JP2008529516A

JP2008529516A - Nucleic acid isolation methods including the use of ethylene glycol multimers

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Publication number: JP2008529516A
Application number: JP2007554647A
Authority: JP
Inventors: アーリングフィン
Original assignee: インヴィトロジェンダイナルエーエス
Priority date: 2005-02-11
Filing date: 2006-02-13
Publication date: 2008-08-07
Also published as: US20140094597A1; US20090069554A1; CA2597482A1; ATE476505T1; US9464316B2; US8569477B2; WO2006085104A1; EP1859038B1; AU2006212024A1; EP1859038A1

Abstract

A method of isolating nucleic acid from a sample is provided that includes contacting a sample that includes nucleic acid with a solid support, wherein the surface of the solid support includes groups that can complex with the nucleic acid, in the presence of a solution that includes an oligoethylene glycol having 10 or fewer ethylene oxide-units and a salt comprising a monovalent or divalent metal ion, whereby soluble nucleic acid in said sample binds to the surface of the support; separating the solid support with bound nucleic acid from the sample; and eluting the bound nucleic acid from the solid support, thereby isolating nucleic acid from the sample. Also provided is a method of washing nucleic acids bound to a solid support that includes providing a solid support, wherein nucleic acid molecules are bound to the surface of the solid support; and washing the solid support with a solution that includes an oligoethylene glycol having 10 or fewer ethylene oxide units.

Description

本発明はサンプルからの核酸の単離方法、特にDNAまたはRNAの単離方法に関する。 The present invention relates to a method for isolating a nucleic acid from a sample, particularly a method for isolating DNA or RNA.

DNAまたはRNAの単離は、多くの生化学的及び臨床的手法における重要な段階である。例えば、通常そこに存在する複雑な混合物からの核酸の単離は、他の研究及び手順、例えば検出、クローニング、塩基配列決定、増幅、ハイブリダイゼーション、cDNA合成、核酸構造及び組成物の検討（例えばDNAのメチル化パターン）などの前に通常必要であり、かかる複雑な混合物における大量の細胞またはその他、例えばタンパク質または炭水化物の混入物の存在は、しばしば分子生物学において用いる反応及び技術の多くにとり妨げとなる。更に、DNAはRNA調製物に混入し、またその逆もありえる。すなわち、調製の観点のみならず、今日用いられる多くの方法においても、細胞、組織などの複雑な混合物からの核酸の単離方法であって、例えば微生物感染症診断、法医学、組織及び血液のタイピング、遺伝子のタイピング、遺伝的変異の検出用途でのDNAまたはRNAの同定に適用可能であることが要求される。また、DNAまたはRNAが富化されてはいるが未だ混入物の存在するサンプルからのそれらの精製に対するニーズが存在し、例えば合成により調製された核酸物質の精製、例えばPCR生成物の場合の混入する塩類、過剰なプライマー及び／またはdNTPからの精製が挙げられる。 DNA or RNA isolation is an important step in many biochemical and clinical procedures. For example, the isolation of nucleic acids from the complex mixtures normally present therein can include other studies and procedures such as detection, cloning, sequencing, amplification, hybridization, cDNA synthesis, nucleic acid structure and composition studies (eg, The presence of large amounts of cells or other contaminants such as proteins or carbohydrates in such complex mixtures often hinders many of the reactions and techniques used in molecular biology. It becomes. In addition, DNA can be mixed into RNA preparations and vice versa. That is, not only in terms of preparation, but also in many methods used today, nucleic acid isolation methods from complex mixtures of cells, tissues, etc., such as microbial infection diagnosis, forensic medicine, tissue and blood typing It is required to be applicable to the identification of DNA or RNA for gene typing and detection of genetic variation. There is also a need for the purification of samples from samples that are enriched in DNA or RNA but still contain contaminants, eg purification of nucleic acid material prepared synthetically, eg contamination in the case of PCR products. Purification from excess salts, excess primers and / or dNTPs.

特に核酸診断法、母集団検討及び遺伝子タイピングの分野で、高品質及び純粋な核酸調製を取得することは、更なる増幅及び／または検出段階を確実かつ正確に実施することを可能にするために重要である。 Obtaining high-quality and pure nucleic acid preparations, in particular in the fields of nucleic acid diagnostics, population studies and genotyping, to ensure that further amplification and / or detection steps can be carried out reliably and accurately is important.

RNA同定に関しては、検出した配列がRNA分子に由来し、サンプル中のゲノムDNAの混入物に由来しないことを確証することが、確定的な診断にとり重要である。このため、DNAからのRNAの単離方法は重要である。また、RNA分子は通常非常に不安定であり、細胞及び体液に存在するRNaseによって急速に分解するため、迅速なRNA単離方法が必要とされる。RNAの品質はおそらく、mRNAを利用したプロトコル、特にcDNA合成の最終的な結果の質を左右する最も重要な因子であろう。多くの理由により、RNA調製におけるDNA混入の回避は重要である。第1に、DNAは粘度を上昇させ、サンプル処理を困難にしてRNA収率を低下させ、更にはDNA混入の可能性によりRNAの品質を低下させる。また、DNA混入によりRNase酵素がトラップされ、RT−PCRなどの下流の用途を無価値なものにしうる。 With respect to RNA identification, it is important for definitive diagnosis that the detected sequence is derived from RNA molecules and not from genomic DNA contaminants in the sample. For this reason, a method for isolating RNA from DNA is important. Also, RNA molecules are usually very unstable and are rapidly degraded by RNases present in cells and body fluids, so a rapid RNA isolation method is required. RNA quality is probably the most important factor in determining the quality of the final results of mRNA synthesis protocols, especially cDNA synthesis. For many reasons, avoiding DNA contamination in RNA preparation is important. First, DNA increases viscosity, making sample processing difficult, reducing RNA yield, and further reducing RNA quality due to the possibility of DNA contamination. Moreover, RNase enzyme is trapped by DNA contamination, and downstream applications such as RT-PCR can be made worthless.

核酸単離方法には多くの方法が公知であるが、一般的に、これらは抽出及び洗浄段階などの一連の複雑な手順を要し、時間や手間がかかる。更に、アルコールや他の有機溶剤、カオトロピック剤及びプロテイナーゼなどの試薬の使用を伴うが、かかる試薬は多くの酵素反応や他の下流の処理工程にとり妨げとなりうるため、望ましくない。 Numerous methods are known for nucleic acid isolation methods. In general, these methods require a series of complicated procedures such as extraction and washing steps, which are time consuming and laborious. Further, it involves the use of reagents such as alcohol and other organic solvents, chaotropic agents and proteinases, which are undesirable because they can interfere with many enzymatic reactions and other downstream processing steps.

すなわち、血液または血液製剤または組織などの複雑な開始材料からの、古典的な核酸単離方法には、界面活性剤またはカオトロピック剤による生物材料の溶解（可能であればタンパク質分解酵素の存在下）、次いで有機溶剤、例えばフェノール及び／またはクロロホルム、エタノール沈殿による幾つかの抽出、遠心分離及び核酸の透析が含まれる。DNAからのRNA精製法としては、フェノール抽出とエタノール沈殿を組み合わせたLiClによる選択的な沈殿またはグアニジウムチオシアネートによる選択的な単離が挙げられる。かかる方法は実行するのが困難でかつ時間がかかるのみならず、同時に複数のサンプルを処理する場合には、必要となる比較的多数の段階の存在によりサンプルの分解、サンプルの損失またはクロスコンタミネーションの危険性が増加する。RNA単離の場合、DNA混入の危険度が比較的高い。 That is, classical nucleic acid isolation methods from complex starting materials such as blood or blood products or tissues include lysis of biological material with detergents or chaotropic agents (possibly in the presence of proteolytic enzymes). And then organic solvents such as phenol and / or chloroform, several extractions by ethanol precipitation, centrifugation and nucleic acid dialysis. RNA purification methods from DNA include selective precipitation with LiCl, combined with phenol extraction and ethanol precipitation, or selective isolation with guanidinium thiocyanate. Such methods are not only difficult and time consuming to perform, but also when processing multiple samples at the same time, due to the relatively large number of steps required, sample degradation, sample loss or cross-contamination The risk of increases. In the case of RNA isolation, the risk of DNA contamination is relatively high.

RNAの精製において、一般的にmRNAを特異的に単離することが望ましい。大部分のmRNA精製ストラテジーには、全RNAの単離及び単離されたRNAの分画が含まれる。高品質でのmRNA調製は、遺伝子構造及び遺伝子調節の解析における重要な段階である。 In RNA purification, it is generally desirable to specifically isolate mRNA. Most mRNA purification strategies include isolation of total RNA and fractionation of isolated RNA. High quality mRNA preparation is an important step in the analysis of gene structure and gene regulation.

大部分の真核生物mRNAは典型的に約50〜300ヌクレオチド長のポリ（A）テールを有する。かかるmRNAはポリアデニル化またはポリ（A）^＋mRNAと呼ばれる。このポリアデニル化RNAを細胞中の全RNAの95％またはそれ以上を占める非アデニル化RNAから分離する際、このポリ（A）テールは有利であり、ポリ（A）テールとの親和性による若干の単離方法により実施する。従来の技術には、全RNAの精製を行う第一段階、及びオリゴ（dT）−セルロースを用いた親和性クロマトグラフィによるポリ（A）^＋RNAの選択行う第二段階が含まれる。このストラテジーは比較的時間と手間がかかる。mRNA精製の他のストラテジーとして、固体支持体、例えばマイクロプレート、ラテックス、アガロースまたは磁気ビーズに結合させたオリゴ（dT）の使用が挙げられる。 Most eukaryotic mRNAs typically have a poly (A) tail that is about 50-300 nucleotides in length. Such mRNA is referred to as polyadenylation or poly (A) ⁺ mRNA. This poly (A) tail is advantageous when separating this polyadenylated RNA from non-adenylated RNA, which accounts for 95% or more of the total RNA in the cell, and some of the affinity for the poly (A) tail Performed by isolation method. The prior art includes a first step of purifying total RNA and a second step of selecting poly (A) ⁺ RNA by affinity chromatography using oligo (dT) -cellulose. This strategy is relatively time consuming and laborious. Other strategies for mRNA purification include the use of oligo (dT) bound to a solid support such as microplates, latex, agarose or magnetic beads.

mRNA操作においてビーズが有利であると判明したため、ここ数年来、ポリ（A）^＋RNA選択にかかる磁気ビーズを応用したストラテジーの採用が普及している。多くのアプローチにおいて、生成物の収率及び品質は、mRNAがヌクレアーゼ及び他の混入物質からいかに急速に精製できるかに依存する。磁気ビーズ分離技術を用いることにより、純粋かつ完全なポリ（A）^＋RNAを、全RNA調製、またはより重要には固形組織、細胞または体液から調製した粗溶解物から直接に迅速に得ることが可能となる。全ての手順は、微量遠心管中でフェノール抽出またはエタノール沈殿を伴わずに実施可能である。 Since it has been found that beads are advantageous in mRNA manipulation, the adoption of strategies using magnetic beads for poly (A) ⁺ RNA selection has been widespread for several years. In many approaches, product yield and quality depend on how rapidly mRNA can be purified from nucleases and other contaminants. By using magnetic bead separation technology, pure and complete poly (A) ⁺ RNA can be obtained rapidly directly from total RNA preparations or more importantly from crude lysates prepared from solid tissues, cells or body fluids It becomes possible. All procedures can be performed in a microcentrifuge tube without phenol extraction or ethanol precipitation.

