencesおよびその他の公開データベース中のアミノ酸配列と比較して評価する場合、典型的には、BLASTPプログラムを使用して実行する。BLASTXプログラムは、GenBank Protein Sequencesおよびその他の公開データベース中のアミノ酸配列に対して全ての読み枠で翻訳されている核酸配列を検索する場合に好ましい。BLASTPおよびBLASTXの両方は、デフォルトパラメータである11.0のギャップ開始ペナルティおよび1.0のギャップ伸張ペナルティを使用し、BLOSUM-62マトリックスを利用して実行される。同上を参照されたい。
2つ以上の配列間の「％同一性」決定するための、選択された配列の好ましいアライメントは、例えば、10.0のギャップ開始ペナルティおよび0.1のギャップ伸張ペナルティを含む、デフォルトパラメータ、ならびにBLOSUM 30類似性マトリックスを用いて操作されるMacVectorのバージョン6.5中のCLUSTAL-Wプログラムを使用して実行する。
「と特異的にハイブリダイズする」または「特異的ハイブリダイゼーション」または「と選択的にハイブリダイズする」とは、核酸分子が、当該配列が複雑に混ざり合った(例えば、全細胞の)DNAまたはRNA中に存在する場合、ストリンジェントな条件下で、優先的に特定のヌクレオチド配列と結合、二本鎖を形成またはハイブリダイズすることを指す。
「ストリンジェントな条件下」という用語は、プローブが、標的配列とは優先的にハイブリダイズし、かつその他の配列とは、より低い程度でハイブリダイズするか、全くハイブリダイズしない条件を指す。サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験に関する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列に依存し、異なる環境パラメータ下では異なる。核酸のハイブリダイゼーションへの広範な案内が、Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, NY; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 3rd ed., NY;およびAusubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY.に見られる。
一般的に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、定義されたイオン強度およびpHで、特定の配列の融解温度(Tm)より約5℃低くなるように選択される。Tmは、(定義されたイオン強度およびpH下で、)標的配列のうちの50％が、完全に一致するプローブとハイブリダイズする温度である。極めて高度にストリンジェントな条件は、特定のプローブのTmと等しくなるように選択される。
約100個超の相補的な残基を有する相補的な核酸のサザンブロットまたはノーザンブロットのフィルター上でのハイブリダイゼーションの場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の1つの例は、ハイブリダイゼーションを一晩行う場合、42℃で、1mgのへパリンを有する50％ホルマリンである。極めて高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、72℃、0.15M NaCl、約15分間である。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、65℃、0.2×SSC、15分間の洗浄である。SSC緩衝液の説明は、Sambrook et al.を参照されたい。高度にストリンジェントな洗浄の前に、低度にストリンジェントな洗浄を行って、プローブのバックグラウンドシグナルを取り除くことができる。例えば、約100個超のヌクレオチドの二本鎖に対する中等度にストリンジェントな洗浄の例は、45℃、1×SSC、15分間である。例えば、約100個超のヌクレオチドの二本鎖に対する低度にストリンジェントな洗浄の例は、40℃、4〜6×SSC、15分間である。一般的に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、シグナル対ノイズの比が、無関係なプローブについて観察されたシグナル対ノイズの比の2倍(またはそれ以上)である場合、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
本明細書で使用する場合、「約」という用語は、別段の記載がない限り、当該用語によって加減される値を、10％を超えて上回ることもなければ、10％を超えて下回ることもない値を指す。例えば、「約5μg/kg」という用語は、4.5μg/kgから5.5μg/kgの範囲を意味する。別の例として、「約1時間」は、48分から72分の範囲を意味する。
核酸について本明細書で使用する場合、「安定に組み込まれた」という用語は、宿主細胞のゲノムの核酸と組み換えた、したがって、細胞のゲノムの一部となった核酸を指す。安定に組み込まれた核酸が細胞のゲノムの一部として留まっていることを確実にするために、安定に組み込まれた核酸は選択マーカーを含むことができる。安定に組み込まれた核酸は、必ずしも、ゲノム内で、単一の位置に組み込まれて留まる必要はなく、当該核酸は、複数の位置で組み込まれることができ、ゲノム内で、ある位置から別の位置へ移動することができる。
5.2 異種プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する細胞
その表面上に前駆体ヘマグルチニン分子(HA0)を含むインフルエンザウイルスは、細胞と融合し感染を開始させることができない。HA0はタンパク質分解により切断され、HA1およびHA2サブユニットに分離し、その活性形を得るはずである。表面上に成熟HAを有するビリオンは、宿主細胞と活発に融合し感染を開始させる。気道中の細胞を含めたin vivoにおける幾つかの細胞型はHAを活性化させるプロテアーゼを含むが、しかしながら、MDCKを含めたin vitroで使用される多くの細胞型は、HAを効率良く切断することができる活性プロテアーゼを含まない。これらの細胞用に、細胞には負の影響を与えないがHAを切断および活性化することができる濃度で、外来性トリプシンが培養物に加えられている。例えば米国特許第5,698,433号および同5,756,341号を参照のこと。
ブタトリプシンはHAを効率良く活性化させることは示されてきており、この目的のため何人かのインフルエンザ研究者によって日常的に使用されている。以下に記載した実施例中では、例えば、ブタトリプシンまたはトリプシノーゲンを発現する組換え細胞を、例えばMDCK細胞中での、インフルエンザ複製を助長するそれらの能力に関して評価し選択している。
したがって幾つかの実施形態では、組換え系または細胞自体から発現される、活性プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体は、本発明と関係があると企図される。組換え細胞株からのクローンプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現は、動物由来産物を減少させるかあるいは除去することができ、かつプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体はin situでHA分子を最も効率良く切断することができる。あるいは、細胞によって通常発現されない細胞のゲノム中にコードされるプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体は、そのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現の制御を変えることによって発現させることができる。例えば、プロモーター、例えばプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の転写および翻訳を誘導する誘導性プロモーターは、例えばプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現を制御する細胞のゲノムの領域中の相同的組換えによって導入することができる。選択した細胞型を活性化させるプロモーター(および/または他の制御配列)を選択することによって、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を通常発現しない細胞中で、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現させることができる。
非制限的に当業者に知られている、インフルエンザを培養するのに有用であることが知られている任意の細胞を、本発明の細胞を作製するために使用することができる。例えば、インフルエンザウイルスを複製するのに適した宿主細胞には、例えばVero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293T細胞、COS7細胞を含めた293細胞およびCOS細胞がある。さらに、2つ以上の前述の細胞株、例えばMDCK細胞および293TまたはCOS細胞のいずれかを含む同時培養物を例えば1:1の比で使用して、複製効率を改善することができる。このような実施形態では、同時培養細胞の片方または両方が異種プロテアーゼを発現することができる。
5.2.1 細胞によって発現されるプロテアーゼ
HA0インフルエンザタンパク質を切断する際に有用であることが当業者に知られている任意のプロテアーゼを、本発明に従い細胞によって発現させることができる。
幾つかのプロテアーゼは、組換え系から生成される、あるいは細胞、例えばMDCK細胞自体中に工学処理されるそれらの能力によって評価することができる。適切なプロテアーゼおよびプロテアーゼ前駆体にはトリプシン、トリプシノーゲン、およびSPRTがあるが、これらだけには限られない。使用することができる他の例示的なプロテアーゼは、以下の表1中に列挙する。さらに、プロテアーゼの活性断片は、本発明の細胞および方法において使用することもできる。
当業者は通常、個々のプロテアーゼが本発明の細胞および方法において使用するのに適しているかどうか決定することができる。典型的には、このようなアッセイはウイルスタンパク質の切断の評価を含み、このような切断はウイルスのライフサイクル中の重要なステップである。切断は例えば1つの大きなタンパク質からの2つの小さなタンパク質の生成を調べることによって直接、あるいはプロテアーゼの存在下で生じたウイルス力価を調べることによって間接的に評価することができる。例えば、インフルエンザウイルス培養用の細胞および/または方法に適したプロテアーゼは、例えばHA0タンパク質の切断を評価することによって、あるいはプロテアーゼを含む細胞培養物におけるウイルス力価を調べることによって同定することができる。
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5.2.2 プロテアーゼをコードするベクター
細胞中で異種遺伝子を発現させるための、非制限的に当業者に知られている任意の適切な方法を使用して、異種プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現させることができる。典型的には、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を含む組換え核酸構築体は、従来の分子生物学の技法を使用して構築され、次いで構築体は当該の宿主細胞株中に導入される。所望の構築体を含む細胞を同定し、次いでスクリーニングして、所望の濃度まで異種タンパク質を発現する細胞を同定する。各々のこれらの操作を実施するための方法は無数に存在する。
プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、人工染色体およびエピソームベクターだけには限られないが、これらを含めた、この目的に適した多数のベクターが公に入手可能である。それによって構築体を選択しこのようなベクターを使用することができる方法は、当業者によく知られている。このようなベクターは単純なクローニングおよび突然変異誘発に使用することができるが、しかしながら、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を適切な細胞中に導入するときは、遺伝子発現ベクターを使用するべきである。ベクターを選択して、典型的には0.25キロベース(kb)〜40kb以上の長さの任意の望ましい大きさの、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体コード配列を適合させることができる。
ベクターは典型的には、クローニング(または「ポリリンカー」)部位、複製起点および少なくとも1つの選択可能なマーカー遺伝子を含めた、様々な機能要素を含む。さらに、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現させるために、ベクターは典型的には、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸と動作可能に連結するようにクローニング部位の近辺にそれぞれ位置する、エンハンサー要素、プロモーター、転写終了およびシグナル配列の1つまたは複数を有する。
プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体タンパク質の発現は、当技術分野で知られている任意のプロモーターまたはエンハンサー要素によって制御することができる。使用することができる適切なプロモーターには、SV40初期プロモーター領域(Bernoist and Chambon、1981、Nature290: 304〜310)、ラウス肉腫ウイルスの3'の長い末端反復配列中に含まれるプロモーター(Yamamoto、et al.、1980、Cell22: 787〜797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al.、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78: 1441〜1445)、メタロチオネイン遺伝子の制御配列(Brinster et al.、1982、Nature296: 39〜42)、テトラサイクリン(Tet)プロモーター(Gossen et al.、1995、Proc.Nat.Acad.Sci.USA89: 5547〜5551)、またはCMVプロモーター(ヒト即時型初期CMVプロモーターなど)があるが、これらだけには限られない。さらに、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現の一時的制御が望ましい場合、非制限的に当業者に知られている任意の誘導性プロモーターを、本発明に従い使用することができる。例えば、制御要素はインターフェロン応答性誘導性プロモーターまたは制御要素であってよい。例えばLevy et al.、1988、Genes & Devel.2: 383〜393、Reich et al.、1987、P.N.A.S.USA84: 6394〜6398、およびPellegrini et al.、1989、Mol Cell Biol.9: 4605〜4612を参照されたい。ベクターは誘導性であってもよい、何故ならベクターは、ホルモン誘導性を与えることができるグルココルチコイド応答要素(GRE)およびエストロゲン応答要素(ERE)などのホルモン応答要素を含み、ベクターは各ホルモン受容体を有する細胞中での発現に使用されるからである。発現のバックグラウンドレベルを低下させるために、エクジソン受容体と同時発現する、エクジソン、昆虫ホルモンに応答性がある要素を代わりに使用することができる。
ベクターは一般に、1つまたは複数の選択した宿主細胞中でのベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。しかしながら、宿主細胞のゲノム中にベクターを組み込むことを目的とするとき、ベクターは自律的に複製することができる必要はなく、実際、自律的に複製しないことが望ましい。典型的にはこの配列は、宿主染色体DNAとは無関係にベクターの複製を可能にし、複製起点または自律的に複製する配列を含む。様々な細菌、酵母菌、ウイルス、および哺乳動物細胞に関して、このような配列がよく知られている。
プラスミドpBR322からの複製起点は大部分のグラム陰性菌に適しており、2ミクロンのプラスミド起点は酵母菌に適しており、かつ様々なウイルス起点(例えばSV40、アデノウイルス)は、哺乳動物細胞中でベクターをクローニングするのに有用である。一般に複製起点は、COS細胞などの高レベルのDNAを複製することができる哺乳動物細胞中でベクターが使用されない限り、哺乳動物発現ベクターに必要とされない。
有利なことにベクターは、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。この遺伝子は、選択培養培地中で増殖する形質転換宿主細胞の、生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換していない宿主細胞は、培養培地中ではしたがって生存しないはずである。典型的な選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリン、補足栄養不足に対する耐性を与える、あるいは増殖培地中では入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードするベクターは哺乳動物細胞中に導入するのが最も一般的なので、哺乳動物用の選択可能なマーカー、例えばG418耐性遺伝子を有利に使用することができる。
それぞれtk-、hgprt-またはaprt-細胞中で使用することができる、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al.、1977、Cell 11: 223)、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski、1962、Proc.Natl.Acad.Sci.USA48: 2026)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al.、1980、Cell22: 817)遺伝子だけには限られないが、これらを含めた、幾つかの選択系を使用することができる。さらに、メトトレキサートに対する耐性を与えるdhfr(Wigler et al.、1980、Natl.Acad.Sci.USA77: 3567; O'Hare et al.、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.USA78: 1527);マイコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt(Mulligan & Berg、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.USA78: 2072);アミノグリコシドG-418に対する耐性を与えるneo(Colberre-Garapin et al.、1981、J.Mol.Biol.150: 1);およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygro(Santerre et al.、1984、Gene30: 147)遺伝子に関する選択の基準として、代謝拮抗物質耐性を使用することができる。アンピシリン、クラフォラン、ゲンタマイシン、G418、ハイグロマイシン、リファンピシン、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、またはテトラサイクリンに対する耐性を与える遺伝子などの、他の抗生物質耐性遺伝子も選択可能なマーカーとしての用途を見出すことができる。
発現ベクターは典型的には、宿主生物によって認識され当該のコード配列と動作可能に連結したプロモーターを含む。このようなプロモーターは誘導性または構成性であってよい。用語「動作可能に連結した」は、記載する要素がその目的とする形式でそれらが機能することができる関係にある並置を指す。コード配列と「動作可能に連結した」制御配列は、その制御配列と適合性がある条件下でコード配列の発現が実施されるように連結している。
プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードするベクターの構築は、従来の連結技法を使用する。単離ベクターまたはDNA断片を切断し、調整し、必要とされるベクターを作製するのに望ましい形で再度連結させる。望むならば、適切な配列が構築ベクター中に存在することを確認するための分析を、知られている形式で実施することができる。発現ベクターを構築する、in vitro転写産物を調製する、DNAを宿主細胞に導入する、および発現および機能を評価するための分析を実施するのに適した方法は、当業者に知られている。サンプル中の遺伝子配列の存在を検出し、あるいはその増幅および/または発現をDNA、RNAまたはタンパク質のサザンまたはノーザン分析、ウエスタンブロッティング、ドットブロッティング、in situハイブリダイゼーション、核酸またはタンパク質分子の免疫細胞化学または配列分析などの従来法によって定量化する。望むならば当業者は、どのようにしてこれらの方法を改変することができるかを容易に想定するはずである。
アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、当該のプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体コード配列を、アデノウイルス転写/翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三部からなるリーダー配列と連結させることができる。このキメラ遺伝子は、したがってin vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域E1またはE3)中の挿入によって、感染宿主中で生命力がありプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現することができる組換えウイルスが生成するはずである(例えば、Logan & Shenk、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.USA81: 355〜359を参照)。あるいは、プロモーターおよび修飾型ABC輸送ポリペプチドをコードする核酸の側面に位置するハーベーマウス肉腫ウイルス(Ha-MSV)の長い末端反復配列(LTR)を含む、レトロウイルス発現ベクターを使用することができる。レトロウイルスベクターは複製能力があるか、あるいは複製欠陥がある可能性がある。後者の場合、ウイルス増殖は一般に、相補的宿主細胞中でのみ起こるはずである。
人工染色体を使用して、プラスミドまたはレトロウイルスベクター中に含まれそこから発現され得るDNAのより大きな断片を送達することもできる。約6kb〜10Mbの人工染色体を構築し、治療目的の従来の送達法(リポソーム、ポリカチオン性アミノポリマー、または小胞)によって送達することができる(例えば、Harrington、J.J.et al.(1997)Nat.Genet.15: 345〜355を参照)。
特異的開始シグナルが、挿入されるプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体コード配列の有効な翻訳に必要とされる可能性もある。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、挿入体全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは所望のコード配列のリーディングフレームと一致しなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源、天然と合成の両方であってよい。適切な転写エンハンサー要素、転写終了因子などを含ませることによって、発現の有効性を高めることができる(例えば、Bittner et al.、1987、Methods in Enzymol.153: 516〜544を参照)。
幾つかの実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を安定して発現する細胞を提供する。このような細胞株を生成するために、ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御要素(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終了因子、ポリアデニル化部位など)によって制御されるDNA、および選択可能なマーカーで、宿主細胞を形質転換することができる。外来性DNAを導入した後、工学処理細胞は濃縮培地中で1〜2日間増殖させることができ、次いで選択培地に移す。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは選択に対する耐性を与え、細胞がそれらの染色体中にプラスミドを安定して組み込み、増殖して次いでクローニングして細胞株に広げることができる巣を形成するのを可能にする。
5.2.3 異種プロテアーゼを発現する細胞を作製するための方法
プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードするベクターを所望の細胞中に導入するための選択法は、ベクターおよび細胞に典型的には依存するはずである。
核酸を宿主細胞中に導入する形質転換および他の方法(例えば、結合、プロトプラスト形質転換または融合、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技法、高速DNAコーティングペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合)は、当技術分野でよく知られている様々な方法によって実施することができる(例えばAusubel、下記、およびSambrook et al.、下記を参照)。細菌、酵母菌、植物または哺乳動物細胞は、発現ベクター、例えばプラスミド、コスミドなどで形質転換またはトランスフェクションすることができ、発現ベクターは前に記載したように当該の核酸を含む。あるいは、当該の核酸を含むウイルス発現ベクターによって、細胞を感染させることができる。使用する宿主細胞、ベクター、および形質転換の方法に応じて、ポリペプチドの一過的または安定的発現は構成的または誘導的であるはずである。当業者は、前に記載したように、ポリペプチドが一過的または安定的に発現するかどうか、およびタンパク質が構成的または誘導的に発現するかどうかを決定することができるはずである。
哺乳動物細胞はパッケージウイルスベクターによって直接感染させることができ、あるいは化学的または電気的手段によってトランスフェクションすることができる。化学的トランスフェクション用に、DNAをCaPO4と共に沈殿させることができ、あるいはリポソームおよび非リポソーム脂質系物質を使用して導入することができる。CaPO4トランスフェクション用の市販のキットが入手可能であり(CalPhos(商標)哺乳動物トランスフェクション用キット、Clontech Laboratories、Palo Alto、Calif、USA)、脂質介在トランスフェクションは、LIPOFECTAMIN(登録商標)2000、LIPOFECTAMINE(商標)試薬、CELLFECTIN(登録商標)試薬、LIPOFECTIN(登録商標)試薬(Invitrogen、Carlsbad、Calif.、USA)、DOTAPリポソームトランスフェクション試薬、FuGENE6、X-tremeGENEQ2、DOSPER、(Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、Ind.USA)、Effectene(商標)、PolyFect(登録商標)、およびSuperfect(Qiagen、Inc.、Valencia、Calif.、USA)などの市販の試薬を使用して実施することができる。哺乳動物細胞にエレクトロポレーションにより導入するためのプロトコルは、例えばNorton et al.(eds.)、Gene Transfer Methods: Introducing DNA into Living Cells and Organisms、BioTechniques Books、Eaton Publishing Co.(2000)中で見ることができる。他のトランスフェクション技法には、粒子ボンバードメントおよびマイクロインジェクションによるトランスフェクションがある。例えば、Cheng et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(10): 4455〜9(1993); Yang et al、Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(24): 9568〜72(1990)を参照されたい。
