JP2008526201A

JP2008526201A - 中和エピトープベースの成長増強ワクチン

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Publication number: JP2008526201A
Application number: JP2007549477A
Authority: JP
Inventors: マークエル．スミス，; ケネスイー．パーマー，; グレゴリーピー．ポーグ，; デイビッドエル．ユンカー，; マークディー．コクラン，
Original assignee: シェーリング−プラウ・リミテッド
Priority date: 2004-12-30
Filing date: 2005-12-21
Publication date: 2008-07-24
Also published as: WO2006073827A3; US20060159696A1; AU2005323087A1; MX2007008132A; EP1831372A2; US7432079B2; US20090208522A1; WO2006073827A2; CA2594276A1; TW200634156A; AR051853A1; MY144766A; PE20060860A1; JP2011024590A

Abstract

本発明は、植物ウイルスコートタンパク質およびＧＤＦ８ペプチドドメイン、またはＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントを含む融合タンパク質を提供する。この融合タンパク質を発現する植物ウイルスベクター、およびこれらのベクターを用いる方法も提供される。本発明は、ＧＤＦ８タンパク質の有用なエピトープを含む植物ウイルスコートタンパク質（ＶＣＰ）融合タンパク質（「ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質」）、例えば、ＧＤＦ８の少なくとも１つの特異的な中和エピトープを含む、５０残基以下のＧＤＦ８のペプチドフラグメントを含む融合タンパク質を提供することによって、当該分野におけるこれらの欠点および他の欠点を解決する。

Description

発明の分野
本発明は、成長および分化因子８、ならびに成長および分化因子８の抗原性ペプチドフラグメント、ならびに関連の抗原およびワクチンを、植物ウイルスベクターを用いて植物中で、発現することによって形成された融合タンパク質に、そして成長および分化因子８の活性を調節するためにこのような融合タンパク質を用いて動物を処置する方法に関する。

発明の背景
成長および分化因子８は、トランスフォーミング成長因子β（「ＴＧＦ−β」）スーパーファミリーに分類されるタンパク質である。一般には、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのタンパク質は最初に、前駆体（ａ／ｋ／ａプロホルモン）として発現され、これが、前駆タンパク質のＣ末端から塩基性残基約１１０〜１４０アミノ酸のクラスターでタンパク質分解性の切断を受ける。各々の場合に、活性または成熟したＴＧＦ−β種は、切断された前駆体タンパク質Ｃ末端領域のジスルフィド結合二量体であると考えられる。

成長および分化因子８は、本明細書において以降ではＧＤＦ８であって、これはまたミオスタチンとしても当該分野で公知である。ＧＤＦ８の前駆体（本明細書において以降では「前駆体ＧＤＦ８（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒＧＤＦ８）」）をコードする遺伝子は、広範な生物体からクローニングされている。これらとしてはヒトおよびマウスの前駆体ＧＤＦ８が挙げられる（非特許文献１；特許文献１、本明細書において参照によって援用される）。ＧＤＦ８免疫反応性は、ヒト骨格筋において１型および２型のファイバーの両方で検出可能であるということも報告されている。ＧＤＦ８を検出するための抗体およびアッセイは、例えば、特許文献２によって記載される。

ＧＤＦ８は、ＧＤＦ８ノックアウトマウスによって確認されるように、骨格筋の成長および発達を下方制御することまたは阻害することに役割を果たすことがさらに報告されている（非特許文献２）。この理由のために、以前に、詳細には、動物の畜産の分野で、動物のＧＤＦ８活性をいくつかの方法で調節することが試みられており、ここでは種々の食用動物の成長および／または相対的な筋肉量を強化するためにＧＤＦ８活性を下方制御することが目標である。

例えば、特許文献３は、前駆体ＧＤＦ８遺伝子プロモーターおよびアッセイを記載しており、ここでそのプロモーターの理論的インヒビターを同定するためにそのアッセイが用いられるという提案をしている。特許文献４は、細胞と、ＧＤＦ８レセプターと競合するＧＤＦ８プロドメインとを接触させることによってその細胞上でＧＤＦ８の影響を阻害する方法を記載しており、そして成熟ＧＤＦ８のＣ末端が変化し得ることを報告している。特許文献５は、ＧＤＦ８の可能性のあるアンタゴニストとしてホリスタチンの使用を記載している。動物の畜産または臨床適用の分野で任意の現実的な適用が得られている方法はない（ヒトまたは獣医のいずれでも）。

当該技術はまた、ＧＤＦ８機能を下方制御するために抗体およびワクチン技術を使用することを試みている。例えば、本明細書において参照によって援用される米国特許第６，３６９，２０１号は、ペプチド、すなわちＧＤＦ８タンパク質のフラグメント、および抗ＧＤＦ８抗体を惹起するためのワクチンを記載する。その特許はまた、報告されたＧＤＦ８ペプチドフラグメントのいくつかで免疫したげっ歯類での、コントロールに対する、特定されない程度の成長または体重増加を報告した。

ＧＤＦ８の他の生理学的な役割がまた記載されている。例えば、参照によって本明細書に援用される、特許文献６は、ＧＤＦ８機能を阻害することが、ＩＩ型糖尿病を処置するために、例えば、抗ＧＤＦ８抗体または抗ＧＤＦ８ワクチンを、この状態を有する患者に投与することによって、有用であることを示唆している。

近年では、その内容が本明細書において参照によって援用される特許文献７は、キメラタンパク質を発現する組み換え植物ウイルスを記載している。これらのキメラタンパク質は、植物ウイルス（またはウイルス）コートタンパク質（ＶＣＰ）および目的のペプチドまたはポリペプチドの融合によって形成される。このような組み換え植物ウイルスを用いて植物細胞を感染させることによる、特許文献７によれば、比較的大量の所望の融合タンパク質が生成される。ＶＣＰタンパク質が目的のポリペプチド抗原と融合される場合、この融合されたポリペプチド抗原の位置は、免疫系、結合抗体などに対して曝露されるように注意深く選択されなければならない。適切なタンパク質操作を用いて、この融合ＶＣＰは、目的のポリペプチドに対する抗体応答および／または防御的免疫を誘導するための免疫原または抗原として、あるいはこのような目的のポリペプチドを検出するのにおいて有用なイムノアッセイを開発および実施するための試薬として用いられ得る。

抗ＧＤＦ８免疫応答を惹起するための改善された抗原および免疫原について、ならびにＧＤＦ８に対して高度に特異的に結合し得る改良されたＧＤＦ８抗体については当該分野では長年にわたって必要性が残存している。

本明細書における任意の引用文献の引用は、このような引用文献が当該出願の「先行技術（ＰｒｉｏｒＡｒｔ）」として利用可能であるという承認と解釈されるべきではない。
米国特許第５，８２７，７３３号明細書米国特許第６，０９６，５０６号明細書米国特許第６，３９９，３１２号明細書米国特許第６，６５６，４７５号明細書米国特許第６，００４，９３７号明細書米国特許第６，３６８，５９７号明細書米国特許第６，７３０，３０６号明細書Ｎｅｓｔｏｒｅｔａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ９５：１４９３８〜４３ＭｃＰｈｅｒｒｏｎｅｔａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ３８７：８３〜９０

発明の要旨
本発明は、ＧＤＦ８タンパク質の有用なエピトープを含む植物ウイルスコートタンパク質（ＶＣＰ）融合タンパク質（「ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質」）、例えば、ＧＤＦ８の少なくとも１つの特異的な中和エピトープを含む、５０残基以下のＧＤＦ８のペプチドフラグメントを含む融合タンパク質を提供することによって、当該分野におけるこれらの欠点および他の欠点を解決する。本発明はさらに、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質および／またはそのフラグメントによって惹起される抗体、抗体フラグメントおよび関連の結合タンパク質、ならびにこれらを作製する方法およびこれらを用いる方法を提供する。

本発明の１実施形態では、本発明の融合タンパク質は、下に列挙される天然のヒト前駆体ＧＤＦ８（配列番号１）のほぼ３２７残基〜ほぼ３４６残基を含むＧＤＦ８ペプチドドメインを含む。

別の実施形態では、このＧＤＦ８ペプチドドメインは、ほぼ３２７残基〜ほぼ３３８残基を含み、そして好ましくは、天然のヒト前駆体ＧＤＦ８のほぼ３２９残基〜ほぼ３３２残基を含む。ＤＪ５（２０マー）ＧＤＦ８ペプチドドメインは下に、１文字コードおよび３文字コードの両方で図示されており、読み取りの簡便性のために、配列番号１の前駆体ＧＤＦ８に基づく残基番号付けを伴う（その内容が全体が参照によって本明細書に援用される、２００４年１２月２１日出願の米国特許出願第１１／０１９，００１号を参照のこと）。

必要に応じて、本発明の融合タンパク質で使用されるＧＤＦ８ペプチドドメインは、保存的な単一のアミノ酸置換を含む。単なる例として、これらは、このペプチド内の少なくとも５つのアミノ酸位置のうちの１つに由来してもよい。詳細には、必要に応じて、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換が、例えば、ＧＤＦ８の残基３２７〜３４６に存在する。別の選択肢では、ＧＤＦ８ペプチドドメインは、ＧＤＦ８ペプチドドメイン内の５つ以下のアミノ酸位置で保存的アミノ酸置換を含む。別の実施形態では、ＧＤＦ８の残基３２７〜３４６の間に例えば２つの保存的アミノ酸置換が存在する。さらに別の実施形態では、ＧＤＦ８の残基３２７〜３４６の間に例えば、３つの保存的アミノ酸置換が存在する。なおさらに別の実施形態では、ＧＤＦ８の残基３２７〜３４６の間に例えば、４つの保存的アミノ酸置換が存在する。

好ましくは、このアミノ酸残基置換は、図２の種間アラインメントのアミノ酸のバリエーションによって記される天然のヒト前駆体ＧＤＦ８（配列番号１）に対して、１つ以上の位置である。これらは、残基３２８、３２９、３３１、３３３およびならびにそれらの組み合わせであって、ここで
（ａ）アミノ酸残基３２８がＨｉｓ、ＬｅｕまたはＡｓｎであり；
（ｂ）アミノ酸残基３２９がＧｌｎまたはＬｙｓであり；
（ｃ）アミノ酸残基３３１がＡｓｎまたはＳｅｒであり；
（ｄ）アミノ酸残基３３３がＡｒｇまたはＬｙｓであり；そして／または
（ｅ）アミノ酸残基３３５がＳｅｒ、ＰｒｏまたはＴｈｒである。

好ましくは、この置換されたＧＤＦ８ペプチドドメインは、ラットモノクローナル抗体ＭＡＢ７８８（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に結合する。

従って、本発明は、ＧＤＦ８ペプチドドメインを含む融合タンパク質を提供し、ここでこのＧＤＦ８ペプチドドメインは、配列番号１のアミノ酸残基３２７〜３４６、またはＧＤＦ８ペプチドの抗原性フラグメントを含む。この抗原性フラグメントは、例えば、配列番号１の残基３２７〜３３８、および／または配列番号１の残基３２９〜３３２を含んでもよい。ＧＤＦ８ペプチドドメインは好ましくは、ウイルスコートタンパク質、またはそのフラグメントを含むポリペプチドに融合される。

１実施形態では、本明細書において記載されるような「ウイルスコートタンパク質（ｖｉｒｕｓｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ）」すなわちＶＣＰは、本発明の融合タンパク質の一部である場合、天然の（非融合）ＶＣＰで見出されるアミノ酸残基の全てを含む。選択的な別の実施形態では、この「ウイルスコートタンパク質（ｖｉｒｕｓｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語はまた、ＧＤＦ８ペプチドドメインに対する結合から生じる、そして／または天然のＶＣＰの配列内のＧＤＦ８ペプチドドメインの挿入（例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端およびまたはその間のいずれかの挿入）から生じる天然のＶＣＰのフラグメント（単数または複数）、ならびに／あるいはＧＤＦ８ペプチドドメインの挿入または融合を操作する結果としてＶＣＰタンパク質からの１つ以上のアミノ酸残基の欠失から生じるフラグメントを包含する。従って、融合タンパク質の一部としてのＶＣＰ「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、天然のＶＣＰに対して１〜約１０残基を必要に応じて欠失しているか、そして／またはＧＤＦ８ペプチドドメインの挿入によって２つ以上のドメインに分けられているＶＣＰである。