固相と組み合わせて使用できる一つの一般的なRNA精製方法は、生物材料の溶解、それに続くLiCl及びLiDS／SDSバッファ中でのオリゴdTとのハイブリダイゼーションにより行われ、このことにより余計な段階、例えばフェノール抽出またはプロテイナーゼK消化を省略できる。直接の全mRNA単離には約15分かかり、mRNAは溶解緩衝液中で30分を超える時間安定であるため、精製mRNAの品質の高さが確保される。しかしながら、この方法の不利な点は、組織の単位重量当たりのmRNA量が、用いる組織の量に影響を受けるということであり、すなわち細胞溶解物が閾値を上回る場合にはmRNAの収率が減少する。 One common RNA purification method that can be used in combination with a solid phase is performed by lysis of the biological material followed by hybridization with oligo dT in LiCl and LiDS / SDS buffer, which provides an extra step, For example, phenol extraction or proteinase K digestion can be omitted. Direct total mRNA isolation takes about 15 minutes, and the mRNA is stable in lysis buffer for more than 30 minutes, ensuring high quality of purified mRNA. However, the disadvantage of this method is that the amount of mRNA per unit weight of tissue is affected by the amount of tissue used, i.e., the yield of mRNA is reduced if the cell lysate exceeds a threshold. To do.

他の一般的なmRNAの直接精製法では、上記したようにグアニジウムイソチオシアネート（GTC）及びザルコシルが使用される。GTC−バッファ系は、このカオトロピック塩のRNase阻害能力により、多くの研究者に好まれる。これを磁気ビーズ法と組み合わせて用いることもできる。 Other common methods for direct purification of mRNA use guanidinium isothiocyanate (GTC) and sarkosyl as described above. The GTC-buffer system is preferred by many researchers due to the ability of this chaotropic salt to inhibit RNase. This can also be used in combination with the magnetic bead method.

しかしながら、4M GTC中における細胞可溶化物の粘性は高いため、ビーズを磁石によって効果的に吸引できず、それによりビーズや他の固相にとってDNA混入の危険性が増加し、あるいは収率が低下することもある。 However, due to the high viscosity of the cell lysate in 4M GTC, the beads cannot be effectively aspirated by the magnet, thereby increasing the risk of DNA contamination for beads and other solid phases, or reducing yield. Sometimes.

近年、固相の使用に基づく他の方法が提案されている。US-A-5,234,809では例えば、グアニジウム塩などのカオトロピック剤の存在下で核酸をシリカ粒子の形の固相に密接に結合し、それによりサンプル中の物質と分離する方法が記載されている。国際公開公報第91／12079号では、核酸を固相の表面にトラップさせ、沈殿させる方法が記載されている。一般的に、アルコール及び塩が沈殿剤として用いられる。 Recently, other methods based on the use of solid phases have been proposed. US-A-5,234,809 describes, for example, a method in which nucleic acids are closely bound to a solid phase in the form of silica particles in the presence of a chaotropic agent such as a guanidinium salt, thereby separating them from the substance in the sample. International Publication No. 91/12079 describes a method of trapping and precipitating nucleic acids on the surface of a solid phase. In general, alcohols and salts are used as precipitants.

米国特許第5,705,628号及び米国特許第5,898,071号では、7〜13％の濃度の高分子ポリアルキレングリコール（例えばポリエチレングリコール）と、0.5〜5Mの範囲の塩の組合せを使用して、DNAのバイオ親和性吸収剤として機能する固体支持体上の官能基に結合させることを特徴とする、核酸断片の単離方法が記載されている。 US Pat. No. 5,705,628 and US Pat. No. 5,898,071 use a combination of high molecular weight polyalkylene glycol (eg, polyethylene glycol) at a concentration of 7-13% and a salt in the range of 0.5-5 M to biocompatible DNA. A method for isolating a nucleic acid fragment is described, characterized in that it is attached to a functional group on a solid support that functions as an absorbent.

一般にかかる方法により核酸分離作業の速度が向上するが、アルコール、カオトロピック剤、塩、高分子などの試薬の使用を伴うという不利な点がある。 In general, such a method improves the speed of nucleic acid separation work, but has the disadvantage that it involves the use of reagents such as alcohol, chaotropic agents, salts and polymers.

高分子は液体の粘度を上昇させ、精製プロトコルを実施する際の効率を低下させる。磁気ビーズの分離の場合、ビーズを分離するための磁石との接触回数を増加させる必要があることから、かかる大型の分子は単離速度を減少させる。更に、かかるシステムでは高分子が存在する場合には上澄みの除去がより困難となる。 The polymer increases the viscosity of the liquid and reduces the efficiency in performing the purification protocol. In the case of magnetic bead separation, such large molecules reduce the isolation rate because the number of contacts with the magnet for separating the beads needs to be increased. Furthermore, such a system makes it more difficult to remove the supernatant when a polymer is present.

カオトロピック剤は高いモル濃度での使用が必要であり、それにより溶液の粘性が高くなり、特にRNAの場合操作が困難になる。PCR及び他の酵素に基づく反応などの増幅方法の場合、アルコール及び他の試薬による阻害的、或いは妨害的な効果に非常に影響される。更に、アルコール沈殿の後で必要となる核酸ペレットの乾燥、及び核酸の溶解に関する問題は、PCRなどの酵素を基本とする手法においてアーティファクトを生じさせることも公知である。 Chaotropic agents need to be used at high molar concentrations, which makes the solution more viscous and difficult to manipulate, especially in the case of RNA. In the case of amplification methods such as PCR and other enzyme-based reactions, they are very sensitive to the inhibitory or disruptive effects of alcohol and other reagents. Furthermore, it is also known that problems with drying nucleic acid pellets and nucleic acid dissolution required after alcohol precipitation cause artifacts in enzyme-based techniques such as PCR.

上記の方法が現在の分子生物学の到達点であるため、改良された核酸単離方法、特に迅速でありかつ実施が簡便で、損失なく良好な収率を可能にし、溶媒及びカオトロピック剤若しくはアルコール沈殿の使用、または高濃度の塩及び／若しくは高い粘性を有する高分子化合物の使用を回避する方法に対するニーズが存在する。また、RNAとDNAの分離を可能にし、同じサンプルからのいずれのタイプの核酸の単離も可能にする方法に対するニーズも存在する。本発明はかかる方法を提供する。 Because the above method is the current molecular biology attainment, improved nucleic acid isolation methods, particularly rapid and simple to perform, allow good yields without loss, solvent and chaotropic agents or alcohols There is a need for methods that avoid the use of precipitation or the use of high concentrations of salts and / or high viscosity polymeric compounds. There is also a need for a method that allows the separation of RNA and DNA and allows the isolation of any type of nucleic acid from the same sample. The present invention provides such a method.

特に、核酸は塩基配列決定または他の分析などの、増幅または増幅の後の他の下流側の処理に適する形で、単純かつ容易に実施できる方法でサンプルから単離できることを見出した。すなわち該方法は、サンプルを界面活性剤（必要な場合）で処理し、2〜70のエチレンオキシド単位（例えばテトラエチレングリコール）からなる高濃度の分子の存在下で核酸を固体支持体に結合させることを特徴とし、それにより、例えば支持体の除去によって核酸をサンプルから簡便に分離できる。上記のような核酸の結合は、その配列とは無関係である。 In particular, it has been found that nucleic acids can be isolated from a sample in a manner that is simple and easy to perform, suitable for amplification or other downstream processing after amplification, such as sequencing or other analyses. That is, the method treats a sample with a surfactant (if necessary) and binds the nucleic acid to the solid support in the presence of a high concentration of molecules consisting of 2-70 ethylene oxide units (eg, tetraethylene glycol). Whereby the nucleic acid can be conveniently separated from the sample, for example by removal of the support. Nucleic acid binding as described above is independent of its sequence.

以上より本発明の一態様では、サンプルからの核酸単離方法を提供し、該方法は、前記サンプルを、2〜70個のエチレンオキシド単位（好ましくはオリゴエチレングリコール、特に好ましくはテトラエチレングリコール（テトラEGまたはTEG称する））からなる分子の存在下で固体支持体と接触させ、これにより前記サンプル中の可溶性の核酸を支持体の表面に結合させる段階と、結合した核酸と共に前記支持体をサンプルから分離する段階とを含む。 As described above, in one embodiment of the present invention, a method for isolating nucleic acid from a sample is provided, in which the sample is divided into 2 to 70 ethylene oxide units (preferably oligoethylene glycol, particularly preferably tetraethylene glycol (tetra Contacting the solid support in the presence of a molecule consisting of EG or TEG), thereby binding soluble nucleic acid in the sample to the surface of the support, and the support together with the bound nucleic acid from the sample. Separating.

本発明で用いる分子は、2〜70個のエチレンオキシド（すなわち−O−CH₂−CH₂）単位、好ましくは線形のものからなる多量体（すなわち分子量約100〜3100）である。かかる分子は本明細書において、エチレングリコール多量体と称され、一般式H−（O−CH₂−CH₂）_n−OHを有する。ここで、nはエチレンオキシド単位の数である。好ましい分子は、2〜60、50、40、30または20個の単量体を有する。エチレングリコール多量体、特により大きな多量体の場合を含む組成物は、まさしくその性質によって、様々な長さの多量体を含有できる。本明細書でいう多量体のサイズとは、組成物中の多量体に存在する単量体の平均数をいう。2〜70個の単量体を有する1つまたは複数の分子を溶液で使用できる（すなわち1つの特定の平均長を有する多量体と、第2の特定の平均長を有する多量体との混合物を使用できる）。本発明の好ましい分子は、2〜10個の単量体を有する多量体であり、以下オリゴエチレングリコールと記載する。本明細書のオリゴエチレングリコールとは、10個またはそれ以下（すなわち9、8、7、6、5、4、3または2個）のエチレンオキシド単位を有し、分子量460未満である。特に好ましくは、前記オリゴエチレングリコールは2〜6個（または3〜6個）のエチレンオキシド単位、例えばテトラエチレングリコールを有する。 The molecules used in the present invention are multimers consisting of _{2 to} 70 ethylene oxide (ie —O—CH ₂ —CH ₂ ) units, preferably linear (ie, molecular weights of about 100 to 3100). Such molecules are referred to herein as ethylene glycol multimers and have the general formula H— (O—CH ₂ —CH ₂ ) _n —OH. Here, n is the number of ethylene oxide units. Preferred molecules have 2-60, 50, 40, 30 or 20 monomers. Compositions including cases of ethylene glycol multimers, particularly larger multimers, can contain multimers of various lengths, depending on the nature of the composition. As used herein, the size of the multimer refers to the average number of monomers present in the multimer in the composition. One or more molecules with 2 to 70 monomers can be used in solution (i.e. a mixture of a multimer having one specific average length and a multimer having a second specific average length Can be used). A preferred molecule of the present invention is a multimer having 2 to 10 monomers and is hereinafter referred to as oligoethylene glycol. Oligoethylene glycol as used herein has 10 or less (ie 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 or 2) ethylene oxide units and a molecular weight of less than 460. Particularly preferably, the oligoethylene glycol has 2 to 6 (or 3 to 6) ethylene oxide units, such as tetraethylene glycol.

