JP2008537136A - 微視的要素のマルチパラメトリック分析のための装置及び方法 - Google Patents
微視的要素のマルチパラメトリック分析のための装置及び方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
ここで、「微視的要素」とは、微視的な寸法のあらゆる要素、特に生物学的粒子又は細胞(原核生物又は真核生物)を意味することが理解される。
広範に用いられる技術の中でも、透過、回折、反射、及び屈折を含む、散乱技術として知られているもの、並びに、蛍光及び燐光を含む光ルミネセンスとして知られているものに特に言及することができる。これらは、別個で又は組み合わせて、形状、容積、大きさ、色、密度、構造、生化学的性質、又は粒径分布についての情報を特に取得することを可能にする。
各々の測定原理は、比較的単純な物理的な方法であるが、これらの測定の同時増倍は、それらを使用不能にするような程度まで後者を干渉する可能性がある相互作用を誘起させる。このように、多数の測定の実施は、これらの相互作用を防止する能力によって制限される。
例えば、容積及び屈折率は、単一波長及び2つの異なる観察角度に基づく散乱分析の結果から推論することができる。この検出モードは、例えば、TECHNICON Instruments Corp.からの米国特許第4,735,504号において記載されている。この特許において記載される光学系は、2つの異なる角度範囲にわたり回折される光の測定を用い、要素の光学反応と、容積及び屈折率が較正された要素の光学反応とを比較することにより、要素の容積及び屈折率の値を分離することを可能にする。これらのデータ値の処理は、Gustav MIEによって開発され、特にインターネット・アドレス<http://en.wikipedia.org/wiki/Mie_scattering>において記載される、球状粒子による光散乱理論に基づいている。
蛍光は、励起可能な分子がその特性波長の1つにおける光エネルギーによる励起後に基底状態に戻るときに誘起される現象であることが想起される。蛍光発光は、常に、励起の周波数より低い周波数で生じる。蛍光発光は、実質的に等方性である。測定は、一般的に、入射光の励起軸から離れる方向で、光学フィルタを通して行われて、関心のあるスペクトル帯域のみを検出器に伝送する。
免疫プローブの実施によるこうしたマーキング・モードは、細胞学的同定のため、特に既述のフローサイトメトリー技術によって普及した。Ortho Diagnostics Inc.という会社からの特許第EP0 022 670号は、その抗原算出基によりフローサイトメトリーを用いた種々の細胞同定を記載する。この特許において記載される技術は、現在、効率的で、安全な、信頼性のある細胞同定技術として認識される免疫表現法の非常に広範な発展への扉を開いた。
同時に、John A.Steinkampによる、「A Modular Detector for Flow Cytometric Multicolor Fluorescence Measurements」、1987年、サイトメトリー8、pp.353−365の文献において示される、分析装置内の蛍光測定波長の増倍は、ますます多くのマーカーの使用、したがってますます多くの抗体の使用を可能にしたが、また、装置及びその実施の複雑さも極めて重大に増加させた。
スペクトルの重なりについてのこれらの問題を克服するためには、「Spectral Compensation for Flow Cytometry Visualization Artifacts, Limitations and Caveats」サイトメトリー45、pp.194−205の文献において示されるように、全体的には他の微視的要素のスペクトルの重なりの比例部分によって分析される微視的要素の蛍光信号を減少させることにある「補償」と呼ばれる補正法が、一般的には使用される。
幾つかの励起波長の使用は、色素選択の幅を広くすることを可能にし、発光スペクトルをより容易に分離することを可能にする。J.Steinkampによる「Improved multilaser/multiparameter flow cytometer for analysis and sorting of cells and particles」、John A.Steinkamp、Robert C.Habbersett、及びRichard D.HiebertによるReview of Scientific Instruments、第62(11)号、pp.2751−2764、1991年11月の論文において記載されるように、種々の励起波長は、この場合は、測定タンク内でしばしば空間的に分離されて、幾つかの独立した測定の利点を提供する。この方法に関する問題には、空間的な変位が応答における時間的な位相シフトを誘起させ、しかも、アナログ様式で情報を遅延させるか又はソフトウェア手段によって測定を再調整することによって、下流側で情報の再調整を行う必要がある、という事実が存在する。