5.2.4 異種プロテアーゼを発現する細胞の培養
異種プロテアーゼを発現する細胞は、非制限的に当業者に知られている任意の適切な培養培地中で培養することができる。典型的には、血清(例えば、10％ウシ胎児血清)を補ったダルベッコ改変イーグル培地などの標準的な市販の培養培地中、あるいは中性緩衝pH(例えば、7.0と7.2の間のpH)を維持するのに適した制御湿度およびCO2濃度下において無血清培地中で、細胞を培養する。場合によっては培地は、細菌の増殖を予防するために抗生物質、例えばペニシリン、ストレプトマイシンなど、および/または他の栄養素、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸など、好ましい増殖特性を助長するための他のサプリメント、例えばトリプシン、β-メルカプトエタノールなどを含む。
培養中に哺乳動物細胞を維持するための手順は広く報告されてきており、当業者に知られている。一般的なプロトコルは、例えばFreshney (1983) Culture of Animal Cells: Manual of Basic Technique、Alan R.Liss、New York; Paul(1975) Cell and Tissue Culture、5th ed.、Livingston、Edinburgh; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists、Work and Burdon (eds.) Elsevier、Amsterdam中に与えられている。in vitroでのインフルエンザウイルスの生成における特に興味深い組織培養手順に関する他の詳細には、例えばMerten et al.(1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparationがある。その全容が本明細書に組み込まれる、In Cohen and Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines。さらに、本発明に適合させたこのような手順の変形は、通常の実験によって容易に決定される。
一実施形態では、本発明の細胞を、それらが結合する表面上で接着細胞として培養する。その上で組織培養細胞を増殖することができる接着表面は、当技術分野でよく知られている。接着表面には、ポリスチレンプラスチック修飾表面、タンパク質コーティング表面(例えば、フィブロネクチンおよび/またはコラーゲンコーティングガラス/プラスチック)、ならびに多くの様々な市販のマイクロ担体(例えば、DEAE-デキストランマイクロ担体ビーズ、Dormacell、Pfeifer & Langen; Superbead、Flow Laboratoriesなど;スチレンコポリマー-トリ-メチルアミンビーズ、Hillex、SoloHill、Ann Arborなど)があるが、これらだけには限られない。
一実施形態では、本発明の細胞を、担体無しで懸濁細胞として培養する。担体無しの懸濁液中での増殖に細胞を適合させるための方法は、当技術分野で知られている(例えば、米国特許第6,825,036号および同6,455,298号を参照)。代替的、あるいは場合によっては、本発明の細胞によって発現されるプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体のレベルは、いかなる適合も無しで懸濁液中での細胞の増殖をもたらすように制御することができる。幾つかの実施形態では、本発明の細胞は十分なレベルのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現して、適合無しで懸濁液中において増殖する。他の実施形態では、適合無しで懸濁細胞として増殖する本発明の細胞を、ウイルスの複製に使用する。特定の実施形態では、適合無しで懸濁細胞として増殖する本発明の細胞を、インフルエンザウイルスの複製に使用する。
一実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現により、本発明の細胞は適合無しで懸濁細胞として増殖する。幾つかの実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体はセリンプロテアーゼである。他の実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体はトリプシンまたはトリプシノーゲンである。さらに他の実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体は哺乳動物トリプシンまたはトリプシノーゲンである。さらに他の実施形態では、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体は細菌トリプシンまたはトリプシノーゲンである。
幾つかの実施形態では、懸濁液中で増殖する本発明の細胞によって発現されるプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体のレベルは、細胞培養物1ml当たり約0.1ngと約50μgの間である。他の実施形態では、懸濁液中で増殖する本発明の細胞によって発現されるプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体のレベルは、細胞培養物1ml当たり少なくとも0.1ng、または少なくとも0.5ng、または少なくとも1.0ng、または少なくとも5.0ng、または少なくとも10ng、または少なくとも20ng、または少なくとも30ng、または少なくとも40ng、または少なくとも50ng、または少なくとも60ng、または少なくとも70ng、または少なくとも80ng、または少なくとも90ng、または少なくとも1μg、または少なくとも2μg、または少なくとも5μg、または少なくとも10μg、または少なくとも20μg、または少なくとも30μg、または少なくとも40μg、または少なくとも50μgである。
インフルエンザウイルスを生成するための細胞は、血清含有または無血清培地中で培養することができる。例えば精製ウイルスの調製に関する幾つかの場合、無血清条件で宿主細胞を増殖させることが望ましい。適切な無血清培地は、それぞれその全容が参照によって本明細書に組み込まれる、2004年12月23日に出願された米国仮出願第60/638,166号、2005年1月5日に出願された米国仮出願第60/641,139号、および2005年12月16日に出願された米国特許出願第11/304,589号中に記載されている。
組織培養用途において血清または動物性抽出物の使用が、幾つかの欠点を有し得ることは、当業者によって理解されるはずである(Lambert、K.J.et al.、In: Animal Cell Biotechnology、Vol 1、Spier、R.E.et al.、Eds.、Academic Pres New York、pp.85〜122(1985))。例えば、これらのサプリメントの化学組成は、1つの製造者からのものでさえロット間で変わる可能性がある。さらに、動物またはヒト起源のサプリメントは、外来物質(例えば、マイコプラズマ、ウイルス、およびプリオン)で汚染される可能性もある。これらの汚染サプリメントを細胞培養培地配合物において使用するとき、これらの物質は培養細胞の健康状態をひどく害する可能性がある。さらに、外来物質で汚染された培養物中で生成される物質を細胞療法および他の臨床用途において使用するとき、これらの物質は健康上の危険を呈する可能性がある。主な脅威は、動物において海綿状脳症およびヒトにおいてクロイツフェルト-ヤコブ病を引き起こすプリオンの存在である。したがって、幾つかの実施形態では、培養培地は完全に無血清である。有利なことに、培養培地は動物産物を完全に含まないことができる。したがって、幾つかの実施形態では、培養培地は動物性タンパク質を含まない(APF)。幾つかの実施形態では、外来動物由来のプロテアーゼを培養培地に加えることはない。幾つかの実施形態では、動物由来の産物を培養培地に加えることはない。具体的な培地配合は、例えば2005年12月16日に出願された米国特許出願第11/304,589号中に開示されている。
細胞は小規模で、例えば25ml未満の培地、培養チューブまたはフラスコ中、あるいは攪拌しながら大きなフラスコ中、回転ボトル中、あるいはマイクロ担体ビーズ(例えば、DEAE-デキストランマイクロ担体ビーズ、Dormacell、Pfeifer & Langen; Superbead、Flow Laboratoriesなど;スチレンコポリマー-トリ-メチルアミンビーズ、Hillex、SoloHill、Ann Arborなど)上、フラスコ、ボトルまたはリアクター培養器中で培養することができる。マイクロ担体ビーズは、細胞培養体積当たりの接着細胞の増殖用の大きな表面積を与える小さな球体(直径100〜200ミクロンの範囲)である。例えば1リットルの培地は、8000平方センチメートルを超える増殖表面を与える2千万個を超えるマイクロ担体ビーズを含むことができる。ウイルスの工業生産用に、例えばワクチン生産用に、バイオリアクターまたは発酵槽中で細胞を培養することが、しばしば望ましい。バイオリアクター、例えばCyto3バイオリアクター(Osmonics、Minnetonka、MN);NBSバイオリアクター(New Brunswick Scientific、Edison、N.J.);B.Braun Biotech International(B.Braun Biotech、Melsungen、ドイツ)からの研究室および工業規模のバイオリアクターを1リットル未満から100リットルを超える体積で利用可能である。
培養体積とは無関係に、幾つかの実施形態では、培養物を35℃以下の温度に保って、ある程度低温適応している組換えおよび/または再集合体インフルエンザウイルスの有効な回収を確実にすることが重要である。例えば、幾つかの実施形態では、約32℃と35℃の間の温度、典型的には約32℃と約34℃の間の温度、通常は約33℃で細胞を培養する。
典型的には、レギュレーター、例えばサーモスタット、または細胞培養系の温度を検知および維持するための他のデバイスを使用して、ウイルス複製の期間中に温度が35℃を超えないことを確実にすることができる。
5.3 ストレプトミセスグリセウス(Streptoinyces griseus)由来のSPRTプロテアーゼ
前に記載したプロテアーゼ以外に、本発明はSPRTという名称の新規の細菌プロテアーゼを提供する。このプロテアーゼをコードする遺伝子を、以下の実施例中に記載したようにストレプトミセスグリセウスからクローニングした。前に記載したように、SPRTプロテアーゼはウイルス培養用に使用する細胞中で発現させるのに適している。
sprT遺伝子のヌクレオチド配列は図9(配列番号1)として表し、一方SPRTプロテアーゼのアミノ酸配列は図10(配列番号2)として表す。sprT遺伝子をコードする元の核酸以外に、sprT遺伝子の核酸配列と相同的な配列をコードする核酸も本発明によって企図される。したがって幾つかの実施形態では、本発明は図9の核酸配列と約99％、約95％、約90％、約85％、約80％、約75％、約70％、約65％、約60％、約55％、または約50％同一であるヌクレオチド配列をコードする核酸を提供する。他の態様では本発明は、図9の核酸配列によってコードされるポリペプチドの配列と約99％、約95％、約90％、約85％、約80％、約75％、約70％、約65％、約60％、約55％、または約50％同一である配列を有するポリペプチドをコードする核酸を提供する。
他の実施形態では本発明は、図9として表すヌクレオチド配列を含む(あるいは表1のポリペプチドをコードする)核酸とハイブリダイズする核酸を提供する。幾つかの実施形態では、核酸は定義したハイブリダイゼーション条件下で、図9として表すヌクレオチド配列を含む核酸とハイブリダイズする。幾つかの実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は厳格なハイブリダイゼーション条件である。幾つかの実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は非常に厳格なハイブリダイゼーション条件である。
さらに、本発明の核酸は、SPRTプロテアーゼをコードする核酸の誘導体型も含む。非制限的に当業者に知られている任意の方法によって、このような誘導体を作製することができる。例えば、核酸の1、2、3、5、10個あるいはそれより多くのヌクレオチドの置換、挿入、または欠失を含めた部位特異的突然変異誘発によって誘導体を作製することができる。あるいは、ランダムな突然変異誘発によって誘導体を作製することができる。核酸をランダムに突然変異誘発するための1つの方法は、0.1mMのMnCl2および非平衡ヌクレオチド濃度の存在下でPCR反応において核酸を増幅させることを含む。これらの条件はPCR反応中使用されるポリメラーゼの誤った取り込み率を増大させ、増幅した核酸のランダムな突然変異誘発をもたらす。
幾つかの実施形態では、SPRTプロテアーゼの誘導体をコードする誘導体核酸は、本明細書に記載する野生型酵素と比較して改善された性質を有する。例えば、幾つかの実施形態では、誘導体核酸は、野生型酵素より大きな活性、例えば大きな特異的活性を有する誘導体SPRTプロテアーゼをコードする。幾つかの実施形態では、誘導体SPRTプロテアーゼは、野生型プロテアーゼと比較してSPRTプロテアーゼの分泌を増大させる誘導体分泌シグナルを有する可能性がある。幾つかの実施形態では、誘導体SPRTプロテアーゼは、野生型プロテアーゼと比較してSPRTプロテアーゼからのプレプロペプチドの切断を増大させる、誘導体プレプロペプチド配列を有する可能性がある。幾つかの実施形態では、誘導体SPRTプロテアーゼは、野生型プロテアーゼのpHと異なるpHで最大の活性を示す。幾つかの実施形態ではpHは、ウイルス、例えばインフルエンザウイルスを培養するのに好ましいpHである。
他の態様では本発明は、SPRTポリペプチドを提供する。幾つかの実施形態では、SPRTポリペプチドのアミノ酸配列は、図10のアミノ酸配列と少なくとも約99％、約95％、約90％、約85％、約80％、約75％、約70％、約65％、約60％、約55％、または約50％同一である。他の態様では本発明は、表1のアミノ酸配列と少なくとも約99％、約95％、約90％、約85％、約80％、約75％、約70％、約65％、約60％、約55％、または約50％同一であるポリペプチドのアミノ酸配列を有するタンパク質を提供する。さらに本発明は、本発明のSPRTポリペプチドまたはプロテアーゼの活性断片を提供する。幾つかの実施形態では、活性断片はプロテアーゼ活性を保ちながら、図10(または表1)のアミノ酸配列から選択される少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、または320の隣接アミノ酸を含む。当業者は通常、例えば従来の技法を使用して、断片を発現させることおよびプロテアーゼ活性を試験することによって、このような活性断片を同定することができる。
したがって、他の態様では本発明は、配列番号2(または表1)の成熟ポリペプチドの1つまたは複数のアミノ酸;またはその相同的配列の保存的置換、欠失、および/または挿入を含む人工変異体に関する。特定の実施形態では、アミノ酸の変化はわずかな性質のものであり、それはタンパク質のフォールディングおよび/または活性に著しく影響を与えない保存的アミノ酸置換または挿入;典型的には1〜約30アミノ酸の小さな欠失;アミノ-末端メチオニン残基などの小さなアミノ-またはカルボキシル-末端延長;約20〜25残基までの小さなリンカーペプチド;または純電荷または他の機能を変えることによる精製を容易にする小さな延長部分、ポリ-ヒスチジン部分、抗原エピトープまたは結合ドメインなどである。
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸(アルギニン、リシンおよびヒスチジン)、酸性アミノ酸(グルタミン酸およびアスパラギン酸)、極性アミノ酸(グルタミンおよびアスパラギン)、疎水性アミノ酸(ロイシン、イソロイシンおよびバリン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン)、および小さなアミノ酸(グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン)の群内である。特異的活性を一般に変えないアミノ酸置換は当技術分野で知られており、例えばH.Neurath and R.L.Hill、1979、In、The Proteins、Academic Press、ニューヨークによって記載されている。最も一般的に起こる交換はAla/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、およびAsp/Glyである。
20の標準アミノ酸以外に、非標準アミノ酸(4-ヒドロキシプロリン、6-M-メチルリシン、2-アミノイソ酪酸、イソバリン、およびα-メチルセリンなど)は、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基と置換することができる。限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝コードによってコードされていないアミノ酸、および非天然アミノ酸はアミノ酸残基を置換することができる。「非天然アミノ酸」はタンパク質合成後に修飾されている、かつ/あるいは標準アミノ酸のそれとは異なる化学構造をそれらの側鎖中に有する。非天然アミノ酸は化学合成することができ、市販されており、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-および4-メチルプロリン、および3,3-ジメチルプロリンを含む。
あるいは、アミノ酸の変化は、ポリペプチドの物理化学的性質が変わるような性質のものである。例えば、アミノ酸の変化はポリペプチドの熱安定性を改善し、基質特異性を変え、pH最適値などを変える可能性がある。
親ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発(Cunningham and Wells、1989、Science244: 1081〜1085)などの、当技術分野で知られている手順に従い同定することができる。後者の技法では、1つのアラニン突然変異体を分子中の各残基に導入し、生成した突然変異分子を生物活性(すなわち、リパーゼ活性)に関して試験して、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定する。Hilton et al.、1996、J.Biol.Chem.271: 4699〜4708も参照されたい。酵素または他の生物学的相互作用の活性部位は、推定接触部位のアミノ酸の突然変異に関する核磁気共鳴、結晶学、電子回析、または光親和性標識などの技法によって決定される、構造の物理的分析によって決定することもできる。例えばde Vos et al.、1992、Science255: 306〜312; Smith et al.、1992、J.Mol.Biol.224: 899〜904; Wlodaver et al.、1992、FEBS Lett.309: 59〜64を参照されたい。必須アミノ酸の同一性は、本発明によるポリペプチドと関係があるポリペプチドとの同一性の分析から推測することもできる。
1つまたは複数のアミノ酸置換は、Reidhaar-Olson and Sauer、1988、Science241: 53〜57; Bowie and Sauer、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA86: 2152〜2156; WO95/17413;またはWO95/22625によって開示された方法などの、突然変異誘発、組換え、および/またはシャッフリングの知られている方法、次に関連スクリーニング手順を使用して作製し試験することができる。使用することができる他の方法には、誤りがちなPCR、ファージディスプレー(例えば、Lowman et al.、1991、Biochem.30: 10832〜10837;米国特許第5,223,409号;WO92/06204)、および部位特異的突然変異誘発(Derbyshire et al.、1986、Gene46: 145; Ner et al.、1988、DNA7: 127)がある。
突然変異誘発/シャッフリング法を高スループット、自動スクリーニング法と組み合わせて、宿主細胞によって発現されるクローニング、突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出することができる(Ness et al.、1999、Nature Biotechnology17: 893〜896)。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発DNA分子を宿主細胞から回収し、当技術分野の標準的な方法を使用して直ぐに塩基配列を決定することができる。これらの方法は当該のポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性を直ぐに決定することができ、未知の構造のポリペプチドに適用することができる。
5.4 発現ベクター
さらに他の態様では、本発明は、本発明のSPRTプロテアーゼまたは他のプロテアーゼ(例えば表1参照)を発現させるための発現ベクターを提供する。一般に発現ベクターは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と動作可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチド分子である。発現ベクターは適切なプロモーター、複製配列、選択可能なマーカーなどを封入することによって原核生物または真核生物における機能に容易に適合させて、mRNAの安定した転写および翻訳をもたらすことができる。発現ベクターを構築するため、および発現ベクターを含む細胞中で遺伝子を発現させるための技法は、当技術分野でよく知られている。例えば、Sambrook et al.、2001、Molecular Cloning--A Laboratory Manual、3rd edition、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、およびAusubel et al.、eds.、Current Edition、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、NYを参照されたい。
発現ベクター中で使用するのに有用なプロモーターには、メタロチオネインプロモーター、構成性アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタソン誘導性MMTVプロモーター、SV40プロモーター、MRPpolIIIプロモーター、構成性MPSVプロモーター、テトラサイクリン誘導性CMVプロモーター(ヒト即時型初期CMVプロモーターなど)、構成性CMVプロモーター、およびインターフェロン応答性プロモーターがあるが、これらだけには限られない。
発現ベクターは、SPRTプロテアーゼがその中で発現される細胞と適合性がある、発現および複製シグナルを含まなければならない。適切な発現ベクターには、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスなどのウイルスベクター、プラスミドベクター、コスミドなどがあるが、これらだけには限られない。ウイルスおよびプラスミドベクターは、発現ベクターを哺乳動物細胞中にトランスフェクションするのに好ましい。例えば、発現制御配列がCMVプロモーターを含む発現ベクターpcDNAI(Invitrogen、サンディエゴ、CA)は、このような細胞中の優れたトランスフェクション率および発現率をもたらす。使用することができる発現ベクターの他の例は、以下の実施例中に与える。
発現ベクターは、非制限的に当業者に知られている任意の方法によって細胞中に導入することができる。このような方法には、例えば溶液からの細胞による分子の直接的取り込み;例えばリポソームまたはイムノリポソームを使用するリポフェクションによる容易な取り込み;粒子介在トランスフェクションなどがあるが、これらだけには限られない。例えば、米国特許第5,272,065号; Goeddel et al.、eds、1990、Methods in Enzymology、vol.185、Academic Press、Inc.、CA; Krieger、1990、Gene Transfer and Expression--A Laboratory Manual、Stockton Press、NY; Sambrook et al.、1989、Molecular Cloning--A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、NY;およびAusubel et al.、eds.、Current Edition、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience、NYを参照されたい。
発現ベクターは、送達構築体の単離を簡単にする精製成分も含むことができる。例えば、例えば6個のヒスチジン残基のポリヒスチジン成分を、タンパク質のアミノ末端に取り込ませることができる。ポリヒスチジン成分は、ニッケル-キレートクロマトグラフィーによる1ステップのタンパク質の好都合な単離を可能にする。幾つかの実施形態では、精製後に送達構築体の残り部分から、精製成分を切断することができる。他の実施形態では、成分は送達構築体の機能性ドメインの機能に干渉せず、したがって切断する必要はない。
5.5 核酸およびタンパク質を操作するための他の方法
本発明の文脈では、ウイルス核酸、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸などを含めた核酸は、よく知られている分子生物学の技法に従って操作することができる。増幅、クローニング、突然変異誘発、形質転換などを含めた多数のこのような手順に関する詳細なプロトコルは、例えばAusubel et al.Current Protocols in Molecular Biology (2006年中に増刊) John Wiley & Sons、ニューヨーク(「Ausubel」); Sambrook et al. Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3rd Ed.)、Vol. 1〜3、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、2001(「Sambrook」)、およびBerger and Kimmel Guide to Molecular Cloning Techniques、Methods in Enzymology volume152、Academic Press、Inc.、サンディエゴ、CA(「Berger」)中に記載されている。