エチレングリコール多量体は、サンプルと固体支持体の最終的な混合物に対して10〜90％の最終濃度で用いる。エチレングリコール多量体の濃度を表すときは、これらの分子が室温で固体か液体かに依存し、w／vまたはv／vで表す。例えばオリゴエチレングリコールの場合、室温では液体であるため、濃度をv／vで表す。好ましくは、15％超、20％超または30％超、例えば15〜35％、20〜40％または30〜75％、例えば45〜60％の最終濃度が採用される。本明細書のTEGは式HOCH₂CH₂（OCH₂CH₂）₃OHを有し、Sigma−Aldrich社（Fluka＃86660または86662）またはAldrich＃11（017−5））から入手可能である。 The ethylene glycol multimer is used at a final concentration of 10-90% with respect to the final sample and solid support mixture. When expressing the concentration of ethylene glycol multimers, it depends on whether these molecules are solid or liquid at room temperature, expressed as w / v or v / v. For example, since oligoethylene glycol is a liquid at room temperature, the concentration is represented by v / v. Preferably, a final concentration of greater than 15%, greater than 20% or greater than 30%, such as 15-35%, 20-40% or 30-75%, such as 45-60% is employed. TEG herein are available from the formula _{_{_{HOCH 2 CH 2 (OCH 2 CH}}} 2) have ₃ OH, Sigma-Aldrich Corp. (Fluka # 86660 or 86662) or Aldrich # 11 (017-5)).

本発明で用いるTEG及び他のオリゴエチレングリコールは適当な合成プロトコルで得られる。例えば、ジ、トリ及びテトラエチレングリコール及び他のオリゴエチレングリコールはエチレンオキシドの水和によって得られる。より大きな高分子はエチレングリコールの重合によって得られる。 TEG and other oligoethylene glycols used in the present invention can be obtained by a suitable synthesis protocol. For example, di, tri and tetraethylene glycol and other oligoethylene glycols are obtained by hydration of ethylene oxide. Larger polymers are obtained by polymerization of ethylene glycol.

好ましい態様において、結合反応は塩の存在下で好ましくは行われる。塩は好ましくは1M（最終濃度で）未満の濃度であり、例えば5mM、10mM、20mMまたは50mMから0.5M、0.4M、0.3M、0.2Mまたは0.1M未満である。これは用いる特定の塩／陽イオンによって変化し得る。例えばMg^2＋は5〜50mM（好ましくは約15mMの最終濃度）の範囲で使用可能であり、Na^＋は0.5〜1M（最終濃度）範囲で使用可能である。使用可能である他のイオンとしては、Ba^2＋、Ca^2＋、K^＋及びLi^＋、例えば塩化物が挙げられる。 In a preferred embodiment, the coupling reaction is preferably performed in the presence of a salt. The salt is preferably at a concentration of less than 1M (at final concentration), for example from 5 mM, 10 mM, 20 mM or 50 mM to less than 0.5 M, 0.4 M, 0.3 M, 0.2 M or 0.1 M. This can vary depending on the particular salt / cation used. For example, Mg ²⁺ can be used in the range of 5-50 mM (preferably about 15 mM final concentration), and Na ⁺ can be used in the range of 0.5-1 M (final concentration). Other ions that can be used include Ba ²⁺ , Ca ²⁺ , K ⁺ and Li ⁺ , such as chloride.

あるいは、前記サンプルを、エチレングリコール多量体と前記サンプルの接触の前、同時または後に界面活性剤と接触させてもよい。混合状態の及び／または不純なサンプルを出発原料として用いるときは、界面活性剤の使用が特に望ましい。特に好ましくは、サンプルをエチレングリコール多量体と接触させるが、以下の1つまたは複数と接触しない（またはそれらを低濃度で存在させる）のが好ましい。
−界面活性剤、
−カオトロピック剤、
−アルコール、例えばエタノール。 Alternatively, the sample may be contacted with a surfactant before, simultaneously with, or after contacting the ethylene glycol multimer with the sample. The use of a surfactant is particularly desirable when mixed and / or impure samples are used as starting materials. Particularly preferably, the sample is contacted with the ethylene glycol multimer but not with one or more of the following (or they are present at a low concentration):
-Surfactants,
-Chaotropic agents,
An alcohol, for example ethanol.

特に好ましくは、エチレングリコール多量体のみを単純な緩衝液（任意に上記の塩を含む）中で、例えば15〜35％で用いる。界面活性剤、カオトロピック剤及び／またはアルコールを少量または微量存在させてもよい。界面活性剤を存在させる場合、好ましくは後述するように例えば0.2〜30％（w／v）で存在させる。しかしながら、例えば1％未満、または0.5％若しくは0.2％未満の低濃度で界面活性剤を存在させるのが好ましい。 Particularly preferably, only ethylene glycol multimers are used in simple buffers (optionally containing the above-mentioned salts), for example at 15 to 35%. Surfactants, chaotropic agents and / or alcohols may be present in small or trace amounts. When the surfactant is present, it is preferably present at 0.2 to 30% (w / v) as described later. However, it is preferred to have the surfactant present at a low concentration, for example, less than 1%, or less than 0.5% or 0.2%.

カオトロピック剤は、好ましくは全く含まれない。 Chaotropic agents are preferably not included at all.

アルコール濃度は好ましくは30％未満（v／v）、例えば20％、10％、5％、3％、2％または1％未満（サンプルへの添加後の、添加した固体支持体に結合した液体によるいかなる関与も含んだ最終濃度）である。存在させる場合、アルコールは例えば1〜30％、例えば5〜10または20％で存在させるのが好ましい。高い濃度のアルコールは、特に本発明の方法で核酸分子を混入オリゴヌクレオチドから分離、例えばプライマーから増幅産物を分離する場合には、小分子のオリゴヌクレオチドの混入につながるため通常望ましくない。 The alcohol concentration is preferably less than 30% (v / v), eg less than 20%, 10%, 5%, 3%, 2% or 1% (liquid added to the added solid support after addition to the sample Final concentration including any involvement by). When present, the alcohol is preferably present at, for example, 1-30%, such as 5-10 or 20%. High concentrations of alcohol are usually undesirable, especially when separating nucleic acid molecules from contaminating oligonucleotides, eg, separating amplification products from primers, in the methods of the present invention.

すなわち本発明は具体的には、短い鎖長のオリゴヌクレオチド、例えば30未満のヌクレオチドからの100塩基対超の核酸分子の分離を可能にする方法を提供する。 That is, the present invention specifically provides a method that allows the separation of nucleic acid molecules greater than 100 base pairs from short chain oligonucleotides, eg, fewer than 30 nucleotides.

特に好ましくは、本発明はサンプルからの核酸の単離方法を提供し、前記方法は、15〜35％のエチレングリコール多量体（好ましくはオリゴエチレングリコール、特に好ましくはテトラエチレングリコール（TEG）、（任意に1M未満、例えば5mM〜0.5M、好ましくは5〜30mMの塩）及び30％未満（好ましくは10％未満）のアルコールの存在下で、前記サンプルを固体支持体と接触させて、これにより、前記サンプル中で可溶性の核酸が支持体表面に密接に結合する段階と、結合した核酸と共に前記支持体をサンプルから分離する段階とを含む。 Particularly preferably, the present invention provides a method for isolating nucleic acids from a sample, said method comprising 15-35% ethylene glycol multimers (preferably oligoethylene glycol, particularly preferably tetraethylene glycol (TEG), ( Optionally contacting said sample with a solid support in the presence of less than 1M, for example 5 mM to 0.5 M, preferably 5 to 30 mM salt) and less than 30% (preferably less than 10%) alcohol, thereby The nucleic acid soluble in the sample is closely bound to the surface of the support, and the support is separated from the sample together with the bound nucleic acid.

好ましくは前記方法には更に固体支持体からの前記核酸物質の溶出、並びに任意に前記溶出された物質の塩基配列決定などの、更なる下流側の処理工程が含まれる。 Preferably, the method further includes further downstream processing steps such as elution of the nucleic acid material from the solid support, and optionally sequencing of the eluted material.

核酸は、DNA、RNA、またはいかなる天然若しくは合成由来の修飾体（例えばPNA）またはそれらの組み合わせでもよい。しかしながら好ましくは核酸はDNAであり、ゲノム由来またはcDNA、一本鎖または二本鎖、または例えば直鎖状または環状などの他の形態であってもよい。特に好ましくは、前記核酸分子は例えばPCRなどによる増幅生成物である。好ましい態様において、非ゲノムDNA断片は単離され、例えば10〜250kbpのサイズを有し、特に好ましくは100bp〜10kbpの分子として単離される。 The nucleic acid may be DNA, RNA, or any natural or synthetic modification (eg PNA) or combinations thereof. Preferably, however, the nucleic acid is DNA and may be genomically derived or cDNA, single stranded or double stranded, or other forms such as linear or circular. Particularly preferably, the nucleic acid molecule is an amplification product, for example by PCR. In a preferred embodiment, the non-genomic DNA fragment is isolated, for example having a size of 10 to 250 kbp, particularly preferably as a molecule of 100 bp to 10 kbp.

本明細書の増幅方法には、インビトロでの方法によって核酸分子またはその相補的な配列の濃度を上昇させるいかなる方法も含まれ、例えばLAR、3SR及びQβレプリカーゼ系などの技術が含まれる。しかしながら、PCR及びその様々な変法、例えば入れ子型プライマーの使用が通常選択される方法である（例えば核酸増幅技術についてはAbramson and Myers，1993，Current Opinion in Biotechnology，4：41−47を参照）。 The amplification methods herein include any method of increasing the concentration of a nucleic acid molecule or its complementary sequence by in vitro methods, including techniques such as the LAR, 3SR and Qβ replicase systems. However, PCR and its various variants, such as the use of nested primers, is usually the method of choice (see eg Abramson and Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4: 41-47 for nucleic acid amplification techniques). .

本発明の方法をDNAの単離に用いる場合、同じサンプルからRNAを単離する更なる段階を簡便に連結できる。かかる2段階によるRNA分離における該方法の使用については以下に詳述する。 When the method of the present invention is used for DNA isolation, a further step of isolating RNA from the same sample can be conveniently linked. The use of the method in such two-step RNA separation is described in detail below.

サンプルは核酸を含むいかなる材料でもあってもよく、例えば食料品、臨床及び環境サンプルが挙げられる。サンプルは、生物学的サンプルでもよく、これは、ウイルスまたは細胞由来の材料が挙げられることができ、あらゆる原核または真核生物細胞、ウイルス、バクテリオファージ、マイコプラズマ、原形質及び細胞小器官を含む。すなわちかかる生物材料には全ての種類の哺乳動物及び非哺乳動物の細胞、植物細胞、藍藻を含む藻類、菌類、バクテリア、原生動物などが含まれうる。代表的なサンプルとしては全血、並びに血漿、血清などの血液由来の製品、及び軟膜、尿、糞便、脳脊髄液または他の流体、組織、細胞培養、細胞懸濁液などが挙げられる。 The sample can be any material that contains nucleic acids, such as foodstuffs, clinical and environmental samples. The sample can be a biological sample, which can include virus or cell-derived material, including any prokaryotic or eukaryotic cell, virus, bacteriophage, mycoplasma, protoplasm and organelle. That is, such biological materials can include all types of mammalian and non-mammalian cells, plant cells, algae including cyanobacteria, fungi, bacteria, protozoa, and the like. Representative samples include whole blood and blood-derived products such as plasma and serum, and buffy coat, urine, feces, cerebrospinal fluid or other fluids, tissues, cell cultures, cell suspensions, and the like.

