JP2008535793A - Dipolymer / protein conjugate and preparation method thereof - Google Patents

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Abstract

本発明は、ジポリマー・タンパク質コンジュゲートおよびその調製方法に関する。さらに本発明は、そのようなジポリマー・タンパク質コンジュゲート、特にジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの、疾患治療用の薬剤の製造のための使用に関する。The present invention relates to dipolymer protein conjugates and methods for their preparation. The invention further relates to the use of such dipolymer protein conjugates, in particular diPEGylated protein conjugates, for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases.

Description

本発明は、ジポリマー・タンパク質コンジュゲートおよびその調製方法に関する。さらに本発明は、そのようなジポリマー・タンパク質コンジュゲート、特にジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの、疾患治療用の薬剤の製造のための使用に関する。   The present invention relates to dipolymer protein conjugates and methods for their preparation. The invention further relates to the use of such dipolymer protein conjugates, in particular diPEGylated protein conjugates, for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases.

天然型の組換えタンパク質は、２０年以上にわたり治療薬として成功裡に使用されてきた。しかしながら、タンパク質治療薬の生物学的利用能は、短い血漿中半減期およびプロテアーゼ分解への感受性によって制限されることが多く、このため該治療薬の臨床上の最大能力が制限されている。   Natural recombinant proteins have been successfully used as therapeutics for over 20 years. However, the bioavailability of protein therapeutics is often limited by a short plasma half-life and sensitivity to protease degradation, which limits the clinical maximum capacity of the therapeutic agent.

これらの欠点を克服すべく、タンパク質治療薬の血中半減期を長くするために、該タンパク質の修飾が、例えばタンパク質にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマーを化学的または酵素的に結合させることによって為されてきた。タンパク質にポリエチレングリコール部分を結合させることによるタンパク質の修飾は、ＰＥＧ化としても知られている。ＰＥＧ化によって成功裡に修飾されたタンパク質には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロンα、インターフェロンβおよびインターフェロンγのようなインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦまたはＧＣＳＦ）、ＩＬ−２およびＩＬ−６のようなインターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、様々なサイトカインおよび合成赤血球形成タンパク質（合成ＥＰＯ）が挙げられる。   To overcome these shortcomings, in order to increase the blood half-life of protein therapeutics, the modification of the protein can chemically or enzymatically attach a polymer such as polyethylene glycol (PEG) to the protein. Has been done by. Modification of a protein by attaching a polyethylene glycol moiety to the protein is also known as PEGylation. Proteins successfully modified by PEGylation include interferons such as erythropoietin (EPO), interferon alpha, interferon beta and interferon gamma, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF or GCSF), IL-2 and IL- Interleukins such as 6, tumor necrosis factor (TNF), various cytokines and synthetic erythropoiesis protein (synthetic EPO).

ポリエチレングリコールとの結合によるタンパク質の化学修飾の結果、耐熱性が改善され、酵素分解に対する感受性が低減され、タンパク質の抗原決定基が保護されて免疫原性の低下および抗体との反応性の低下がもたらされ、溶解度が増大し、ＰＥＧ結合タンパク質治療薬の腎臓および細胞でのクリアランスの減少によりインビボで血漿中半減期が延長し（非特許文献１を参照）、最大血漿中濃度が低下し、血漿中濃度の変動が小さくなり、投与頻度が低下し、したがって生活の質の向上がもたらされる。したがって、ＰＥＧ修飾されたタンパク質は、バイオ医学・生物工学における適用に広く使用されている（非特許文献２を参照）。   Chemical modification of the protein by conjugation with polyethylene glycol results in improved heat resistance, reduced sensitivity to enzymatic degradation, protected protein antigenic determinants and reduced immunogenicity and decreased reactivity with antibodies. Resulting in increased solubility, decreased renal and cellular clearance of PEG-binding protein therapeutics in vivo, increasing plasma half-life in vivo (see Non-Patent Document 1), and decreasing maximum plasma concentration, Fluctuations in plasma concentration are reduced, the frequency of administration is reduced, and therefore quality of life is improved. Therefore, PEG-modified proteins are widely used for applications in biomedicine and biotechnology (see Non-Patent Document 2).

タンパク質へのポリエチレングリコール部分の結合方法は、非特許文献３〜６に記述されている。また、プロテイノイドへのポリエチレングリコール部分の結合方法は、非特許文献７に記述されている。   Non-patent documents 3 to 6 describe a method for binding a polyethylene glycol moiety to a protein. Non-patent document 7 describes a method for binding a polyethylene glycol moiety to a proteinoid.

一般に、ポリエチレングリコール分子はタンパク質の官能基を介して該タンパク質に結合する。タンパク質のアミノ酸鎖中の各官能基で、求核性であるもの、すなわち電子供与体としての能力を有するものは、ＰＥＧ分子に結合している相補的な基と反応する場合がある。そのような求核基には、α−アミノ、ε−アミノ、カルボキシル、チオール、ヒドロキシル、イミダゾールおよびグアニジン基が挙げられる。例えば、タンパク質のアミノ基、すなわちα−アミノ基（Ｎ末端）およびリジン残基のε−アミノ基は、ＰＥＧのカップリングのための反応性基または官能基として使用される（非特許文献５を参照）。   In general, polyethylene glycol molecules are attached to the protein via the functional group of the protein. Each functional group in the amino acid chain of a protein that is nucleophilic, ie, capable of acting as an electron donor, may react with a complementary group attached to the PEG molecule. Such nucleophilic groups include α-amino, ε-amino, carboxyl, thiol, hydroxyl, imidazole and guanidine groups. For example, the amino group of a protein, that is, the α-amino group (N-terminal) and the ε-amino group of a lysine residue are used as a reactive group or a functional group for PEG coupling (see Non-Patent Document 5). reference).

特許文献１は、アシル化反応によってＰＥＧとタンパク質との間にアミド結合を生成することによるタンパク質へのＰＥＧ結合を開示している。
特許文献２には、還元的アルキル化を用いて酵素にＰＥＧを結合し、ＰＥＧとタンパク質との間にアミン結合を生成することが記載されている。 Patent Document 1 discloses PEG binding to a protein by generating an amide bond between PEG and protein by an acylation reaction.
Patent Document 2 describes that reductive alkylation is used to bind PEG to an enzyme to produce an amine bond between PEG and protein.

さらに、タンパク質のアミノ基へのＰＥＧのカップリングは、特許文献３（ヘモグロビンのアシル化）、特許文献４（ウロキナーゼ、カリクレインあるいは白血球インターフェロンのアシル化）、特許文献５（中性ｐＨでのリンホカインの還元的アルキル化）、特許文献６（ウロキナーゼのアシル化）、特許文献７（インターフェロンβ、インターロイキン２およびイムノトキシンのアシル化）、特許文献８（腫瘍壊死因子のアシル化）、特許文献９（Ｇ−ＣＳＦのアシル化）、特許文献１０（中性ｐＨでのＣＤ４免疫接着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）のアルキル化）、特許文献１１（トレシルクロライドを用いた、特にＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＳＣＦのアルキル化）、特許文献１２（インターロイキン６のアシル化）、特許文献１３（カルシトニン、インターロイキン２または顆粒球コロニー刺激因子のアシル化）および特許文献１４（タンパク質のアシル化）に記載されている。しかしながら、これらの特許出願文献に記述されたＰＥＧ化反応では、多重にＰＥＧ化された生成物、つまり１つのタンパク質当たり複数のＰＥＧ部分を有するタンパク質コンジュゲートを生じる。ＰＥＧ部分の数が多くなるほど、多重ＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの特徴解析はますます難しくなり、規制当局による治療用タンパク質の医薬品としての認可を阻むことになる。   Furthermore, the coupling of PEG to the amino group of a protein is described in Patent Document 3 (acylation of hemoglobin), Patent Document 4 (acylation of urokinase, kallikrein or leukocyte interferon), and Patent Document 5 (lymphokine at neutral pH). Reductive alkylation), Patent Document 6 (acylation of urokinase), Patent Document 7 (acylation of interferon β, interleukin 2 and immunotoxin), Patent Document 8 (acylation of tumor necrosis factor), Patent Document 9 ( G-CSF acylation), Patent Document 10 (CD4 immunoadhesin alkylation at neutral pH), Patent Document 11 (using tresyl chloride, especially GM-CSF or G-SCF alkyl) ), Patent Document 12 (acylation of interleukin 6), Patent Document 1 It is described in (calcitonin, interleukin 2 or acylation of granulocyte colony stimulating factor) and Patent Document 14 (Acylation of proteins). However, the PEGylation reactions described in these patent applications result in multiple PEGylated products, ie protein conjugates having multiple PEG moieties per protein. The greater the number of PEG moieties, the more difficult it becomes to characterize multiplex PEGylated protein conjugates and prevent regulatory authorities from approving therapeutic proteins as pharmaceuticals.

従って、治療用タンパク質中のＰＥＧ部分の数を低く維持することは、予測可能な活性を有しかつロット間の製品一致性を備えた規定の生成物の生産を容易にし、該生成物を医薬製造に役立たせる。さらに、１タンパク質当たりのＰＥＧ部分の数が少ないと、酵素基質相互作用におけるレセプター認識が低下する危険性が低くなる。したがって、生物薬剤として適用するためのＰＥＧ化タンパク質は、１タンパク質当たりのＰＥＧユニットの数が少ないことが好ましい。   Thus, keeping the number of PEG moieties low in a therapeutic protein facilitates the production of a defined product with predictable activity and product consistency between lots, and the product is Useful for manufacturing. Furthermore, if the number of PEG moieties per protein is small, the risk of reduced receptor recognition in enzyme-substrate interactions is reduced. Therefore, it is preferable that the number of PEG units per protein in a PEGylated protein for application as a biopharmaceutical is small.

このことから、下記に述べるように、１タンパク質当たりのＰＥＧユニット数の少ないＰＥＧタンパク質コンジュゲートが開発された。
特許文献１５には、還元的アルキル化の条件下およびα−アミノ基を選択的に活性化するのに十分な酸性のｐＨ条件でポリペプチドのα−アミノ基（Ｎ末端基）に１つのポリエチレングリコール分子を結合させる方法が記載されている。Ｎ末端のα−アミノ基（ｐＫａはｐＨ６．８〜８．２の範囲）とリシル側鎖のε−アミノ基（ｐＫａはｐＨ１０．４〜１０．５の範囲）との間のｐＫａ値の差（非特許文献８を参照）から、酸性環境でのＰＥＧ化により選択的にタンパク質のＮ末端がモノＰＥＧ化されることが示唆される。 This has led to the development of PEG protein conjugates with a low number of PEG units per protein, as described below.
Patent Document 15 discloses that one polyethylene is added to the α-amino group (N-terminal group) of a polypeptide under conditions of reductive alkylation and under acidic pH conditions sufficient to selectively activate the α-amino group. A method for coupling glycol molecules is described. Difference in pKa value between N-terminal α-amino group (pKa ranges from pH 6.8 to 8.2) and ε-amino group of lysyl side chain (pKa ranges from pH 10.4 to 10.5) (See Non-Patent Document 8) suggests that the N-terminus of the protein is selectively monoPEGylated by PEGylation in an acidic environment.

しかしながら、モノＰＥＧ化されたタンパク質と比較して、ジＰＥＧ化されたタンパク質は以下のようないくつかの重要な利点を有する。
― 直線状ＰＥＧ１分子あたりのエチレンオキサイド単位の最大数から、分子量がおよそ３０ｋＤａに制限される（非特許文献９）。したがって、第２のＰＥＧ分子を結合することによりＰＥＧタンパク質コンジュゲート中のＰＥＧ部分の分子量を増大させることが可能となる。
― 分子量の大きいＰＥＧ分子はＰＥＧ化タンパク質溶液の粘度を増大させる。分子量の大きい１つのＰＥＧ分子の代わりに分子量の小さい２つのＰＥＧ分子を結合することにより、この作用を弱めることができる。
― ＰＥＧタンパク質コンジュゲート全体の分子量が等しい場合には、１つのＰＥＧ分子の代わりに２つのＰＥＧ分子を結合するとＰＥＧタンパク質コンジュゲートの流体力学半径が増大し、その結果クリアランスが延長され、したがって該コンジュゲートの生物活性の持続時間が延びる。
― 第２のＰＥＧ分子をタンパク質に連結することにより、タンパク質のエピトープをより有効に保護し、その結果タンパク質分解への感受性および免疫原性を低減するとともにＰＥＧタンパク質コンジュゲートの安定性を改善することができる。これは、プロテイノイド、ならびに潜在的に免疫原性を増加させうる非天然リンカーによって連結される非組換えの合成タンパク質フラグメントには、特に有利である。
― 第２のＰＥＧ部分の結合により、ＰＥＧタンパク質コンジュゲートの親水性が高まる。従って、バッファー系における溶解度が改善され、コンジュゲートが凝集する危険性が低減される。 However, compared to monoPEGylated protein, diPEGylated protein has several important advantages:
-From the maximum number of ethylene oxide units per linear PEG molecule, the molecular weight is limited to approximately 30 kDa (Non-Patent Document 9). Thus, it is possible to increase the molecular weight of the PEG moiety in the PEG protein conjugate by attaching a second PEG molecule.
-High molecular weight PEG molecules increase the viscosity of PEGylated protein solutions. This effect can be reduced by linking two low molecular weight PEG molecules instead of one high molecular weight PEG molecule.
-If the overall molecular weight of the PEG protein conjugate is equal, linking two PEG molecules instead of one PEG molecule increases the hydrodynamic radius of the PEG protein conjugate, thus extending the clearance and thus the conjugate. Increases the duration of the biological activity of the gate.
-Linking a second PEG molecule to the protein more effectively protects the epitope of the protein, thus reducing its sensitivity to proteolysis and immunogenicity and improving the stability of the PEG protein conjugate. Can do. This is particularly advantageous for proteinoids as well as non-recombinant synthetic protein fragments joined by non-natural linkers that can potentially increase immunogenicity.
-The attachment of the second PEG moiety increases the hydrophilicity of the PEG protein conjugate. Thus, solubility in the buffer system is improved and the risk of conjugate aggregation is reduced.

これらの利点を考慮して、主としてジＰＥＧ化されたタンパク質コンジュゲートを合成する試みがなされた。これらの試みは、天然タンパク質配列の遺伝学的操作を含むものであり、該遺伝学的操作はジＰＥＧ化された突然変異タンパク質コンジュゲートを作製するための先行条件として部位特異的にＰＥＧタンパク質をカップリングする手段を提供する。   In view of these advantages, attempts have been made to synthesize primarily diPEGylated protein conjugates. These attempts involve genetic manipulation of the native protein sequence, which genetically manipulates the PEG protein in a site-specific manner as a precondition for making a diPEGylated mutant protein conjugate. A means for coupling is provided.

特許文献１６には、ジＰＥＧ化されたレプチンおよびＧ−ＣＳＦの突然変異タンパク質であって、そのタンパク質配列にシステイン突然変異が導入されているものが記載されている。システイン点突然変異を導入する目的は、第２の結合部位を提供することであり、これは、Ｎ末端特異的にＰＥＧを結合させる既存の技術を補足するものである。   Patent Document 16 describes a diPEGylated leptin and G-CSF mutein in which a cysteine mutation is introduced into the protein sequence. The purpose of introducing a cysteine point mutation is to provide a second attachment site, which complements existing techniques for attaching PEG specifically at the N-terminus.

特許文献１７にはＧ−ＣＳＦ変異タンパク質コンジュゲートについて記載されており、該Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列は、ヒトＧ−ＣＳＦのアミノ配列に対して、ＰＥＧ用の結合基を含む少なくとも１つの特異的に改変されたアミノ酸残基に関して異なっている。特に、特許文献１７には、特異的に導入されたアミノ基がアシル化によりＰＥＧ化されたジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ突然変異体が記載されている。特許文献１７によれば、Ｇ−ＣＳＦ中のリジン残基のうち１つ以上に無制限に結合が生じると、得られるコンジュゲートの活性が失われたり著しく低減されたりする可能性があるため、これを回避するためにＧ−ＣＳＦ中のリジン残基のうち少なくとも１つまたは全部を取り除き、次いでアシル化用の少なくとも１つの新しいアミノ基を導入することが好ましい。   Patent Document 17 describes a G-CSF mutant protein conjugate, wherein the amino acid sequence of G-CSF is at least one specific group containing a binding group for PEG with respect to the amino sequence of human G-CSF. Differ with respect to the amino acid residues modified. In particular, Patent Document 17 describes a diPEGylated G-CSF mutant in which a specifically introduced amino group is PEGylated by acylation. According to Patent Document 17, when unlimited binding occurs to one or more of lysine residues in G-CSF, the activity of the resulting conjugate may be lost or significantly reduced. It is preferred to remove at least one or all of the lysine residues in G-CSF and then introduce at least one new amino group for acylation.

特許文献１８には、Ｇ−ＣＳＦ変異タンパク質コンジュゲートについて記述されており、該コンジュゲートにおいて、Ｇ−ＣＳＦアミノ酸配列は、ヒトＧ−ＣＳＦのアミノ配列と比較して、１７位システインのセリンへの変異によって少なくとも１アミノ酸残基が特異的に変更されている点で異なっている。特に、特許文献１８には、還元的アルキル化によってα−アミノ基が特異的にＰＥＧ化されたモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ突然変異体について記述されている。特許文献１８によれば、還元的アルキル化のために適用される反応条件は、反応ｐＨが酸性であるため主としてモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異タンパク質コンジュゲートと、微量のジＰＥＧ化およびトリＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ変異タンパク質コンジュゲートとを生じるものであり、医薬製品の製造には使用されなかった。   Patent Document 18 describes a G-CSF mutant protein conjugate in which the G-CSF amino acid sequence is compared to the amino sequence of human G-CSF to the serine at position 17 cysteine. The difference is that at least one amino acid residue is specifically altered by the mutation. In particular, Patent Document 18 describes a monoPEGylated G-CSF mutant in which an α-amino group is specifically PEGylated by reductive alkylation. According to U.S. Patent No. 6,057,049, the reaction conditions applied for reductive alkylation are primarily monoPEGylated G-CSF mutein conjugates due to the acidic reaction pH, and trace amounts of diPEGylation and triPEGylation. Yields a G-CSF mutein conjugate and was not used in the manufacture of pharmaceutical products.

突然変異タンパク質は、開発の複雑さという不利点とは別に、天然の配列のアミノ酸を変更することによって引き起こされる可能性のある免疫原性のような、別の危険性を有している。したがって、特許文献１６および特許文献１７に記述されたジＰＥＧ化方法とは対照的に、ＰＥＧ化のためにタンパク質を変異させる必要のない野生型アミノ酸配列の組換えまたは天然タンパク質をジＰＥＧ化することが望ましいであろう。   Apart from the disadvantages of development complexity, muteins have other risks, such as immunogenicity that can be caused by altering the amino acids of the native sequence. Thus, in contrast to the diPEGylation methods described in US Pat. Nos. 6,057,069 and 5,037,17, a recombinant or native protein of a wild type amino acid sequence that does not require mutation of the protein for PEGylation is diPEGylated. It would be desirable.

一例が特許文献１９に挙げられており、同文献には、アシル化によってタンパク質にＰＥＧ部分をカップリングして得られる非特定的なジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートが記述されている。特許文献１９によればＰＥＧ結合可能な部位はα−およびε−アミノ基へのアミド結合ならびに第１ヒドロキシル基へのエステル結合である。しかしながら、このＰＥＧ化反応では特異的にジＰＥＧ化されたＧ−ＣＳＦ分子は生じなかった。   An example is given in US Pat. No. 6,057,086, which describes a non-specific diPEGylated G-CSF conjugate obtained by coupling a PEG moiety to a protein by acylation. According to Patent Document 19, PEG-bondable sites are amide bonds to α- and ε-amino groups and ester bonds to the primary hydroxyl group. However, this PEGylation reaction did not yield specifically diPEGylated G-CSF molecules.

アシル化によりＧ−ＣＳＦのジＰＥＧ化が可能となるが、アシル化によって合成されたＰＥＧ・タンパク質コンジュゲートは安定性が低く、凝集性が高い（非特許文献１０）。
エリスロポエチン、インターフェロンあるいはヒト成長ホルモンのようなその他の商業
上興味深い分子をポリマーと結合させることが試みられたときも、同様の問題が生じた。多くの場合、ＰＥＧ化反応により非特異的なポリマー結合が起きた。ある場合には、非特異的なポリマー結合を回避または低減するために上記分子の突然変異タンパク質が用いられた。
米国特許第４，１７９，３３７号明細書 米国特許第４，００２，５３１号明細書 欧州特許出願第０ ０６７ ０２９号明細書 欧州特許出願第０ ０９８ １１０号明細書 欧州特許出願第０ １５４ ３１６号明細書 欧州特許出願第０ １５４ ４３２号明細書 欧州特許出願第０ ２２９ １０８号明細書 欧州特許出願第０ ２４７ ８６０号明細書 欧州特許出願第０ ３３５ ４２３号明細書 欧州特許出願第０ ３７２ ７５２号明細書 欧州特許出願第０ ４３９ ５０８号明細書 欧州特許出願第０ ４４２ ７２４号明細書 欧州特許出願第０ ４７３ ２６８号明細書 欧州特許出願第０ ５３９ １６７号明細書 国際公開公報第９６／１１９５３号パンフレット 国際公開公報第００／２１５７４号パンフレット 国際公開公報第０１／５１５１０号パンフレット 国際公開公報第２００４／０８３２４２号パンフレット 国際公開公報第００／４４７８５号パンフレット デルガド（Delgado ）ら、Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 、１９９２年、第９巻（３，４）、ｐ．２４９−３０４ イナダ（Ｉｎａｄａ）ら、ＴＩＢＴＥＣＨ １９９５年、第１３巻、ｐ．８６−９１ パス（Pasut ）ら、Expert Opin. Ther. Patents、２００４年、第１４巻（６）、ｐ．８５９−８９４ Ｗ．Ｐ．シェフィールド（Sheffield ）、Curr. Drug Targets、２００１年、ｐ．１−２２ Ｆ．Ｍ ベロネーゼ（Veronese）、Biomaterials、２００１年、第２２巻、ｐ．４０５−４１７ Ｓ．ザリプスキー（Zalipsky）、Adv. Drug Deliv. Rev. 、１９９５年、第１６巻、ｐ．１５７−１８２ Ｇ．コッヘンドルファー（Kochendoerfer ）、Expert Opin Biol Ther.、２００３年、第８巻、ｐ．１２５３−６１ アザルカン（Azarkan ）ら、Rec Res Develop Biotech Bioeng、１９９９年、第２巻、ｐ．７７−９３ ハリス（Harris）およびチェス（Chess ）Nat. Rev. Drug Discovery、２００３年、第２巻（３）、ｐ．２１４−２２３ キンスラー（Kinstler）ら、Pharm. Res. 、１９９６年、第１３巻、ｐ．９９６−１００２ G-CSF can be diPEGylated by acylation, but the PEG / protein conjugate synthesized by acylation has low stability and high aggregation properties (Non-patent Document 10).
Similar problems occurred when attempts were made to attach other commercially interesting molecules such as erythropoietin, interferon or human growth hormone to the polymer. In many cases, PEGylation reactions resulted in non-specific polymer attachment. In some cases, the mutant protein of the molecule was used to avoid or reduce non-specific polymer binding.
US Pat. No. 4,179,337 US Pat. No. 4,002,531 European Patent Application No. 0 067 029 European Patent Application No. 0 098 110 European Patent Application No. 0 154 316 European Patent Application No. 0 154 432 European Patent Application No. 0 229 108 European Patent Application No. 0 247 860 European Patent Application No. 0 335 423 European Patent Application No. 0 372 752 European Patent Application No. 0 439 508 European Patent Application No. 0 442 724 European Patent Application No. 0 473 268 European Patent Application No. 0 539 167 International Publication No. 96/11953 Pamphlet International Publication No. 00/21574 Pamphlet International Publication No. 01/51510 Pamphlet International Publication No. 2004/083242 Pamphlet International Publication No. 00/44785 Pamphlet Delgado et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1992, 9 (3,4), p. 249-304 Inada et al., TIBTECH 1995, Vol. 13, p. 86-91 Pasut et al., Expert Opin. Ther. Patents, 2004, Vol. 14 (6), p. 859-894 W. P. Sheffield, Curr. Drug Targets, 2001, p. 1-22 F. M Veronese, Biomaterials, 2001, Vol. 22, p. 405-417 S. Zalipsky, Adv. Drug Deliv. Rev., 1995, Vol. 16, p. 157-182 G. Kochendoerfer, Expert Opin Biol Ther., 2003, Vol. 8, p. 1253-61 Azarkan et al., Rec Res Develop Biotech Bioeng, 1999, Volume 2, p. 77-93 Harris and Chess Nat. Rev. Drug Discovery, 2003, Volume 2 (3), p. 214-223 Kinstler et al., Pharm. Res., 1996, Vol. 13, p. 996-1002

前述の問題を考慮すると、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えた安定かつ明確なポリマー・タンパク質コンジュゲートが必要とされている。
従って本発明の目的は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えた安定かつ明確なポリマー・タンパク質コンジュゲートを提供することである。特に、安定かつ明確なジ
ＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートを提供することが本発明の目的である。 In view of the foregoing problems, there is a need for a stable and well-defined polymer-protein conjugate with two polymer units per protein.
The object of the present invention is therefore to provide a stable and well-defined polymer-protein conjugate with two polymer units per protein. In particular, it is an object of the present invention to provide a stable and well-defined diPEGylated protein conjugate.

本発明のさらなる目的は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えたポリマー・タンパク質コンジュゲート、特にジＰＥＧ化されたタンパク質コンジュゲートであって、該タンパク質が野生型または天然のアミノ酸配列を有するか、野生型タンパク質の合成タンパク質様模倣物すなわちプロテイノイドであって少なくとも野生型タンパク質の生物活性を有しているものを提供することである。   A further object of the present invention is a polymer protein conjugate with 2 polymer units per protein, in particular a diPEGylated protein conjugate, wherein the protein has a wild type or natural amino acid sequence, It is to provide a synthetic protein-like mimic of a wild-type protein, ie, a proteinoid that has at least the biological activity of the wild-type protein.

本発明の別の目的は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えたポリマー・タンパク質コンジュゲート、特にジＰＥＧ化されたタンパク質コンジュゲートであって、対応する非コンジュゲートタンパク質よりも血中半減期が長く、かつインビボでの生物活性が高いものを提供することである。   Another object of the present invention is a polymer-protein conjugate with two polymer units per protein, in particular a diPEGylated protein conjugate, which has a blood half-life greater than the corresponding unconjugated protein. It is to provide a long and high biological activity in vivo.

本発明の別の目的は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えたポリマー・タンパク質コンジュゲート、特にジＰＥＧ化されたタンパク質コンジュゲートの収量を著しく増加させる方法を提供することである。   Another object of the present invention is to provide a method for significantly increasing the yield of polymer-protein conjugates with 2 polymer units per protein, in particular diPEGylated protein conjugates.

さらに、本発明の目的は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えたポリマー・タンパク質コンジュゲートを優先的に高収率で製造する方法であって、生成物の一致性が高く反応原料（educt ）が容易に利用可能である方法を提供することである。   Furthermore, an object of the present invention is a method for preferentially producing a polymer / protein conjugate having two polymer units per protein in a high yield, and having high product consistency and an educt. Is to provide a method that is readily available.

最後に、本発明の目的は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えたポリマー・タンパク質コンジュゲート、特に、ジＰＥＧ化されたタンパク質コンジュゲートを製造する方法の条件であって、タンパク質中の予め選択された２つの結合部位に優先的にポリマー単位が結合する条件を特定することである。   Finally, the object of the present invention is the conditions of the process for producing a polymer-protein conjugate with 2 polymer units per protein, in particular a diPEGylated protein conjugate, which is pre-selected in the protein It is to specify the conditions under which the polymer unit is preferentially bound to the two binding sites.

本発明によれば、上記およびその他の目的は独立請求項の特徴の組合せにより達成される。本発明の利点および実施形態は従属請求項に定義されている。
１タンパク質当たり２つのポリマー単位を備えた安定かつ生物学的に活性なポリマー・タンパク質コンジュゲート、特にＰＥＧタンパク質コンジュゲートであって、該タンパク質のアミノ基の２つの窒素原子が各々１つのポリマー単位、特にポリエチレングリコール部分と結合しているものを提供することが可能であることが見出された。 According to the invention, these and other objects are achieved by a combination of the features of the independent claims. Advantages and embodiments of the invention are defined in the dependent claims.
A stable and biologically active polymer-protein conjugate with two polymer units per protein, in particular a PEG protein conjugate, wherein the two nitrogen atoms of the amino group of the protein are each one polymer unit, It has been found that it is possible in particular to provide one that is linked to a polyethylene glycol moiety.

本発明の別の態様では、少なくとも１つ、および好ましくは２つの本発明のジポリマー・タンパク質コンジュゲートを含む医薬調製物が提供される。
本発明の別の態様では、ポリマー・タンパク質コンジュゲートの製造方法であって、少なくとも２つのアミノ基を有するタンパク質を、還元剤存在下に単一のアルデヒド基を有するポリマー試薬と反応させることを含み、反応時間は、タンパク質のアミノ基の２つの窒素原子がアミン結合によってポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲートが優先的に作製されるように選択されることを特徴とする方法が提供される。 In another aspect of the present invention there is provided a pharmaceutical preparation comprising at least one, and preferably two, dipolymer protein conjugates of the present invention.
In another aspect of the present invention, a method for producing a polymer-protein conjugate comprising reacting a protein having at least two amino groups with a polymer reagent having a single aldehyde group in the presence of a reducing agent. Providing a method characterized in that the reaction time is selected to preferentially make a polymer-protein conjugate in which the two nitrogen atoms of the amino group of the protein are linked to the polymer unit by an amine bond Is done.

さらに、本発明は、疾患治療用の薬剤の製造のための、本発明によるポリエチレングリコール・タンパク質コンジュゲートのようなポリマー・タンパク質コンジュゲートの使用に関する。治療される疾患の種類は、ポリマーに結合したタンパク質の種類に依存する。例えば、疾患は造血機能または免疫機能の低下を特徴とするものである場合が考えられる。タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合、該疾患は通常、化学療法、放射線療法および感染のうち少なくともいずれかによって引き起こされる好中球減少症および白血病のうち少なくともいずれか一方である。タンパク質がエリスロポエチンである場合、該疾患は通常、一種の貧血症、例えば腎性貧血である。タンパク質が成長ホルモン（ソマトトロピンとも
呼ばれる）である場合、該疾患は通常、成長ホルモン欠損症である。タンパク質がインターフェロンである場合、該疾患は感染症の場合が考えられる。 The invention further relates to the use of a polymer protein conjugate, such as a polyethylene glycol protein conjugate according to the invention, for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases. The type of disease being treated depends on the type of protein bound to the polymer. For example, the disease may be characterized by a decrease in hematopoietic function or immune function. When the protein is G-CSF, the disease is usually at least one of neutropenia and leukemia caused by chemotherapy, radiation therapy and / or infection. When the protein is erythropoietin, the disease is usually a type of anemia, such as renal anemia. If the protein is growth hormone (also called somatotropin), the disease is usually growth hormone deficiency. When the protein is interferon, the disease can be an infectious disease.

特に、本発明は、好ましくは２つのポリマー単位、特にポリエチレングリコール分子を、適切なｐＨ、例えばおよそｐＨ７を選択することにより、還元的アルキル化条件の下でタンパク質に結合させることが可能であるという発見に基づく。   In particular, the invention states that preferably two polymer units, in particular polyethylene glycol molecules, can be attached to a protein under reductive alkylation conditions by selecting a suitable pH, for example approximately pH 7. Based on discovery.

さらに、反応時間は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を有するポリマー・タンパク質コンジュゲート、特に本発明のジＰＥＧ化されたタンパク質コンジュゲートを形成するための重大なパラメータであることが見出された。例えば、本発明のＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートは、時間依存的な順序でモノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化、トリＰＥＧ化、さらに高度にＰＥＧ化されたタンパク質コンジュゲートへと連続的に形成されることが分かった（図３を参照）。   Furthermore, the reaction time has been found to be a critical parameter for forming polymer protein conjugates with 2 polymer units per protein, in particular the diPEGylated protein conjugates of the present invention. For example, the PEGylated protein conjugates of the present invention can be formed sequentially into monoPEGylated, diPEGylated, triPEGylated, and even highly PEGylated protein conjugates in a time-dependent order. Okay (see Figure 3).

さらに、タンパク質とポリマーとのモル比および／またはタンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を有するポリマー・タンパク質コンジュゲート、特に本発明のジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの形成にとって重要であることが分かった。さらに、非グリコシル化タンパク質と比較すると、タンパク質がグリコシル化されている場合は、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を有するポリマー・タンパク質コンジュゲート、特に本発明のジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの形成には、ポリマー分子とタンパク質内のアミノ基との化学量論比がより低くてよいことが分かった。   Furthermore, the molar ratio of protein to polymer and / or the stoichiometric ratio between the number of amino groups in the protein and the number of polymer molecules is a polymer-protein conjugate having two polymer units per protein, in particular the present invention. Was found to be important for the formation of di-PEGylated protein conjugates. Furthermore, when compared to non-glycosylated proteins, when the protein is glycosylated, the formation of a polymer-protein conjugate having two polymer units per protein, particularly a diPEGylated protein conjugate of the invention, It has been found that the stoichiometric ratio between the polymer molecule and the amino group in the protein may be lower.

さらに、未反応または部分的に反応したタンパク質分子に相当する望ましくない反応生成物を、第２のポリマー結合処理ステップ、例えばジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートをさらに生成してジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの全体的な工程歩留まりの向上に寄与する第２のＰＥＧ化反応ステップに適用する、再利用ステップの導入により、工程歩留まりが著しく増加される場合があることが分かった。予想外にも、再利用ステップにより、最初のＰＥＧ化反応で得られた品質に匹敵する高品質のジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートが高収率で得られる。さらに、１タンパク質当たり２つのポリマー単位を有するポリマー・タンパク質コンジュゲートをより大量に生産するために望ましくない反応生成物を再利用するというこの考え方は、他のポリマー・タンパク質コンジュゲートを形成する反応にも適用可能である。   Further, the undesired reaction product corresponding to the unreacted or partially reacted protein molecule can be further converted into a second polymer conjugation processing step, eg, a diPEGylated protein conjugate, to form the entire diPEGylated protein conjugate. It has been found that the process yield may be significantly increased by the introduction of a reuse step applied to the second PEGylation reaction step that contributes to an improved process yield. Unexpectedly, the recycling step yields a high quality diPEGylated protein conjugate in high yield that is comparable to the quality obtained in the initial PEGylation reaction. Furthermore, this notion of reusing undesirable reaction products to produce larger quantities of polymer-protein conjugates with two polymer units per protein is useful for reactions that form other polymer-protein conjugates. Is also applicable.

さらに、本発明のタンパク質修飾方法により、同じタイプのアミノ基（例えばリジン残基のε−アミノ基）でもタンパク質配列中の該反応性アミノ基を備えたアミノ酸に隣接するアミノ酸残基に応じて反応性が異なることを利用して、タンパク質の特定部位に優先的または圧倒的にポリマー単位を結合させることが可能になることが分かった。したがって、本発明の方法は、例えばタンパク質の異なるε−アミノ基、異なるグアニジノ基および／または異なるイミダゾール基の間のｐＫａの差異を利用するようなｐＨで行なわれることが好ましい。これにより、タンパク質の指定または事前選択可能または事前選択済または所定のアミノ基にポリマーが優先的に結合しているジポリマー・タンパク質コンジュゲートがほぼ均質に調製される。   Furthermore, by the protein modification method of the present invention, the same type of amino group (for example, ε-amino group of lysine residue) reacts depending on the amino acid residue adjacent to the amino acid having the reactive amino group in the protein sequence. It has been found that it is possible to bind polymer units preferentially or predominantly to specific sites of a protein by utilizing the difference in sex. Thus, the method of the present invention is preferably carried out at a pH that takes advantage of the difference in pKa between, for example, different ε-amino groups, different guanidino groups and / or different imidazole groups of proteins. This results in a nearly homogeneous preparation of a dipolymer-protein conjugate in which the polymer is preferentially attached to a designated or preselectable or preselected or predetermined amino group of the protein.

本発明の状況において「ほぼ均質」とは、調製物が、タンパク質の指定または事前選択可能または事前選択済または所定のアミノ基にポリマーが優先的に結合しているジポリマー・タンパク質コンジュゲートを主として含み、かつ非コンジュゲートタンパク質または１もしくは３以上のポリマーが結合しているタンパク質または所定のアミノ基とは別のアミノ基にポリマーが結合しているタンパク質がより少ないことを意味するように意図されている。好ましくは、調製物は、該調製物中に存在するタンパク質の総量に対して少なく
とも５０％、より好ましくは少なくとも６０、６５、７０もしくは７５％、さらに好ましくは少なくとも８０、８５もしくは９０％、そして最も好ましくは少なくとも９２、９４、９６、９８もしくは９９％の、事前選択されたアミノ基にポリマーが結合しているジポリマー・タンパク質コンジュゲートを含む。 In the context of the present invention, “substantially homogenous” mainly comprises a dipolymer / protein conjugate in which the polymer is preferentially bound to a designated or preselectable or preselected or predetermined amino group of a protein. And is intended to mean that less protein is bound to an unconjugated protein or protein to which one or more polymers are bound or to an amino group other than a given amino group. Yes. Preferably, the preparation is at least 50%, more preferably at least 60, 65, 70 or 75%, more preferably at least 80, 85 or 90%, and most preferably, relative to the total amount of protein present in the preparation Preferably at least 92, 94, 96, 98 or 99% of a dipolymer protein conjugate wherein the polymer is attached to a preselected amino group.