任意の適切なウイルスが、植物ウイルスのような融合パートナーとして使用され得る。好ましい植物ウイルスは、例えば、トバモウイルスである。トバモウイルス株としては、例えば、タバコモザイクウイルス（「ＴＭＶ」）型の株（Ｕ１）、タバコ・マイルド・グリーン・モザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏｍｉｌｄｇｒｅｅｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）（Ｕ５）、トマトモザイクウイルス、オドントグロッサム・リングスポット（Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍｒｉｎｇｓｐｏｔ）ウイルス、リブグラス（ｒｉｂｇｒａｓｓ）モザイクウイルス、サンヘンプ（Ｓｕｎｎ−ｈｅｍｐ）モザイクウイルスおよび／またはキュウリ緑斑モザイクウイルスを挙げることができる。

この融合タンパク質は好ましくは、２０マーのＧＤＦ８ペプチドドメインを有する、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１に従う、および／または１２マーのＧＤＦ８ペプチドドメインを有する、配列番号５４もしくは配列番号５５に従う、本明細書において以前に例示されたポリペプチドの群から選択される。

この融合タンパク質は一般には、以下の形態である：
（ａ）一本鎖のプラス−センス植物ＲＮＡウイルス由来の植物ウイルスコートタンパク質；
（ｂ）このウイルスコートタンパク質に融合されたＧＤＦ８ペプチドドメインであって、以下の位置：
（ｉ）このウイルスコートタンパク質のＮ末端
（ｉｉ）このコートタンパク質のＣ末端
（ｉｉｉ）このコートタンパク質のＣ末端由来の４つのアミノ酸、
（ｉｖ）該コートタンパク質の外部に露出されたループ領域内；
のうちの１つから選択される位置で融合されたＧＤＦペプチドドメイン；
、ここでこの融合タンパク質は、アジュバントがあっても無くても、ＧＤＦ８に対する免疫応答を惹起する。

好ましくは、この融合タンパク質は、抗ＧＤＦ８抗体の特定の中和エピトープ、例えば、ラット抗ＧＤＦ８モノクローナル抗体７８８および／またはヤギ抗ＧＤＦ８ポリクローナル抗血清のＩｇＧ画分を含む。

さらに好ましくは、本発明の融合タンパク質は、アジュバントがあっても無くても、脊椎動物の免疫系に提示される場合、ＧＤＦ８に対する免疫応答を惹起する。

本発明はまた、例えば、本発明の融合タンパク質をコードする複製可能なベクター、例えば、配列番号２のヌクレオチド１１１２〜ヌクレオチド１１７１を含む核酸分子の形態で、核酸分子を提供する。

本発明による複製可能なベクターは必要に応じて、プラスミド、ファージ、コスミド、および／またはウイルスである。植物ウイルス、例えば、トバモウイルスが好ましい。さらに好ましくは、複製可能なベクターは、Ｕ１株またはＵ５株由来のＴＭＶである。ＧＤＦ８ペプチドドメインを発現する、操作されたキメラＴＭＶは、本明細書において、ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ３、ＴＭＶ−ＦＶ４、ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７として例示される。宿主の細胞および植物、例えば、複製可能なベクターを発現するＮｉｃｏｔｉａｎａ植物も本発明によって提供される。

本発明はさらに、融合タンパク質を発現するＴＭＶウイルスのような、本発明の融合タンパク質および／または上記の複製可能な発現ベクターを例えば含む、ワクチン組成物を提供する。必要に応じて、当該分野で公知のアジュバントも、本発明のワクチン組成物に含まれる。

本発明はまた、多数の有用な方法およびプロセスを提供する。例えば、本発明は、本発明の融合タンパク質を生成する方法を提供し、この方法は、上記の複製可能な発現ベクターを含む宿主の植物または植物細胞を培養する工程、コードされた融合タンパク質を発現する工程、およびこの融合タンパク質を回収する工程を包含する。

好ましくは、本発明の融合タンパク質を生成する方法は、ＧＤＦ８ペプチドドメインを含む融合タンパク質を発現する組み換えウイルスを用いて、例えば、例示されるＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ３、ＴＭＶ−ＦＶ４、ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７のウイルスのうちの１つ以上を用いて、宿主植物を感染させる工程と、次いでこの複製されたウイルスを回収して精製する工程とを包含する。必要に応じてこの融合タンパク質はさらに、ＴＭＶゲノムＲＮＡから融合コートタンパク質を分離することによって、精製された組み換えＴＭＶから単離される。

さらなる提供された方法は、動物において抗ＧＤＦ８免疫応答を惹起する方法を包含し、これには、本発明のワクチン組成物の有効量をこの動物に投与する工程を包含する。

最も好ましくは、本発明は、本発明のワクチン組成物の有効量を用いて動物を免疫する工程を含む、動物においてＧＤＦ８活性を下方制御する方法を提供する。

発明の詳細な説明
従って、本発明は、植物ウイルスＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を提供する。これらのＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質は、動物において抗ＧＤＦ８免疫応答を惹起するため、例えば、ＧＤＦ８を下方制御するかおよび／または筋肉量の増大を促進するための免疫原として、そして／あるいはＧＤＦ８に対するＧＤＦ８または抗体の結合の検出の方法のための試薬として、直接働き得る。これらのＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質はまた、融合タンパク質のＶＣＰ部分を実質的に含まない形態で、発現されたＧＤＦ８エピトープの容易な切断および回収を可能にするように操作され得る。ＧＤＦ８エピトープは一般に、本明細書においてＧＤＦ８ペプチドまたはペプチドフラグメントと呼ばれる。これらのＧＤＦ８ペプチドの有用性としては、動物における抗ＧＤＦ８免疫応答を惹起するための免疫原としての使用、およびＧＤＦ８関連アッセイにおける高度に特異的な抗体結合標的としての使用が挙げられる。本発明はまた、ウイルス粒子、すなわち、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を含む、ビリオン、および同じものを含む植物細胞を提供する。コレラは必要に応じて、供給源として使用され、これからＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質が精製されるか、または免疫原として直接使用され得る。

好ましくは、植物ウイルスは、トバモウイルス群の種である。トバモウイルス種としては、例えば、タバコモザイクウイルス（Ｕ１株型）、キュウリ緑斑モザイウウイルス（ＳＨ株）、フランジパニモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス（ｋｙｕｒｉｇｒｅｅｎｍｏｔｔｌｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）、オドントグロッサム・リングスポットウイルス（Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ）、パプリカ・マイルド・モットル（ｐａｐｒｉｋａｍｉｌｄｍｏｔｔｌｅ）ウイルス、ペッパー・マイルド・モットル（ｐｅｐｐｅｒｍｉｌｄｍｏｔｔｌｅ）ウイルス（Ｓ株）、リブグラス（ｒｉｂｇｒａｓｓ）モザイクウイルス、サーモンズ・オプンチア（Ｓａｍｍｏｎｓ’ Ｏｐｕｎｔｉａ）ウイルス、サンヘンプ（Ｓｕｎｎ−ｈｅｍｐ）モザイクウイルス、タバコ・マイルド・グリーン・モザイク（ｔｏｂａｃｃｏｍｉｌｄｇｒｅｅｎｍｏｓａｉｃ）ウイルス（Ｕ５）、タバコモザイクウイルス（Ｖｕｌｇａｒｅ株；ｓｓｐ．ＮＣ８２株）、トマトモザイクウイルスおよびＵｌｌｕｃｕｓマイルド・モットルウイルスが挙げられる。本明細書に例示されるトバモウイルスは、タバコモザイクウイルスＵ１およびタバコ・マイルド・グリーン・モザイクウイルスＵ５であって、そうでなければ、それぞれＴＭＶのＵ１およびＴＭＶのＵ５と呼ばれる。

ＧＤＦ８の特定の結合エピトープは、抗ＧＤＦ８抗血清と、重複するＧＤＦ８ペプチドの集団とを接触すること、およびペプチドと抗血清ＩｇＧ抗体との間の結合活性の程度を決定することによって最初に同定された。この抗ＧＤＦ８抗血清は、発現および抗原性のために最適化された構造を有する、前駆体ＧＤＦ８タンパク質で免疫されたヤギから得られた。

本発明をさらに完全に評価するために、以下の定義が提供される。説明の簡便性のための単数の用語の使用は、決してそれに限定されるものではない。従って、例えば、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」を含む組成物についての言及は、このようなポリペプチドの１つ以上についての言及を包含する。

本明細書において用いる場合、「約、ほぼ、およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、「約、ほぼ、およそ（ａｂｏｕｔ）」という用語と交換可能に用いられ、そしてある値が示された値の２０％内であることを意味し、すなわち、「約、ほぼ、およそ」５０個のアミノ酸残基を含むペプチドは、４０〜６０個のアミノ酸残基を含んでもよい。

本発明は、本明細書に開示される特定の構成、工程段階、および物質には限定されず、従ってこのような構成、工程段階および物質はある程度変化してもよいことも理解されるべきである。本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のために用いられるだけであって、限定されるものではないことも理解されるべきである。なぜなら本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるからである。

本明細書において用いる場合、「ポリペプチド」という用語は、「タンパク質」という用語と交換可能に用いられ、そしてペプチド結合によって接続される２つ以上のアミノ酸を含むポリマーを意味する。好ましくは、本明細書において他に言及しない限り、ポリペプチドという用語は、サイズまたは鎖の長さによって、本明細書において使用されるような「ペプチド」という用語とは区別され、ここで「ペプチド」とは、約５０またはそれより少ないアミノ酸のポリマー鎖を指し、そしてポリペプチドまたはタンパク質は、他に特定されない限り、約５０個を超えるアミノ酸を含むポリマー鎖をいう。必要に応じて、ペプチドまたはポリペプチドは、遺伝子によってまたはｍＲＮＡによってコードされる特定のアミノ酸残基を欠いてもよい。例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ分子は、最終のタンパク質から切断され、従って最終のタンパク質の一部ではなくてもよい、ポリペプチドのＮ末端上のアミノ酸残基の配列（すなわち、シグナル配列）をコードし得る。

本発明に従う、融合タンパク質の「ＧＤＦ８ペプチドドメイン（ＧＤＦ８ｐｅｐｔｉｄｅｄｏｍａｉｎ）」を含む「ＧＤＦ８ペプチド（ＧＤＦ８ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、ＧＤＦ８タンパク質由来の比較的短いフラグメント、例えば、本明細書において同定されたＤＪ５の２０マーである。この用語は必要に応じて、これらのペプチドまたはペプチドドメインのそれよりさらに小さいフラグメントさえ、例えば、本明細書においてやはり同定される１２マーおよび４マーのドメインさえ含み、そしてこれはまた必要に応じて、本明細書に記載のアミノ酸置換を含む。ＧＤＦ８ペプチドまたはペプチドドメインの最大サイズを限定することは意図しないが、ペプチドドメインのサイズは、約４〜約５０残基におよぶことが好ましく、より好ましくは、これは約４〜約２０残基のサイズにおよび、そして必要に応じて、本発明によるＧＤＦ８ペプチドドメインは、約８〜約１２残基のサイズにおよぶ。１つの特定の実施形態では、ペプチドドメインのサイズは、約５〜約１６のアミノ酸残基におよぶ。

本明細書において用いる場合、「抗原性フラグメント（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｆｒａｇｍｅｎｔ）」という用語とは、特定のタンパク質および／またはペプチドに関して、抗原性であるタンパク質／ペプチドのフラグメントである。例えば、ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントとは、抗原性であるＧＤＦ８ペプチドドメインのフラグメントである。本明細書において用いる場合、ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントは、全長ペプチドから単一のアミノ酸程度の小さいアミノ酸を欠失しているＧＤＦ８ペプチドドメインの任意のフラグメントであってもよい。特定の実施形態では、ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントは、約３〜約２０個のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントは、約４〜約１６個のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントは、約８〜約１２個のアミノ酸を含む。別の特定の実施形態では、ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントは、約８〜約１２個のアミノ酸を含む。所定のＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントは、ＧＤＦ８ペプチドドメイン自体として、組み換え供給源から、天然の供給源から単離されたタンパク質から、および／または化学的／ペプチド合成を通じて得られてもよい。従って、抗原性フラグメントは、例えば、（ｉ）天然に存在するＧＤＦ８もしくはそのペプチドフラグメントのタンパク質分解性消化後、（ｉｉ）組み換えＧＤＦ８もしくはそのペプチドフラグメントのタンパク質分解性消化後、（ｉｉｉ）それ自体として、もしくは融合タンパク質としてのいずれかによるその組み換え発現を直接通じて、得られてもよく、そして／または（ｉｖ）例えばペプチド合成を通じて新規に生成されてもよい。