しかしながら好ましくは、該サンプルは比較的純粋な出発原料、例えばPCR生成物などの増幅工程の実施後の増幅生成物、または他の核酸回復工程によって得た半純粋な調製物である。該方法は、他の非ゲノムDNA、例えばプラスミド、コスミド及び他のDNA断片の精製に用いてもよい。これらは、例えば電気泳動などの技術を使用した分離の後に行うのが有利であり、かかる分離の後、核酸物質が単離された状態となる。すなわちサンプルは、例えば、膜などの細胞内の器官を実質的に含まないのが好ましく、サンプル調製の元となる細胞由来の遺伝物質（またはそのコピー）のみを含む。特に好ましくは、該サンプルはその供給源の細胞由来の染色体DNA、タンパク質及び膜を含まない。 Preferably, however, the sample is a relatively pure starting material, eg an amplification product after performing an amplification step such as a PCR product, or a semi-pure preparation obtained by other nucleic acid recovery steps. The method may be used to purify other non-genomic DNA, such as plasmids, cosmids and other DNA fragments. These are advantageously performed after separation using techniques such as electrophoresis, for example, after which the nucleic acid material is isolated. That is, the sample is preferably substantially free of intracellular organs, such as membranes, and contains only genetic material (or a copy thereof) derived from the cell from which the sample is prepared. Particularly preferably, the sample does not contain chromosomal DNA, proteins and membranes from the source cell.

核酸含有サンプルは一般的に、単に溶液を含むエチレングリコール多量体、並びにエチレングリコール多量体をサンプルに添加する前に、と同時に、または後に添加する固相と接触するのが好ましい。（好ましくはサンプル、例えばPCRサンプル：エチレングリコール多量体を含む溶液の比率＝約1：1である。）必要に応じて、細胞壁などの器官を破壊または溶解させるために、1つまたは複数の別の段階をその前に設置してもよい。そのための方法は公知技術である。例えば、若干の細胞、例えば血液細胞に対し界面活性剤を付加的に用いることにより溶解できる。植物または菌類の細胞などの他種類の細胞、または固形の動物組織の場合、例えばより激しい処理（液体窒素中での破砕、界面活性剤の存在下での加熱、界面活性剤の存在下でのアルカリ溶解）が必要となりうる。パラフィン切片の形態のサンプルなどでは、溶解（及びパラフィンの溶融）は、例えば電子レンジによる加熱により実施できる（Banerjee，S．K．et al．，1995，Biotechniques 18：769−773）。また、特定のより小さい組織の場合は酵素処理が必要となり得、例えばプロテイナーゼKを使用して核酸の充分な有利を促す。各種の成分を混合し、単に適切な時間反応させ、核酸を支持体と結合させる。好ましくは、酵素などの他の試薬、例えばプロテイナーゼKを用いる場合、後者を用いる場合にはエチレングリコール多量体または界面活性剤を含める。次いで支持体を何らかの簡便な手段（当然支持体の性質に依存する）によって溶液から除去する。該方法にはサンプル上澄から支持体を除去する全ての方法、またはその逆の方法、例えば遠心分離、デカント、ピペッティングなどが含まれる。 The nucleic acid-containing sample is generally preferably contacted with an ethylene glycol multimer that simply contains the solution, as well as a solid phase that is added before, simultaneously with, or after the ethylene glycol multimer is added to the sample. (Preferably the ratio of sample, eg PCR sample: ethylene glycol multimer solution = about 1: 1.) If necessary, one or more separate ones to break down or lyse organs such as cell walls The stage may be installed before that. The method for this is a known technique. For example, some cells, such as blood cells, can be lysed by additionally using a surfactant. For other types of cells, such as plant or fungal cells, or solid animal tissues, for example, more intense treatment (breaking in liquid nitrogen, heating in the presence of surfactants, in the presence of surfactants) Alkali dissolution) may be required. For samples such as in the form of paraffin sections, lysis (and paraffin melting) can be performed, for example, by heating in a microwave oven (Banerjee, SK et al ., 1995, Biotechniques 18: 769-773). Also, for certain smaller tissues, enzyme treatment may be necessary, for example, proteinase K is used to promote full advantage of the nucleic acid. The various components are mixed and simply reacted for an appropriate time to bind the nucleic acid to the support. Preferably, other reagents such as enzymes are used, such as proteinase K, and if the latter is used, ethylene glycol multimers or surfactants are included. The support is then removed from the solution by some convenient means (which naturally depends on the nature of the support). Such methods include all methods of removing the support from the sample supernatant, or vice versa, such as centrifugation, decanting, pipetting and the like.

このプロセス中の反応条件は決定的でなく、例えば、単に固相の存在下で、サンプルとエチレングリコール多量体を混合し、室温、例えば15〜25℃、例えば約20℃にて30秒〜20分間、例えば2〜10分間静置し、更にその後分離を行う。長いインキュベート時間を採用することにより、長い核酸分子の収率を最大化できる。 The reaction conditions during this process are not critical, for example, the sample and the ethylene glycol multimer are simply mixed in the presence of a solid phase and room temperature, e.g. 15-25 ° C, e.g. Allow to stand for 2 minutes, for example 2-10 minutes, and then separate. By employing a long incubation time, the yield of long nucleic acid molecules can be maximized.

上記したように、反応時間は決定的でなく、通常はわずか5分で十分である。しかしながら、簡便には、長い時間、例えば0.5〜3時間、または一晩を採用してもよい。いかなる簡便な手段によって混合してもよく、例えば撹拌による単純な混合、またはボルテックスが挙げられる。また、必要に応じて高温または低温を採用してもよいが、これらは必須でない。 As mentioned above, the reaction time is not critical and usually only 5 minutes is sufficient. However, for convenience, a long time, for example 0.5-3 hours, or overnight may be employed. Mixing may be performed by any convenient means such as simple mixing by stirring or vortexing. Moreover, although high temperature or low temperature may be employ | adopted as needed, these are not essential.

界面活性剤を用いる場合、いかなる界面活性剤であってもよく、多くの種類のものが公知で、文献に記載されている。 When a surfactant is used, it may be any surfactant and many types are known and described in the literature.

したがって、界面活性剤は、アニオン性およびカチオン性を含むイオン性、非イオン性または双性イオン性であってもよい。本明細書で用いられる「イオン界面活性剤」という用語には、水に溶解したときに部分的または完全にイオンの形態となるいかなる界面活性剤も包含される。アニオン性界面活性剤は特に良好な機能を示し、好ましい。適切なアニオン性界面活性剤としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、他のアルカリ金属アルキルスルフェート若しくは同様の界面活性剤（ザルコシル）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。 Thus, the surfactant may be ionic, nonionic or zwitterionic including anionic and cationic. As used herein, the term “ionic surfactant” includes any surfactant that is partially or fully in ionic form when dissolved in water. Anionic surfactants exhibit particularly good functions and are preferred. Suitable anionic surfactants include, for example, sodium dodecyl sulfate (SDS), other alkali metal alkyl sulfates or similar surfactants (sarkosyl), or combinations thereof.

簡便には、界面活性剤は0.2〜30％（w／v）、例えば0.5〜30％、好ましくは0.5〜15％、より好ましくは1〜10％の濃度において使用可能である。アニオン性界面活性剤の場合、1.0〜5％、例えば0.5〜5％の濃度で良好に機能することが示されている。 Conveniently, the surfactant can be used at a concentration of 0.2-30% (w / v), for example 0.5-30%, preferably 0.5-15%, more preferably 1-10%. In the case of anionic surfactants, it has been shown to function well at concentrations of 1.0-5%, such as 0.5-5%.

好都合なことに、界面活性剤を室温で、またはより高い温度（例えば37℃、50℃または65℃）でサンプルとインキュベートすることにより溶解が行われる。同様に、インキュベート時間は、数分（例えば5または10分）から数時間、（例えば20〜40分、または1〜2時間）で変動させることができる。酵素による溶解、例えばプロテイナーゼKなどの使用の場合、例えば一晩などの長い処理時間が必要とされうる。 Conveniently, lysis is performed by incubating the surfactant with the sample at room temperature or at a higher temperature (eg, 37 ° C, 50 ° C or 65 ° C). Similarly, the incubation time can vary from a few minutes (eg, 5 or 10 minutes) to a few hours (eg, 20-40 minutes, or 1-2 hours). In the case of enzymatic lysis, such as the use of proteinase K, a long processing time such as overnight may be required.

界面活性剤は、単純な水溶液（アルカリ性または酸性でもよい）中、または好ましくはバッファ中に添加する。 The surfactant is added in a simple aqueous solution (which may be alkaline or acidic) or preferably in the buffer.

エチレングリコール多量体、及び任意に界面活性剤をいかなる適切なバッファ、例えばトリス、ビシン、トリシン及びリン酸バッファに添加してもよい。好ましくは、上記したように、一価の陽イオンの供給源、例えば塩を添加し、核酸の捕捉を促進してもよいが、これは必ずしも必須ではない。好適な塩としては塩化物であり、例えば塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化リチウムが挙げられ、例えば0.1〜1Mの濃度、例えば250〜500mMである。例えば200mM未満、例えば5〜50mMの低い塩濃度を採用してもよい。上記の濃度は、サンプル：ビーズ：エチレングリコール多量体の混合溶液中の最終濃度を指す。上記したように、酵素などの他の構成要素を含めてもよい。 Ethylene glycol multimers, and optionally surfactants, may be added to any suitable buffer, such as Tris, bicine, tricine and phosphate buffers. Preferably, as noted above, a source of monovalent cation, such as a salt, may be added to facilitate nucleic acid capture, but this is not necessary. Suitable salts are chlorides, such as magnesium chloride, sodium chloride, and lithium chloride, for example, a concentration of 0.1-1M, for example 250-500 mM. For example, a low salt concentration of less than 200 mM, such as 5-50 mM may be employed. The above concentration refers to the final concentration in the sample: bead: ethylene glycol multimer mixed solution. As noted above, other components such as enzymes may be included.

エチレングリコール多量体を含む組成物の他の成分として、典型的には1〜50mMなどの濃度のキレート剤、例えばEDTA、EGTA及び他のポリアミノカルボン酸、並びに例えば1〜10mMの濃度の還元剤、例えばジチオトレイトール（DTT）またはβ−メルカプトエタノールを任意に添加してもよい。 As other components of the composition comprising ethylene glycol multimers, typically chelating agents at a concentration such as 1-50 mM, such as EDTA, EGTA and other polyaminocarboxylic acids, and reducing agents, such as at a concentration of 1-10 mM, For example, dithiothreitol (DTT) or β-mercaptoethanol may optionally be added.

好ましいTEG組成物は、例えば以下の組成である。
10mM トリス−HCl（pH7.5）
10mM EDTA
40％ TEG
または：
10mM トリス−HCl（pH7.5）
50％ TEG
30mM MgCl₂
または：
10mM トリス−HCl（pH7.5）
60％ TEG
30mM MgCl₂
2％ SDS
または：
10mM トリス−HCl（pH7.5）
40％ TEG
30mM MgCl₂
20％ EtOH A preferred TEG composition is, for example, the following composition.
10 mM Tris-HCl (pH 7.5)
10 mM EDTA
40% TEG
Or:
10 mM Tris-HCl (pH 7.5)
50% TEG
30 mM MgCl ₂
Or:
10 mM Tris-HCl (pH 7.5)
60% TEG
30 mM MgCl ₂
2% SDS
Or:
10 mM Tris-HCl (pH 7.5)
40% TEG
30 mM MgCl ₂
20% EtOH

これらの溶液は好ましくはサンプルと1：1の比率で用いるストック液であり、すなわち最終溶液での各構成要素の含有濃度は半分となる。 These solutions are preferably stock solutions used in a 1: 1 ratio with the sample, i.e. the concentration of each component in the final solution is halved.

理論に束縛される訳ではないが、エチレングリコール多量体（及び存在する場合は塩）が水と核酸分子との間の水素結合を破壊し、それにより後者と固体支持体とを結合させ、溶媒和物でない構造が形成されると考えられる。次いでイオン架橋が荷電した固体支持体と荷電した核酸分子との間でカチオンにより形成されうる。 Without being bound by theory, ethylene glycol multimers (and salts, if present) break the hydrogen bonds between water and the nucleic acid molecule, thereby binding the latter to the solid support and the solvent. It is thought that a non-Japanese structure is formed. An ionic bridge can then be formed by a cation between the charged solid support and the charged nucleic acid molecule.