最後に、２つのジポリマー・タンパク質アイソフォームを指定の混合物として含むか、または単一のジポリマー・タンパク質アイソフォームを含むかのいずれかのジポリマー・タンパク質コンジュゲートの均質な調製物は、同様のモノＰＥＧ化タンパク質に少なくとも匹敵し、かつ対応する非ＰＥＧ化タンパク質よりも良好な生物活性を示すことが分かった。   Finally, homogenous preparations of dipolymer protein conjugates, either containing the two dipolymer protein isoforms as a specified mixture or containing a single dipolymer protein isoform, can be obtained from a similar monoPEG It was found to be at least comparable to the conjugated protein and to show better biological activity than the corresponding non-PEGylated protein.

好ましくは、本発明のポリマー・タンパク質コンジュゲートは還元的アルキル化によって調製される。したがって本発明は、タンパク質のアミノ基の２つの窒素原子が各々アミン結合によってポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲートを提供することが好ましい。   Preferably, the polymer protein conjugates of the present invention are prepared by reductive alkylation. Accordingly, the present invention preferably provides a polymer-protein conjugate in which the two nitrogen atoms of the amino group of the protein are each bonded to the polymer unit by an amine bond.

本発明の状況では、用語「アミノ基」としては、第一アミノ基および第二アミノ基、特に、アミノ酸側鎖のＮＨ基またはＮＨ２基、例えばリジン側鎖のＮＨ２基、アルギニンのグアニジノ基のＮＨ基またはＮＨ２基、あるいはヒスチジンのイミダゾール側鎖のＮＨ基が挙げられる。特に、用語「アミノ基」には、α−（Ｎ末端）アミノ基およびリジン側鎖のＮＨ２基であるε−アミノ基が含まれる。 In the context of the present invention, term "amino group", primary amino groups and secondary amino groups, in particular, NH group or NH 2 group of the amino acid side chains, for example, NH 2 groups of lysine side chains, guanidino group of arginine NH group or NH 2 group, or the imidazole side chain NH group of histidine. In particular, the term “amino group” includes an α- (N-terminal) amino group and an ε-amino group that is a NH 2 group on the lysine side chain.

ポリマー単位は、少なくとも１つのポリマー部分とリンカー部分とを含み、該リンカー部分は少なくとも１つのポリマー部分とアミン結合との間にある。リンカー部分は直線状でも分岐状でもよい。リンカー部分が分岐している場合、ポリマー単位は２以上のポリマー部分を含む場合がある。   The polymer unit includes at least one polymer moiety and a linker moiety, the linker moiety being between the at least one polymer moiety and the amine bond. The linker moiety may be linear or branched. When the linker moiety is branched, the polymer unit may contain two or more polymer moieties.

リンカー部分は好ましくは脂肪族リンカー部分である。適切な脂肪族リンカー部分はさらに、置換されたアルキルジアミンおよびトリアミン、リジンエステルおよびマロン酸エステル誘導体を含んでいる。リンカー部分は、ポリマー鎖が堅く固定されないように平面状でないことが好ましい。好ましくは、リンカー部分は、最大１８個、より好ましくは１〜１０個の炭素原子を含む、多重官能化されたアルキル基を含む。窒素、酸素あるいは硫黄のようなヘテロ原子が該アルキル鎖に含まれていてもよい。リンカー部分は、例えば炭素原子または窒素原子において分岐していてもよい。分岐状リンカー部分および該リンカー部分から生じる分枝状ポリマーユニットならびにそれらの調製方法の例は、国際公開公報第９５／１１９２４号パンフレットおよび国際公開公報第０３／０４９６９９号パンフレットに記述されている。前記特許文献は参照により本願に組込まれる。本発明の意味における「分岐状」とは、くし形状の部分をも含むように意図される。   The linker moiety is preferably an aliphatic linker moiety. Suitable aliphatic linker moieties further include substituted alkyl diamines and triamines, lysine esters and malonic ester derivatives. The linker moiety is preferably not planar so that the polymer chain is not firmly fixed. Preferably, the linker moiety comprises a multi-functionalized alkyl group containing up to 18, more preferably 1-10 carbon atoms. Heteroatoms such as nitrogen, oxygen or sulfur may be included in the alkyl chain. The linker moiety may be branched, for example at a carbon atom or a nitrogen atom. Examples of branched linker moieties and branched polymer units resulting from the linker moieties and methods for their preparation are described in WO 95/11924 and WO 03/049699. Said patent document is incorporated herein by reference. “Branched” in the sense of the present invention is intended to include comb-shaped parts.

本発明の好ましい実施形態では、リンカー部分は、アミン結合の窒素原子に結合した少なくとも１つのメチレン基、例えば、アミン結合の窒素原子に直接結合している１〜１２個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは２つのメチレン基を含む。   In a preferred embodiment of the present invention, the linker moiety is at least one methylene group bonded to the amine bonded nitrogen atom, for example 1-12, preferably 1-5 bonded directly to the amine bonded nitrogen atom. More preferably 1 to 3 and most preferably 2 methylene groups.

１つの好ましい本発明のポリマー・タンパク質コンジュゲートは、下式：
［（Ｒ−Ｌ１−ポリマー）ｙ−Ｌ２−（ＣＨ２−）ｍ−ＮＨ］２−Ｐ
（式中、Ｒは、Ｈ、低級アルキル、アリールまたは任意の適切な保護基であり；ポリマーは、タンパク質と結合させるのに適したポリマーであり；ｍはメチレン基の数を表わす整数であり、Ｐは生物学的に活性なタンパク質またはプロテイノイドであって、該タンパク質またはプロテイノイドのアミノ基の２つの窒素原子（上記式中ＮＨで表わされている）
は各々ポリマー単位と結合しており、Ｌ１はＯ、Ｎ、Ｓ、および分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分のうち少なくともいずれかであって存在していても存在しなくてもよく；Ｌ２は分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分であって存在していても存在しなくてもよく；ｙは整数であり、ただし、Ｌ２が存在しない場合ｙは１であり、Ｌ２が存在する場合ｙは少なくとも１である）を有する。 One preferred polymer-protein conjugate of the invention has the following formula:
[(R-L 1 - polymer) y -L 2 - (CH 2 -) m -NH] 2 -P
Wherein R is H, lower alkyl, aryl or any suitable protecting group; the polymer is a polymer suitable for conjugation with a protein; m is an integer representing the number of methylene groups; P is a biologically active protein or proteinoid, and two nitrogen atoms of the amino group of the protein or proteinoid (represented by NH in the above formula)
Are each linked to a polymer unit and L 1 may be present or absent from at least one of O, N, S, and a branched or unbranched linker moiety; 2 is a branched or unbranched linker moiety and may or may not be present; y is an integer, provided that if L 2 is not present, y is 1 and L 2 is present Y is at least 1).

Ｒは低級アルキルまたはベンジルのようなアリールである。用語「低級アルキル」には、１〜７個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子を含む低級アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチルなどがあり、特に好ましいのはメチルである。   R is lower alkyl or aryl such as benzyl. The term “lower alkyl” includes lower alkyl groups containing 1 to 7 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl and the like, with methyl being particularly preferred. It is.

少なくとも１つのポリマー部分と適切な保護基との間の結合の一部であるリンカーＬ１、および／またはＰＥＧ鎖のエチレンオキシド残基のような少なくとも１つのポリマー部分とタンパク質もしくはプロテイノイドの窒素原子との間、特に、ＰＥＧ鎖のエチレンオキシド残基とメチレン基との間の結合の一部であるリンカーＬ２は、独立に存在していても存在していなくてもよく、また上記リンカー部分、例えば（−ＣＯ）２−ＣＨ−、−ＣＯ−Ｏ−、および／または−ＣＯ−ＮＨ−などの任意の構造式を有する分岐状または非分岐状のリンカー部分から独立に選択される。リンカーＬ１は、Ｏ、Ｎおよび／またはＳである場合もありうる。 A linker L 1 that is part of a bond between at least one polymer moiety and a suitable protecting group, and / or at least one polymer moiety such as an ethylene oxide residue of a PEG chain and a nitrogen atom of a protein or proteinoid In particular, the linker L 2 which is part of the bond between the ethylene oxide residue of the PEG chain and the methylene group may or may not be present independently, and the linker moiety, eg It is independently selected from a branched or unbranched linker moiety having any structural formula such as (—CO) 2 —CH—, —CO—O—, and / or —CO—NH—. The linker L 1 can be O, N and / or S.

通常、ＰＥＧ鎖のエチレンオキシド残基などのポリマー部分と、ＰＥＧ試薬のようなポリマー部分が結合されるタンパク質またはプロテイノイドの窒素原子との間の結合の一部を形成しているメチレン基の数ｍは、１〜１２の範囲、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３、最も好ましくは２である。   Usually, the number m of methylene groups forming part of the bond between a polymer moiety such as an ethylene oxide residue of a PEG chain and a nitrogen atom of a protein or proteinoid to which the polymer moiety such as a PEG reagent is bound Is in the range of 1-12, preferably 1-5, more preferably 1-3, most preferably 2.

通常、数値ｙは、Ｌ２が存在する場合、１〜１０の範囲、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３、最も好ましくは２である。
ポリマー部分は通常、ほとんど非抗原性または非免疫原性のポリマー鎖である。さらに、使用されるポリマー部分は、水溶性ポリマー部分の中から選択されることが好ましい。これは、水溶性ポリマー部分が付着または結合したタンパク質が生理学的環境のような水性環境の中で沈殿しないという利点を有する。還元的アルキル化については、本方法で提供されるように重合度を制御可能なように、選択されたポリマーはさらに単一の反応性アルデヒドを有していなければならない。ポリマー部分と同様にポリマー単位も分岐状または非分岐状であってよい。最終生成調製物の治療的使用については、ポリマーは薬学的に許容可能なものが好ましいであろう。当業者であれば、ポリマー・タンパク質コンジュゲートが治療的に使用されるかどうか、そうであれば所望の投与量、血中循環時間、タンパク質分解への耐性およびその他の事項を考慮して、所望のポリマー部分を選択することができるであろう。 Usually, numbers y, if L 2 is present, 1 to 10 range, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, most preferably 2.
The polymer portion is usually mostly non-antigenic or non-immunogenic polymer chains. Furthermore, the polymer part used is preferably selected from among water-soluble polymer parts. This has the advantage that proteins to which water-soluble polymer moieties are attached or bound do not precipitate in an aqueous environment, such as a physiological environment. For reductive alkylation, the selected polymer must additionally have a single reactive aldehyde so that the degree of polymerization can be controlled as provided in the present process. Similar to the polymer portion, the polymer unit may be branched or unbranched. For therapeutic use of the final product preparation, the polymer will preferably be pharmaceutically acceptable. Those skilled in the art will consider whether the polymer-protein conjugate is used therapeutically and, if so, considering the desired dosage, blood circulation time, resistance to proteolysis and other considerations. The polymer portion could be selected.

好ましくは、ポリマー部分は、ポリアルキレン・グリコール部分、デキストランとその誘導体のような多糖部分、多糖およびその誘導体、ポリビニルピロリドンのようなピロリドン部分、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース部分、ポリビニルアルコール、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン−無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸部分および／またはポリアクリルアミド部分、ならびに／または、他の同様の非免疫原性ポリマー部分（ホモポリマーまたはランダム共重合体のいずれか）および／またはその誘導体、から成る群から選択されうる。そのようなポリマーはまた、本発明に組み入れるために官能化されてもよいし活性化されてもよい。   Preferably, the polymer moiety is a polyalkylene glycol moiety, a polysaccharide moiety such as dextran and derivatives thereof, a polysaccharide and derivatives thereof, a pyrrolidone moiety such as polyvinylpyrrolidone, a cellulose moiety such as carboxymethylcellulose, polyvinyl alcohol, poly-1 , 3-dioxolane, poly-1,3,6-trioxane, ethylene-maleic anhydride copolymer, polyamino acid moiety and / or polyacrylamide moiety, and / or other similar non-immunogenic polymer moieties (homo Either a polymer or a random copolymer) and / or derivatives thereof. Such polymers may also be functionalized or activated for incorporation into the present invention.

特に、ポリマー部分はポリアルキレン・グリコール部分である。用語「ポリアルキレン・グリコール」は、アルキレン基が直鎖または分岐鎖の基であるポリアルキレン・グリコ
ール基またはポリアルキレン・グリコール部分を示す。用語「ポリアルキレン・グリコール」はまた、ポリエチレン基とポリプロピレン基との混合物を含んでいるポリマー、およびポリイソプロピレン基、ポリエチレン基およびポリイソブチレン基の混合物を含んでいるポリマーのような混合アルキレン・グリコールから形成されたポリアルキレン・グリコールも含む。好ましくは、本発明のポリマー・タンパク質コンジュゲート中のポリアルキレン・グリコール部分は、２つの末端ヒドロキシル基の除去によって形成されたポリエチレングリコール部分またはポリエチレングリコール残基である。 In particular, the polymer moiety is a polyalkylene glycol moiety. The term “polyalkylene glycol” refers to a polyalkylene glycol group or polyalkylene glycol moiety in which the alkylene group is a linear or branched group. The term “polyalkylene glycol” also includes mixed alkylene glycols such as polymers containing mixtures of polyethylene and polypropylene groups, and polymers containing mixtures of polyisopropylene, polyethylene and polyisobutylene groups. Also included are polyalkylene glycols formed from Preferably, the polyalkylene glycol moiety in the polymer protein conjugate of the present invention is a polyethylene glycol moiety or a polyethylene glycol residue formed by removal of two terminal hydroxyl groups.

この群には、メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）などのａ置換されたポリアルキレンオキシド誘導体、あるいは他の適切なアルキル置換されたポリアルキレンオキシド誘導体、例えばモノ−またはビス末端Ｃ１−Ｃ４基を含んでいるものがある。モノメチル・ポリエチレングリコール・ホモポリマーのような直鎖の非抗原性ポリマーが好ましい。さらに、他のポリエチレングリコール・ホモポリマー、ポリエチレングリコール・ヘテロポリマー、他のアルキルポリアルキレンオキシドブロック共重合体、およびポリアルキレンオキシドのブロック共重合体の共重合体のような別のポリアルキレンオキシドも有用である。 This group includes a-substituted polyalkylene oxide derivatives such as methoxypolyethylene glycol (mPEG), or other suitable alkyl-substituted polyalkylene oxide derivatives such as mono- or bis-terminated C 1 -C 4 groups There is something that is. Linear non-antigenic polymers such as monomethyl polyethylene glycol homopolymer are preferred. In addition, other polyalkylene oxides such as other polyethylene glycol homopolymers, polyethylene glycol heteropolymers, other alkyl polyalkylene oxide block copolymers, and block copolymer copolymers of polyalkylene oxide are also useful. It is.

上記は単なる例証であり、ここで使用するのに適した非抗原性のポリマーまたはポリマー部分のタイプを限定するものではない。
本発明による特に好ましいポリマーは、下式：
［（Ｒ−Ｌ１−ＰＥＧｙ）−Ｌ２−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ］２−Ｐ
（式中、Ｒ、Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、ｙ、ｍは上記のように定義される）のＰＥＧタンパク質コンジュゲートを生じるポリエチレングリコールである。 The above is merely illustrative and does not limit the type of non-antigenic polymer or polymer moiety suitable for use herein.
Particularly preferred polymers according to the invention have the following formula:
[(R-L 1 -PEG y ) -L 2 - (CH 2) m -NH] 2 -P
(Wherein R, P, L 1 , L 2 , y, m are as defined above) is a polyethylene glycol that yields a PEG protein conjugate.

特に、ＰＥＧは式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎを有し、式中、ｎはポリエチレングリコール単位中のエチレンオキシド残基の数を表す。さらに、Ｌ１はＯであり、Ｌ２は存在せずｙは１であることが好ましい。 In particular, PEG has the formula — (CH 2 —CH 2 —O) n , where n represents the number of ethylene oxide residues in the polyethylene glycol unit. Furthermore, it is preferred that L 1 is O, L 2 does not exist and y is 1.

本発明によりポリマー単位が結合されうるアミノ基の窒素原子は、α−アミノ基、ε−アミノ基、グアニジン基およびイミダゾール基の窒素原子から成る群から選択されることが好ましい。第一アミノ基の窒素原子にポリマー単位を結合することが好ましいが、これに限定はされない。   The nitrogen atom of the amino group to which the polymer unit can be bound according to the present invention is preferably selected from the group consisting of nitrogen atoms of α-amino groups, ε-amino groups, guanidine groups and imidazole groups. The polymer unit is preferably bonded to the nitrogen atom of the primary amino group, but is not limited thereto.

本発明に従ってコンジュゲートとすることが可能な、生物学的に活性なタンパク質は、従来の治療用タンパク質のうち任意のものであってよい。さらに、本発明の状況においては、用語「タンパク質」はタンパク質およびプロテイノイドを含むものとして了解される。本発明の状況においては、プロテイノイドは、対応する天然タンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、ペプチドの形態で化学合成され互いに連結されて天然タンパク質と同様の生物活性を示す天然タンパク質様構造を形成する、合成のタンパク質様分子である。これらのプロテイノイドは潜在的なタンパク質治療薬である。   The biologically active protein that can be conjugated in accordance with the present invention can be any of the conventional therapeutic proteins. Further, in the context of the present invention, the term “protein” is understood to include proteins and proteinoids. In the context of the present invention, a proteinoid has the same amino acid sequence as the corresponding natural protein, but is chemically synthesized in the form of a peptide and linked together to form a natural protein-like structure that exhibits biological activity similar to that of the natural protein. It is a synthetic protein-like molecule. These proteinoids are potential protein therapeutics.

２つのポリマー単位と結合させることが可能であり、特に、本発明によってジＰＥＧ化することが可能であるタンパク質には、非変異型および変異型タンパク質、たとえば限定するものではないが増殖因子、抗体、ホルモン、特に治療上活性を有するタンパク質、たとえば限定するものではないがエリスロポエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、コンセンサスインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ヘモグロビン、成長ホルモン、インターロイキン２およびインターロイキン６のようなインターロイキン、腫瘍壊死因子、様々なサイトカインならびにＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤのような免疫グロブリン、および／またはそれらの構造的および／または機能的なバリアントおよび／またはフラグメントおよび／または類似体、ならびにこれ
らのプロテイノイドまたは合成タンパク質様の形態、例えば合成赤血球形成タンパク質（合成ＥＰＯ）などが挙げられる。２つのポリマー単位と結合させることが可能なタンパク質はグリコシル化されていてもよいし、グリコシル化されていなくてもよい。例えばエリスロポエチンについては、その活性がグリコシル化に大きく依存することが示されている。天然のエリスロポエチンは、成熟型タンパク質の２４、３８、８３位、および１２６位が、それぞれＮグリコシル化およびＯグリコシル化されている。本発明によるコンジュゲート作製に使用しようとするグリコシル化タンパク質は、天然のタンパク質と同じグリコシル化パターンを有することが好ましい。しかしながら、本発明はまた、天然のタンパク質とは異なったグリコシル化パターンを有するが天然タンパク質とほぼ同じかまたはそれよりも高い生物活性を有するグリコシル化タンパク質をも包含する。用語「グリコシル化タンパク質」とは、該タンパク質のアミノ酸鎖に少なくとも１つの炭水化物分子が結合していることを意味するものと意図される。 Proteins that can be conjugated to two polymer units and in particular can be diPEGylated according to the present invention include non-mutated and mutated proteins such as, but not limited to, growth factors, antibodies Hormones, particularly proteins with therapeutic activity, such as but not limited to erythropoietin, interferon alpha, interferon beta, interferon gamma, consensus interferon, G-CSF, GM-CSF, hemoglobin, growth hormone, interleukin 2 and interleukin 2 Interleukins such as leukin 6, tumor necrosis factor, various cytokines and immunoglobulins such as IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, and / or their structural and / or functional variants and / or The fragments and / or analogs, as well as the form of these proteinoid or synthetic protein-like, such as synthetic erythropoiesis protein (synthetic EPO) and the like. Proteins that can be linked to two polymer units may or may not be glycosylated. For example, for erythropoietin, its activity has been shown to be highly dependent on glycosylation. Natural erythropoietin is N-glycosylated and O-glycosylated at positions 24, 38, 83, and 126 of the mature protein, respectively. The glycosylated protein to be used to make the conjugate according to the invention preferably has the same glycosylation pattern as the native protein. However, the present invention also encompasses glycosylated proteins that have a glycosylation pattern that differs from that of the native protein, but that have approximately the same or higher biological activity as the native protein. The term “glycosylated protein” is intended to mean that at least one carbohydrate molecule is attached to the amino acid chain of the protein.

一般に、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ＩＦＮα２ａおよびｈＧＨのような本発明の実施に役立つタンパク質は、哺乳類から単離された任意の形態でもよいし、ゲノムやｃＤＮＡのクローニングまたはＤＮＡ合成によって得られた外来ＤＮＡ配列を原核生物もしくは真核生物の宿主で発現させた生成物でもよいし、あるいは化学合成法または内在遺伝子の活性化による生成物であってもよい。したがって、タンパク質は、組織、哺乳動物細胞または微生物細胞の培養物、植物細胞の培養物、トランスジェニック動物、酵母、菌類および／またはトランスジェニック植物から得られた天然または組換えの供給源のものでよい。適切な原核生物の宿主としては大腸菌のような様々な細菌があり；適切な真核生物の宿主としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母、チャイニーズハムスター卵巣細胞またはサルの細胞のような哺乳動物細胞、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどのトランスジェニック動物、植物細胞培養物、およびＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ（苔）のようなトランスジェニック植物がある。使用される宿主によって、タンパク質発現産物は、哺乳類、植物またはその他の真核生物の炭水化物によってグリコシル化されていてもよいし、あるいは、グリコシル化されていなくてもよい。   In general, proteins useful for the practice of the present invention, such as G-CSF, erythropoietin, IFNα2a and hGH, can be in any form isolated from mammals, or can be foreign DNA obtained by genomic or cDNA cloning or DNA synthesis. It may be a product of the sequence expressed in a prokaryotic or eukaryotic host, or it may be a product of chemical synthesis or activation of an endogenous gene. Thus, proteins are of natural or recombinant sources obtained from tissues, cultures of mammalian or microbial cells, cultures of plant cells, transgenic animals, yeast, fungi and / or transgenic plants. Good. Suitable prokaryotic hosts include various bacteria such as E. coli; suitable eukaryotic hosts include S. cerevisiae. Like yeasts such as cerevisiae or Pichia pastoris, mammalian cells such as Chinese hamster ovary cells or monkey cells, transgenic animals such as mice, rabbits, goats, sheep, plant cell cultures, and Physcomitrella patens (moss) There are many transgenic plants. Depending on the host used, the protein expression product may or may not be glycosylated by mammalian, plant or other eukaryotic carbohydrates.

本発明の範囲内では、野生型タンパク質の類似体は、野生型の配列と比較して追加のアミノ基などの追加のポリマー結合部位を含まないことが好ましい。さらに、類似体は、野生型のアミノ酸配列中に本来存在するアミノ基含有アミノ酸の突然変異を含まないことが好ましい。しかしながら、野生型タンパク質のアミノ酸配列を使用することが好ましい。   Within the scope of the present invention, it is preferred that the analog of the wild-type protein does not contain additional polymer binding sites such as additional amino groups compared to the wild-type sequence. Furthermore, it is preferred that the analog does not contain amino group-containing amino acid mutations that are naturally present in the wild-type amino acid sequence. However, it is preferred to use the amino acid sequence of the wild type protein.

タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合、Ｇ−ＣＳＦ発現産物は１位に開始メチオニン・アミノ酸残基を含んでいてもよい。本発明は、ありとあらゆる形態のＧ−ＣＳＦの使用を企図しているが、組換えＧ−ＣＳＦ、特に大腸菌由来のものが好ましい。ある種のＧ−ＣＳＦ類似体が生物学的機能を有することが報告されており、これらが本発明によってコンジュゲートに供されてもよい。これらのＧ−ＣＳＦ類似体には、配列番号１のＧ−ＣＳＦアミノ酸配列と比較してアミノ酸の付加、欠失および／または置換を有するものが挙げられる。本発明の範囲内で、これらの類似体は、配列番号１のＧ−ＣＳＦアミノ酸配列と比較して、追加のアミノ基のような追加のポリマー結合部位を含まない。さらに、類似体は、配列番号１のＧ−ＣＳＦアミノ酸配列中に本来存在するアミノ基含有アミノ酸の突然変異を含まない。しかしながら、配列番号１の野生型のタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質が最も好ましい。   When the protein is G-CSF, the G-CSF expression product may contain an initiating methionine amino acid residue at position 1. Although the present invention contemplates the use of any and all forms of G-CSF, recombinant G-CSF, particularly those from E. coli, are preferred. Certain G-CSF analogs have been reported to have biological functions and may be subjected to conjugates according to the present invention. These G-CSF analogs include those having amino acid additions, deletions and / or substitutions compared to the G-CSF amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Within the scope of the present invention, these analogs do not contain additional polymer binding sites such as additional amino groups compared to the G-CSF amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. In addition, the analog does not contain amino group-containing amino acid mutations naturally present in the G-CSF amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. However, a protein having the amino acid sequence of the wild type protein of SEQ ID NO: 1 is most preferred.

好ましくは、タンパク質は、Ｇ−ＣＳＦの活性を有するもの、例えばＧ−ＣＳＦの突然変異体、グリコシル化Ｇ−ＣＳＦ、非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦおよび／またはその他の構造的および／または機能的修飾を有するＧ−ＣＳＦバリアントなどである。一層の好ましい実施形態では、タンパク質は、配列番号１（図２０を参照）で特定されるＧ−ＣＳＦの
アミノ酸配列を有し、該配列は、１７４アミノ酸に加えてＮ末端メチオニル残基を有する細菌で生産された組換えＧＣＳＦに相当するものである。生物学的活性を有するＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列であって、１位にメチオニル残基を含まないという点で配列番号１と異なるものも好ましく、野生型タンパク質と呼ばれるものも本発明の範囲内にある。 Preferably, the protein has G-CSF activity, such as a mutant of G-CSF, glycosylated G-CSF, non-glycosylated G-CSF and / or other structural and / or functional modifications. G-CSF variants and the like. In a more preferred embodiment, the protein has the amino acid sequence of G-CSF identified by SEQ ID NO: 1 (see FIG. 20), which sequence has a N-terminal methionyl residue in addition to 174 amino acids. This corresponds to the recombinant GCSF produced in (1). An amino acid sequence of G-CSF having biological activity that is different from SEQ ID NO: 1 in that it does not contain a methionyl residue at the 1-position is preferred, and a so-called wild-type protein is also within the scope of the present invention. is there.

タンパク質がＧ−ＣＳＦの活性を有するものである場合、２つのアミノ基は、Ｇ−ＣＳＦのα−アミノ基（Ｎ末端基）およびリジン残基のε−アミノ基から成る群から選択されることが好ましい。国際公開公報第９６／１１９５３号パンフレットには、（ｉ）モノＰＥＧ化は、タンパク質のα−アミノ基とε−アミノ基との間のｐＫａの差異に基づいた反応性の違いが利用されて次の順序：Ｎ末端＞リジン３５＞リジン４１＞＞リジン１７，２４（ここでは有意なＰＥＧ化は検出できなかった）で生じ、また（ｉｉ）モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの生物活性は次の順序：Ｎ末端＞リジン３５＞リジン４１で減少したことが示されている。ライダー−オルソン（Reidhaar-Olson）ら（Biochemistry、（１９９６）第３５巻、ｐ．９０３４−９０４１）によって記述されたアラニンスキャニング突然変異誘発から、リジン３５およびリジン４１が生物活性に関して重要な残基であることが明らかとなった。また、構造シミュレーション研究から、Ｇ−ＣＳＦのリジン１７およびリジン２４はタンパク質レセプター相互作用の領域内に位置するため、これらのリジンをＰＥＧ化するとタンパク質の生物活性が低くなる可能性があることが明らかとなった。したがって、これらの部位にポリエチレングリコールのようなポリマー部分を結合させれば、レセプター結合が立体的に妨害されることが考えられる。   When the protein has G-CSF activity, the two amino groups are selected from the group consisting of the α-amino group (N-terminal group) of G-CSF and the ε-amino group of lysine residues. Is preferred. In WO 96/11953 pamphlet, (i) mono-PEGylation is based on the difference in reactivity based on pKa difference between α-amino group and ε-amino group of protein. Order: N-terminus> lysine 35> lysine 41 >> lysine 17,24 (no significant PEGylation was detectable here) and (ii) the biological activity of mono-PEGylated G-CSF is in the following order: : Decreased at N-terminal> lysine 35> lysine 41. From alanine scanning mutagenesis described by Reidhaar-Olson et al. (Biochemistry, (1996) Vol. 35, p. 9034-9041), lysine 35 and lysine 41 are important residues for biological activity. It became clear that there was. From structural simulation studies, it is clear that lysine 17 and lysine 24 of G-CSF are located in the region of protein receptor interaction, so that PEGylation of these lysines may reduce protein biological activity. It became. Therefore, if a polymer moiety such as polyethylene glycol is bound to these sites, it is considered that receptor binding is sterically hindered.

ここで、本発明において使用される穏やかな反応条件の下では、ジＰＥＧ化は、利用可能なε−アミノ基の間の反応性の違いが識別されて別の順序すなわちＮ末端＞リジン１７およびリジン３５＞＞リジン２４，４１（ここでは有意なＰＥＧ化は検出できなかった）で生じることが見出された。したがって、ＰＥＧと結合する該タンパク質の２つのアミノ基は、Ｎ末端アミノ基、リジン１７のｅ−アミノ基およびリジン３５のｅ−アミノ基から成る群から選ばれることが好ましい。しかしながら、他の実施例では、ＰＥＧのようなポリマー基のカップリングは、リジン２４のｅ−アミノ基および／またはリジン４１のｅ−アミノ基で生じる場合もある。残基の番号は、配列番号１（図２０を参照）において特定されたＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列を参照するものである。   Here, under the mild reaction conditions used in the present invention, diPEGylation is identified in a different order, ie, N-terminal> lysine 17 and the difference in reactivity between the available ε-amino groups. It was found to occur with lysine 35 >> lysine 24,41 (where no significant PEGylation could be detected). Accordingly, the two amino groups of the protein that bind to PEG are preferably selected from the group consisting of an N-terminal amino group, an e-amino group of lysine 17 and an e-amino group of lysine 35. However, in other examples, coupling of a polymer group such as PEG may occur at the e-amino group of lysine 24 and / or the e-amino group of lysine 41. Residue numbers refer to the amino acid sequence of G-CSF identified in SEQ ID NO: 1 (see FIG. 20).

タンパク質はインターフェロン・ファミリーのタンパク質であってもよく、好ましくはタンパク質はインターフェロンαタンパク質、最も好ましくはインターフェロンα２ａである。タンパク質がインターフェロンα２ａである場合、その配列は好ましくは配列番号２（図２１を参照）である。本発明は、ありとあらゆる形態のインターフェロンα２ａ、さらには例えば生物学的機能を有する該タンパク質の類似体の使用をも企図している。これらの類似体には、配列番号２のインターフェロンα２ａアミノ酸配列と比較してアミノ酸の付加、欠失および／または置換を有するものが含まれうる。本発明の範囲内では、これらの類似体は、配列番号２のインターフェロンα２ａアミノ酸配列と比較して、追加のアミノ基のような追加のポリマー結合部位を含まない。さらに、類似体は、配列番号２のインターフェロンα２ａアミノ酸配列中に本来存在するアミノ基含有アミノ酸の突然変異を含まない。しかしながら、配列番号２の野生型タンパク質のアミノ酸配列を使用することが好ましい。   The protein may be an interferon family protein, preferably the protein is an interferon alpha protein, most preferably interferon alpha 2a. When the protein is interferon α2a, the sequence is preferably SEQ ID NO: 2 (see FIG. 21). The present invention also contemplates the use of any and all forms of interferon α2a, as well as analogs of the protein having, for example, biological function. These analogs can include those with amino acid additions, deletions and / or substitutions compared to the interferon α2a amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Within the scope of the present invention, these analogs do not contain additional polymer binding sites such as additional amino groups as compared to the interferon α2a amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. In addition, the analog does not contain amino acid-containing amino acid mutations that are naturally present in the interferon α2a amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. However, it is preferred to use the amino acid sequence of the wild type protein of SEQ ID NO: 2.

タンパク質がインターフェロンα２ａの活性を有するものである場合、ポリマー結合用の２つのアミノ基はα−アミノ基（Ｎ末端基）およびインターフェロンα２ａのリジン残基のｅ−アミノ基から成る群から選択されることが好ましい。潜在的なＰＥＧ結合部位の中では、配列番号２の成熟型タンパク質の１２１位、１３１位、１３４位、３１位および４９位のリジン残基が、溶媒に接触しやすいことから最も好ましいことが示された。しかしながら、本発明はさらに、ＰＥＧのようなポリマー基を、成熟型タンパク質配列のリジ
ン７０、８３、１１２、１６４、２３および／またはリジン１３３のε−アミノ基に結合させることにも関する。 When the protein has interferon α2a activity, the two amino groups for polymer attachment are selected from the group consisting of an α-amino group (N-terminal group) and the e-amino group of the lysine residue of interferon α2a. It is preferable. Among the potential PEG binding sites, the lysine residues at positions 121, 131, 134, 31 and 49 of the mature protein of SEQ ID NO: 2 are most preferred because they are easily accessible to solvents. It was done. However, the present invention further relates to attachment of a polymer group such as PEG to the ε-amino group of lysine 70, 83, 112, 164, 23 and / or lysine 133 of the mature protein sequence.

タンパク質がエリスロポエチンである場合、配列番号３（図２２を参照）の配列を有することが好ましい。本発明は、ありとあらゆる形態のエリスロポエチン、さらには例えば該タンパク質の生物学的機能を有する類似体の使用をも企図している。本発明はさらに、グリコシル化および非グリコシル化エリスロポエチンのいずれの使用も企図している。これらの類似体には、配列番号３のエリスロポエチン・アミノ酸配列と比較して、アミノ酸の付加、欠失および／または置換を有するものが含まれうる。本発明の範囲内では、これらの類似体は、配列番号３のエリスロポエチン・アミノ酸配列と比較して、追加のアミノ基のような追加のポリマー結合部位を含まない。さらに、類似体は、配列番号３のエリスロポエチン・アミノ酸配列中に本来存在するアミノ基含有アミノ酸の突然変異を含まない。しかしながら、配列番号３の野生型タンパク質のアミノ酸配列を使用することが好ましい。   When the protein is erythropoietin, it preferably has the sequence of SEQ ID NO: 3 (see FIG. 22). The present invention also contemplates the use of all forms of erythropoietin, as well as analogs having, for example, the biological function of the protein. The present invention further contemplates the use of both glycosylated and non-glycosylated erythropoietin. These analogs can include those having amino acid additions, deletions and / or substitutions compared to the erythropoietin amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. Within the scope of the present invention, these analogs do not contain additional polymer binding sites such as additional amino groups compared to the erythropoietin amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. Furthermore, the analog does not contain amino acid-containing amino acid mutations that are naturally present in the erythropoietin amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. However, it is preferred to use the amino acid sequence of the wild type protein of SEQ ID NO: 3.

タンパク質がエリスロポエチンの活性を有するものである場合、ポリマー結合用の２つのアミノ基はα−アミノ基（Ｎ末端基）およびエリスロポエチンのリジン残基のｅ−アミノ基から成る群から選択されることが好ましい。潜在的なＰＥＧ結合部位の中では、配列番号３の成熟型タンパク質の５２位、１１６位および１５２位のリジン残基が、溶媒に接触しやすいことから最も好ましいことが示された。しかしながら、本発明はさらに、ＰＥＧのようなポリマー基を、成熟型タンパク質配列のリジン２０、４５、９７、１４０および／またはリジン１５４のε−アミノ基に結合させることにも関する。   If the protein has erythropoietin activity, the two amino groups for polymer attachment may be selected from the group consisting of an α-amino group (N-terminal group) and the e-amino group of the lysine residue of erythropoietin. preferable. Among the potential PEG binding sites, the lysine residues at positions 52, 116 and 152 of the mature protein of SEQ ID NO: 3 were shown to be most preferable because they are easily accessible to solvents. However, the present invention further relates to attaching a polymer group such as PEG to the ε-amino group of lysine 20, 45, 97, 140 and / or lysine 154 of the mature protein sequence.