別の特定の実施形態では、ＧＤＦ８ペプチドは、ＧＤＦ８の天然に存在するヒト前駆体（配列番号１）の残基番号３２７〜３４６（配列番号８）によって規定されるペプチドに対して約５０％の類似性（好ましくは同一性）〜１００％の類似性におよぶ、ある程度の類似性（そして好ましくは同一性の程度）を有するペプチドドメインを含む。

本明細書において使用される場合、「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」または「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、無関係の物質、すなわち、混入物または不純物であって、その物質が由来する天然の物質を含む物質の存在を減少させるかまたは排除する条件下で分けられた物質をいう。例えば、精製されるかまたは単離されたタンパク質は好ましくは、細胞内で見出され得る他のタンパク質または核酸を含まない。精製された物質は、もともと関連する細胞成分のうち約２５％未満、好ましくは約５０％未満、さらに好ましくは約７５％未満、そして最も好ましくは約９０％未満を含んでもよい。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、イムノアッセイ、組成物分析、生物学的アッセイおよび当該分野で公知の他の方法によって評価され得る。機能的な局面から、本発明による単離されたＧＤＦ８ペプチドは、ＧＤＦ８ペプチドに特異的である免疫応答を惹起し得るために、前駆体ＧＤＦ８タンパク質および／または成熟ＧＤＦ８タンパク質を含む他の物質から実質的に分離されているＧＤＦ８ペプチドであってもよい。

精製のための方法は当該分野で周知である。例えば、核酸は、沈降、クロマトグラフィー、超遠心および他の方法によって精製され得る。タンパク質およびポリペプチド、ならびにペプチドは、限定はしないが、分取ディスク−ゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、沈降および塩析クロマトグラフィー、抽出および向流分配を含む種々の方法によって精製され得る。いくつかの目的のために、組み換え系においてポリペプチドを生成することが好ましく、ここでは、限定はしないがポリヒスチジン配列、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＧＳＴおよび／または抗体に対して特異的に結合する配列のような、精製を容易にするさらなる配列タグを、タンパク質が含む。次いで、このポリペプチドは、適切な固相マトリックス上のクロマトグラフィーによって宿主細胞の粗溶解物から精製され得る。あるいは、ポリペプチドに対して生成される、抗体またはその結合フラグメントは、精製試薬として用いられ得る。

「実質的に純粋な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙｐｕｒｅ）」という用語は、当該分野で公知の従来の精製技術を用いて達成され得る最高程度の純度を示しており、そしてもともとの供給源の生物体または組み換えＤＮＡ発現系由来の他の混入するタンパク質、核酸および他の生物学的物質を含まない、核酸、ポリペプチド、ペプチドまたは他の物質を意味する。実質的な純度は、標準的な方法によってアッセイされてもよく、そして代表的には、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％の純度を超える。純度の評価は、質量およびモルに基づいて行われてもよい。

「ポリヌクレオチド」または「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、限定はしないが、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびさらに合成ＤＮＡ配列さえ含むヌクレオチドを含む分子である。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の当該分野で公知のベースのアナログを含む核酸分子を包含するものとする。

「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」または「複製ベクター（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｖｅｃｔｏｒ）」はレプリコン、例えば、プラスミド、ファージまたはコスミドであって、これに対して、付着されたセグメントの複製をもたらすように別の核酸セグメントが結合されてもよく、または組み込まれてもよい。この用語はまた、組み込まれるかまたは結合された目的の核酸セグメントを含むレプリコンを含む。

本発明において用いられ得るベクターとしては、微生物プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み込み可能なＤＮＡフラグメントおよび、宿主のゲノムへの核酸の組み込みを容易にし得る他のビヒクルが挙げられる。プラスミドはベクターの最も一般に用いられる形態であるが、等価な機能を果たし、そして当該分野で公知となるベクターの全ての他の形態が、本明細書における使用のために適切である。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓｅｔａｌ．，ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，１９８５、ならびに補遺、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚｅｔａｌ．（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：ＡＳｕｒｖｅｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓａｎｄＴｈｅｉｒＵｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。

本発明のＧＤＦ８ペプチド（単数または複数）をコードするＤＮＡのベクターへの挿入は、このＤＮＡおよびベクターの両方の末端が適合する制限部位を有する場合には容易に達成される。これを行うことができない場合、制限エンドヌクレアーゼ切断によって生成される一本鎖ＤＮＡオーバーハングに戻って消化することによってＤＮＡおよび／またはベクターの末端を改変して、平滑末端を生成するか、あるいは適切なＤＮＡポリメラーゼで一本鎖末端を充填することによって同じ結果を得る必要があるかもしれない。あるいは、所望の部位は、例えば、ヌクレオチド配列（リンカー）を末端に連結することによって、生成されてもよい。このようなリンカーは、所望の制限部位を規定する特定のオリゴヌクレオチド配列を含んでもよい。制限部位はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を通じて生成され得る。例えば、Ｓａｉｋｉｅｔａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：４８７を参照のこと。切断されたベクターおよびＤＮＡフラグメントはまた、必要に応じて、ホモポリマーのテーリングによって改変され得る。

本発明において用いられる組み換え発現ベクターは代表的には、適合する宿主細胞中で核酸の発現を調節し得る適切な遺伝子制御エレメントに通常作動可能に連結された、本発明のＧＤＦペプチド（単数または複数）の１つをコードする核酸を含む自己複製するＤＮＡまたはＲＮＡ構築物である。遺伝子制御エレメントとしては、原核生物プロモーター系または真核生物プロモーター発現制御系を含んでもよく、そして代表的には、転写プロモーター、転写の発現を制御する選択的プロモーター、ｍＲＮＡ発現のレベルを上昇させる転写エンハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳を終結させる配列が挙げられる。発現ベクターはまた、ベクターが宿主細胞と独立して複製することを可能にする複製起点を含んでもよい。

本発明のＧＤＦ８ペプチド（単数または複数）をコードする核酸の発現は、原核生物細胞または真核生物細胞のいずれかにおいて従来の方法によって行われ得る。

核酸「コード配列（ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または特定のタンパク質もしくはペプチドを「コードする配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅｅｎｃｏｄｉｎｇ）」とは、適切な調節性エレメントの制御下においた場合、インビトロまたはインビボでポリペプチドに転写および／または翻訳される核酸配列（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。コード配列の境界は、５’末端の開始コドンおよび３’末端の終止コドンによって決定される。コード配列としては、限定はしないが、ＲＮＡウイルス配列、原核生物配列、原核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、およびさらに合成のＤＮＡ配列さえ挙げることができる。転写終止配列は通常、コード配列に対して３’に位置する。

本明細書において用いる場合、「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ）」および「融合ペプチド（ｆｕｓｉｏｎｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、交換可能に用いられて、「キメラタンパク質および／またはキメラペプチド（ｃｈｉｍｅｒｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄ／ｏｒｃｈｉｍｅｒｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓ）」および融合「タンパク質／ペプチド（ｉｎｔｅｉｎｐｒｏｔｅｉｎｓ／ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」を包含する。融合タンパク質は、別のタンパク質の少なくとも一部に結合されたペプチドを介して連結された本発明のＧＤＦ８ペプチドの少なくとも一部を含む。例えば、融合タンパク質は、マーカータンパク質もしくはペプチド、あるいは本発明のＧＤＦ８ペプチドの単離および／または精製および／または抗原性を補助するタンパク質もしくはペプチドを含んでもよい。ＧＤＦ８融合タンパク質は、ＧＤＦ８ポリペプチドの少なくとも一部に結合されたペプチドを介して結合された非ＧＤＦ８タンパク質の少なくとも一部を含み得る。好ましい実施形態では、ＧＤＦ８の一部は機能的であって、すなわち、その抗原性を保持する。非ＧＤＦ８配列は、ＧＤＦ８配列に対してアミノ末端であっても、および／またはカルボキシ末端であってもよい。これはまた、ＤＪ５ペプチドドメインがキャリアポリペプチド内に挿入される、ループ融合物を必要に応じて含むと考えられる。

このような融合タンパク質をコードする組み換え核酸分子は、ＧＤＦ８コード配列に対してインフレームで結合された非ＧＤＦ８タンパク質の少なくとも一部をコードする配列を含み、そして特定のプロテアーゼ、例えば、トロンビンまたは第Ｘａ因子の切断部位を、好ましくは、ＧＤＦ８配列と非ＧＤＦ８配列との間の接合部でまたはその近辺でコードし得る、１つの特定の実施形態では、この融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞中で発現される。このような融合タンパク質は、ＧＤＦ８ペプチドに融合されたタンパク質および／またはタグに特異的であるアフィニティーカラムの使用を通じて、本発明のＧＤＦ８ペプチドを単離するために用いられ得る。例えば、精製されたＧＤＦ８ペプチドは、次に、上記されているような、タンパク質分解性酵素および切断部位の使用を通じて融合タンパク質から遊離され得る。

別の実施形態では、キメラＧＤＦ８ペプチド、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質、マルトース結合（ＭＢＰ）タンパク質融合タンパク質、またはポリ−ヒスチジン−タグ化融合タンパク質が、任意の細胞における、あるいは無細胞系における発現のために、調製され得る。例えば、ＧＳＴは、固体支持体マトリックスに結合体化されたグルタチオンを結合し、ＭＢＰは、マルトースマトリックスに結合し、そしてポリ−ヒスチジンは、Ｎｉ−キレート化支持マトリックスに対してキレートする。この融合タンパク質は、適切な緩衝液を用いて、またはＧＤＦペプチドと下に例示されるような融合パートナー（例えば、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＦＬＡＧ（登録商標））との間で通常操作された切断部位に特異的なプロテアーゼ、もしくは上記のようなポリ−Ｈｉｓを用いて処理することによって特定のマトリックスから溶出され得る。本発明の特定の融合タンパク質としては、下に例示されたＴＭＶコートタンパク質−ＧＤＦ８ペプチドを含む融合タンパク質が挙げられる。

本明細書において用いる場合、「異種ヌクレオチド配列（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、現実には通常には形成されない核酸を形成するように組み換え方法によって、本発明のヌクレオチド配列に付加されるヌクレオチド配列である。このような核酸は、融合（例えば、キメラ）タンパク質をコードし得る。したがって、この異種ヌクレオチド配列は、調節特性および／または構造特性を含むペプチドおよび／またはタンパク質をコードし得る。別のこのような実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、組み換え核酸が発現された後に、本発明のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質またはペプチドを検出する方法として機能するタンパク質またはペプチドをコードし得る。さらに別の実施形態では、この異種ヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列を検出する方法として機能し得る。異種ヌクレオチド配列は、制限部位、調節部位、プロモーターなどを含む非コード配列を含んでもよい。

「宿主細胞（ｈｏｓｔｃｅｌｌ）」とは、一過性にまたは永続的にいずれかで、外因性の核酸分子を含むか、または含んで、かつ発現し得る細胞である。外因性の核酸（ＤＮＡまたなＲＮＡ）は、細胞のゲノムを作製する染色体ＤＮＡに組み込まれ（共有結合され）てもよいし、または組み込まれなくてもよい。例えば、原核生物および酵母では、この外因性の核酸は、エピソームのエレメント、例えばプラスミド上で維持されてもよい。真核生物細胞に関しては、適切に形質転換された細胞は、１つであって、ここでは外因性の核酸は、染色体に組み込まれて、その結果、染色体複製を通じて娘細胞によって遺伝される。この安定性は、真核生物細胞が、外因性核酸を含む娘細胞の集団からなる細胞株またはクローンを樹立する能力によって実証される。本明細書において例示されるように、「宿主細胞（ｈｏｓｔｃｅｌｌ）」は、組み換えトバモウイルスで感染される真核生物植物細胞を包含する。例示的なトバモウイルスベクターは、ＴＭＶベクターであり、そして感染したＮｉｃｏｔｉａｎａ植物、例えば、タバコ植物の細胞質においてのみ複製することが公知である。このＴＭＶベクターは、核には入らず、感染した植物細胞を安定に形質転換することはない。

原核生物としては、グラム陰性およびグラム陽性の両方の生物体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。それより高度な真核生物としては、下に例示されるように、動物細胞、非哺乳動物由来、例えば昆虫細胞、および鳥類、ならびに哺乳動物由来、例えば、ヒト、霊長類、およびげっ歯類の両方の動物細胞、または植物に由来する、樹立された組織培養細胞株が挙げられる。