前述の参照文献以外に、例えば本発明のcDNAプローブを増幅させるのに有用である、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Qβ-レプリカーゼ増幅、および他のRNAポリメラーゼ介在技法(例えば、NASBA)などのin vitro増幅技法に関するプロトコルは、Mullis et al.(1987)米国特許第4,683,202号; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. サンディエゴ、CA (1990)(「Innis」); Arnheim and Levinson (1990) C&EN36; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81; Kwoh et al.(1989) Proc Natl Acad Sci USA86、1173; Guatelli et al.(1990) Proc Natl Acad Sci USA87: 1874; Lomell et al.(1989) J Clin Chem35: 1826; Landegren et al.(1988) Science241:1077; Van Brunt (1990) Biotechnology8: 291; Wu and Wallace (1989) Gene 4: 560; Barringer et al.(1990) Gene89: 117、およびSooknanan and Malek (1995) Biotechnology13: 563中で見られる。本発明の文脈で核酸をクローニングするのに有用な他の方法は、Wallace et alの米国特許第5,426,039号を含む。PCRによって大きな核酸を増幅する改良法は、Cheng et al.(1994) Nature369: 684およびその中の参照文献中に要約されている。
本発明の幾つかのポリヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチドは、モノヌクレオチドおよび/またはトリヌクレオチド系ホスホラミダイトカップリング化学技法を含めた様々な固相戦略を使用して合成することができる。例えば、活性化モノマーおよび/またはトリマーを延長しているポリヌクレオチド鎖に連続的に加えることによって、核酸配列を合成することができる。例えば、Caruthers、M.H.et al.(1992) Meth Enzymol211:3を参照されたい。
所望の配列を合成する代わりに、The Midland Certified Reagent Company、The Great American Gene Company、ExpressGen、Inc.、Operon Technologies、Inc.、および他の多くなどの任意の様々な市販の供給源から、ほぼ全ての核酸を特注することができる。
さらに、ウイルスポリペプチド、プロテアーゼ、またはプロテアーゼ前駆体中の選択したアミノ酸残基の置換は、例えば部位特異的突然変異誘発によって実施することができる。例えば、望ましい表現型特性、例えば弱化表現型、低温適応、温度感受性、特定のプロテアーゼによる切断などと機能上関係があるアミノ酸置換を有するウイルスポリペプチドは、ポリペプチドをコードするウイルス核酸セグメントに特異的突然変異を導入することによって生成することができる。部位特異的突然変異誘発のための方法は当技術分野でよく知られており、例えばAusubel、Sambrook、およびBerger、上記中に記載されている。部位特異的突然変異誘発を実施するための多数のキット、例えばChameleon部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene、La Jolla)が市販されており、製造者の教示書に従い使用して、例えば1つまたは複数のアミノ酸置換をインフルエンザAまたはBポリペプチドをそれぞれコードするゲノムセグメント中、あるいはプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸中に導入することができる。
5.6 インフルエンザを培養するための異種プロテアーゼを発現する細胞の使用
細胞培養中にインフルエンザウイルスを複製するための方法は、当業者に知られている(「異種プロテアーゼを発現する細胞の培養」という表題のセクション、上記を参照)。典型的にはこれらの方法は、選択したウイルスの菌株で適切な宿主細胞を感染させることを含む。あるいは、組換え法を使用してウイルスゲノムを宿主に導入する(例えば、「プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する宿主細胞中のインフルエンザゲノムベクター」という表題のセクション中で詳細に述べるプラスミドレスキュー、下記)。前で広く論じたように、典型的には外来性プロテアーゼが培養培地に加えられて、HAOタンパク質を効率良く切断するプロテアーゼを発現しない細胞に関する細胞培養において、インフルエンザウイルスが効率良く生成されている(例えば、Appleyard、et al.、1974、J.Gen Virol.25: 351〜357;米国特許第5,824,536号;同4,500,513号;および特許公開WO96/15232を参照)。本発明の目的の1つは、異種プロテアーゼを発現する細胞を提供してインフルエンザを複製することであり、特定の実施形態では、インフルエンザ感染の有効性を改善して細胞培養中のウイルス力価を高めることである。
したがって、幾つかの実施形態では、外来性プロテアーゼ、例えばブタトリプシンは、ウイルス、例えばインフルエンザウイルスを複製させる細胞培養培地に加えない。幾つかの実施形態では、外来性プロテアーゼを含まない異種プロテアーゼを発現する細胞培養物から生じるインフルエンザウイルスの力価は、外来性プロテアーゼを加えた異種プロテアーゼを発現しない細胞培養物から得られるはずである力価と等しいかあるいはほぼ等しい。他の実施形態では、外来性プロテアーゼを含まない異種プロテアーゼを発現する細胞培養物から生じるインフルエンザウイルスの力価は、外来性プロテアーゼを加えた異種プロテアーゼを発現しない細胞培養物から得られるはずである力価より大きい。さらに他の実施形態では、異種プロテアーゼを発現する細胞培養物は、市販用の妥当な力価(>107LogTCID50/mL)までインフルエンザウイルスを増殖させることができる。
さらに他の実施形態では、外来性プロテアーゼ、例えばブタトリプシンまたはSPRTプロテアーゼを、ウイルス、例えばインフルエンザウイルスを複製させる本発明の細胞を含む細胞培養物に加えることができる。このような実施形態は、低レベル、例えば市販用の妥当な力価までウイルスを増殖させるのに不十分なレベルで、プロテアーゼを発現する本発明の細胞中でウイルスを培養するのに、例えば有用である。このような実施形態は、本発明の細胞がタンパク質分解による切断によって活性化されるプロテアーゼ前駆体を発現する方法においてさらに有用である。
一実施形態では、培養細胞中でのネガティブ鎖RNAウイルスの感染性ウイルス粒子の生成法を提供し、この場合外来性プロテアーゼ、例えばトリプシンは細胞培養培地に加えない。特定の実施形態では、細胞群中で少なくとも約6.0、または少なくとも6.2、または少なくとも6.4、または少なくとも6.6、または少なくとも6.8、または少なくとも7.0、または少なくとも7.2、または少なくとも7.4、または少なくとも7.6、または少なくとも7.8、または少なくとも8.0、または少なくとも8.2、または少なくとも8.4、または少なくとも8.6、または少なくとも8.8、または少なくとも9.0、または少なくとも9.2、または少なくとも9.4、または少なくとも9.6、または少なくとも9.8の力価(log10TCID50/mL)までネガティブ鎖RNAウイルスを複製する方法を提供し、この場合外来性プロテアーゼは細胞培養培地に加えない。
幾つかの実施形態では、外来性プロテアーゼを含まない異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養物から生じるインフルエンザウイルスの力価(log10TCID50/mL)は、少なくとも6.0、または少なくとも6.2、または少なくとも6.4、または少なくとも6.6、または少なくとも6.8、または少なくとも7.0、または少なくとも7.2、または少なくとも7.4、または少なくとも7.6、または少なくとも7.8、または少なくとも8.0、または少なくとも8.2、または少なくとも8.4、または少なくとも8.6、または少なくとも8.8、または少なくとも9.0、または少なくとも9.2、または少なくとも9.4、または少なくとも9.6、または少なくとも9.8である。
特定の実施形態では、外来性プロテアーゼを含まない異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養物から生じるインフルエンザウイルスの力価は、異種プロテアーゼを発現せず外来性プロテアーゼ、例えばトリプシンが加えられていない対応する細胞の培養中に生成したインフルエンザウイルスの力価より、少なくとも約0.1、または少なくとも約0.2、または少なくとも約0.3、または少なくとも約0.4、または少なくとも約0.5、または少なくとも約0.6、または少なくとも約0.7、または少なくとも約0.8、または少なくとも約0.9、または少なくとも約1.0、または少なくとも約1.2、または少なくとも約1.4、または少なくとも約1.6、または少なくとも約1.8、または少なくとも約2.0、または少なくとも約2.2、または少なくとも約2.4、または少なくとも約2.6、または少なくとも約2.6、または少なくとも約2.8、または少なくとも約3.0、または少なくとも約3.2、または少なくとも約3.4、または少なくとも約3.6、または少なくとも約3.8、または少なくとも約4.0、または少なくとも約4.2、または少なくとも約4.4、または少なくとも約4.6、または少なくとも約4.8、または少なくとも約5.0大きいlog10TCID50/mLを有する。
他の実施形態では、他の場合に細胞培養培地に加えるはずである少量のプロテアーゼを、細胞培養培地に加えることができる。したがって、幾つかの実施形態では、培養細胞中でのネガティブ鎖RNAウイルスの感染性ウイルス粒子の生成法を提供し、この場合最小量の外来性プロテアーゼ、例えばトリプシンを細胞培養培地に加える。特定の実施形態では、細胞群中で少なくとも約6.0、または少なくとも6.2、または少なくとも6.4、または少なくとも6.6、または少なくとも6.8、または少なくとも7.0、または少なくとも7.2、または少なくとも7.4、または少なくとも7.6、または少なくとも7.8、または少なくとも8.0、または少なくとも8.2、または少なくとも8.4、または少なくとも8.6、または少なくとも8.8、または少なくとも9.0、または少なくとも9.2、または少なくとも9.4、または少なくとも9.6、または少なくとも9.8の力価(log10TCID50/mL)までネガティブ鎖RNAウイルスを複製する方法を提供し、この場合約0.1ng/ml〜約100μg/mlの外来性プロテアーゼを細胞培養培地に加える。
他の特定の実施形態では、細胞群中で少なくとも約6.0、または少なくとも6.2、または少なくとも6.4、または少なくとも6.6、または少なくとも6.8、または少なくとも7.0、または少なくとも7.2、または少なくとも7.4、または少なくとも7.6、または少なくとも7.8、または少なくとも8.0、または少なくとも8.2、または少なくとも8.4、または少なくとも8.6、または少なくとも8.8、または少なくとも9.0、または少なくとも9.2、または少なくとも9.4、または少なくとも9.6、または少なくとも9.8の力価(log10TCID50/mL)までネガティブ鎖RNAウイルスを複製する方法を提供し、この場合約1mU/ml〜約5000mU/mlの外来性プロテアーゼを細胞培養培地に加える。
さらに他の実施形態では、約0.1ng/ml〜約100μg/mlの外来性プロテアーゼを加えた異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養物から生じる、インフルエンザウイルスの力価(log10TCID50/mL)は、少なくとも6.0、または少なくとも6.2、または少なくとも6.4、または少なくとも6.6、または少なくとも6.8、または少なくとも7.0、または少なくとも7.2、または少なくとも7.4、または少なくとも7.6、または少なくとも7.8、または少なくとも8.0、または少なくとも8.2、または少なくとも8.4、または少なくとも8.6、または少なくとも8.8、または少なくとも9.0、または少なくとも9.2、または少なくとも9.4、または少なくとも9.6、または少なくとも9.8である。特定の実施形態では、約0.1ng/ml〜約10μg/mlの外来性プロテアーゼを加えた異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養物から生じる、インフルエンザウイルスの力価(log10TCID50/mL)は、少なくとも7.0、または少なくとも7.2、または少なくとも7.4、または少なくとも7.6、または少なくとも7.8、または少なくとも8.0、または少なくとも8.2、または少なくとも8.4、または少なくとも8.6、または少なくとも8.8、または少なくとも9.0、または少なくとも9.2、または少なくとも9.4、または少なくとも9.6、または少なくとも9.8である。他の特定の実施形態では、約0.1ng/ml〜約1.0μg/mlの外来性プロテアーゼを加えた異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養物から生じる、インフルエンザウイルスの力価(log10TCID50/mL)は、少なくとも7.0、または少なくとも7.2、または少なくとも7.4、または少なくとも7.6、または少なくとも7.8、または少なくとも8.0、または少なくとも8.2、または少なくとも8.4、または少なくとも8.6、または少なくとも8.8、または少なくとも9.0、または少なくとも9.2、または少なくとも9.4、または少なくとも9.6、または少なくとも9.8である。
幾つかの実施形態では、約1mU/ml〜約5000mU/mlの外来性プロテアーゼを加えた異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養物から生じる、インフルエンザウイルスの力価(log10TCID50/mL)は、少なくとも6.0、または少なくとも6.2、または少なくとも6.4、または少なくとも6.6、または少なくとも6.8、または少なくとも7.0、または少なくとも7.2、または少なくとも7.4、または少なくとも7.6、または少なくとも7.8、または少なくとも8.0、または少なくとも8.2、または少なくとも8.4、または少なくとも8.6、または少なくとも8.8、または少なくとも9.0、または少なくとも9.2、または少なくとも9.4、または少なくとも9.6、または少なくとも9.8である。特定の実施形態では、約1mU/ml〜約1000mU/mlの外来性プロテアーゼを加えた異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養物から生じる、インフルエンザウイルスの力価(log10TCID50/mL)は、少なくとも7.0、または少なくとも7.2、または少なくとも7.4、または少なくとも7.6、または少なくとも7.8、または少なくとも8.0、または少なくとも8.2、または少なくとも8.4、または少なくとも8.6、または少なくとも8.8、または少なくとも9.0、または少なくとも9.2、または少なくとも9.4、または少なくとも9.6、または少なくとも9.8である。他の特定の実施形態では、約1mU/ml〜約500mU/mlの外来性プロテアーゼを加えた異種プロテアーゼを発現する細胞の細胞培養物から生じる、インフルエンザウイルスの力価(log10TCID50/mL)は、少なくとも7.0、または少なくとも7.2、または少なくとも7.4、または少なくとも7.6、または少なくとも7.8、または少なくとも8.0、または少なくとも8.2、または少なくとも8.4、または少なくとも8.6、または少なくとも8.8、または少なくとも9.0、または少なくとも9.2、または少なくとも9.4、または少なくとも9.6、または少なくとも9.8である。
幾つかの実施形態では、約2日〜約10日、または場合によっては約3日〜約7日の細胞のインキュベーション後にウイルスの力価を得る。特定の実施形態では、2日、または3日、または4日、または5日、または6日後、または7日、または8日、または9日、または10日、または12日、または14日の細胞のインキュベーション後にウイルスの力価を得る。
幾つかの実施形態では、約0.1ng/ml未満の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約0.1ng/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約0.5ng/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約1ng/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約5ng/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約10ng/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約50ng/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約100ng/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約250ng/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約500ng/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約750ng/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約1μg/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約5μg/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約10μg/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約25μg/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約50μg/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約100μg/mlの最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。
幾つかの実施形態では、約0.01ng/mlと約100μg/mlの間の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約1ng/mlと約100μg/mlの間の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約10ng/mlと約100μg/mlの間の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約100ng/mlと約100μg/mlの間の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約1μg/mlと約100μg/mlの間の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約10μg/mlと約100μg/mlの間の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。
幾つかの実施形態では、約0.01ng/mlと約10μg/mlの間の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約0.01ng/mlと約1μg/mlの間の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約0.01ng/mlと約100ng/mlの間の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約0.01ng/mlと約10ng/mlの間の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約0.01ng/mlと約1ng/mlの間の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、約0.01ng/mlと約0.1ng/mlの間の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。
幾つかの実施形態では、約1〜5000mU/ml、または5〜1000mU/ml、または100〜500mU/mlの間の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。一実施形態では、約1mU/ml未満の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。一実施形態では、約5mU/ml未満の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。一実施形態では、約10mU/ml未満の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。一実施形態では、約25mU/ml未満の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。一実施形態では、約50mU/ml未満の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。一実施形態では、約100mU/ml未満の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。一実施形態では、約250mU/ml未満の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。一実施形態では、約500mU/ml未満の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。一実施形態では、約1000mU/ml未満の最終濃度まで細胞培養培地に外来性プロテアーゼを加える。
インフルエンザウイルスの有効な生成に典型的に必要とされるはずであるプロテアーゼより少ないプロテアーゼを培養培地に加える、これらの実施形態は、培養する細胞がプロテアーゼ前駆体を発現するとき特に有用である。培養培地に外来性プロテアーゼを加えることによって、保護プロ-ペプチドを切断し、プロテアーゼ前駆体をその活性形に変換することによりプロテアーゼ前駆体を「促進する」ことができる。その後、活性化プロテアーゼは細胞によって後に発現されるプロテアーゼ前駆体を切断し、それによってこれらの新たに生じたプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することができる。したがってこのような実施形態によって、ブタトリプシンなどの外から加えられるプロテアーゼの使用を大幅に減らすことが可能である。
したがって、幾つかの実施形態では、外来性プロテアーゼを1回の施用で細胞培養物に加える。幾つかの実施形態では、ウイルスを使用して細胞培養物中の細胞を感染させるのと同時に、あるいはそれとほぼ同時に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、ウイルスを使用して細胞培養物中の細胞を感染させるのと同日に、外来性プロテアーゼを加える。他の実施形態では、ウイルスの添加を使用して細胞培養物中の細胞を感染させる前に、外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、ウイルス生成用に細胞培養物中の細胞中にベクターを導入するのと同時に、あるいはそれとほぼ同時に外来性プロテアーゼを加える。幾つかの実施形態では、ウイルス生成用に細胞培養物中の細胞中にベクターを導入するのと同日に、外来性プロテアーゼを加える。他の実施形態では、ウイルス生成用に細胞培養物中の細胞中に導入するベクターの添加前に、外来性プロテアーゼを加える。
あるいは、幾つかの実施形態では、細胞はプロテアーゼとプロテアーゼ前駆体の両方を発現することができる。幾つかのこのような実施形態では、プロテアーゼの一過性の発現を可能にするために、プロテアーゼの発現は誘導性プロモーターの制御下にあってよい。このような実施形態はプロテアーゼを一時的に発現させ、それによってプロテアーゼ前駆体を活性化することができる。その後、活性化プロテアーゼ前駆体は、後に発現されるプロテアーゼ前駆体を活性化し続けることができる。あるいは、幾つかの実施形態では、細胞は2つ以上のプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現することができる。幾つかの実施形態では、2つ以上のプロテアーゼ前駆体を、同じまたは異なる制御系の下、例えば構成的または誘導的発現で発現させることができる。誘導的発現の実施形態に関しては、選択する誘導系は、それぞれ誘導的に発現可能であるプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体に関して同じであるかあるいは異なってよい。
幾つかの実施形態では、細胞培養物中の異種プロテアーゼの発現を一時的に制御することが有用である。例えば、定義した時間、例えばインフルエンザウイルスを細胞培養物に感染させた後約1、2、3、4、または5日で、プロテアーゼの発現を誘導することが有用となる可能性がある。他の実施形態では、インフルエンザウイルスを細胞培養物に感染させる前に、プロテアーゼの発現を誘導する。さらに他の実施形態では、インフルエンザウイルスを細胞培養物に感染させると同時にプロテアーゼを誘導する。さらに他の実施形態では、ウイルス生成用に細胞培養物中の細胞中に導入するベクターの添加前、それと同時あるいはその後に、プロテアーゼを誘導する。したがって、幾つかの実施形態では、異種プロテアーゼは誘導性プロモーターの制御下にあってよく、あるいは他の場合は、前に記載したような遺伝的制御要素の制御下にあってよい。
5.7 プロテアーゼまたはプロプロテアーゼを発現している宿主細胞におけるインフルエンザゲノムベクター
細胞培養物に生ウイルスを感染させることに頼っている細胞培養を基礎とした方法に加えて、十分に感染性のインフルエンザウイルスを組換えDNA技術、例えば、プラスミドレスキューを使って細胞培養で作製することができる。例えば、Neumann et al.(1999) Generation of influenza A virus entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA 96:9345〜9350; Fodor et al.(1999) Rescue of influenza A virus from recombinant DNA. J.Virol 73:9679〜9682; Hoffmann et al.(2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci USA 97:6108〜6113;国際公開第01/83794号; HoffmannとWebster(2000), Unidirectional RNA polymerase I-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from 8 plasmids, 81:2843-2847; Hoffmann et al. (2002), Rescue of influenza B viruses from 8 plasmids, 99(17): 11411〜11416;米国特許第6,649,372号および第6,951,754号;米国特許出願公開第20050003349号および第20050037487号を参照されたい。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれているものとする。