タンパク質がｈＧＨ（ヒト成長ホルモン）である場合、配列番号４（図２３を参照）の配列を有することが好ましい。本発明は、ありとあらゆる形態のｈＧＨ、さらには例えば該タンパク質の生物学的機能を有する類似体の使用をも企図している。これらの類似体には、配列番号４のｈＧＨアミノ酸配列と比較して、アミノ酸の付加、欠失および／または置換を有するものが含まれうる。本発明の範囲内では、これらの類似体は、配列番号４のｈＧＨアミノ酸配列と比較して、追加のアミノ基のような追加のポリマー結合部位を含まない。さらに、類似体は、配列番号４のｈＧＨアミノ酸配列中に本来存在するアミノ基含有アミノ酸の突然変異を含まない。しかしながら、配列番号４の野生型タンパク質のアミノ酸配列を使用することが好ましい。   When the protein is hGH (human growth hormone), it preferably has the sequence of SEQ ID NO: 4 (see FIG. 23). The present invention also contemplates the use of all forms of hGH, as well as analogs that have, for example, the biological function of the protein. These analogs can include those with amino acid additions, deletions and / or substitutions compared to the hGH amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Within the scope of the present invention, these analogs do not contain additional polymer binding sites such as additional amino groups as compared to the hGH amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. In addition, the analog does not contain amino acid-containing amino acid mutations that are naturally present in the hGH amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. However, it is preferred to use the amino acid sequence of the wild type protein of SEQ ID NO: 4.

タンパク質がｈＧＨの活性を有するものである場合、ポリマー結合用の２つのアミノ基はα−アミノ基（Ｎ末端基）およびｈＧＨのリジン残基のｅ−アミノ基から成る群から選択されることが好ましい。潜在的なＰＥＧ結合部位の中では、配列番号４の成熟型タンパク質配列の１４０位、１４５位、３８位および７０位のリジン残基が、溶媒に接触しやすいことから最も好ましく、一方、該成熟型タンパク質の１７２位、４１位、１５８位、１６８位および１１５位のリジン残基は、レセプター結合に関与することからあまり好ましくないことが示されている（クラーク（Clark ）ら、（１９９６）J. Biol. Chem.、第２７１巻（３６）、ｐ．２１９６９−２１９７７）。しかしながら、本発明はさらに、ＰＥＧのようなポリマー基を、成熟型タンパク質配列のリジン４１、１１５、１５８、１６８および／またはリジン１７２のε−アミノ基に結合させることにも関する。   If the protein has hGH activity, the two amino groups for polymer attachment may be selected from the group consisting of an α-amino group (N-terminal group) and the e-amino group of the lysine residue of hGH. preferable. Of the potential PEG attachment sites, the lysine residues at positions 140, 145, 38 and 70 of the mature protein sequence of SEQ ID NO: 4 are most preferred due to their accessibility to solvents, whereas the mature The lysine residues at positions 172, 41, 158, 168 and 115 of the type protein have been shown to be less preferred because they are involved in receptor binding (Clark et al., (1996) J Biol. Chem., 271, (36), p. 21969-21977). However, the present invention further relates to attachment of a polymer group such as PEG to the ε-amino group of lysine 41, 115, 158, 168 and / or lysine 172 of the mature protein sequence.

さらに、アミノ基に結合させるポリエチレングリコール部分の分子量は、２〜１００ｋＤａ、好ましくは５〜６０ｋＤａ、より好ましくは１０〜３０ｋＤａ、および最も好ましくは１２〜２０ｋＤａである。本発明の一層の好ましい実施形態では、ポリエチレングリコール部分のエチレンオキシド残基の数ｎは、約４０〜約２２７０、より好ましくは約１１０〜約１３７０、および最も好ましくは約２２５〜約６８０である。   Furthermore, the molecular weight of the polyethylene glycol moiety attached to the amino group is 2 to 100 kDa, preferably 5 to 60 kDa, more preferably 10 to 30 kDa, and most preferably 12 to 20 kDa. In a further preferred embodiment of the invention, the number n of ethylene oxide residues of the polyethylene glycol moiety is from about 40 to about 2270, more preferably from about 110 to about 1370, and most preferably from about 225 to about 680.

本発明の別の態様では、上記のポリマー・タンパク質コンジュゲートの医薬組成物が提供される。そのような医薬組成物は、注射による投与、あるいは経口、経肺、経鼻またはその他の形式による投与に好適であってよい。概して、本発明は、有効な量の本発明のジポリマー・タンパク質コンジュゲートを、薬学的に許容可能な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または担体と一緒に含んでなる医薬組成物を提供する。そのような組成物は、トリス−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩のような様々なバッファー含有量、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤を含んでもよいし；ツウィーン８０のような界面活性剤および可溶化剤、アスコルビン酸およびメタ亜硫酸水素ナトリウムのような酸化防止剤、ベンジルアルコールのような防腐剤、およびラクトースまたはマンニトールのような増量物質、などの添加剤を含んでもよく；該材料が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのようなポリマー化合物の微粒子調製物内に、あるいはリポソーム内に組み込まれてもよい。そのような組成物は、本発明によるポリマー・タンパク質コンジュゲートの物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、およびインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼす場合がある。   In another aspect of the present invention, a pharmaceutical composition of the above polymer-protein conjugate is provided. Such pharmaceutical compositions may be suitable for administration by injection or administration by oral, pulmonary, nasal or other forms. In general, the present invention relates to a medicament comprising an effective amount of a dipolymer protein conjugate of the present invention together with a pharmaceutically acceptable diluent, preservative, solubilizer, emulsifier, adjuvant and / or carrier. A composition is provided. Such compositions may include various buffer content, pH and ionic strength diluents such as Tris-HCl, acetate, phosphate; surfactants such as Tween 80 and solubilization Additives such as additives, antioxidants such as ascorbic acid and sodium metabisulfite, preservatives such as benzyl alcohol, and bulking substances such as lactose or mannitol; It may be incorporated into microparticle preparations of polymer compounds such as polyglycolic acid or the like, or into liposomes. Such compositions may affect the physical state, stability, in vivo release rate, and in vivo clearance rate of the polymer protein conjugates according to the present invention.

既に上述したように、本発明の医薬調製物は、少なくとも１つの本発明のジポリマー・タンパク質コンジュゲートを含む。混合物中での２つのジポリマー・タンパク質コンジュゲートの比率を選択するために２つのジポリマー・タンパク質コンジュゲートの混合物を調製すると有利な場合がある。更に、望ましい場合は、様々な数のポリマー部分が結合した様々なタンパク質の混合物を調製し、この混合物を、本発明のジポリマー・タンパク質コンジュゲートと組み合わせて、本発明のジポリマー・タンパク質コンジュゲートを所定の割合で有する混合物を生成させてもよい。   As already mentioned above, the pharmaceutical preparation according to the invention comprises at least one dipolymer protein conjugate according to the invention. It may be advantageous to prepare a mixture of two dipolymer protein conjugates in order to select the ratio of the two dipolymer protein conjugates in the mixture. In addition, if desired, a mixture of different proteins with different numbers of polymer moieties attached is prepared and this mixture is combined with the dipolymer-protein conjugate of the present invention to provide the dipolymer-protein conjugate of the present invention. A mixture having a ratio of

さらに好ましい実施形態によれば、本発明の調製物は、α−アミノ基（Ｎ末端基）およびリジン１７のｅ−アミノ基がポリエチレングリコール部分と結合したＧ−ＣＳＦ、ならびにＮ末端アミノ基およびリジン３５のｅ−アミノ基がポリエチレングリコール部分と結合したＧ−ＣＳＦから成る群から選択された、アイソフォームまたはジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームとも呼ばれる少なくとも１つのジポリエチレングリコール−Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートを含む。ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートのアイソフォームは、該タンパク質中に３個以上のＰＥＧ結合部位、例えばアミノ基の窒素原子が３個以上ある場合に生じうる。いずれのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームも、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームの混合物と比べて同じ生物活性を示す。   According to a further preferred embodiment, the preparation according to the invention comprises an α-amino group (N-terminal group) and G-CSF in which the e-amino group of lysine 17 is bound to a polyethylene glycol moiety, and an N-terminal amino group and lysine. At least one dipolyethylene glycol-G-CSF conjugate, also called isoform or diPEGylated G-CSF isoform, selected from the group consisting of G-CSF with 35 e-amino groups attached to a polyethylene glycol moiety Including. An isoform of a diPEGylated protein conjugate can occur when there are more than two PEG binding sites in the protein, eg, more than two nitrogen atoms of an amino group. Both diPEGylated G-CSF isoforms show the same biological activity compared to a mixture of diPEGylated G-CSF isoforms.

本発明の別の実施形態では、指定のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート調製物は、上述のような２つのアイソフォーム、例えば、Ｎ末端基とリジン１７のｅ−アミノ基とにポリエチレングリコール部分を備えたアイソフォーム（以下、Ｎ末端基＋リジン１７とも呼ぶ）、ならびにＮ末端基とリジン３５のｅ−アミノ基とにポリエチレングリコール部分を備えたアイソフォーム（以下、Ｎ末端基＋リジン３５とも呼ぶ）を、任意の所定の化学量論比、例えば０．１〜１０、または０．５〜２、または０．７５〜１．３３、あるいは約１の比で含みうる。   In another embodiment of the present invention, the designated diPEGylated G-CSF conjugate preparation comprises a polyethylene glycol moiety in two isoforms as described above, eg, the N-terminal group and the e-amino group of lysine 17. (Hereinafter also referred to as N-terminal group + lysine 17), and isoforms having a polyethylene glycol moiety in the N-terminal group and the e-amino group of lysine 35 (hereinafter also referred to as N-terminal group + lysine 35). May be included in any given stoichiometric ratio, such as a ratio of 0.1 to 10, or 0.5 to 2, or 0.75 to 1.33, or about 1.

以下に示す実施例で実証するように、上述のような２つのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームの所定の混合物［（Ｎ末端基＋リジン１７）／（Ｎ末端基＋リジン３５）の混合比が例えば約０．７６：１のもの］で構成される本発明の所定の生成物または調製物は、モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）として市販）の生理活性に匹敵する生理活性を有し、かつ非修飾型Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ）として市販）より高い生理活性すらも有する。更に、上述のような２つのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームは、別の実施例において示すように同等の生理活性を有する。したがって、上述のような２つのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームの各々が、モノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの生理活性に匹敵し、かつ非修飾型Ｇ−ＣＳＦの生理活性よりさらに高い生理活性を有する。この
ことは、（ｉ）構造研究から（アリトミ（Aritomi ）ら、Nature、１９９９年、第４０１巻、ｐ．７１３−７１７）、および（ｉｉ）ヤング（Young ）ら記載のアラニンスキャニング突然変異誘発実験から（Protein Science 、１９９７年、第６巻、ｐ．１２２８−１２３６）推測可能な、リジン１７の修飾を含むＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームの生物活性への悪影響を仮定する仮説とは対照的である。 As demonstrated in the examples shown below, a given mixture of two diPEGylated G-CSF isoforms as described above [(N-terminal group + lysine 17) / (N-terminal group + lysine 35) mixing ratio] Certain products or preparations of the invention composed of, for example, about 0.76: 1] have a physiological activity comparable to that of monoPEGylated G-CSF (commercially available as Neulasta®). And even higher bioactivity than unmodified G-CSF (commercially available as Neupogen®). Furthermore, the two diPEGylated G-CSF isoforms as described above have equivalent bioactivity as shown in another example. Therefore, each of the two diPEGylated G-CSF isoforms as described above is comparable to that of monoPEGylated G-CSF and has a higher physiological activity than that of unmodified G-CSF. . This is because (i) from structural studies (Aritomi et al., Nature, 1999, 401, p. 713-717), and (ii) alanine scanning mutagenesis experiments described by Young et al. (Protein Science, 1997, Vol. 6, p. 1228-1236) in contrast to the hypothesis hypothesized to have an adverse effect on the biological activity of a PEGylated G-CSF isoform containing a modification of lysine 17. is there.

更に、異なる分子量（すなわち１２ｋＤａおよび２０ｋＤａ）を有するＰＥＧ分子が結合しているジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームが、同等の生物活性を有することが示された。両アイソフォームの生物活性はモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの生物活性に匹敵する。しかしながら、２０ｋＤａのＰＥＧが結合したタンパク質は、１２ｋＤａのＰＥＧが結合したタンパク質に比べて白血球数および好中球数がわずかに高く、応答性が維持されている。   Furthermore, diPEGylated G-CSF isoforms to which PEG molecules with different molecular weights (ie 12 kDa and 20 kDa) are attached have been shown to have comparable biological activity. The biological activity of both isoforms is comparable to that of monoPEGylated G-CSF. However, the protein with 20 kDa PEG attached has a slightly higher white blood cell count and neutrophil count than the protein with 12 kDa PEG attached, and the responsiveness is maintained.

別の態様によれば、本発明は、上述のような少なくとも１つのジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートを、多重ＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートとともに混合して含む、ＰＥＧタンパク質コンジュゲートの混合医薬調製物であって、前記ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの割合が予め指定されていることを特徴とする医薬混合調製物を提供する。本発明の状況において、用語「多重ＰＥＧ化タンパク質コンジュゲート」とは、１タンパク質分子当たり３以上のＰＥＧ部分を有するタンパク質コンジュゲートを意味する。混合医薬調製物中の前記少なくとも１つのジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの割合は、１％〜９９％、好ましくは５０％〜９９％、より好ましくは６０、７０、８０または９０％〜９９％、ならびに最も好ましくは９２、９４、９６、９８〜９９％の範囲にある。   According to another aspect, the present invention is a mixed pharmaceutical preparation of PEG protein conjugates comprising at least one diPEGylated protein conjugate as described above mixed with multiple PEGylated protein conjugates. Provided is a pharmaceutical mixture preparation, characterized in that the proportion of the diPEGylated protein conjugate is specified in advance. In the context of the present invention, the term “multiple PEGylated protein conjugate” means a protein conjugate having 3 or more PEG moieties per protein molecule. The proportion of the at least one diPEGylated protein conjugate in the mixed pharmaceutical preparation is 1% to 99%, preferably 50% to 99%, more preferably 60, 70, 80 or 90% to 99%, and Most preferably, it is in the range of 92, 94, 96, 98 to 99%.

本発明の別の態様によれば、ポリエチレングリコール・タンパク質コンジュゲートのようなポリマー・タンパク質コンジュゲートの調製方法であって、還元的アルキル化条件の下で、ジＰＥＧ化タンパク質のようなジポリマー・タンパク質コンジュゲートを主として生成する方法が提供される。好ましくは、ＰＥＧ試薬のようなポリマー試薬をタンパク質とともにこのようにジポリマー・タンパク質コンジュゲートへと変換することは、適切な反応時間、適切なタンパク質濃度、ポリマーとタンパク質との適切なモル比および適切な反応温度のような、ジポリマー・タンパク質コンジュゲートが豊富に得られる反応条件を選択することにより達成される。ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートを主として調製するための方法を提供することが特に好ましい。   According to another aspect of the present invention, a method for preparing a polymer protein conjugate, such as a polyethylene glycol protein conjugate, comprising a dipolymer protein, such as a diPEGylated protein, under reductive alkylation conditions. Methods are provided for primarily producing conjugates. Preferably, converting a polymer reagent, such as a PEG reagent, with a protein in this way into a dipolymer-protein conjugate is suitable reaction time, suitable protein concentration, suitable molar ratio of polymer to protein and suitable This is accomplished by selecting reaction conditions such as reaction temperature that will yield abundant dipolymer-protein conjugates. It is particularly preferred to provide a method for primarily preparing diPEGylated protein conjugates.

本発明の状況において、ポリマーをタンパク質とともに選択的または優先的または主としてジポリマー・タンパク質コンジュゲートへと変換すること、あるいはジポリマー・タンパク質コンジュゲートを選択的または優先的または主として生産すること、あるいはタンパク質のアミノ基の２つの窒素原子が各々１つのポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲートを選択的または優先的または主として調製することは、本発明の方法による反応混合生成物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、そして最も好ましくは少なくとも４０％または少なくとも４５％、あるいはさらに少なくとも５０％または少なくとも６０％が、本発明のジポリマー・タンパク質コンジュゲートであることを意味する。本発明の状況において、反応混合物中のジポリマー・タンパク質コンジュゲートの割合（％）は、ＨＰＬＣシステムを使用した陽イオン交換クロマトグラフィーおよび質量分析によって決定された反応混合物中のすべての同定された分子種または生成物の量に関する少なくとも１つのジポリマー・タンパク質コンジュゲートの量である。   In the context of the present invention, the polymer is selectively or preferentially or predominantly converted into a dipolymer / protein conjugate with the protein, or the dipolymer / protein conjugate is selectively or preferentially or predominantly produced, or the amino acid of the protein. Selectively or preferentially or predominantly preparing a polymer-protein conjugate in which the two nitrogen atoms of the group are each bound to one polymer unit is preferably at least 20% of the reaction mixture product according to the method of the invention, preferably Is at least 25%, more preferably at least 30%, and most preferably at least 40% or at least 45%, or even at least 50% or at least 60% of the dipolymer protein conjugates of the present invention Means that a. In the context of the present invention, the percentage of dipolymer protein conjugate in the reaction mixture is determined for all identified molecular species in the reaction mixture as determined by cation exchange chromatography and mass spectrometry using an HPLC system. Or the amount of at least one dipolymer protein conjugate relative to the amount of product.

本発明の状況において、ＰＥＧをタンパク質とともに選択的または優先的または主としてジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲートへと変換すること、あるいはジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲートを選択的または優先的または主として生産すること、ある
いはタンパク質のアミノ基の２つの窒素原子が各々１つのポリエチレングリコール単位と結合しているポリエチレングリコール・タンパク質コンジュゲートを選択的または優先的または主として調製することは、本発明の方法による反応混合生成物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、そして最も好ましくは少なくとも４０％または少なくとも４５％、あるいはさらに少なくとも５０％または少なくとも６０％が、本発明のジＰＥＧ化されたＰＥＧタンパク質コンジュゲートであることを意味する。本発明の状況において、反応混合物中のジＰＥＧ化されたＰＥＧタンパク質コンジュゲートの割合（％）は、ＨＰＬＣシステムを使用した陽イオン交換クロマトグラフィーおよび質量分析によって決定された反応混合物中のすべての同定された分子種または生成物の量に関する少なくとも１つのジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲートの量である（表１も参照のこと）。 In the context of the present invention, selectively or preferentially or predominantly producing diPEGylated PEG protein conjugates with the protein or selectively or preferentially or predominantly producing diPEGylated PEG protein conjugates; Alternatively, selectively or preferentially or primarily preparing a polyethylene glycol protein conjugate in which two nitrogen atoms of the amino group of the protein are each bound to a polyethylene glycol unit is a reaction mixture product according to the method of the present invention. At least 20%, preferably at least 25%, more preferably at least 30%, and most preferably at least 40% or at least 45%, or even at least 50% or at least 60% of the di Means that the EG of been PEG protein conjugates. In the context of the present invention, the percentage of diPEGylated PEG protein conjugate in the reaction mixture is the total identification in the reaction mixture as determined by cation exchange chromatography and mass spectrometry using an HPLC system. The amount of at least one diPEGylated PEG protein conjugate with respect to the amount of molecular species or product produced (see also Table 1).

好ましくは、本発明の２つのプロセス・サイクルの各々の反応時間は、約６ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは１２ｈ〜３２ｈである。他の好ましい反応時間は、約７ｈ、約８ｈ、約９ｈ、約１０ｈ、約１１ｈ、約１３ｈ、約１４ｈ、約１５ｈ、約１６ｈ、約１７ｈ、約１８ｈ、約１９ｈ、約２０ｈ、約２１ｈ、約２２ｈ、約２３ｈ、約２４ｈ、約２５ｈ、約２６ｈ、約２７ｈ、約２９ｈ、約３０ｈ、約３１ｈ、約３３ｈ、約３４ｈあるいは約３５ｈである。しかしながら、当業者であれば、反応時間は反応温度のような他のプロセス・パラメータと相互関係を有するという事実を承知している。この点では、シャモフ（Chamov）ら（Bioconjugate Chemistry（１９９４）第５巻（２）、ｐ．１３３−１４０）により、反応温度を増加させると反応時間が少なくとも２分の１に減少することが実証されている。さらに、非グリコシル化タンパク質については、反応時間はタンパク質に対するポリマーのモル比にも依存することが見出されている。例えば、所与のタンパク質濃度に対してポリマー量を２倍にすると、ジポリマー・タンパク質コンジュゲートの形成反応時間を２分の１に減少させることができる。   Preferably, the reaction time for each of the two process cycles of the present invention is from about 6 h to about 48 h, more preferably from 12 h to 32 h. Other preferred reaction times are about 7h, about 8h, about 9h, about 10h, about 11h, about 13h, about 14h, about 15h, about 16h, about 17h, about 18h, about 19h, about 20h, about 21h, about 22h, about 23h, about 24h, about 25h, about 26h, about 27h, about 29h, about 30h, about 31h, about 33h, about 34h or about 35h. However, those skilled in the art are aware of the fact that reaction time correlates with other process parameters such as reaction temperature. In this regard, Chamov et al. (Bioconjugate Chemistry (1994) vol. 5 (2), p. 133-140) demonstrated that increasing the reaction temperature reduces the reaction time by at least a factor of two. Has been. Furthermore, for non-glycosylated proteins it has been found that the reaction time also depends on the molar ratio of polymer to protein. For example, doubling the amount of polymer for a given protein concentration can reduce the formation reaction time of the dipolymer-protein conjugate by a factor of two.

反応は、２℃〜５０℃の温度で、より好ましくは２℃〜８℃の温度で、最も好ましくは約４℃の温度で行なわれることが好ましい。既に上に述べたように、特定温度の選択は反応時間に影響する場合があり、反応時間はタンパク質のアミノ基の２つの窒素原子がアミン結合によってポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲートが優先的に調製されるように選択されるべきである。特に、反応時間は好ましくは約６ｈ〜約４８ｈであるが、反応温度を上昇させた場合には６ｈ未満、例えば１ｈ、２ｈ、４ｈ、または５ｈであってもよい。例えば、反応が１５℃〜２５℃、好ましくは１８℃〜２４℃、および最も好ましくは２２℃の温度で行なわれる場合、反応時間は少なくとも６ｈ、好ましくは６ｈ〜１２ｈまたは８ｈ〜１０ｈであり、反応が５℃で行なわれる場合は少なくとも１８ｈである。   The reaction is preferably carried out at a temperature of 2 ° C to 50 ° C, more preferably at a temperature of 2 ° C to 8 ° C, most preferably at a temperature of about 4 ° C. As already mentioned above, the selection of a specific temperature may affect the reaction time, which is a polymer-protein conjugate in which the two nitrogen atoms of the protein amino group are linked to the polymer unit by an amine bond. Should be selected to be preferentially prepared. In particular, the reaction time is preferably from about 6 h to about 48 h, but may be less than 6 h, for example 1 h, 2 h, 4 h, or 5 h when the reaction temperature is increased. For example, if the reaction is carried out at a temperature of 15 ° C. to 25 ° C., preferably 18 ° C. to 24 ° C., and most preferably 22 ° C., the reaction time is at least 6 h, preferably 6 h to 12 h or 8 h to 10 h. Is at least 18 h when carried out at 5 ° C.

さらに、タンパク質濃度が０．５〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは３〜７ｍｇ／ｍｌで反応が行なわれることが好ましい。
さらに好ましい本発明の実施形態によれば、反応はタンパク質とポリマーとのモル比を１：１〜１：４００、好ましくは１：５〜１：５０、最も好ましくは１：１５〜１：３０として行われる。本発明の状況においては、タンパク質とポリマーとのモル比は、反応試料中の所与のタンパク質濃度におけるタンパク質のモル数とポリマーのモル数との間の比を意味する。タンパク質とポリマーとのモル比に基づいて、タンパク質内のアミノ基とポリマー分子との化学量論比を推定することが可能である。本発明の状況においては、アミノ基とポリマー分子との化学量論比は、タンパク質分子の数に対するタンパク質内のα−およびε−アミノ基の数を意味する。 Furthermore, the reaction is preferably carried out at a protein concentration of 0.5 to 100 mg / ml, more preferably 1 to 10 mg / ml, most preferably 3 to 7 mg / ml.
According to a further preferred embodiment of the invention, the reaction is carried out with a protein to polymer molar ratio of 1: 1 to 1: 400, preferably 1: 5 to 1:50, most preferably 1:15 to 1:30. Done. In the context of the present invention, the molar ratio of protein to polymer means the ratio between the number of moles of protein and the number of moles of polymer at a given protein concentration in the reaction sample. Based on the molar ratio of protein to polymer, it is possible to estimate the stoichiometric ratio of amino groups in the protein to polymer molecules. In the context of the present invention, the stoichiometric ratio of amino groups to polymer molecules means the number of α- and ε-amino groups in the protein relative to the number of protein molecules.

非グリコシル化タンパク質については、アミノ基の数に対して、例えばインターフェロンα２ａの場合には少なくとも１．２５倍過剰、ＧＣＳＦの場合には２倍過剰の数のポリ
マー分子が、ポリマー基が２つ結合したタンパク質を主に生産するのに必要であり、一方グリコシル化タンパク質については、ポリマー分子の数に対してアミノ基の数が過剰であってもジポリマー・タンパク質コンジュゲートが主として生産される、ということが見出された。 For non-glycosylated proteins, for example, at least 1.25 fold excess of the number of amino groups in the case of interferon α2a and 2 fold excess in the case of GCSF, two polymer groups attached Is necessary for the production of the primary protein, whereas diglycoprotein conjugates are mainly produced for glycosylated proteins even if the number of amino groups is excessive relative to the number of polymer molecules. Was found.

したがって、非グリコシル化タンパク質については、ポリマー分子の数に対するアミノ基の数の化学量論比が、１：１〜１：８０、好ましくは１：１．２５〜１：８０、より好ましくは１：１．２５〜１：５０、さらに一層好ましくは１：１．２５〜１：３０、最も好ましくは１：２〜１：１０の範囲にあることが好ましい。   Thus, for non-glycosylated proteins, the stoichiometric ratio of the number of amino groups to the number of polymer molecules is 1: 1 to 1:80, preferably 1: 1.25 to 1:80, more preferably 1: It is preferably in the range of 1.25 to 1:50, more preferably 1: 1.25 to 1:30, most preferably 1: 2 to 1:10.

グリコシル化タンパク質については、ポリマー分子の数に対するタンパク質内のアミノ基の数の化学量論比が、１０：１〜１：５０、好ましくは１：０．３〜１：５０、より好ましくは２：１〜１：２５、さらに一層好ましくは１：０．８〜１：１０の範囲にあることが好ましい。最も好ましくは、化学量論比は、１０：１、５：１、１：０．３、１：０．４、２：１、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９あるいは１：１である。他の好ましい化学量論比は、１：２〜１：１０または１：２〜１：５である。   For glycosylated proteins, the stoichiometric ratio of the number of amino groups in the protein to the number of polymer molecules is 10: 1 to 1:50, preferably 1: 0.3 to 1:50, more preferably 2: It is preferably in the range of 1 to 1:25, more preferably 1: 0.8 to 1:10. Most preferably, the stoichiometric ratio is 10: 1, 5: 1, 1: 0.3, 1: 0.4, 2: 1, 1: 0.6, 1: 0.7, 1: 0. 8, 1: 0.9 or 1: 1. Other preferred stoichiometric ratios are 1: 2 to 1:10 or 1: 2 to 1: 5.

本発明の一層好ましい実施形態では、反応時間は約６ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは１２ｈ〜３２ｈである。他の好ましい反応時間は、約７ｈ、約８ｈ、約９ｈ、約１０ｈ、約１１ｈ、約１３ｈ、約１４ｈ、約１５ｈ、約１６ｈ、約１７ｈ、約１８ｈ、約１９ｈ、約２０ｈ、約２１ｈ、約２２ｈ、約２３ｈ、約２４ｈ、約２５ｈ、約２６ｈ、約２７ｈ、約２９ｈ、約３０ｈ、約３１ｈ、約３３ｈ、約３４ｈあるいは約３５ｈであり、タンパク質とポリマーとのモル比は１：１〜１：４００、好ましくは１：５〜１：５０、最も好ましくは１：１５〜１：３０である。   In a more preferred embodiment of the invention, the reaction time is about 6 h to about 48 h, more preferably 12 h to 32 h. Other preferred reaction times are about 7h, about 8h, about 9h, about 10h, about 11h, about 13h, about 14h, about 15h, about 16h, about 17h, about 18h, about 19h, about 20h, about 21h, about 22h, about 23h, about 24h, about 25h, about 26h, about 27h, about 29h, about 30h, about 31h, about 33h, about 34h or about 35h, and the molar ratio of protein to polymer is 1: 1 to 1 : 400, preferably 1: 5 to 1:50, most preferably 1:15 to 1:30.

本発明の一層好ましい実施形態では、反応時間は約６ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは１２ｈ〜３２ｈである。他の好ましい反応時間は、約７ｈ、約８ｈ、約９ｈ、約１０ｈ、約１１ｈ、約１３ｈ、約１４ｈ、約１５ｈ、約１６ｈ、約１７ｈ、約１８ｈ、約１９ｈ、約２０ｈ、約２１ｈ、約２２ｈ、約２３ｈ、約２４ｈ、約２５ｈ、約２６ｈ、約２７ｈ、約２９ｈ、約３０ｈ、約３１ｈ、約３３ｈ、約３４ｈあるいは約３５ｈであり、アミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、非グリコシル化タンパク質について、１：１〜１：８０、好ましくは１：１．２５〜１：８０、より好ましくは１：１．２５〜１：５０、さらに一層好ましくは１：１．２５〜１：３０、最も好ましくは１：２〜１：１０の範囲にあることが好ましい。   In a more preferred embodiment of the invention, the reaction time is about 6 h to about 48 h, more preferably 12 h to 32 h. Other preferred reaction times are about 7h, about 8h, about 9h, about 10h, about 11h, about 13h, about 14h, about 15h, about 16h, about 17h, about 18h, about 19h, about 20h, about 21h, about 22h, about 23h, about 24h, about 25h, about 26h, about 27h, about 29h, about 30h, about 31h, about 33h, about 34h or about 35h, the stoichiometric amount of the number of amino groups and the number of polymer molecules The ratio is 1: 1 to 1:80, preferably 1: 1.25 to 1:80, more preferably 1: 1.25 to 1:50, even more preferably 1: 1 for non-glycosylated proteins. It is preferably in the range of 25 to 1:30, most preferably 1: 2 to 1:10.

本発明の一層好ましい実施形態では、反応時間は約６ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは１２ｈ〜３２ｈである。他の好ましい反応時間は、約７ｈ、約８ｈ、約９ｈ、約１０ｈ、約１１ｈ、約１３ｈ、約１４ｈ、約１５ｈ、約１６ｈ、約１７ｈ、約１８ｈ、約１９ｈ、約２０ｈ、約２１ｈ、約２２ｈ、約２３ｈ、約２４ｈ、約２５ｈ、約２６ｈ、約２７ｈ、約２９ｈ、約３０ｈ、約３１ｈ、約３３ｈ、約３４ｈあるいは約３５ｈであり、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、グリコシル化タンパク質について、１０：１〜１：５０、好ましくは１：０．３〜１：５０、より好ましくは２：１〜１：２５、さらに一層好ましくは１：０．８〜１：１０の範囲にあり、最も好ましくは、化学量論比は、１０：１、５：１、１：０．３、１：０．４、２：１、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９あるいは１：１である。   In a more preferred embodiment of the invention, the reaction time is about 6 h to about 48 h, more preferably 12 h to 32 h. Other preferred reaction times are about 7h, about 8h, about 9h, about 10h, about 11h, about 13h, about 14h, about 15h, about 16h, about 17h, about 18h, about 19h, about 20h, about 21h, about 22h, about 23h, about 24h, about 25h, about 26h, about 27h, about 29h, about 30h, about 31h, about 33h, about 34h or about 35h, the number of amino groups in the protein and the number of polymer molecules The stoichiometric ratio is 10: 1 to 1:50, preferably 1: 0.3 to 1:50, more preferably 2: 1 to 1:25, even more preferably 1: 0 for glycosylated proteins. In the range of 8 to 1:10, most preferably the stoichiometric ratio is 10: 1, 5: 1, 1: 0.3, 1: 0.4, 2: 1, 1: 0.6. 1: 0.7, 1: 0.8, 1: 0.9 or 1: 1 .

本発明の一層好ましい実施形態では、反応時間は約６ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは１２ｈ〜３２ｈである。他の好ましい反応時間は、約７ｈ、約８ｈ、約９ｈ、約１０ｈ、約１１ｈ、約１３ｈ、約１４ｈ、約１５ｈ、約１６ｈ、約１７ｈ、約１８ｈ、約１９ｈ、約２０ｈ、約２１ｈ、約２２ｈ、約２３ｈ、約２４ｈ、約２５ｈ、約２６ｈ、約２７ｈ、約
２９ｈ、約３０ｈ、約３１ｈ、約３３ｈ、約３４ｈあるいは約３５ｈであり、反応は、２℃〜５０℃の温度、より好ましくは２℃〜８℃、最も好ましくは約４℃の温度で行なわれ、タンパク質とポリマーとのモル比は１：１〜１：４００、好ましくは１：５〜１：５０、最も好ましくは１：１５〜１：３０である。 In a more preferred embodiment of the invention, the reaction time is about 6 h to about 48 h, more preferably 12 h to 32 h. Other preferred reaction times are about 7h, about 8h, about 9h, about 10h, about 11h, about 13h, about 14h, about 15h, about 16h, about 17h, about 18h, about 19h, about 20h, about 21h, about 22h, about 23h, about 24h, about 25h, about 26h, about 27h, about 29h, about 30h, about 31h, about 33h, about 34h or about 35h, and the reaction is more preferably at a temperature of 2 ° C to 50 ° C. Is carried out at a temperature of 2 ° C. to 8 ° C., most preferably about 4 ° C., and the molar ratio of protein to polymer is 1: 1 to 1: 400, preferably 1: 5 to 1:50, most preferably 1: 15 to 1:30.

本発明の一層好ましい実施形態では、反応時間は約６ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは１２ｈ〜３２ｈである。他の好ましい反応時間は、約７ｈ、約８ｈ、約９ｈ、約１０ｈ、約１１ｈ、約１３ｈ、約１４ｈ、約１５ｈ、約１６ｈ、約１７ｈ、約１８ｈ、約１９ｈ、約２０ｈ、約２１ｈ、約２２ｈ、約２３ｈ、約２４ｈ、約２５ｈ、約２６ｈ、約２７ｈ、約２９ｈ、約３０ｈ、約３１ｈ、約３３ｈ、約３４ｈあるいは約３５ｈであり、反応は、２℃〜５０℃の温度、より好ましくは２℃〜８℃の温度、最も好ましくは約４℃の温度で行なわれ、アミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、非グリコシル化タンパク質について、１：１〜１：８０、好ましくは１：１．２５〜１：８０、より好ましくは１：１．２５〜１：５０、さらに一層好ましくは１：１．２５〜１：３０、最も好ましくは１：２〜１：１０の範囲にある。   In a more preferred embodiment of the invention, the reaction time is about 6 h to about 48 h, more preferably 12 h to 32 h. Other preferred reaction times are about 7h, about 8h, about 9h, about 10h, about 11h, about 13h, about 14h, about 15h, about 16h, about 17h, about 18h, about 19h, about 20h, about 21h, about 22h, about 23h, about 24h, about 25h, about 26h, about 27h, about 29h, about 30h, about 31h, about 33h, about 34h or about 35h, and the reaction is more preferably at a temperature of 2 ° C to 50 ° C. Is carried out at a temperature between 2 ° C. and 8 ° C., most preferably at a temperature of about 4 ° C., and the stoichiometric ratio between the number of amino groups and the number of polymer molecules is 1: 1 to 1: 80, preferably 1: 1.25 to 1:80, more preferably 1: 1.25 to 1:50, even more preferably 1: 1.25 to 1:30, most preferably 1: 2 to 1: It is in the range of 10.

本発明の一層好ましい実施形態では、反応時間は約６ｈ〜約４８ｈ、より好ましくは１２ｈ〜３２ｈである。他の好ましい反応時間は、約７ｈ、約８ｈ、約９ｈ、約１０ｈ、約１１ｈ、約１３ｈ、約１４ｈ、約１５ｈ、約１６ｈ、約１７ｈ、約１８ｈ、約１９ｈ、約２０ｈ、約２１ｈ、約２２ｈ、約２３ｈ、約２４ｈ、約２５ｈ、約２６ｈ、約２７ｈ、約２９ｈ、約３０ｈ、約３１ｈ、約３３ｈ、約３４ｈあるいは約３５ｈであり、反応は、２℃〜５０℃の温度、より好ましくは２℃〜８℃の温度、最も好ましくは約４℃の温度で行なわれ、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、グリコシル化タンパク質について、１０：１〜１：５０、好ましくは１：０．３〜１：５０、より好ましくは２：１〜１：２５、さらに一層好ましくは１：０．８〜１：１０の範囲にあり、最も好ましくは、化学量論比は、１０：１、５：１、１：０．３、１：０．４、２：１、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９あるいは１：１である。   In a more preferred embodiment of the invention, the reaction time is about 6 h to about 48 h, more preferably 12 h to 32 h. Other preferred reaction times are about 7h, about 8h, about 9h, about 10h, about 11h, about 13h, about 14h, about 15h, about 16h, about 17h, about 18h, about 19h, about 20h, about 21h, about 22h, about 23h, about 24h, about 25h, about 26h, about 27h, about 29h, about 30h, about 31h, about 33h, about 34h or about 35h, and the reaction is more preferably at a temperature of 2 ° C to 50 ° C. Is carried out at a temperature between 2 ° C. and 8 ° C., most preferably at a temperature of about 4 ° C., and the stoichiometric ratio between the number of amino groups in the protein and the number of polymer molecules is 10: 1 to 10 for glycosylated proteins. 1:50, preferably 1: 0.3 to 1:50, more preferably 2: 1 to 1:25, even more preferably 1: 0.8 to 1:10, most preferably chemical. The stoichiometric ratio is 10: 1, 5: 1 1: 0.3, 1: 0.4,2: 1,1: 0.6,1: 0.7, 1: 0.8,: 0.9 or 1: 1.

タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合、反応時間は好ましくは１２ｈ〜２４ｈであり、反応温度は好ましくは約４℃であり、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、好ましくは１：２〜１：１０である。   When the protein is G-CSF, the reaction time is preferably 12h-24h, the reaction temperature is preferably about 4 ° C, and the stoichiometric ratio between the number of amino groups in the protein and the number of polymer molecules is The ratio is preferably 1: 2 to 1:10.

タンパク質がインターフェロンα２ａである場合、反応時間は好ましくは１２ｈ〜２４ｈであり、反応温度は好ましくは約４℃であり、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、好ましくは１：１〜１：１０の範囲にあり、最も好ましくは１：１．２５である。   When the protein is interferon α2a, the reaction time is preferably 12h-24h, the reaction temperature is preferably about 4 ° C., and the stoichiometric ratio between the number of amino groups in the protein and the number of polymer molecules is Preferably it is in the range of 1: 1 to 1:10, most preferably 1: 1.25.

タンパク質がエリスロポエチンである場合、反応時間は好ましくは１２ｈ〜２４ｈであり、反応温度は好ましくは約４℃であり、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、好ましくは１：０．５〜１：８の範囲にあり、最も好ましくは１：０．６２５である。   When the protein is erythropoietin, the reaction time is preferably 12h-24h, the reaction temperature is preferably about 4 ° C, and the stoichiometric ratio between the number of amino groups in the protein and the number of polymer molecules is preferably Is in the range of 1: 0.5 to 1: 8, most preferably 1: 0.625.

タンパク質がｈＧＨである場合、反応時間は好ましくは１２ｈ〜２４ｈであり、反応温度は好ましくは約４℃であり、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、好ましくは１：１〜１：８の範囲にあり、最も好ましくは１：１．６である。   When the protein is hGH, the reaction time is preferably 12h-24h, the reaction temperature is preferably about 4 ° C, and the stoichiometric ratio between the number of amino groups in the protein and the number of polymer molecules is preferably Is in the range of 1: 1 to 1: 8, most preferably 1: 1.6.

還元的アルキル化において使用される還元剤は、ＮａＣＮＢＨ４またはＮａＢＨ４から選択されることが好ましいが、これらに限定はされない。
さらに、反応は、特にタンパク質がＧ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ｈＧＨまたはインターフェロンの生物活性を有するタンパク質である場合には、中性付近、例えば、ｐＨ６
〜８、より好ましくはｐＨ６．９〜７．８、最も好ましくはｐＨ７．２〜７．５で行なわれることが好ましい。他のタンパク質については、ｐＨ４．５〜７．５または５．０〜６．５または約５．５からｐＨを選択することが望ましい場合がある。 The reducing agent used in the reductive alkylation is preferably selected from, but not limited to, NaCNBH 4 or NaBH 4 .
In addition, the reaction may be near neutral, eg, pH 6 when the protein is a protein with G-CSF, erythropoietin, hGH or interferon biological activity.
It is preferably carried out at ˜8, more preferably at pH 6.9 to 7.8, most preferably at pH 7.2 to 7.5. For other proteins, it may be desirable to select a pH from pH 4.5-7.5 or 5.0-6.5 or about 5.5.

好ましい範囲のｐＨを維持するために、反応を、バッファー（例えば、リン酸塩、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳおよび／またはｂｉｃｉｎｅバッファーから選択可能）の存在下で行うとよい。   In order to maintain a preferred range of pH, the reaction may be carried out in the presence of a buffer (selectable from, for example, phosphate, acetate, HEPES, MES and / or bicine buffer).

本発明の方法において使用されるＰＥＧ試薬は一般に、次式：
［Ｒ−Ｌ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ］ｙ−Ｌ２−（ＣＨ２−）ｍ−１−ＣＨＯ（式中、Ｒは、Ｈ、低級アルキル、アリールまたは任意の適切な保護基であり；ｎは、ポリエチレングリコール部分の中のエチレンオキシド残基の数を表す整数であり；ｍはメチレン基の数を表わす整数であり；Ｌ１は、Ｏ、Ｎ、Ｓおよび分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分のうち少なくともいずれかであって存在していても存在しなくてもよく；Ｌ２は、分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分であって存在していても存在しなくてもよく；ｙは整数であって、ただしＬ２が存在しない場合にはｙは１であり、Ｌ２が存在する場合にはｙは少なくとも１である）を有する試薬である。 The PEG reagents used in the methods of the invention generally have the following formula:
[R-L 1 - (CH 2 -CH 2 -O) n] y -L 2 - (CH 2 -) m-1 -CHO ( wherein, R, H, lower alkyl, aryl or any suitable A protecting group; n is an integer representing the number of ethylene oxide residues in the polyethylene glycol moiety; m is an integer representing the number of methylene groups; L 1 is O, N, S and branched or may be absent be present be at least one of the non-branched linker moiety; L 2 is not present or is present in a branched or unbranched linker moiety Y is an integer, provided that y is 1 when L 2 is not present and y is at least 1 when L 2 is present.

好ましくは、Ｒ、ｍ、ｎ、Ｌ１、Ｌ２およびｙは、本発明のポリマー・タンパク質コンジュゲートについて上記されているように定義される。
さらに、該ポリマー試薬がＰＥＧアルデヒド、より好ましくはＰＥＧアセトアルデヒド、最も好ましくはメトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒド（ｍＰＥＧアセトアルデヒド）であることが好ましい。 Preferably R, m, n, L 1 , L 2 and y are defined as described above for the polymer-protein conjugates of the present invention.
Furthermore, the polymer reagent is preferably PEG aldehyde, more preferably PEG acetaldehyde, most preferably methoxypolyethylene glycol acetaldehyde (mPEG acetaldehyde).

タンパク質と反応させるための、単一のアルデヒド基を有するポリエチレングリコールは、対応するアセタールの形態で保存可能である。該ＰＥＧアセタール先駆物質は、結合しようとするタンパク質とともに変換させる前のどの時点で活性化してＰＥＧアルデヒド試薬としてもよいが、ただし活性化されたＰＥＧアルデヒドが本発明の方法によりタンパク質と結合するまで安定であることを条件とする。例えば、単一のアセトアルデヒド基を有するポリエチレングリコール試薬を得るためには、対応するポリエチレングリコールジエチルアセタールを活性化すればよい。   Polyethylene glycols with a single aldehyde group for reaction with proteins can be stored in the corresponding acetal form. The PEG acetal precursor may be activated at any time prior to conversion with the protein to be bound to form a PEG aldehyde reagent, but is stable until the activated PEG aldehyde is bound to the protein by the method of the present invention. On condition that For example, in order to obtain a polyethylene glycol reagent having a single acetaldehyde group, the corresponding polyethylene glycol diethyl acetal may be activated.

この問題に関連して、メトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒドのようなポリエチレングリコール・アセトアルデヒドの長期保存方法が提供され、該方法では、ポリエチレングリコール・アセトアルデヒドは窒素のような不活性雰囲気下で約−２０℃以下の温度で固体物質として保存される。この方法によれば、メトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒドのようなポリエチレングリコール・アセトアルデヒドを、少なくとも１か月、好ましくは少なくとも２か月、より好ましくは少なくとも３か月、最も好ましくは少なくとも４または６か月保存可能である。   In connection with this problem, a method for long-term storage of polyethylene glycol acetaldehyde, such as methoxypolyethylene glycol acetaldehyde, is provided, wherein the polyethylene glycol acetaldehyde is about −20 ° C. or less under an inert atmosphere such as nitrogen. Stored as a solid material at a temperature of According to this method, polyethylene glycol acetaldehyde, such as methoxypolyethylene glycol acetaldehyde, is stored for at least 1 month, preferably at least 2 months, more preferably at least 3 months, most preferably at least 4 or 6 months. Is possible.

本発明の方法の別の好ましい実施形態によれば、該方法は、分離ステップまたは精製ステップをさらに含み、該ステップは、ジポリマー・タンパク質コンジュゲート、好ましくはジＰＥＧ化ポリエチレングリコール・タンパク質コンジュゲートであって、タンパク質の２つの所定のアミノ基が各々１つのポリマー単位と結合しているコンジュゲートのプール（生成物プールとも呼ばれる）をもたらし、かつ、未反応タンパク質、未反応ポリマー試薬、生成物プールのジポリマー・コンジュゲート以外のジポリマー・タンパク質コンジュゲート・アイソフォーム、および／またはタンパク質の２未満もしくは３以上のアミノ基がポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲートを含有するプール（残余物プールとも呼ばれる）を生じさせる。   According to another preferred embodiment of the method of the invention, the method further comprises a separation step or a purification step, wherein the step is a dipolymer protein conjugate, preferably a diPEGylated polyethylene glycol protein conjugate. Resulting in a pool of conjugates (also called product pools) in which each of the two predetermined amino groups of the protein is bound to one polymer unit, and of unreacted protein, unreacted polymer reagent, product pool Pools containing dipolymer / protein conjugate isoforms other than dipolymer conjugates and / or polymer / protein conjugates in which less than 2 or more amino groups of the protein are bound to polymer units (also referred to as residual pools) be called) Cause.

この生成物プールおよび残余物プールを生成する分離ステップまたは精製ステップは、イオン交換クロマトグラフィーによって行われることが好ましい。
本発明の方法の化学反応および穏やかな反応条件により、本発明の別の方法（例えば本発明による別のジＰＥＧ化方法）についての望ましくない安定な反応生成物のフラクションを再利用することが可能となる。従って、別の好ましい実施形態によれば、残余物プールを再び本発明の方法に供する。例えば、ＰＥＧ試薬による変換において非ＰＥＧ化タンパク質のみを使用する代わりに、残余物プールを、還元的アルキル化条件の下で、単一のアルデヒド基（例えばアセトアルデヒド基）を有するポリエチレングリコール試薬と反応させる。このとき、反応時間、反応温度、モル比および／または化学量論比は、タンパク質のアミノ基の窒素原子２つが各々１つのポリエチレングリコール単位と結合しているポリエチレングリコール・タンパク質コンジュゲートが選択的に調製されるように選択する。反応時間、反応温度、モル比および化学量論比は、本発明の方法について上述したようにして選択される。 The separation or purification step that produces this product pool and residue pool is preferably performed by ion exchange chromatography.
The chemical reaction and mild reaction conditions of the process of the present invention allow reuse of the undesired stable reaction product fraction for another process of the present invention (eg, another diPEGylation process according to the present invention). It becomes. Thus, according to another preferred embodiment, the residual pool is again subjected to the method of the invention. For example, instead of using only non-PEGylated protein in the conversion with PEG reagent, the residual pool is reacted with a polyethylene glycol reagent having a single aldehyde group (eg, acetaldehyde group) under reductive alkylation conditions. . At this time, the reaction time, reaction temperature, molar ratio, and / or stoichiometric ratio are selectively determined by the polyethylene glycol / protein conjugate in which two nitrogen atoms of the amino group of the protein are each bonded to one polyethylene glycol unit. Choose to be prepared. Reaction time, reaction temperature, molar ratio and stoichiometric ratio are selected as described above for the process of the present invention.

この好ましい再利用ステップにより、本発明のジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲートのようなジポリマー・タンパク質コンジュゲートの収量を著しく増加させることが可能となる。特に、タンパク質のアミノ酸鎖の所定位置のアミノ基の窒素原子にＰＥＧ部分が結合しているジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲート・アイソフォームを得ることができる。   This preferred recycling step can significantly increase the yield of dipolymer protein conjugates such as the diPEGylated PEG protein conjugates of the present invention. In particular, a diPEGylated PEG protein conjugate isoform in which a PEG moiety is bonded to the nitrogen atom of the amino group at a predetermined position of the protein amino acid chain can be obtained.

本発明の状況において、ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートには、広義には、２つのポリエチレングリコール単位と結合し、該ポリエチレングリコール単位が両方とも各々タンパク質の１つのアミノ基と結合している、任意のタンパク質が含まれる。本発明のジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートは、タンパク質のアミノ基由来のアミンとポリエチレングリコール単位のエチレンオキシド残基の鎖との間にＣ２リンカーを有するジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲートを選択的に生じさせる還元的アルキル化条件の下で、ポリエチレン・アセトアルデヒド分子をタンパク質と反応させることにより得られることが好ましい。 In the context of the present invention, a diPEGylated protein conjugate is broadly bound to any polyethylene glycol unit that is bound to two polyethylene glycol units, both of which are each bound to one amino group of the protein. Contains protein. Di PEG protein conjugates of the present invention causes selective di PEG of PEG protein conjugates with C 2 linker between the chain of ethylene oxide residues in the amine and polyethylene glycol unit derived from the amino groups of the protein It is preferably obtained by reacting a polyethylene acetaldehyde molecule with a protein under reductive alkylation conditions.

本発明の特徴および利点は、さらなる好ましい実施形態についての以降の記載からより詳細に明らかとなろう。最良の形態を含むこれらの実施形態では、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮα２ａ、エリスロポエチンおよびヒト成長ホルモンがタンパク質として例証され、ＰＥＧがポリマー部分として例証される。しかしながらこのことは、上記タンパク質とＰＥＧとのジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲートが特に好ましいとはいっても、本発明を上記タンパク質とＰＥＧとのコンジュゲートに限定するものとして解釈すべきではない。   The features and advantages of the present invention will become more apparent from the following description of further preferred embodiments. In these embodiments, including the best mode, G-CSF, IFNα2a, erythropoietin and human growth hormone are illustrated as proteins and PEG is illustrated as a polymer moiety. However, this should not be construed as limiting the invention to conjugates of the protein and PEG, although diPEGylated PEG protein conjugates of the protein and PEG are particularly preferred.

本発明の１つの態様は、ポリエチレングリコール・アルデヒド部分を、還元的アルキル化条件の下でタンパク質のａ−アミノ基およびｅ−アミノ基に結合させることにより、ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートを調製する方法に関する。   One aspect of the present invention is a method for preparing a diPEGylated protein conjugate by attaching a polyethylene glycol aldehyde moiety to a-amino and e-amino groups of a protein under reductive alkylation conditions. About.

この方法の第１のステップは、任意選択で、タンパク質とともに変換させるべき相応のポリエチレングリコール試薬を準備することであってよい。好ましい実施形態では、ポリエチレングリコール試薬はポリエチレングリコール・アセトアルデヒドであり、より好ましくはメトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒドである。米国特許第５，２５２，７１４号明細書には、メトキシＰＥＧアセトアルデヒドがアルドール分解および酸化により水溶液中で不安定であることが記載されている。従って、本発明の１つの実施形態では、ポリエチレングリコール試薬を提供する方法は、メトキシＰＥＧアセトアルデヒドの安定な保存形態であるメトキシＰＥＧジエチルアセタールを活性化してメトキシＰＥＧアセトアルデヒドにすることを含む。   The first step of the method may optionally be providing a corresponding polyethylene glycol reagent to be converted with the protein. In a preferred embodiment, the polyethylene glycol reagent is polyethylene glycol acetaldehyde, more preferably methoxy polyethylene glycol acetaldehyde. US Pat. No. 5,252,714 describes that methoxy PEG acetaldehyde is unstable in aqueous solution due to aldol degradation and oxidation. Thus, in one embodiment of the invention, a method of providing a polyethylene glycol reagent comprises activating methoxy PEG diethyl acetal, a stable storage form of methoxy PEG acetaldehyde, to methoxy PEG acetaldehyde.

しかしながら、驚くべきことに、窒素下および低温、例えば−２０℃以下で固体物質として保存すると、ＰＥＧアセトアルデヒドの活性は、少なくとも４か月、好ましくは少なくとも６か月、最も好ましくは少なくとも１年間保存可能であり、従ってその期間に再現性良くジＰＥＧ化を行うことが可能であることがわかった。本発明の状況において、再現性の良いジＰＥＧ化とは、ジＰＥＧ化タンパク質の収率および反応速度論において同等であることを意味する。従って、本発明の他の実施形態では、ＰＥＧアセトアルデヒドはタンパク質との反応の直前に提供される必要はない。むしろ、ＰＥＧジエチルアセタール先駆物質を、タンパク質（好ましくはＧ−ＣＳＦ）との反応の数時間前（例えば１２時間または２４時間前）、好ましくは数週間前（例えば１週間または２週間前）、あるいは数か月前（例えば２、３または４か月前）あるいはそれ以前に、ＰＥＧアセトアルデヒド、好ましくはメトキシＰＥＧアセトアルデヒドへと活性化してもよい。   Surprisingly, however, the activity of PEG acetaldehyde can be stored for at least 4 months, preferably at least 6 months, most preferably at least 1 year when stored as a solid material under nitrogen and at low temperatures, eg, -20 ° C. or lower. Therefore, it was found that diPEGization can be performed with good reproducibility during that period. In the context of the present invention, reproducible diPEGylation means that the yield and reaction kinetics of diPEGylated protein are equivalent. Thus, in other embodiments of the invention, PEG acetaldehyde need not be provided immediately prior to reaction with the protein. Rather, the PEG diethyl acetal precursor is added several hours before the reaction with the protein (preferably G-CSF), for example 12 hours or 24 hours, preferably several weeks before (for example one or two weeks), or It may be activated to PEG acetaldehyde, preferably methoxy PEG acetaldehyde several months ago (eg 2, 3 or 4 months ago) or earlier.

さらに、本発明の再利用ステップを含むジＰＥＧ化方法の収率および／または反応速度論に影響を及ぼすパラメータが同定された。これらのパラメータには、タンパク質濃度、タンパク質とＰＥＧとのモル比、タンパク質がグリコシル化されているか否かによって変化するタンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比、ｐＨ、還元的アルキル化において使用される還元剤、温度、インキュベーション時間、共溶媒、撹拌速度および撹拌方法、バッファーのイオン強度が含まれる。   In addition, parameters affecting the yield and / or kinetics of the diPEGylation process including the recycling step of the present invention have been identified. These parameters include protein concentration, the molar ratio of protein to PEG, the stoichiometric ratio of the number of amino groups in the protein to the number of polymer molecules, pH, which varies depending on whether the protein is glycosylated, pH, This includes the reducing agent used in the reductive alkylation, temperature, incubation time, co-solvent, stirring speed and stirring method, ionic strength of the buffer.

国際公開公報第９６／１１９５３号パンフレットは、十分に酸性のｐＨでは、α−アミノ基およびｅ−アミノ基のｐＫａ差からみてα−アミノ基のモノＰＥＧ化が選択的に生じることを教示している。国際公開公報第０３／０４９６９９号パンフレットには、ｐＨ５．５〜７．５の範囲のｐＨでのＰＥＧ化はα−アミノ基においてのみ生じ、その結果モノＰＥＧ化タンパク質が得られることが記載されている。シャモウ（Chamow）ら（Bioconjugate Chemistry（１９９４）第５巻（２）、ｐ．１３３−１４０）は、ｐＨ７．５ではＣＤ４−ＩｇＧのａ−アミノ基がプロトン化されていないために主にこのアミノ基がＰＥＧ化され、一方、ｅ−アミノ基はプロトン化されているためＰＥＧ化されないままであることを述べている。この結果としてほぼ完全にモノＰＥＧ化タンパク質分子が生じる。   WO 96/11953 teaches that at sufficiently acidic pH, mono-PEGylation of the α-amino group occurs selectively in view of the pKa difference between the α-amino group and the e-amino group. Yes. WO 03/049699 describes that PEGylation at pH in the range of 5.5-7.5 occurs only at the α-amino group, resulting in a mono-PEGylated protein. Yes. Chamow et al. (Bioconjugate Chemistry (1994) vol. 5 (2), p. 133-140) reported that at pH 7.5, the a-amino group of CD4-IgG is mainly unprotonated. It states that the group is PEGylated while the e-amino group remains protonated because it is protonated. This results in almost completely monoPEGylated protein molecules.

しかしながら、今回、タンパク質の異なるｅ−アミノ基の間で検知される反応性の違いを利用してジＰＥＧ化タンパク質を優先的に生産するパラメータを、本発明の方法について選択可能であることが見出された。ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮα２ａ、エリスロポエチンおよびｈＧＨについては、本発明によるＰＥＧ化反応は、中性付近、例えばｐＨ６．５〜７．５で行なわれることが好ましい。本発明による他のジポリマー・タンパク質コンジュゲートＰＥＧ化反応については、より酸性またはより塩基性のｐＨ、例えばｐＨ３、４、５、５、８、９または１０に調節することが望ましい場合もある。   However, it has now been found that parameters that preferentially produce diPEGylated proteins can be selected for the method of the present invention utilizing the difference in reactivity detected between different e-amino groups of the protein. It was issued. For diPEGylated G-CSF, IFNα2a, erythropoietin and hGH, the PEGylation reaction according to the present invention is preferably carried out near neutrality, for example, pH 6.5 to 7.5. For other dipolymer protein conjugate PEGylation reactions according to the present invention, it may be desirable to adjust to a more acidic or more basic pH, such as pH 3, 4, 5, 5, 8, 9 or 10.

特に、Ｇ−ＣＳＦのようなタンパク質のＰＥＧ化度について重要な１つのパラメータは、反応時間であることが分かった。好ましい実施形態では、好ましい反応時間は、反応混合物の少なくとも２０％が、ジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲート、すなわちタンパク質の２つのアミノ基が各々１つのポリエチレングリコール単位と結合しているポリエチレングリコール・タンパク質コンジュゲートからなるように選択される。他の好ましい実施形態では、ジＰＥＧ化反応の反応時間は、反応混合物の少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％あるいは少なくとも５０％が、ジＰＥＧ化ＧＣＳＦのようなジＰＥＧ化タンパク質からなるように選択される。   In particular, one important parameter for the degree of PEGylation of proteins such as G-CSF was found to be reaction time. In a preferred embodiment, the preferred reaction time is that at least 20% of the reaction mixture is a diPEGylated PEG protein conjugate, ie, a polyethylene glycol protein conjugate in which two amino groups of the protein are each bound to one polyethylene glycol unit. Selected to consist of gates. In other preferred embodiments, the reaction time of the diPEGylation reaction is such that at least 25%, at least 30%, at least 40% or at least 50% of the reaction mixture consists of a diPEGylated protein such as diPEGylated GCSF. Selected.

特に、タンパク質濃度、タンパク質とＰＥＧとのモル比、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比、ｐＨおよび温度などのパラメータの所定のセットについて、ポリエチレングリコール試薬、好ましくはポリエチレングリコール・アセトアル
デヒド、より好ましくはメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）アセトアルデヒドを、タンパク質、好ましくはＧ−ＣＳＦ、ＩＦＮα２ａ、エリスロポエチンおよびｈＧＨとともにインキュベーションするための、ジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲートの形成に有利に働く特定の時間フレームが存在することが分かった。Ｇ−ＣＳＦの例に関して図３に示すように、各ｍＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート、すなわちモノ−、ジ−、トリ−およびテトラＰＥＧ化物の収量はインキュベーション時間に依存して変わる。インキュベーションの初期には、モノＰＥＧ化物の収量が最大に達して減少が始まる（データは示さない）のに対し、ジＰＥＧ化およびトリＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートは漸増的に形成される。次に、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの収量が最大に達して数時間維持された後で減少し始める一方、トリＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートは漸増的に形成される。調べたインキュベーション時間内では、トリＰＥＧ化およびそれ以上にＰＥＧ化されたコンジュゲートはその最大収量に達しない。 In particular, for a given set of parameters such as protein concentration, molar ratio of protein to PEG, stoichiometric ratio between the number of amino groups in the protein and the number of polymer molecules, pH and temperature, preferably a polyethylene glycol reagent, preferably Specifics that favor the formation of diPEGylated PEG protein conjugates for incubation of polyethylene glycol acetaldehyde, more preferably methoxypolyethylene glycol (mPEG) acetaldehyde, with proteins, preferably G-CSF, IFNα2a, erythropoietin and hGH It turns out that there is a time frame. As shown in FIG. 3 for the G-CSF example, the yield of each mPEG-G-CSF conjugate, ie mono-, di-, tri-, and tetra-PEGate, varies depending on the incubation time. Early in the incubation, the yield of monoPEGylated product reaches a maximum and begins to decrease (data not shown), whereas diPEGylated and triPEGylated G-CSF conjugates are formed incrementally. Next, the triPEGylated G-CSF conjugate is formed incrementally while the yield of diPEGylated G-CSF conjugate starts to decrease after reaching a maximum and maintained for several hours. Within the examined incubation time, the triPEGylated and more PEGylated conjugate does not reach its maximum yield.

従って、本発明の方法の反応時間に関して所定の時間フレームを選択することは、Ｇ−ＣＳＦなどのＰＥＧ化タンパク質の特定のアイソフォームまたは分子種を高収率で生産するために不可欠であることが分かった。   Therefore, selecting a predetermined time frame for the reaction time of the method of the present invention may be essential for producing a specific isoform or molecular species of a PEGylated protein such as G-CSF in high yield. I understood.

ジＰＥＧ化タンパク質の生産のための別の重要なパラメータは、タンパク質とＰＥＧとのモル比、およびタンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数の化学量論比であり、化学量論比はグリコシル化タンパク質と非グリコシル化タンパク質とで異なっている。   Another important parameter for the production of diPEGylated proteins is the molar ratio of protein to PEG, and the stoichiometric ratio of the number of amino groups in the protein to the number of polymer molecules, Different between glycosylated and non-glycosylated proteins.

通常、本発明の方法はＰＥＧ化状態の異なる形態の混合生成物を生じ、該混合生成物はジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートが非常に豊富、すなわち反応混合物のうち好ましくは少なくとも２０％、またはより好ましくは少なくとも３０％がジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートからなる。しかしながら、該反応混合物は、未反応タンパク質、未反応ポリマーおよび別のＰＥＧ化状態のタンパク質コンジュゲートをも含んでいる。したがって、本発明の方法は、望ましくない物質からジＰＥＧ化物を分離するために、例えばクロマトグラフィー、好ましくはイオン交換クロマトグラフィーのステップ、より好ましくは陽イオン交換クロマトグラフィーのステップ（Ｃ−ＩＥＸ）による精製ステップをさらに含むことが好ましい。この精製ステップでは、ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートは、未反応タンパク質、未反応ＰＥＧ試薬、および／または１タンパク質当たり３以上もしくは２未満のポリエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコール・コンジュゲートから分離されうる。さらに、ＰＥＧ結合部位が所望のジＰＥＧ化ＰＥＧタンパク質コンジュゲート生成物と異なっているジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲート・アイソフォームが分離される場合もある。ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲート生成物を含むプールは生成物プールとも呼ばれ、望ましくない化合物を含むプールは残余物プールまたは生成物非含有溶出液とも呼ばれる。   Usually, the method of the invention results in a mixed product of different forms of PEGylation state, which is very rich in diPEGylated protein conjugates, ie preferably at least 20% of the reaction mixture, or more preferably Consists of at least 30% diPEGylated protein conjugate. However, the reaction mixture also contains unreacted protein, unreacted polymer and another PEGylated protein conjugate. Thus, the method of the present invention can be used, for example, by chromatography, preferably ion exchange chromatography steps, more preferably cation exchange chromatography steps (C-IEX) to separate diPEGylated products from undesired materials. Preferably further comprising a purification step. In this purification step, diPEGylated protein conjugates can be separated from unreacted proteins, unreacted PEG reagents, and / or polyethylene glycol conjugates having 3 or more and less than 2 polyethylene glycol units per protein. In addition, diPEGylated protein conjugate isoforms in which the PEG binding site is different from the desired diPEGylated PEG protein conjugate product may be separated. Pools containing diPEGylated protein conjugate products are also referred to as product pools, and pools containing undesired compounds are also referred to as residue pools or product-free eluates.

本発明のさらに好ましい実施形態では、ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの全収量は、本発明の別のＰＥＧ化方法において、Ｃ−ＩＥＸステップのような精製ステップから得られた生成物非含有溶出液を再利用することによってさらに増加させることが可能と思われる。この実施形態では、クロマトグラフィーカラム（例えばＣ−ＩＥＸカラム）の溶出液を、通常は、バッファー交換および濃縮のために限外濾過および／または透析濾過に供し、次に、ポリエチレングリコール・アルデヒド試薬、好ましくはメトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒドのようなアセトアルデヒドを用いて変換させる。   In a further preferred embodiment of the present invention, the total yield of diPEGylated protein conjugate is obtained by using a product-free eluate obtained from a purification step, such as a C-IEX step, in another PEGylation method of the present invention. It seems that it can be further increased by reuse. In this embodiment, the eluate of a chromatography column (eg, C-IEX column) is typically subjected to ultrafiltration and / or diafiltration for buffer exchange and concentration, followed by a polyethylene glycol aldehyde reagent, Preferably, the transformation is performed using acetaldehyde such as methoxypolyethylene glycol acetaldehyde.

本発明の別の態様では、本発明のジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートが高い生物活性を示し、該活性が本発明のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームおよびアイソフォーム混合物のバイオアッセイで実証されたことが示された。本発明のコンジュゲートは、天然Ｇ−ＣＳＦの造血性の生物学的特性を示した。特に、インビボのデータから、本発明のジＰ
ＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームおよびアイソフォーム混合物を投与すると好中球および白血球数が増加することが明らかとなり、さらに、生物活性の時間が持続されることが明らかとなったが、このことは、コンジュゲートではないＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））の反復注射と比較して、治療コース当たりのＧ−ＣＳＦの注射を少なくすることができるため、患者にとって実際的な利点をもたらすものである。 In another aspect of the present invention, the diPEGylated protein conjugates of the present invention showed high biological activity that was demonstrated in the bioassay of the diPEGylated G-CSF isoforms and isoform mixtures of the present invention. It has been shown. The conjugates of the present invention showed the hematopoietic biological properties of native G-CSF. In particular, from in vivo data, the diP of the present invention
It was found that administration of EGated G-CSF isoforms and isoform mixtures increased neutrophil and leukocyte counts, and further demonstrated that the duration of biological activity was sustained, Compared to repeated injections of non-conjugate G-CSF (Neupogen®), it is possible to reduce the injection of G-CSF per course of treatment, thus providing a practical advantage for the patient.

本発明のＰＥＧ化方法のさらなる実施形態をより詳細に以下に説明する。
［ポリエチレングリコール・アセタールの活性化］
本発明の方法において、タンパク質コンジュゲートの作製に次式：
（Ｒ−Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨＯ
を有するポリエチレングリコール・アルデヒドを使用することが好ましく、上記式中、ＲはＨまたはメチルのような低級アルキルであり；ｎは、ポリエチレングリコール部分のエチレンオキシド残基の数を表わす整数であって好ましくは２２５〜６８０であり；ｍはメチレン基の数を表わす整数であり；Ｌ１は不在であり；Ｌ２は不在であり；ｙは１である。当業者は、これらの化合物および本発明による他のポリマー試薬を生産するためのプロトコールおよび条件についてよく承知している（例えば欧州特許出願第０ １５４ ３１６号明細書；米国特許第５，９９０，２３７号明細書；シャモフ（Chamov）ら、Bioconjugate Chem.、１９９４年、第５巻、ｐ．１３３−１４０を参照のこと）。 Further embodiments of the PEGylation method of the present invention are described in more detail below.
[Activation of polyethylene glycol acetal]
In the method of the present invention, the production of protein conjugates has the following formula:
(R—O— (CH 2 —CH 2 —O) n ) y —CH 2 —CHO
It is preferred to use a polyethylene glycol aldehyde having the formula: wherein R is lower alkyl such as H or methyl; n is an integer representing the number of ethylene oxide residues of the polyethylene glycol moiety, preferably M is an integer representing the number of methylene groups; L 1 is absent; L 2 is absent; y is 1. Those skilled in the art are well aware of the protocols and conditions for producing these compounds and other polymeric reagents according to the present invention (eg, European Patent Application 0 154 316; US Pat. No. 5,990,237). No .; see Chamov et al., Bioconjugate Chem., 1994, Vol. 5, pages 133-140).

１つの実施形態では、本発明の方法は、メトキシポリエチレングリコール・アセタールのようなポリエチレングリコール試薬の前駆物質化合物を、メトキシポリエチレングリコール・アルデヒドのような活性化されたポリエチレングリコール・アセトアルデヒドに変換することにより開始される。この活性化は通常、水溶液中で、例えば最大３時間、酸性ｐＨ、例えばｐＨ２（任意の有機酸および／または無機酸を加えることにより達成可能）で行なわれる。通常、ポリエチレングリコール・アセタールからポリエチレングリコール・アルデヒドへの変換は１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定による成分分析により検知される。 In one embodiment, the method of the invention involves converting a precursor compound of a polyethylene glycol reagent such as methoxypolyethylene glycol acetal to an activated polyethylene glycol acetaldehyde such as methoxypolyethylene glycol aldehyde. Be started. This activation is usually carried out in aqueous solution, for example for a maximum of 3 hours, at an acidic pH, for example pH 2 (which can be achieved by adding any organic and / or inorganic acid). Usually, the conversion from polyethylene glycol acetal to polyethylene glycol aldehyde is detected by component analysis by 1 H-NMR spectrum measurement.

［ＰＥＧ化反応］
ＰＥＧ化反応において変換されるタンパク質としては、任意の天然もしくは組換えタンパク質、または任意の原核生物もしくは真核細胞から得られるようなタンパク質バリアントまたはタンパク質変異体を使用することができる。ヒトのタンパク質が好ましい。特に、野生型形態の活性を有する任意のタンパク質、例えばバリアント、突然変異タンパク質、構造上または機能的に同等なタンパク質ならびにタンパク質様の合成物を使用することができる。しかしながら、野生型タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質の使用が好ましい。 [PEGylation reaction]
The protein to be converted in the PEGylation reaction can be any natural or recombinant protein, or protein variant or protein variant such as obtained from any prokaryotic or eukaryotic cell. Human proteins are preferred. In particular, any protein having wild-type form of activity, such as variants, muteins, structurally or functionally equivalent proteins, and protein-like compounds can be used. However, the use of proteins having the amino acid sequence of the wild type protein is preferred.

好ましくは、Ｇ−ＣＳＦの活性を有するタンパク質、より好ましくは配列番号１に特定されたアミノ酸配列を有するＧ−ＣＳＦが、本発明の方法において使用される。天然または組換えの供給源からＧ−ＣＳＦを入手し単離することはよく知られている。（例えば欧州特許出願第０ ２３７ ５４５号、同第０ １６９ ５６６号明細書）通常、Ｇ−ＣＳＦは、適切なバッファー、例えば１０ｍＭの酢酸Ｎａバッファー（ｐＨ４．０）中にて低濃度、例えば約１ｍｇ／ｍｌで保存される。   Preferably, a protein having G-CSF activity, more preferably G-CSF having the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 1, is used in the method of the present invention. It is well known to obtain and isolate G-CSF from natural or recombinant sources. (Eg European patent applications 0 237 545, 0 169 566) G-CSF is usually low in concentration in a suitable buffer, eg 10 mM Na acetate buffer (pH 4.0), eg about Stored at 1 mg / ml.

他の好ましいタンパク質は、インターフェロン・ファミリーのタンパク質、好ましくはＩＦＮα２ａと、エリスロポエチンおよびヒト成長ホルモンであって、それぞれ配列番号２、配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列を有するもの、ならびにその類似体である。   Other preferred proteins are interferon family proteins, preferably IFNα2a, erythropoietin and human growth hormone, having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 respectively, and analogs thereof is there.

さらに、本発明によるＰＥＧ化反応は、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＦＮα２ａ、エリスロポエチンまたはヒト成長ホルモンのようなタンパク質と、生理学的バッファー系と、メトキシポリ
エチレングリコール・アセトアルデヒドのような活性化ポリエチレングリコール・アルデヒドと、還元剤とを含んでいる適切なインキュベータ中で一般に行なわれる。さらに、反応混合物を低温で静かに撹拌することが好ましい。反応は、反応混合物の酸性化によって停止可能である。 Furthermore, the PEGylation reaction according to the present invention comprises a protein such as G-CSF, IFNα2a, erythropoietin or human growth hormone, a physiological buffer system, an activated polyethylene glycol aldehyde such as methoxypolyethylene glycol acetaldehyde, and a reduction. This is generally done in a suitable incubator containing the agent. Furthermore, it is preferable to gently stir the reaction mixture at a low temperature. The reaction can be stopped by acidification of the reaction mixture.

反応バッファー
本発明によるＰＥＧ化反応用の典型的な反応バッファーには、リン酸、クエン酸／リン酸、カコジル酸、炭酸、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ｂｉｃｉｎｅおよび／またはその他の適切なバッファーが挙げられる。 Reaction Buffer Typical reaction buffers for PEGylation reactions according to the present invention include phosphate, citric acid / phosphate, cacodylic acid, carbonic acid, HEPES, MES, BES, MOPS, bicine and / or other suitable buffers. Can be mentioned.

バッファーの使用濃度は、使用されるタンパク質の量に依存して変更可能である。典型的な濃度は５０〜２００ｍＭのリン酸バッファーなどのバッファーである。しかしながら、イオン強度が異なってもジＰＥＧ化生成物の収量には影響しない。   The working concentration of the buffer can vary depending on the amount of protein used. A typical concentration is a buffer such as 50-200 mM phosphate buffer. However, different ionic strengths do not affect the yield of diPEGylated product.