原核生物の宿主ベクター系としては、多くの異なる種についての広範な種々のベクターが挙げられる。本明細書において用いる場合、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ「Ｅ．ｃｏｌｉ」およびそのベクターとは、他の原核生物において用いられる等価なベクターを含むとして一般に用いられる。ＤＮＡを増幅するための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２またはその多くの誘導体である。ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ８ペプチドを発現するために用いられ得るベクターとしては、限定はしないが、ｌａｃプロモーター（ｐＵＣ−シリーズ）；ｔｒｐプロモーター（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；ｌｐｐプロモーター（ｐｌＮ−シリーズ）；λ−ｐＰまたはｐＲプロモーター（ｐＯＴＳ）；またはハイブリッドのプロモーター、例えば、ｐｔａｃ（ｐＤＲ５４０）が挙げられる。Ｂｒｏｓｉｕｓｅｔａｌ．，「ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓＥｍｐｌｏｙｉｎｇＬａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄｌｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄＰｒｏｍｏｔｅｒｓ」，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：ＡＳｕｒｖｅｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓａｎｄＴｈｅｉｒＵｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．２０５〜２３６を参照のこと。

酵母、およびより高度な真核生物組織培養細胞は、本発明のＧＤＦペプチドの、および／または抗ＧＤＦ８抗体の、および／またはそれらの抗体のフラグメントの組み換え産生のための宿主として用いられ得る。昆虫のバキュロウイルス発現系を含む、任意のより高度な真核生物組織培養細胞株が用いられ得るが、哺乳動物細胞が好ましい。このような細胞の形質転換またはトランスフェクションおよび増殖は、慣用的な手順になっている。有用な細胞株の例としてはＨｅＬａ細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ラット胎児腎（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、鳥類細胞株およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。

このような細胞株のための発現ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡが用いられる場合）、ポリアデニル化部位、および転写終止部位を含む。これらのベクターはまた通常、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、またはサイトメガロウイルスのような供給源から誘導されたプロモーターを担持するプラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスであってもよい。適切な発現ベクターの代表的な例としては、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ［Ｏｋａｙａｍａｅｔａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．５：１１３６］、ｐＭＣ１ｎｅｏＰｏＩｙ−Ａ［Ｔｈｏｍａｓｅｔａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ５７：５０３］、ｐＵＣ１９、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴおよびその誘導体、ならびにバキュロウイルスベクター、例えば、ｐＡＣ３７３またはｐＡＣ６１０が挙げられる。

代表的に用いられる原核生物発現制御配列としては、プロモーターが挙げられ、これには、βラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系由来のプロモーター［Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．，１９７７，Ｎａｔｕｒｅ，７９８：１０５６］、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌｅｔａｌ，１９８０，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．８：４０５７］、λＰＬプロモーター系［Ｓｈｉｍａｔａｋｅｅｔａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１２８］およびｔａｃプロモーター［ＤｅＢｏｅｒｅｔａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２９２：１２８］（全て、参照によって本明細書に援用される）が挙げられる。このような制御配列を含む多数の発現ベクターが、当該分野で公知であって、市販されている。

「作動可能に連結された（Ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）」とは、エレメントの配置であって、そのように記載された成分が、その有用な機能を行うように構成されている、エレメントの配置をいう。従って、コード配列に対して作動可能に連結された制御エレメントは、コード配列の発現を達成し得る。この制御エレメントは、それらがその発現を指向するように機能する限り、コード配列と連続する必要はない。従って、例えば、介在する非翻訳のまだ転写されていない配列が、プロモーターとコード配列との間に存在してもよく、そしてこのプロモーターはそれでも、コード配列に対して「作動可能に連結された」とみなすことができる。

一般的なＧＤＦ８ベクターの設計
コードする核酸配列は好ましくは、できるだけ哺乳動物の核酸配列から相違するように設計した。例えば、１実施形態では、前駆体ＧＤＦ８のアミノ酸配列は、酵母の好ましいコドンを用いて逆翻訳された。得られた配列は、コドンについて調査して、これはヒトＧＤＦ８核酸配列に対してその相同性を保持していた。可能性のあるこれらのコドンを、同じアミノ酸をコードする次に最も好ましい酵母コドンで置換した。

得られた最適化遺伝子（配列番号３）は、例えば、当該分野で公知の昆虫、哺乳動物、細菌、ウイルスおよび酵母発現系を含む、任意の適切な宿主系で発現され得る。例えば、昆虫細胞発現系、例えば、バキュロウイルス系は、当該分野で公知であって、例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，ＴｅｘａｓＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳｔａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔｉｎＮｏ．１５５５（１９８７）に記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、キットの形態で、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏＣａｌｉｆ．（「ＭａｘＢａｃ」キット）から市販されている。同様に、細菌および哺乳動物の細胞発現系は、当該分野で周知であって、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，ＶｏＩｓ．ＩａｎｄＩＩ；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）によって記載される。酵母発現系は当該分野で公知であって、例えば、ＹＥＡＳＴＧＥＮＥＴＩＣＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（Ｂａｒｒｅｔａｌ．，編、１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎによって記載される。多くの他のこのような発現系が、当該分野で公知であって、キットの形態で市販されている。

１つの好ましい実施形態では、改変された前駆体ＧＤＦ８遺伝子（配列番号３）は、下の実施例１にさらに詳細に記載されるように、Ｆｌｐ−ｌｎ（商標）ＣＨＯ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で発現された。

さらに好ましくは、ＧＤＦ８ペプチドは、適切な植物ウイルスにおいて融合タンパク質の一部として発現される。遺伝子的に変更された植物ウイルスは、ペプチド−キャリア融合タンパク質をコードする遺伝子で植物をトランスフェクトするという効率的な方法を提供する。例えば、ＴＭＶコートタンパク質融合物の考察は、Ｔｕｒｐｅｎｅｔａｌ．，１９９９、米国特許第５，９７７，４３８号に提供される。また以下も参照のこと：その全てが参照によって本明細書に援用される、ＹｕｓｉｂｏｖＶ．ｅｔａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：５７８４〜５７８８；Ｍｏｄｅｌｓｋａ，Ａｅｔａｌ．，１９９８Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：２４８１〜２４８５。

従って、本発明はまた、新規な組み換え植物ウイルスであって、上記で考察されるように、植物ウイルスコートタンパク質（「ＶＣＰ」）およびＧＤＦ８ペプチドをコードする、それらの遺伝物質のヌクレオチド配列を含む新規な組み換え植物ウイルスを提供する。このコードされた融合タンパク質は、本明細書においてＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質と記載される。組み換え植物ウイルスによって、感染された植物における融合タンパク質の全身的な発現が可能になる。これによって、これらの組み換え植物ウイルスを使用することによって、大量のＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を生成してもよい。必要に応じて、この融合タンパク質は、ＧＤＦ８ペプチドが融合タンパク質から容易に切断されて分離されるように操作される。

ＧＤＦ８ペプチドがＶＣＰに結合（融合）されるＶＣＰにおける位置（単数または複数）は、本明細書においては「融合ジョイント（ｆｕｓｉｏｎｊｏｉｎｔ）」と呼ばれる。所定の融合タンパク質は、１つまたは２つの融合ジョイントを有してもよい。この融合ジョイントは、ＶＣＰのＣ末端に位置してもよく、ここで目的のペプチドのＮ末端に融合される。この融合ジョイントは、ＶＣＰのＮ末端に位置してもよく、ここでＧＤＦ８ペプチドのＣ末端に融合される。本発明の他の実施形態では、ＧＤＦ８ペプチドは、ＶＣＰの内部に位置して；この場合、この融合タンパク質は２つの融合ジョイントを有する。これは、内部融合タンパク質と名付けられる。内部融合タンパク質は、ＧＤＦ８ペプチドによって「中断される（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ）」植物ＶＣＰ全体またはそのフラグメントを含んでもよい。

融合ジョイントは、コートタンパク質内の種々の部位に位置してもよい。そのペプチドの全体は、ＶＣＰのＮ末端部分またはＣ末端部部分に存在してもよい。融合ジョイントに適切な部位は、得られた内部融合タンパク質を所望の特性について試験する、慣用的な体系的バリエーションを通じて決定され得る。融合ジョイントの適切な部位はまた、融合タンパク質のＶＣＰ部分の構造的および生物学的機能を有意に妨害しないペプチドの「挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）」のための部位を決定するために、コートタンパク質の三次元構造の検討によって決定されてもよい。植物ＶＣＰの詳細な三次元構造およびウイルス中でのそれらの方向は、決定されており、そして当業者に公的に利用可能である。例えば、キュウリ緑斑モザイクウイルス（ＣｕｃｕｍｂｅｒＧｒｅｅｎＭｏｔｔｌｅＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓ）のコートタンパク質（他のトバモウイルスのコートタンパク質に対して強力な構造的類似性を保有するコートタンパク質）およびウイルスの解像モデルは、ＷａｎｇおよびＳｔｕｂｂｓ，１９９４，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２３９：３７１〜３８４に見出され得る。ＴＭＶの詳細な構造情報は、とりわけ、Ｎａｍｂａｅｔａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０８：３０７〜３２５ならびにＰａｔｔａｎａｙｏｋおよびＳｔｕｂｂｓ，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２８：５１６〜５２８に見出され得る。

植物ウイルス粒子の三次元構造およびウイルス粒子のアセンブリプロセスの知識によって、当業者は、挿入および部分的な置換を含んで、本発明の種々のＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を設計することが可能になる。例えば、ＧＤＦ８ペプチドが親水性である場合、表面ループ領域として配向されることが公知であるＴＭＶコートタンパク質（ＴＭＶＣＰ）領域に対してペプチドを融合することが適切であり得る。同様に、サブユニット接触を維持するらせん状セグメントは、ゲノムに向かって配向されたＴＭＶＣＰの領域中で発現されるＴＭＶＣＰらせんまたは核酸結合ドメインの適切な領域と置換され得る。

ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、融合ジョイントで「リーキー（ｌｅａｋｙ）」終止コドンを含んでもよい。この終止コドンは、融合ジョイントに直に隣接したコドンとして存在してもよいし、または融合ジョイントをコードするコドンの近位（例えば、９塩基内）に位置してもよい。このようなリーキー終止コドンの目的は、野性型コートタンパク質に対して融合タンパク質の所望の比を維持することである。「リーキー」終止コドンは、常に翻訳終止をもたらすわけではなく、周期的に翻訳される。所定の開始／終止コドンでの開始または終止の頻度は、状況次第である。リボソームは、最初のＡＴＧコドンのｍＲＮＡの５’−末端からスキャンする。最適でない配列状況である場合、リボソームは特定の頻度で、次の利用可能な開始コドンに通過して、翻訳を最初の下流で開始する。同様に、翻訳の間に遭遇される最初の終止コドンは、それが特定の配列状態にある場合、常には機能しない。

結果として、多くの天然に存在するタンパク質は、異種のＮ末端および／またはＣ末端伸長を有する集団として存在する。ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質をコードする組み換えウイルスベクター中に、融合ジョイントコード領域でリーキー終止コドンを含むことによって、このベクターを用いて、より長い融合タンパク質および第二のより短いタンパク質、例えば、ＶＣＰ自体の両方を生成することができる。リーキー終止コドンは、融合タンパク質の融合ジョイントで、またはその近位で用いられ得、ここで目的のペプチド部分は、コートタンパク質領域のＣ末端に接続されて、それによって単独の組み換えウイルスベクターでＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質およびＶＣＰの両方を生成し得る。さらに、リーキー終止コドンを融合ジョイントでまたはその付近で用いて、同様の結果を得てもよい。ＴＭＶＣＰの場合、Ｎ末端およびＣ末端の伸長は、ウイルス粒子の表面に位置して、らせん軸から離れて突出することが予想され得る。リーキー終止配列の例は、何年か前に記載されたようにＴＭＶの１２６／１８３ｋＤａのリーディングフレームの接合部に存在する［Ｐｅｌｈａｍ，Ｈ．Ｒ．Ｂ．，１９７８，Ｎａｔｕｒｅ２７２：４６９〜４７１．Ｓｋｕｚｅｓｋｉ，Ｊ．Ｍ．ｅｔａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：３６５〜３７３，ｄｅｆｉｎｅｄｎｅｃｅｓｓａｒｙ３’ ｃｏｎｔｅｘｔｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｉｓｒｅｇｉｏｎｔｏｃｏｎｆｅｒｌｅａｋｉｎｅｓｓｏｆｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｎａｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒｇｅｎｅ（ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）ａｓＣＡＲ−ＹＹＡ（Ｒ＝ｐｕｒｉｎｅ；Ｙ＝ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）］。