ある種の実施形態では、本発明の方法は、それぞれがインフルエンザウイルスゲノムの一部をコードしている複数個のベクターを異種プロテアーゼまたはプロプロテアーゼを発現している細胞に導入してインフルエンザウイルスを得ることを含む。次に、異種プロテアーゼまたはプロプロテアーゼを発現している細胞をウイルスの増殖に許容的な条件の下で培養し、インフルエンザウイルスを回収する。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスは弱毒化されたウイルス、低温適応ウイルスおよび/または温度感受性ウイルスである。例えば、ある種の実施形態では、ベクター由来組換えインフルエンザウイルスは、弱毒化生ワクチンとして投与に適しているような、例えば、鼻腔内ワクチン製剤の弱毒化、低温適応、温度感受性ウイルスでもよい。一般的な実施形態では、前記ウイルスは、インフルエンザB/Ann Arbor/1/66ウイルスゲノムの全てまたは一部、例えばca B/Ann Arbor/1/66ウイルスゲノムを組み込んでいる複数個のベクターを導入することにより作製される。
幾つかの実施形態では、1つのインフルエンザ株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメントをコードしているcDNAおよび異なるインフルエンザ株の1つまたは複数のゲノムセグメント(例えば、HAおよびNA vRNAセグメント)をコードしているcDNAを含む複数個のベクターを、異種プロテアーゼまたはプロプロテアーゼを発現している細胞に導入し、インフルエンザウイルスを得ることができる。例えば、弱毒化、低温適応および/または温度感受性インフルエンザAまたはB株の少なくとも6つの内部ゲノムセグメント(「骨格」)、例えば、B/Ann Arbor/1/66のca, att, ts株を、別のウイルス株由来の免疫原性抗原をコードする1つまたは複数のセグメントと共に、異種プロテアーゼまたはプロプロテアーゼを発現している細胞に導入することができる。典型的には、前記免疫原性表面抗原には、赤血球凝集素(HA)および/またはノイラミニダーゼ(NA)抗原の一方または両方がある。免疫原性表面抗原をコードする単一セグメントが導入される実施形態では、選択されたウイルスの7つの相補的なセグメントも宿主細胞に導入される。
幾つかの実施形態では、1つのインフルエンザ株の1〜7つの内部ゲノムセグメントをコードするcDNAおよび異なるインフルエンザ株の1〜7つのゲノムセグメント(例えば、HAおよびNA vRNAセグメント)をコードするcDNAを含む複数個のベクターを、異種プロテアーゼまたはプロプロテアーゼを発現している細胞に導入してインフルエンザウイルスを得ることができる。
ある種の実施形態では、インフルエンザvRNAをコードする発現ベクターが、エレクトロポレーションにより、異種プロテアーゼまたはプロプロテアーゼを発現している細胞にコトランスフェクションされる。ある種の実施形態では、前記発現ベクターは、リポソームトランスフェクション試薬の存在の下で細胞にトランスフェクションすることにより、またはリン酸カルシウム共沈法により、異種プロテアーゼまたはプロプロテアーゼを発現している細胞に導入される。ある種の実施形態では、前記発現ベクターはプラスミドである。ある種の実施形態では、前記発現ベクターは、前記ウイルスのそれぞれのゲノムRNAセグメントまたはそれに対応するコードRNAを発現するための別個の発現ベクターを含んでいる。
ある種の実施形態では、それぞれのインフルエンザウイルスvRNAをコードする複数個のプラスミドベクターは宿主細胞の集団に導入される。例えば、ある実施形態では、それぞれが異なるvRNAセグメントをコードする8個のプラスミドを利用して、完全なインフルエンザゲノムを前記宿主細胞に導入することができる。一実施形態では、プラスミドベクターは少なくとも1つのインフルエンザポリペプチドのmRNAもコードしている。あるいはまた、比較的小さなゲノム部分配列を組み込んでいる多数のプラスミドを用いることができる。
本発明に従って、インフルエンザの前記8つのゲノムセグメントのそれぞれと対応するウイルスゲノムRNAを、インフルエンザウイルスの操作と作製のために組換え発現ベクターに挿入することができる。ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、ファージ、および人口染色体を含む多種のベクターを本発明の文脈で用いることができる。典型的には、容易に操作するために、前記ウイルスゲノムセグメントは、細菌細胞および真核生物細胞で機能する1つまたは複数の複製起点、ならびに、任意選択で、前記プラスミド配列を組み込んでいる細胞をスクリーニングまたは選別するために都合のよいマーカーを提供するプラスミドベクターに挿入される。次に、これらのベクターは、異種プロテアーゼまたはプロプロテアーゼを発現している細胞に導入してインフルエンザウイルスを得ることができる。
別の実施形態では、本発明は、それぞれのインフルエンザゲノムRNAをコードする1つまたは複数のcDNAに動作可能的に連結されているRNA pol Iプロモーターを含む複数個の発現ベクター、ならびに1つまたは複数のインフルエンザポリペプチド、すなわちPB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2およびNS2をコードするウイルスmRNAを発現する1つまたは複数の発現ベクターを本発明の細胞に導入し、前記組換えインフルエンザウイルスを前記細胞から単離する、すなわち回収することを含む、組換えインフルエンザウイルスを作製するための方法を提供する。
一実施形態では、前記vRNAセグメントまたは対応するcRNAおよびインフルエンザウイルスタンパク質、特にPB1, PB2, PAおよびNAを発現する発現ベクターを使って、本発明の宿主細胞内で感染性の組換えインフルエンザウイルスを産生する方法を提供する。本実施形態に従って、前記感染性の組換えインフルエンザウイルスを産生するため、ヘルパーウイルスは含んでいてもよいし含まなくてもよい。
本発明は、マイナス鎖RNAウイルスの感染性ウイルス粒子を前記発明の培養細胞中で産生するための方法、すなわち、(a)前記細胞中でゲノムvRNAを発現して前記ウイルスの完全なゲノムvRNAを提供することができ、かつ、前記ウイルスの1つまたは複数のポリペプチドをコードするmRNAを発現することもできる1組の発現ベクターを前記細胞の集団に導入し、(b)前記細胞を培養してそれにより前記ウイルス粒子を作製することを含む前記方法を提供する。ある種の実施形態では、前記細胞はイヌ細胞である。ある種の実施形態では、前記細胞はMDCK細胞である。ある種の実施形態では、前記ウイルスはB型インフルエンザウイルスである。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターは1〜17個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターは1〜8個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターは1〜3個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターはエレクトロポレーションにより導入される。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターはインフルエンザウイルスのそれぞれのvRNAセグメントをコードしている。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターは1つまたは複数のインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードしている。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターはインフルエンザウイルスのそれぞれのvRNAセグメントおよび1つまたは複数のインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードしている。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターは第2のウイルスのvRNAまたはmRNAをコードしている。例えば、前記の組のベクターは、第2のインフルエンザウイルスのHAおよび/またはNA mRNAおよび/またはvRNAをコードする1つまたは複数のベクターを含む。一実施形態では、ヘルパーウイルスが前記方法に使用される。一実施形態では、前記方法に使用される培養細胞はイヌ細胞である。
本発明は、マイナス鎖RNAウイルスの感染性組換えウイルス粒子を前記発明の培養細胞中で産生するための方法、すなわち、(a)前記細胞中でゲノムvRNAを発現して前記ウイルスの完全なゲノムvRNAを提供することができる第1の組の発現ベクターを前記細胞の集団に導入し、(b)前記ウイルスの1つまたは複数のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる第2の組の発現ベクターを前記細胞に導入し、および(c)前記細胞を培養してそれにより前記ウイルス粒子を作製することを含む前記方法をさらに提供する。ある種の実施形態では、前記細胞はイヌ細胞である。ある種の実施形態では、前記細胞はMDCK細胞である。ある種の実施形態では、前記ウイルスはB型インフルエンザウイルスである。ある種の実施形態では、前記第1の組の発現ベクターは1〜8個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、前記第1の組の発現ベクターは1個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、前記第2の組の発現ベクターは1〜8個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、前記第2の組の発現ベクターは1個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、第1、第2、または両方の組の発現ベクターはエレクトロポレーションにより導入される。ある種の実施形態では、前記第1の組の発現ベクターはインフルエンザウイルスのそれぞれのvRNAセグメントをコードしている。ある種の実施形態では、前記第2の組の発現ベクターは1つまたは複数のインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードしている。ある種の実施形態では、前記第1の組のまたは第2の組の発現ベクター(または両方の組)は前記発明の核酸を含んでいる。一実施形態では、ヘルパーウイルスが前記方法に使用される。
本発明は、3つよりも大きなゲノムvRNAセグメントを有する分節マイナス鎖RNAウイルスの感染性組換えウイルス粒子、例えばA型インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルスを前記発明の培養細胞中で産生するための方法、すなわち、(a)前記細胞中でゲノムvRNAセグメントを発現して前記ウイルスの完全なゲノムvRNAセグメントを提供することができる第1の組の発現ベクターを前記細胞の集団に導入し、(b)前記ウイルスの1つまたは複数のポリペプチドをコードするmRNAを発現することができる第2の組の発現ベクターを前記細胞に導入し、および(c)前記細胞を培養してそれにより前記ウイルス粒子を作製することを含む前記方法も提供する。ある種の実施形態では、前記細胞はイヌ細胞である。ある種の実施形態では、前記細胞はMDCK細胞である。ある種の実施形態では、前記組換えウイルスはA型またはB型インフルエンザウイルスである。ある種の実施形態では、前記第1の組の発現ベクターは1〜8個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、前記第1の組の発現ベクターは1個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、前記第2の組の発現ベクターは1〜8個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、前記第2の組の発現ベクターは1個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、第1、第2、または両方の組の発現ベクターはエレクトロポレーションにより導入される。ある種の実施形態では、前記第1の組の発現ベクターはインフルエンザウイルスのそれぞれのvRNAセグメントをコードしている。ある種の実施形態では、前記第2の組の発現ベクターは1つまたは複数または全てのインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードしている。ある種の実施形態では、前記第1の組のまたは第2の組の発現ベクター(または両方の組)は第2のウイルスのvRNAまたはmRNAをコードしている。例えば、1組のベクターは、第2のインフルエンザウイルスのHAおよび/またはNA mRNAおよび/またはvRNAをコードする1つまたは複数のベクターを含む。一実施形態では、ヘルパーウイルスが前記方法に使用される。
本発明は、3つよりも大きなゲノムvRNAセグメントを有する分節マイナス鎖RNAウイルスの感染性組換えウイルス粒子、例えばA型インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルスを前記発明の培養細胞中で産生するための方法、すなわち、(a)前記細胞中でゲノムvRNAセグメントを発現して前記ウイルスの完全なゲノムvRNAセグメントを提供することができ、かつ、前記ウイルスの1つまたは複数のポリペプチドをコードするmRNAを発現することもできる1組の発現ベクターを前記細胞の集団に導入し、(b)前記細胞を培養してそれにより前記ウイルス粒子を作製することを含む前記方法をさらに提供する。ある種の実施形態では、前記細胞はイヌ細胞である。ある種の実施形態では、前記細胞はMDCK細胞である。ある種の実施形態では、前記ウイルスはA型またはB型インフルエンザウイルスである。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターは1〜17個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターは1〜8個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターは1〜3個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターは1個のプラスミドに含有されている。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターはエレクトロポレーションにより導入される。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターはインフルエンザウイルスのそれぞれのvRNAセグメントをコードしている。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターは1つまたは複数のインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードしている。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターはインフルエンザウイルスのそれぞれのvRNAセグメントおよび1つまたは複数のインフルエンザポリペプチドのmRNAをコードしている。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターは前記発明の核酸を含んでいる。ある種の実施形態では、前記の組の発現ベクターは第2のウイルスのvRNAまたはmRNAをコードしている。例えば、前記の組のベクターは、第2のインフルエンザウイルスのHAおよび/またはNA mRNAおよび/またはvRNAをコードする1つまたは複数のベクターを含む。ある種の実施形態では、第1の組のまたは第2の組の発現ベクター(または両方の組)は第2のウイルスのvRNAまたはmRNAをコードしている。例えば、1組のベクターは、第2のインフルエンザウイルスのHAおよび/またはNA mRNAおよび/またはvRNAをコードする1つまたは複数のベクターを含む。一実施形態では、ヘルパーウイルスが前記方法に使用される。
前記プラスミド発現ベクターは、前記挿入されたウイルスゲノムセグメントの転写をどちらの方向へも開始する、すなわち(+)鎖のおよび(-)鎖のウイルスRNA分子を両方とも生じることができる双方向性の発現ベクターであってよい。双方向性の転写をもたらすために、前記ウイルスゲノムセグメントはそれぞれ、ウイルスゲノムRNAのコピーが第1のRNAポリメラーゼプロモーター(例えば、RNA pol Iプロモーター)により1つの鎖から転写され、ウイルスmRNAが第2のRNAポリメラーゼプロモーター(例えば、RNA pol IIプロモーターまたは細胞中でRNA pol IIにより転写を開始することができる他のプロモーター)から合成されるように、少なくとも2つの独立したプロモーターを有するベクターに挿入される。したがって、前記2つのプロモーターは、少なくとも1つのクローニング部位(すなわち、制限酵素認識配列)好ましくはウイルスゲノムRNAセグメントの挿入に適した独自のクローニング部位に隣接して反対方向に配置することができる。あるいはまた、(+)鎖mRNAおよび(-)鎖ウイルスRNA(cRNAとして)がベクターの同一鎖から転写される「アンビセンス」ベクターを用いることができる。
それぞれの発現されたvRNAまたはcRNAの正しい3'末端を確保するために、それぞれのvRNAまたはcRNA発現ベクターは、前記RNAコード配列の下流にリボザイム配列または適切なターミネーター配列を組み込むことができる。これは、例えば、デルタ型肝炎ウイルスゲノムリボザイム配列でも、その機能的な誘導体でも、ネズミrDNAターミネーター配列(GenBank登録番号M12074)でもよい。あるいはまた、例えば、Pol Iターミネーターを用いてもよい(Neumann et al.,1994, Virology 202:477〜479)。前記RNA発現ベクターは、Pleschka et al.,1996, J.Virol. 70:4188〜4192; HoffmannとWebster, 2000, J. Gen Virol. 81:2843〜2847; Hoffmann et al.,2002, Vaccine 20:3165〜3170; Fodor et al.,1999, J.Virol. 73:9679〜9682; Neumann et al.,1999, P.N.A.S. USA 96:9345〜9350;およびHoffmann et al., 2000, Virology 267:310〜317;米国特許第6,649,372号および同第6,951,754号;米国特許出願公開第20050003349号および同第20050037487号に記載のvRNA発現ベクターと同じ方法で構築してよい。これらの文献はそれぞれが参照によりその全体として本明細書に組み込まれているものとする。
他の系では、pol Iおよびpol IIプロモーターにより転写されたウイルス配列は異なるベクターから転写することができる。これらの実施形態では、pol Iプロモーターの制御の下で前記ウイルスゲノムセグメントのそれぞれをコードするベクターならびにpol IIプロモーターの制御の下で少なくともPA, PB1, PB2およびNPをコードするベクターを使うことができる。
どちらの場合にも、前記pol IIプロモーターに関して、発現される前記インフルエンザウイルスゲノムセグメントをmRNA合成を指示する適切な転写制御配列(プロモーター)に作動可能的に連結することができる。種々のプロモーターが、インフルエンザウイルスゲノムセグメントの転写を調節するための発現ベクターにおいて使用するのに適している。ある種の実施形態では、サイトメガロウイルス(CMV)DNA依存性RNAポリメラーゼII(Pol II)プロモーターが使用される。必要ならば、例えば、条件的な発現を調節するためには、特定の条件の下で、または特定の組織もしくは細胞でRNA転写を誘発する他のプロモーターで置き換えることができる。多数のウイルスのおよび哺乳動物の、例えばヒトプロモーターが利用可能であり、または予想される特定の適用に従って単離することができる。例えば、動物およびヒトウイルスのゲノムから得られる選択的プロモーターには、(アデノウイルス2などの)アデノウイルス、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、およびポリオーマウイルスなどのプロモーター、ならびに種々のレトロウイルスプロモーターがある。哺乳動物プロモーターには、その他多くのプロモーターの中で、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどがある。特定の実施形態では、Berg et al., Bio Techniques 14:972〜978により記載されているように、前記調節配列はヒトアデノウイルス2のスプライスされた3部分リーダー配列に連結されたアデノウイルス2の主要な後期プロモーターを含む。さらに、バクテリオファージプロモーター、例えばT7プロモーターを、同族RNAポリメラーゼと併せて用いることができる。
ウイルスタンパク質、特にRNP複合体形成のためのウイルスタンパク質を発現するために使われる発現ベクターは、所望のウイルスに相同なウイルスタンパク質を好んで発現するであろう。これらの発現ベクターによるウイルスタンパク質の発現は、当業者に公知のいかなる調節配列により調節されてもよい。前記調節配列は、構成的プロモーターでも、誘導プロモーターでも、組織特異的プロモーターでもよい。
タンパク質発現ベクター中でウイルスタンパク質の発現を制御するために使用してもよいプロモーターの追加の例には、SV40早期プロモーター領域(BernoistとChambon, 1981, Nature 290:304〜310)、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復に含有されるプロモーター(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787〜797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441〜1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., 1982, Nature 296:39〜42)、β-ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727〜3731)、またはtacプロモーター(DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21〜25)があるが、これらに限定されるものではない。"Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74〜94、ノパリンシンセターゼプロモーター領域(Herrera-Estrella et al., Nature 303:209〜213)またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871)を含む植物発現ベクター、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115〜120);Gal 4プロモーター、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターなどの酵母または他の菌類由来のプロモーターエレメント、ならびに組織特異性を示しトランスジェニック動物に利用されてきた以下の動物転写制御領域、すなわち、膵腺房細胞で活性なエラスターゼI遺伝子制御領域(Swift et al., 1984, Cell 38:639〜646; Omitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399〜409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425〜515)、膵臓ベータ細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan, 1985, Nature 315:115〜122)、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647〜658; Adames et al., 1985, Nature 318:533〜538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436〜1444)、精巣、***、リンパ系、およびマスト細胞で活性なマウス***腫瘍ウイルス制御領域(Leder et al., 1986, Cell 45:485〜495)、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268〜276)、肝臓で活性なアルファ-胎児蛋白遺伝子制御領域(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639〜1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53〜58)、肝臓で活性なアルファ 1-アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161〜171)、骨髄細胞で活性なベータグロブリン遺伝子制御領域(Mogram et al., 1985, Nature 315:338〜340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89〜94)、脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readhead et al., 1987, Cell 48:703〜712)、骨格筋で活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Sani, 1985, Nature 314:283〜286)、および視床下部で活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., 1986, Science 234:1372〜1378)も参照されたい。
特定の実施形態では、前記タンパク質発現ベクターは、核酸配列、1つまたは複数の複製起点、および、任意選択で、1つまたは複数の選択可能なマーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)に動作可能的に連結されたプロモーターを含む。別の実施形態では、バイシストロニックmRNAを産生することができるタンパク質発現ベクターを、バイシストロニックmRNA配列を挿入することにより作製してもよい。ある種の内部リボソーム進入部位(IRES)配列を利用してもよい。好ましいIRESエレメントには、哺乳動物BiP IRESおよびC型肝炎ウイルスIRESがあるが、これらのIRESに限定されるものではない。
遺伝子挿入物を含有する発現ベクターは、例えば3つの一般的方法、すなわち、(a)核酸ハイブリダイゼーション、(b)「マーカー」遺伝子機能の存在または不在、および(c)挿入された配列の発現、により同定することができる。第1の方法では、発現ベクター(群)に挿入されたウイルス遺伝子の存在は、前記挿入された遺伝子(群)に相同な配列を含むプローブを使った核酸ハイブリダイゼーションにより検出することができる。第2の方法では、前記組換えベクター/宿主系は、前記ベクター(群)への前記遺伝子(群)の挿入によって引き起こされるある種の「マーカー」遺伝子機能(例えば、抗生物質に対する耐性もしくは形質転換表現型)の存在または不在に基づいて同定し選別することができる。第3の方法では、発現ベクターは、発現された前記遺伝子産物を検定することにより同定することができる。当該検定法は、例えば、インビトロ検定法におけるウイルスタンパク質の物理的または機能的特性、例えば抗体へのウイルスタンパク質の結合に基づいていてよい。