タンパク質濃度
本発明のＰＥＧ化方法に使用されるタンパク質の濃度は、溶解度および凝集性のようなタンパク質の物理化学的性質、ならびに方法の経済性に依存する。タンパク質濃度が高いほど、同等な生成物収量とするためのタンパク質とポリエチレングリコール試薬との規定モル比は小さくなる。 Protein Concentration The concentration of protein used in the PEGylation method of the present invention depends on the physicochemical properties of the protein, such as solubility and aggregation, and the economics of the method. The higher the protein concentration, the smaller the defined molar ratio of protein to polyethylene glycol reagent to achieve an equivalent product yield.

本発明によるＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化については、反応混合物中のタンパク質の濃度は、好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約２または２．４〜約５．７または６ｍｇ／ｍｌの範囲であり、最も好ましくは約３．２ｍｇ／ｍｌである。   For PEGylation of G-CSF according to the present invention, the concentration of protein in the reaction mixture is preferably in the range of 1-20 mg / ml, more preferably about 2 or 2.4 to about 5.7 or 6 mg / ml. Yes, most preferably about 3.2 mg / ml.

ポリエチレングリコール・アルデヒドとタンパク質とのモル比
ポリエチレングリコール・アルデヒド部分の濃度はジＰＥＧ化タンパク質の最終的な収量に影響しないことが分かった。しかしながら、一定のタンパク質濃度に対するポリエチレングリコール濃度が高いほど、反応はより速く終了点に達する。 Molar ratio of polyethylene glycol aldehyde to protein It was found that the concentration of the polyethylene glycol aldehyde moiety did not affect the final yield of diPEGylated protein. However, the higher the polyethylene glycol concentration for a given protein concentration, the faster the reaction reaches the end point.

従って、本発明によるタンパク質のジＰＥＧ化は、広範囲のタンパク質とポリエチレングリコール試薬とのモル比において実施可能である。好ましくは、ポリエチレングリコール・アルデヒド、例えばメトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒドのタンパク質に対するモル比が約５：１〜４００：１であることが好ましい。より好ましくは、特に非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦのジＰＥＧ化について、モル比は１０：１〜５０：１であり、最も好ましくは１５：１〜３０：１である。   Thus, diPEGylation of proteins according to the present invention can be performed in a wide range of protein to polyethylene glycol reagent molar ratios. Preferably, the molar ratio of polyethylene glycol aldehyde, such as methoxypolyethylene glycol acetaldehyde, to protein is about 5: 1 to 400: 1. More preferably, especially for diPEGylation of non-glycosylated G-CSF, the molar ratio is 10: 1 to 50: 1, most preferably 15: 1 to 30: 1.

タンパク質内のアミノ基に対するポリエチレングリコールの化学量論比
非グリコシル化タンパク質について、２つのポリマー基を備えたタンパク質を生産するためには、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、１：１．２５〜１：５０、好ましくは１：１．２５〜１：３０、より好ましくは１：２〜１：１０の範囲であることが好ましい。 Stoichiometric ratio of polyethylene glycol to amino groups in the protein To produce a protein with two polymer groups for non-glycosylated proteins, the stoichiometry of the number of amino groups in the protein and the number of polymer molecules The theoretical ratio is preferably in the range of 1: 1.25 to 1:50, preferably 1: 1.25 to 1:30, more preferably 1: 2 to 1:10.

グリコシル化タンパク質については、ＰＥＧ結合に関し接触可能となるアミノ基の数が所与のタンパク質濃度におけるポリマー分子の数に対して過剰であっても、主としてジポリマー・タンパク質コンジュゲートが生産される。   For glycosylated proteins, dipolymer protein conjugates are mainly produced even if the number of amino groups that can be contacted for PEG linkage is excessive relative to the number of polymer molecules at a given protein concentration.

したがって、タンパク質内のアミノ基の数とポリマー分子の数との化学量論比は、グリコシル化タンパク質については、１０：１〜１：５０、好ましくは１：０．３〜１：５０、より好ましくは２：１〜１：２５、さらに一層好ましくは１：０．８〜１：１０までの範囲であり、最も好ましくは化学量論比は１０：１、５：１、１：０．３、１：０．４、
２：１、１：０．６、１：０．７、１：０．８、１：０．９または１：１である。 Therefore, the stoichiometric ratio of the number of amino groups in the protein to the number of polymer molecules is 10: 1 to 1:50, preferably 1: 0.3 to 1:50, more preferably for glycosylated proteins. Is in the range of 2: 1 to 1:25, even more preferably 1: 0.8 to 1:10, most preferably the stoichiometric ratio is 10: 1, 5: 1, 1: 0.3, 1: 0.4,
2: 1, 1: 0.6, 1: 0.7, 1: 0.8, 1: 0.9 or 1: 1.

ポリエチレングリコール・アルデヒド試薬の分子量
本発明によるタンパク質のジＰＥＧ化は、広範囲の分子量のポリエチレングリコール試薬（すなわち２〜１００ｋＤａ）において実施されうる。ポリエチレングリコール・アルデヒド試薬の好ましい分子量は、１０〜３０ｋＤａ、例えば１２〜２０ｋＤａの範囲にある。分子量が大きいほど、ジＰＥＧ化の収量は低くなる可能性があり、次いで反応混合物の粘性が増大する場合がある。 Molecular Weight of Polyethylene Glycol Aldehyde Reagents DiPEGylation of proteins according to the present invention can be carried out in a wide range of molecular weight polyethylene glycol reagents (ie 2-100 kDa). The preferred molecular weight of the polyethylene glycol aldehyde reagent is in the range of 10-30 kDa, for example 12-20 kDa. The higher the molecular weight, the lower the yield of diPEGylation may then increase the viscosity of the reaction mixture.

ポリエチレングリコール・アルデヒド試薬の化学構造は重要ではなく、したがって直線状のものに限定されるものではなく分岐状であってもよい。
反応温度
通常、本発明による方法の反応温度は、約２℃〜５０℃、より好ましくは２℃〜２０℃の範囲にある。好ましくは、化学的または物理的なプロセスによるタンパク質の分解および／または凝集のような非特異的な変性を最小限にするために、本発明の方法は低い温度で行なわれる。従って、本発明の方法について最も好ましい反応温度は、約２℃〜約８℃の範囲にあり、例えば約４℃である。 The chemical structure of the polyethylene glycol aldehyde reagent is not critical and is therefore not limited to a linear one and may be branched.
Reaction temperature The reaction temperature of the process according to the invention is usually in the range of about 2 ° C. to 50 ° C., more preferably 2 ° C. to 20 ° C. Preferably, the methods of the present invention are performed at low temperatures to minimize non-specific denaturation such as protein degradation and / or aggregation by chemical or physical processes. Accordingly, the most preferred reaction temperature for the process of the present invention is in the range of about 2 ° C to about 8 ° C, for example about 4 ° C.

還元剤
ＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの収量に対する還元剤の影響は、欧州特許出願第０
１５４ ３１６号明細書（１００〜４００倍モル濃度過剰のＮａＣＮＢＨ４）および国際公開公報第９６／１１９５３号パンフレット（７５倍モル濃度過剰のＮａＣＮＢＨ４）のいずれにも報告されていない。欧州特許出願第０ １５４ ３１６号明細書には、還元剤は水溶液中で安定であるべきで、還元的アルキル化の初期過程で形成されたシッフ塩基だけを還元することができると好ましいことが述べられている。 Reducing agents The effect of reducing agents on the yield of PEGylated protein conjugates is described in European patent application no.
No. 154 316 (100 to 400- fold molar excess NaCNBH 4 ) and WO 96/11953 (75-fold molar excess NaCNBH 4 ) are not reported. European Patent Application 0 154 316 states that the reducing agent should be stable in aqueous solution and preferably only the Schiff base formed in the initial process of reductive alkylation can be reduced. It has been.

好ましい還元剤は、水素化ホウ素ナトリウムおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムから成る群から選択可能であり、使用されるタンパク質の濃度に対して過剰に加えるべきである。シアノ水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤のモル濃度過剰量が低い、すなわち１１７倍モル濃度過剰より少ないと、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの形成は減速するが、最大１８０倍モル濃度過剰のモル濃度過剰量など高濃度の還元剤と比較してジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの最大収量は同じになることが見出された。１２０倍モル濃度過剰の範囲より高いモル濃度過剰量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムでは、ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの速度論的形成は、使用される還元剤の濃度に依存しない。   Preferred reducing agents can be selected from the group consisting of sodium borohydride and sodium cyanoborohydride and should be added in excess relative to the concentration of protein used. When the molar excess of a reducing agent such as sodium cyanoborohydride is low, i.e. less than a 117-fold molar excess, the formation of diPEGylated G-CSF is slowed, but a molar concentration of up to 180-fold molar excess. It has been found that the maximum yield of diPEGylated protein conjugate is the same compared to high concentrations of reducing agent, such as excess. With a molar excess of sodium cyanoborohydride higher than the 120-fold molar excess range, the kinetic formation of the diPEGylated protein conjugate is independent of the concentration of reducing agent used.

攪拌方法および攪拌速度
ＰＥＧ化反応混合物のインキュベーションに旋回式撹拌を加えても加えなくても、最終的なジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの収量には影響しないことがわかった。更に、旋回式撹拌の速度が速いほど、同じインキュベーション時間での最終的なジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲート収量が低くなることがわかった。 Agitation method and agitation speed It was found that adding or not adding swirl agitation to the incubation of the PEGylation reaction mixture did not affect the final diPEGylated protein conjugate yield. Furthermore, it was found that the faster the swirl speed, the lower the final diPEGylated protein conjugate yield at the same incubation time.

共溶媒
イオン性液体を、部位選択的なＰＥＧ化のための共溶媒として試験したところ、１−ブチル−４−メチルピリジニウムテトラフルオロホウ酸などの共溶媒の濃度を増大させると最終的なジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの収量が減少することが明らかとなった。 Co-solvents When ionic liquids were tested as co-solvents for site-selective PEGylation, increasing the concentration of co-solvents such as 1-butyl-4-methylpyridinium tetrafluoroborate resulted in final diPEG It was found that the yield of conjugated protein conjugate was reduced.

［精製］
既に上述したように、本発明によるＰＥＧ化反応を好ましくは酸性化によって停止させた後、一般には反応混合物を精製ステップに、好ましくは反応混合物を陽イオン交換クロマトグラフィーに供する。 [Purification]
As already mentioned above, after the PEGylation reaction according to the invention is preferably stopped by acidification, the reaction mixture is generally subjected to a purification step, preferably the reaction mixture is subjected to cation exchange chromatography.

陽イオン交換クロマトグラフィーは、すべての一般的かつ／または市販の陽イオン交換マトリクスを用いて実施することが可能である。本発明の目的で使用されうる典型的なイオン交換樹脂は、ＳＰ−５ＰＷ（ドイツ連邦共和国所在のトーソーハース・バイオサイエンス（Tosohaas Biosciences））、Ｓｏｕｒｃｅ Ｓ（ドイツ連邦共和国所在のアマシャム・バイオサイエンス（Amersham Biosciences））、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（Ｒ）ＳＯ３ ６５０（ドイツ連邦共和国所在のメルク（Merck ））、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ドイツ連邦共和国所在のアマシャム・バイオサイエンス）およびＳＰ ＦＦ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ドイツ連邦共和国所在のアマシャム・バイオサイエンス）を含む。 Cation exchange chromatography can be performed using all common and / or commercially available cation exchange matrices. Typical ion exchange resins that can be used for the purposes of the present invention are SP-5PW (Tosohaas Biosciences, Germany), Source S (Amersham Biosciences, Germany). Biosciences), Fractogel® SO 3 650 (Merck, Germany), SP Sepharose HP (Amersham Bioscience, Germany) and SP FF Sepharose (Amersham Biotechnology, Germany) Science).

通常、精製ステップは２℃〜周囲温度で、好ましくは室温で行なわれる。
希釈、平衡化、洗浄および溶出については、リン酸塩、酢酸ナトリウム、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳまたはその他の適切なバッファーを含む、イオン交換クロマトグラフィーに一般的に使用される任意のバッファーを使用することができる。典型的には、バッファーは分析されるタンパク質に応じて選択され、かつｐＨ３．５〜８．５、好ましくはｐＨ４〜６に調節される。 Usually, the purification step is performed at 2 ° C. to ambient temperature, preferably at room temperature.
For dilution, equilibration, washing and elution, use any buffer commonly used for ion exchange chromatography, including phosphate, sodium acetate, TRIS / HCl, HEPES or other suitable buffer. Can do. Typically, the buffer is selected depending on the protein to be analyzed and adjusted to pH 3.5-8.5, preferably pH 4-6.

好ましくは、希釈、洗浄および平衡化バッファーはｐＨ４．２で１５ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。溶出バッファーは平衡化バッファーと同じ組成であってよく、かつ約１ＭのＮａＣｌを含みうる。   Preferably, the dilution, wash and equilibration buffer contains 15 mM sodium acetate at pH 4.2. The elution buffer may be the same composition as the equilibration buffer and may contain about 1M NaCl.

クロマトグラフィー・ステップの好ましい実施形態では、反応混合物を例えば平衡化バッファーで３倍に希釈して、導電率をおよそ６ｍＳ／ｃｍに低下させてもよい。これにより、本発明のタンパク質コンジュゲートをイオン交換カラムに完全に結合させる条件が提供される。   In a preferred embodiment of the chromatography step, the reaction mixture may be diluted 3-fold, for example with equilibration buffer, to reduce the conductivity to approximately 6 mS / cm. This provides conditions for fully binding the protein conjugate of the invention to the ion exchange column.

Ｃ−ＩＥＸによる精製は典型的には下記ステップ：
１カラム体積のバッファーＡによりカラムを平衡化するステップ；
サンプルを装荷するステップ；
０．２〜１カラム体積でカラムを洗浄するステップ；および／または
およそ１７カラム体積のバッファー中０〜３５％の１Ｍ ＮａＣｌ溶液により直線勾配溶出を行うステップ
を含む。 Purification by C-IEX typically involves the following steps:
Equilibrating the column with 1 column volume of buffer A;
Loading the sample;
Washing the column with 0.2-1 column volume; and / or performing a linear gradient elution with 0-35% 1 M NaCl solution in approximately 17 column volumes of buffer.

１例として、すべてのクロマトグラフィー・ステップに約６８ｃｍ／ｈの線形流速を使用可能であるが、例外としてサンプルの装荷は１７ｃｍ／ｈで行うとよい。
本発明の方法の精製ステップの好ましい実施形態では、２つのプールが溶出液から形成される。第１のプールは、生成物プールＩとも呼ばれ、タンパク質の１つまたは２つのジＰＥＧ化アイソフォームのフラクション（第１および／または第２のジＰＥＧ化フラクションあるいはＧ−ＣＳＦのようなジＰＥＧ化タンパク質の分子種とも呼ばれる）を含んでいる。第２のプールは、残余物プールとも呼ばれ、その他のタンパク質フラクションを含んでおり、非ＰＥＧ化、モノＰＥＧ化、第１および／または第２のジＰＥＧ化アイソフォームとは同一でないジＰＥＧ化アイソフォーム、およびさらに高度にＰＥＧ化されたタンパク質フラクションを含みうる。残余物プールはまた、生成物プールのジＰＥＧ化アイソフォームを微量含む場合もあるが、本質的に生成物プールのジＰＥＧ化アイソフォームを含まない。この残余物プールは、別のＰＥＧ化反応に再利用されることが好ましく、該反応は本発明の方法について上述したようにして実施される。 As an example, a linear flow rate of about 68 cm / h can be used for all chromatographic steps, with the exception that sample loading should be done at 17 cm / h.
In a preferred embodiment of the purification step of the method of the invention, two pools are formed from the eluate. The first pool, also called product pool I, is a fraction of one or two diPEGylated isoforms of protein (first and / or second diPEGylated fraction or diPEG such as G-CSF. (Also called molecular species of chemical proteins). The second pool, also called the residue pool, contains other protein fractions and is non-PEGylated, monoPEGylated, diPEGylated not identical to the first and / or second diPEGylated isoform It may include isoforms and more highly PEGylated protein fractions. The residual pool may also contain minor amounts of the product pool diPEGylated isoform, but is essentially free of the product pool diPEGylated isoform. This residue pool is preferably reused for another PEGylation reaction, which is performed as described above for the method of the present invention.

この再利用または再循環化または再ＰＥＧ化ステップでは、残余物プールは通常、修飾タンパク質を濃縮し、かつ本発明の方法によってＰＥＧ化反応を行うのに適したバッファ
ーへバッファー交換を行うために、限外濾過／透析濾過に供される。次いで、残余物プールは、本発明の方法について上述したようにしてＰＥＧ化反応に供され、任意選択でその後上述のような陽イオン交換精製に供される。次に、この再ＰＥＧ化ステップから得られ、任意選択で精製された生成物プールＩＩを、生成物プールＩと混合すればよい（図１を参照）。 In this recycling or recirculation or rePEGylation step, the residue pool is typically used to concentrate the modified protein and perform a buffer exchange to a buffer suitable for performing the PEGylation reaction by the method of the present invention. Subjected to ultrafiltration / diafiltration. The residue pool is then subjected to a PEGylation reaction as described above for the method of the present invention, and optionally subjected to cation exchange purification as described above. The product pool II obtained from this rePEGylation step and optionally purified can then be mixed with the product pool I (see FIG. 1).

以下の実施例は本明細書に記載の発明を例証するために提供されるものであり、本発明をどのようにも限定することを意図したものではない。
実施例
以下の実施例は、（ｉ）還元的アルキル化によるＧ−ＣＳＦのジＰＥＧ化および２つの異なるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの精製、ならびに（ｉｉ）本発明によるＩＦＮα２ａ、エリスロポエチンおよびヒト成長ホルモンのジＰＥＧ化、のための好ましい実施形態を例証するものである。 The following examples are provided to illustrate the invention described herein and are not intended to limit the invention in any way.
Examples The following examples include (i) G-CSF diPEGylation by reductive alkylation and purification of two different diPEGylated G-CSF conjugates, and (ii) IFNα2a, erythropoietin and human according to the present invention. FIG. 2 illustrates a preferred embodiment for diPEGylation of growth hormone.

Ａ）１２ｋＤａ ｍＰＥＧアセタールを用いたＧ−ＣＳＦのＰＥＧ化
１．ポリエチレングリコール試薬の準備
ａ）ｍＰＥＧアルデヒドへのｍＰＥＧアセタールの活性化
１５０ｍｇの１２ｋＤａ ｍＰＥＧアセタールを８０ｍＭのリン酸に溶解し、５０℃で３時間加水分解した。氷上でおよそ２〜８℃まで冷却した後、該溶液に重炭酸ナトリウム溶液（５％）を滴下してｐＨ７に中和した。該混合物をＮａＣｌで飽和させ、２ｍｌの塩化メチレンで３回抽出した。回収した３つの有機相を合わせ、硫酸ナトリウムを加えて脱水し、容量を１．５ｍｌに減少させた（窒素流）。 A) PEGylation of G-CSF using 12 kDa mPEG acetal Preparation of polyethylene glycol reagent a) Activation of mPEG acetal to mPEG aldehyde 150 mg of 12 kDa mPEG acetal was dissolved in 80 mM phosphoric acid and hydrolyzed at 50 ° C. for 3 hours. After cooling to approximately 2-8 ° C. on ice, sodium bicarbonate solution (5%) was added dropwise to the solution to neutralize to pH7. The mixture was saturated with NaCl and extracted 3 times with 2 ml of methylene chloride. The three recovered organic phases were combined, dehydrated by adding sodium sulfate, and the volume was reduced to 1.5 ml (nitrogen flow).

３０ｍｌの氷冷ジエチルエーテルを加えることによりｍＰＥＧアセトアルデヒドを沈殿させた。沈殿物を減圧濾過（Ｇ４漏斗）によって単離し、減圧下にて室温で乾燥させ、気密のチューブ中へ移した。該チューブを密閉する前に窒素ガスでフラッシングし、−２０℃で保存した。   MPEG acetaldehyde was precipitated by adding 30 ml ice-cold diethyl ether. The precipitate was isolated by vacuum filtration (G4 funnel), dried at room temperature under reduced pressure, and transferred into an airtight tube. Before the tube was sealed, it was flushed with nitrogen gas and stored at -20 ° C.

ｂ）活性化されたｍＰＥＧアルデヒドの安定性
先行技術によれば、ｍＰＥＧアセタールは一般に、各ＰＥＧ化反応について新たに活性化されるか、あるいは最大でも一晩保存されるかであった。 b) Stability of activated mPEG aldehyde According to the prior art, mPEG acetals were generally either freshly activated for each PEGylation reaction or stored at most overnight.

窒素下−２０℃で保存された活性化ｍＰＥＧアルデヒドの安定性を調査するために、保存されたｍＰＥＧアルデヒドをＰＥＧ化反応に供した（以下を参照）。ジ−ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの収量および生成物形成の反応速度を読み取り値として用いた。   To investigate the stability of activated mPEG aldehyde stored at −20 ° C. under nitrogen, the stored mPEG aldehyde was subjected to a PEGylation reaction (see below). The yield of di-PEGylated G-CSF conjugate and the reaction rate of product formation were used as readings.

ｃ）ポリエチレングリコール試薬の分析論
アセタールのアルデヒドへの変換の質を評価するために、以下の３つのパラメータを求めた：
検出される活性：
アセタールからアルデヒドへの変換の程度を測定するための、ｍＰＥＧアセタールおよび活性化ｍＰＥＧアルデヒドの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定（４００ＭＨｚ分光器、溶剤としてＣＤＣｌ３）。 c) Analytical theory of polyethylene glycol reagents In order to assess the quality of the conversion of acetals to aldehydes, the following three parameters were determined:
Detected activity:
1 H-NMR spectral measurement of mPEG acetal and activated mPEG aldehyde (400 MHz spectrometer, CDCl 3 as solvent) to determine the degree of acetal to aldehyde conversion.

質量収率の活性：
使用したｍＰＥＧアセタール量に対する回収された抽出物（educt ）の量を測定するための、乾燥させた活性化ｍＰＥＧアルデヒドの風袋測定（tarring ）。 Mass yield activity:
Tare measurement of the dried activated mPEG aldehyde to determine the amount of recovered extract (educt) relative to the amount of mPEG acetal used.

ＰＥＧ化の反応速度および生成分子種：
反応混合物中の分子種の分布を測定するための分析型Ｃ−ＩＥＸ ＨＰＬＣ（「ＰＥＧ化
反応」を参照）。 PEGylation kinetics and product species:
Analytical C-IEX HPLC (see “PEGylation Reaction”) to determine the distribution of molecular species in the reaction mixture.

ｄ）結果
ｍＰＥＧアセタールをｍＰＥＧアルデヒドへ繰り返し活性化したときの同一性は、以下によって立証可能であると考えられる：
使用されたｍＰＥＧアセタール量に対して活性化後のｍＰＥＧアルデヒドの収量は平均８５±７％。
両サンプルについて繰り返し１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定したところ、ＰＥＧ骨格の吸収は３．５１ｐｐｍであった。ｍＰＥＧアセタールは４．６ｐｐｍにアセタール・トリプレット（−ＣＨ２−ＣＨ−（Ｏ−Ｃ２Ｈ５）２）、１．１ｐｐｍにエチル・トリプレット（−ＣＨ２−ＣＨ３）の吸収を示す。活性化後、アセタール・トリプレットのシグナルはもはや検出できなかったが、アルデヒド・シングレットが９．７ｐｐｍに出現した。
同等のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート最大収量ならびに同等の生成物形成速度（以下を参照）。
活性化されたｍＰＥＧアルデヒドは、遮光し、密封チューブ中で、Ｎ２雰囲気下−２０℃で保存された場合、少なくとも１２５日間安定のようである（図２を参照）。 d) Results The identity when mPEG acetal is repeatedly activated to mPEG aldehydes can be verified by the following:
The average yield of mPEG aldehyde after activation relative to the amount of mPEG acetal used averaged 85 ± 7%.
When 1 H-NMR spectrum was measured repeatedly for both samples, the absorption of the PEG skeleton was 3.51 ppm. mPEG acetal shows absorption of acetal triplet (—CH 2 —CH— (O—C 2 H 5 ) 2 ) at 4.6 ppm and ethyl triplet (—CH 2 —CH 3 ) at 1.1 ppm. After activation, the acetal triplet signal could no longer be detected, but the aldehyde singlet appeared at 9.7 ppm.
Equivalent diPEGylated G-CSF conjugate maximum yield as well as equivalent product formation rate (see below).
Activated mPEG aldehyde appears to be stable for at least 125 days when stored in a sealed tube at -20 ° C. under N 2 atmosphere in a sealed tube (see FIG. 2).

２．限外濾過濃縮
ＰＥＧ化反応に先立って、希釈されたＧ−ＣＳＦサンプルを限外濾過によって濃縮した。最終サンプル濃度に応じて、カットオフ分子量１０ｋＤａのＹＭ１０メンブレンを装備したアミコンセル（５０ｍｌ）またはｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）チューブ（２ｍｌ）を使用して、Ｇ−ＣＳＦをおよそ４−８ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。 2. Ultrafiltration concentration Prior to the PEGylation reaction, diluted G-CSF samples were concentrated by ultrafiltration. Depending on the final sample concentration, G-CSF was concentrated to approximately 4-8 mg / ml using Amicon cells (50 ml) or centricon® tubes (2 ml) equipped with a YM10 membrane with a cutoff molecular weight of 10 kDa.

限外濾過後の回収率は使用したタンパク質の量に関して平均で８９±５％であった。
ＵＶ２８０ｎｍにおける吸収
Ｇ−ＣＳＦについては、２８０ｎｍで０．８６±０．０１５の吸光度は１ｍｇ／ｍｌのタンパク質に相当する。ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートについてタンパク質濃度の測定値を計算するために、同じモル吸光係数を適用した。 The recovery after ultrafiltration averaged 89 ± 5% with respect to the amount of protein used.
Absorption at UV 280 nm For G-CSF, an absorbance of 0.86 ± 0.015 at 280 nm corresponds to 1 mg / ml protein. The same molar extinction coefficient was applied to calculate protein concentration measurements for PEGylated G-CSF conjugates.

３．ＰＥＧ化反応
ａ）反応
２５ｍｇの固体のｍＰＥＧアルデヒド（分子量１２ｋＤａ）を、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中３．２ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦに加え、Ｇ−ＣＳＦとｍＰＥＧアルデヒドとのモル比を１：２５とした。２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、反応混合物を２〜８℃でさらに数時間インキュベートした。８ＮのＨＣｌで酸性化して反応を停止させた。 3. PEGylation reaction a) Reaction 25 mg of solid mPEG aldehyde (molecular weight 12 kDa) is added to 3.2 mg / ml G-CSF in 100 mM phosphate buffer (pH 7.5) and the molar ratio of G-CSF to mPEG aldehyde Was 1:25. 20 mM sodium cyanoborohydride was added and the reaction mixture was further incubated at 2-8 ° C. for several hours. The reaction was stopped by acidification with 8N HCl.

ｂ）分析論
分析用陽イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（Ｃ−ＩＥＸ ＨＰＬＣ）
ＰＥＧ Ｇ−ＣＳＦ反応混合物中の分子種の分布（モノ−、ジ−、トリ−、テトラ−）を、Ｃ−ＩＥＸ ＨＰＬＣによって測定した。したがって、停止させた反応混合物を１５ｍＭの酢酸バッファー（ｐＨ４．２）で３倍に希釈し、ダイオネックス（Dionex）システムまたは島津製作所ＨＰＬＣシステムに装備されたトーソーハース・バイオサイエンス（Tosohaas Bioscience ）製のＳＰ−５ＰＷ充填カラム（７５×７．５ｍｍ、粒径１０μｍ、カラム体積３．３ｍｌ）に通した。 b) Analytical Analytical Cation Exchange High Performance Liquid Chromatography (C-IEX HPLC)
The distribution of molecular species (mono-, di-, tri-, tetra-) in the PEG G-CSF reaction mixture was measured by C-IEX HPLC. Therefore, the stopped reaction mixture was diluted 3-fold with 15 mM acetate buffer (pH 4.2) and manufactured by Tosohaas Bioscience equipped with a Dionex system or a Shimadzu HPLC system. It was passed through a SP-5PW packed column (75 × 7.5 mm, particle size 10 μm, column volume 3.3 ml).

カラムは１５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．２で平衡化させた。流量は０．４ｍｌ／分とし、一般に２００μｇのタンパク質を注入した。カラムは室温で使用したが、サンプルはオートインジェクタ中で５℃に維持した。   The column was equilibrated with 15 mM NaAc, pH 4.2. The flow rate was 0.4 ml / min and generally 200 μg of protein was injected. The column was used at room temperature, but the sample was maintained at 5 ° C. in an autoinjector.

ＰＥＧ化状態の異なる分子種の同定については、分析用Ｃ−ＩＥＸの溶出ピークを質量分析した。
質量分析
Ｃ−ＩＥＸ ＨＰＬＣピークの質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間型）によって、各ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートを溶出ピークの保持時間に割り当てることができた。 For identification of molecular species having different PEGylation states, the elution peak of analytical C-IEX was subjected to mass spectrometry.
Mass Spectrometry By mass analysis of C-IEX HPLC peaks (MALDI-TOF, matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight), each PEGylated G-CSF conjugate could be assigned to the retention time of the elution peak.

ｃ）結果
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって決定された単一ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ種の質量は、アミノ酸配列およびＰＥＧ部分に基づいた事前の推定質量と一致した（表１を参照）。 c) Results The mass of the single PEGylated G-CSF species determined by MALDI-TOF was consistent with the previous estimated mass based on amino acid sequence and PEG moiety (see Table 1).

Figure 2008535793
質量分析の情報から、保持時間を対応するＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子種に割り当てることができた。分析Ｃ−ＩＥＸにより、保持時間に応じて１つのモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ、３つのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォーム、４つのトリＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォーム、および１つのテトラＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを分離することができた。
Figure 2008535793
 From the information of mass spectrometry, the retention time could be assigned to the corresponding PEGylated G-CSF molecular species. Analytical C-IEX showed 1 monoPEGylated G-CSF, 3 diPEGylated G-CSF isoforms, 4 triPEGylated G-CSF isoforms, and 1 tetraPEGylated G- depending on retention time CSF could be separated.

一般に、組換えヒトＧ−ＣＳＦとｍＰＥＧアルデヒドをモル比１：２５として用いてＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートに変換させると、１８ｈ〜４２ｈインキュベーションの反応時間で主としてジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが生成され、約３０ｈのインキュベーション時間で最大収量に達する（図３ａを参照）。   In general, conversion to PEGylated G-CSF conjugates using recombinant human G-CSF and mPEG aldehyde at a molar ratio of 1:25 mainly produces diPEGylated G-CSF with reaction times of 18h-42h incubation. The maximum yield is reached with an incubation time of about 30 h (see FIG. 3a).

ｄ）プロセス・パラメータの最適化
ｉ）いくつかのプロセス・パラメータの影響
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの生産が最大となるインキュベーション時間（約３０ｈ）を特定したところで、他のパラメータ（ｉ）リン酸バッファーの濃度、（ｉｉ）リン酸バッファーのｐＨ、（ｉｉｉ）還元剤シアノボロハイドライドの濃度、（ｉｖ）生成物の収量に対するタンパク質濃度およびタンパク質とＰＥＧとのモル比、ならびに（ｖ）撹拌速度、の影響を調べた。 d) Optimization of process parameters i) Effect of some process parameters Once the incubation time (about 30 h) at which diPEGylated G-CSF production is maximal has been identified, other parameters (i) phosphate buffer (Iii) phosphate buffer pH, (iii) reducing agent cyanoborohydride concentration, (iv) protein concentration and protein to PEG molar ratio to product yield, and (v) stirring rate The effect was investigated.

同様の反応速度プロファイルおよび最大生成物収量が達成されたのは：
バッファー濃度が５０ｍＭ〜１５０ｍＭリン酸（ｐＨ７．５）のとき、
１００ｍＭリン酸バッファーでｐＨ範囲がｐＨ６．９〜７．８のとき、
還元剤の濃度が≧２０ｍＭのとき；対照的に、１０ｍＭのような低濃度ではジＰＥＧ化Ｇ
−ＣＳＦの形成が減速する（４２ｈで最大生成物収量）、
最大で５．７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度および対応するモル比のとき（タンパク質濃度のさらなる増加は、タンパク質の凝集の危険性がありうるので回避した。ＰＥＧ濃度を増加させても最大生成物収量は向上しない。）
≦７００ｒｐｍの速度で旋回撹拌するとき
であった。 Similar reaction rate profiles and maximum product yields were achieved:
When the buffer concentration is 50 mM to 150 mM phosphate (pH 7.5),
When the pH range is 6.9 to 7.8 with 100 mM phosphate buffer,
When the concentration of reducing agent is ≧ 20 mM; in contrast, at low concentrations such as 10 mM, diPEGylated G
-CSF formation slows down (maximum product yield in 42 h),
At protein concentrations up to 5.7 mg / ml and corresponding molar ratios (further increases in protein concentration were avoided because there could be a risk of protein aggregation. Increasing the PEG concentration did not increase the maximum product yield. Not improved.)
It was when swirling and stirring at a speed of ≦ 700 rpm.

ｉｉ）モル比の影響
様々な量の固体のｍＰＥＧアルデヒド（１５〜３８ｍｇ）を、様々なタンパク質濃度（２．４ｍｇ／ｍｌ、３．２ｍｇ／ｍｌ、５．７ｍｇ／ｍｌ）に対して加え、モル比を約１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０および１：５０（タンパク質：ＰＥＧ）とした。反応は実施例３ａに記述されるように低温（５℃）で実施し、サンプルは実施例３ｂに従って分析した。 ii) Effect of molar ratio Different amounts of solid mPEG aldehyde (15-38 mg) were added for different protein concentrations (2.4 mg / ml, 3.2 mg / ml, 5.7 mg / ml) The ratios were approximately 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30 and 1:50 (protein: PEG). The reaction was performed at low temperature (5 ° C.) as described in Example 3a and the sample was analyzed according to Example 3b.

所与のタンパク質濃度、例えば２．４、３．２または５．７ｍｇ／ｍｌでは、モル比で表現されるＰＥＧ量を増加させると、主としてジＰＥＧ化を達成するための総インキュベーション時間が縮小される（図３ｂを参照）。すべてのタンパク質濃度について、ＰＥＧ量を２倍にすると、ジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームを含む最大のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートを生産するためのインキュベーション時間が、少なくとも２分の１に縮小されることが示されている。   For a given protein concentration, for example 2.4, 3.2 or 5.7 mg / ml, increasing the amount of PEG expressed in molar ratios reduces the total incubation time mainly to achieve diPEGylation. (See FIG. 3b). For all protein concentrations, doubling the amount of PEG results in an incubation time to produce the largest diPEGylated G-CSF conjugate, including diPEGylated and di'PEGylated G-CSF isoforms, of at least 2 It is shown to be reduced by a factor of one.

タンパク質とポリマーとのモル比が１：３０までのとき、ｍＰＥＧアルデヒド分子とタンパク質内のアミノ基の数との化学量論比が６：１である場合、１８時間インキュベーションの後に主としてジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートが生産されるが、Ｇ−ＣＳＦ：ＰＥＧのモル比が１：５０で化学量論比がより高い１０：１では、２．４ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦでモル比Ｇ−ＣＳＦ：ＰＥＧが１：５０の条件においてみられるように、反応および最大のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート生成物形成は１８ｈ未満のインキュベーションで生じる。   When the molar ratio of protein to polymer is up to 1:30 and the stoichiometric ratio of mPEG aldehyde molecule to the number of amino groups in the protein is 6: 1, it is mainly diPEGylated G after 18 hours incubation. -CSF conjugates are produced, but at a molar ratio of G-CSF: PEG of 1:50 and a higher stoichiometric ratio of 10: 1, a molar ratio of G-CSF with 2.4 mg / ml G-CSF The reaction and maximal diPEGylated G-CSF conjugate product formation occurs in less than 18 h incubation, as seen in the 1:50 condition: PEG.

しかしながら、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの最大合成収量（４０％、図３ｃを参照）は、ＰＥＧ分子とタンパク質内のアミノ基の数との化学量論比を変えても影響を受けない。   However, the maximum synthetic yield of diPEGylated G-CSF conjugate (40%, see FIG. 3c) is not affected by changing the stoichiometric ratio between the PEG molecule and the number of amino groups in the protein.

ｉｉｉ）温度の影響
タンパク質：ＰＥＧの化学量論比に加えて、温度は、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物生産のためのインキュベーション時間にさらなる影響を及ぼすものと思われる。ジＰＥＧ化生成物収量（ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォーム混合物）および生成物形成の反応速度に対する温度の影響を試験するために、２つの反応条件（５．７ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、ＰＥＧとのモル比は１：１０または１：２０のいずれか）について２つの異なる温度（５℃および２２℃）で試験を実施し、本発明に従って低温（５℃）および高温（２２℃）の影響を比較分析した。 iii) Effect of temperature In addition to the protein: PEG stoichiometry, temperature appears to have an additional effect on the incubation time for diPEGylated G-CSF product production. To test the effect of temperature on diPEGylated product yield (diPEGylated G-CSF isoform mixture) and product formation reaction rate, two reaction conditions (5.7 mg / ml G-CSF, PEG Was tested at two different temperatures (5 ° C. and 22 ° C.) for either 1:10 or 1:20 molar ratio, and the effect of low temperature (5 ° C.) and high temperature (22 ° C.) according to the present invention Were comparatively analyzed.