本発明の別の実施形態では、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質上の融合ジョイントは、プロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を有することによって切断可能であるように設計される。これによって、適切なタンパク質分解性酵素を用いてＧＤＦ８ペプチドの分離および単離が可能になる。このタンパク質分解性酵素は、インビトロまたはインビボのいずれで融合タンパク質と接触してもよい。

ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質の発現は、組み換え植物ウイルスベクターおよび宿主植物の状況で機能的な任意の種々のプロモーターによって駆動され得る。好ましい実施形態では、植物ウイルスのサブゲノムのプロモーターが用いられる（例えば、本明細書に参照によって援用される、米国特許第５，３１６，９３１号を参照のこと）。

組み換え技術によって、多数の植物ＲＮＡウイルスのライフサイクルが、ウイルスゲノムの操作を容易にするＤＮＡ段階を人工的に通じて伸長することが可能にされている。これらの技術は、本発明の組み換え植物ウイルスを作成および使用するために、当業者によって適応され得る。ＴＭＶゲノムのｃＤＮＡ全体を、クローニングして、Ｅ．ｃｏｌｉのプラスミドにおける細菌プロモーターに対して機能的に結合させた（Ｄａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．ｅｔａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：１８３２〜１８３６）。感染性の組み換え植物ウイルスＲＮＡ転写物はまた、他の周知の技術、例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６由来の市販のＲＮＡポリメラーゼを用いて生成されてもよい。ビリオンＲＮＡの正確なレプリカは、ＲＮＡポリメラーゼおよびジヌクレオチドｃａｐ，ｍ７ＧｐｐｐＧを用いてインビトロで生成され得る。これによって、逆遺伝学のウイルスゲノムの操作が可能になるだけでなく、外来遺伝子を発現するためのベクターへのウイルスの操作も可能になる。ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡフラグメントを操作することに基づいて植物ＲＮＡウイルスベクターを生成する方法が記載されている（Ｐｅｌｃｈｅｒ，Ｌ．Ｅ．ｅｔａｌ．，１９８２，欧州特許第６７５５３号Ａ２）。組み換えＲＮＡ植物ウイルスを作成および使用する方法に対する詳細な情報は、とりわけ、参照によって本明細書に援用される、米国特許第５，３１６，９３１号（Ｄｏｎｓｏｎら）において見出され得る。本発明は、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質の発現のための組み換えＲＮＡ植物ベクターを含む核酸を提供する。本発明はまた、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質をコードするベクターの一部（単数または複数）を含む核酸を提供する。本明細書において参照によって援用される、米国特許第５，３１６，９３１号に記載されるベクターは、本発明の融合タンパク質を発現するために特に好ましい。

植物ＶＣＰ部分は、この発現ベクターのゲノムが由来する同じウイルスに由来してもよい。すなわち、このコートタンパク質は必要に応じて、組み換えウイルスゲノムに対して天然である。あるいは、このコートタンパク質融合パートナーは、異種であってもよく、すなわち、組み換えウイルスゲノムに寄与するウイルスとは異なるウイルスに由来するという点で、天然ではない。好ましい実施形態では、ＴＭＶの１７．５ｋＤａのコートタンパク質を、ＴＭＶ由来ベクターと接続して用いる。

タンパク質における目的のペプチド／ポリペプチドは、本明細書に規定されるとおり任意のＧＤＦ８ペプチドから構成されてもよく、ただしこれは、ＧＤＦ８ペプチドドメインが、ただ２〜３例を挙げれば、意図される（ｉ）融合タンパク質が、抗体およびＴ細胞レセプターに対するものを含む、レセプター分子に対して結合する能力；（ｉｉ）免疫応答を誘導する能力；および／または（ｉｉｉ）ホルモン活性、免疫調節性活性、酵素の基質として，または金属キレート活性を含む、融合タンパク質に必要であり得る任意の生物学的活性、を有意に妨害しないという条件下である。

詳細には、ＴＭＶに基づく、ＬａｒｇｅＳｃａｌｅＢｉｏｌｏｇｙＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（「ＬＳＢＣ」）から入手可能なＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）系を使用した。例えば、本明細書によって参照によって援用される、Ｐｏｇｕｅ，ｅｔａｌ．２００２，ＡｎｎＲｅｖＰｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ４０：４５〜７４を参照のこと。ＴＭＶは、約６４００個のヌクレオチドのプラスのサンスの一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。ＲＮＡ複製に関与するウイルスタンパク質はゲノムのＲＮＡから直接転写されるが、内部遺伝子の発現は、サブゲノムＲＮＡの生成を通じている。サブゲノムのＲＮＡの生成は、サブゲノムのプロモーターとして機能する、ＴＭＶゲノムにおける配列によって制御される。ＶＣＰは、サブゲノムのＲＮＡから翻訳され、そして感染された細胞において生成される最も豊富なタンパク質およびＲＮＡである（概説は図３によって提供される）。ＴＭＶ感染植物では、感染された組織の１グラムあたり数ミリグラムのＶＣＰが生成される。ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）発現ベクターは、植物宿主細胞の翻訳優先度を再プログラムするこのプロモーターの活性の強度および期間の両方を利用して、この結果、ウイルスにコードされるタンパク質は、ＴＭＶＶＣＰと同様に高レベルで合成される。

Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下のＴＭＶＲＮＡゲノムの全長ｃＤＮＡコピーは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ適合性プラスミド中で構築された。ウイルスｃＤＮＡに対する操作は、標準的な組み換えＤＮＡ手順およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで転写された組み換えＤＮＡを用いて行われ、感染性ＲＮＡが生成された（図４に概説を示す）。感染性転写物を用いて、ｔａｂａｃｕｍ、ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、および研磨によって誘発される傷を介するＬＳＢＣ−作成Ｎｉｃｏｔｉａｎａｅｘｃｅｌｓｉａｎａ種（参照によって本明細書に援用される、Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅ，Ｗ．Ｐ．，２００２．米国特許第６，３４４，５９７号）を含む、種々のタバコ関連の種（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属）を感染させた。ＴＭＶは最初の細胞で複製して、隣接する細胞に移動して、円形の感染病巣を生成し、次いで気葉へ輸送するための植物維管束に入る。これは各々の感染した葉における細胞のほとんどに系統的に感染する。外来の遺伝子は、レプリカーゼ、移動タンパク質およびコートタンパク質を含む他のウイルスタンパク質生成物を発現する全ての細胞で発現される。外来タンパク質は、そのタンパク質配列によって決定される部位に沈着される。細胞質タンパク質は、植物細胞質に蓄積し（例えば、緑色蛍光タンパク質；ＧＦＰ）；分泌されたタンパク質は、外来タンパク質内に存在する特定のタンパク質標的配列に依存して、植物のＥＲ、維管束画分またはアポプラストに蓄積するか、または遺伝子操作を通じて付加される。この系によって、逆遺伝学のウイルスゲノムの操作だけでなく、標準的な組み換えＤＮＡ方法によるウイルスの操作も可能になる。

ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ベクターによって、２つの別個の方法によって外来のタンパク質またはペプチドの発現が可能になる：１）依存性遺伝子発現：ウイルスコートタンパク質の代わりに発現のための外来遺伝子を付加して、これによって内因性のウイルスコートタンパク質から発現されることによって。配列において転写の活性の程度が低くそして同一性がない第二のコートタンパク質プロモーターは、異種コード領域の下流に配置されて、次いで、ウイルスコートタンパク質遺伝子が付加される。これは、過剰発現について意図される異種遺伝子に加えて、ウイルスベクターがウイルス複製および浸透移行性の移動の全ての必須の遺伝子を発現することを可能にさせる第三のサブゲノムのＲＮＡをコードする。２）ウイルス粒子の表面上の免疫原性ペプチドの提示：ＴＭＶビリオンは、約１８ｎｍの直径でかつ３００ｎｍの長さの堅いロッドである。このビリオンおよびコートタンパク質の構造は、Ｘ線回折によって決定され、これによって、１ターンあたり１６．３のサブユニットを有する、ゲノムＲＮＡをカプシドで包んでいる右回りらせんに配置された約２，１３０のコートタンパク質サブユニットの構造が明らかになる。

本発明はまた、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を含むウイルス粒子またはビリオンを提供する。例えば、本発明のウイルス粒子のコートは全体として、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質から構成され得る。別の実施形態では、このウイルス粒子は、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質および融合されていないＶＣＰの混合物からなり、ここで２つのタンパク質の比は、変化し得る。トバモウイルスのコートタンパク質は、ウイルス粒子に自己アセンブリし得るので、本発明のウイルス粒子は、インビボでまたはインビトロでアセンブリされてもよい。このウイルス粒子はまた、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質またはその一部の精製を簡単にするために、周知の技術を用いて都合良く分解されてもよい。

本発明はまた、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を含む組み換え植物細胞、および／またはＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を含むウイルス粒子を提供する。これらの植物細胞は、本発明の感染性組み換えウイルス粒子で、または本発明の感染性ウイルス粒子のゲノムを含むポリヌクレオチドで、植物細胞（培養物において、または植物全体において）を感染させることによって生成され得る。本発明の組み換え植物細胞は、多くの用途を有し、とりわけ本発明の融合コートタンパク質の供給源として役立つ。

必要に応じて、本発明のベクターは、選択された宿主生物体、例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属の植物のコドン用途のためにコドン最適化される。

抗ＧＤＦ８および抗−ＶＣＰ−ＧＤＦ８抗体
本発明の方法は、ポリクローナル抗ＧＤＦ８抗血清に対してＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質および／またはＧＤＦ８ペプチドをスクリーニングするプロセスを包含した。このプロセスは、抗ＧＤＦ抗体が特異的に結合するＧＤＦ８のいくつかのエピトープを同定するために使用された。１実施形態では、抗ＧＤＦ８抗血清は、前駆体ＧＤＦ８を用いて動物を免疫することによって得た。前駆体ＧＤＦ８遺伝子は、発現および免疫原性について最適化された形態を提供するように改変された。例えば、ＧＤＦ８プロホルモン（配列番号２）の天然のＤＮＡ配列は、哺乳動物およびウイルスの発現系における発現のために最適化された。さらに、ウイルス宿主のシャットオフ（遮断）機構の負の効果を回避するために変化を作成した。代表的には、ウイルス宿主シャットオフ機構は、転写制御、ＲＮＡ安定性（スプライシング）などを含む。これらの変化は、核酸を宿主のようではなくさせ、よりウイルスのようにさせた。

本発明はまた、本発明のＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質に対して、ならびに／またはＧＤＦ８およびそのペプチドフラグメントに対して特異的に結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む。本明細書において用いる場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、免疫グロブリンおよび／またはそのフラグメントをいう。天然に存在する免疫グロブリンは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなる。この認識された免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。本発明による抗体（単数または複数）はまた、抗体フラグメント、すなわち、抗原結合フラグメント、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２、操作された単鎖結合タンパク質（例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される、Ｈｕｓｔｏｎｅｔａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，５８７９〜５８８３，およびＢｉｒｄｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２４２，４２３〜４２６）、ならびに二機能的なハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａｅｔａｌ．，１９８７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５）を包含する。［一般には、Ｈｏｏｄｅｔａｌ．，１９８４，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎ．Ｙ．，第２版，ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）ならびにＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒおよびＨｏｏｄ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２３，１５〜１６、前述の全ては、本明細書において参照によって援用される］。

例えば、標準的な方法を用いて、本発明のＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質および／またはＧＤＦ８ペプチドによって免疫された動物から生成された血清が、直接用いられてもよく、またはＩｇＧ画分が、血漿分離交換法または吸着クロマトグラフィーであって、ＩｇＧ特異的吸着剤、例えば、固定されたプロテインＡまたはプロテインＧを用いるような標準的な方法を用いて血清から分離されてもよい。あるいは、モノクローナル抗体が、そして必要に応じて、このようなｍＡｂに由来する抗原結合フラグメントまたは組み換え結合タンパク質が調製されてもよい。このようなｍＡｂまたはそのフラグメントは当該分野で公知の方法によって必要に応じてヒト化されてもよい。