結果の解釈におけるエラーのリスクのレベルはパラメータの数と共に増加し、これらの機器の使用は、不適切で誤った、したがって潜在的に危険な結果を得るリスクを覚悟の上で、極めて特殊な技師に限定される。
・第1に、微視的要素を分析するための測定空間と、
・第2に、少なくとも2つの異なる分析波長を有し、相互作用放射線を形成するために測定空間内の微視的要素と相互作用するように設計された放射線を放出する少なくとも1つの供給源と、
・第3に、測定空間から出る相互作用放射線の少なくとも一部を電気信号に変換する役割を果たす検出手段と、
・第4に、分析された微視的要素を表すデータを求めることを可能にするように電気信号を分析する役割を果たす分析手段と、
を含む、微視的要素を分析するための装置を提供する。
ここで、「相互作用放射線」とは、分析ビームと分析される微視的要素との間の相互作用から生じる放射線のことを指す。この相互作用放射線は、特に、散乱(屈折、反射、回折)及び/又は光ルミネセンス(蛍光、燐光)による放射線とすることができる。
本発明による装置は、
・コード化された放射線が測定空間内で共役されることと、
・i)異なるコードで測定空間の上流側の放射線をエンコードする役割を果たすコード化手段と、ii)検出手段の上流側の、その波長の関数として蛍光及び/又は散乱相互作用放射線を選択的にフィルタリングする役割を果たす光学フィルタリング手段とを含むことと、
・その分析手段は、電気信号をデコードして、それらがそれらの元のコードの関数として分析される役割を果たすデコード化手段を含むこと、
を特徴とする。
これらのパルスは、同期又は非同期とすることができる。同期パルスの場合は、全ての波長は、分析される微視的要素と同時に相互作用する。非同期パルスの場合は、波長は、分析される微視的要素と逐次的に相互作用する。光学フィルタリング手段は、実行される補償を回避するように、所与の族の蛍光色素に合わせて、かつ所与の種類のコード化に合わせて設計される。
・その光学フィルタリング手段は、その波長が2つの分析波長の間にそれぞれ挿入され、最長の分析波長を越えて配置される蛍光分析帯域に属する蛍光相互作用放射線を選択的にフィルタリングする役割を果たすことができ、
・そのコード化手段は、周期的に及び/又は正弦的に分析放射線の強度をコード化する役割を果たすことができ、
・そのコード化手段の少なくとも一部は、供給源に組み込むことができる、放射線のための分布出力部の上流側の供給源に作用することができ、
・そのコード化手段の少なくとも一部は、分析放射線を形成するように供給源の下流側の放射線に作用することができ、
・そのコード化手段は、分析放射線を形成するように、例えば音響光学変調器によって、供給源により放出される放射線の強度を変調することができ、
・供給源は、必要に応じて、その分析放射線が測定空間内で共役される、単色型の、及び/又は少なくとも1つの発光ダイオードの、少なくとも2つの結合レーザーを含むことができ、変形態様としては、供給源は、例えば、多色レーザー、白熱ランプ、又はアーク・ランプのような、実質的に連続する多色光源を含むことができ、
・供給源は、連続するモード及び/又はパルス・モードによって分析放射線を放出することができ、
・供給源により放出される各々の分析放射線ビームの強度は、調整可能とすることができ、
・その検出手段は、分析される微視的要素上の分析放射線によって誘起される(散乱及び蛍光プロセスを表す)相互作用放射線の検出専用の様々な感光センサを含むことができ、変形態様としては、検出手段は、散乱プロセスを表す相互作用放射線の検出専用であり、測定空間内の分析放射線の伝搬の全体的な方向を遮断する軸によって定められる位置に埋め込まれた様々な感光センサを含むことができ、この軸は、全体的な方向に対して0°から360°までの範囲の角度をなして配向され、
・その分析手段は、散乱プロセスを表す相互作用放射線の変換によりもたらされる信号から分析された微視的要素の1つの種類の反射率を推論することを可能にすることができ、特に、微視的要素が血液試料に属するときは、分析手段は、特に赤血球内ヘモグロビン含有物又は白血球の細胞質内タンパク質含有物を求めることを可能にすることができ、