温度をおよそ＋２０℃増加させるとＰＥＧ化反応は２倍に加速し、チャモウ（Chamow）ら（１９９４）の結果を確認している。
ＰＥＧの総量を増加させると、ジＰＥＧ化を主とするためのインキュベーション時間が縮小される（図３ｄを参照）。ＰＥＧ量を２倍（１８ｍｇの代わりに３６ｍｇ）にすることにより、低温（５℃）でも高温（２２℃）でも生成物の形成が最大となるインキュベーション時間は２分の１（４２ｈ→〜２１ｈ）に縮小される。 Increasing the temperature by approximately + 20 ° C accelerates the PEGylation reaction by a factor of 2, confirming the results of Chamow et al. (1994).
Increasing the total amount of PEG reduces the incubation time for mainly diPEGylation (see Figure 3d). By doubling the amount of PEG (36 mg instead of 18 mg), the incubation time that maximizes product formation at low (5 ° C.) or high (22 ° C.) time is halved (42 h → ˜21 h) Reduced to

驚いたことに、本発明者らは、反応物中の所与のタンパク質濃度に対するＰＥＧ量を少
なくとも２倍にし、その結果選択された温度とは関係なくＰＥＧ結合に利用可能なアミノ基（アミノおよびε）に対してＰＥＧ分子を少なくとも２−１０倍過剰とすることにより、優先的にジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートを生産するためのＰＥＧ化反応をさらに加速させることが可能であることを見出した。 Surprisingly, we have at least doubled the amount of PEG for a given protein concentration in the reaction, so that the amino groups (amino and amino) available for PEG attachment regardless of the selected temperature. It has been found that a PEGylation reaction to preferentially produce a diPEGylated protein conjugate can be further accelerated by making the PEG molecule at least a 2-10 fold excess over ε).

一般に、Ｇ−ＣＳＦの選択的ジ−ＰＥＧ化を促進するためには、（ｉ）反応のｐＨは、（標的タンパク質のε−アミノ基の反応性の差異を利用するために）中性付近とすべきであり、（ｉｉ）ＰＥＧは、標的タンパク質中の利用可能なα−およびε−アミノ基に対して少なくとも２−１０倍過剰に加えるべきであり、これはＧ−ＣＳＦの場合にはＧ−ＣＳＦ：ＰＥＧのモル比がほぼ１：１０〜１：５０であることに相当する。   In general, to facilitate selective di-PEGylation of G-CSF, (i) the pH of the reaction is near neutral (to take advantage of the reactivity of the target protein's ε-amino group) and (Ii) PEG should be added at least 2-10 fold in excess of the available α- and ε-amino groups in the target protein, which in the case of G-CSF is G -Corresponds to a molar ratio of CSF: PEG of approximately 1:10 to 1:50.

ｅ）反応の再現性
上記に列挙した条件下で実施された５回の単一ＰＥＧ化反応について、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して分析した。これにより、本発明によるＧ−ＣＳＦ ＰＥＧ化反応の再現性が実証された。 e) Reaction reproducibility Five single PEGylation reactions carried out under the conditions listed above were analyzed using cation exchange chromatography. This demonstrated the reproducibility of the G-CSF PEGylation reaction according to the present invention.

３０ｈインキュベーション時点のＰＥＧ Ｇ−ＣＳＦ反応混合物中の平均的なアイソフォーム組成を決定した（表２を参照）。   The average isoform composition in the PEG G-CSF reaction mixture at 30 h incubation time was determined (see Table 2).

Figure 2008535793
４．再ＰＥＧ化およびその再現性
工程歩留まりを改善するために、分取用Ｃ−ＩＥＸクロマトグラフィー（実施例５を参照）からの残余物プールの再ＰＥＧ化を、追加処理ステップとして実施した。
Figure 2008535793
 4). Re-PEGylation and its reproducibility To improve process yield, re-PEGylation of the residual pool from preparative C-IEX chromatography (see Example 5) was performed as an additional processing step.

この再ＰＥＧ化ステップのために、微量の本発明の生成物を含むすべての分子種を含んだ、分取用Ｃ−ＩＥＸクロマトグラフィー（図４を参照）の残余物プールを回収し、限外濾過／透析濾過によって脱塩かつ濃縮し、ＰＥＧ修飾Ｇ−ＣＳＦ（３．２ｍｇ／ｍｌ）を用いた以外は、再び前記ＰＥＧ化反応（実施例３を参照）に供した。   For this rePEGylation step, a preparative C-IEX chromatography residue pool (see FIG. 4) containing all molecular species including trace amounts of the product of the present invention was recovered and The solution was desalted and concentrated by filtration / diafiltration, and again subjected to the PEGylation reaction (see Example 3) except that PEG-modified G-CSF (3.2 mg / ml) was used.

様々なインキュベーション時間での分子種の分布を分析したところ、ＰＥＧ化時間を１８ｈまで短縮するとジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの収量は平均で４％減少するが、再循環化のための残余物プール内のモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの割合が平均で１５％増加することが観察された。これは、再ＰＥＧ化ステップにおける収量を増加させ、全体としては使用されるタンパク質のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物収量の著しい増加に結びつくものと予想された。   Analysis of the distribution of molecular species at various incubation times revealed that yields of diPEGylated G-CSF conjugates decreased on average by 4% when the PEGylation time was reduced to 18 h, but there was a residue for recycling. It was observed that the proportion of monoPEGylated G-CSF in the pool increased on average by 15%. This was expected to increase the yield in the re-PEGylation step and overall lead to a significant increase in the yield of the diPEGylated G-CSF product of the protein used.

各１８時間で２回のＰＥＧ化サイクル後の反応混合物中の平均ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート収量を決定した（表３を参照）。   The average diPEGylated G-CSF conjugate yield in the reaction mixture after 2 PEGylation cycles at 18 hours each was determined (see Table 3).

Figure 2008535793
５．分取用Ｃ−ＩＥＸによる精製
ａ）クロマトグラフィー
最初のＰＥＧ化反応後、または再ＰＥＧ化の後での他の分子種からのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの分離は、下記ステップ：
ＳＰ−５ＰＷゲル材料（ゲル材料１０．６ｍｌ、粒径２０μｍ、ドイツ連邦共和国所在のトーソーハース・バイオサイエンス・ゲーエムベーハー（Tosohaas Bioscience GmbH））を充填したＥＣＯ １５／２００カラム（ドイツ連邦共和国所在のクロンラブ・ゲーエムベーハー（Kronlab GmbH））；
１カラム体積の１５ｍＭ ＮａＡｃバッファー、ｐＨ４．２（バッファーＡ）でカラムを平衡化；
タンパク質を装荷（６．１ｍｇの反応混合物）；
０．２ＣＶのバッファーＡでカラムを洗浄；
およそ１７カラム体積中０〜３５％の１Ｍ ＮａＣｌバッファーＡ溶液による直線勾配溶出；および／または
２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでの溶出液のモニタリングとフラクション３ｍｌの回収
を含む陽イオン交換クロマトグラフィーによって行われた。
Figure 2008535793
 5. Purification by preparative C-IEX a) Chromatography Separation of diPEGylated G-CSF conjugate from other molecular species after initial PEGylation reaction or after rePEGylation involves the following steps:
ECO 15/200 column (Clonlab, Germany) packed with SP-5PW gel material (gel material 10.6 ml, particle size 20 μm, Tosohaas Bioscience GmbH, Germany) Kronlab GmbH);
Equilibrate the column with 1 column volume of 15 mM NaAc buffer, pH 4.2 (buffer A);
Loading protein (6.1 mg reaction mixture);
Wash the column with 0.2 CV buffer A;
Linear gradient elution with 0-35% 1M NaCl buffer A solution in approximately 17 column volumes; and / or cation exchange chromatography including monitoring of eluate at 214 nm and 280 nm and recovery of 3 ml fractions.

直線流量は、タンパク質の装荷を１７ｃｍ／ｈで実施したことを除きすべてのクロマトグラフィー・ステップについておよそ６８ｃｍ／ｈとした。
ｂ）分析論
回収した各フラクション中のＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートのタンパク質濃度を決定するための、ＵＶ２８０ｎｍでの吸収（上記参照）
各溶出ピーク内の対応するＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子種およびアイソフォームを同定するための、分析用陽イオン交換高性能液体クロマトグラフィー（Ｃ−ＩＥＸ ＨＰＬＣ）（上記参照）。 The linear flow rate was approximately 68 cm / h for all chromatographic steps except that the protein loading was performed at 17 cm / h.
b) Analytical absorption at 280 nm UV (see above) to determine protein concentration of PEGylated G-CSF conjugate in each fraction collected
Analytical cation exchange high performance liquid chromatography (C-IEX HPLC) to identify the corresponding PEGylated G-CSF molecular species and isoform within each elution peak (see above).

ｃ）結果
直線勾配溶出により６つのピークが得られた。該ピークを図４に示し、また表４に概要を示す。 c) Results Six peaks were obtained by linear gradient elution. The peaks are shown in FIG. 4 and summarized in Table 4.

Figure 2008535793
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦについては、１０種の可能なアイソフォームのうちの３つを同定することができた。２つのアイソフォーム、ジおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは、主要な単一ピークとして溶出された。第三の微量のアイソフォームはトリＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームとともに溶出する。
Figure 2008535793
 For diPEGylated G-CSF, three of the ten possible isoforms could be identified. The two isoforms, di and di'PEGylated G-CSF, eluted as the main single peak. The third minor isoform elutes with the triPEGylated G-CSF isoform.

ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ調製物の生成物を正確に定義するために、アイソフォームの数を低く維持して、２つのアイソフォームすなわちジ−体（ピーク２）およびジ’−体（ピーク３）からなる本発明のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物を定義した。これらのアイソフォームのＰＥＧ結合部位は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ナノＬＣ ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳおよびエドマン法の配列決定を組み合わせて使用することにより、Ｎ末端基とリジン１７またはＮ末端基とリジン３５にそれぞれ位置することが特定された（「生成物の特徴解析」を参照）。   In order to accurately define the product of the diPEGylated G-CSF preparation, the number of isoforms was kept low and the two isoforms, di-form (peak 2) and di'-form (peak 3) A diPEGylated G-CSF product of the invention consisting of The PEG attachment sites of these isoforms are linked to N-terminal group and lysine 17 or N-terminal group and lysine 35, respectively, using a combination of MALDI-MS / Nano LC ESI-MS / MS and Edman sequencing. Located (see “Product Characterization”).

定義されたジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物は、少なくとも９０％の、ジおよびジ’アイソフォームをおよそ０．７６（ジ）対１（ジ’）の比で含むジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ種を含有しており、かつ極めて純度が高いものであった（表５を参照）。   The defined diPEGylated G-CSF product contains at least 90% diPEGylated G-CSF species containing di and di 'isoforms in a ratio of approximately 0.76 (di) to 1 (di'). It contained and was extremely high in purity (see Table 5).

Figure 2008535793
６．生成物の特徴解析
単離されたジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物は、２つの主要な（ジおよびジ’）ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームで構成されており、該アイソフォームは活性を有する主要なジＰＥＧ化生成物に相当する。
Figure 2008535793
 6). Product characterization The isolated diPEGylated G-CSF product is composed of two major (di and di ') diPEGylated G-CSF isoforms, which are active Corresponds to the main diPEGylated product.

ａ）組成および純度
最終ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物の組成および純度について、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。 a) Composition and purity The composition and purity of the final diPEGylated G-CSF product was analyzed by cation exchange chromatography and size exclusion chromatography.

最終ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物の組成をコントロールするＣ−ＩＥＸ ＨＰＬＣ
カラム：トーソー ＳＰ ５ＰＷ １０μｍ ７５×７．５ｍｍ（３．３１ｍｌ）
流量：０．４ｍｌ／分
バッファーＡ：１５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．２
バッファーＢ：１５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．２；１．０００ｍＭ ＮａＣｌ
サンプル：５０μｇ
勾配：直線、１７カラム体積中０〜４５％、０．５ＣＶ中４５〜１００％
ＵＶモニタ：２１４ｎｍ
結果：
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物の異性体組成をＣ−ＩＥＸ ＨＰＬＣによって分析したところ（図５を参照）、該組成は定義された生成物の規格（表６を参照）内にあった。 C-IEX HPLC to control the composition of the final diPEGylated G-CSF product
Column: Tosoh SP 5PW 10 μm 75 × 7.5 mm (3.31 ml)
Flow rate: 0.4 ml / min Buffer A: 15 mM NaAc, pH 4.2
Buffer B: 15 mM NaAc, pH 4.2; 1.000 mM NaCl
Sample: 50 μg
Gradient: linear, 0-45% in 17 column volume, 45-100% in 0.5 CV
UV monitor: 214 nm
result:
The isomeric composition of the diPEGylated G-CSF product was analyzed by C-IEX HPLC (see FIG. 5), and the composition was within the defined product specifications (see Table 6).

Figure 2008535793
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの非特異的な凝集をコントロールするＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析
カラム：ＴＳＫ Ｇ ３０００ ＳＷＸＬ ３００×７．８ｍｍ、ＴＯＳＯＨ ＢＩＯＳＥＰ
バッファーＡ：１００ｍＭ Ｐｉ；ｐＨ６．９
サンプル：２０μｇ
流量：０．５ｍｌ／分
勾配：アイソクラチック
実行時間：６０分
結果：
ＳＥＣ分析（図６を参照）によれば、最終生成物は、＞９０％のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦで構成され、該ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦはジおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームを一定の混合比で含んでいる。保持時間１１分と１３分との間のピークはさらに分析はしなかったが、より高度の分子凝集体である可能性が考えられた（〜１．５％、表７を参照）。
Figure 2008535793
 SEC-HPLC analysis column for controlling non-specific aggregation of diPEGylated G-CSF: TSK G 3000 SWXL 300 × 7.8 mm, TOSOH BIOSEP
Buffer A: 100 mM Pi; pH 6.9
Sample: 20 μg
Flow rate: 0.5 ml / min Gradient: Isocratic Run time: 60 minutes Results:
According to SEC analysis (see Figure 6), the final product is composed of> 90% diPEGylated G-CSF, which is di- and di'PEGylated G-CSF isoform. At a constant mixing ratio. The peak between retention times 11 and 13 minutes was not analyzed further, but was considered to be a higher molecular aggregate (~ 1.5%, see Table 7).

Figure 2008535793
ｂ）構造の一致性
構造安定性を示すためのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物の円偏光二色性（ＣＤ）測定
タンパク質修飾後の二次構造の変化を分析するために、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ最終生成物（サンプルＢ）および天然の非修飾型Ｇ−ＣＳＦ（サンプルＡ）を、円偏光二色性分光法によって分析した。ＣＤスペクトルは日本国所在のＪａｓｃｏのＪ−７２０分光偏光計を使用して、波長１８０〜２６０ｎｍで記録した。
Figure 2008535793
 b) Structural Consistency Circular Dichroism (CD) Measurement of DiPEGylated G-CSF Product to Show Structural Stability In order to analyze changes in secondary structure after protein modification, diPEGylated G -CSF end product (Sample B) and natural unmodified G-CSF (Sample A) were analyzed by circular dichroism spectroscopy. CD spectra were recorded at a wavelength of 180-260 nm using a Jasco J-720 spectropolarimeter located in Japan.

結果：
これらのスペクトル（ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよび非修飾Ｇ−ＣＳＦ）が極めて類似していることから、ＰＥＧ修飾によりＧ−ＣＳＦの二次構造は変化しないことが示される（図７を参照）。 result:
These spectra (diPEGylated G-CSF and unmodified G-CSF) are very similar, indicating that PEG modification does not change the secondary structure of G-CSF (see FIG. 7).

ｃ）ＰＥＧ結合部位の同定
ＰＥＧ結合部位を同定するために、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォーム（ジ−およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）をペプチドマッピングによって分析した。参照用のｒｐＨＰＬＣクロマトグラムを作成するために、ＰＥＧ化されていないＧ−ＣＳＦを同じように処理した。 c) Identification of PEG binding sites To identify PEG binding sites, diPEGylated G-CSF isoforms (di- and di'PEGylated G-CSF) were analyzed by peptide mapping. Non-PEGylated G-CSF was treated in the same way to generate a reference rpHPLC chromatogram.

その処理手順は、次のステップ、すなわち（ｉ）ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームの変性および還元的アルキル化による遊離ＳＨ基のキャッピング、（ｉｉ）変性ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームのキモトリプシン消化、（ｉｉｉ）ｒｐＨＰＬＣによるペプチド分離、ならびに（ｉｖ）エレクトロスプレー・タンデム質量分析およびＭＡＬＤＩ−ＭＳ／Ｎ末端配列決定の組み合わせによる配列分析、を含むものとした。   The procedure consists of the following steps: (i) capping of free SH groups by denaturation and reductive alkylation of PEGylated G-CSF isoform, (ii) chymotrypsin digestion of modified PEGylated G-CSF isoform, iii) peptide separation by rpHPLC and (iv) sequence analysis by a combination of electrospray tandem mass spectrometry and MALDI-MS / N-terminal sequencing.

（ｉ）ＳＨ基のカルボキシメチル化
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームのおよそ１ｍｇの分割試料をｓｐｅｅｄ ｖａｃ（Ｒ）によって乾燥し、６Ｍ塩酸グアニジンを含む７００μｌの０．３Ｍトリス−ＨＣＬバッファー、ｐＨ８．３中１ｍｇの濃度に再構成した。試料にヨード酢酸を加えてカルボキシメチル化し、３７℃で１時間インキュベートした。ＤＴＴを加えて反応を停止させ、次いで試料を注射用水に対して透析して脱塩し、最後に、ｓｐｅｅｄ ｖａｃで乾燥させた。 (I) Carboxymethylation of SH groups Approximately 1 mg aliquots of diPEGylated G-CSF conjugate isoforms were dried by speed vac (R) and 700 μl 0.3 M Tris-HCL buffer containing 6 M guanidine hydrochloride. Reconstituted to a concentration of 1 mg in pH 8.3. The sample was carboxymethylated by adding iodoacetic acid and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The reaction was stopped by adding DTT, then the sample was dialyzed against water for injection and desalted, and finally dried in a speed vac.

（ｉｉ）キモトリプシン消化
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームの乾燥試料を、消化用に、１ｍｌの０．１Ｍ炭酸水素アンモニウムバッファー、ｐＨ７．８中１ｍｇの濃度に再構成した。このアイソフォームを、キモトリプシンにより（酵素と基質との重量比は１：１００）３７℃で３時間消化した。 (Ii) Chymotrypsin digestion A dry sample of the diPEGylated G-CSF isoform was reconstituted for digestion to a concentration of 1 mg in 1 ml 0.1 M ammonium bicarbonate buffer, pH 7.8. This isoform was digested with chymotrypsin (enzyme to substrate weight ratio 1: 100) at 37 ° C. for 3 hours.

（ｉｉｉ）ｒｐＨＰＬＣペプチドマッピング
タンパク質消化物をＶｙｄａｃ（Ｒ）Ｃ４カラム（４．６×２５０ｍｍ、粒径５ｍ、孔径３００Å）に注入し、０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリルの直線濃度勾配（アセトニトリルを１分間に１％上昇させながら９０分間）を使用したＨＰＬＣにより、ペプチドをマッピングした。得られたペプチドを、ナノＬＣ ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳおよびＮ末端配列決定の組合せによってペプチド配列決定するために回収した。 (Iii) rpHPLC peptide mapping The protein digest was injected onto a Vydac® C4 column (4.6 × 250 mm, particle size 5 m, pore size 300 mm) and a linear gradient of acetonitrile in 0.1% TFA (acetonitrile 1 Peptides were mapped by HPLC using 90% with 1% increase in minutes). The resulting peptides were recovered for peptide sequencing by a combination of nano LC ESI MS / MS and N-terminal sequencing.

（ｉｖ）ナノＬＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ：
単一のアイソフォームの完全消化物ならびに単離されたＰＥＧ化ペプチドを、ＥＳＩ ＭＳ／ＭＳと組み合わせたナノＬＣによって分析し、ＰＥＧ化ペプチドのアミノ酸配列およびＰＥＧ結合部位を決定した。 (Iv) Nano LC-ESI / MS / MS:
Complete digests of single isoforms as well as isolated PEGylated peptides were analyzed by nanoLC in combination with ESI MS / MS to determine the amino acid sequence and PEG binding site of the PEGylated peptide.

（ｖ）ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／Ｎ末端配列決定
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームおよび非ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの分解物のｒｐＨＰＬＣクロマトグラムの比較から、２つの新しいピークの出現が明らかとなった。第１に、この新しいピークの質量をＭＡＬＤＩ−ＭＳによって測定し、第２に、該ピークの同定のためにＮ末端配列を決定した。 (V) MALDI-MS / N-terminal sequencing Comparison of rpHPLC chromatograms of diPEGylated G-CSF isoforms and non-PEGylated G-CSF degradation products revealed the appearance of two new peaks. First, the mass of this new peak was measured by MALDI-MS and second, the N-terminal sequence was determined for identification of the peak.

結果：
想定されるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームのキモトリプシン消化シミュレーションによれば、３種の潜在的ＰＥＧ化ペプチドが予想可能であった。実験では、２つのジＰＥＧ化体アイソフォーム（ジおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）各々のキモトリプシン消化物は、２つのＰＥＧ化ペプチドに帰着した。１つのＰＥＧ化ペプチドについては、ナノＬＣ ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳによるペプチドマス配列決定から、Ｎ末端メチオニンのα−アミノ基にＰＥＧが結合しているアミノ酸１〜１３位の配列：Ｍ−Ｔ−Ｐ−Ｌ−Ｇ−Ｐ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｐ−Ｑ−Ｓ−Ｆ（ＭＷ １４７０ ｍ／ｚ）が同定された。 result:
According to the chymotrypsin digestion simulation of the assumed diPEGylated G-CSF isoform, three potential PEGylated peptides were predictable. In the experiment, a chymotrypsin digest of each of the two diPEGylated isoforms (di and di'PEGylated G-CSF) resulted in two PEGylated peptides. For one PEGylated peptide, from peptide mass sequencing by nano LC ESI-MS / MS, the sequence of amino acids 1 to 13 where PEG is bonded to the α-amino group of the N-terminal methionine: MTP -LGPSASSLSLPQSF (MW 1470 m / z) was identified.

アイソフォーム当たりのもう１つのＰＥＧ結合部位の同定は、この技法では失敗に終わった。したがって、選択されたｒｐＨＰＬＣのフラクションを質量分析し、続いてＮ末端アミノ酸配列分析に供した。   The identification of another PEG attachment site per isoform has failed with this technique. Therefore, selected rpHPLC fractions were mass analyzed followed by N-terminal amino acid sequence analysis.

ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームについては、Ｎ末端配列分析（２２サイクル）により、リジン１７のε−アミノ基にＰＥＧが結合しているアミノ酸１４〜４０位の配列：ＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹが決定された。 For the diPEGylated G-CSF isoform, N-terminal sequence analysis (22 cycles) determined the sequence of amino acids 14-40 where PEG is attached to the ε-amino group of lysine 17: LL K CLEQVRKIQGDGAALQEKLCATY .

ジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームについては、Ｎ末端配列分析（２２サイクル）により、リジン３５のε−アミノ基にＰＥＧが結合しているアミノ酸１４〜４０位の配列：ＬＬＫＣＬＥＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥＫＬＣＡＴＹが決定された。 For the di'PEGylated G-CSF isoform, N-terminal sequence analysis (22 cycles) determined the amino acid 14-40 sequence with PEG attached to the ε-amino group of lysine 35: LLKCLEQVRKIQGDGAALQE K LCATY It was.

従って、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームはＮ末端基およびリジン１７においてジＰＥＧ化され、ジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームはＮ末端基およびリジン３５においてジＰＥＧ化されている。   Thus, the diPEGylated G-CSF isoform is diPEGylated at the N-terminal group and lysine 17, and the di'PEGylated G-CSF isoform is diPEGylated at the N-terminal group and lysine 35.

ｄ）生物活性
ｉ）ジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの混合物からなるジＰＥ
Ｇ化Ｇ−ＣＳＦ生成物の生物活性
本発明によるジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームの混合物からなるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物をインビボで試験し、非修飾型Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））に対し活性が向上していることを示し、かつその生物活性を市販のモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ））と比較した。 d) Biological activity i) DiPE consisting of a mixture of diPEGylated and di'PEGylated G-CSF conjugate
Biological Activity of Gated G-CSF Products DiPEGylated G-CSF products consisting of a mixture of diPEGylated and di'PEGylated G-CSF conjugate isoforms according to the present invention were tested in vivo and unmodified The activity against G-CSF (Neupogen®) was shown to be improved, and its biological activity was compared to commercially available mono-PEGylated G-CSF (Neulasta®).

このインビボ試験は、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ）およびＮｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）とジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物との、オープンかつ無作為、並行群間の、単回用量での生物学的同等性（biocomparability）試験であった。同試験はオスのラットに０．１ｍｇ／ｋｇの皮下注射を行うことにより実行された。１つの時点につき１群当たり６匹の動物から採血した。血清試料は、該試料を採取したのと同じ日に完全な血球数測定を実施した。平均白血球数および好中球数が計算された。   This in vivo study is a single-dose biocomparability study between open, random, parallel groups of Neupogen® and Neulasta® with diPEGylated G-CSF products. Met. The study was performed by injecting 0.1 mg / kg subcutaneously into male rats. Blood was drawn from 6 animals per group per time point. Serum samples were subjected to a complete blood count on the same day that the samples were collected. Average white blood cell counts and neutrophil counts were calculated.

結果：
ジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームの混合物を含むジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物は、非修飾型Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））と比較して、ＷＢＣおよび好中球の数が多く、ＷＢＣおよび好中球の応答性がより長く保持された（図８および図９を参照）。 result:
DiPEGylated G-CSF products, including a mixture of diPEGylated and di'PEGylated G-CSF conjugate isoforms, have a higher WBC and favorable compared to unmodified G-CSF (Neupogen®). The number of neutrophils was large, and WBC and neutrophil responsiveness was retained longer (see FIGS. 8 and 9).

Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）との比較では、本発明によるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物は、少なくとも生物学的に類似しており（biosimilar）、最大のＷＢＣおよび好中球数がわずかに高いことから恐らくは潜在的により良いものであった（図８および図９を参照）。   Compared to Neulasta®, the diPEGylated G-CSF product according to the present invention is probably at least biosimilar, with a slightly higher maximum WBC and slightly higher neutrophil count. Potentially better (see FIGS. 8 and 9).

ｉｉ）２つのアイソフォーム、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの生物活性
ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成混合物の全体的な生物活性に対する個々の単一のアイソフォーム（ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）の寄与を示すために、アイソフォームを陽イオン交換クロマトグラフィーによって均質に精製した。各アイソフォーム生成物（ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）の純度および組成は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび陽イオン交換ＨＰＬＣによって分析した。 ii) Biological activity of two isoforms, diPEGylated G-CSF and di'PEGylated G-CSF Individual single isoforms (diPEGylated) for the overall biological activity of the diPEGylated G-CSF product mixture To show the contribution of G-CSF and di'PEGylated G-CSF), isoforms were purified to homogeneity by cation exchange chromatography. The purity and composition of each isoform product (diPEGylated G-CSF and di'PEGylated G-CSF) was analyzed by size exclusion chromatography and cation exchange HPLC.

結果：
確定された単一アイソフォーム生成物（ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ）は、それぞれのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームを少なくとも９５％含んでいた（表８を参照）。 result:
The confirmed single isoform products (diPEGylated G-CSF and di'PEGylated G-CSF) contained at least 95% of each diPEGylated G-CSF conjugate isoform (Table 8). See).

Figure 2008535793
単一アイソフォーム生成物、ジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート生成物、および実施例５に記述されるような両方のアイソフォームを含むジＰＥＧ化Ｇ−
ＣＳＦコンジュゲート生成混合物をインビボで試験して、相互に生物活性を比較した。
Figure 2008535793
 A single isoform product, a diPEGylated and di'PEGylated G-CSF conjugate product, and a diPEGylated G- containing both isoforms as described in Example 5
CSF conjugate product mixtures were tested in vivo and compared to each other for biological activity.

このインビボ試験は、両アイソフォームの混合物であって本発明により定義された生成物としてのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート混合物と、単一アイソフォーム生成物であるジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートとについての、オープンかつ無作為、並行群間の、単回用量での生物学的同等性試験であった。このインビボ試験は、前記生成物各々をオスのラットに０．１ｍｇ／ｋｇ皮下注射することにより実施した。１つの時点につき１群当たり１２匹の動物から採血した。血清試料は、該試料を採取したのと同じ日に完全な血球数測定を実施した。平均白血球数および好中球数が計算された。   This in vivo test shows the diPEGylated G-CSF conjugate mixture as a mixture of both isoforms as defined by the present invention and the single isoform product diPEGylated and di'PEGylated. It was an open, random, parallel group bioequivalence study with the G-CSF conjugate in a single dose. This in vivo study was performed by injecting 0.1 mg / kg subcutaneously each of the products into male rats. Blood was drawn from 12 animals per group per time point. Serum samples were subjected to a complete blood count on the same day that the samples were collected. Average white blood cell counts and neutrophil counts were calculated.

結果：
両アイソフォームすなわちジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦは、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成混合物と比較して同等の高いＷＢＣ数および好中球数を生じ、かつ同様に保持されたＷＢＣおよび好中球の応答性を示した（図１０および図１１を参照）。両アイソフォームは同等の生物活性を有し、従って、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成混合物の全体的な生物活性に均等に寄与している。この観測結果は、アリトミ（Aritomi ）ら（Nature、１９９９年、第４０１巻、ｐ．７１３−７１７）およびヤング（Young ）ら（Protein Science 、１９９７年、第６巻、ｐ．１２２８−１２３６）によって示唆されるような、Ｇ−ＣＳＦのリジン３５のＰＥＧ修飾と比較してＧ−ＣＳＦのリジン１７のＰＥＧ修飾はそのアイソフォームの生物活性を低減するだろうという仮説とは大きく異なるものである。 result:
Both isoforms, i.e. diPEGylated G-CSF and di'PEGylated G-CSF, produce comparable and retained WBC and neutrophil counts compared to the diPEGylated G-CSF product mixture. WBC and neutrophil responsiveness were shown (see FIG. 10 and FIG. 11). Both isoforms have comparable biological activity and thus contribute equally to the overall biological activity of the diPEGylated G-CSF product mixture. This observation is reported by Aritomi et al. (Nature, 1999, 401, p. 713-717) and Young et al. (Protein Science, 1997, vol. 6, p. 1228-1236). As suggested, the PEG modification of lysine 17 of G-CSF compared to the PEG modification of lysine 35 of G-CSF is very different from the hypothesis that it would reduce the biological activity of the isoform.

Ｂ）Ｇ−ＣＳＦおよび２０ｋＤ ｍＰＥＧアセタール
１．ＰＥＧ化反応と分析論
ＰＥＧ化反応のために、反応原料である２０ｋＤａ ｍＰＥＧアセタールおよびＧ−ＣＳＦを実施例Ａ１ａおよびＡ２に従って調製した。３２ｍｇの固体ｍＰＥＧアルデヒド（分子量２０ｋＤａ）を、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中２．４ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦまたは３．２ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦに加え、Ｇ−ＣＳＦのｍＰＥＧアルデヒドに対するモル比がそれぞれ１：２５（２．４ｍｇ／ｍｌ）および１：１９（３．２ｍｇ／ｍｌ）となるようにした。反応を実施し、試料を実施例３ａおよび３ｂに記述されるようにＣ−ＩＥＸ ＨＰＬＣによって分析した。 B) G-CSF and 20 kD mPEG acetal PEGylation Reaction and Analytical For the PEGylation reaction, the reaction raw materials 20 kDa mPEG acetal and G-CSF were prepared according to Examples A1a and A2. 32 mg of solid mPEG aldehyde (molecular weight 20 kDa) was added to 2.4 mg / ml G-CSF or 3.2 mg / ml G-CSF in 100 mM phosphate buffer (pH 7.5), and G-CSF against mPEG aldehyde The molar ratios were 1:25 (2.4 mg / ml) and 1:19 (3.2 mg / ml), respectively. The reaction was performed and samples were analyzed by C-IEX HPLC as described in Examples 3a and 3b.

結果：
ｍＰＥＧ（１２ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートの分析Ｃ−ＩＥＸ溶出プロファイルから推定して、対応するｍＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートのピークを同定して割り当てることができた（図１２を参照）。より高分子量のＰＥＧとＧ−ＣＳＦとのコンジュゲートについては、分析用Ｃ−ＩＥＸにより、１つのモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート（３９ｋＤａの総分子量を有する）、２つのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート（５９ｋＤａの総分子量を有する）および３つのトリＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート（７９ｋＤａの総分子量を有する）の分離が可能であった。 result:
Analysis of mPEG (12 kDa) G-CSF conjugate Estimated from the C-IEX elution profile, the corresponding mPEG (20 kDa) G-CSF conjugate peak could be identified and assigned (see FIG. 12). For higher molecular weight PEG and G-CSF conjugates, by analytical C-IEX, one monoPEGylated G-CSF conjugate (with a total molecular weight of 39 kDa), two diPEGylated G-CSF Separation of the conjugate (having a total molecular weight of 59 kDa) and three triPEGylated G-CSF conjugates (having a total molecular weight of 79 kDa) was possible.

一般に、組換えヒトＧ−ＣＳＦと２０ｋＤａのｍＰＥＧアルデヒドを１：１９またはそれ以上のモル比で用いてＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートへと変換すると、低温で２０時間のインキュベーション後に総分子量５９ｋＤａのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートが主として生産された（図１３を参照）。   In general, conversion of recombinant human G-CSF and 20 kDa mPEG aldehyde to a PEGylated G-CSF conjugate using a molar ratio of 1:19 or more resulted in a total molecular weight of 59 kDa after incubation at low temperature for 20 hours. PEGylated G-CSF conjugates were mainly produced (see Figure 13).

２．ジ’ＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームの生物活性
ジ’ＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームの生物活性をインビボで試験するために、この単一アイソフォームを分取用陽イオン交換クロマトグラフィーによって高度に精製した。確定された生成物は、実施例Ａ６の段落ｄ）ｉｉ）で述べ
たように、少なくとも９５％のジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームを含んでいた。 2. Bi'Activity of Di'PEG (20 kDa) G-CSF Conjugate Isoform To test the biological activity of di'PEG (20 kDa) G-CSF conjugate isoform in vivo, this single isoform was aliquoted. Highly purified by cation exchange chromatography. The confirmed product contained at least 95% di'PEGylated G-CSF conjugate isoform as described in paragraph d) ii) of Example A6.

このインビボ試験は、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ）およびＮｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）と上記ジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・単一アイソフォームとの、オープンかつ無作為、並行群間の、単回用量での生物学的同等性試験であった。同試験はオスのラットに０．１ｍｇ／ｋｇの皮下注射を行うことにより実行された。１つの時点につき１群当たり６匹の動物から採血した。血清試料は、該試料を採取したのと同じ日に完全な血球数測定を実施した。平均白血球数および好中球数が計算された。   This in vivo study is a single dose biology of open and random, parallel groups of Neupogen® and Neulasta® with the di'PEGylated G-CSF conjugate single isoform. Equivalence test. The study was performed by injecting 0.1 mg / kg subcutaneously into male rats. Blood was drawn from 6 animals per group per time point. Serum samples were subjected to a complete blood count on the same day that the samples were collected. Average white blood cell counts and neutrophil counts were calculated.

結果：
本発明によるジ’ＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・単一アイソフォームでは、非修飾型Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））と比較して、ｉ）ＷＢＣ数および好中球数が高く、ｉｉ）ＷＢＣおよび好中球の応答性が長く保持されていた（図１４および図１５を参照）。 result:
The di′PEG (20 kDa) G-CSF conjugate / single isoform according to the present invention has a higher number of i) WBC and neutrophils compared to unmodified G-CSF (Neupogen®), ii) The responsiveness of WBC and neutrophils was maintained for a long time (see FIGS. 14 and 15).

Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）との比較では、本発明のジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームは、最大ＷＢＣ数および好中球数が高く、かつＷＢＣおよび好中球の応答性が長く保持されることから、生物学的に改善（bioimproved ）されている（図１４および図１５を参照）。   In comparison with Neulasta®, the di'PEGylated G-CSF conjugate isoforms of the present invention have a high maximum WBC count and neutrophil count and a long retention of WBC and neutrophil responsiveness. Therefore, it is biologically improved (see FIG. 14 and FIG. 15).

３．薬物動態学的調査
（ｉ）実施例Ａ６による、ジＰＥＧ（１２ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦおよびジ’ＰＥＧ（１２ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームを含んでなるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成混合物（総分子量４３ｋＤａ）、ならびに（ｉｉ）単一アイソフォームである実施例Ｂのジ’ＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート（総分子量５９ｋＤａ）、のクリアランス機構を、市販のモノＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ））と比較してインビボで試験した。 3. Pharmacokinetic Studies (i) DiPEGylated G-CSF product mixture comprising diPEG (12 kDa) G-CSF and di'PEG (12 kDa) G-CSF conjugate isoform according to Example A6 (total The clearance mechanism of molecular weight 43 kDa), as well as (ii) the di′PEG (20 kDa) G-CSF conjugate of Example B (total molecular weight 59 kDa), which is a single isoform, was compared with the commercially available mono-PEGylated G-CSF (Neulasta (R)) and compared in vivo.