特定の実施形態では、1つまたは複数のタンパク質発現ベクターがRNP複合体の形成に必要なウイルスタンパク質をコードし発現する。別の実施形態では、1つまたは複数のタンパク質発現ベクターがウイルス粒子を形成するのに必要なウイルスタンパク質をコードし発現する。さらに別の実施形態では、1つまたは複数のタンパク質発現ベクターが、特定のマイナス鎖RNAウイルスのウイルスタンパク質の全てをコードし発現する。
転写はエンハンサー配列を含めることにより任意選択で増加させることができる。エンハンサーは、典型的にはプロモーターと呼応して作用して転写を増加させる短い、例えば、10〜500bp、シス作用性のDNAエレメントである。多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子(ヘモグロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ-胎児タンパク質、およびインスリン)ならびに真核細胞ウイルスから単離されてきた。前記エンハンサーは、異種コード配列に対し位置5'または3'でベクターにスプライスすることができるが、典型的にはプロモーターに対して部位5'で挿入される。典型的には、プロモーター、および必要ならば、追加の転写増強配列は、異種DNAを導入することになっている宿主細胞型での発現を最適化するように選択される(Scharf et al.(1994) Heat stress promoters and transcription factors Results Probl Cell Differ 20:125〜62; Kriegler et al.(1990) Assembly of enhancers, promoters, and splice signals to control expression of transferred genes Methods in Enzymol 185:512〜27)。任意選択で、単位複製配列は、翻訳開始のためのリボソーム結合部位または内部リボソーム進入部位(IRES)も含有することができる。
前記ベクターは、ポリアデニル化部位またはターミネーター配列などの転写の終結のためのおよび前記mRNAを安定化するための配列も含むことができる。当該配列は、通常、真核生物のまたはウイルスのDNAまたはcDNAの5'および時折3'非翻訳領域から入手可能である。幾つかの実施形態では、SV40ポリアデニル化配列はポリアデニル化シグナルを提供する。
さらに、上記のように、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選別するための表現型形質を提供する1つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子を任意選択で含んでおり、以前に記載した遺伝子に加えて、ジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性などのマーカーは真核細胞培養における選別に適している。
上記のような適切なDNA配列、ならびに適切なプロモーターまたは制御配列を含有するベクターを用いて、前記タンパク質の発現を許容する宿主細胞を形質転換することができる。前記ベクターは細菌細胞で複製することができるが、最も頻繁には、発現のためには、前記ベクターを哺乳動物細胞、例えば、Vero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞、COS細胞に導入するのが好ましいであろう。特定の実施形態では、発現のためにMDCK細胞が使用される。
前記発現ベクターを使って、1つまたは複数の変異体を有するゲノムvRNA(群)または対応するcRNA(群)の発現を指示することができる。これらの変異体は前記ウイルスを弱毒化する可能性がある。例えば、前記vRNAセグメントは、パンハンドル二重鎖プロモーター領域に弱毒化した塩基対置換、特に、例えばNA特異的vRNAの二重鎖領域に位置11〜12'でCの代わりにAのおよびGの代わりにUの既知の弱毒化塩基対置換(Fodor et al., 1998, J.Virol. 6923〜6290)を有するA型インフルエンザウイルスのvRNAセグメントであってよい。組換えマイナス鎖RNAウイルスを作製する方法を使うことにより、新しい弱毒化変異体を同定してもよい。
さらに、米国特許第6,951,754号、同第6,887,699号、同第6,649,372号、同第6,544,785号、同第6,001,634号、同第5,854,037号、同第5,824,536号、同第5,840,520号、同第5,820,871号、同第5,786,199号、および同第5,166,057号、ならびに米国特許出願公開第20060019350号、同第20050158342号、同第20050037487号、同第20050266026号、同第20050186563号、同第20050221489号、同第20050032043号、同第20040142003号、同第20030035814号、および同第20020164770号に記載の発現ベクターのどれでも本発明に従って使用することができる。
さらに、前記発現ベクターを使って、ウイルスゲノムに非相同な配列を発現するキメラウイルスを作ることもできる。発現ベクターと共に宿主細胞に導入されたvRNA(群)または対応するcRNA(群)の発現を指示する発現ベクターは、ウイルスタンパク質の発現を指示して、新規の感染性の組換えマイナス鎖RNAウイルスまたはキメラウイルスを生み出す。これらのウイルス内に工学的に処理してもよい異種配列には、アンチセンス核酸およびリボザイムなどの核酸がある。あるいはまた、ペプチドまたはポリペプチドを発現する異種配列をこれらのウイルス内に工学的に処理してもよい。以下のペプチドまたはポリペプチド、すなわち、(1)病原体に特徴的な抗原、(2)自己免疫疾患に特徴的な抗原、(3)アレルゲンに特徴的な抗原、および(4)腫瘍に特徴的な抗原をコードしている異種配列をこれらのウイルス内に工学的に処理してもよい。例えば、本発明のキメラウイルス内に工学的に処理することができる異種遺伝子配列には、数例を挙げれば、gp160などのヒト免疫不全ウイルス(HIV)のエピトープ、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、ヘルペスウイルスの糖タンパク質(例えば、gD, gE)、ポリオウイルスのVP1、および細菌や寄生虫などの非ウイルス性病原体の抗原決定基があるが、これらの例に限定されるものではない。
さらに、本発明の方法は、感染性のウイルス粒子の救出の効率を改善するために、当業者に公知の方法の態様を組み込むように改変してもよい。例えば、逆遺伝学技術では、ウイルスポリメラーゼによる認識に、および成熟ビリオンを生み出すのに必要なパッケージングシグナルに不可欠なマイナス鎖ウイルスRNAの非コード領域を含有する合成組換えウイルスRNAを調製する。前記組換えRNAは組換えDNA鋳型から合成され、精製ウイルスポリメラーゼ複合体によりインビトロで再構成されて、細胞をトランフェクションするために使うことができる組換えリボ核タンパク質(RNP)を形成する。インビトロでもインビボでも合成RNAの転写中に前記ウイルスポリメラーゼタンパク質が存在すれば、より効率的なトランスフェクションが実現される。前記合成組換えRNPを感染性のウイルス粒子内に救出することができる。上述の技術は、1992年11月24日開示の米国特許第5,166,057号、1998年12月29日開示の米国特許第5,854,037号、1998年8月4日開示の米国特許第5,789,229号、1996年2月20日開示の欧州特許出願公開第0702085A1号、米国特許出願第09/152,845号、1997年4月3日開示の国際特許公開PCR第97/12032号、1996年11月7日開示の国際公開第96/34625号、欧州特許公開第A780475号、1999年1月21日開示の国際公開第99/02657号、1998年11月26日開示の国際公開第98/53078号、1998年1月22日開示の国際公開第98/02530号、1999年4月1日開示の国際公開第99/15672号、1998年4月2日開示の国際公開第98/13501号、1997年2月20日開示の国際公開第97/06720号、および1997年6月25日開示の欧州特許出願公開第78047SA1号に記載されており、これらの文献はそれぞれが参照によりその全体として本明細書に組み込まれているものとする。
インフルエンザゲノムセグメントを含むベクターを、異種核酸を真核細胞に導入するために当分野で公知の方法、例えば、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、およびポリアミントランスフェクション試薬を用いたトランスフェクションに従って、本発明の宿主細胞に導入(例えば、トランスフェクション)することができる。例えば、ベクター、例えばプラスミドを、ポリアミドトランスフェクション試薬TransIT-LT1 (Mirus)を製造業者の指示に従って使って、COS細胞、293T細胞、MDCK細胞、またはCOSもしくは293T細胞とMDCK細胞を組み合わせたものなどの宿主細胞にトランスフェクションすることができる。宿主細胞の集団に導入するそれぞれのベクターをおよそ1μg、およそ2μlのTransIT-LT1と共に160μlの培養液(例えば、無血清培養液)に希釈し、全容積を200μlにする。前記DNAトランスフェクション試薬混合物を室温で45分間インキュベートし、続いて800μlの培養液を添加する。前記トランスフェクション混合物を宿主細胞に添加し、前記細胞を上記のように培養する。したがって、組換えまたは再集合体ウイルスを細胞培養で作製するために、前記8つのゲノムセグメント(PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HAおよびNA)のそれぞれを組み込んでいるベクターをおよそ20μlのTransIT-LT1と混ぜ合わせ、宿主細胞にトランスフェクションする。任意選択で、トランスフェクションに先立って、血清含有培養液を無血清培養液、例えば、Opti-MEM1で取り替えて、4〜6時間インキュベートする。
あるいはまた、エレクトロポレーションを用いて、インフルエンザゲノムセグメントを組み込んだベクターを本発明の宿主細胞に導入することができる。例えば、A型ンフルエンザまたはB型インフルエンザウイルスを組み込んだプラスミドベクターを以下の手順に従ってエレクトロポレーションを使ってVero細胞に導入するのが好ましい。手短に言えば、例えば、10％ウシ胎仔血清(FBS)を補充した変法イーグル培地(MEM)で増殖させた5×106のVero細胞を、0.4mlのOptiMEMに再懸濁して、エレクトロポレーションキュベットに入れる。最大25μlの容積中20μgのDNAを前記キュベット中の細胞に添加し、次にこれを軽くたたいて穏やかに混ぜ合わせる。エレクトロポレーションは、製造業者の指示(例えば、Capacitance Extender Plusを接続したBioRad Gene Pulser II)に従って、300ボルト、950マイクロファラッド、28〜33ミリ秒間の時定数で実施する。前記細胞は穏やかにたたいて再度混ぜ、エレクトロポレーションに続いておよそ1〜2分で10％FBSを補充した0.7mlのMEMを前記キュベットに直接添加する。次に、前記細胞を、2mlMEM、10％FBSまたはOPTI-MEMを含有し無血清の標準6ウェル組織培養皿の2つのウェルに移動させる。前記キュベットを洗浄し、残っている細胞を全て回収しその洗浄懸濁液は前記2つのウェル間で分ける。最終的な容積はおよそ3.5mlにする。次に、前記細胞を、ウイルス増殖に許容的な条件の下で、例えば、低温適応株ではおよそ33℃でインキュベートする。
5.8 細胞培養液からのウイルスの回収
ウイルスは典型的には、感染した(トランスフェクションした)細胞を増殖させた培養液から回収することができる。典型的には、インフルエンザウイルスの濃縮に先立って粗培養液を浄化する。一般的な方法には、ろ過、限外ろ過、硫酸バリウム上への吸着および溶出、ならびに遠心分離がある。例えば、感染した培養物由来の粗培養液は先ず、例えば、1000〜2000×gで、細胞片と他の大きな粒子状物質を除去するのに十分な時間、例えば、10〜30分の間で遠心分離により浄化することができる。あるいはまた、前記培養液は0.8μm酢酸セルロースフィルターによってろ過し、無傷の細胞と他の大きな粒子状物質を除去する。任意選択で、次に浄化した培養液上清を、例えば、15,000×gでおよそ3〜5時間遠心分離して、インフルエンザウイルスをペレット状にする。前記ウイルスペレットを、STE(0.01M Tris-HCl; 0.15M NaCl; 0.0001M EDTA)またはリン酸緩衝食塩水(PBS)などの適切な緩衝液中にpH7.4で再懸濁するのに続いて、前記ウイルスを、ショ糖(60％〜12％)または酒石酸カリウム(50％〜10％)上での密度勾配遠心分離により濃縮する。連続勾配でも段階勾配、例えば、12％と60％の間で12％4段階のショ糖勾配でも適切である。前記勾配物は、前記ウイルスが回収のために可視帯に集中するに十分な速度および時間遠心分離される。あるいはまた、および最も大規模な商業的適用のために、ウイルスは、連続モードで作動するゾーン遠心分離ローターを使って密度勾配物から洗い分ける。組織培養からのインフルエンザウイルスの調製について当業者を導くのに十分な追加の詳細な点は、例えば、Furminger. Vaccine Production, Nicholson et al.(eds) Textbook of Influenza pp.324〜332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, Cohen & Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp.141〜151、および米国特許第5,690,937号において提供されている。必要であれば、前記回収したウイルスは、安定剤としてショ糖リン酸グルタミン酸(SPG)の存在の下で-80℃で保管することができる。
一実施形態では、本発明は、潜在的癌遺伝子を除去するために、ベンゾナーゼなどの薬剤で処理済みの本発明の細胞で複製させたウイルス(またはその部分)を含む組成物を提供する。したがって、本発明の実施形態の中には、無癌遺伝子ワクチン組成物が明確に含まれている。
5.9 他のウイルス
上記のインフルエンザウイルスに加えて、本発明の細胞および方法を使って他のウイルスも培養することができる。ある種の実施形態では、前記ウイルスの1つまたは複数のポリペプチドは、前記ウイルスの生活環のある時点で宿主細胞プロテアーゼによりタンパク質切断を受ける。特定の実施形態では、本発明の細胞または方法を使用することで、ウイルスの産生量、すなわちウイルスの感染力を増大させる、または当業者に公知のウイルスの別の好ましい生物学的特性が改善されるであろう。
したがって、ある種の実施形態では、前記培養されたウイルスはDNAウイルスである。ある種の実施形態では、前記ウイルスはRNAウイルスである。ある種の実施形態では、前記ウイルスは一本鎖DNAウイルスである。ある種の実施形態では、前記ウイルスは二本鎖DNAウイルスである。ある種の実施形態では、前記ウイルスはプラス鎖一本鎖RNAウイルスである。ある種の実施形態では、前記ウイルスはマイナス鎖一本鎖RNAウイルスである。ある種の実施形態では、前記ウイルスは二本鎖RNAウイルスである。ある種の実施形態では、前記ウイルスは逆転写ウイルスである。
ある種の実施形態では、前記ウイルスはカウドウイルス目(Caudovirales)、モノネガウイルス目(Mononegavirales)、またはニドウイルス目(Nidovirales)からなる群から選択される目の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスはマイオウイルス科(Myoviridae)、サイフォウイルス科(Siphoviridae)、ポドウイルス科(Podoviridae)、ルディウイルス科(Rudiviridae)、テクティウイルス科(Tectiviridae)、コルチコウイルス科(Corticoviridae)、リポスリクスウイルス科(Lipothrixviridae)、プラズマウイルス科(Plasmaviridae)、フセロウイルス科(Fuselloviridae)、フィコドナウイルス科(Phycodnaviridae)、グッタウイルス科(Guttaviridae)、ポックスウイルス科(Poxviridae)、チョルドポックスウイルス亜科(Chordopoxvirinae)、エントモポックスウイルス亜科(Entomopoxvirinae)、イリドウイルス科(Iridoviridae)、ポリドナウイルス科(Polydnaviridae)、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)、アルファヘルペスウイルス亜科(Alphaherpesvirinae)、ベータヘルペスウイルス亜科(Betaherpesvirinae)、ガンマヘルペスウイルス亜科(Gammaherpesvirinae)、ポリオーマウイルス科(Polyomaviridae)、パピローマウイルス科(Papillomaviridae)、アデノウイルス科(Adenoviridae)、アスコウイルス科(Ascoviridae)、バキュロウイルス科(Baculoviridae)、ニマウイルス科(Nimaviridae)、およびアスファウイルス科(Asfarviridae)からなる群から選択される科または亜科の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、T4様ウイルス属、P1様ウイルス属、P2様ウイルス属、Mu様ウイルス属、SP01様ウイルス属、ΦH様ウイルス属、λ様ウイルス属、T1様ウイルス属、T5様ウイルス属、c2様ウイルス属、L5様ウイルス属、ψM1様ウイルス属、T7様ウイルス属、φ29様ウイルス属、P22様ウイルス属、ルディウイルス属(Rudivirus)、テクティウイルス属(Tectivirus)、コルティコウイルス属(Corticovirus)、アルファリポスリックスウイルス属(Alphalipothrixvirus)、ベータリポスリックスウイルス属(Betalipothrixvirus)、ガンマリポスリックスウイルス属(Gammalipothrixvirus), プラズマウイルス属(Plasmavirus)、フセロウイルス属(Fusellovirus)、クロロウイルス属(Chlorovirus)、プラシノウイルス属(Prasinovirus)、プリムネシオウイルス属(Prymnesiovirus)、ファエオウイルス属(Phaeovirus)、ラフィドウイルス属(Raphidovirus)、コッコリスウイルス属(Coccolithovirus)、グッタウイルス属(Guttavirus)、オルソポックスウイルス属(Orthopoxvirus)、パラポックスウイルス属(Parapoxvirus)、アヴィポックスウイルス属(Avipoxvirus)、カプリポックスウイルス属(Capripoxvirus)、レポリポックスウイルス属(Leporipoxvirus)、ブタポックスウイルス属(Suipoxvirus)、モルシポックスウイルス属(Molluscipoxvirus)、ヤタポックスウイルス属(Yatapoxvirus)、アルファエントモポックスウイルス属(Alphaentomopoxvirus)、ベータエントモポックスウイルス属(Betaentomopoxvirus)、ガンマエントモポックスウイルス属(Gammaentomopoxvirus)、イリドウイルス属(Iridovirus)、クロリリドウイルス属(Chloriridovirus)、ラナウイルス属(Ranavirus)、リンホシスティウイルス属(Lymphocystivirus)、イクノウイルス属(Ichnovirus)、ブラコウイルス属(Bracovirus)、イクタルリウイルス属(Ictalurivirus)、シンプレックスウイルス属(Simplexvirus)、バリセロウイルス属(Varicellovirus)、マルディウイルス属(Mardivirus)、イルトウイルス属(Iltovirus)、サイトメガロウイルス属(Cytomegalovirus)、ムロメガロウイルス属(Muromegalovirus)、ロゼオロウイルス属(Roseolovirus)、リンホクリプトウイルス属(Lymphocryptovirus)、ラジノウイルス属(Rhadinovirus)、ポリオーマウイルス属(Polyomavirus)、パピローマウイルス属(Papillomavirus)、マストアデノウイルス属(Mastadenovirus)、アヴィアデノウイルス属(Aviadenovirus)、アトアデノウイルス属(Atadenovirus)、シアデノウイルス属(Siadenovirus)、アスコウイルス(Ascovirus), ミニウイルス(Mimivirus)、核多核体病ウイルス属(Nucleopolyhedrovirus)、顆粒ウイルス属(Granulovirus)、ウィスポウイルス属(Whispovirus)、アスフィウイルス属(Asfivirus)、およびリジディオウイルス属(Rhizidiovirus)からなる群から選択される属の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、腸内細菌ファージT4(Enterobacteria phage T4)、腸内細菌ファージP1(Enterobacteria phage P1)、腸内細菌ファージP2(Enterobacteria phage P2)、腸内細菌ファージMu(Enterobacteria phage Mu)、桿菌ファージSP01(Bacillus phage SP01)、ハロバクテリウムウイルスΦH (Halobacterium virus ΦH)、腸内細菌ファージλ(Enterobacteria phage λ)、腸内細菌ファージT1(Enterobacteria phage T1)、腸内細菌ファージT5(Enterobacteria phage T5)、ラクトコッカスファージc2(Lactococcus phage c2)、マイコバクテリウムファージL5(Mycobacterium phage L5)、メタノバクテリウムψM1(Methanobacterium ψM1)、腸内細菌ファージT7(Enterobacteria phage T7)、桿菌ファージφ29(Bacillus phage φ29)、腸内細菌ファージP22(Enterobacteria phage P22)、スルホロブスウイルスSIRV1(Sulfolobus virus SIRV1)、腸内細菌ファージPRD1(Enterobacteria phage PRD1)、アルテロモナスファージPM2(Alteromonas phage PM2)、サーモプロテウスウイルス1(Thermoproteus virus 1)、スルホロブスアイスランディカス糸状ウイルス(Sulfolobus islandicus filamentous virus)、アシディアヌス糸状ウイルス1(Acidianus filamentous virus 1)、アコレプラズマファージL2(Acholeplasma phage L2)、スルホロブスウイルスSSV1(Sulfolobus virus SSV1)、ゾウリムシブルサリアクロレラウイルス1(Paramecium bursaria Chlorella virus 1)、ミクロモナスプシラウイルスSP'1(Micromonas pusilla virus SP'1)、クロソクロムリナブレビフィルムウイルスPW1(Chrysochromulina brevifilum virus PW1)、エクトカルパスシリキュロシスウイルス1(Ectocarpus siliculosis virus 1)、ヘテロシグマアカシオウイルス01(Heterosigma akashiwo virus 01)、エミリアニアハクスレーウイルス86(Emiliania huxleyi virus 86)、スルホロブスネオージーランディカス液滴形ウイルス(Sulfolobus neozealandicus droplet-shaped virus)、ワクシニアウイルス(Vaccinia virus)、オーフウイルス(Orf virus)、鶏頭ウイルス(Fowlpox virus)、羊痘ウイルス(Sheeppox virus)、粘液腫ウイルス(Myxoma virus)、ブタポックスウイルス(Swinepox virus)、伝染性軟属腫ウイルス(Molluscum contagiosum virus)、ヤバサル腫瘍ウイルス(Yaba monkey tumor virus)、ヨーロッパコフキコガネエントモポックスウイルス(Melolontha melolontha entomopoxvirus)、アムサクタモーレイエントモポックスウイルス(Amsacta moorei entomopoxvirus)、ユスリカ属ルリドゥスエントモポックスウイルス(Chironomus luridus entomopoxvirus)、無脊椎動物イリデスセントウイルス6(Invertebrate iridescent virus 6)、無脊椎動物イリデスセントウイルス3(Invertebrate iridescent virus 3)、カエルウイルス3(Frog virus 3)、リムフォキスティス症ウイルス1(Lymphocystis disease virus 1)、カンポレティスソノレンシスイチノウイルス(Campoletis sonorensis ichnovirus)、コーテシアメラノスセラブラコウイルス(Cotesia melanoscela bracovirus)、イクタルリドヘルペスウイルス1(Ictalurid herpesvirus 1)、ヒトヘルペスウイルス1(Human herpesvirus 1)、ヒトヘルペスウイルス3(Human herpesvirus 3)、ガリドヘルペスウイルス2(Gallid herpesvirus 2)、ガリドヘルペスウイルス1(Gallid herpesvirus 1)、ヒトヘルペスウイルス5(Human herpesvirus 5)、ネズミ科ヘルペスウイルス1(Murid herpesvirus1)、ヒトヘルペスウイルス6(Human herpesvirus 6)、ヒトヘルペスウイルス4(Human herpesvirus 4)、サイミリイネヘルペスウイルス2(Saimiriine herpesvirus 2)、サルウイルス40(Simian virus 40)、ワタウサギパピローマウイルス(Cottontail rabbit papillomavirus)、ヒトアデノウイルスC(Human adenovirus C)、ニワトリアデノウイルスA(Fowl adenovirus A)、ヒツジアデノウイルスD(Ovine adenovirus D)、シチメンチョウアデノウイルスB(Turkey adenovirus B)、ヨトウガアスコウイルス(Spodoptera frugiperda ascovirus)、アカントアメーバカブトムシ亜科ミミウイルス(Acanthamoeba polyphaga mimivirus)、オウトグラファカリフォルニカ核多核体病ウイルス(Autographa californica nucleopolyhedrovirus)、スモモヒメハマキ顆粒ウイルス(Cydia pomonella granulovirus)、ホワイトスポットシンドロームウイルス1(White spot syndrome virus 1)、アフリカブタ熱ウイルス(African swine fever virus)、およびサカゲカビウイルス(Rhizidiomyces virus)からなる群から選択される。