・その分析手段は、分析放射線と2つの発光剤との間の相互作用によりもたらされる信号から、異なる波長を有する2つの発光剤(又は蛍光色素)間のエネルギー伝達を表す結合の度合いを推論することを可能にすることができる。
・測定空間(CM)内の微視的要素は、相互作用放射線を形成するように、測定空間(CM)内で共役され、少なくとも2つの異なる分析波長及び異なる選ばれたコードによるコード化を有する分析放射線により照射される第1のステップと、
・相互作用放射線の少なくとも一部が集光され、次いで、その波長の関数として分離され、フィルタリングされる第2のステップと、
・フィルタリングされた相互作用放射線が検出され、次いで、電気信号に変換される第3のステップと、
・検出された信号が、分析された微視的要素を表すデータを求めることを可能にするように、それらの元のコードの関数としてデコードされる第4のステップと、
を含む、微視的要素を分析するための方法を提供する。
・第1のステップにおいては、分析放射線は、分析される微視的要素に逐次的に又は同時に適用することができ、
・第1のステップにおいては、正弦的な変調は、分析放射線の強度に適用することもでき、
・第2のステップにおいては、その波長が2つの分析波長の間にそれぞれ挿入され、最長の分析波長を越えて配置される蛍光分析帯域に属する蛍光相互作用放射線は、選択的にフィルタリングすることができ、
・第4のステップにおいては、分析された微視的要素の1つの種類の反射率は、散乱プロセスを表す相互作用放射線の変換によりもたらされる信号から推論することができ、特に、微視的要素が血液試料に属するときは、赤血球内ヘモグロビン含有物又は白血球の細胞質内タンパク質含有物を特に求めることができ、
・第4のステップにおいては、異なる波長を有する2つの発光剤(蛍光色素)間のエネルギー伝達を表す結合の度合いは、分析放射線と2つの発光剤との間の相互作用によりもたらされる信号から推論することができる。
添付の図面は、本発明を完全なものにするためばかりでなく、必要に応じて、その定義に寄与するためにも用いられることが可能である。
以下において、装置DAは、血液試料中の微視的要素のフローサイトメトリーにおけるキャラクタリゼーション及び計数専用であると考えられる。しかしながら、本発明は、この種の試料又はフローサイトメトリーに限定されるものではない。本発明は、実際は、蛍光及び/又は光散乱によって光学的に分析される微視的要素を含むあらゆる種類の試料、特に流体又は生物学的試料中の粒子に関する。
・分析される試料の微視的要素が配置される(又は通過する)測定タンク(又は測定領域、或いは、場合によっては測定ウィンドウ)と呼ばれることがある1つの測定空間CMと、
・測定空間(CM)内で共役される、少なくとも2つの異なる分析波長λiからλnを有する放射線Riを放出する役割を果たす1つの(又は幾つかの)供給源〔図1Aの場合は、幾つかの波長を出すために単一の供給源Sが用いられ、図1Bの場合は、各々が1つの波長を送出するために3つの供給源が用いられ、定義上、ここでは、図1Bにおける異なる供給源は放射線源の下位部分を形成すると考えられる〕と、
・コード化が例えば図2Aから図2Cまでに示される種類である場合に、少なくとも特定のコードωi(ここで、i=1からnまで、例えば、n=2又は3)により波長λiの各々の光放射線ビームRiをコード化する(変調する)役割を果たし、場合によっては制御モジュールMCによって制御されるコード化手段Mと、
・最長の、分析波長λnを越えて配置される(最長波長を有する)最後のものを除いて、場合によっては微視的要素と相互作用した後で、測定空間CMから生じる相互作用放射線を選択的にフィルタリングする役割を果たし、各々が2つの分析波長λiとλi+1との間に挿入される蛍光分析帯域Biにその波長が属することが好ましい、光学フィルタリング手段FOと、
・場合によっては微視的要素と相互作用した後で、測定空間から生じる蛍光及び/又は散乱相互作用放射線の少なくとも一部を電気信号に変換する役割を果たす感光センサ(又は光センサ)を含む検出手段DF及び/又はDEと、
・分析された微視的要素を表すデータを求めることを可能にするようにそれらのコードωiの関数としてそれらを分析するための、検出手段DF及び/又はDEによって伝送された電気信号をデコードする役割を果たす少なくともデコード化手段DRF及び/又はDREを含む分析手段MAと、
を含む。
・関連するデコード化手段DRFをもつ蛍光DF専用の検出手段と関連するが、散乱DE及び関連するデコード化手段DRE専用の検出手段はもたない光学フィルタリング手段FOか、