本発明のＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質および／またはＧＤＦ８ペプチドに選択的に結合するｍＡｂを産生するハイブリドーマは、周知の技術によって生成される。通常は、このプロセスは、不死化細胞株と所望の抗体を生成するＢリンパ球との融合を包含する。あるいは、不死の抗体産生細胞株を生成するための非融合技術、例えば、ウイルス誘導性形質転換（ｖｉｒａｌｌｙ−ｉｎｄｕｃｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）［Ｃａｓａｌｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４：４７６（１９８６）］が用いられ得る。不死化細胞株は通常形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト由来の黒色腫細胞である。最も頻繁には、ラットまたはマウスの黒色腫細胞株が、簡便性および利用性の問題として使用される。

抗原を注射された哺乳動物から抗体産生リンパ球を得る技術は周知である。一般には、ヒト由来の細胞を使用する場合、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が用いられ、または非ヒト哺乳動物供給源由来の脾臓もしくはリンパ節細胞が用いられる。宿主動物は、精製された抗原の反復用量を注射されて（ヒト細胞はインビトロで感作される）、そして動物は、所望の抗体産生細胞を生成させられて、その後にそれらが不死化細胞株との融合のために回収される。融合のための技術はまた、当該分野で周知であって、一般に、ポリエチレングリコールのような融合因子と細胞とを混合する工程を包含する。

ハイブリドーマは、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択のような標準的な手順によって選択される。所望の抗体を分泌するハイブリドーマは、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）などのような標準的なイムノアッセイを用いて選択される。抗体は、標準的なタンパク質精製技術を用いて培地から回収される［Ｔｉｊｓｓｅｎ，ＰｒａｃｔｉｃｅａｎｄＴｈｅｏｒｙｏｆＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）］。

上記の技術を適用することに手引きを提供するために多くの引用文献が利用可能である［Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．，ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８０）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，ＰｒａｃｔｉｃｅａｎｄＴｈｅｏｒｙｏｆＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８４）；Ｈｕｒｒｅｌｌ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＨｙｂｒｉｄｏｍａＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ，１９８２）］．モノクローナル抗体はまた、周知のファージライブラリー系を用いて生成され得る。例えば、Ｈｕｓｅ，ｅｔａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５；Ｗａｒｄ，ｅｔａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４を参照のこと。

このように生成された抗体は、ポリクローナルであろうとまたはモノクローナルであろうと、例えば、イムノアフィニティークロマトグラフィーによりＧＤＦ８ペプチドを精製するために周知の方法によって固体支持体に結合された固定型で用いられ得る。

ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質および／またはＧＤＦ８ペプチドに結合する抗体も、ＧＤＦ８エピトープ、例えば、天然のＧＤＦ８タンパク質、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質および／またはＧＤＦ８ペプチドを含むタンパク質またはペプチドを検出または定量するためのイムノアッセイの基礎として、標準的な方法によって、用いられても、未標識であっても、標識されてもよい。用いられる特定の標識は、イムノアッセイのタイプに依存する。用いられ得る標識の例としては、限定はしないが、放射性標識、例えば、^３２Ｐ、^１２５Ｉ、^３Ｈおよび^１４Ｃ；蛍光標識、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシルおよびウンベリフェロン；化学発光因子（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒｓ）、例えば、ルシフェリアおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン；および酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチームおよびグルコース−６−リン酸脱水素酵素が挙げられる。

抗体は、公知の方法によってこのような標識でタグ化されてもよい。例えば、カップリング剤、例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミダート、スクシンイミド、ビスジアゾ化ベンザジンなどを用いて、蛍光標識、化学発光標識または酵素標識で抗体をタグ化してもよい。関与する一般的な方法は、当該分野で周知であって、例えば、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅ，１９８７，Ｃｈａｎ（編），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬに記載されている。このようなイムノアッセイは、例えば、レセプターの精製の間に得られた画分に対して行われてもよい。

本発明の抗体はまた、発現クローニング系においてＧＤＦ８関連ポリペプチドを発現する特定のｃＤＮＡクローンを同定するために用いられ得る。

レセプターのリガンド結合部位に特異的な中和抗体も、ＧＤＦ８機能をブロックするかまたは下方制御するアンタゴニスト（インヒビター）として用いられ得る。このような中和抗体は、下に提供される実施例によって例証されるように、慣用的な実験を通じて容易に同定され得る。

インビボまたはインビトロにおけるＧＤＦ８活性のアンタゴニズムは、完全な抗体分子、または周知の抗原結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）_２およびＦｖフラグメントを用いて達成され得る。このようなフラグメントの定義は、本明細書の上記に記載されるように、または例えば、Ｋｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２）；Ｐａｒｈａｍ，第１４章，Ｗｅｉｒ，編．Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版（ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８６）に見出され得る。抗体フラグメントの使用および生成も記載されている、例えば：Ｆａｂフラグメント［Ｔｉｊｓｓｅｎ，ＰｒａｃｔｉｃｅａｎｄＴｈｅｏｒｙｏｆＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）］、Ｆｖフラグメント［Ｈｏｃｈｍａｎｅｔａｌ．，１９７３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１２：１１３０；Ｓｈａｒｏｎｅｔａｌ．，１９７６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ７５：１５９１；Ｅｈｒｌｉｃｈｅｔａｌ．，米国特許第４，３５５，０２３号］および抗体の半分子（Ａｕｄｉｔｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，米国特許第４，４７０，９２５号）。公知の抗体重鎖および軽鎖の可変領域配列に基づいて組み換えＦｖフラグメントを作成するための方法は、例えば、Ｍｏｏｒｅら（米国特許第４，６４２，３３４号）およびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，１９９１，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：５４５にさらに記載されている。あるいは、それらは、標準的な方法によって化学的に合成されてもよい。

本発明はまた、抗原として上記の抗体を用いて生成される、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の、抗イディオタイプ抗体を包含する。これらの抗体はリガンドの構造を模倣し得るので有用である。

ワクチン組成物および投与
好ましい実施形態では、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質および／またはそれらに由来するＧＤＦ８ペプチドを発現するビリオンは、任意の適切なワクチン組成物に組み込まれる。このようなワクチン組成物は、当該分野で周知であって、そしてこれには例えば、生理学的に適合性の緩衝液および生理食塩水など、ならびに本明細書において下にさらに詳細に記載されるアジュバントが挙げられる。提供されたワクチン組成物は、例えば、抗ＧＤＦ８抗体の特異的な中和エピトープをスクリーニングおよび同定するための抗血清を惹起するために使用される。

本明細書において例示されるとおり、配列番号３を含むベクターによって発現される精製された前駆体ＧＤＦ８タンパク質を、ワクチン組成物中でヤギに注射し、この組成物は、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）に乳化された０．５ｍｇの前駆体ＧＤＦ８タンパク質を含んだ。このワクチン組成物は好ましくは、ヤギの皮膚の下に皮下（ＳＣ）注射された。その後のブースター（追加）免疫が好ましい。これらは、例えば、最初の注射後２〜５週の範囲におよぶ間隔で、同じ量または減少した用量のタンパク質とともに適切なさらなる間隔で投与され得る。

最初の注射の約２週後から開始し、ただし好ましくは、それより長期間、例えば、３〜１５週、またはそれ以上後に開始して、免疫した動物から、必要に応じて血清を収集する。次いで、この収集された血清を好ましくは、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、プロテインＧアガロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または適切なリガンドでのアフィニティークロマトグラフィーなどによって精製および／または分画する。本明細書において例示されるように、血清のＩｇＧ画分は、プロテインＧアガロースカラムでさらに分画した。

次いで、抗ＧＤＦ８抗血清ＩｇＧ画分は、本明細書において下記の実施例３にさらに詳細に記載されるように、成熟ＧＤＦ８のペプチドのある範囲のペプチドに対するスクリーニングについて利用可能である。

１つの好ましい実施形態では、このワクチンは、例えば、適切な生理学的な組成物に懸濁された、免疫原としてＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を発現するインタクトな植物ウイルスを含む。別の好ましい実施形態では、このワクチンは、このビリオンから実質的に単離されたＶＣＰタンパク質を含み、そして必要に応じて、１つ以上の当該分野で公知のアジュバントを含む。さらに好ましい実施形態では、このワクチン組成物は、適切なアジュバントとともに、１つ以上のＧＤＦ８ペプチドを含む。なおさらなる実施形態では、このワクチン組成物は、前述の組み合わせを含む。

このワクチン組成物は、免疫応答を惹起するために十分な量の所望の免疫原、例えば、ＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質を含む。１用量あたりに投与される量は、動物の量に対して、約１μｇ／ｋｇ〜約１．０ｇ／ｋｇの範囲にわたってもよい。

免疫がポリクローナル抗体または活性化されたリンパ球を（さらなるスクリーニングおよびハイブリダイゼーションのために）惹起することを意図する場合、任意の適切な脊椎動物が容易に使用される。好ましくは、動物とは哺乳動物であり、そしてこれには限定はしないが、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、例えば、ブタ（ｐｉｇおよびｈｏｇ）、ヒツジ、例えば、ヤギおよびヒツジ、霊長類、例えば、サル、大型の類人猿およびヒト、などが挙げられる。

「アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔｓ）」とは、特定の抗原に対する免疫応答を非特異的に増大し、これによって、任意の所定のワクチンに必要な抗原の量、および／または目的の抗原に対して適切な免疫応答を生じるのに必要な注射の頻度を減少させる、因子である。動物のワクチン接種に適切なアジュバントとしては、限定はしないが、Ａｄｊｕｖａｎｔ６５（ピーナツ油、マンニドモノオレエート（ｍａｎｎｉｄｅｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）およびモノステアリン酸アルミニウムを含む）；フロイントの完全または不完全アジュバント；鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびミョウバン；サーファクタント、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジメチルヂオクタデシル臭化アンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃｐｏｌｙｏｌｓ）；ポリアニオン、例えば、ピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアルコール酸およびカルボポール；ペプチド、例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシンおよびタフトシン；ならびに油状エマルジョンが挙げられる。このタンパク質またはペプチドはまた、リポソームまたは他のマイクロキャリアへの組み込み後に投与され得る。イムノアッセイのアジュバントおよび種々の局面に関与する情報は、例えば、本明細書において参照によって援用される、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎによるシリーズ，ＰｒａｃｔｉｃｅａｎｄＴｈｅｏｒｙｏｆＥｎｚｙｍｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，第３版，１９８７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋに開示される。

本発明のＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質、そのフラグメント、またはＧＤＦ８−ＶＣＰタンパク質もしくはフラグメントを発現するウイルス粒子がインビボで投与される場合、それらは代表的には、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む薬学的組成物として与えられる。このようなキャリアは、身体への所望の化合物の送達のために適切な任意の適合性の非毒性の物質であってもよい。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックスおよび不活性な固体が、キャリアに含まれてもよい。薬学的に受容可能な緩衝化剤、分散剤なども薬学的組成物中に組み込まれてもよい。さらに、融合タンパク質またはフラグメントが、免疫応答（防御的またはその他）を誘導するために用いられる場合、この処方物は、より強力な所望の免疫応答を刺激するために１つ以上の免疫学的アジュバントを含んでもよい。

ヒトを含む動物に対して組成物を与える場合、任意の多数の投与経路が用いられ得る。標準的な投与経路としては、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内および／または口腔が挙げられる。魚類の種のためには、ワクチン組成物または免疫原性組成物を投与する方法としては、前述に加えて、抗原性濃度のペプチドを含む水へこの魚を浸すこと、魚を水から短時間出している間に抗原性濃度のペプチドをこの魚に噴霧することなどが挙げられる。当業者は、このワクチン組成物が好ましくは各々のタイプのレシピエント動物および投与経路に適切に処方されることを理解する。非経口投与のための組成物は、受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリア、例えば、水、緩衝化水、０，４％生理食塩水、緩衝化生理食塩水、０．３％グリセリンなどに溶解された融合タンパク質（または誘導体）の溶液またはそのカクテルを含む。これらの溶液は、無菌であって、一般には粒子性の物質を含まない。これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得る。組成物は、適切な生理学的状態に必要な薬学的に受容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調節剤および緩衝化剤、毒性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含んでもよい。

これらの処方物におけるＧＤＦ８ペプチドおよび／またはＧＤＦ８−ＶＣＰ融合タンパク質（またはその一部）の濃度は、特定のアミノ酸配列および所望の生物学的活性に依存して広範に、例えば、約０．５％未満、通常は少なくとも約１％から１５または２０重量％程度の大きさまで変化し得、そして選択された特定の投与の様式およびレシピエントの条件に従って、主に液体の容積、粘度などに基づいて選択される。