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、イノウイルス科(Inoviridae)、ミクロウイルス科(Microviridae)、ジェミニウイルス科(Geminiviridae)、サーコウイルス科(Circoviridae)、ナノウイルス科(Nanoviridae)、パルボウイルス科(Parvoviridae)、パルボウイルス亜科(Parvovirinae)、およびデンシウイルス亜科(Densovirinae)からなる群から選択される科または亜科の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、イノウイルス属(Inovirus)、プレクトロウイルス属(Plectrovirus)、ミクロウイルス属(Microvirus)、スピロミクロウイルス属(Spiromicrovirus)、ブデロミクロウイルス属(Bdellomicrovirus)、クラミジアミクロウイルス属(Chlamydiamicrovirus)、マストレウイルス属(Mastrevirus)、クルトウイルス属(Curtovirus)、ベゴモウイルス属(Begomovirus)、サーコウイルス属(Circovirus)、ギロウイルス属(Gyrovirus)、ナノウイルス属(Nanovirus)、バブウイルス属(Babuvirus)、パルボウイルス属(Parvovirus)、エリスロウイルス属(Erythrovirus)、ディペンドウイルス属(Dependovirus)、デンソウイルス属(Densovirus)、イテラウイルス属(Iteravirus)、およびブレビデンソウイルス属(Brevidensovirus)からなる群から選択される属の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、腸内細菌ファージM13(Enterobacteria phage M13)、アコレプラズマファージMV-L51(Acholeplasma phage MV-L51)、腸内細菌ファージφX174(Enterobacteria phage φX174)、スピロプラズマファージ4(Spiroplasma phage 4)、ブデロビブリオファージMAC1(Bdellovibrio phage MAC1)、クラミジアファージ1(Chlamydia phage 1)、メイズストリークウイルス(Maize streak virus)、ビートカーリートップウイルス(Beet curly top virus)、ビーンゴールデンモザイクウイルス(Bean golden mosaic virus)-プエルトリコ(Puerto Rico)、ブタサーコウイルス(Porcine circovirus)、ニワトリ貧血ウイルス(Chicken anaemia virus)、サブテレイニアンクローバースタントウイルス(Subterranean clover stunt virus)、バナナバンチートップウイルス(Banana bunchy top virus)、マウス微小ウイルス(Minute virus of mice)、B19ウイルス(B19 virus)、アデノ随伴ウイルス2(Adeno-associated virus 2)、ジュノニアコエニアデンソウイルス(Junonia coenia densovirus)、カイコデンソウイルス(Bombyx mori densovirus)、およびネッタイシマカデンソウイルス(Aedes aegypti densovirus)からなる群から選択される。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)、およびカリモウイルス科(Caulimoviridae)からなる群から選択される科または亜科の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、オルソヘパドナウイルス属(Orthohepadnavirus)、アビヘパドナウイルス属(Avihepadnavirus)、バドナウイルス属(Badnavirus)、カリモウイルス属(Caulimovirus)、タングロウイルス属(Tungrovirus)、ソイモウイルス属(Soymovirus)、カベモウイルス属(Cavemovirus)、およびペツウイルス属(Petuvirus)からなる群から選択される属の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、B型肝炎ウイルス(Hepatitis B virus)、アヒルB型肝炎ウイルス(Duck hepatitis B virus)、ツユクサ横斑点ウイルス(Commelina yellow mottle virus)、カリフラワーモザイクウイルス(Cauliflower mosaic virus)、ライスタングロバシリフォルミスウイルス(Rice tungro bacilliform virus)、ソイビーンクロロティック斑点ウイルス(Soybean chlorotic mottle virus)、キャッサバベインモザイクウイルス(Cassava vein mosaic virus)、およびペチュニアベインクリーニングウイルス(Petunia vein clearing virus)からなる群から選択される。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、シュウドウイルス科(Pseudoviridae)、メタウイルス科(Metaviridae)、およびレトロウイルス科(Retroviridae)からなる群から選択される科または亜科の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、シュウドウイルス属(Pseudovirus)、ヘミウイルス属(Hemivirus)、メタウイルス属(Metavirus)、エランティウイルス属(Errantivirus)、アルファレトロウイルス属(Alpharetrovirus)、ベータレトロウイルス属(Betaretrovirus)、ガンマレトロウイルス属(Gammaretrovirus)、デルタレトロウイルス属(Deltaretrovirus)、イプシロンレトロウイルス属(Epsilonretrovirus)、レンチウイルス属(Lentivirus)、およびスプーマウイルス属(Spumavirus)からなる群から選択される属の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、出芽酵母Ty1ウイルス(Saccharomyces cerevisiae Ty1 virus)、キイロショウジョウバエコピアウイルス(Drosophila melanogaster copia virus)、出芽酵母Ty3ウイルス(Saccharomyces cerevisiae Ty3 virus)、キイロショウジョウバエジプシーウイルス(Drosophila melanogaster gypsy virus)、トリ白血病ウイルス(Avian leucosis virus)、マウス乳癌ウイルス(Mouse mammary tumour virus)、マウス白血病ウイルス(Murine leukaemia virus)、ウシ白血病ウイルス(Bovine leukaemia virus)、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス(Walleye dermal sarcoma virus)、ヒト免疫不全ウイルス1(Human immunodeficiency virus 1)、およびチンパンジー泡沫状ウイルス(Chimpanzee foamy virus)からなる群から選択される。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、シストウイルス科(Cystoviridae)、レオウイルス科(Reoviridae)、ビルナウイルス科(Birnaviridae)、トティウイルス科(Totiviridae)、クリソウイルス科(Chrysoviridae)、パルティティウイルス科(Partitiviridae)、およびハイポウイルス科(Hypoviridae)からなる群から選択される科または亜科の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、シストウイルス属(Cystovirus)、オルトレオウイルス属(Orthoreovirus)、オルビウイルス属(Orbivirus)、ロタウイルス属(Rotavirus)、コルティウイルス属(Coltivirus)、アクアレオウイルス属(Aquareovirus)、サイポウイルス属(Cypovirus)、フィジウイルス属(Fijivirus)、フィトレオウイルス属(Phytoreovirus)、オリザウイルス属(Oryzavirus)、アクアビルナウイルス属(Aquabirnavirus)、アビビルナウイルス属(Avibirnavirus)、エントモビルナウイルス属(Entomobirnavirus)、トティウイルス属(Totivirus)、ジアルジアウイルス属(Giardiavirus)、リューシュマニアウイルス属(Leishmaniavirus)、クリソウイルス属(Chrysovirus)、パルティティウイルス属(Partitivirus)、アルファクリプトウイルス属(Alphacryptovirus)、ベータクリオウトウイルス属(Betacryptovirus)、ハイポウイルス属(Hypovirus)、およびヴァリコサウイルス属(Varicosavirus)からなる群から選択される属の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、緑膿菌ファージψ6(Pseudomonas phage ψ6)、哺乳類オルトレオウイルス(Mammalian orthoreovirus)、ブルータングウイルス(Bluetongue virus)、ロタウイルスA(Rotavirus A)、コロラドダニ熱ウイルス(Colorado tick fever virus)、アクアレオウイルスA(Aquareovirus A)、サイポウイルス1(Cypovirus 1)、フィジー病ウイルス(Fiji disease virus)、イネ萎縮ウイルス(Rice dwarf virus)、イネラグドスタントウイルス(Rice ragged stunt virus)、伝染性膵臓壊死症ウイルス(Infectious pancreatic necrosis virus)、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(Infectious bursal disease virus)、ショウジョウバエXウイルス(Drosophila X virus)、出芽酵母ウイルスL-A(Saccharomyces cerevisiae virus L-A)、ランブル鞭毛虫ウイルス(Giardia lamblia virus)、リーシュマニアRNAウイルス1-1(Leishmania RNA virus 1-1)、ペニシリウムクリソゲナムウイルス(Penicillium chrysogenum virus)、アトキンソネラヒポキシロンウイルス(Atkinsonella hypoxylon virus)、ホワイトクローバークリプトウイルス1(White clover cryptic virus 1)、ホワイトクローバークリプトウイルス2(White clover cryptic virus 2)、クリホネクトリアハイポウイルス1-EP713(Cryphonectria hypovirus 1-EP713)、およびレタスビグベイン随伴ウイルス(Lettuce big-vein associated virus)からなる群から選択される。
ある種の実施形態では、前記ウイルスRNAは前記目由来のウイルスのゲノムウイルスRNAをコードしている。ある種の実施形態では、前記ウイルスは、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)、肺炎ウイルス亜科(Pneumovirinae)、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)、フィロウイルス科(Filoviridae)、ボルナウイルス科(Bornaviridae)、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)、ブニアウイルス科(Bunyaviridae)、およびアレナウイルス科(Arenaviridae)からなる群から選択される科または亜科の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、レスピロウイルス属(Respirovirus)、モルビリウイルス属(Morbillivirus)、ルブラウイルス属(Rubulavirus)、ヘニパウイルス属(Henipavirus)、アブラウイルス属(Avulavirus)、ニューモウイルス属(Pneumovirus)、メタニューモウイルス属(Metapneumovirus)、ベシクロウイルス属(Vesiculovirus)、リッサウイルス属(Lyssavirus)、エファメロウイルス属(Ephemerovirus)、サイトラブドウイルス属(Cytorhabdovirus)、ヌクレオラブドウイルス属(Nucleorhabdovirus)、ノビラブドウイルス属(Novirhabdovirus)、マールブルグウイルス属(Marburgvirus)、エボラウイルス属(Ebolavirus)、ボルナウイルス属(Bornavirus)、A型インフルエンザウイルス属(Influenzavirus A)、B型インフルエンザウイルス属(Influenzavirus B)、C型インフルエンザウイルス属(Influenzavirus C)、トゴトウイルス属(Thogotovirus)、アイザウイルス属(Isavirus)、オルトブニアウイルス属(Orthobunyavirus)、ハンタウイルス属(Hantavirus)、ナイロウイルス属(Nairovirus)、フレボウイルス属(Phlebovirus)、トスポウイルス属(Tospovirus)、アレナウイルス属(Arenavirus)、オフィオウイルス属(Ophiovirus)、テヌイウイルス属(Tenuivirus)、またはデルタウイルス属(Deltavirus)からなる群から選択される属の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、センダイウイルス(Sendai virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、流行性耳下腺炎ウイルス(Mumps virus)、ヘンドラウイルス(Hendra virus)、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、ヒト呼吸器多核体ウイルス(Human respiratory syncytial virus)、トリニューモウイルス(Avian pneumovirus)、水泡性口内炎インディアナウイルス(Vesicular stomatitis Indiana virus)、狂犬病ウイルス(Rabies virus)、ウシ流行熱ウイルス(Bovine ephemeral fever virus)、レタス壊死性イエローウイルス(Lettuce necrotic yellows virus)、ジャガイモ黄化萎縮病ウイルス(Potato yellow dwarf virus)、伝染性造血器壊死症ウイルス(Infectious hematopoietic necrosis virus)、ビクトリア湖マールブルグウイルス(Lake Victoria marburgvirus)、ザイールエボラウイルス(Zaire ebolavirus)、ボルナ病ウイルス(Borna disease virus)、A型インフルエンザウイルス(Influenza A virus)、B型インフルエンザウイルス(Influenza B virus)、C型インフルエンザウイルス(Influenza C virus)、トゴトウイウス(Thogoto virus)、伝染性サケ貧血症ウイルス(Infectious salmon anemia virus)、ブニヤムウェラウイルス(Bunyamwera virus)、ハンタンウイルス(Hantaan virus)、ダグビーウイルス(Dugbe virus)、リフトバレー出血熱ウイルス(Rift Valley fever virus)、トマト黄化壊疸ウイルス(Tomato spotted wilt virus)、リンパ球性脈絡骨髄炎ウイルス(Lymphocytic choriomeningitis virus)、カンキツソローシスウイルス(Citrus psorosis virus)、イネ縞葉枯ウイルス(Rice stripe virus)、およびデルタ型肝炎ウイルス(Hepatitis delta virus)からなる群から選択される。特定の実施形態では、前記ウイルスはA型インフルエンザウイルスまたはB型インフルエンザウイルスである。別の特定の実施形態では、前記ウイルスは弱毒化インフルエンザウイルス、低温適応インフルエンザウイルス、温度感受性インフルエンザウイルス、またはこれらの好ましい性質のどんな組合せでも有するウイルスである。一実施形態では、前記インフルエンザウイルスは、インフルエンザB/アナーバー/1/66株ウイルス、例えば、B/アナーバー/1/66の低温適応、温度感受性、弱毒化株を組み込んでいる。別の実施形態では、前記インフルエンザウイルスは、インフルエンザA/アナーバー/6/60株ウイルス、例えば、A/アナーバー/6/60の低温適応、温度感受性、弱毒化株を組み込んでいる。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、レビウイルス科(Leviviridae)、ジシストロウイルス科(Dicistroviridae)、ピコルナウイルス科(Picornaviridae)、セキウイルス科(Sequiviridae)、コモウイルス科(Comoviridae)、ポティウイルス科(Potyviridae)、カリシウイルス科(Caliciviridae)、アストロウイルス科(Astroviridae)、ノダウイルス科(Nodaviridae)、テトラウイルス科(Tetraviridae)、トンブスウイルス科(Tombusviridae)、コロナウイルス科(Coronaviridae)、アルテリウイルス科(Arteriviridae)、ロニウイルス科(Roniviridae)、トガウイルス科(Togaviridae)、フラビウイルス科(Flaviviridae)、ブロモウイルス科(Bromoviridae)、クロステロウイルス科(Closterovirida)、バルナウイルス科(Barnaviridae)、ルテオウイルス科(Luteoviridae)、ティモウイルス科(Tymoviridae)、およびフレキシウイルス科(Flexiviridae)からなる群から選択される科または亜科の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、レビウイルス属(Levivirus)、アロレビウイルス属(Allolevivirus)、クリパウイルス属(Cripavirus)、イフラウイルス属(Iflavirus)、腸内ウイルス属(Enterovirus)、ライノウイルス属(Rhinovirus)、ヘパトウイルス属(Hepatovirus)、カルジオウイルス属(Cardiovirus)、***ウイルス属(Aphthovirus)、パレコウイルス属(Parechovirus)、セキウイルス属(Sequivirus)、ワイカウイルス属(Waikavirus)、コモウイルス属(Comovirus)、ファバウイルス属(Fabavirus)、ネポウイルス属(Nepovirus)、ポティウイルス属(Potyvirus)、ライモウイルス属(Rymovirus)、バイモウイルス属(Bymovirus)、マクルラウイルス属(Macluravirus)、イポモウイルス属(Ipomovirus)、トリティモウイルス属(Tritimovirus)、ベシウイルス属(Vesivirus)、ラゴウイルス属(Lagovirus)、ノロウイルス属(Norovirus)、サポウイルス属(Sapovirus)、ヘペウイルス属(Hepevirus)、ママストロウイルス属(Mamastrovirus)、アバストロウイルス属(Avastrovirus)、アルファノダウイルス属(Alphanodavirus)、ベータノダウイルス属(Betanodavirus)、ベータテトラウイルス属(Betatetravirus)、オメガテトラウイルス属(Omegatetravirus)、トンブスウイルス属(Tombusvirus)、カーモウイルス属(Carmovirus)、ネクロウイルス属(Necrovirus)、ダイアンソウイルス属(Dianthovirus)、マクロモウイルス属(Machlomovirus)、アベナウイルス属(Avenavirus)、アウレウスウイルス属(Aureusvirus)、パニコウイルス属(Panicovirus)、コロナウイルス属(Coronavirus)、トロウイルス属(Torovirus)、アルテリウイルス属(Arterivirus)、オカウイルス属(Okavirus)、アルファウイルス属(Alphavirus)、ルビウイルス属(Rubivirus)、フラビウイルス属(Flavivirus), ペスチウイルス属(Pestivirus)、ヘパシウイルス属(Hepacivirus)、アルファモウイルス属(Alfamovirus)、イラルウイルス属(Ilarvirus)、ブロモウイルス属(Bromovirus)、ククモウイルス属(Cucumovirus)、オレアウイルス属(Oleavirus), クロステロウイルス属(Closterovirus)、クリニウイルス属(Crinivirus)、アムペロウイルス属(Ampelovirus)、バルナウイルス属(Barnavirus)、ルテオウイルス属(Luteovirus)、ポレロウイルス属(Polerovirus)、エナモウイルス属(Enamovirus), トバモウイルス属(Tobamovirus)、トブラウイルス属(Tobravirus)、ホルデイウイルス属(Hordeivirus)、フロウイルス属(Furovirus)、ポモウイルス属(Pomovirus)、ペクルウイルス属(Pecluvirus)、ベニウイルス属(Benyvirus)、イダエオウイルス属(Idaeovirus)、ソベモウイルス属(Sobemovirus)、アンブラウイルス属(Umbravirus)、ティモウイルス属(Tymovirus)、マラフィウイルス属(Marafivirus)、マキュラウイルス属(Maculavirus)、アレクシウイルス属(Allexivirus)、マナドリウイルス属(Manadrivirus)、カーラウイルス属(Carlavirus)、カピロウイルス属(Capillovirus)、フォヴェアウイルス属(Foveavirus)、ポルテクスウイルス属(Potexvirus)、トリコウイルス属(Trichovirus)、ヴィティウイルス属(Vitivirus)、およびウルミアウイルス属(Ourmiavirus)からなる群から選択される属の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、腸内細菌ファージMS2(Enterobacteria phage MS2)、腸内細菌ファージQβ(Enterobacteria phage Qβ)、コオロギ麻痺ウイルス(Cricket paralysis virus)、伝染性軟化病ウイルス(Infectious flacherie virus)、ポリオウイルス(Poliovirus)、ヒトライノウイルスA(Human rhinovirus A)、A型肝炎ウイルス(Hepatitis A virus)、脳心筋炎ウイルス(Encephalomyocarditis virus)、***ウイルス(Foot-and-mouth disease virus)、ヒトパレコウイルス(Human parechovirus)、パースニップイエローフレックウイルス(Parsnip yellow fleck virus)、ライスタングロスフェリカルウイルス(Rice tungro spherical virus)、ササゲモザイクウイルス(Cowpea mosaic virus)、ソラマメウイルトウイルス1(Broad bean wilt virus 1)、タバコリングスポットウイルス(Tobacco ringspot virus)、ジャガイモウイルスY(Potato virus Y)、ドクムギモザイクウイルス(Ryegrass mosaic virus)、オオムギ縞萎縮ウイルス(Barley yellow mosaic virus)、ハリグワモザイクウイルス(Maclura mosaic virus)、サツマイモマイルド斑点ウイルス(Sweet potato mild mottle virus)、コムギスジモザイクウイルス(Wheat streak mosaic virus)、ブタ水疱疹ウイルス(Swine vesicular exanthema virus)、ウサギ出血病ウイルス(Rabbit hemorrhagic disease virus)、ノーウォークウイルス(Norwalk virus)、サッポロウイルス(Sapporo virus)、E型肝炎ウイルス(Hepatitis E virus)、ヒトアストロウイルス(Human astrovirus)、シチメンチョウアストロウイルス(Turkey astrovirus)、ノダムラウイルス(Nodamura virus)、シマアジ神経壊死症ウイルス(Striped jack nervous necrosis virus)、ヌダウレリアカペンシスβウイルス(Nudaurelia capensis β virus)、ヌダウレリアカペンシスωウイルス(Nudaurelia capensis ω virus)、トマトブッシースタントウイルス(Tomato bushy stunt virus)、カーネーション斑紋ウイルス(Carnation mottle virus)、タバコネクロシスウイルスA(Tobacco necrosis virus A)、カーネーションリングスポットウイルス(Carnation ringspot virus)、トウモロコシクロロティック斑点ウイルス(Maize chlorotic mottle virus)、カラズムギクロロティックスタントウイルス(Oat chlorotic stunt virus)、ポソスラテントウイルス(Pothos latent virus)、キビ類モザイクウイルス(Panicum mosaic virus)、伝染性気管支炎ウイルス(Infectious bronchitis virus)、ウマトロウイルス(Equine torovirus)、ウマ動脈炎(Equine arteritis virus)、エラ随伴ウイルス(Gill-associated virus)、シンドビスウイルス(Sindbis virus)、風疹ウイルス(Rubella virus)、黄熱病ウイルス(Yellow fever virus)、ウシウイルス性下痢症ウイルス(Bovine viral diarrhea virus)、C型肝炎ウイルス(Hepatitis C virus)、アルファルファモザイクウイルス(Alfalfa mosaic virus)、タバコ条斑病ウイルス(Tobacco streak virus)、ブロムモザイクウイルス(Brome mosaic virus)、キュウリモザイクウイルス(Cucumber mosaic virus)、オリーブラテントウイルス2(Olive latent virus 2)、ビート萎黄ウイルス(Beet ellows virus)、レタス伝染性黄斑ウイルス(Lettuce infectious yellows virus)、ブドウ葉巻随伴ウイルス(Grapevine leafroll-associated virus 3)、キノコバチルス状ウイルス(Mushroom bacilliform virus)、オオムギ黄萎ウイルスPAV(Barley yellow dwarf virus-PAV)、ジャガイモ葉巻ウイルス(Potato leafroll virus)、エンドウエネーションモザイクウイルス1 (Pea enation mosaic virus-1)、タバコモザイクウイルス(Tobacco mosaic virus)、タバコ茎エソウイルス(Tobacco rattle virus)、オオムギ斑葉モザイクウイルス(Barley stripe mosaic virus)、ムギ類萎縮病ウイルス(Soil-borne wheat mosaic virus)、ジャガイモモップトップウイルス(Potato mop-top virus)、ピーナツクランプウイルス(Peanut clump virus)、サトウダイコンエソ性葉脈黄化ウイルス(Beet necrotic yellow vein virus)、ラズベリーブッシードゥウォーフウイルス(Raspberry bushy dwarf virus)、インゲンマメ南部モザイクウイルス(Southern bean mosaic virus)、ニンジン斑点ウイルス(Carrot mottle virus)、ハクサイ黄化モザイクウイルス(Turnip yellow mosaic virus)、トウモロコシラヤドフィノウイルス(Maize rayado fino virus)、ブドウフレックウイルス(Grapevine fleck virus)、シャロットウイルスX(Shallot virus X)、インディアンシトリスリングスポットウイルス(Indian citrus ringspot virus)、カーネーション潜在ウイルス(Carnation latent virus)、リンゴステムグルービングウイルス(Apple stem grooving virus)、リンゴステムピッティングウイルス(Apple stem pitting virus)、ジャガイモウイルスX(Potato virus X)、リンゴクロロティックリーフスポットウイルス(Apple chlorotic leaf spot virus)、ブドウウイルスA(Grape vine virus A)、およびウルミアメロンウイルス(Ourmia melon virus)からなる群から選択される。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、ナルナウイルス科(Narnaviridae)の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、ナルナウイルス属(Narnavirus)および ミトウイルス(Mitovirus)からなる群から選択される属の一員である。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、からなる群から選択される。