・関連するデコード化手段DRFをもつ蛍光DF専用の検出手段と関連する光学フィルタリング手段FO、並びに、関連するデコード化手段DREをもつ散乱DE及び専用の検出手段と関連する光学フィルタリング手段FOか、
・散乱DE及び関連するデコード化手段DRE専用であるが、関連するデコード化手段DRFをもつ蛍光DF専用の光学フィルタリング手段FOも検出手段ももたない他の検出手段、
のいずれかをもつ。
図1Aの例においては、供給源Sは、
であるとすると、それぞれの波長λ1からλnのn個の放射線ビームRiの重ね合わせからなる単一光ビームを生成す役割を果たす。図1Bの例においては、3つの供給源Sの各々が、波長λi(λ1、λ2、又はλ3)の1つの放射線ビームRi(R1、R2、又はR3)からなる単一光ビームを生成する役割を果たす。
微視的要素の蛍光レベルを制御するこうした可能性のために、供給源Sは、光学「シンセサイザ・イコライザ」とも呼ばれる。
供給源Sが、例えば、半導体レーザーのようなレーザー、又は発光ダイオードを含むときは、コード化は、注入電流に作用することによって達成することができ、この場合、変調器Mは、放射線ビームの各々に適用されるコードの画像電流を送給することが可能な電気発電機である。コード化が正弦型のものであるときは、コード化は、特に、後述される種々の実験的な考慮事項の関数である固定変調周波数ωiで構成される。
nの放射線Riのビームは、当業者には公知の任意の技術によって予めマークされ及び/又は染色された微視的要素(ここでは、生物細胞)と相互作用する測定(又は計数)空間内部には示されない光学手段によって合焦される。
異なる種類の蛍光色素の数は、ここでは、説明を容易にするために3つに限定される。しかしながら、本発明は、この数に限定されるものではない。これは、実際は、任意の所与の数の蛍光色素に当て嵌まり得る。
各々の帯域Biに対しては、蛍光検出器DFiが対応することが好ましい。
ここで、[PM0]は、この(n=3)蛍光検出器DFiによって送給される光電信号の行列であり、添え字0は、エネルギー伝達がない蛍光信号を示す。ここでの[C]、[D]及び[E]は、蛍光光ビームを算出することを可能にする伝達行列である。ここで、[Q]は、モル数と表現される、(n=3)蛍光色素の量Q1からQ3の行列である。
行列[PM0]及び関連する係数の分解の考査は、測定信号の一次結合なしで、各々のモル濃度Qiを求めることが可能であることを示す。前述の書き方規約によって、モル濃度Qiは、付録における式A5からA7によって与えられる。これらの3つの式A5から式A7においては、項PMi(ωi)は、コードωiの特徴を表す。
したがって、所与の蛍光色素のモル濃度を求めるために、(種々の信号の一次結合の)補償が用いられる。本発明の堅牢性は、干渉作用、したがって補償を回避することを可能にし、よって、これまでに用いられた通常の方法より信頼性かつ堅牢性がある。
上記で与えられた書き方規約を考慮して、エネルギー伝達の存在下の種々の蛍光信号についての式は、付録における式A8から式A10によって与えられる。
式A2からA7についての式を考慮して、次いで、付録における式A11及び式A12から、付録における3つの式A14からA16を抽出することができる。次に、式A14からA16までからモル濃度Q1からQ3を除去することによって、第1の2つの蛍光色素間のエネルギー伝達パラメータκ12を求めることができる。このエネルギー伝達パラメータκ12についての式は、付録における式A17によって与えられる。
第1及び第3の蛍光色素間及び/又は第2及び第3の蛍光色素間のエネルギー伝達も考慮される場合は、上記及び付録において与えられた式を展開できることに注目することが重要である。
ここで、広帯域光(又は白色光、或いは多色光)は、微細構造光ファイバOFに射出されるパルス・レーザーLによって得られる。この種の供給源Sは、例えば、Optics Exress、第12巻、第19号、2004年9月の「White−light supercontinuum generation in normally dispersive optical fiber using mult――wavelength pumping system」という表題の論文において出願人によって記載されている。
この種の供給源Sによって放出される多色光は、その空間的コヒーレンスが極めて高い(全ての連続体の光子が同じ空間的モードで発せられる)という事実において白熱ランプによって放出されるものとは異なっている。