非経口的に投与可能な組成物および被験体への投与に必要な調節物を調製するための正確な方法は、公知であるかまたは当業者に明白であって、例えば、本明細書において参照によって援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，現行版，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．にさらに詳細に記載される。

ＧＤＦ８結合エピトープの同定
適切な抗ＧＤＦ８モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を、ＧＤＦ８タンパク質に対して抗体が選択的に結合するのに十分な時間、このタンパク質と接触させた。その後に、ＧＤＦ８バイオアッセイによって、この抗体が、ＧＤＦ８タンパク質活性の実質的に全てを中和したことが確認された。任意のＧＤＦ８バイオアッセイが、この目的のために使用され得るが、実施例３によって本明細書の下に例示されるとおり、Ｔｈｉｅｓら，２００１，（ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ１８，２５１）によるインビトロの転写活性アッセイが好ましい。

一般には、本発明による抗原または結合エピトープとして有用なＧＤＦ８ペプチドは、ＧＤＦ８（配列番号１）のほぼ残基３１２〜ほぼ残基３６１を含む。詳細には、本発明によるペプチドとしては、ＧＤＦ８（配列番号１）の残基約３２０〜残基約３５０を含む。このペプチドは好ましくは、ＧＤＦ８（配列番号１）の約残基３２１〜約残基３４６を含む。

当業者は、本発明のＧＤＦ８ペプチドは、ポリペプチドが本明細書において下に例示されるようなラットモノクローナル抗体ＭＡＢ７８８に特異的に結合する条件下で、任意の位置で少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むように容易に改変され得ることを理解する。このような保存的置換としては、例えば、残基３２８、３２９および３３５ならびにその組み合わせでのバリエーションを挙げることが可能で、ここでアミノ酸残基３２８は、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、ＡｓｎまたはＶａｌであり；アミノ酸残基３２９は、ＬｙｓまたはＬｅｕであり；そしてアミノ酸残基３３５は、ＳｅｒまたはＰｒｏまたはＴｈｒである。前駆体ＧＤＦ８残基３２８、３２９および３３５は、図２に図示されるように、種にまたがってＧＤＦ８タンパク質配列内で変化するが、それにもかかわらず、成熟ＧＤＦ８は機能を保持する。

図１は、ＧＤＦ８活性領域（成熟タンパク質を形成する）のマップを、その前駆体タンパク質の状況において図示する。ＧＤＦ８活性領域のマップ上に重ね合わせたのは、７つの重複するペプチドの位置である。これらの重複するペプチドは、ＧＤＦ８の抗体結合エピトープ（単数または複数）を同定するための標的を提供するように設計された。ＤＪ５と表示されたペプチドは、例示されたヤギ抗ＧＤＦ８抗血清のＩｇＧ画分内でスクリーニングすることによって、例示された抗血清についてのＧＤＦ８の唯一の有意な結合エピトープとして同定された。このペプチドは、前駆体ＧＤＦ８（配列番号１）の残基３２１〜残基３４６に相当する配列（配列番号８）を有する。

処置されるか、および／または免疫されるべき動物
ＧＤＦ８中和抗体を惹起する首尾よい免疫の結果は、免疫された動物におけるＧＤＦ８機能の下方制御である。１つの好ましい実施形態では、動物は、「食物生産（ｆｏｏｄ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）」動物であって、能動免疫または受動免疫の結果は、免疫されていない動物に対する、動物の体重、特に筋肉量の増加である。受動免疫は、中和抗ＧＤＦ８抗体および／またはその抗体フラグメントを用いて動物を処置することによって、例えば、行われ得る。

別の好ましい実施形態では、動物は、ヒトまたは他の動物、例えば、ペットまたはコンパニオン・アニマルであって、ＧＤＦ機能は、能動免疫または受動免疫によって下方制御される。この選択的な別の実施形態では、ＧＤＦ８下方制御の目的は、例えば、筋肉の消耗状態を相殺するために、食物目的のために飼育されているのではない動物において研究目的のために、および／または医学的または獣医学的処置を提供することである。選択的な別の好ましい実施形態では、獣医目的のために処置される動物としては、例えば、上で列挙されたような、ただし詳細にはヒトを除く、このような処置が有益である全ての動物が挙げられる。

動物は好ましくは脊椎動物であり、そしてより好ましくは、哺乳動物、トリまたは魚である。食用動物の定義は、異なる文化の人の間では変化することが理解されるべきである。さらに、ヒトの消費に通常使用されない食用動物は、例えば、米国では、他の動物、例えば、ペット、外来のペット、コンパニオン・アニマルおよび／または研究用動物に給餌するための食用動物として使用され得る。従って、以下のリストは、限定する意図ではなく、単なる例として提供される。

１つの特定の実施形態では、動物被験体は哺乳動物である。他の哺乳動物被験体としては非ヒト霊長類（例えば、サル）、ウシ（例えば、肉牛または乳牛）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）（例えば、雄豚（ｈｏｇ）または豚（ｐｉｇ））、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）（例えば、ヤギ（山羊）または羊（ｓｈｅｅｐ））、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）（例えば、馬（ｈｏｒｓｅ））、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）（例えば、犬）、ネコ（例えば、家ネコ）、ラクダ、シカ、アンテロープ、ウサギおよびげっ歯類（例えば、モルモット、リス、ラット、マウス、スナネズミおよびハムスター）が挙げられる。トリとしては、Ａｎａｔｉｄａｅ（ガンカモ科）（白鳥、カモおよびガチョウ）、Ｃｏｌｕｍｂｉｄａｅ（ハト科）（例えば、ハト（ｄｏｖｅ）およびハト（ｐｉｇｅｏｎ））、Ｐｈａｓｉａｎｉｄａｅ（キジ科）（例えば、ヤマウズラ、ライチョウおよびシチメンチョウ）、Ｔｈｅｓｉｅｎｉｄａｅ（例えば、家禽）、Ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅｓ（例えば、インコ、コンゴウインコおよびオウム）、狩猟鳥および、走鳥類（例えば、ダチョウ）が挙げられる。

鳥類は、商業的または非商業的いずれかの鳥類飼育に関連し得る。これらとしては、例えば、Ａｎａｔｉｄａｅ（ガンカモ科）、例えば、ガチョウおよびカモ、Ｃｏｌｕｍｂｉｄａｅ（ハト科）、例えば、ドバトを含む、ハト（ｄｏｖｅ）およびハト（ｐｉｇｅｏｎ）、Ｐｈａｓｉａｎｉｄａｅ（キジ科）、例えば、ヤマウズラ、ライチョウおよびシチメンチョウ、Ｔｈｅｓｉｅｎｉｄａｅ、例えば、家禽が挙げられる。

他の食用動物としては、例えば、有袋類（例えば、カンガルー）、爬虫類（例えば、養殖カメ）および他の経済的に重要な家畜が挙げられ、このために本発明の方法は、体重を増強すること、および／または筋肉増殖を促進することに安全かつ有効である。

本発明の目的のためには、「魚の（ｐｉｓｃｉｎｅ）」または「魚（ｆｉｓｈ）」という用語は、限定はしないが、Ｔｅｌｅｏｓｔｉ群の魚、すなわち、硬骨魚を包含することが理解される。Ｓａｌｍｏｎｉｆｏｒｍｅｓ（サケ目）（Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ（サケ科）を含む）およびＰｅｒｃｉｆｏｒｍｅｓ（スズキ目）（Ｃｅｎｔｒａｒｃｈｉｄａｅ（クロマス科）を含む）の両方とも、Ｔｅｌｅｏｓｔｉ分類内に含まれる。

可能性のある魚のレシピエントの例としては、サケ科（Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅｆａｍｉｌｙ）、ハタ科（Ｓｅｒｒａｎｉｄａｅｆａｍｉｌｙ）、タイ科（Ｓｐａｒｉｄａｅｆａｍｉｌｙ）、カワスズメ科（Ｃｉｃｈｌｉｄａｅｆａｍｉｌｙ）、クロマス科（Ｃｅｎｔｒａｒｃｈｉｄａｅｆａｍｉｌｙ）、三本線のイサキ（ｔｈｒｅｅ−ＬｉｎｅＧｒｕｎｔ）（Ｐａｒａｐｒｉｓｔｉｐｏｍａｔｒｉｌｉｎｅａｔｕｍ）、および青い眼のプレコストムス（Ｂｌｕｅ−ＥｙｅｄＰｌｅｃｏｓｔｏｍｕｓ）（Ｐｌｅｃｏｓｔｏｍｕｓｓｐｐ）が挙げられる。

さらなる実施形態では、この動物は、コンパニオン・アニマルまたはヒトであって、ワクチンは、このようなＧＤＦ８下方制御に応答する任意の獣医のまたは医学の目的のためのＧＤＦ８の長期の下方制御を提供するために投与される。本発明の目的のためには、この「コンパニオン（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ）」アニマルという用語は、馬（ウマ）、猫（ネコ）、犬（イヌ）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットを含む）ウサギ種、およびトリ、例えば、ハト、オウムなどを含むことが理解されるべきである。

このようなワクチン接種または抗体を投与される鳥類は、商業的または非商業的いずれかの鳥類飼育に関連し得る。これらとしては、例えば、Ａｎａｔｉｄａｅ（ガンカモ科）、例えば、ハクチョウ、ガチョウおよびカモ、Ｃｏｌｕｍｂｉｄａｅ（ハト科）、例えば、ハト（ｄｏｖｅ）およびハト（ｐｉｇｅｏｎ）、例えば、ドバト、Ｐｈａｓｉａｎｉｄａｅ（キジ科）、例えば、ヤマウズラ、ライチョウおよびシチメンチョウ、Ｔｈｅｓｉｅｎｉｄａｅ、例えば、家禽、オウム科（Ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅｓ）、例えば、インコ、コンゴウインコおよびオウム、例えば、ペットまたはコレクターの市場のために飼育されるものが挙げられる。

別の好ましい実施形態では、任意の上述の動物（好ましくは非ヒト）が、本発明のペプチドに特異的に結合する抗ＧＤＦ８抗体を得るために免疫され、そしてその惹起された抗体は、このようなＧＤＦ８下方制御に応答性の任意の獣医または医学の目的のためにＧＤＦ８の下方制御を、例えば、提供するために、アッセイにおいて、および／または獣医もしくはヒトの医薬における使用のために回収される。

本発明は、本発明の例示として提供される、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらによく理解され得る。以下の実施例は、本発明の実施形態をさらに詳細に例示するために提示されるものであって、本発明の広範な範囲を限定するとは決して解釈されるべきではない。

実施例１
材料および方法
Ａ．前駆体ＧＤＦ８（ＧＤＦ８プロホルモン）の発現および精製
前駆体ＧＤＦ８またはプロホルモンの天然のＤＮＡ配列（配列番号２）は、哺乳動物およびウイルス発現系における発現のために最適化された。ウイルス宿主のシャットオフ（遮断）機構の負の影響を回避するために、ＤＮＡ配列は、できるだけ哺乳動物の核酸配列から相違するように設計した。これを達成するために、ＧＤＦ８プロホルモンのアミノ酸配列は、酵母の好ましいコドンを用いて逆翻訳させた。得られた配列をコドンについて調査して、これはヒトＧＤＦ８核酸配列に対してその相同性を保持していた。可能性のあるこれらのコドンを、同じアミノ酸をコードする次に最も好ましい酵母コドンで置換した。得られた核酸分子（配列番号３）は、適切な発現ベクターへの組み込みのために商業的に合成した。

Ｆｌｐ−ｌｎ（商標）ＣＨＯ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、最適化されたＧＤＦ８プロホルモンを発現した。要するに、Ｃ末端ＦＬＡＧ（登録商標）−（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）エピトープ融合物を含むＧＤＦ８プロホルモン構築物は、プラスミドｐＣＭＶｔａｇ４Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ．）へ、改変ＧＤＦ８プロホルモンをコードする遺伝子を挿入することによって構築した。ＦＬＡＧ（登録商標）融合タグによって、抗−ＦＬＡＧ（Ｒ）ゲルカラム上のＦＬＡＧ（登録商標）融合タンパク質の分離を容易になる。次いで、改変ＧＤＦ８プロホルモン−ＦＬＡＧ（登録商標）遺伝子を含むＰＣＲＤＮＡフラグメントをプラスミド発現ベクターｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中にクローニングした。ＧＤＦ８プロホルモン−ＦＬＡＧ（登録商標）融合タンパク質を発現するＦｌｐ−ｌｎ（商標）ＣＨＯ細胞株の生成は、ＧＤＦ８−ＦＬＡＧ（登録商標）遺伝子およびＦｌｐリコンビナーゼ発現プラスミドＰＯＧ４４を含むＦｌｐ−ｌｎ（商標）発現ベクターを用いるＦｌｐ−ｌｎ（商標）ＣＨＯ細胞株の同時トランスフェクションによって達成された。Ｆｌｐリコンビナーゼは、部位特異的なＤＮＡリコンビナーゼによる、組み込まれたＦＲＴ部位でのゲノムへのＦｌｐ−ｌｎ発現カセットの挿入を媒介する。ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープを含むＧＤＦプロホルモンを発現しかつ分泌する安定な細胞株を、ハイグロマイシンＢ選択を用いて得た。