ある種の実施形態では、前記ウイルスは、出芽酵母20SRNAナラウイルス(Saccharomyces cerevisiae 20SRNA narnavirus)およびクリフォネクトリアパラサイチカミトウイルス1 NB631(Cryphonectria parasitica mitovirus-1 NB631)からなる群から選択される科または亜科の一員である。
6. 特定の実施形態
1. プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体（pro-protease）をコードする核酸を含む宿主細胞であって、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸が、宿主細胞のゲノム内に組み込まれており、かつプロテアーゼおよびプロテアーゼ前駆体は、当該細胞内では通常発現しない宿主細胞。
2. プロテアーゼを発現する、実施形態1に記載の宿主細胞。
3. プロテアーゼが、セリンプロテアーゼである、実施形態2に記載の宿主細胞。
4. セリンプロテアーゼが、S1ファミリーのプロテアーゼである、実施形態3に記載の宿主細胞。
5. プロテアーゼが、トリプシンである、実施形態4に記載の宿主細胞。
6. セリンプロテアーゼが、細菌のサブチリシンである、実施形態2に記載の宿主細胞。
7. プロテアーゼが、ストレプトマイセス・グリセウスからのSPRTである、実施形態6に記載の宿主細胞。
8. プロテアーゼが、表1に列挙するプロテアーゼである、実施形態2に記載の宿主細胞。
9. プロテアーゼが、プロテアーゼ前駆体である、実施形態1に記載の宿主細胞。
10. プロテアーゼ前駆体が、トリプシノーゲンまたはストレプトマイセス・グリセウスからのプレプロSPRTプロテアーゼである、実施形態9に記載の宿主細胞。
11. プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現が、誘導性プロモーターの制御下にある、前記実施形態のいずれかに記載の宿主細胞。
12. 誘導性プロモーターが、インターフェロンによってまたはインターフェロンが誘導する下流のシグナル分子によって誘導される、実施形態11に記載の宿主細胞。
13. 誘導性プロモーターが、テトラサイクリン調節性発現系よって誘導される、実施形態11に記載の宿主細胞。
14. プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現が、恒常的に活性のあるプロモーターの制御下にある、実施形態1から10のいずれかに記載の宿主細胞。
15. 核酸が、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の分泌を指示する分泌シグナルを含む、前記実施形態のいずれかに記載の宿主細胞。
16. 哺乳動物細胞である、前記実施形態のいずれかに記載の宿主細胞。
17. イヌ細胞である、実施形態16に記載の宿主細胞。
18. MDCK細胞である、実施形態17に記載の宿主細胞。
19. 霊長類細胞である、実施形態16に記載の宿主細胞。
20. アフリカミドリザル細胞またはヒト細胞である、実施形態19に記載の宿主細胞。
21. 鳥類細胞である、実施形態1から15のいずれかに記載の宿主細胞。
22. ニワトリ細胞である、実施形態21に記載の宿主細胞。
23. 懸濁状態で順応せずに生育する、前記実施形態のいずれかに記載の宿主細胞。
24. インフルエンザウイルスを産生する方法であって、前記実施形態のいずれかに記載の宿主細胞をインフルエンザウイルスに感染させるステップと、当該細胞をインフルエンザウイルスの複製を可能にする条件下で培養するステップと、インフルエンザウイルスを細胞培養から収集するステップとを含む方法。
25. インフルエンザウイルスを産生する方法であって、実施形態1から23のいずれかに記載の宿主細胞にインフルエンザのゲノムをコードする核酸をトランスフェクションするステップと、当該細胞をインフルエンザウイルスの複製を可能にする条件下で培養するステップと、インフルエンザウイルスを細胞培養から収集するステップとを含む方法。
26. 宿主細胞がプロテアーゼを発現し、外因性のプロテアーゼを培地に添加するステップをさらに含む、実施形態24または25に記載の方法。
27. 外因性のプロテアーゼを、約0.1μg/mlの最大濃度まで添加する、実施形態26に記載の方法。
28. 外因性のプロテアーゼが、トリプシンである、実施形態26に記載の方法。
29. 外因的に添加するトリプシンの非存在下でインフルエンザウイルスを複製させる方法であって、宿主細胞をインフルエンザウイルスに感染させるステップと、当該細胞をインフルエンザウイルスの複製を可能にする条件下で培養するステップであって、当該条件が外因的に添加するトリプシンを含まないステップと、インフルエンザウイルスを細胞培養から収集するステップとを含む方法。
30. 外因的に添加するトリプシンの非存在下でインフルエンザウイルスを複製させる方法であって、宿主細胞にインフルエンザのゲノムをコードする核酸をトランスフェクションするステップと、当該細胞をインフルエンザウイルスの複製を可能にする条件下で培養するステップであって、当該条件が外因的に添加するトリプシンを含まないステップと、インフルエンザウイルスを細胞培養から収集するステップとを含む方法。
31. 宿主細胞が、通常は当該細胞によって発現されない、酵素活性を示すプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する、実施形態29または30に記載の方法。
32. 宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態29または30に記載の方法。
33. 宿主細胞が鳥類細胞である、実施形態29または30に記載の方法。
34. 宿主細胞が、霊長類細胞、イヌ細胞、ハムスター細胞、マウス細胞またはラット細胞である、実施形態32に記載の方法。
35. 宿主細胞がMDCK細胞である、実施形態32に記載の方法。
36. 宿主細胞がベロ細胞である、実施形態34に記載の方法。
37. 宿主細胞がニワトリ細胞である、実施形態33に記載の方法。
38. 細胞培養で生育したインフルエンザウイルスの力価を増加させる方法であって、インフルエンザウイルスを細胞培養で培養するステップを含み、細胞培養の細胞は、(i)当該細胞と異種であり、かつ(ii)インフルエンザウイルスの赤血球凝集素を切断する、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を安定して発現し、それによって、異種プロテアーゼおよびプロテアーゼ前駆体を発現しない細胞内でインフルエンザウイルスを培養することよって得た力価と比較して、当該の細胞培養で生育したインフルエンザウイルスの力価を増加させる方法。
39. 細胞が、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を恒常的に発現する、実施形態38に記載の方法。
40. 細胞が、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を誘導性に発現する、実施形態38に記載の方法。
41. 細胞が、プロテアーゼを発現する、実施形態38、39または40に記載の方法。
42. 細胞が、プロテアーゼ前駆体を発現する、実施形態38、39または40に記載の方法。
43. プロテアーゼが、トリプシンである、実施形態41に記載の方法。
44. プロテアーゼが、ストレプトマイセス・グリセウスからのSPRTである、実施形態41に記載の方法。
45. プロテアーゼ前駆体が、トリプシノーゲンまたはストレプトマイセス・グリセウスからのプレプロSPRTプロテアーゼである、実施形態42に記載の方法。
46. インフルエンザの複製を支援することができる宿主細胞内で異種プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を産生するための方法であって、通常は細胞内で発現しないプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を含む細胞を、当該のプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現を可能にする条件下で培養するステップを含み、それによって、細胞内でプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を産生する方法。
47. 宿主細胞が、プロテアーゼを安定して発現する、実施形態46に記載の方法。
48. 宿主細胞が、プロテアーゼ前駆体を安定して発現する、実施形態46に記載の方法。
49. 宿主細胞が、細胞培養の培地中にプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を分泌する、実施形態46、47または48に記載の方法。
50. 宿主細胞が、宿主細胞培養液1ml当たり約0.1ngから約10μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する、実施形態46、47、48または49に記載の方法。
51. 細胞が、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する宿主細胞の培養で生育したウイルスの力価を増加させるのに十分な量のプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する、実施形態46、47、48、49または50に記載の方法。
52. プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現が誘導性である、実施形態46、47、48、49、50または51に記載の方法。
53. プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現が恒常的である、実施形態46、47、48、49、50または51に記載の方法。
54. 配列番号1と少なくとも約90％同一であるヌクレオチド配列をコードする単離核酸。
55. 核酸が、配列番号1のヌクレオチド配列をコードする、実施形態54に記載の核酸。
56. 配列番号2のアミノ酸を含む単離ポリペプチド。
57. 実施形態56のポリペプチドをコードする単離核酸。
58. 実施形態54、55または57に記載の核酸を含む発現ベクター。
59. 実施形態58に記載の発現ベクターを含む単離細胞。
60. プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を安定して発現する宿主細胞を作製する方法であって、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を宿主細胞内に導入するステップと、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を安定して発現する宿主細胞を単離するステップとを含み、当該のプロテアーゼおよびプロテアーゼ前駆体は、当該宿主細胞中では通常発現しない方法。
61. 懸濁状態で粘着性の宿主細胞を生育させる方法であって、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を導入するステップを含み、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれており、かつ当該のプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体は、当該細胞内では通常発現しない方法。
62. 宿主細胞が、プロテアーゼを安定して発現する、実施形態60または61に記載の方法。
63. 宿主細胞が、プロテアーゼ前駆体を安定して発現する、実施形態60または61に記載の方法。
64. 宿主細胞が、細胞培養の培地中にプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を分泌する、実施形態60、61、62または63に記載の方法。
65. 宿主細胞が、宿主細胞培養液1ml当たり約0.1ngから約50μgのプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する、実施形態60、61、62、63または64に記載の方法。
66. 細胞が、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する宿主細胞の培養で生育したウイルスの力価を増加させるのに十分な量のプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する、実施形態60、61、62、63、64または65に記載の方法。
67. プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現が誘導性である、実施形態60、61、62、63、64、65または66に記載の方法。
68. プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現が恒常的である、実施形態60、61、62、63、64、65または66に記載の方法。
69. 宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態60、61、62、63、64、65、66、67または68に記載の方法。
70. 宿主細胞が鳥類細胞である、実施形態60、61、62、63、64、65、66、67または68に記載の方法。
71. 宿主細胞が、霊長類細胞、イヌ細胞、ハムスター細胞、マウス細胞またはラット細胞である、実施形態69に記載の方法。
72. 宿主細胞がMDCK細胞である、実施形態71に記載の方法。
73. 宿主細胞がベロ細胞である、実施形態71に記載の方法。
74. 宿主細胞がニワトリ細胞である、実施形態70に記載の方法。
75. 宿主細胞が細菌細胞である、実施形態60に記載の方法。
76. プロテアーゼが、トリプシンである、実施形態60から62または実施形態64から75のいずれかに記載の方法。
77. プロテアーゼが、ストレプトマイセス・グリセウス由来のSPRTプロテアーゼである、実施形態60から62または実施形態64から75のいずれかに記載の方法。
78. プロテアーゼ前駆体が、トリプシノーゲンである、実施形態60から61または実施形態63から75のいずれかに記載の方法。
以下の例は本発明を説明するためだけの働きをするものであって、本発明をいかなる形でも限定することを意図するものでは決してない。
実施例１
MDCK細胞におけるインフルエンザ株の増殖
本実施例では、インフルエンザを培養するための数種の細胞株の特徴付けを説明する。MRC-5, WI-38, FRhL-2, PerC6, 293, NIH 3T3, CEF, CEK, DF-1, VeroおよびMDCKを含む数種の異なる細胞株および初代細胞を、2種類の実験室適応インフルエンザ株、すなわちA型およびB型由来の遺伝子再集合体の産生のために評価した。前記細胞型の多くが一部の低温適応インフルエンザ株の複製を限られた範囲内で支持したが、MDCKのみが高力価のA型およびB型ウイルスの両方を一貫して産生した。前記MDCK細胞は潜在的汎発性ワクチンであるca A/ベトナム/1203/2004の複製を支持する能力も試験した。MDCK細胞にはca A/ベトナム/1203/2004を低感染多重度（multiplicity of infection）で感染させ、上清中のウイルスを感染後様々な時点で定量した。感染後48時間までに、ca A/ベトナム/1203/2004の力価はおよそ8 log10TCID50/mLに達し、その後の3日から4日間は安定したままであった。図1を参照されたい。
前記実験では、ATCCから入手したMDCK細胞(寄託番号CCL-34)は、米国から供給される10％ウシ胎仔血清を含有する培地、または適切な無血清培地(例えば、SFMV 100)のいずれかで限定された回数増殖させ、最初の特徴付け研究のためにプレマスター細胞ストックを作製した。適切な無血清培地は2004年12月23日出願の米国仮出願第60/638,166号、および2005年1月5日出願の米国仮出願第60/641,139号に記載されている。細胞は両種類の培地で容易に増殖し、両ストックの細胞はそれぞれ下記の表2および図1で示すように低温適応ワクチン株および汎発性株の複製を支持した。
Figure 2008546408
実施例２
MDCK細胞株の腫瘍原性
MDCK細胞の2種類のプレマスター細胞ストック、すなわち血清を含有する培地で増殖された細胞および無血清培地で増殖された細胞の潜在的腫瘍原性を、胸腺欠損ヌードマウスモデルにおいて、その後ワクチン作製のために使用されると期待される5細胞継代を表すと考えられる段階で評価した。腫瘍原性を評価するために、107細胞を10匹のマウスの群に皮下注射し、84日後に前記動物を屠殺し調査した。腫瘍形成が、無血清培地で継代された細胞を接種された前記10動物のうち6動物で観察された。これとは対照的に、10％ウシ胎仔血清を添加した培地で継代された細胞を接種された動物ではどれも腫瘍形成の証拠は存在しなかった。接種部位に幾つかの線維肉腫が観察されたが、表3に示すように血清中で継代された細胞は腫瘍原性ではなかった。
Figure 2008546408
表3に示すように、それぞれの培地の4代継代と20代継代の両方でこの2種類のプレマスター細胞ストックについて核型分析も実施した。10％FCS中で継代された非腫瘍原性細胞は78***中期染色体の中央値を有し、他の染色体数(70〜82)を持つ細胞は比較的限定された分布であった。無血清培地中で継代された細胞も78***中期染色体の中央値を有していたが、52〜82***中期染色体にわたる異数性染色体数を持つ細胞が有意に多く観察された。両方の場合で、カリオロジーでは継代後に変化はなかった。
実施例３
MDCK細胞を無血清培地中で増殖するよう適応させる
ATCC由来のMDCK細胞をガンマ線照射を受けたFBSを含有する培地で継代する。次にこれらの細胞を、細胞バンク作製を支持するように選ばれた無血清培地配合物中で限定された回数継代する。無血清培地は米国仮出願第60/638,166号および同第60/641,139号に記載されている。これらの追加継代は37℃と33℃のいずれかで実施してよい。血清ではなく植物由来添加物を含有する3種類の培地中でのMDCK細胞の継代により、FCS含有培地中で継代されたMDCK細胞の核型に類似の核型を持つ細胞が得られた(データは示していない)。
実施例４
MDCL細胞のクローン化
細胞は、確実に産生細胞が単一の遺伝的集合に由来するように限界希釈法によって生物学的にクローン化された。クローンは倍加時間および相対的腫瘍原性、ならびにウイルス産生を含む種々の表現型特性で選別した。最初の実施可能性試験の実験において、FCS含有培地で54のMDCKクローンが得られた。これらのクローンは継代され、それぞれのクローンに低感染多重度のca A/ニューカレドニア/20/99を感染させた。感染の数日後、上清を取り出し、前記上清中のウイルスの量をTCID50により測定した。前記クローンのうちの少数が、非クローン化親細胞で産生されるよりも大きな、比較的高力価のウイルスを産生した。優れた生物学的特性および生理学的特性を持つクローンを用いて以下に説明するようなマスター細胞バンク(MCB)を樹立する。
実施例５
マスター細胞バンクの試験および特徴付け
外来性因子の証拠がないことを確認するために前記MCBを広範囲に試験する。例えば、下記の表4に示すように、入手可能なウイルス因子に対して数種のPCRおよび/または抗体特異的試験のうちの1つまたは複数を行う。
Figure 2008546408
実施例６
細胞培養由来インフルエンザウイルスの前臨床的特徴付け
本実施例では、細胞培養から産生されたインフルエンザ株ならびに卵から産生されたインフルエンザ株の特徴付けを説明し、それらの系から産生されたウイルスを比較する。一般に、前記インフルエンザウイルスはワクチンとしてヒトで使用するのに適しており、前記ウイルスが当該使用に適したものになる生物学的特性を有している。本実施例では、前記インフルエンザウイルスは低温適応(ca;比較的低温で効率的に複製する能力を有する)であり、温度感受性(ts;比較的高温でのインビトロ複製が制限される)であり、および弱毒化(att;フェレットの肺組織で検出可能な複製がない)しており、本明細書ではca ts att株と呼ばれる。比較には、ウイルス産物の生化学的、抗原性、および遺伝的評価(塩基配列決定)、ヒト細胞における複製に続く前記ウイルスの生物学的および生化学的特徴付け、許容動物モデルにおける複製、ならびに許容動物モデルにおける免疫原性がある。
遺伝的、生化学的、および抗原性比較可能性
A/H1N1型、A/H5N1型、A/H3N2型およびB型のca ts att株はMDCK細胞内では比較的高力価まで複製した。さらに、MDCK細胞でこれらのca ts att株を継代してもそのゲノム配列は変化しなかった。3種類のca ts att株、すなわちca A/シドニー/05/97、ca A/北京/262/95、およびca B/アナーバー/1/94はMDCK細胞内で1回または2回継代し、6つの内部遺伝子全ての全コード領域を塩基配列決定し、出発物質と比較した。ヌクレオチドの変化は観察されず、この基質によるこの継代ではこれらの株の遺伝子組成は変化しないことが実証された。培地組成、投入量(moi)、インキュベーションの温度および回収時期を含む産生プロセスを再現すると期待される条件の下でMDCK細胞中で産生される種々のワクチン株についてさらに配列特徴付けを実施する。予備データに基づけば、MDCK産生ウイルスのゲノム配列には変化はないと期待される。
前記ゲノムはMDCK細胞での継代に続いて遺伝的に安定していたので、卵またはMDCK細胞内で産生されるワクチンの生物学的特徴は区別できないと期待される。しかし、細胞培養からの前記一次ウイルス産物は、卵に基づく産物と比較して、特にHAおよびNAを含むウイルスタンパク質の翻訳後修飾、またはウイルス膜中の脂質組成に関して、幾つかの微妙な相違点を有する可能性があり、その両方の相違点はウイルス粒子の全体的物理特性が潜在的に変化させる恐れがある。細胞培養産生ワクチンおよび卵産生ワクチンの抗原性に関する予備的前臨床データによれば、この重要なパラメータに検出可能な相違点はないことが実証された。数種のワクチン株の卵ストックをMDCK細胞により継代し、両方の産物の抗原性を、標準抗血清を使って前記HAI力価を測定することにより決定した。表5に示すように、前記HAI力価全てがお互いに2倍以内であり、細胞内の前記ワクチンが複製しても、卵由来物質と比較して前記ワクチンの抗原性は変化しないことを示していた。
Figure 2008546408
実施例７
培養中のヒト上皮細胞の感染
一部の実施形態では、ヒト由来細胞中でのMDCKおよび卵産生ワクチンの複製に続いて、生化学的、生物学的、および構造的類似点を評価するために、正常ヒト気管支上皮細胞(NHBE)などの適切な二倍体ヒト細胞でワクチンを1回継代してもよい。この継代はヒト気道における1回感染事象を再現する働きをし、次に前記子孫ウイルス、すなわち有効な免疫応答を誘発することを最終的に司るウイルスの比較を可能にすることになる。前記ワクチンの赤血球凝集素(結合および融合)ならびにノイラミニダーゼ活性の研究はこれらの物質に関して測定され、そしてもちろん電子顕微鏡、感染性粒子の全粒子に対する比、およびウイルスゲノム当量を含む他の生化学的ならびに構造的研究を評価することができる。全体としては、これらの比較は、前記細胞由来ワクチンの、効果的で安全な卵産生ワクチンとの同等性を実証する働きをする。分析的研究の概要は表6にまとめている。
Figure 2008546408
実施例８
前臨床的動物モデル
フェレットは弱毒化したインフルエンザワクチンおよび成分ワクチン株の弱毒化および免疫原性を評価するために用いる確実な動物である。MCBから産生された細胞由来インフルエンザ株の能力は卵で産生された同一株と比較される。対照研究でのこれらの物質の一対一比較により、これらのウイルス産物の同等性の高度な保証が可能になる。
前記2種類のワクチンがフェレットに感染するかまたは「捕える」能力を評価するために、動物に軽度の麻酔をかけ、細胞産生ウイルス調製物または卵産生ウイルス調製物のいずれかを鼻腔内に接種する。鼻洗浄物を接種に続く数時点で収集し、前記動物の上気道におけるウイルス複製の動態および程度を評価するために数種の利用可能な方法のうちの1つによってウイルスの量を評価する。実験は一定範囲の用量で実施し、卵産生株に対する細胞培養増殖株の相対的感染力を一般化するよう多数の株および異なる三価の混合物を含む。これらと同一の研究を、前記インフルエンザ株の免疫原性、すなわち前記ウイルスが感染を惹起する能力に本質的に関連している特性を評価するためにも利用する。動物は、接種後様々な時点(週)で脱血して鼻洗浄物を回収し、これらの標本を用いて、感染に対する血清抗体および鼻のIgA応答を評価する。これらのデータの結果、すなわち感染力、血清抗体、および粘膜抗体応答を用いて、卵産生ワクチンに対する細胞産生ワクチンの相対的感染力を比較し評価する。最も可能性の高い結果は、前記細胞および卵産生ワクチン株は類似する感染力および免疫原性を有するというものであると予想される。細胞由来ワクチンが卵由来産物よりも感染力があるかまたは免疫原性があると思われた場合には、もっと低用量の可能性を評価する研究をさらに実施する。
単一単位ヒト用量で前記細胞培養由来ワクチンを評価するために、多くの免疫原性および複製研究をフェレットモデルで実施する。catsatt株の感染は通常フェレットに強力で迅速な抗体応答を誘発する。さらに、個々のcatsatt株を規定どおりに試験し、これらの動物の鼻咽頭では比較的高力価まで、しかし肺では検出不可能なレベルに複製することによって弱毒化した(att)表現型を表すことが明らかにされる。これらの生物学的特徴に対する細胞培養増殖の影響も評価される。しかし、前記att表現型はこれらの株の遺伝子組成に不可欠な部分なので、いかなる相違点も見られそうにない。これらの株の増殖機構および交差反応性を、これらの動物での単一ヒト用量の投与に続いて評価する。これは、遺伝系統内での多数の株と交差反応する血清抗体を誘導し、さらに細胞由来ワクチンは同一能力を有すると期待される。