微細構造光ファイバOFから生じる光のビームは、例えば、反射屈折型(鏡)の光学的な組み合わせにより補正された色収差又はゼロ色収差を用いて、合焦光学系O1によって調整される。この光ビームは、変調器M上に合焦され、該変調器は、角色収差が入射のブラッグ角における回折に適合されたピッチの回折格子の空間的重ね合わせによって補正されることが好ましい音響光学セルの形態をとる。
このような音響光学変調器Mは、例えば、A−A Opto−Electronicという会社によって市場に出されているものである。
ここでの準単色光放射線は、幅が1nmから50nmの間の範囲のスペクトル帯域において発される光を意味することが理解される。
変調器Mの出力において放出される分析放射線Riは、例えば、測定タンク(又は空間)CM内で合焦されるように光学系O2によって調整される。
例えば、分析される生物細胞が、約1m/秒の速度において、約30μmの半分の高さにおける幅のガウス・プロファイルを有する放射線の分析ビームを通過する場合には、ほぼガウス形状で、ほぼ30μsに等しい持続時間の相互作用放射線(蛍光又は散乱(消光))パルスを発生させる。この場合、周波数スペクトルは、ガウス形状のものであり、半分の高さにおけるその高さは、ほぼ0.3/30μsに等しいか、又は約10kHzである。電子クロストーク現象を防止するためには、2つの連続した変調周波数ωiとωi+1との間で100kHzの最小分離を選択することが好ましい。例えば、100kHzに等しいω1、200kHzに等しいω2、及び300kHzに等しいω3を選択することができる。
他の種類の変調器Mを想定できることに注目することが重要である。特に、変調器Mは、少なくともその一部を供給源Sに組み込むこともできるし、或いは少なくともその一部が後者の下流側にあるとすることもできる。変調器Mはまた、例えば、その電力供給電流を制御するように、少なくともその一部を供給源Sの上流側に配置することもできる。
図1Aにおいては、検出器DEは、一例として、測定空間CM内の分析放射線の伝搬の全体的な方向に対して約45°の平均方向に配向される。しかしながら、この平均方向の角度は、望まれる種類の情報に応じて、0°から360°までの範囲の任意の所与の値をとることができる。
復調器DREの出力においては、3つの散乱信号SE(λ1=488nm)、SE(λ2=570nm)、及びSE(λ3=976nm)が存在する。散乱信号SE(488nm)及びSE(976nm)の値は、屈折率及び赤血球の容積の算出に必要な散乱断面Cext(488nm)及びCext(976nm)を求めることを可能にする。
蛍光の結果生じる相互作用放射線の一部は、光学フィルタリング手段FOに到達する前に、信号を調整する光学アレイを通過する。次に、相互作用放射線は、その波長がn(ここでは、n=3)の検出帯域Biに属するもののみが保存されるように波長にフィルタリングされる。
図5に示すように、分離手段LSは、蛍光相互作用放射線を少なくとも2つの部分にスペクトル分離するために用いることができる。この目的のために、例えば、場合によっては二色性型の、セパレータ板LSを用いることができる。このように、(少なくとも)2つの蛍光検出及び分析チャネルが定められて、1つのチャネル上では光学フィルタFO1の第1の光学フィルタリング帯域B1において第1の種類の蛍光の蛍光色素からの蛍光信号を得て、第2のチャネル上では光学フィルタFO2の第2の光学フィルタリング帯域B2における第2の種類蛍光の蛍光色素からの蛍光信号を得ることを可能にする。
ここでは、それぞれ488nm及び560nmに等しい波長λ1及びλ2を有する、2つの分析放射線ビームR1(ω1)及びR2(ω2)を用いて、白血球の核酸及び膜抗原をそれぞれマークすることを可能にする、2つの蛍光色素(オレンジ・チアゾール及びPE)の蛍光を検出する。これらの2つの放射線ビームR1(ω1)及びR2(ω2)は、図4を参照して既述された装置によって得られる。
第1の光学フィルタFO1によってフィルタリングされる相互作用放射線は、第1の蛍光検出器DF1に到達して、信号PM1(ω1)を送るために、第1の変調周波数ω1によりそれらを復調する役割を果たす分析モジュールMAの第1の蛍光デコーダ(又は復調器)DRF1に伝送される電気信号に、光検出器によって変換される。
蛍光検出器DRF1及びDRF2は、例えば、バターワース帯域通過型の、変調周波数の中央に位置させられる、アナログ・フィルタリング・ステージで構成される。