界面活性剤が存在する場合、それは該方法において核酸を含む材料、例えば細胞及び核を溶解させ、核酸を遊離させる機能を果たす。不純または多くの物質の混合したサンプルを用いる場合、界面活性剤は核酸へのタンパク質、例えばDNA−結合タンパク質の結合の崩壊を促進し、サンプル中の固体支持体への混入物質の付着問題を減少すると考えられる。 If a surfactant is present, it serves to lyse and release nucleic acid-containing materials such as cells and nuclei in the method. When using impure or mixed material samples, detergents promote disruption of protein, eg DNA-binding protein, binding to nucleic acids and reduce contamination problems with solid support in the sample. I think that.

固体支持体は、固定、分離などに現在広く使われ、提案されている周知の支持体またはマトリックスのいずれでもよい。これらは粒子、シート、ゲル、フィルタ、膜（例えばナイロン製メンブラン）、繊維、毛細管、針またはマイクロタイターストリップ、管、プレートまたはウェルなど、コーム、ピペットチップ、マイクロアレイ、チップまたはいかなる固体状の表面素材の形を採ってもよい。 The solid support may be any well-known support or matrix that is currently widely used for fixation, separation, etc. and has been proposed. These can be particles, sheets, gels, filters, membranes (eg nylon membranes), fibers, capillaries, needles or microtiter strips, tubes, plates or wells, combs, pipette tips, microarrays, tips or any solid surface material You may take the form.

好都合なことに、前記支持体はガラス、シリカ、ラテックス、プラスチックまたはポリマー材料で作製されてもよい。核酸を結合させるため、高い表面積を有する材料が好ましい。かかる支持体は通常不規則な表面を有し、例えば多孔性または微粒子、例えば粒子、繊維、ウェブ、焼結物または篩の状態である。微粒子の材料、例えばビーズとしては、通常、より大きな結合能により特にポリマービーズが好ましい。 Conveniently, the support may be made of glass, silica, latex, plastic or polymer material. A material having a high surface area is preferred for binding nucleic acids. Such supports usually have an irregular surface, for example in the form of porous or fine particles, such as particles, fibers, webs, sinters or sieves. As the fine particle material, for example, beads, polymer beads are particularly preferable because of their larger binding ability.

好都合なことに、本発明で用いる微粒子状の固体支持体としては球状のビーズが挙げられる。ビーズのサイズは決定的でないが、例えば少なくとも1μm、及び好ましくは少なくとも2μmのオーダーの直径、並びに好ましくは10μm未満、及び好ましくは6μm未満の最大直径を有する。例えば1μm、2.8μmまたは4.5μmの直径を有するビーズを用いるのが好ましい。 Conveniently, the particulate solid support used in the present invention includes spherical beads. The size of the beads is not critical, but for example has a diameter on the order of at least 1 μm, and preferably at least 2 μm, and a maximum diameter of preferably less than 10 μm and preferably less than 6 μm. For example, it is preferable to use beads having a diameter of 1 μm, 2.8 μm or 4.5 μm.

単分散の粒子、すなわち実質的に同一の粒子径（例えば直径の標準偏差が5％未満）の粒子は、極めて良好な反応再現性を提供する効果がある。US-A-4336173に記載の技術によって得られる単分散ポリマー粒子が特に好適である。 Monodispersed particles, i.e. particles having substantially the same particle size (for example, a standard deviation of the diameter of less than 5%) are effective in providing very good reaction reproducibility. Monodisperse polymer particles obtained by the technique described in US-A-4336173 are particularly suitable.

本発明の方法での使用に適する非磁性ポリマービーズとしては、Dynal Biotech ASA社（オスロ、ノルウェー）、並びにQiagen社、Amersham Pharmacia Biotech社、Serotec社、Seradyne社、Merck社、日本ペイント社、Chemagen社、Promega社、Prolabo社、Polysciences社、Agowa社及びBangs Laboratories社から入手可能である。 Non-magnetic polymer beads suitable for use in the method of the present invention include Dynal Biotech ASA (Oslo, Norway), and Qiagen, Amersham Pharmacia Biotech, Serotec, Seradyne, Merck, Nippon Paint, Chemagen , Promega, Prolabo, Polysciences, Agowa and Bangs Laboratories.

しかしながら、操作及び分離を促進するために磁気ビーズが好ましい。本明細書中で用いる「磁性の」という用語は、磁場に置かれたとき、支持体がそれに与えられる磁気モーメントを有することができ、それによりその領域での作用下で移動可能であることを意味する。換言すれば、磁気粒子を含む支持体は磁気凝集によって、直ちに除去でき、それは核酸の結合段階に続く粒子の迅速、簡便及び効率的な分離方法を提供する。該方法は従来の技術、例えば核酸を分解させうる剪断力を発生させる遠心分離と比較し、はるかに穏やかな方法である。 However, magnetic beads are preferred to facilitate manipulation and separation. As used herein, the term “magnetic” means that when placed in a magnetic field, the support can have a magnetic moment imparted to it and thereby be movable under action in that region. means. In other words, the support containing magnetic particles can be readily removed by magnetic aggregation, which provides a rapid, convenient and efficient method of separating particles following the nucleic acid binding step. The method is much gentler than conventional techniques, such as centrifugation that generates shear forces that can degrade nucleic acids.

すなわち、本発明の方法を用いれば、核酸が結合した磁性粒子を、磁場例えば永久磁石の適用によって、適切な表面へ移動させることができる。通常、サンプル混合物を含む容器の側面に磁石を配置し、容器の壁に向けて粒子を凝集させ、サンプル中の他の物質を注ぎ出すことにより十分実施可能である。 That is, by using the method of the present invention, magnetic particles to which nucleic acids are bound can be moved to an appropriate surface by applying a magnetic field such as a permanent magnet. It is usually sufficient to place a magnet on the side of the container containing the sample mixture, agglomerate the particles towards the container wall, and pour out other substances in the sample.

磁気凝集には超常磁性粒子が特に好ましく、反応の間における粒子の凝集を回避できるため、均一な核酸抽出が確実となる。かかる粒子は、例えばSintefによるEP-A-106873に記載されている。周知の磁性粒子は、DYNABEADS（登録商標）として、Dynal Biotech ASA社（オスロ、ノルウェー）から市販されており、特に本発明の使用法に適する。 Superparamagnetic particles are particularly preferred for magnetic aggregation, and particle aggregation during the reaction can be avoided, thus ensuring uniform nucleic acid extraction. Such particles are described, for example, in EP-A-106873 by Sintef. A well-known magnetic particle is commercially available from Dynal Biotech ASA (Oslo, Norway) as DYNABEADS® and is particularly suitable for use in the present invention.

使用可能な固体支持体は、表面が比較的親水性で、中性の、または上記方法を実施するpHにおいて全体的に負電荷を有する、いかなる固体支持体も含まれる。該方法の実施にとり好ましいpHは4〜9である。好ましくは、かかる固体支持体は、核酸との複合体形成に関与できる基を含む。適当な固体支持体としては、シリカ、ポリウレタン、エポキシ基及び炭水化物を含むかまたはそれらをコーティングしたものが挙げられる。 Usable solid supports include any solid support that has a relatively hydrophilic surface, is neutral, or has an overall negative charge at the pH at which the process is carried out. The preferred pH for carrying out the process is 4-9. Preferably, such a solid support comprises a group that can participate in complex formation with a nucleic acid. Suitable solid supports include those containing or coated with silica, polyurethane, epoxy groups and carbohydrates.

固体支持体の選択に応じて、官能基の添加なしで使用できるか、またはかかる基を提供するためにかかる官能基を修飾してもよい。 Depending on the choice of solid support, it can be used without the addition of functional groups, or such functional groups may be modified to provide such groups.

本発明で用いる官能化された被覆粒子は、米国特許第4,336,173号、同第4,459,378号及び同第4,654,267号の方法に従いビーズを修飾して調製できる。すなわち、ビーズまたは他の支持体の表面を様々なタイプに官能化して調製できる。特に好ましくは、磁気ビーズなどの固体支持体（親水性でなく及び／または核酸と複合体を形成するための適切な基を有しない）を、核酸を結合できるフリーの官能基を有する態様で修飾する。かかる官能基は、水酸基、エポキシ基、カルボン酸またはスルホン酸であってもよい。好ましいビーズとしては、シリカコートのビーズ、及びアクリル酸またはエポキシドなどの親水性表面を有するビーズが挙げられる。 The functionalized coated particles used in the present invention can be prepared by modifying the beads according to the methods of US Pat. Nos. 4,336,173, 4,459,378 and 4,654,267. That is, it can be prepared by functionalizing the surface of a bead or other support to various types. Particularly preferably, a solid support, such as a magnetic bead (which is not hydrophilic and / or does not have a suitable group for forming a complex with a nucleic acid) is modified in a manner having a free functional group capable of binding nucleic acids. To do. Such functional groups may be hydroxyl groups, epoxy groups, carboxylic acids or sulfonic acids. Preferred beads include silica-coated beads and beads having a hydrophilic surface such as acrylic acid or epoxide.

出発原料が比較的不純な調製物であるときは、核酸を含む所望の細胞、ウイルスなどの選択的な捕捉ができる態様で修飾された固体支持体を用いることもできる。例えば、所望の細胞に対して特異的な抗体または他の結合タンパク質を有する支持体を使用できる。これは核酸の単離にある程度の選択の幅をもたらす。なぜなら、複雑な混合物中の所望の標的給源に由来する核酸のみを分離できるからである。例えば、かかる支持体を用いてサンプルから所望の細胞種などを分離・除去してもよく、その後界面活性剤を添加して溶解させ、更に核酸を遊離させ、エチレングリコール多量体を添加して支持体に結合させる。 When the starting material is a relatively impure preparation, a solid support modified in a manner that allows selective capture of desired cells, viruses, etc., containing nucleic acids can also be used. For example, a support having antibodies or other binding proteins specific for the desired cells can be used. This provides some range of choice for nucleic acid isolation. This is because only nucleic acids from the desired target source in a complex mixture can be separated. For example, such a support may be used to separate and remove a desired cell type from a sample, and then a surfactant is added to dissolve, further nucleic acid is released, and an ethylene glycol multimer is added for support. Bind to the body.

かかる選択的な細胞捕捉マトリックスの調製は、従来技術において周知であり、文献に記載されている。 The preparation of such selective cell capture matrices is well known in the prior art and is described in the literature.

すなわち、本発明の好ましい態様では、上記のようにサンプルから核酸を単離する方法を提供し、該方法では前記サンプルが目的の核酸を含む細胞を含み、前記細胞を免疫磁気的分離方法によって得る、例えば標的細胞に特異的な抗原を有する固体支持体（例えばビーズ）抗体を用いる。細胞を結合させる固体支持体は、本発明に従い核酸を結合させる固体支持体と同じであっても、または異なってもよい。好ましくは、細胞の分離に用いる固体支持体はビーズであり、すなわち免疫磁気分離の後、核酸単離に先行し、細胞：ビーズ複合体中に細胞を存在させる。本発明の他の方法と同様、この方法中に前記サンプルからRNAを単離する追加的な段階を更に含めてもよい。 That is, a preferred embodiment of the present invention provides a method for isolating a nucleic acid from a sample as described above, wherein the sample contains a cell containing the target nucleic acid, and the cell is obtained by an immunomagnetic separation method. For example, a solid support (eg, bead) antibody having an antigen specific for a target cell is used. The solid support to which the cells are bound may be the same as or different from the solid support to which the nucleic acid is bound according to the present invention. Preferably, the solid support used for cell separation is a bead, ie after immunomagnetic separation, prior to nucleic acid isolation, the cells are present in a cell: bead complex. As with other methods of the invention, this method may further include an additional step of isolating RNA from the sample.