これらの同等性評価は、前記一次ウイルス産物の潜在的生化学的および/または生物物理学的相違点についての重大な洞察を提供し、先ずヒト細胞内で前記ウイルスを継代することによって、または動物実験によって測定される前記catsatt株の能力に対するこれらの後成的な相違点の影響を実証するはずである。今日までの配列情報に基づけば、前記catsatt株免疫原性能力に対してMDCK細胞での産生に起因する期待される影響は存在しない。
フェレットはインフルエンザに関して十分に立証された動物モデルであり、catsatt株の弱毒化表現型および免疫原性を評価するために規定どおりに使用される。一般に、8〜10週齢動物を用いて弱毒化を評価し、通常は研究デザインでは試験群または対照群当たりn=3〜5動物を評価する。免疫原性研究は、8週から6か月齢の動物で評価され、通常、被験物質または対照群当たりn=3〜5動物を必要とする。これらの数は群間の統計的に有効なまたは観察的に重要な比較が得られるのに十分な情報を提供する。大半の研究中、インフルエンザ様徴候に気づくことがあるが、可能性は低い。フェレットは食欲または体重低下の徴候、鼻汁または眼漏を見せず、インフルエンザ様疾病の徴候を観察することは研究の不可欠な一部であり、鎮痛剤などの介入は正当ではない。皮膚潰瘍または有意な体重減少などの不快な他の徴候があれば、担当獣医との話合いに続いて前記動物を適切に処分することになるであろう。
実施例９
マスターウイルスシード(MVS)開発
現在、インフルエンザワクチン株は、トリ細胞に野生型ウイルスとA型またはB型MDVのいずれかを同時感染させ、所望の6:2遺伝子配列を求めてその子孫を単離し選別することにより作製されている。このプロセスには、トリ細胞培養物および/またはSPF卵による数継代のウイルスが必要である。最近では、インフルエンザウイルス調製物を作製するためにプラスミドレスキューが導入されている。このプロセスでは、広範囲に試験され特徴付けされた細胞バンク由来のVero(アフリカミドリザル)細胞を、それぞれが8種のインフルエンザRNA断片のうちの1つのcDNAコピーを含有する8種のDNAプラスミドを使ってエレクトロポレーションする。エレクトロポレーションの数日後、これらのエレクトロポレーションされた細胞の上清はインフルエンザウイルスを含有している。次に前記上清をSPF卵内に接種し、前記ウイルス株を増幅し生物学的にクローン化する。これらの両方の手法により、SPF卵内に接種すると前記MVSを産生するワクチン株が得られる。プラスミドレスキューには、より信頼性のある時間的調節、より遺伝的に正確な遺伝子断片および野生型分離株由来の外来性因子による潜在的汚染が少ないことを含む数種の利点があるが、これら2つの方法によって生み出される個々のMVSはお互いに区別ができず、大量のワクチン作製を開始するのに利用することができる。
前記ワクチン株の最終的増幅はMDCK細胞バンク由来の細胞中で行う。この最終的増幅はMDCK細胞の小規模培養物(<20L)を使って実現することが可能である。これらの細胞由来の上清を収集し、濃縮し特徴付けし/試験して前記MVSを作製する。
実施例１０
異種プロタンパク質分解酵素を発現しているMDCK細胞を使った感染性ウイルスのタンパク質分解活性
以下の実施例では、ブタトリプシノーゲンを恒常的に発現しているMDCK細胞株の構築を説明する。
先ず、ブタトリプシノーゲンをコードしている遺伝子をレトロウイルスベクターpLNHX(Clonetech Inc., マウンテンビュー、カリフォルニア)にクローン化した。これを実行するために、トリプシノーゲンをコードし、配列が図11(配列番号3)で示される組換えヌクレオチド配列を合成しシャトルベクターにクローン化した。次に、前記トリプシノーゲン遺伝子を前記シャトルベクターからBglIIを使って消化し、前記pLNHXポリリンカーのBglII部位にクローン化した。こうして作製されたベクターは本明細書ではpTGENと呼ぶ。
次に、pTGENを2種類の異なるパッケージング細胞株、すなわちAmpho 293およびGP2に従来の技法を使ってトランスフェクションした。陽性対照として使用するためのpTGENを含有するレトロウイルス(本明細書ではvTGENと呼ぶ)またはルシフェラーゼ発現ベクター(本明細書ではvLLRNと呼ぶ)を、従来の技法を使って前記パッケージング細胞を溶解することにより感染の48時間後に単離した。MDCK細胞にvLLRNを感染させると、GP2細胞内で産生されたvLLRNは、1)感染の48時間後にMDCK細胞でルシフェラーゼ活性を検出することができたので(図2)、前記ルシフェラーゼ遺伝子を前記MDCKゲノムに導入することができ、2)感染の48時間後に前記MDCK細胞によって発現されるルシフェラーゼの量は前記MDCK細胞に感染させるのに使われたvLLRNの濃度に比例していること(図3)が示された。このように、陽性対照により、前記pLNHX系はMDCK細胞に異種遺伝子をトランスフェクションするのに利用することができること、および当該遺伝子は前記MDCK細胞によって発現されることが実証されている。
pTGENを安定的にトランスフェクションされたクローンを同定するために、以下の手法を用いた。vTGEN、vLLRNまたはvLNHX(陰性対照のみのベクター)を感染させた48時間後に、G418を前記増殖培地に添加して耐性のMDCKクローンを選別した。およそ3週間後、個々のMDCKクローンを単離し、同質遺伝子培養物として増殖させた。
安定的に形質転換したMDCKクローンからのルシフェラーゼの発現を図4に示す。図4に見られるように、ルシフェラーゼを高レベルで発現している12の異なる個別クローンおよび3つのクローンからなる2種類の異なる混合物がこの手法により得られた。前記12の個別クローンは1000細胞当たり約10ngから300ngの間の活性ルシフェラーゼを産生した。このように、これらのデータは、トランスジーンを高レベルで発現する安定的に形質転換されたMDCKクローンがpLNHXベクター系から得られることを実証している。
前記トランスフェクション実験から得られた前記個別クローンおよびクローン混合物の概要は図5に示されている。図5に示すように、トリプシノーゲンを発現している18のMDCKクローンはそれぞれ、Ampho 293細胞およびGP2細胞で産生されたレトロウイルス粒子から単離された。
実施例１１
培養中のトリプシノーゲンを発現しているMDCK細胞におけるインフルエンザ感染および増殖
本実施例では、外因性トリプシンの存在および不在の下でトリプシノーゲンを発現するMDCK細胞における2種類の異なるインフルエンザ株の感染および増殖を説明する。
トリプシノーゲンを発現している2種類のMDCKクローン(1つはMDCK細胞にAmpho293細胞中で産生された粒子をトランスフェクションすることにより産生されたクローン、他方はGP2細胞中で産生された粒子をトランスフェクションすることにより産生されたクローン)のウイルス宿主としての能力は以下の通りに評価された。前記の適当なクローン由来の細胞に株ca A/アナーバー/6/60 MDV-Aまたはca A/ニューカレドニア/20/90のいずれかを時間0時に感染多重度0.01(すなわち、100細胞当たり1インフルエンザウイルス)で感染させた。pLLRNまたはpLNHXをトランスフェクションした細胞を対照として使用した。培養物中のウイルス力価を感染に続く12時間、24時間、48時間、72時間、96時間および120時間に評価した。
実験の1つの群では、外因性ブタトリプシンを、感染24時間後に最終濃度0.1μg/mlまで前記細胞培養物に添加した(中黒丸)。実験の別の群では、培養物中の外因性ブタトリプシンの濃度を1日目(感染24時間後)から5日目(感染120時間後)まで1μg/mlに維持した。実験の最後の群では、外因性トリプシンは全く添加しなかった。
前記実験の結果を図6A〜図6Cとして示している。図6Aは、偽感染MDCK細胞へのMDV-A(上左)またはca A/NC(上右)のインフルエンザ感染、およびルシフェラーゼ発現MDCK細胞へのMDV-A(下左)またはca A/NC(下右)のインフルエンザ感染の結果を示している。期待どおりに、ウイルス全産生量は、外因性トリプシンを1日目から5日目まで1μg/mlまで添加した場合は全実験でかなり大きく(白抜き四角形)、外因性トリプシンを全く添加しなかった場合は産生量が最も低かった(白抜き三角形)。1日目に外因性トリプシンを0.1μg/ml添加してもウイルス産生量が有意に増加することはなかった(中黒丸)。
図6B〜図6Cは2種類の異なるトリプシノーゲン発現MDCKクローンへのMDV-A(左パネル)またはca A/NC(右パネル)のインフルエンザ感染の結果を示している。図6Bに示される実験で使用したMDCKクローンはAmpho 293細胞で産生されたウイルス粒子を使ったトランスフェクションにより作製し、図6Cに示されるこれらの実験で使用したMDCKクローンはGP2細胞で産生されたウイルス粒子を使ったトランスフェクションにより作製した。
図6B〜図6Cで示されるように、ウイルス力価は前記感染した細胞がトリプシノーゲンを発現した場合には有意に増加した。全ての場合に、外因性トリプシンの不在の下で得られたウイルス力価(白抜き三角形)は1μg/mlトリプシンの存在の下で得られたウイルス力価(白抜き四角形)よりも小さかったが、対照群で観察されたウイルス力価よりも大きかった。しかし、幾つかの場合では(例えば、図6B上左、上右および下右、図6C上左および下右)、1日目での少量のトリプシン(0.1μg/ml)の添加(中黒丸)により、得られるウイルス力価は外因性トリプシンの存在の下で観察されるウイルス力価に匹敵するほど増加した。いかなる特定の理論や作用機序にも縛られるつもりがなければ、外因性トリプシンの添加だけで、トリプシノーゲンのプロペプチドを切断し、それによってプロ酵素をその完全に活性な形にまで活性化すると考えられる。このように、培養を少量のペプチダーゼで「刺激」してやると、前記培養中の細胞により産生されるプロ酵素が活性化され、ウイルス全産生量を増加することができる。
実施例１２
MDCK細胞中でのタグ付きトリプシノーゲンの発現
本実施例では、MDCK細胞における6ヒスチジン残基のタグが付いたトリプシノーゲンの作製および検出を説明する。
トリプシノーゲンを高レベルで発現しているクローンを同定するために、別の組のクローンを、6xHis標識トリプシノーゲン融合タンパク質をコードする遺伝子をMDCK細胞にトランスフェクションすることにより作製した。つまり、図11として示されるブタトリプシノーゲンをコードする組換えヌクレオチド配列をポリリンカーのpDEST(商標)26(Invitrogen Inc., カールズバッド、カリフォルニア)にクローニングし、得られたベクターをMDCK細胞にトランスフェクションした。前記pDEST(商標)26プラスミドは、pDEST(商標)26から人工的トリプシノーゲン遺伝子を発現すると6xHisタグ付きのブタトリプシノーゲンを産生するように前記ポリリンカーに隣接して6xHisタグをコードしている。次に、前記トランスフェクションされた細胞を48時間培養し、次にトランスフェクタントをG418の存在の下で約3週間培養することにより選別した。その後、16のG418耐性クローンを単離し単一クローンとして増殖させた。
次に、前記16のクローンによるトリプシノーゲンの発現をウエスタンブロット法により評価した。つまり、それぞれのクローンを1〜2日培養し、次に遠心分離により前記細胞を収集し、その細胞を1×リン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄し、次に前記細胞を200μlの1×タンパク質溶解緩衝液(Promega Corp.;マディソン、ウィスコンシン)中で溶解することによりタンパク質を前記細胞から単離した。次に、それぞれのタンパク質溶解物10μlを、ウエスタンブロット分析のために12％変性ポリアクリルアミドゲルにロードした。6×His標識トリプシノーゲンをトリプシンに特異的なウサギ抗トリプシンポリクロナール抗体(Chemicon AB1823; Chemicon International;テメキュラ、カリフォルニア)を1:10,000に希釈して用いて検出した。1:3,000に希釈したヤギ抗ウサギHRPコンジュゲート化二次抗体を添加し、2回洗浄し、ECLと基質(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.;ピスカタウェイ, ニュージャージー)を添加することによりタンパク質を可視化した。ウエスタンブロット法の結果は図7Aおよび図7Bとして示している。これらの図に示すように、16のG418耐性MDCKクローンのうちの12が6×His標識トリプシノーゲンを検出可能な量で産生した。
実施例１３
誘導性プロモーターの制御の下でのMDCK細胞におけるトリプシンの発現
本実施例では、誘導性プロモーターの制御の下でトリプシンを発現するMDCK細胞株の構築を説明する。
ウイルス感染に続く適切な時間に細胞培養物にトリプシンを提供する別の方法を試験するために、誘導性プロモーターの制御の下でトリプシンを発現するMDCK細胞を以下の通りに作製した。先ず、MDCK細胞株にpcDNA(商標)6/TR(Invitrogen, Inc., カールズバッド、カリフォルニア)をトランスフェクションし、トランスフェクタントはブラストサイジンの存在の下で培養することにより選別した。次に、抗生物質耐性クローンを単離し、単一クローンから増殖させた。
次に、前記個々のクローンにおける組込み型ベクターからのテトラサイクリン(tet)抑制タンパク質の発現を陽性対照ベクターpDEST30Luc.(Invitrogen, Inc., カールズバッド、カリフォルニア)を使って試験した。この実験の目的は、ドキシサイクリン(dox)の不在の下では非常に低いルシフェラーゼ発現を有しdoxの存在の下では高発現を有するのに十分なtet抑制タンパク質を発現するMDCKクローンを同定することであった。これを実行するために、選別対象のそれぞれのクローン由来のおよそ20,000細胞を6ウェルマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに入れた。各試料に従来の技法を使ってpDEST30Lucを一過性にトランスフェクションし、次にトランスフェクションに続く1日目に前記ウェルのうちの3ウェルにdoxを添加した。前記細胞はトランスフェクションに続く2日目に回収し、20μlの上清を各ルシフェラーゼ検定のために使用した。
12のクローンについてのルシフェラーゼ検定の結果は図8として示している。図8に示すように、クローン3はドキシサイクリンの存在および不在の下で観察された活性で最大の差を示した。36のMDCK-Trexクローンを一過性ルシフェラーゼ検定により選別した。2つのクローン、MDCK/R3およびMDCK/R7を誘導性トリプシン発現MDCK細胞を作製するために選別した(発光量比(fold induction): それぞれ+DC/-DC=13.1および14.0)。MDCK/R3またはR7にpT-Rex-DEST30/ルシフェラーゼ(図13)を対照としてトランスフェクションした。29の抗生物質耐性クローンR3/LucおよびR7/Lucを単離し、ドキシサイクリン(DC)誘導ありまたは誘導なしでのルシフェラーゼ検定のために増殖させた。前記化学的誘導後、R3では最大70倍の差、R7では最大56倍の差がある(+DC/-DC=70および56)。本データは、R3/LucおよびR7/Lucクローンはルシフェラーゼ遺伝子を安定的に担持していること、およびルシフェラーゼ発現はDCにより誘導可能であることを示している。
誘導性トリプシン発現MDCK細胞を作製するために、MDCK/R3またはR7にpT-Rex-DEST30/トリプシン(図13)をトランスフェクションして、抗生物質耐性クローンを2〜3週間MDCK増殖培地＋ブラストサイジン/G418を使って選別した。トリプシンを発現している70のクローンを単離し、プロテアーゼ活性検定のために増殖させた。これらのクローン由来のゲノムDNAを単離し、トリプシン遺伝子はPCRにより検出した。DNA配列分析によってはDNAヌクレオシド変異体は全く発見されなかった。
次に、ドキシサイクリンの存在および不在の下で観察された活性で最大の差を示すクローンを、トリプシノーゲンを誘導的に発現している細胞上で培養されたインフルエンザウイルスの増殖および力価を評価する実施例11に記載する研究などの増殖曲線研究により評価する。およそ15のクローンはDC誘導では高トリプシンを、DCなしでは低トリプシン発現を有していた。例えば、1つのクローンR3/6U7は、DCの不在の下では約10ng/mlのベースライントリプシン発現を有するが、この発現は3μg/ml DCで誘導すると約2.5μg/ml(約250の発光量比)まで増加する。大半のインフルエンザワクチン株の複製のために、トリプシンは通常約1.0μg/mlの濃度で使用する。これらの細胞におけるトリプシンの発現レベルは、インフルエンザワクチン作製のために種々のDC濃度で誘導され制御される。
多くの誘導性トリプシン発現MDCKクローンは、ワクチン作製のために有用なインフルエンザ株の感染および複製に許容的である。親MDCK細胞は通常懸濁液中の細胞のうちの10％未満で接着細胞として増殖する。しかし、前記誘導性トリプシンMDCKクローンは、懸濁細胞中で増殖している細胞のうちの約30％でより低い接着性である。懸濁液中の細胞のうちの大多数(>90％)はトリパンブルー染色検定により生存可能である。外因性トリプシン発現を調整することにより、懸濁液中の細胞の割合は増加させることができる。インフルエンザワクチン作製のために懸濁細胞を使用すれば、担体の必要性を排除することにより製品価格を下げることができる。
実施例１４
ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)由来の細菌性セリンプロテアーゼのクローニング
本実施例では、細菌ストレプトマイセス・グリセウス由来のセリンプロテアーゼのクローニングを説明する。
これを実行するため、プライマーペア(SprT順方向および逆方向)を用いて、ゲノムDNAから前記SPRTプロテアーゼのコード配列を従来の技法を使って増幅した。プライマーペアのヌクレオチド配列は図12として示している。ATCC(寄託番号23915)に寄託されたストレプトマイセス・グリセウス株をゲノムDNAの供給源として使った。次に、前記sprT遺伝子を従来の技法を使ってpDEST(商標)14にクローニングし、前記sprT遺伝子のヌクレオチド配列を従来の技法を使って決定した。
sprT遺伝子のヌクレオチド配列を図9として示している。
前述の発明は明瞭さおよび理解を目的にある程度詳細に説明してきたが、本発明の真の範囲から逸脱することなく形式および詳細において種々に変更できることは本開示を読めば当業者にとっては明白となるであろう。例えば、上記の技法および装置は全て種々の組合せで使うことができる。刊行物、特許、特許出願、または本出願に引用したその他の文書は全て、個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文書がそれぞれ、あらゆる目的のために参照によって組み込まれていることを個別に示している場合と同じ程度にあらゆる目的のために参照によりその全体として組み込まれているものとする。さらに、2006年4月19日出願の米国仮特許出願第60/793,522号、2006年4月19日出願の米国仮特許出願第60/793,525号、2005年7月22日出願の米国仮特許出願第60/702,006号、2005年7月15日出願の米国仮特許出願第60/699,556号、2005年7月15日出願の米国仮特許出願第60/699,555号、2005年6月21日出願の米国仮特許出願第60/692,965号、および2005年6月21日出願の米国仮特許出願第60/692,978号はあらゆる目的のために参照によりその全体として組み込まれているものとする。
MDCK細胞におけるca A/ベトナム/1203/2004(H5N1)の複製を示す図である。 種々のレトロウイルスベクターをトランスフェクションした細胞において観察されるルシフェラーゼ活性の量を表す表である。 MDCK細胞で観察されるルシフェラーゼ活性を、前記MDCK細胞に感染するのに使われたレトロウイルス粒子の濃度と比較するグラフである。 12の異なる単一MDCKクローンおよびMDCKクローンの2種類の異なる混合物におけるルシフェラーゼ発現を示す表である。 2種類の異なるパッケージング細胞株で産生されたウイルス粒子から得られ、3種類の異なるベクターをトランスフェクションされたMDCKクローンの概要を示す表である。 図6AはMDCKクローン(対照クローン)にMDV-Aまたはca A/NCインフルエンザ株を感染させることにより得られるインフルエンザウイルス力価のグラフである。外因性トリプシン添加:0.0μg/ml、中抜き三角形;1日目に0.1μg/ml、中黒丸;1日目〜5に1.0μg/ml、中抜き四角形。 図6BはMDCKクローン(Amphoトリプシノーゲンクローン)にMDV-Aまたはca A/NCインフルエンザ株を感染させることにより得られるインフルエンザウイルス力価のグラフである。外因性トリプシン添加:0.0μg/ml、中抜き三角形;1日目に0.1μg/ml、中黒丸;1〜5日目に1.0μg/ml、中抜き四角形。 図6CはMDCKクローン(GP2トリプシノーゲンクローン)にMDV-Aまたはca A/NCインフルエンザ株を感染させることにより得られるインフルエンザウイルス力価のグラフである。外因性トリプシン添加:0.0μg/ml、中抜き三角形;1日目に0.1μg/ml、中黒丸;1日目〜5に1.0μg/ml、中抜き四角形。 図7Aは16のMDCKクローンのうちの12における6xHis標識トリプシノーゲンの発現を表すウエスタンブロットである。図7Bは16のMDCKクローンのうちの12における6xHis標識トリプシノーゲンの発現を表すウエスタンブロットである。 15の異なるMDCKクローンにおける誘導性ルシフェラーゼ発現を示す表である。 ストレプトマイセス・グリセウス由来のセリンプロテアーゼをコードするsprT遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号1)を示す図である。 sprT遺伝子によりコードされるストレプトマイセス・グリセウス由来のセリンプロテアーゼのアミノ酸配列(配列番号2)を示す図である。 トリプシノーゲンをコードするヌクレオチド配列(配列番号3)を示す図である。 sprT遺伝子をクローン化するのに使われる順方向および逆方向プライマー(それぞれ配列番号4および5)を示す図である。 R3/7クローンにトランスフェクションされるpT-Rex-DEST30/ルシフェラーゼおよびpT-Rex-DEST30/トリプシンプラスミドの概略地図である。

Claims (22)

  1. プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体（pro-protease）をコードする核酸を含む宿主細胞であって、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸が、宿主細胞のゲノム内に組み込まれており、かつプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体は、前記細胞内では通常発現していない、上記宿主細胞。
  2. プロテアーゼを発現する、請求項１に記載の宿主細胞。
  3. プロテアーゼが、セリンプロテアーゼである、請求項２に記載の宿主細胞。
  4. プロテアーゼが、プロテアーゼ前駆体である、請求項１に記載の宿主細胞。
  5. プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現が、誘導性プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の宿主細胞。
  6. プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現が、恒常的に活性のあるプロモーターの制御下にある、請求項１に記載の宿主細胞。
  7. 核酸が、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の分泌を指示する分泌シグナルを含む、請求項１に記載の宿主細胞。
  8. 哺乳動物細胞である、請求項１に記載の宿主細胞。
  9. 哺乳動物細胞が、ヒト細胞、霊長類細胞、イヌ細胞、ハムスター細胞、マウス細胞またはラット細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
  10. 鳥類細胞である、請求項１に記載の宿主細胞。
  11. 懸濁状態で順応なしで増殖する、請求項１に記載の宿主細胞。
  12. インフルエンザウイルスを生成する方法であって、
    （ａ）請求項１に記載の宿主細胞をインフルエンザウイルスに感染させるか、または該宿主細胞にインフルエンザゲノムをコードする核酸をトランスフェクションすることによって、該宿主細胞内にインフルエンザゲノムを導入するステップと、
    （ｂ）前記細胞をインフルエンザウイルスの複製を可能にする条件下で培養するステップと、
    （ｃ）インフルエンザウイルスを細胞培養から収集するステップと
    を含む、上記方法。
  13. 宿主細胞がプロテアーゼ前駆体（pro-protease）を発現し、外因性のプロテアーゼを培地に添加するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 外因性のプロテアーゼを、約０．１μｇ／ｍｌの最大濃度まで添加する、請求項１３に記載の方法。
  15. 外因的に添加するプロテアーゼの非存在下でインフルエンザウイルスを複製させる方法であって、
    （ａ）請求項１に記載の宿主細胞をインフルエンザウイルスに感染させるか、または該宿主細胞にインフルエンザゲノムをコードする核酸をトランスフェクションすることによって、該宿主細胞内にインフルエンザゲノムを導入するステップと、
    （ｂ）前記細胞をインフルエンザウイルスの複製を可能にする条件下で培養するステップであって、前記条件が外因的に添加するプロテアーゼを含まないステップと、
    （ｃ）インフルエンザウイルスを細胞培養から収集するステップと
    を含む、上記方法。
  16. 細胞培養で増殖したインフルエンザウイルスの力価を上昇させる方法であって、インフルエンザウイルスを細胞培養で培養するステップを含み、細胞培養の細胞は、（ｉ）前記細胞と異種であり、かつ（ｉｉ）インフルエンザウイルスの赤血球凝集素を切断する、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を安定して発現し、それによって、異種プロテアーゼおよびプロテアーゼ前駆体を発現しない細胞内でインフルエンザウイルスを培養することよって得た力価と比較して、前記細胞培養で増殖したインフルエンザウイルスの力価を上昇させる、上記方法。
  17. インフルエンザの複製を支援することができる宿主細胞内で異種プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を生成するための方法であって、通常は該細胞内で発現していないプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体をコードする核酸を含む細胞を、前記のプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体の発現を可能にする条件下で培養するステップを含み、それによって、細胞内でプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を生成させる、上記方法。
  18. 細胞が、プロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する宿主細胞の培養で増殖したウイルスの力価を上昇させるのに十分な量のプロテアーゼまたはプロテアーゼ前駆体を発現する、請求項１７に記載の方法。
  19. 配列番号１を含む単離核酸。
  20. 配列番号２のアミノ酸を含む単離ポリペプチド。
  21. 請求項１９に記載の核酸を含む発現ベクター。
  22. 請求項２１に記載の発現ベクターを含む単離細胞。
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