このインビボ試験は、Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）と、ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成混合物またはジ’ＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・単一アイソフォームのいずれかとについて、シャム手術群（対照群）および腎摘出群のラットにおいて行うオープンかつ無作為、並行群間のクリアランス試験であった。この試験は、オスのラットに０．００５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲートを静脈内注射することより実行された。１つの時点につき１群当たり４匹の動物から採血した。血清試料について、Ｇ−ＣＳＦの血漿中残存濃度を測定し、血漿中半減期などの関連する薬物動態学的データを算出した。   This in vivo study was carried out for Neulasta® and either diPEGylated G-CSF product mixture or di′PEG (20 kDa) G-CSF conjugate single isoform for sham surgery group (control group) and kidney. It was an open, random, parallel group clearance test performed in the isolated group of rats. This study was performed by intravenously injecting 0.005 mg / kg conjugate into male rats. Blood was drawn from 4 animals per group per time point. For serum samples, the residual plasma concentration of G-CSF was measured and relevant pharmacokinetic data such as plasma half-life was calculated.

結果：
Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ）、ジＰＥＧ（１２ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦ生成混合物、および本発明によるジ’ＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・単一アイソフォームが、同様の薬物動態学的データを示し（表９を参照）かつ同様のクリアランス動態を示したことから、３つの生成物がいずれも好中球のレセプターを介したクリアランスによって主に***されることが示唆される。 result:
Neulasta®, diPEG (12 kDa) G-CSF product mixture, and di′PEG (20 kDa) G-CSF conjugate single isoform according to the present invention show similar pharmacokinetic data (Table 9). And similar clearance kinetics suggests that all three products are mainly excreted by neutrophil receptor-mediated clearance.

Figure 2008535793
Ｃ）ＩＦＮα２ａのジＰＥＧ化
１．ＰＥＧ化反応および分析論
１２ｋＤａ ｍＰＥＧアセタールを、実施例Ａ１に記述したようにＰＥＧ化反応用に活性化した。ＰＥＧ化反応に先立って、凍結乾燥されたＩＦＮα２ａ試料を水に溶解し、酸性の酢酸バッファー溶液に対して透析し、最後に、カットオフ分子量が１０ｋＤａのＹＭ１０メンブレンを装備したｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）チューブ（２ｍｌ）を使用して、限外濾過により反応条件に応じておよそ４〜８ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮した。
Figure 2008535793
 C) DiPEGylation of IFNα2a PEGylation Reaction and Analysis 12 kDa mPEG acetal was activated for the PEGylation reaction as described in Example A1. Prior to the PEGylation reaction, the lyophilized IFNα2a sample was dissolved in water, dialyzed against an acidic acetate buffer solution, and finally a centricon® tube equipped with a YM10 membrane with a cutoff molecular weight of 10 kDa ( 2 ml) was used to concentrate to a concentration of approximately 4-8 mg / ml depending on the reaction conditions by ultrafiltration.

ＩＦＮα２ａについては、２８０ｎｍで吸光度１．０５のとき１ｍｇ／ｍｌのタンパク質に相当する。ＰＥＧ化されたＩＦＮα２ａコンジュゲートのタンパク質濃度測定値を計算するために、同じモル吸光係数を適用した。   For IFNα2a, when the absorbance is 1.05 at 280 nm, it corresponds to 1 mg / ml protein. The same molar extinction coefficient was applied to calculate protein concentration measurements of PEGylated IFNα2a conjugates.

２７ｍｇの固体ｍＰＥＧアルデヒド（分子量１２ｋＤａ）を６ｍｇ／ｍｌの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中ＩＦＮα２ａ溶液に加え、ＩＦＮα２ａとｍＰＥＧアルデヒドとのモル比を１：１５とした。２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、反応混合物を穏やかに撹拌しながら２〜８℃で数時間さらにインキュベートした。反応は８Ｎ ＨＣｌで酸性化することによって停止させた。   27 mg of solid mPEG aldehyde (molecular weight 12 kDa) was added to the IFNα2a solution in 6 mg / ml 100 mM phosphate buffer (pH 7.5) to give a molar ratio of IFNα2a to mPEG aldehyde of 1:15. 20 mM sodium cyanoborohydride was added and the reaction mixture was further incubated for several hours at 2-8 ° C. with gentle agitation. The reaction was stopped by acidification with 8N HCl.

ＰＥＧ ＩＦＮα２ａ反応混合物中の分子種の分布（モノ体、ジ体、トリ体）を、Ｃ−ＩＥＸ ＨＰＬＣによって決定した。従って、反応を停止させた反応混合物を、４０ｍＭ酢酸バッファー溶液（ｐＨ４．２）で３倍に希釈し、ダイオネックス（Dionex）システムまたは島津製作所ＨＰＬＣシステムに装備されたＳＰ−５ＰＷ充填カラム（７５×７．５ｍｍ、粒径１０μｍ、カラム体積３．３ｍｌ、トーソーハース・バイオサイエンス（Tosohaas Bioscience ）製）に通した。   The distribution of molecular species (mono, di, tri) in the PEG IFNα2a reaction mixture was determined by C-IEX HPLC. Therefore, the reaction mixture which stopped the reaction was diluted 3-fold with a 40 mM acetate buffer solution (pH 4.2), and a SP-5PW packed column (75 ×) equipped on a Dionex system or a Shimadzu HPLC system was used. 7.5 mm, particle size 10 μm, column volume 3.3 ml, manufactured by Tosohaas Bioscience).

カラムを４０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．２で平衡化した。流量は０．４ｍｌ／分とし、典型的には２００μｇのタンパク質が注入された。カラムは室温で使用したが、試料はオートインジェクタ内で５℃に維持した。   The column was equilibrated with 40 mM NaAc, pH 4.2. The flow rate was 0.4 ml / min and typically 200 μg of protein was injected. The column was used at room temperature, but the sample was maintained at 5 ° C. in an autoinjector.

ＰＥＧ化状態の異なる分子種の同定については、分析用Ｃ−ＩＥＸ ＨＰＬＣの溶出ピークを、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）にかけるか、あるいはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行うかのうち少なくともいずれかを実施し、溶出ピークの保持時間に対して各ＰＥＧ化ＩＦＮα２ａのピークが割り当てられるようにした。   For the identification of molecular species having different PEGylation states, at least one of whether the elution peak of analytical C-IEX HPLC is subjected to mass spectrometry (MALDI-TOF) or SDS-PAGE analysis is performed. Each pegylated IFNα2a peak was assigned to the retention time of the elution peak.

質量分析と、クマシー染色（タンパク質の標識）およびヨード染色（ＰＥＧの標識）を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥとを組み合わせた分析結果は、アミノ酸配列およびＰＥＧ部分に基づいた事前の質量推定と一致した（表１０を参照）。   Analytical results combining mass spectrometry and SDS-PAGE with Coomassie staining (protein labeling) and iodine staining (PEG labeling) were consistent with prior mass estimation based on amino acid sequence and PEG moiety (Table 10). See).

Figure 2008535793
質量分析／ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの情報を用いて、保持時間を対応するＰＥＧ化ＩＦＮα２ａ分子種に割り当てることができた。分析用Ｃ−ＩＥＸから、モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化およびトリＰＥＧ化ＩＦＮα２ａアイソフォームを保持時間に応じて分離することが可能となった。
Figure 2008535793
 Using information from mass spectrometry / SDS-PAGE, retention times could be assigned to the corresponding PEGylated IFNα2a molecular species. From analytical C-IEX, it became possible to separate monoPEGylated, diPEGylated and triPEGylated IFNα2a isoforms according to retention time.

一般に、例えば６ｍｇ／ｍｌの濃度の組換えヒトＩＦＮα２ａを、１：１５のモル比でｍＰＥＧアルデヒドを用いてＰＥＧ化ＩＦＮα２ａコンジュゲートへと変換すると、およそ２０時間の反応時間以降に主としてジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａコンジュゲートが生じた（図１６ａを参照）。   In general, conversion of recombinant human IFNα2a, for example at a concentration of 6 mg / ml, into a PEGylated IFNα2a conjugate using mPEG aldehyde at a molar ratio of 1:15 mainly results in diPEGylated IFNα2a after approximately 20 hours reaction time. A conjugate was formed (see FIG. 16a).

Figure 2008535793
別の実験セットでは、様々な量の固体ｍＰＥＧアルデヒド（３〜３０ｍｇ）を異なるタンパク質濃度（３ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ）に対して加え、モル比を約１：１．５、１：３、１：５、１：１０、１：１５および１：３０（タンパク質：ＰＥＧ）とした。反応は上述のように低温（５℃）で実施し、試料を上述のようにして分析した。
Figure 2008535793
 In another set of experiments, varying amounts of solid mPEG aldehyde (3-30 mg) were added for different protein concentrations (3 mg / ml, 6 mg / ml) and the molar ratios were about 1: 1.5, 1: 3, 1: 5, 1:10, 1:15 and 1:30 (protein: PEG). The reaction was carried out at a low temperature (5 ° C.) as described above and the sample was analyzed as described above.

ジＰＥＧ化ＩＦＮαを主に形成させるためには、モル比ＩＦＮ：ＰＥＧは少なくとも１：１５でなければならなかったが、このモル比は、タンパク質内（合計１２個のアミノ基中）の利用可能なアミノ基の数とＰＥＧ分子の数との化学量論比が少なくとも１：１．２５であることに相当する。   In order to predominantly form diPEGylated IFNα, the molar ratio IFN: PEG had to be at least 1:15, but this molar ratio is available within the protein (in a total of 12 amino groups) This corresponds to a stoichiometric ratio of the number of active amino groups to the number of PEG molecules of at least 1: 1.25.

最大の生成物形成（〜４０％の合成収量）は、２０時間インキュベーション後に達成されたが、生成物形成の反応速度は、温度の上昇（＋２０℃）およびＰＥＧ量の増加（少なくとも２倍）により影響を受ける場合もあった（図１６ｂを参照）。   Maximum product formation (˜40% synthetic yield) was achieved after 20 hours incubation, but the reaction rate of product formation was increased by increasing temperature (+ 20 ° C.) and increasing the amount of PEG (at least 2-fold). In some cases, it was affected (see FIG. 16b).

ジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａコンジュゲートの合成収量を増加させるために、本発明において実施例Ａ３およびＡ４に記述されるように、いくつかのプロセス・パラメータ、例えば限定するものではないが反応ｐＨ、タンパク質濃度、タンパク質：ＰＥＧモル比をさらに最適化することや、場合によっては再利用ステップを導入してジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲート収量をより高めることが推奨される。   In order to increase the synthetic yield of the diPEGylated IFNα2a conjugate, several process parameters such as, but not limited to, reaction pH, protein concentration, as described in Examples A3 and A4 in the present invention. It is recommended to further optimize the protein: PEG molar ratio and possibly introduce a recycling step to further increase the diPEGylated protein conjugate yield.

重要なパラメータであることが確認されたインキュベーション時間に加えて、使用されるタンパク質濃度に対するＰＥＧ濃度（タンパク質とＰＥＧとのモル比で表現される）は、主としてジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａ生成物を形成するための反応の別の重要な促進要因である。タンパク質とＰＥＧとのモル比＝１：１５である場合、反応はジＰＥＧ化に向かう。   In addition to the incubation time that has been found to be an important parameter, the PEG concentration (expressed as the molar ratio of protein to PEG) relative to the protein concentration used is primarily due to the formation of diPEGylated IFNα2a product. Is another important driver of reaction. If the molar ratio of protein to PEG = 1: 15, the reaction goes to diPEGylation.

２．分取Ｃ−ＩＥＸによる精製
最初のＰＥＧ化反応の後に、ジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａコンジュゲートを、実施例Ａ５に記述されるような分取用陽イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｃ−ＩＥＸ ＨＰＬＣ分析に使用されたものと同一の直線的塩濃度勾配を適用して、他のＩＦＮα２ａアイソフォームから分離した。各溶出ピークを再度クロマトグラフィ（Ｃ−ＩＥＸ ＨＰＬＣ）で分析して対応するＰＥＧ化ＩＦＮα２ａアイソフォームを識別した（上記参照）。 2. Purification by preparative C-IEX After the initial PEGylation reaction, the diPEGylated IFNα2a conjugate was used for C-IEX HPLC analysis by preparative cation exchange chromatography as described in Example A5. The same linear salt gradient was applied to separate the other IFNα2a isoforms. Each eluted peak was again analyzed by chromatography (C-IEX HPLC) to identify the corresponding PEGylated IFNα2a isoform (see above).

結果
直線勾配溶出の結果、３つの主要ピークが得られたが、これを図１７に示し、表１２に要約する。 Results The linear gradient elution resulted in 3 major peaks, which are shown in FIG. 17 and summarized in Table 12.

Figure 2008535793
ジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａについては、１つの主要なジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａピークを同定することができた。しかしながら、ピークの形から、６６種の可能なアイソフォームのうちの２以上が同時に溶出していることが想定される。ＩＦＮについて考えられる生成物は、対応するピークが２つの肩を示すことから、少なくとも３つのアイソフォームで構成される可能性が高いと思われる。
Figure 2008535793
 For diPEGylated IFNα2a, one major diPEGylated IFNα2a peak could be identified. However, from the shape of the peak, it is assumed that two or more of the 66 possible isoforms elute simultaneously. The possible products for IFN are likely to be composed of at least three isoforms, since the corresponding peak shows two shoulders.

Ｄ）グリコシル化エリスロポエチン（ＥＰＯ）のジＰＥＧ化
１．ＰＥＧ化反応および分析論
１２ｋＤａのｍＰＥＧアセタールを、実施例Ａ１に記述されるようにしてＰＥＧ化反応用に活性化した。ＰＥＧ化反応に先立って、グリコシル化ＥＰＯの試料を酸性の酢酸バッファー溶液に対して透析し、最終的には分子量カットオフ値１０ｋＤａのＹＭ１０メンブレンを装備したｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）チューブ（２ｍｌ）を使用して、反応条件に応
じておよそ４〜８ｍｇ／ｍｌまで限外濾過により濃縮した。 D) DiPEGylation of glycosylated erythropoietin (EPO) PEGylation Reaction and Analysis 12 kDa mPEG acetal was activated for the PEGylation reaction as described in Example A1. Prior to the PEGylation reaction, a sample of glycosylated EPO was dialyzed against an acidic acetate buffer solution and finally used with a centricon® tube (2 ml) equipped with a YM10 membrane with a molecular weight cutoff of 10 kDa. Depending on the reaction conditions, it was concentrated by ultrafiltration to approximately 4-8 mg / ml.

ＥＰＯについては、２８０ｎｍで吸光度が０．８１５のとき１ｍｇ／ｍｌのタンパク質に相当する。ＰＥＧ化されたＥＰＯコンジュゲートのタンパク質濃度測定値を計算するために、同じモル吸光係数を適用した。   For EPO, when the absorbance is 0.815 at 280 nm, it corresponds to 1 mg / ml protein. The same molar extinction coefficient was applied to calculate protein concentration measurements of PEGylated EPO conjugates.

６ｍｇの固体のｍＰＥＧアルデヒド（分子量１２ｋＤａ）を６ｍｇ／ｍｌの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中グリコシル化ＥＰＯ溶液に加え、ＥＰＯとｍＰＥＧアルデヒドとのモル比を１：５とした。２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、反応混合物を穏やかに撹拌しながら５０℃で数時間さらにインキュベーションした。反応は８ＮのＨＣｌで酸性化することにより停止させた。   6 mg of solid mPEG aldehyde (molecular weight 12 kDa) was added to the glycosylated EPO solution in 6 mg / ml 100 mM phosphate buffer (pH 7.5) to give a molar ratio of EPO to mPEG aldehyde of 1: 5. 20 mM sodium cyanoborohydride was added and the reaction mixture was further incubated for several hours at 50 ° C. with gentle agitation. The reaction was stopped by acidification with 8N HCl.

ＰＥＧとＥＰＯとの反応混合物中の分子種（モノ体、ジ体、トリ体）の分布は、Ｃ−ＩＥＸ ＨＰＬＣによって決定した。従って、反応を停止させた反応混合物を、４０ｍＭ酢酸バッファー溶液（ｐＨ３．８）で３倍に希釈し、ダイオネックス（Dionex）システムまたは島津製作所ＨＰＬＣシステムに装備されたＳＰ−５ＰＷ充填カラム（７５×７．５ｍｍ、粒径１０μｍ、カラム体積３．３ｍｌ、トーソーハース・バイオサイエンス（Tosohaas Bioscience ）製）に通した。   The distribution of molecular species (mono, di, tri) in the reaction mixture of PEG and EPO was determined by C-IEX HPLC. Therefore, the reaction mixture which stopped the reaction was diluted 3-fold with 40 mM acetate buffer solution (pH 3.8), and the SP-5PW packed column (75 ×) installed in the Dionex system or Shimadzu HPLC system was used. 7.5 mm, particle size 10 μm, column volume 3.3 ml, manufactured by Tosohaas Bioscience).

カラムを４０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ３．８および２０％イソプロパノール（ｖ／ｖ）で平衡化した。流量は１ｍｌ／分とし、典型的には２００μｇのタンパク質を注入した。カラム洗浄の後、直線勾配溶出は、およそ２０カラム体積の、２０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールを含有する４０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ３．８中の１Ｍ ＮａＣｌを用いて実施した（図１８ｃを参照）。   The column was equilibrated with 40 mM NaAc, pH 3.8 and 20% isopropanol (v / v). The flow rate was 1 ml / min and typically 200 μg of protein was injected. After column washing, linear gradient elution was performed using approximately 20 column volumes of 1M NaCl in 40 mM NaAc, pH 3.8 containing 20% (v / v) isopropanol (see FIG. 18c).

カラムは室温で使用したが、試料はオートインジェクタ内で５℃に維持した。
ＰＥＧ化状態の異なる分子種の同定については、分析用Ｃ−ＩＥＸ ＨＰＬＣの溶出ピークを、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）にかけ、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施し、溶出ピークの保持時間に対して各ＰＥＧ化状態のＥＰＯのピークが割り当てられるようにした。 The column was used at room temperature, but the sample was maintained at 5 ° C. in an autoinjector.
For the identification of molecular species with different PEGylation states, the elution peak of analytical C-IEX HPLC was subjected to mass spectrometry (MALDI-TOF), and SDS-PAGE analysis was performed. The peak of EPO in the PEGylated state was assigned.

質量分析と、クマシー染色（タンパク質の標識）およびヨード染色（ＰＥＧの標識）を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥとを組み合わせた分析結果は、アミノ酸配列およびＰＥＧ部分に基づいた事前の質量推定と一致した（表１３を参照）。   Analytical results combining mass spectrometry and SDS-PAGE with Coomassie staining (protein labeling) and iodine staining (PEG labeling) were consistent with prior mass estimation based on amino acid sequence and PEG moiety (Table 13). See).

Figure 2008535793
質量分析／ＳＤＳ−ＰＡＧＥからの情報を用いて、保持時間を対応するＰＥＧ化ＥＰＯ分子種に割り当てることができた。分析用Ｃ−ＩＥＸから、モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化およびトリＰＥＧ化ＥＰＯアイソフォームを保持時間に応じて分離することが可能となった。
Figure 2008535793
 Using information from mass spectrometry / SDS-PAGE, retention times could be assigned to the corresponding PEGylated EPO species. From analytical C-IEX, it became possible to separate monoPEGylated, diPEGylated and triPEGylated EPO isoforms according to retention time.

一般に、組換えヒトグリコシル化ＥＰＯを、ｍＰＥＧアルデヒドを１：５のモル比（グリコシル化ＥＰＯ：ＰＥＧ）で用いて変換すると、およそ１２〜１８時間以降の反応時間で主としてジＰＥＧ化ＥＰＯコンジュゲートが生じた（図１８ａを参照）。   In general, when recombinant human glycosylated EPO is converted using mPEG aldehyde in a 1: 5 molar ratio (glycosylated EPO: PEG), mainly diPEGylated EPO conjugates are obtained with reaction times of approximately 12-18 hours and beyond. Has occurred (see FIG. 18a).

別の実験セットでは、様々な量の固体ｍＰＥＧアルデヒド（３〜１３ｍｇ）を異なるタンパク質濃度（３ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ）に対して加え、モル比を約１：５、１：１５、１：２５および１：３０（タンパク質：ＰＥＧ）とした。反応は上述のように低温（５℃）で実施し、試料を上述のようにして分析した。   In another experimental set, varying amounts of solid mPEG aldehyde (3-13 mg) were added for different protein concentrations (3 mg / ml, 6 mg / ml) and the molar ratios were about 1: 5, 1:15, 1: 25 and 1:30 (protein: PEG). The reaction was carried out at a low temperature (5 ° C.) as described above and the sample was analyzed as described above.

興味深いことには、タンパク質グリコシル化の影響により恐らくタンパク質表面上の遮蔽効果が引き起こされる結果、選択的なＰＥＧ結合がもたらされる。したがって、タンパク質内のアミノ酸の数とＰＥＧ分子の数との化学量論比が１：０．５で既にジＰＥＧ化が生じることは、驚くべきことではない（図１８ｂを参照）。   Interestingly, the effects of protein glycosylation probably cause a shielding effect on the protein surface, resulting in selective PEG attachment. Thus, it is not surprising that diPEGylation already occurs at a stoichiometric ratio of 1: 0.5 amino acids to PEG molecules (see FIG. 18b).

ジＰＥＧ化グリコシル化ＥＰＯコンジュゲートの合成収量を増加させるために、本発明において実施例Ａ３およびＡ４に記述されるように、タンパク質濃度およびモル比（タンパク質：ＰＥＧ）など（これらに限定はされない）のパラメータをさらに最適化することや、場合により再利用ステップを導入してより高いジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲート合成収量を達成することが推奨される。   To increase the synthetic yield of diPEGylated glycosylated EPO conjugates, such as, but not limited to, protein concentration and molar ratio (protein: PEG) as described in Examples A3 and A4 in the present invention It is recommended to further optimize these parameters and optionally introduce a recycling step to achieve higher diPEGylated protein conjugate synthesis yields.

重要なパラメータであると確認されたインキュベーション時間に加えて、使用されるタンパク質濃度に応じたＰＥＧ濃度（タンパク質とＰＥＧとのモル比、またはより好ましくは標的タンパク質のＰＥＧ結合に利用可能なアミノ基に対するモル過剰量で表現される）は、反応が主としてジＰＥＧ化エリスロポエチン生成物を形成するように促進する別の重要な因子である。標的タンパク質とＰＥＧとのモル比が約１：５、またはより好ましくはタンパク質内のアミノ基の数とＰＥＧ分子の数との化学量論比が少なくとも１：０．５であるとき、反応はジＰＥＧ化を指向する。   In addition to the incubation time identified as an important parameter, the PEG concentration depends on the protein concentration used (molar ratio of protein to PEG, or more preferably relative to the amino groups available for PEG conjugation of the target protein. (Expressed in molar excess) is another important factor that facilitates the reaction to form primarily diPEGylated erythropoietin products. When the molar ratio of target protein to PEG is about 1: 5, or more preferably, the stoichiometric ratio of the number of amino groups in the protein to the number of PEG molecules is at least 1: 0.5 Directed to PEGylation.

Ｅ）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のジＰＥＧ化
１．ＰＥＧ化反応および分析論
１２ｋＤａのｍＰＥＧアセタールを実施例Ａ１に記述したようにしてＰＥＧ化反応用に活性化した。ＰＥＧ化反応に先立って、凍結乾燥されたヒト成長ホルモン試料を水に溶解し、ｂｉｃｉｎｅバッファーに対して透析し、最終的に分子量カットオフ値が１０ｋＤａのＹＭ１０メンブレンを装備したｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）チューブ（２ｍｌ）を使用して、反応条件に応じておよそ４〜８ｍｇ／ｍｌの濃度まで限外濾過により濃縮した。 E) DiPEGylation of human growth hormone (hGH) PEGylation Reaction and Analytical A 12 kDa mPEG acetal was activated for the PEGylation reaction as described in Example A1. Prior to the PEGylation reaction, a lyophilized human growth hormone sample was dissolved in water, dialyzed against bicine buffer, and finally a centricon® tube equipped with a YM10 membrane with a molecular weight cutoff of 10 kDa ( 2 ml) and concentrated by ultrafiltration to a concentration of approximately 4-8 mg / ml depending on the reaction conditions.

ｈＧＨについては、２８０ｎｍでの吸光度が０．７２のとき１ｍｇ／ｍｌのタンパク質に相当する。ＰＥＧ化されたｈＧＨコンジュゲートのタンパク質濃度測定値を計算するために、同じモル吸光係数を適用した。   For hGH, when the absorbance at 280 nm is 0.72, it corresponds to 1 mg / ml protein. The same molar extinction coefficient was applied to calculate protein concentration measurements of PEGylated hGH conjugates.

２５ｍｇの固体のｍＰＥＧアルデヒド（分子量１２ｋＤａ）を、１００ｍＭ ｂｉｃｉｎｅバッファー、ｐＨ７．５中の６．０ｍｇ／ｍｌ ｈＧＨ溶液に加え、ｈＧＨとｍＰＥＧアルデヒドとのモル比を１：１５とした。２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加え、反応混合物を穏やかに撹拌しながら２〜８℃で数時間さらにインキュベーションした。反応は８ＮのＨＣｌで酸性化することにより停止させた。   25 mg of solid mPEG aldehyde (molecular weight 12 kDa) was added to a 6.0 mg / ml hGH solution in 100 mM bicine buffer, pH 7.5 to give a molar ratio of hGH to mPEG aldehyde of 1:15. 20 mM sodium cyanoborohydride was added and the reaction mixture was further incubated for several hours at 2-8 ° C. with gentle agitation. The reaction was stopped by acidification with 8N HCl.

ＰＥＧとｈＧＨとの反応混合物中の分子種（モノ体、ジ体、トリ体）の分布は、Ｃ−ＩＥＸ ＨＰＬＣによって決定した。したがって、反応を停止させた反応混合物を４０ｍＭ
ＮａＡｃバッファー（ｐＨ４．２）で３倍に希釈し、ダイオネックス（Dionex）システムまたは島津製作所ＨＰＬＣシステムに装備されたＳＰ−５ＰＷ充填カラム（７５×７．５ｍｍ、粒径１０μｍ、カラム体積３．３ｍｌ、トーソーハース・バイオサイエンス（Tosohaas Bioscience ）製）に通した。 The distribution of molecular species (mono, di, tri) in the reaction mixture of PEG and hGH was determined by C-IEX HPLC. Therefore, the reaction mixture that stopped the reaction was 40 mM.
SP-5PW packed column (75 × 7.5 mm, particle size 10 μm, column volume 3.3 ml) diluted 3-fold with NaAc buffer (pH 4.2) and equipped with Dionex system or Shimadzu HPLC system , Manufactured by Tosohaas Bioscience).

カラムを同じバッファーで平衡化し、流量は０．４ｍｌ／分として、典型的には２００μｇのタンパク質を注入した。カラムは室温で使用したが、試料はオートインジェクタ内で５℃に維持した。   The column was equilibrated with the same buffer, the flow rate was 0.4 ml / min, and typically 200 μg of protein was injected. The column was used at room temperature, but the sample was maintained at 5 ° C. in an autoinjector.

異なるＰＥＧ化状態の分子種の同定については、分析用Ｃ−ＩＥＸ ＨＰＬＣの溶出ピークについて、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって質量を分析し、溶出ピークの保持時間に対してＰＥＧ化ｈＧＨの各ピークを割り当てることができた。   For identification of molecular species in different PEGylation states, mass was analyzed by MALDI / TOF and SDS-PAGE for the elution peak of analytical C-IEX HPLC, and each peak of PEGylated hGH was compared with the retention time of the elution peak. Could be assigned.

ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦの結果は、アミノ酸配列およびＰＥＧ部分に基づいた事前の質量推定と一致した（表１４を参照）。   MALDI / TOF results were consistent with previous mass estimation based on amino acid sequence and PEG moiety (see Table 14).

Figure 2008535793
ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析からの情報を用いて、保持時間を対応するＰＥＧ化ｈＧＨ分子種に割り当てることができた。分析Ｃ−ＩＥＸにより、モノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化およびトリＰＥＧ化ｈＧＨアイソフォームを保持時間に応じて分離することが可能となった。
Figure 2008535793
 Using information from MALDI / TOF and SDS-PAGE analysis, retention times could be assigned to the corresponding PEGylated hGH species. Analytical C-IEX enabled the separation of monoPEGylated, diPEGylated and triPEGylated hGH isoforms depending on retention time.

一般に、組換えヒトｈＧＨを、ｍＰＥＧアルデヒドを１：１５のモル比で用いてＰＥＧ化ｈＧＨコンジュゲートに変換すると、およそ１５時間の反応時間以降に主としてジＰＥＧ化ｈＧＨコンジュゲートが生じた（図１９を参照）。この１：１５のモル比は、タンパク質内のアミノ基の数（９）とＰＥＧ分子の数との化学量論比が１：１．６であることに相当する。   In general, conversion of recombinant human hGH to a PEGylated hGH conjugate using mPEG aldehyde in a 1:15 molar ratio resulted primarily in diPEGylated hGH conjugate after approximately 15 hours reaction time (FIG. 19). See). This molar ratio of 1:15 corresponds to a stoichiometric ratio of 1: 1.6 between the number of amino groups in the protein (9) and the number of PEG molecules.

重要なパラメータであると確認されたインキュベーション時間に加えて、使用されるＰＥＧ濃度（タンパク質とＰＥＧとのモル比で表現される）は、反応が主としてジＰＥＧ化ｈＧＨコンジュゲート生成物を形成するように促進する。タンパク質とＰＥＧとのモル比＝１：１０のとき、反応はジＰＥＧ化を指向する。   In addition to the incubation time identified as an important parameter, the concentration of PEG used (expressed as the molar ratio of protein to PEG) is such that the reaction mainly forms a diPEGylated hGH conjugate product. To promote. When the molar ratio of protein to PEG = 1: 10, the reaction is directed to diPEGylation.