同様に、支持体に結合パートナーを設けて、核酸の選択的な捕捉を補助してもよい。例えば、相補的DNAまたはRNA配列、またはDNA結合タンパク質が使用可能であり、またはウイルス由来の核酸と結合するウイルスタンパク質であってもよい。固体支持体へのかかるタンパク質の付与は、公知の技術を使用して実施できる。 Similarly, a binding partner may be provided on the support to assist in the selective capture of nucleic acids. For example, complementary DNA or RNA sequences, or DNA binding proteins can be used, or can be viral proteins that bind to nucleic acids from viruses. Application of such proteins to a solid support can be performed using known techniques.

必須ではないが、本発明の単離方法に1回または複数回の洗浄段階を導入するのが好ましく、例えばサンプルからの支持体の分離後に行う。好ましくは、本明細書に記載する該方法は、後述するように少なくとも1回の洗浄段階を含む。磁気ビーズの場合、DNAをビーズから遊離させる前にするのが好ましい。特に好ましくは、核酸物質の結合の後、最初の洗浄段階（任意に再度行う）を、例えば1M未満、好ましく500mM未満、例えば250、100または50mM未満の塩を含む溶液を使用して実施する。1つの態様において、洗浄バッファはエチレングリコール多量体、例えばTEG／塩混合物を含むバッファと同様でもよい。特に好ましくは、いかなる塩も含まない50〜90％のアルコール溶液、例えば70％エタノールを洗浄に用いる。 Although not required, it is preferred to introduce one or more washing steps into the isolation method of the present invention, for example after separation of the support from the sample. Preferably, the method described herein includes at least one washing step as described below. In the case of magnetic beads, it is preferred to do so before releasing the DNA from the beads. Particularly preferably, after the binding of the nucleic acid substance, an initial washing step (optionally again) is carried out using a solution containing, for example, less than 1M, preferably less than 500 mM, such as less than 250, 100 or 50 mM. In one embodiment, the wash buffer may be similar to a buffer comprising an ethylene glycol multimer, such as a TEG / salt mixture. Particularly preferably, a 50-90% alcohol solution without any salt, for example 70% ethanol, is used for washing.

分離段階、及び必要となりうるいかなる任意の洗浄段階に続いて、核酸を保持する支持体を、任意の適切な溶媒、例えば水または低イオン強度のバッファ中に移す、例えば再懸濁または浸漬することができる。好ましくは、キレート剤、例えばEDTAを添加して過剰な陽イオン、例えばMg^2＋を除去することにより、溶出効率を改善できる。支持体及び必要となるいかなる次の処理の性質に応じ、核酸を支持体から有利させるのが望ましい場合もあり、または望ましくない場合もある。 Following the separation step, and any optional washing steps that may be required, the support holding the nucleic acid is transferred, eg, resuspended or immersed, in any suitable solvent, such as water or a low ionic strength buffer. Can do. Preferably, elution efficiency can be improved by adding a chelating agent such as EDTA to remove excess cations such as Mg ²⁺ . Depending on the nature of the support and any subsequent processing required, it may or may not be desirable to favor the nucleic acid from the support.

磁性または非磁性ビーズなどの微粒子状の固体支持体を用いる場合、PCRまたは他の増幅に、または塩基配列決定などの多くの場合に、該支持体から核酸を溶出することなく直接使用できる。また、多くのDNA検出または同定方法の場合、溶出が必要でない。なぜなら、結合した分子の大部分の長さを、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション及び増幅に使用できるからである。 When a particulate solid support such as magnetic or non-magnetic beads is used, it can be used directly without elution of nucleic acid from the support for PCR or other amplification, or in many cases such as sequencing. Also, elution is not necessary for many DNA detection or identification methods. This is because most of the length of bound molecules can be used for hybridization and amplification with oligonucleotides.

しかしながら、必要に応じて核酸の溶出を、例えば65℃で5〜10分間、または単に室温によって1〜10分、例えば2〜4分間、水または低イオン強度のエチレングリコール多量体を含まない溶媒、例えば10〜30mMのトリス−HClバッファ（pH7.5）中で加熱するなど、周知の方法により簡便に実施できる。都合のいいことには、単離する核酸を濃縮するために少ない体積で溶出を実施する。 However, if necessary, elution of the nucleic acid, e.g. for 5-10 minutes at 65C, or simply 1-10 minutes, e.g. 2-4 minutes at room temperature, water or a solvent free of low ionic strength ethylene glycol multimers For example, it can be simply carried out by a known method such as heating in 10-30 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). Conveniently, elution is performed in a small volume to concentrate the nucleic acid to be isolated.

溶出後、核酸を溶液に残した状態で支持体を培地から除去してもよい。 After elution, the support may be removed from the medium while leaving the nucleic acid in solution.

上記したように、該方法を増幅生成物の単離に好適に使用できる。本発明の方法は、効果的に所望の増幅生成物からプライマーを除去し、それらの混入濃度は10％未満、例えば5または1％未満である。好ましくは、1kpを超える断片の場合は85％を超える収率、100bpの断片の場合は40％を超える、例えば60％を超える収率である。DNAからRNAを除去しようとする場合、例えばRNAアーゼまたはアルカリ、例えばNaOHの添加によって、DNA分離段階の前にRNAを破壊させてもよい。 As described above, the method can be suitably used for isolation of amplification products. The method of the present invention effectively removes primers from the desired amplification product, and their contamination concentration is less than 10%, such as less than 5 or 1%. Preferably, the yield is greater than 85% for fragments greater than 1 kp, greater than 40% for fragments of 100 bp, for example greater than 60%. If RNA is to be removed from the DNA, the RNA may be disrupted prior to the DNA separation step, for example by the addition of RNAase or alkali, such as NaOH.

あるいは、上記したように、本発明の方法を用いてDNA及びRNAをサンプルから順次分離してもよい。また、RNA精製工程においてサンプルからDNAを除去するために用いてもよい。 Alternatively, as described above, DNA and RNA may be sequentially separated from the sample using the method of the present invention. Moreover, you may use in order to remove DNA from a sample in an RNA purification process.

好都合なことに、2つの異なる固相、例えばDNA及びRNAを区別できる固体支持体を使用して順次分離を行う。すなわち、かかる方法では、上記の通りにDNAを単離するための第一段階の分離の実施を含めてもよい。次いで、更なる固体支持体をサンプルに添加し、サンプル中に残留するRNAを捕捉することができ、それはRNAまたはいかなる残留している核酸も結合できる固体支持体を用いるか、または特異的なRNA分子（例えば相補的な核酸プローブを用いた場合）若しくはRNA分子のサブセット、例えばポリアデニル化RNAを捕捉できる固体支持体を用いて実施できる。このようにして、同じサンプルからDNA及びRNA、またはその両方のサブセットを迅速に単離・分離できる。この方法により、例えば単離されたDNAの測定値からRNA抽出に供する細胞の量を推定でき、それにより異なるサンプルとの間での参照となりうる。 Conveniently, the separation is performed sequentially using a solid support capable of distinguishing two different solid phases, for example DNA and RNA. That is, such methods may include performing a first stage separation to isolate DNA as described above. Additional solid support can then be added to the sample to capture the remaining RNA in the sample, either using solid support that can bind RNA or any remaining nucleic acid, or specific RNA It can be carried out using a solid support capable of capturing a molecule (eg when using complementary nucleic acid probes) or a subset of RNA molecules, eg polyadenylated RNA. In this way, a subset of DNA and / or RNA can be rapidly isolated and separated from the same sample. By this method, for example, the amount of cells subjected to RNA extraction can be estimated from the measured value of isolated DNA, which can be used as a reference between different samples.

しかしながら、本発明のDNA単離方法に、予備段階として他の従来のRNA精製方法を簡便に組み込むこともでき、例えば本発明に係るエチレングリコール多量体によるDNA単離を、例えばLiClを用いる選択的なRNA沈殿段階の前に、またはGTCとザルコシルを用いるRNA分離の前に実施することが可能である。 However, other conventional RNA purification methods can also be easily incorporated into the DNA isolation method of the present invention as a preliminary step. For example, DNA isolation using the ethylene glycol multimer according to the present invention is selectively performed using, for example, LiCl. Can be performed prior to the RNA precipitation step or prior to RNA isolation using GTC and sarkosyl.

代表的な方法において、サンプルを任意で界面活性剤の存在下で溶解させ、DNAをエチレングリコール多量体の存在下で固体支持体と結合させる。それにより、支持体を除去することによって、DNAとサンプルから簡便に分離できる。必要に応じて、該DNAを更に増幅または他のそれ以降の処理、例えば塩基配列決定のために迅速かつ簡便に取り扱うことができる。次いでRNAを単離してもよい。これは例えば本発明の方法の反復など、上記の固相ベースのシステムで行ってもよいし、または従来の技術、例えば抽出、沈殿または親和性クロマトグラフィなどにより行ってもよい。 In a typical method, the sample is optionally lysed in the presence of a surfactant and the DNA is bound to a solid support in the presence of ethylene glycol multimers. Thereby, it can be easily separated from the DNA and the sample by removing the support. If necessary, the DNA can be handled quickly and conveniently for further amplification or other subsequent processing, such as sequencing. The RNA may then be isolated. This may be done with solid phase based systems as described above, for example by repeating the methods of the invention, or by conventional techniques such as extraction, precipitation or affinity chromatography.

本発明の特に有利な実施態様は、RNAの単離の前に本発明の単離方法を用いてサンプルからDNAを除去することであり、そこでは溶解サンプルの粘度が低下し、またRNA分子の特異的な単離が促進され、その結果、更にRNAへのDNA混入の可能性が減少または回避される。かかる方法にはまた、迅速に実施できるという効果がある。 A particularly advantageous embodiment of the present invention is to remove DNA from the sample using the isolation method of the present invention prior to RNA isolation, where the viscosity of the lysed sample is reduced and the RNA molecule Specific isolation is facilitated, which further reduces or avoids the possibility of DNA contamination into RNA. Such a method also has the effect that it can be implemented quickly.

本発明は、具体的には粒子、特に磁性粒子が支持体として使用される場合、好適に自動化に供することができる。Beckman Coulter Biomek（登録商標）FXまたはTecan Freedom EVO（商標）などの自動液体処理ワークステーションが使用可能である。 Specifically, the present invention can be suitably subjected to automation when particles, particularly magnetic particles, are used as a support. Automated liquid handling workstations such as Beckman Coulter Biomek® FX or Tecan Freedom EVO ™ can be used.

本発明の方法の実施に必要な様々な反応物質及び成分を、キットの形態で簡便に提供できる。かかるキットは本発明の更なる態様を意味する。 Various reactants and components necessary for carrying out the method of the present invention can be conveniently provided in the form of a kit. Such a kit represents a further aspect of the invention.

本発明の態様の最も単純なものとしては、固体支持体及びエチレングリコール多量体を含む、サンプルからの核酸単離用キットが提供される。好ましくは、前記固体支持体はその支持体上に遊離官能基としてカルボン酸基を有する磁気ビーズである。 In the simplest aspect of the present invention, a kit for nucleic acid isolation from a sample comprising a solid support and an ethylene glycol multimer is provided. Preferably, the solid support is a magnetic bead having a carboxylic acid group as a free functional group on the support.