モル濃度Q2は、周波数ω2の中央に位置させられる帯域通過型のフィルタを用いて第2の復調器DRF2によって、第2の蛍光検出器DF2により送られる蛍光信号PM2から抽出することができる。実際に、既述のように、蛍光色素間の光学クロストークのため、PM2は、2つの周波数成分、すなわち、r.m.s.値又は周波数ω2あたりでフィルタリングされる電気パルスの最大振幅値に対応するPM2(ω2)と、光学クロストークに対応するPM2(ω1)とを含む。したがって、PM2=PM2(ω1)+PM2(ω2)である。付録における式A15及びA16によって定義される、これらの周波数成分PM2(ω1)及びPM2(ω2)は、周波数ω2の中央に位置させられる単純な帯域通過フィルタによって分離することができる。
分離手段LSを含まず、κ12=1の状況に対応する構成においては、唯一の蛍光検出器PMによって送られる信号は、付録における式A20の形態で再公式化することができる式A19によって与えられる。付録における式A21及びA22によって与えられる、これらの信号PM(ω1)及びPM(ω2)は、復調によって信号PMから抽出することができる。
上記で説明された例は、任意の所与の複雑さの光学クロストーク・レベルをもつ任意数の蛍光色素に展開することができる。
実際、光学的視点からは、赤血球は、厚さが約7nmで、1.46に近い屈折率の「脂質二重層」の膜からなる。細胞間の含有物は、ヘモグロビン(〜34g/dl)、塩(〜0.7g/dl)、及び少数の有機化合物(〜0.2g/dl)が存在する、水相中に溶解した幾つかの固体化合物を含む。
ヘモグロビンのモル質量が知られている(M=66500g/モル)ため、濃度(mmol/dl)は、質量濃度(g/dl)と等しくすることができる。赤血球中に溶解したヘモグロビンの平均質量は、12pgである。これは、33g/dl又は5mmol/lの平均濃度をもたらす。
上記及び式A23を考慮して、赤血球の屈折率は、次のように書くことがでる。
980nmの分析波長については、n(980nm)=1.34+0.0019*Hb(血球濃度g/dl)、及び、
488nmの分析波長については、n(488nm)=1.35+0.0016*Hb(血球濃度g/dl)
980nm及び488nmに等しい分析波長における屈折率の虚部は、以下の式によって数値的に求めることができる。
κ(980nm)=1.47*10-5*Hb、及び、
κ(488nm)=3.7*10-5*Hb
図6に示される種類の等容曲線及び等濃度曲線の図を構成することができ、血球ヘモグロビンの容積及び濃度を分析波長(ここでは、488nm及び976nm)における散乱断面Cextの関数として求めることを可能にする。この図においては、測定値Cext(488nm)及びCext(976nm)の各々の対には、所与のヘモグロビン濃度及び容積の単一の球が対応する。
本発明により、現在は、ヘモグロビン含有物の測定(散乱測定による)及び他の測定(蛍光測定による)の同時測定を、それらの間での干渉なしで、かつ処理モードによるエラーのリスクを減少させて実行することが可能である。
・胎児ヘモグロビン(HbF)を含有する赤血球、
・マラリア原虫が侵入した赤血球、
・トランスフェリン(CD71)レセプタ、又は、
・グリコホリンA(CD235a)の発現
の同定又は試験のような潜在的に有用な他の特定の同定を可能にする付加的なマーキングのために同時に用いることができる。
本発明の適用例は、有核細胞(白血球及び他のもの)上と、赤血球系又は血小板要素(活性化又は血小板の未成熟のマーキング)上の両方において多数存在する。
上記の説明において、本発明は、主に分析装置の形態で説明された。しかしながら、本発明はまた、説明された分析装置によって、さらにその変形によって実施することができる分析方法の形態で考えることもできる。
本発明は、単なる一例に過ぎないものであり、上記で説明された光学分析装置及び方法の実施形態に限定されるものではなく、当業者であれば想定することができる全ての変形を特許請求の範囲内に含む。
(付録)
c21=α11η11F12 c22=α21η21F22 c23=0
c31=α11η11F13 c32=α21η21F32 c33=α31η31F33
d11=0 d12=0 d13=0 (A3)
d21=0 d22=α22η22F22 d23=0
d31=0 d32=α22η22F32 d33=α32η32F33
e11=0 e12=0 e13=0 (A4)
e21=0 e22=0 e23=0
e31=0 e32=0 e33=α33η33F33
ここで、αijは、波長λjにおける化合物iのモル吸収係数であり、ηijは、検出帯域Bjにおける化合物iの蛍光係数であり、Fijは、化合物iの蛍光スペクトルの一部のみが検出帯域Bj内でフィルタリングされるという事実に関連する、0から1の間の範囲の重み係数である。
Q2=d22PM2(ω2) (A6)
Q3=e33PM3(ω3) (A7)