本発明のジポリマー・タンパク質コンジュゲートの生産におけるすべての処理ステップの概観を示す図。FIG. 3 shows an overview of all processing steps in the production of the dipolymer protein conjugates of the present invention. ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォーム全体の最大収量および形成の反応速度を、該ＰＥＧ化反応に使用される活性化ｍＰＥＧアルデヒドの低温保存時間に関して示す図。FIG. 5 shows the maximum yield and rate of formation of the entire diPEGylated G-CSF conjugate isoform with respect to the cryopreservation time of the activated mPEG aldehyde used in the PEGylation reaction. １〜４本の１２ｋＤａ ｍＰＥＧアルデヒド鎖を有する組換えＧ−ＣＳＦコンジュゲートが時間依存的に順次形成されるのを示す図。最大のジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ収量は３０時間インキュベーションでみられる。The figure which shows that the recombinant G-CSF conjugate which has 1-4 12 kDa mPEG aldehyde chain | strand is formed sequentially in a time-dependent manner. Maximum diPEGylated G-CSF yield is seen with a 30 hour incubation. ２つのアイソフォームの混合物であるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート生成物の形成について、使用したタンパク質およびＰＥＧの量に依存した反応速度を示す図。様々な量のＰＥＧおよびタンパク質について、本発明に従ってｐＨ７．５、５℃で穏やかに撹拌しながら０．５ｍＬの反応容量で試験した。FIG. 4 shows the reaction rate depending on the amount of protein and PEG used for the formation of a diPEGylated G-CSF conjugate product, which is a mixture of two isoforms. Various amounts of PEG and protein were tested in accordance with the invention at pH 7.5, 5 ° C. with 0.5 mL reaction volume with gentle agitation. 所与のインキュベーション時間（ｔ＝３０ｈ）におけるＰＥＧ量の関数としてのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート混合物の形成を示す図。本発明に従って、ｐＨ（７．５）、温度（５℃）として０．５ｍＬの反応容量で穏やかに撹拌した。FIG. 5 shows the formation of a diPEGylated G-CSF conjugate mixture as a function of PEG amount at a given incubation time (t = 30 h). In accordance with the present invention, gently stirred at a reaction volume of 0.5 mL as pH (7.5), temperature (5 ° C). 反応（５．７ｍｇ／ｍｌタンパク質、０．５ｍＬの反応容量で表示のモル比にて実施）における生成物（ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート混合物）の形成反応速度に対する温度（２２℃と５℃）の影響を示す図。Formation of product (diPEGylated G-CSF conjugate mixture) in reaction (5.7 mg / ml protein, performed at 0.5 mL reaction volume in the indicated molar ratio) Temperature vs. reaction rate (22 ° C. and 5 ° C. FIG. ＰＥＧ化反応混合物からのジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの分離用の典型的な分取Ｃ−ＩＥＸ溶出プロファイルを示す図（タンパク質装荷量：６．１ｍｇのＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ；カラム：ＳＰ−５ＰＷ Ｃ−ＩＥＸカラム（トーソーハース（Tosohaas）、２０μｍ、カラム体積１０．６ｍｌ）、バッファーＡ：１５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．２；バッファーＢ：１Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．２；直線濃度勾配）。Ｅ：溶出液、ＲＰ：残余物プール、Ｍｉｎ：分。Diagram showing typical preparative C-IEX elution profile for separation of diPEGylated G-CSF from PEGylation reaction mixture (protein loading: 6.1 mg PEGylated G-CSF; column: SP-5PWC) -IEX column (Tosohaas, 20 μm, column volume 10.6 ml), buffer A: 15 mM NaAc, pH 4.2; buffer B: 1 M NaCl, 15 mM NaAc, pH 4.2; linear concentration gradient). E: eluate, RP: residue pool, Min: minutes. ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物のＣ−ＩＥＸ ＨＰＬＣによる分離を示す図。クロマトグラムは２１４ｎｍで記録した。アイソフォーム名を記載（Ｄｉ”：ジ”ＰＥＧ化、Ｔｒｉ：トリＰＥＧ化、Ｄｉ’：ジ’ＰＥＧ化、Ｄｉ：ジＰＥＧ化、Ｍｏｎｏ：モノＰＥＧ化）。ｍｉｎ：分。FIG. 3 shows the separation of diPEGylated G-CSF product by C-IEX HPLC. The chromatogram was recorded at 214 nm. The isoform name is described (Di ": di" PEGylation, Tri: triPEGylation, Di ': di'PEGylation, Di: diPEGylation, Mono: monoPEGylation). min: minutes. ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物のＳＥＣによる分離を示す図。クロマトグラムは２１４ｎｍで記録した。２３分のピークは塩に相当する。FIG. 3 shows separation of diPEGylated G-CSF product by SEC. The chromatogram was recorded at 214 nm. The 23 minute peak corresponds to salt. 非修飾型Ｇ−ＣＳＦ（黒色）およびジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ生成物（赤色）のＣＤスペクトルを示す図。The figure which shows CD spectrum of a non-modified type G-CSF (black) and a diPEGylated G-CSF product (red). ジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームの混合物（０．７６：１）からなるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート生成物（Ｄｉ−ＰＥＧ Ｇ−ＣＳＦ）のインビボでの生物活性を、非修飾型ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））およびモノＰＥＧ化ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ））と比較して示す図。単回皮下注射後の平均ＷＢＣによって示されている（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）。In vivo biology of diPEGylated G-CSF conjugate product (Di-PEG G-CSF) consisting of a mixture of diPEGylated and di'PEGylated G-CSF conjugate isoforms (0.76: 1) The figure which shows activity in comparison with non-modified rhG-CSF (Neupogen®) and mono-PEGylated rhG-CSF (Neulasta®). Indicated by mean WBC after a single subcutaneous injection (PBS: phosphate buffered saline). ジＰＥＧ化およびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート・アイソフォームの混合物（０．７６：１）からなるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート生成物（Ｄｉ−ＰＥＧ Ｇ−ＣＳＦ）のインビボでの生物活性を、非修飾型ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））およびモノＰＥＧ化ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ））と比較して示す図。単回皮下注射後の平均好中球数によって示されている（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）。In vivo biology of diPEGylated G-CSF conjugate product (Di-PEG G-CSF) consisting of a mixture of diPEGylated and di'PEGylated G-CSF conjugate isoforms (0.76: 1) The figure which shows activity in comparison with non-modified rhG-CSF (Neupogen®) and mono-PEGylated rhG-CSF (Neulasta®). Indicated by mean neutrophil count after a single subcutaneous injection (PBS: phosphate buffered saline). ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームのインビボでの生物活性を、両アイソフォームの混合物（０．７６：１）であるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート生成物と比較して、単回皮下注射後の平均ＷＢＣによって示す図（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）。The in vivo biological activity of diPEGylated G-CSF isoforms and di'PEGylated G-CSF isoforms is a mixture of both isoforms (0.76: 1) diPEGylated G-CSF conjugate product The figure shown by the average WBC after a single subcutaneous injection compared with (PBS: phosphate buffered saline). ジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームおよびジ’ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦアイソフォームのインビボでの生物活性を、両アイソフォームの混合物（０．７６：１）であるジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦコンジュゲート生成物と比較して、単回皮下注射後の平均好中球数によって示す図（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）。The in vivo biological activity of diPEGylated G-CSF isoforms and di'PEGylated G-CSF isoforms is a mixture of both isoforms (0.76: 1) diPEGylated G-CSF conjugate product The figure shown by the average neutrophil count after a single subcutaneous injection compared with (PBS: phosphate buffered saline). Ｇ−ＣＳＦ（３．２ｍｇ／ｍｌ）を、ｍＰＥＧ １２ｋＤａ（モル比１：２５、上側のクロマトグラム）、およびｍＰＥＧ ２０ｋＤａ（モル比１：１９、下側のクロマトグラム））を用いて３０時間ＰＥＧ化した後の反応混合物の分析Ｃ−ＩＥＸ溶出プロファイルを示す図。ＳＰ−５ＰＷカラムを装備したダイオネックス（Dionex）システムで同一の条件下で分析した（ＵＶ ２１４ｎｍ）。ピークのプロファイルが一致していることから、ｉ）ピークの同定、およびｉｉ）対応するＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ分子種（モノ、ジ、およびジ’ＰＥＧ化アイソフォーム）へのピークの割り当てが可能である。（Ｆｌｏｗ：流量）G-CSF (3.2 mg / ml) with mPEG 12 kDa (molar ratio 1:25, upper chromatogram) and mPEG 20 kDa (molar ratio 1:19, lower chromatogram)) for 30 hours PEG The figure which shows the analysis C-IEX elution profile of the reaction mixture after making it into a right state. Analysis was performed under the same conditions (UV 214 nm) on a Dionex system equipped with an SP-5 PW column. Matching peak profiles allow i) peak identification and ii) peak assignment to corresponding PEGylated G-CSF molecular species (mono, di, and di'PEGylated isoforms) is there. (Flow: flow rate) １〜４本の２０ｋＤａ ｍＰＥＧアルデヒドを備えた組換えＧ−ＣＳＦコンジュゲートの時間依存的な連続的形成を示す図。１８時間インキュベーション以降にジＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを主とした生産が達成される。反応条件は、３．２ｍｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦとＰＥＧ２０ｋとのモル比１：１９、５℃で穏やかに撹拌、とした。FIG. 4 shows time-dependent continuous formation of recombinant G-CSF conjugate with 1-4 20 kDa mPEG aldehydes. After 18 hours incubation, production mainly of diPEGylated G-CSF is achieved. The reaction conditions were 3.2 mg / ml G-CSF, molar ratio of G-CSF to PEG20k 1:19, and gentle stirring at 5 ° C. ジ’ＰＥＧ（２０ｋ）Ｇ−ＣＳＦアイソフォームのインビボでの生物活性を、非修飾型ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））およびモノＰＥＧ化ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ））と比較して、単回皮下注射後の平均ＷＢＣによって示す図（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）。The in vivo biological activity of di'PEG (20k) G-CSF isoforms was compared to unmodified rhG-CSF (Neupogen®) and monoPEGylated rhG-CSF (Neulasta®). The figure shown by the average WBC after a subcutaneous injection (PBS: phosphate buffered saline). ジ’ＰＥＧ（２０ｋＤａ）Ｇ−ＣＳＦアイソフォームのインビボでの生物活性を、非修飾型ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（Ｒ））およびモノＰＥＧ化ｒｈＧ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ（Ｒ））と比較して、単回皮下注射後の平均好中球数によって示す図（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）。The in vivo biological activity of the di'PEG (20 kDa) G-CSF isoform was compared to that of unmodified rhG-CSF (Neupogen®) and monoPEGylated rhG-CSF (Neulasta®). The figure shown by the average neutrophil count after subcutaneous injection (PBS: phosphate buffered saline). １〜３本の１２ｋＤａ ｍＰＥＧアルデヒドを備えた組換えＩＦＮα２ａコンジュゲートの時間依存的な連続的形成を示す図。およそ２０時間インキュベーション後には既にジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａを主とした生産が達成され、調査した５０時間の時間枠では全体にわたって継続される。FIG. 3 shows time-dependent sequential formation of recombinant IFNα2a conjugate with 1-3 12 kDa mPEG aldehydes. Already after about 20 hours of incubation, production mainly of diPEGylated IFNα2a is achieved and continues throughout the 50 hour time frame investigated. ジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａコンジュゲート生成物の形成について、使用したタンパク質およびＰＥＧの量に依存した反応速度を示す図。様々な量のＰＥＧおよびタンパク質について、ｐＨ７．５、５℃で穏やかに撹拌しながら０．５ｍＬの反応容量で試験した。FIG. 4 shows the reaction rate depending on the amount of protein and PEG used for the formation of diPEGylated IFNα2a conjugate product. Various amounts of PEG and protein were tested in a reaction volume of 0.5 mL with gentle agitation at pH 7.5, 5 ° C. ＰＥＧ化反応混合物からジＰＥＧ化ＩＦＮα２ａコンジュゲートを分離するための分取Ｃ−ＩＥＸ溶出プロファイルを示す図（タンパク質装荷量：２４時間インキュベーション後のＰＥＧ化ＩＦＮα２ａを６ｍｇ；カラム：ＳＰ−５ＰＷ Ｃ−ＩＥＸカラム（トーソーハース（Tosohaas）、２０μｍ、カラム体積１０．６ｍｌ）、バッファーＡ：４０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．２；バッファーＢ：１Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．２；直線濃度勾配）。Ｐ１：モノＰＥＧ化；Ｐ２：ジＰＥＧ化；Ｐ３：混合物（トリＰＥＧ化／ジＰＥＧ化）；Ｍｉｎ：分。Diagram showing preparative C-IEX elution profile for separating diPEGylated IFNα2a conjugate from PEGylated reaction mixture (protein loading: 6 mg PEGylated IFNα2a after 24 hours incubation; column: SP-5PW C-IEX Column (Tosohaas, 20 μm, column volume 10.6 ml), buffer A: 40 mM NaAc, pH 4.2; buffer B: 1 M NaCl, 40 mM NaAc, pH 4.2; linear concentration gradient). P1: monoPEGylation; P2: diPEGylation; P3: mixture (triPEGylation / diPEGylation); Min: min. １〜３本の１２ｋＤａ ｍＰＥＧアルデヒド鎖を備えた組換えＥＰＯコンジュゲートの時間依存的な連続的形成を示す図。驚くべきことに最初の１８時間インキュベーション以内にはジＰＥＧ化ＥＰＯを主とした生産が達成され、残りのインキュベーションの間維持される。FIG. 3 shows time-dependent sequential formation of recombinant EPO conjugates with 1-3 12 kDa mPEG aldehyde chains. Surprisingly, the main production of diPEGylated EPO is achieved within the first 18 hour incubation and is maintained for the remainder of the incubation. ジＰＥＧ化エリスロポエチンコンジュゲート生成物の形成について、使用したタンパク質およびＰＥＧの量に依存した反応速度を示す図。様々な量のＰＥＧおよびタンパク質について、ｐＨ７．５、５℃で穏やかに撹拌しながら０．５ｍＬの反応容量で試験した。FIG. 4 shows the reaction rate depending on the amount of protein and PEG used for the formation of diPEGylated erythropoietin conjugate product. Various amounts of PEG and protein were tested in a reaction volume of 0.5 mL with gentle agitation at pH 7.5, 5 ° C. ＰＥＧ化反応混合物からジＰＥＧ化ＥＰＯコンジュゲートを分離するための分析Ｃ−ＩＥＸ溶出プロファイルを示す図（タンパク質装荷量：２４時間インキュベーション後のＰＥＧ化ＥＰＯ混合物を１ｍｇ；カラム：ＳＰ−５ＰＷ Ｃ−ＩＥＸカラム（トーソーハース（Tosohaas）、１０μｍ、カラム体積３．３ｍｌ）、バッファーＡ：４０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ３．８、２０％イソプロパノール；バッファーＢ：１Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ３．８、２０％イソプロパノール；直線濃度勾配）。Ｐ１：モノＰＥＧ化；Ｐ２：ジＰＥＧ化；Ｐ３：トリＰＥＧ化；Ｍｉｎ：分。Diagram showing analytical C-IEX elution profile for separating diPEGylated EPO conjugate from PEGylated reaction mixture (protein loading: 1 mg PEGylated EPO mixture after 24 hours incubation; column: SP-5PW C-IEX Column (Tosohaas, 10 μm, column volume 3.3 ml), buffer A: 40 mM NaAc, pH 3.8, 20% isopropanol; buffer B: 1 M NaCl, 40 mM NaAc, pH 3.8, 20% isopropanol; linear concentration Slope). P1: monoPEGylation; P2: diPEGylation; P3: triPEGylation; Min: min. １〜３本の１２ｋＤａ ｍＰＥＧアルデヒド鎖を備えた組換えｈＧＨコンジュゲートの時間依存的な連続的形成を示す図。およそ１５時間インキュベーション後にジＰＥＧ化ｈＧＨを主とした生産が達成され、維持される。FIG. 3 shows time-dependent continuous formation of recombinant hGH conjugates with 1-3 12 kDa mPEG aldehyde chains. Production based on diPEGylated hGH is achieved and maintained after approximately 15 hours of incubation. 配列番号１（１位にメチオニンを含むＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列）。SEQ ID NO: 1 (amino acid sequence of G-CSF containing methionine at position 1). 配列番号２（ＩＦＮα２ａのアミノ酸配列）。SEQ ID NO: 2 (amino acid sequence of IFNα2a). 配列番号３（ＥＰＯのアミノ酸配列）。SEQ ID NO: 3 (amino acid sequence of EPO). 配列番号４（ｈＧＨのアミノ酸配列）。SEQ ID NO: 4 (amino acid sequence of hGH).

Claims (73)

ポリマー・タンパク質コンジュゲートであって、タンパク質のアミノ基の２つの窒素原子が各々アミン結合によってポリマー単位と結合していることを特徴とするコンジュゲート。   A polymer-protein conjugate, wherein two nitrogen atoms of an amino group of a protein are each bonded to a polymer unit by an amine bond. ポリマー単位は、少なくとも１つのポリマー部分とリンカー部分とを含み、該リンカー部分は少なくとも１つのポリマー部分とアミン結合との間に位置する、請求項１に記載のコンジュゲート。   The conjugate of claim 1, wherein the polymer unit comprises at least one polymer moiety and a linker moiety, the linker moiety being located between the at least one polymer moiety and the amine bond. リンカー部分は直線状である、請求項２に記載のコンジュゲート。   The conjugate of claim 2, wherein the linker moiety is linear. リンカー部分は分岐状である、請求項２に記載のコンジュゲート。   The conjugate according to claim 2, wherein the linker moiety is branched. ポリマー単位は２以上のポリマー部分を含む、請求項４に記載のコンジュゲート。   5. A conjugate according to claim 4, wherein the polymer unit comprises two or more polymer moieties. リンカー部分は、アミン結合の窒素原子に結合した少なくとも１つのメチレン基を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲート。   6. A conjugate according to any one of claims 1 to 5, wherein the linker moiety comprises at least one methylene group bonded to the nitrogen atom of the amine bond. リンカー部分は、アミン結合の窒素原子に結合している１〜１２個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは２つのメチレン基を含む、請求項６に記載のコンジュゲート。   The linker moiety comprises 1 to 12, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, most preferably 2 methylene groups attached to the nitrogen atom of the amine bond. Conjugate. タンパク質は生物学的に活性なタンパク質である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。   The conjugate according to any one of claims 1 to 7, wherein the protein is a biologically active protein. タンパク質はグリコシル化タンパク質または非グリコシル化タンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。   9. A conjugate according to any one of claims 1 to 8, wherein the protein is a glycosylated protein or a non-glycosylated protein. タンパク質は、天然型のタンパク質と同じグリコシル化パターンを有する、請求項９に記載のコンジュゲート。   10. A conjugate according to claim 9, wherein the protein has the same glycosylation pattern as the native protein. タンパク質は、天然型のタンパク質とは異なったグリコシル化パターンを有する、請求項９に記載のコンジュゲート。   10. A conjugate according to claim 9, wherein the protein has a glycosylation pattern different from that of the native protein. 下式：
［（Ｒ−Ｌ１−ポリマー）ｙ−Ｌ２−（ＣＨ２−）ｍ−ＮＨ］２−Ｐ
（式中、Ｒは、Ｈ、低級アルキル、アリールまたは任意の適切な保護基であり；ポリマーは、Ｐと結合させるのに適したポリマーであり；ｍはメチレン基の数を表わす整数であり、Ｐは生物学的に活性なタンパク質またはプロテイノイドであって、該タンパク質またはプロテイノイドのアミノ基の２つの窒素原子は各々ポリマー単位と結合しており、Ｌ１はＯ、Ｎ、Ｓ、および分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分のうち少なくともいずれかであって存在していても存在しなくてもよく；Ｌ２は分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分であって存在していても存在しなくてもよく；ｙは整数であり、ただし、Ｌ２が存在しない場合ｙは１であり、Ｌ２が存在する場合ｙは少なくとも１である）を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。 The following formula:
[(R-L 1 - polymer) y -L 2 - (CH 2 -) m -NH] 2 -P
Where R is H, lower alkyl, aryl or any suitable protecting group; the polymer is a polymer suitable for conjugation with P; m is an integer representing the number of methylene groups; P is a biologically active protein or proteinoid wherein the two nitrogen atoms of the amino group of the protein or proteinoid are each bonded to a polymer unit, and L 1 is O, N, S, and branched L 2 may be present or absent, at least one of a branched or unbranched linker moiety; L 2 may be present even if it is a branched or unbranched linker moiety. 12. y is an integer, provided that y is 1 when L 2 is not present and y is at least 1 when L 2 is present. In terms The conjugate as described. ポリマーは、ポリアルキレン・グリコール、多糖、ピロリドン、セルロース、ポリアミノ酸、ポリアクリルアミド、およびこれらの誘導体から成る群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。   13. A conjugate according to any one of claims 1 to 12, wherein the polymer is selected from the group consisting of polyalkylene glycols, polysaccharides, pyrrolidones, celluloses, polyamino acids, polyacrylamides, and derivatives thereof. 下式：
［（Ｒ−Ｌ１−ＰＥＧｙ）−Ｌ２−（ＣＨ２−）ｍ−ＮＨ］２−Ｐ
（式中、Ｒは、Ｈ、低級アルキル、アリールまたは任意の適切な保護基であり；ＰＥＧはポリエチレングリコール部分であり；ｍはメチレン基の数を表わす整数であり、Ｐは生物学的に活性なタンパク質またはプロテイノイドであって、該タンパク質またはプロテイノイドのアミノ基の２つの窒素原子は各々ポリエチレングリコール単位と結合しており、Ｌ１はＯ、Ｎ、Ｓ、および分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分のうち少なくともいずれかであって存在していても存在しなくてもよく；Ｌ２は分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分であって存在していても存在しなくてもよく；ｙは整数であり、ただし、Ｌ２が存在しない場合ｙは１であり、Ｌ２が存在する場合ｙは少なくとも１である）を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。 The following formula:
[(R-L 1 -PEG y ) -L 2 - (CH 2 -) m -NH] 2 -P
Wherein R is H, lower alkyl, aryl or any suitable protecting group; PEG is a polyethylene glycol moiety; m is an integer representing the number of methylene groups and P is biologically active A protein or proteinoid, wherein two nitrogen atoms of the amino group of the protein or proteinoid are each bonded to a polyethylene glycol unit, and L 1 is O, N, S, and branched or unbranched At least one of the linker moieties may or may not be present; L 2 may be a branched or unbranched linker moiety that may or may not be present; y Is an integer, wherein y is 1 if L 2 is not present and y is at least 1 if L 2 is present). The conjugate according to item. ＰＥＧは式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎを有し、前記式中、ｎはポリエチレングリコール単位中のエチレンオキシド残基の数を表す、請求項１４に記載のコンジュゲート。 PEG has the formula - has a (CH 2 -CH 2 -O) n , in the formula, n represents the number of ethylene oxide residues in the polyethylene glycol units conjugate according to claim 14. ｙは１である、請求項１４または１５に記載のコンジュゲート。   16. The conjugate according to claim 14 or 15, wherein y is 1. アミノ基は、Ｎ末端のアミノ基、ε−アミノ基、グアニジン基およびイミダゾール基から成る群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。   The conjugate according to any one of claims 1 to 16, wherein the amino group is selected from the group consisting of an N-terminal amino group, an ε-amino group, a guanidine group and an imidazole group. タンパク質またはプロテイノイドは、増殖因子、抗体、ホルモン、特に治療上活性を有するタンパク質、たとえばエリスロポエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、コンセンサスインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ヒト成長ホルモン、ヘモグロビン、インターロイキン２およびインターロイキン６のようなインターロイキン、腫瘍壊死因子、サイトカイン、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤのような免疫グロブリン、またはそれらの構造的もしくは機能的もしくは構造的かつ機能的なバリアントもしくはフラグメント、のうち少なくともいずれかの生物学的な活性を有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のコンジュゲート。   Proteins or proteinoids are growth factors, antibodies, hormones, particularly therapeutically active proteins such as erythropoietin, interferon alpha, interferon beta, interferon gamma, consensus interferon, G-CSF, GM-CSF, human growth hormone, hemoglobin, Interleukins such as interleukin 2 and interleukin 6, tumor necrosis factor, cytokines, immunoglobulins such as IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, or structural or functional or structural and functional variants thereof The conjugate according to any one of claims 1 to 17, which has biological activity of at least any one of fragments or fragments. タンパク質またはプロテイノイドはＧ−ＣＳＦの生物学的な活性を有する、請求項１８に記載のコンジュゲート。   19. A conjugate according to claim 18, wherein the protein or proteinoid has a biological activity of G-CSF. タンパク質またはプロテイノイドはＩＦＮα２ａの生物学的な活性を有する、請求項１８に記載のコンジュゲート。   19. The conjugate of claim 18, wherein the protein or proteinoid has IFNα2a biological activity. タンパク質またはプロテイノイドはエリスロポエチンの生物学的な活性を有する、請求項１８に記載のコンジュゲート。   19. The conjugate of claim 18, wherein the protein or proteinoid has erythropoietin biological activity. タンパク質またはプロテイノイドはヒト成長ホルモンの生物学的な活性を有する、請求項１８に記載のコンジュゲート。   19. The conjugate of claim 18, wherein the protein or proteinoid has a biological activity of human growth hormone. ２つのアミノ基は、Ｎ末端のアミノ基およびリジン残基のε−アミノ基から成る群から選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。   23. A conjugate according to any one of claims 1 to 22, wherein the two amino groups are selected from the group consisting of an N-terminal amino group and an ε-amino group of a lysine residue. タンパク質は、該タンパク質の野生型の配列のアミノ基含有アミノ酸が、欠失、修飾、付加のいずれも為されていないという点で野生型の配列と同じであるアミノ酸配列を有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。   The protein has an amino acid sequence that is the same as the wild-type sequence in that the amino group-containing amino acid of the wild-type sequence of the protein has not been deleted, modified, or added. 24. The conjugate according to any one of 23. Ｇ−ＣＳＦは配列番号１に特定されたアミノ酸配列を有する、請求項１８、１９、２３
または２４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。 24. G-CSF has the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 1.
Or the conjugate according to any one of 24. ２つのアミノ基は、Ｎ末端のアミノ基、リジン１７のε−アミノ基およびリジン３５のε−アミノ基から成る群から選択される、請求項２５に記載のコンジュゲート。   26. The conjugate according to claim 25, wherein the two amino groups are selected from the group consisting of an N-terminal amino group, an ε-amino group of lysine 17 and an ε-amino group of lysine 35. Ｇ−ＣＳＦはグリコシル化Ｇ−ＣＳＦまたは非グリコシル化Ｇ−ＣＳＦである、請求項２５または請求項２６に記載のコンジュゲート。   27. A conjugate according to claim 25 or claim 26, wherein G-CSF is glycosylated G-CSF or non-glycosylated G-CSF. ＩＦＮα２ａは配列番号２に特定されたアミノ酸配列を有する、請求項１８、２０、２３または２４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。   25. A conjugate according to any one of claims 18, 20, 23 or 24, wherein IFNα2a has the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 2. エリスロポエチンは配列番号３に特定されたアミノ酸配列を有する、請求項１８、２１、２３または２４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。   25. A conjugate according to any one of claims 18, 21, 23 or 24, wherein erythropoietin has the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 3. エリスロポエチンはグリコシル化されている、請求項２９に記載のコンジュゲート。   30. The conjugate of claim 29, wherein erythropoietin is glycosylated. ヒト成長ホルモンは配列番号４に特定されたアミノ酸配列を有する、請求項１８、２２、２３または２４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。   25. A conjugate according to any one of claims 18, 22, 23 or 24, wherein the human growth hormone has the amino acid sequence specified in SEQ ID NO: 4. Ｒは、メチル、エチル、プロピル、ブチルおよびベンジルから成る群から選択される、低級アルキルまたはアリールである、請求項１２または１４に記載のコンジュゲート。   15. A conjugate according to claim 12 or 14, wherein R is lower alkyl or aryl selected from the group consisting of methyl, ethyl, propyl, butyl and benzyl. ポリエチレングリコール部分の分子量は、２〜１００ｋＤａ、より好ましくは５〜６０ｋＤａ、最も好ましくは１０〜３０ｋＤａである、請求項１３〜３２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。   33. A conjugate according to any one of claims 13 to 32, wherein the molecular weight of the polyethylene glycol moiety is 2 to 100 kDa, more preferably 5 to 60 kDa, most preferably 10 to 30 kDa. ｍは、１〜１２、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３、最も好ましくは２である、請求項１２〜３３のいずれか１項に記載のコンジュゲート。   34. A conjugate according to any one of claims 12 to 33, wherein m is 1 to 12, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, most preferably 2. 請求項１〜３４のいずれか１項に記載のポリマー・タンパク質コンジュゲートを、少なくとも１つ、好ましくは２つ含んでなる医薬調製物。   A pharmaceutical preparation comprising at least one, preferably two, polymer-protein conjugates according to any one of claims 1 to 34. 請求項１４〜３４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートを、多重ＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートとともに混合して含む、ＰＥＧタンパク質コンジュゲートの混合医薬調製物であって、該混合医薬調製物における前記ジＰＥＧ化タンパク質コンジュゲートの割合が予め指定されていることを特徴とする調製物。   A mixed pharmaceutical preparation of PEG protein conjugates comprising at least one diPEGylated protein conjugate according to any one of claims 14 to 34 in admixture with multiple PEGylated protein conjugates, comprising: A preparation characterized in that the proportion of said diPEGylated protein conjugate in a mixed pharmaceutical preparation is pre-specified. Ｎ末端のアミノ基およびリジン１７のε−アミノ基にポリエチレングリコール単位が結合しているＧ−ＣＳＦと、Ｎ末端のアミノ基およびリジン３５のε−アミノ基にポリエチレングリコール単位が結合しているＧ−ＣＳＦとから成る群から選択される２つのポリエチレングリコール・Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートを含んでなる、請求項３５または請求項３６に記載の調製物。   G-CSF in which a polyethylene glycol unit is bonded to the N-terminal amino group and the ε-amino group of lysine 17; 37. A preparation according to claim 35 or claim 36, comprising two polyethylene glycol G-CSF conjugates selected from the group consisting of -CSF. 薬学的に許容可能な希釈剤、担体、バッファー、およびアジュバントのうち少なくともいずれか１つをさらに含んでなる、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の調製物。   38. The preparation of any one of claims 35 to 37, further comprising at least one of a pharmaceutically acceptable diluent, carrier, buffer, and adjuvant. ポリマー・タンパク質コンジュゲートの調製方法であって、タンパク質をポリマー試薬と反応させてポリマー・タンパク質コンジュゲートを生成させる第１の反応ステップと、第１の反応ステップの望ましくない生成物の一部または全部を用いて反応ステップを繰り返す再利用ステップとを含む方法。   A method for preparing a polymer-protein conjugate, comprising a first reaction step in which a protein is reacted with a polymer reagent to produce a polymer-protein conjugate, and some or all of the undesired products of the first reaction step And a reusing step of repeating the reaction step using ポリマー・タンパク質コンジュゲートの調製方法であって、少なくとも２つのアミノ基を有するタンパク質を、単一のアルデヒド基を有するポリマー試薬と還元剤存在下に反応させることを含み、反応時間は、タンパク質のアミノ基の２つの窒素原子がアミン結合によってポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲートが選択的に生成されるように調節されていることを特徴とする方法。   A method for preparing a polymer-protein conjugate, comprising reacting a protein having at least two amino groups with a polymer reagent having a single aldehyde group in the presence of a reducing agent, wherein the reaction time is the amino acid of the protein A process characterized in that it is regulated to selectively produce a polymer-protein conjugate in which the two nitrogen atoms of the group are linked to the polymer unit by an amine bond. ポリマー試薬は、ポリアルキレン・グリコール、多糖、ピロリドン、セルロース、ポリアミノ酸部分、ポリアクリルアミド、およびこれらの誘導体のうち少なくともいずれかを含む、請求項３９または４０に記載の方法。   41. The method of claim 39 or 40, wherein the polymeric reagent comprises at least one of polyalkylene glycol, polysaccharide, pyrrolidone, cellulose, polyamino acid moiety, polyacrylamide, and derivatives thereof. タンパク質は、増殖因子、抗体、ホルモン、特に治療上活性を有するタンパク質、たとえばエリスロポエチン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、コンセンサスインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ヒト成長ホルモン、ヘモグロビン、インターロイキン２およびインターロイキン６のようなインターロイキン、腫瘍壊死因子、サイトカイン、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤのような免疫グロブリン、またはそれらの構造的もしくは機能的もしくは構造的かつ機能的なバリアントもしくはフラグメント、のうち少なくともいずれかの生物学的な活性を有するタンパク質またはプロテイノイドである、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。   Proteins are growth factors, antibodies, hormones, particularly therapeutically active proteins such as erythropoietin, interferon α, interferon β, interferon γ, consensus interferon, G-CSF, GM-CSF, human growth hormone, hemoglobin, interleukin 2 And interleukins such as interleukin 6, tumor necrosis factor, cytokines, immunoglobulins such as IgG, IgE, IgM, IgA, IgD, or structural or functional or structural and functional variants or fragments thereof, 42. The method according to any one of claims 39 to 41, which is a protein or proteinoid having at least any one of the biological activities. 反応時間は、該方法の生成物の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％が、タンパク質のアミノ基の２つの窒素原子がアミン結合によりポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲートであるように選択される、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。   The reaction time is at least 20%, preferably at least 25%, more preferably at least 30%, most preferably at least 40% of the product of the process, wherein two nitrogen atoms of the amino group of the protein are polymer units due to amine bonds 43. The method of any one of claims 39 to 42, wherein the method is selected to be a polymer-protein conjugate that is bound to. 反応時間は、６ｈ〜４８ｈ、好ましくは１２ｈ〜４８ｈ、より好ましくは１６ｈ〜３６ｈ、最も好ましくは１８ｈ〜３２ｈである、請求項３９〜４３のいずれか１項に記載の方法。   44. A process according to any one of claims 39 to 43, wherein the reaction time is 6h to 48h, preferably 12h to 48h, more preferably 16h to 36h, most preferably 18h to 32h. ポリマー・タンパク質コンジュゲートは、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のポリマー・タンパク質コンジュゲートである、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の方法。   45. The method according to any one of claims 39 to 44, wherein the polymer-protein conjugate is a polymer-protein conjugate according to any one of claims 1-34. 反応は、タンパク質濃度を０．５〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約３．２ｍｇ／ｍｌとして行われる、請求項３９〜４５のいずれか１項に記載の方法。   46. The method according to any one of claims 39 to 45, wherein the reaction is performed at a protein concentration of 0.5 to 100 mg / ml, more preferably 1 to 10 mg / ml, most preferably about 3.2 mg / ml. . 反応は、タンパク質とポリマーとのモル比を１：１〜１：４００、好ましくは１：５〜１：５０、より好ましくは１：１０〜１：３０として行われる、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。   47. A reaction according to any of claims 39 to 46, wherein the reaction is carried out at a protein to polymer molar ratio of 1: 1 to 1: 400, preferably 1: 5 to 1:50, more preferably 1:10 to 1:30. The method according to claim 1. タンパク質がグリコシル化タンパク質である場合、反応は、タンパク質内のアミノ基とポリマー分子との化学量論比を、１０：１〜１：８０、好ましくは１：０．３〜１：５０、より好ましくは２：１〜１：２０として行われる、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の方法。   If the protein is a glycosylated protein, the reaction will result in a stoichiometric ratio of amino groups in the protein to the polymer molecule of 10: 1 to 1:80, preferably 1: 0.3 to 1:50, more preferably 48. The method according to any one of claims 39 to 47, wherein is performed as 2: 1 to 1:20. タンパク質が非グリコシル化タンパク質である場合、反応は、タンパク質内のアミノ基とポリマー分子との化学量論比を、１：１〜１：８０、好ましくは１：１．２５〜１：８０、より好ましくは１：１．２５〜１：５０、さらに一層好ましくは１：１．２５〜１：
３０、最も好ましくは１：２〜１：１０として行われる、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の方法。 If the protein is a non-glycosylated protein, the reaction will produce a stoichiometric ratio of amino groups in the protein to the polymer molecule of 1: 1 to 1:80, preferably 1: 1.25 to 1:80. Preferably 1: 1.25 to 1:50, even more preferably 1: 1.25 to 1:
48. The method of any one of claims 39 to 47, wherein the method is performed as 30, most preferably 1: 2 to 1:10. 還元的アルキル化において使用される還元剤は、ＮａＣＮＢＨ４またはＮａＢＨ４のうち少なくともいずれか一方である、請求項３９〜４９のいずれか１項に記載の方法。 The reducing agent used in the reductive alkylation is on at least one of NaCNBH 4 or NaBH 4, The method according to any one of claims 39 to 49. 反応はｐＨ６．９〜７．８で行われる、請求項３９〜５０のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 39 to 50, wherein the reaction is carried out at a pH of 6.9 to 7.8. 反応は、リン酸塩、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳおよびその他の適切なバッファーから選択されたバッファーの存在下で行われる、請求項３９〜５１のいずれか１項に記載の方法。   52. A method according to any one of claims 39 to 51, wherein the reaction is carried out in the presence of a buffer selected from phosphate, acetate, HEPES, MES and other suitable buffers. 反応は、２℃〜５０℃、好ましくは２℃〜８℃の温度で行われる、請求項３９〜５２のいずれか１項に記載の方法。   53. A process according to any one of claims 39 to 52, wherein the reaction is carried out at a temperature of 2 [deg.] C to 50 [deg.] C, preferably 2 [deg.] C to 8 [deg.] C. ポリマー試薬は、次式：
［Ｒ−Ｌ１−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ］ｙ−Ｌ２−（ＣＨ２−）ｍ−１−ＣＨＯ（式中、Ｒは、Ｈ、低級アルキル、アリールまたは任意の適切な保護基であり；ｎは、ポリエチレングリコール部分の中のエチレンオキシド残基の数を表す整数であり；ｍはメチレン基の数を表わす整数であり；Ｌ１は、Ｏ、Ｎ、Ｓおよび分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分のうち少なくともいずれかであって存在していても存在しなくてもよく；Ｌ２は、分岐状もしくは非分岐状のリンカー部分であって存在していても存在しなくてもよく；ｙは整数であって、ただしＬ２が存在しない場合にはｙは１であり、Ｌ２が存在する場合にはｙは少なくとも１である）を有する試薬である、請求項３９〜５３のいずれか１項に記載の方法。 The polymer reagent has the following formula:
[R-L 1 - (CH 2 -CH 2 -O) n] y -L 2 - (CH 2 -) m-1 -CHO ( wherein, R, H, lower alkyl, aryl or any suitable A protecting group; n is an integer representing the number of ethylene oxide residues in the polyethylene glycol moiety; m is an integer representing the number of methylene groups; L 1 is O, N, S and branched or may be absent be present be at least one of the non-branched linker moiety; L 2 is not present or is present in a branched or unbranched linker moiety 40, wherein y is an integer, wherein y is 1 if L 2 is not present and y is at least 1 if L 2 is present). 54. The method according to any one of -53. ポリマー試薬は、ＰＥＧアルデヒド、好ましくはメトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒドである、請求項５４に記載の方法。   55. The method of claim 54, wherein the polymeric reagent is PEG aldehyde, preferably methoxypolyethylene glycol acetaldehyde. メトキシポリエチレングリコール・アセトアルデヒドは、窒素下で−２０℃以下の温度で固体物質として保存される、請求項５５に記載の方法。   56. The method of claim 55, wherein the methoxypolyethylene glycol acetaldehyde is stored as a solid material at a temperature of -20 <0> C or less under nitrogen. ポリエチレングリコール・アセトアルデヒドは、対応するポリエチレングリコールジエチルアセタールを活性化して得られる、請求項５５または５６に記載の方法。   The method according to claim 55 or 56, wherein the polyethylene glycol acetaldehyde is obtained by activating the corresponding polyethylene glycol diethyl acetal. 精製ステップをさらに含み、該ステップは、タンパク質の２つの所定のアミノ基が各々１つのポリマー単位と結合しているジポリマー・タンパク質コンジュゲートの生成物プールをもたらし、かつ、未反応タンパク質、未反応ポリマー試薬、生成物プールのジポリマー・タンパク質コンジュゲート・アイソフォーム以外のジポリマー・タンパク質コンジュゲート・アイソフォーム、およびタンパク質の２未満もしくは３以上のアミノ基がポリマー単位と結合しているポリマー・タンパク質コンジュゲート、のうち少なくともいずれか１つを含有する残余物プールを生じさせる、請求項３９〜５７のいずれか１項に記載の方法。   Further comprising a purification step, wherein the step results in a product pool of dipolymer protein conjugates in which two predetermined amino groups of the protein are each bound to one polymer unit, and unreacted protein, unreacted polymer Reagents, dipolymers / protein conjugates / isoforms other than dipolymers / protein conjugates / isoforms of product pools, and polymer / protein conjugates in which less than 2 or more amino groups of proteins are bound to polymer units, 58. A method according to any one of claims 39 to 57, wherein a residue pool containing at least one of the above is generated. 精製ステップはイオン交換クロマトグラフィーによって行われる、請求項５８に記載の方法。   59. The method of claim 58, wherein the purification step is performed by ion exchange chromatography. 請求項３９〜５７のいずれか１項に記載の方法が残余物プールを用いて繰り返され、得られた生成物プールが好ましくは前記生成物プールと混合される、請求項５８または５９
に記載の方法。 58. The method of any one of claims 39 to 57 is repeated with a residue pool, and the resulting product pool is preferably mixed with the product pool.
The method described in 1. 第１の反応ステップは、請求項３９〜５７のいずれか１項に記載の方法に相当する、請求項３９に記載の方法。   The method according to claim 39, wherein the first reaction step corresponds to the method according to any one of claims 39 to 57. 再利用ステップは、請求項６０に記載の方法を含む、請求項３９に記載の方法。   40. The method of claim 39, wherein the reusing step comprises the method of claim 60. 請求項３９〜６２のいずれか１項に記載の方法に従って調製されたポリマー・タンパク質コンジュゲート。   64. A polymer-protein conjugate prepared according to the method of any one of claims 39-62. 請求項１〜３４または６３のいずれか１項に記載のポリマー・タンパク質コンジュゲート、または請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の医薬調製物の、疾患治療用の薬剤の製造のための使用。   A polymer-protein conjugate according to any one of claims 1-34 or 63, or a pharmaceutical preparation according to any one of claims 35-38, for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases. use. ポリマー・タンパク質コンジュゲートはポリマー・Ｇ−ＣＳＦコンジュゲートである、請求項６４に記載の使用。   65. Use according to claim 64, wherein the polymer-protein conjugate is a polymer-G-CSF conjugate. 疾患は、化学療法、放射線療法および感染のうち少なくともいずれかによって引き起こされる好中球減少症および白血病のうち少なくともいずれか一方である、請求項６５に記載の使用。   66. The use according to claim 65, wherein the disease is at least one of neutropenia and leukemia caused by chemotherapy, radiation therapy and / or infection. ポリマー・タンパク質コンジュゲートはポリマー・ＩＦＮα２ａコンジュゲートである、請求項６４に記載の使用。   65. Use according to claim 64, wherein the polymer-protein conjugate is a polymer-IFNα2a conjugate. 疾患は、感染症、特に肝炎である、請求項６７に記載の使用。   68. Use according to claim 67, wherein the disease is an infectious disease, in particular hepatitis. ポリマー・タンパク質コンジュゲートはポリマー・エリスロポエチンコンジュゲートである、請求項６４に記載の使用。   65. Use according to claim 64, wherein the polymer protein conjugate is a polymer erythropoietin conjugate. 疾患は貧血症である、請求項６９に記載の使用。   70. Use according to claim 69, wherein the disease is anemia. ポリマー・タンパク質コンジュゲートはポリマー・成長ホルモンコンジュゲートである、請求項６４に記載の使用。   65. Use according to claim 64, wherein the polymer-protein conjugate is a polymer-growth hormone conjugate. 疾患は成長ホルモン欠損症である、請求項７１に記載の使用。   72. Use according to claim 71, wherein the disease is growth hormone deficiency. タンパク質の免疫原性を低減するための、請求項１〜３４または６３のいずれか１項に記載のポリマー・タンパク質コンジュゲートの使用。   64. Use of the polymer-protein conjugate of any one of claims 1-34 or 63 for reducing the immunogenicity of a protein.
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