キットには任意にバッファ、界面活性剤、アルコール、塩、溶解剤、例えばプロテイナーゼ、キレート剤及び還元剤を含めてもよい。キットには本発明のキットの使用説明書、例えばリーフレットを含めてもよい。 The kit may optionally include buffers, surfactants, alcohols, salts, solubilizers such as proteinases, chelating agents and reducing agents. The kit may include instructions for using the kit of the present invention, such as a leaflet.

RNA単離の場合、キットにはRNAを単離するための手段、例えばRNA単離用の第2の固体支持体、例えばRNA捕捉用プローブを有する支持体、例えばオリゴdTまたは所望の標的配列と補完的な配列を有するプローブ、またはカオトロピック剤若しくは選択的沈降剤を更に含めてもよい。 For RNA isolation, the kit includes a means for isolating RNA, such as a second solid support for RNA isolation, such as a support having an RNA capture probe, such as oligo dT or the desired target sequence. Probes having complementary sequences, or chaotropic agents or selective precipitation agents may further be included.

以下の図を参照しながら、以下の非限定的な実施例において本発明を更に詳細に記載する。 The invention is described in more detail in the following non-limiting examples with reference to the following figures.

実施例1：DNA単離プロトコルにおけるMgClの効果
MyOne−COOHビーズ（2mg／ml）を含むPCR Clean−Up試薬、及び図1に示す試薬（20μl）を、未精製PCR溶液（20μl）に添加した。混合物を10分インキュベートし、上澄みを除去し、70％エタノール（50μl）で洗浄した。水（20μl）を添加し、サンプルを2分間混合し、インキュベートした。ビーズを磁力吸引によって分離し、上澄みを新しい試験管へ移した。 Example 1: Effect of MgCl in DNA isolation protocol
PCR Clean-Up reagent containing MyOne-COOH beads (2 mg / ml) and the reagent (20 μl) shown in FIG. 1 were added to the unpurified PCR solution (20 μl). The mixture was incubated for 10 minutes, the supernatant was removed and washed with 70% ethanol (50 μl). Water (20 μl) was added and the sample was mixed for 2 minutes and incubated. The beads were separated by magnetic suction and the supernatant was transferred to a new test tube.

上澄み中の単位複製配列の量を、PicoGreen dsDNA detection Assay（Molecular Probe社）を使用して定量した。PCR生成物の収率を、未精製の出発原料中で検出されるDNAの％として表す。（プライマーによりPicoGreen検出試薬が妨げられないことが示されている。） The amount of amplicon in the supernatant was quantified using PicoGreen dsDNA detection Assay (Molecular Probe). The yield of PCR product is expressed as the percentage of DNA detected in the crude starting material. (It is shown that the primer does not interfere with the PicoGreen detection reagent.)

図1に示すように、10〜30mM（最終濃度5〜15mMと同義）の濃度のMgCl₂のとき、PCR生成物の収率が良好であった。 As shown in FIG. 1, the yield of the PCR product was good when the concentration of MgCl ₂ was 10 to 30 mM (synonymous with the final concentration of 5 to 15 mM).

実施例2：DNA単離プロトコルにおけるプライマー除去効率
MyOne−COOHビーズ（2mg／ml）、50％ TEG及び30mM MgCl₂の10mM トリス（pH7.5）（20μl）中溶液を含むPCR Clean−Up試薬を、蛍光標識付きの20merオリゴヌクレオチド10pmol（20μl）を含む未精製PCR溶液に添加した。混合物を10分間インキュベートし、上澄みを分離し、70％エタノール（50μl）で洗浄した。水（20μl）を添加し、サンプルを2分間混合し、インキュベートした。ビーズを磁力吸引によって分離し、上澄みを新しい試験管へ移した。 Example 2: Primer removal efficiency in DNA isolation protocol
PCR Clean-Up reagent containing a solution of MyOne-COOH beads (2 mg / ml), 50% TEG and 30 mM MgCl ₂ in 10 mM Tris (pH 7.5) (20 μl), 10 pmol (20 μl) of 20-mer oligonucleotide with fluorescent label Was added to the unpurified PCR solution. The mixture was incubated for 10 minutes and the supernatant was separated and washed with 70% ethanol (50 μl). Water (20 μl) was added and the sample was mixed for 2 minutes and incubated. The beads were separated by magnetic suction and the supernatant was transferred to a new test tube.

上澄みに移された蛍光プライマーの量を、VictorII（Perkin Elmer社）プレートリーダーを使用して485／515nmの波長で定量した。 The amount of fluorescent primer transferred to the supernatant was quantified using a VictorII (Perkin Elmer) plate reader at a wavelength of 485/515 nm.

図2に示すように、単離方法において混入プライマーを除去することが効果的であった。 As shown in FIG. 2, it was effective to remove contaminating primers in the isolation method.

実施例3：DNA単離プロトコルにおけるTEG濃度の効果
MyOne−COOHビーズ（2mg／ml）、40〜60％TEG及び30mM MgCl₂の10mMトリスpH7.5（20μl）中溶液を含むPCR Clean−Up試薬に、100bpラダー（20μl）または未精製PCR溶液（20μl）を添加した。混合物を10分間インキュベートし、上澄みを分離し、70％エタノール（50μl）で洗浄した。水（20μl）を添加し、サンプルを2分間混合し、インキュベートした。ビーズを磁力吸引によって分離し、上澄みを新しい試験管へ移した。 Example 3: Effect of TEG concentration in DNA isolation protocol
PCR Clean-Up reagent containing MyOne-COOH beads (2 mg / ml), 40-60% TEG and 30 mM MgCl ₂ in 10 mM Tris pH 7.5 (20 μl) with 100 bp ladder (20 μl) or unpurified PCR solution ( 20 μl) was added. The mixture was incubated for 10 minutes and the supernatant was separated and washed with 70% ethanol (50 μl). Water (20 μl) was added and the sample was mixed for 2 minutes and incubated. The beads were separated by magnetic suction and the supernatant was transferred to a new test tube.

MyOne−COOHビーズ（2mg／ml）、25％ PEG−8000及び30mM MgCl₂の10mM トリス（pH7.5）中溶液を用いるPCR−CleanUpを対照として用いた。 PCR-CleanUp using a solution of MyOne-COOH beads (2 mg / ml), 25% PEG-8000 and 30 mM MgCl ₂ in 10 mM Tris (pH 7.5) was used as a control.

溶離液10μlを、1.5％のNuSieveアガロースを用いたゲル電気泳動、及び臭化エチジウム染色により分析した。 10 μl of eluate was analyzed by gel electrophoresis using 1.5% NuSieve agarose and ethidium bromide staining.

図3に示すように、20〜30％最終濃度のTEGがPCR生成物の単離に効果的であった。 As shown in FIG. 3, 20-30% final concentration of TEG was effective in isolating PCR products.

実施例4：DNA単離プロトコルにおける、TEG及びエタノール濃度の効果
MyOne−COOHビーズ（2mg／ml）、40〜50％TEG、0〜20％エタノール及び30mM MgCl₂の10mMトリスpH7.5（20μl）中溶液を含むPCR Clean−Up試薬に、100bpラダー（20μl）を添加した。混合物を10分間インキュベートし、上澄みを分離し、70％エタノール（50μl）で洗浄した。水（20μl）を添加し、サンプルを2分間混合し、インキュベートした。ビーズを磁力吸引によって分離し、上澄みを新しい試験管へ移した。 Example 4: Effect of TEG and ethanol concentration on DNA isolation protocol
100 bp ladder (20 μl) to PCR Clean-Up reagent containing MyOne-COOH beads (2 mg / ml), 40-50% TEG, 0-20% ethanol and 30 mM MgCl ₂ in 10 mM Tris pH 7.5 (20 μl) Was added. The mixture was incubated for 10 minutes and the supernatant was separated and washed with 70% ethanol (50 μl). Water (20 μl) was added and the sample was mixed for 2 minutes and incubated. The beads were separated by magnetic suction and the supernatant was transferred to a new test tube.

図4に明示するように、プロトコルにおいて、20％または25％（最終濃度）のTEG濃度、並びに0％、5％または10％（最終濃度）のエタノール濃度が有効であった。 As clearly shown in FIG. 4, TEG concentrations of 20% or 25% (final concentration) and ethanol concentrations of 0%, 5% or 10% (final concentration) were effective in the protocol.

実施例5：DNA単離プロトコルにおける、TEG及びエタノール濃度の効果
MyOne−COOHビーズ（2mg／ml）、10〜50％TEG、0〜40％エタノール及び30mM MgCl₂の10mMトリスpH7.5（50μl）中溶液を含むPCR Clean−Up試薬に、100bpラダー（50μl）を添加した。混合物を10分間インキュベートし、上澄みを分離し、70％エタノール（1000μl）で洗浄した。水（40μl）を添加し、サンプルを2分間混合し、インキュベートした。ビーズを磁力吸引によって分離し、上澄みを新しい試験管へ移した。 Example 5: Effect of TEG and ethanol concentration on DNA isolation protocol
100 bp ladder (50 μl) to PCR Clean-Up reagent containing MyOne-COOH beads (2 mg / ml), 10-50% TEG, 0-40% ethanol and 30 mM MgCl ₂ in 10 mM Tris pH 7.5 (50 μl) Was added. The mixture was incubated for 10 minutes and the supernatant was separated and washed with 70% ethanol (1000 μl). Water (40 μl) was added and the sample was mixed for 2 minutes and incubated. The beads were separated by magnetic suction and the supernatant was transferred to a new test tube.

図5は、25％のTEG（最終濃度）により単離が有効に行われ、エタノールがない場合に効果的な単離が行えることを示す。 FIG. 5 shows that isolation is effectively performed with 25% TEG (final concentration), and that effective isolation can be achieved in the absence of ethanol.

実施例6：DNA単離プロトコルにおける、高エタノール濃度及びTEGの効果
上記の実施例と同様の方法で実施した。図6に示すレーン構成は以下の通りである。
レーン1：20pmolのプライマーを添加した粗PCR溶液。
レーン2：「粗」100bpラダー。
レーン3：「粗」プライマー。
レーン4、7、10：MyOne−COOHビーズ（2mg／ml）、25％ TEG、67％エタノール及び30mM MgCl₂の10mM トリス（pH7.5）中溶液を用い、20pmolのプライマーを添加して得た精製PCR溶液。
レーン5、8、11：MyOne−COOHビーズ（2mg／ml）、50％ TEG及び30mM MgCl₂の10mM トリス（pH7.5）中溶液を用い、20pmolのプライマーを添加して得た精製PCR溶液。
レーン6、9、12：MyOne−COOHビーズ（2mg／ml）、25％ PEG−8000及び30mM MgCl₂の10mM トリス（pH7.5）中溶液を用い、20pmolのプライマーを添加して得た精製PCR溶液。
レーン13：MyOne−COOHビーズ（2mg／ml）、25％ TEG、67％エタノール及び30mM MgCl₂の10mM トリス（pH7.5）中溶液を用いた精製100bpラダー。
レーン14：MyOne−COOHビーズ（2mg／ml）、50％ TEG及び30mM MgCl₂の10mM トリス（pH7.5）中溶液を用いた精製100bpラダー。
レーン15：MyOne−COOHビーズ（2mg／ml）、25％ PEG−8000及び30mM MgCl₂の10mM トリス（pH7.5）中溶液を用いた精製100bpラダー。 Example 6: Effect of high ethanol concentration and TEG in DNA isolation protocol The same method as in the above example was performed. The lane configuration shown in FIG. 6 is as follows.
Lane 1: crude PCR solution with 20 pmol of primer added.
Lane 2: “Coarse” 100bp ladder.
Lane 3: “Coarse” primer.
Lanes 4, 7, and 10: MyOne-COOH beads (2 mg / ml), 25% TEG, 67% ethanol, and 30 mM MgCl ₂ in 10 mM Tris (pH 7.5), obtained by adding 20 pmol of primer Purified PCR solution.
Lanes 5, 8, and 11: Purified PCR solution obtained by adding 20 pmol of primer using a solution of MyOne-COOH beads (2 mg / ml), 50% TEG and 30 mM MgCl ₂ in 10 mM Tris (pH 7.5).
Lanes 6, 9, and 12: Purified PCR obtained using MyOne-COOH beads (2 mg / ml), 25% PEG-8000 and 30 mM MgCl ₂ in 10 mM Tris (pH 7.5) and adding 20 pmol of primer. solution.
Lane 13: Purified 100 bp ladder using a solution of MyOne-COOH beads (2 mg / ml), 25% TEG, 67% ethanol and 30 mM MgCl ₂ in 10 mM Tris (pH 7.5).
Lane 14: Purified 100 bp ladder using a solution of MyOne-COOH beads (2 mg / ml), 50% TEG and 30 mM MgCl ₂ in 10 mM Tris (pH 7.5).
Lane 15: Purified 100 bp ladder using a solution of MyOne-COOH beads (2 mg / ml), 25% PEG-8000 and 30 mM MgCl ₂ in 10 mM Tris (pH 7.5).