*PM1=κ12*κ13*PM10 (A8)
PM2=κ23*PM20+ρ12(1−κ12)κ13PM10 (A9)
PM3=PM30+ρ13(1−κ13)κ13PM10+ρ23(1−κ23)PM10 (A10)
ここで、κijは、蛍光色素iから蛍光色素jへのエネルギー伝達を表す、0から1までの間の範囲の一定の現象論的結合係数であり、ρijは、蛍光色素iから生じる、伝達された光が蛍光色素jによって蛍光に変換される量子効率を表す係数である。
PM2=PM20+ρ12(1−κ12)PM10 (A12)
PM3=PM30 (A13)
*PM1(ω1)=κ12α11η11I1F11Q1 (A14)
PM2(ω2)=α22η22I2F22Q2 (A15)
PM3(ω1)=α21η21I1F22Q2 +α11η11I1F12Q1+ρ12(1−κ12)α11η11I1F11Q1 (A16)
*Q1=(1/κ12C11I1)PM1(ω1) (A18)
*PM=(a11+a21)Q1+a22Q2 (A20)
*PM(ω2)=α22η22I2F22Q2 (A21)
*PM(ω1)=α21η21I1F22Q2+α11η11I1(F11+F12)Q1 (A22)
*m(Hb,λ)=n(Hb,λ)−iκ(Hb,λ) (A23)
ここで、n(Hb,λ)=no(λ)+α(λ)*Hbは、屈折率の実部であり、no(λ)は、純粋な溶剤の屈折率であり、波長の関数であり、α(λ)は、ヘモグロビンの屈折率の特性である増分係数及び波長の関数であり、κ(Hb,λ)=β(λ)*Hbは、屈折率の虚部であり、β(λ)は、モル吸収係数である。
Claims (27)
- 微視的要素を分析するための測定空間(CM)と、少なくとも2つの異なる分析波長を有し、相互作用放射線を形成するために前記測定空間(CM)内の前記微視的要素と相互作用するように設計された放射線を放出することが可能な少なくとも1つの供給源(S)と、前記測定空間(CM)から出る前記相互作用放射線の少なくとも一部を電気信号に変換するように設計された検出手段(DE、DF)と、前記分析された微視的要素を表すデータを求めることを可能にするように、前記電気信号を分析するように設計された分析手段(MA)と、を含む微視的要素を分析するための装置(DA)であって、
前記コード化された放射線は、前記測定空間(CM)内で共役されることと、
i)異なるコード(ωi)で前記測定空間(CM)の上流側の前記放射線をエンコードするように設計されたコード化手段(M)と、ii)前記検出手段(DE、DF)の上流側の、その波長の関数として前記蛍光及び/又は散乱相互作用放射線を選択的にフィルタリングするように設計された光学フィルタリング手段(FO、LS)とを含むことと、
前記分析手段(MA)は、前記電気信号をデコードして、それらがそれらの元のコードの関数として分析されるように設計されたデコード化手段(DRE、DRF)を備えること、
を特徴とする装置(DA)。 - 前記供給源(S)によって放出される前記分析放射線(Ri)は、分析される前記微視的要素に逐次的に適用されることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記供給源(S)によって放出される前記分析放射線(Ri)は、分析される前記微視的要素に同時に適用されることを特徴とする請求項1に記載の装置。
- 前記光学フィルタリング手段(FO、LS)は、波長が2つの分析波長の間にそれぞれ挿入され、最長の分析波長を越えて配置される蛍光分析帯域に属する前記蛍光相互作用放射線を選択的にフィルタリングするように設計されることを特徴とする請求項1から3のいずれか1項に記載の装置。
- 前記供給源(S)は、共役された放射線を前記測定空間(CM)に放出することが可能な少なくとも2つのレーザーを含むことを特徴とする請求項1から請求項4のいずれか1項に記載の装置。
- 前記レーザーは単色型のものであることを特徴とする請求項5に記載の装置。
- 前記供給源(S)は少なくとも1つの発光ダイオードを含むことを特徴とする請求項1から請求項6のいずれか1項に記載の装置。
- 前記供給源(S)は多色放射線源を含むことを特徴とする請求項1から請求項4のいずれか1項に記載の装置。
- 前記多色放射線源(S)は、実質的に連続するスペクトルをもつ少なくとも1つの多色レーザーと、白熱ランプと、アーク・ランプとを含む群の中で選択されることを特徴とする請求項8に記載の装置。
- 前記供給源(S)は、連続するモード及び/又はパルス・モードによって前記分析放射線を放出するように設計されることを特徴とする請求項1から請求項9のいずれか1項に記載の装置。