結果は、図6に示すように、高濃度のエタノールの使用によりプライマー（レーン4、7及び10を参照）のキャリーオーバー／共精製がもたらされ、ゆえに望ましくないことを示す。 The results show that, as shown in FIG. 6, the use of a high concentration of ethanol resulted in carryover / co-purification of the primers (see lanes 4, 7 and 10) and is therefore undesirable.

TEG及びMgCl₂の濃度変化による、PCR生成物の収率を示す。数値はストック液のものを指し、最終濃度はその半分量である。The yield of the PCR product according to the concentration change of TEG and MgCl ₂ is shown. The numbers refer to those of the stock solution and the final concentration is half that amount. DNA単離にTEGを使用した場合の、プライマー除去効率を示す。The primer removal efficiency when TEG is used for DNA isolation is shown. DNA単離プロトコルにおけるTEG濃度の効果を示す。数値はストック液の濃度を指し、上図はl00bpラダーに関し、下図は非精製PCR生成物に関する。Figure 6 shows the effect of TEG concentration in DNA isolation protocols. The numbers refer to the stock solution concentration, the upper figure relates to the lOObp ladder and the lower figure relates to the unpurified PCR product. DNA単離方法におけるTEG及びエタノール濃度の効果を示す。数値はストック液の濃度を指す。The effect of TEG and ethanol concentration in a DNA isolation method is shown. Numbers refer to stock solution concentrations. DNA単離方法におけるTEG及びエタノール濃度の効果を示す。数値はストック液の濃度を指す。The effect of TEG and ethanol concentration in a DNA isolation method is shown. Numbers refer to stock solution concentrations. DNA単離方法におけるTEG、PEG及び高エタノール濃度の効果を示す。数値はストック液の濃度を指す。レーン構成は実施例6に記載の通りである。The effect of TEG, PEG and high ethanol concentration in the DNA isolation method is shown. Numbers refer to stock solution concentrations. The lane configuration is as described in Example 6.

Claims

サンプルからの核酸の単離方法であって、前記サンプルを、2〜70個のエチレンオキシド単量体からなるエチレングリコール多量体の存在下で固体支持体と接触させて、これにより前記サンプル中の可溶性の核酸をこの支持体の表面に結合させる段階と、結合した核酸と共に前記支持体をサンプルから分離する段階とを含む方法。 A method for isolating nucleic acid from a sample, wherein the sample is contacted with a solid support in the presence of an ethylene glycol multimer consisting of 2 to 70 ethylene oxide monomers, whereby the solubility in the sample Binding the nucleic acid to the surface of the support and separating the support from the sample together with the bound nucleic acid.

エチレンオキシド単量体が直鎖状配置である、請求項1記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein the ethylene oxide monomer is in a linear configuration.

多量体が2〜20個のエチレンオキシド単量体からなる、請求項1または2記載の方法。 The method according to claim 1 or 2, wherein the multimer consists of 2 to 20 ethylene oxide monomers.

多量体が10個またはそれ以下のエチレンオキシド単位、好ましくは2〜6個のエチレンオキシド単位を有するオリゴエチレングリコールである、請求項1から3のいずれか1項記載の方法。 4. A process according to any one of claims 1 to 3, wherein the multimer is an oligoethylene glycol having 10 or less ethylene oxide units, preferably 2 to 6 ethylene oxide units.

多量体がテトラエチレングリコールである、請求項4記載の方法。 5. The method according to claim 4, wherein the multimer is tetraethylene glycol.

エチレングリコール多量体を15％超、好ましくは15〜35％の最終濃度で用いる、請求項1から5のいずれか1項記載の方法。 6. A process according to any one of claims 1 to 5, wherein the ethylene glycol multimer is used at a final concentration of more than 15%, preferably 15 to 35%.

核酸を固体支持体に結合させる段階を、1M未満、好ましくは5mM〜0.5Mの最終濃度の塩の存在下で実施する、請求項1から6のいずれか1項記載の方法。 7. A method according to any one of claims 1 to 6, wherein the step of binding the nucleic acid to the solid support is carried out in the presence of a final concentration of salt of less than 1M, preferably between 5 mM and 0.5M.

30％（v／v）未満の最終濃度のアルコールの存在下で実施する、請求項1から7のいずれか1項記載の方法。 8. A process according to any one of claims 1 to 7, which is carried out in the presence of a final concentration of alcohol of less than 30% (v / v).

サンプルを、前記サンプルとエチレングリコール多量体とを接触させる前に、と同時に、または後に、界面活性剤と接触させ、前記界面活性剤が0.2〜30％（w／v）の最終濃度で存在する、請求項1から8のいずれか1項記載の方法。 The sample is contacted with a surfactant before, simultaneously with, or after contacting the sample with the ethylene glycol multimer, and the surfactant is present at a final concentration of 0.2-30% (w / v). 9. The method according to any one of claims 1 to 8.

界面活性剤がアニオン性界面活性剤、好ましくはアルカリ金属のアルキル硫酸塩である、請求項9記載の方法。 10. A process according to claim 9, wherein the surfactant is an anionic surfactant, preferably an alkali metal alkyl sulfate.

1％（w／v）未満の界面活性剤、30％（v／v）未満のアルコールの存在下で、かつカオトロピック剤の非存在下で実施する、請求項1から8のいずれか1項記載の方法。 9. The method according to any one of claims 1 to 8, which is carried out in the presence of less than 1% (w / v) surfactant, less than 30% (v / v) alcohol and in the absence of a chaotropic agent. the method of.

界面活性剤、カオトロピック剤及びアルコールのうちの1つまたは複数の非存在下で実施する、請求項11記載の方法。 12. The method of claim 11, wherein the method is performed in the absence of one or more of a surfactant, a chaotropic agent, and an alcohol.

エチレングリコール多量体のみを緩衝液中で用いる、請求項12記載の方法。 13. The method of claim 12, wherein only ethylene glycol multimers are used in the buffer.

30ヌクレオチド未満のオリゴヌクレオチドと、100塩基対超の核酸分子を分離する、請求1から13のいずれか1項記載の方法。 14. The method according to any one of claims 1 to 13, wherein an oligonucleotide of less than 30 nucleotides and a nucleic acid molecule of more than 100 base pairs are separated.

固体支持体から核酸を溶出し、溶出された材料を用いてそれ以降の更なる処理、好ましくは塩基配列決定、を任意で実施する段階を更に含む、請求項1から14のいずれか1項記載の方法。 15. The method according to any one of claims 1 to 14, further comprising the step of eluting the nucleic acid from the solid support and optionally performing further further processing, preferably sequencing, using the eluted material. the method of.

核酸がDNA、好ましくは10〜250kbpの非ゲノムDNA断片である、請求項1から15のいずれか1項記載の方法。 16. The method according to any one of claims 1 to 15, wherein the nucleic acid is DNA, preferably a 10-250 kbp non-genomic DNA fragment.

DNAを単離し、さらに更なる段階でRNAを同じサンプルから単離する、請求項1から16のいずれか1項記載の方法。 17. A method according to any one of claims 1 to 16, wherein the DNA is isolated and in a further step RNA is isolated from the same sample.

サンプルが全血または血液製剤である、請求項1から17のいずれか1項記載の方法。 18. The method according to any one of claims 1 to 17, wherein the sample is whole blood or a blood product.

サンプルが増幅工程の後得られるサンプルである、請求項1から17のいずれか1項記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 17, wherein the sample is a sample obtained after the amplification step.

サンプル中の構造成分を破壊させる、またはサンプル中の細胞を溶解させるための1つまたは複数の追加的な段階を更に含む、請求項1から19のいずれか1項記載の方法。 20. The method of any one of claims 1-19, further comprising one or more additional steps for disrupting structural components in the sample or lysing cells in the sample.

固体支持体が微粒子である、請求項1から20のいずれか1項記載の方法。 21. The method according to any one of claims 1 to 20, wherein the solid support is a microparticle.

固体支持体が磁気ビーズを含む、請求項21記載の方法。 24. The method of claim 21, wherein the solid support comprises magnetic beads.

固体支持体の表面が親水性である、請求項1から22のいずれか1項記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 22, wherein the surface of the solid support is hydrophilic.

固体支持体が水酸基、エポキシ基、カルボン酸基またはスルホン酸基を有する、請求項1から23のいずれか1項記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 23, wherein the solid support has a hydroxyl group, an epoxy group, a carboxylic acid group or a sulfonic acid group.

核酸の結合の後、固体支持体を、好ましくは250mM未満の塩及び50〜90％のアルコールを含む溶液で洗浄する、請求項1から24のいずれか1項記載の方法。 25. A method according to any one of claims 1 to 24, wherein after binding of the nucleic acid, the solid support is washed with a solution preferably containing less than 250 mM salt and 50-90% alcohol.

請求項1から5のいずれか1項記載のエチレングリコール多量体、及び固体支持体を含む、請求項1から25のいずれか1項記載の方法に従うサンプルからの核酸単離用のキット。 26. A kit for nucleic acid isolation from a sample according to the method of any one of claims 1 to 25, comprising an ethylene glycol multimer according to any one of claims 1 to 5 and a solid support.

固体支持体が請求項21から24のいずれか1項で定義される、請求項26記載のキット。 27. A kit according to claim 26, wherein the solid support is defined in any one of claims 21 to 24.

請求項1から25のいずれか1項記載の方法に従うキットの使用説明を有するリーフレットを更に含む、請求項26または27記載のキット。 28. Kit according to claim 26 or 27, further comprising a leaflet with instructions for using the kit according to the method of any one of claims 1 to 25.

サンプルが細胞を含み、細胞を免疫磁気的分離方法によって得る、請求項1から18、または請求項20から25のいずれか1項記載の方法。 26. The method of any one of claims 1 to 18, or 20 to 25, wherein the sample comprises cells and the cells are obtained by an immunomagnetic separation method.

サンプルからRNAを単離する追加的な段階を更に含む、請求項29記載の方法。 30. The method of claim 29, further comprising the additional step of isolating RNA from the sample.

細胞が細胞：ビーズ複合体中に存在する、請求項29または30記載の方法。 32. The method of claim 29 or 30, wherein the cells are in a cell: bead complex.