- 前記供給源(S)によって放出される各々の分析放射線ビーム(Ri)の強度(Ii)は調整可能であることを特徴とする請求項1から請求項10のいずれか1項に記載の装置。
- 前記コード化手段(M)は、前記分析放射線の強度を変調するように設計されることを特徴とする請求項1から請求項11のいずれか1項に記載の装置。
- 前記コード化手段(M)の少なくとも一部は、前記分析放射線を形成するように前記供給源(S)の下流側の放射線に作用するように設計されることを特徴とする請求項1から請求項12のいずれか1項に記載の装置。
- 前記コード化手段(M)の少なくとも一部は、前記分析放射線のための分布出力部の上流側の前記供給源(S)に作用するように設計されることを特徴とする請求項1から請求項13のいずれか1項に記載の装置。
- 前記コード化手段(M)の前記一部は、前記供給源(S)に組み込まれることを特徴とする請求項14に記載の装置。
- 前記コード化手段(M)は、前記分析放射線を形成するように前記供給源(S)によって放出される前記放射線を変調することが可能な音響光学変調器を含むことを特徴とする請求項1から請求項15のいずれか1項に記載の装置。
- 前記検出手段(DE、DF)は、前記相互作用放射線の検出に合わせて設計された様々な感光センサを含むことを特徴とする請求項1から請求項16のいずれか1項に記載の装置。
- 前記検出手段(DE、DF)は、前記相互作用放射線の検出に合わせて設計され、強制的な通路において前記分析放射線の伝搬の全体的な方向を遮断する軸によって定められる位置に埋め込まれた様々な感光センサを含み、前記軸は、前記全体的な方向に対して0°から360°までの範囲の角度をなして配向されることを特徴とする請求項1から請求項16のいずれか1項に記載の装置。
- 制御ソフトウェア・インタフェースを含むコンピュータ・システム(MC)を含むことを特徴とする前記請求項のいずれか1項に記載の装置。
- 微視的要素を分析するための方法であって、
i)測定空間(CM)内の微視的要素は、相互作用放射線を形成するように、前記測定空間(CM)内で共役され、少なくとも2つの異なる分析波長及び異なる選ばれたコードによるコード化を有する分析放射線により照射される第1のステップと、
ii)前記相互作用放射線の少なくとも一部が集光され、次いで、その波長の関数として分離され、フィルタリングされる第2のステップと、
iii)前記フィルタリングされた相互作用放射線が検出され、次いで、電気信号に変換される第3のステップと、
iv)前記検出された信号が、前記分析された微視的要素を表すデータを求めることを可能にするように、それらの元のコードの関数としてデコードされる第4のステップと、
を含むことを特徴とする方法。 - 第1のステップにおいては、前記分析放射線(Ri)は、分析される前記微視的要素に逐次的に適用されることを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 第1のステップにおいては、前記分析放射線(Ri)は、分析される前記微視的要素に同時に適用されることを特徴とする請求項20に記載の装置。
- 第2のステップにおいては、波長が2つの分析波長の間にそれぞれ挿入され、最長の分析波長を越えて配置される蛍光分析帯域に属する前記蛍光相互作用放射線は選択的にフィルタリングされることを特徴とする請求項20から請求項22のいずれか1項に記載の装置。
- 第4のステップにおいては、分析される微視的要素の1つの種類の屈折率は、散乱プロセスを表す前記相互作用放射線の変換によりもたらされる信号から推論されることを特徴とする請求項20から請求項23のいずれか1項に記載の方法。
- 全血試料の存在下における第4のステップにおいては、赤血球系の細胞の血球ヘモグロビン濃度は前記屈折率から求められることを特徴とする請求項20から請求項24のいずれか1項に記載の方法。
- 第4のステップにおいては、前記蛍光色素間のエネルギー伝達を表す結合の度合いは、前記分析放射線と、2つの異なる、空間的に近い蛍光色素との間の相互作用によりもたらされる信号から推論されることを特徴とする請求項20から請求項25のいずれか1項に記載の方法。
- 生物学的分析、生化学的分析、化学的分析、粒子分析、形態学的分析、特にマルチパラメータ・フローサイトメトリー、液体又はガス流体中の荷電粒子の分析、及び粒径分布を含む群の中で選択される分野における、前記請求項のいずれか1項に記載の分析装置及び方法の使用。
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