ＦＬＡＧ（登録商標）タグを含むＧＤＦ８プロホルモンを発現する安定なＣＨＯ細胞株を、標準的な技術を用いて無血清培地中の懸濁培地に適合させた。分泌されたＧＤＦ８プロホルモンを含む順化培地は、ＷＡＶＥバイオリアクターシステム（ＷＡＶＥＢｉｏｔｅｃｈＬＬＣ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）を用いて生成した。ＦＬＡＧ（登録商標）タグ化ＧＤＦ８プロホルモンの精製は、抗−ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって達成した。

Ｂ．ＤＪ５特異的な抗体精製
ＤＪ５（配列番号８；下の表２を参照のこと）特異的な抗体画分は、アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって精製された。アフィニティーカラムは、０．８ｇの臭化シアン−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（ＳｉｇｍａＧｅｎｏｓｙｓ，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）に対して１０ｍｇのＤＪ５合成ペプチドをカップリングすることによって調製された。このカラムは、ＰＢＳを用いて洗浄して平衡化した。約１１ｍｌのヤギＩｇＧ画分（１０ｍｇ／ｍｌ）を、アフィニティーカラムに加えて、２５ｍｌのＰＢＳで洗浄した。１．０ｍｌの画分を収集して、２８０ｎｍでの吸光度をモニターした。結合した物質を約１０ｍｌの０．２Ｍグリシン（ｐＨ１．８５）で溶出した。１．０ｍｌの画分を収集して、０．２５ｍｌの０．５Ｍのリン酸ナトリウム、０．７５ＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．４で中和した。未結合の画分１〜１０および結合した画分２５〜３５の約２５μｌのアリコートを、ＤＪ５ペプチドに対するＥＬＩＳＡ反応性についてアッセイした。未結合の画分は、ＤＪ５反応性について陰性であることが見出された。結合された画分は、ＤＪ５ペプチドに対する反応性の強力なピークを示した。未結合の画分１〜１１および結合した画分２６〜３４をプールした。プールしたサンプルを濃縮して、それらの緩衝液を、下に示されるようにリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で交換した。サンプルの濃度は、ＯＤ２８０法（ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，２．７．３，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）によって確認した。未結合のサンプルを、１０ｍｇ／ｍｌに調節して、結合したサンプルを、引き続く使用のために１ｍｇ／ｍｌに調節した。

実施例２
ヤギ抗ＧＤＦ８ポリクローナルＩｇＧ血清
ヤギ抗前駆体ＧＤＦ８のＩｇＧは、以下の方法によって、免疫されたヤギから得た：
Ａ．ヤギの免疫
ザーネン（Ｓａａｎｅｎ）（乳用）ヤギ（約２歳齢の雄）を、以下のように、精製された組み換えＧＤＦ８プロホルモン（上の実施例１によって記載されるように得られた）を用いて免疫した。０．５ｍｇのタンパク質を、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）に乳化して、ヤギの皮膚下に皮下（ＳＣ）注射した。３週、６週および１０週でＳＣ投与した、その後の追加免疫は、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）中に乳化された０．３ｍｇのタンパク質を含んだ。注射器と針を用いて頸静脈から血液を、収集して、真空のボトルおよび配管で採取した。血液を抗凝血剤を含むボトル中に収集して、２０分間２５００ＲＰＭで遠心分離して赤血球を除去した。血漿を再硬化して、血清を生成した。初回免疫の１５週後に収集した血清サンプルを、さらなる分析に用いた。

Ｂ．ヤギポリクローナルＩｇＧの収集および精製
血清を、１５週後にヤギから収集して、ＩｇＧ画分を以下のようにこの血清から精製した。ヤギ血清のＩｇＧ画分は、製造業者のプロトコールに従って、プロテインＧアガロースカラム（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で精製した。溶出された画分をプールして、濃縮し、そして緩衝液を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ遠心分離Ｆｉｌｔｅｒｓ（ＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐＹＭ− １０，ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を利用してリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて交換した。サンプル濃度は、ＯＤ２８０方法によって確認した。

実施例３
ヤギ抗血清の特徴付け
上記の実施例２によって提供されるヤギ抗血清は、ＰＧＡと命名される。ＰＧＡＩｇＧ画分は、ＧＤＦ８プロホルモン分子上の種々のエピトープに対する抗体を含むと予想される。ＰＧＡ抗血清は、以下のように、インビトロの活性化アッセイによって特徴付けた。ＧＤＦ８の生体中和を定量的に測定するために用いたインビトロの転写活性アッセイは、本質的に、Ｔｈｉｅｓら（ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ１８，２５１（２００１））のアッセイである。９６ウェルの組織培養処理照度計ＶｉｅｗＰｌａｔｅ（商標）アッセイプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬｉｆｅａｎｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に、１．０×１０^５細胞／ウェルのＡ２０４Ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ−８２）を播種して、３７℃，５％ＣＯ^２、加湿チャンバ中でインキュベートした。完全Ａ２０４培養培地は、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地、１０％ウシ胎仔血清、２％Ｌ−グルタミンおよび１％Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐからなる。８０％コンフルエンシーより大きく達する際に、細胞を、ＦＵＧＥＮＥトランスフェクション試薬（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の製造業者によって推奨されるプロトコールを用いてプラスミドｐＤＰＣ４−ルシフェラーゼおよびＨＣＭＶＩＥ−ｌａｃＺの混合物で一過性にトランスフェクトして、３７℃，５％ＣＯ_２、加湿チャンバ中で１６時間インキュベートした。プラスミドｐＤＰＣ４−ルシフェラーゼは、ヒトプラスミノーゲンアクチベータインヒビター（ＰＡＩ−１）由来のＣＡＧＡボックスの４つのコピーを含み、これによって、異種プロモーターレポーター構築物にＧＤＦ８反応性が付与される。

プラスミドＨＣＭＶＩＥ−ｌａｃＺは、構成的ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターの制御下にβガラクトシダーゼ遺伝子を含む。この遺伝子は、トランスフェクション効率を中和するためにコントロールとして添加される。次いで、細胞を１ウェルあたり１００ｎｇのＧＤＦ８タンパク質（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で処理して、さらに１６時間、３７℃、５％ＣＯ_２、加湿チャンバ中でインキュベートした。Ｄｕａｌ−ＬｉｇｈｔＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙ（Ｔｒｏｐｉｘ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、この処理した細胞中でルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼを定量した。

各々のサンプルは、二連（２ウェル）で行った。各々のウェルについてのシグナルは、ルシフェラーゼシグナルをβガラクトシダーゼシグナルで割って１００倍したものとして算出した。サンプルのシグナルは、２つのウェルの平均として算出した。

抗体サンプルの生体中和活性を試験するために、種々の濃度の精製されたＩｇＧ画分を、細胞の処理前にＧＤＦ８タンパク質と（４℃で約１６時間）インキュベートした。阻害パーセントは、１００−（１００×サンプルシグナル）／（ＧＤＦ８単独でのシグナル−ＧＤＦ添加なしのシグナル）として算出した。インビトロの転写活性化アッセイの結果は、下の表１にまとめる。

この中和アッセイによって、回収されたヤギ血清のＩｇＧ画分は、この活性アッセイにおいて用いられるＧＤＦ８の少なくとも９５％を中和し得る抗体を含むことが確認された。

実施例４
ヤギポリクローナル抗体は、ＧＤＦ８タンパク質の特異的な中和エピトープを規定する
免疫応答を中和する特異性を決定するために、ＰＧＡＩｇＧ画分を、活性なＧＤＦ８タンパク質のコード領域全体にまたがる１セットの７つの重複するペプチド（ＤＪ１〜７、表２および図１を参照のこと）とのその反応性についてアッセイした。各々の個々のペプチドに対するヤギＰＧＡＩｇＧの反応性は、酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。ＧＤＦ８ペプチドのＥＬＩＳＡは本質的に、ＰｒｏｔｅｉｎＤｅｔｅｃｔｏｒ（商標）ＥＬＩＳＡＫｉｔＨＲＰ，ＡＢＴＳＳｙｓｔｅｍ（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に記載のように行った。以下の改変をこのアッセイで用いた。合成ペプチドＤＪ１〜７（下の表２を参照のこと）は、ＰｒｏＳｃｉ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｗａｙ，ＣＡ）により本発明者らの指示のもとでカスタム合成した。プレートは、合成ペプチドを１ウェルあたり５００ｎｇで用いてコーティングして、１ウェルあたり２５０ｎｇでＧＤＦ８プロホルモンを精製した。一次抗体は、種々のサンプル由来のＩｇＧ画分であった。二次抗体は、１：２０００の希釈で用いた。ヤギ一次抗体サンプルについて、二次抗体は、ヤギＩｇＧに対するウサギペルオキシダーゼ標識抗体であった。ラット一次抗体サンプルについては、二次抗体は、ラットＩｇＧに対するヤギペルオキシダーゼ標識抗体であった。ＯＤ４５０ｎｍは、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて１５分間読み取った。ＥＬＩＳＡ反応性は、１分あたりのＯＤ４０５の１０００倍として算出した。

ＥＬＩＳＡの結果は下の表３にまとめる。

ＰＧＡＩｇＧ画分は、精製されたＧＤＦ８プロホルモン、およびＤＪ５ペプチドの両方と特異的に反応した。ＧＤＦ８活性領域ペプチドのなかで、ＩｇＧ画分は、特異的にかつ排他的にＤＪ５ペプチドと反応する。このことは、この血清の中和能力が、ＤＪ５ペプチドによって規定されるエピトープに対するものであるということを強力に示す。この仮説を確認するために、ＰＧＡＩｇＧのＤＪ５特異的画分を精製した。これは、前出の実施例１によって記載されるとおりアフィニティークロマトグラフィーによって達成された。ＰＧＡ抗体は、ＤＪ５ペプチドの結合および未結合の画分に分けられた。両方の画分を、ＧＤＦ８タンパク質に対する中和活性についてアッセイした。

下の表４の結果によって、ＧＤＦ８中和能力のほとんどがＤＪ５ペプチドに対して特異的に結合する抗体とともに存在するということが示される。これによって、ＤＪ５ペプチドがＧＤＦ８タンパク質の中和能力を規定するということが明らかに実証される。

不思議なことに、予備的な実験では、中和ＧＤＦ８抗体は、２匹のウサギに、キーホール・リンペット・ヘモシアニンに結合体化したヒトＤＪ５抗原を注射した場合には、得られなかった。図２に示され得るとおり、ウサギおよびヒトＧＤＦ８についてのＤＪ５に対応するアミノ酸配列は同一であるが、ヤギＤＪ５のアミノ酸配列は異なる。従って、ヤギについて上で与えられたデータを考慮して、予備的なウサギのデータによって、宿主動物ＧＤＦ８の領域／部分に相当するものとは異なるアミノ酸配列を含むＤＪ５抗原を用いることが有利であり得るということが示唆される。従って、この場合、組み換えヒトＧＤＦ８プロホルモンがヤギで生体中和抗体を誘導する能力は、用いられる抗原が、ＧＤＦ８のＤＪ５領域／部分において単独のアミノ酸置換で宿主配列のものとは異なるアミノ酸配列を含んだという事実に、少なくとも一部は起因し得る［図２におけるアミノ酸残基３３３を参照のこと］。さらに詳細には、図２が示すとおり、ヒト配列におけるＡｒｇ_３３３は、ヤギの配列においてＬｙｓ_３３３残基で置換される。この孤立した保存的アミノ酸置換は、ヤギ免疫監視機構に対してタンパク質を「外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）」にさせるのに有意に十分である変更を構成し得る。

実施例５
ラットｍＡＢ７８８を中和するＧＤＦ８は、ＧＤＦ８タンパク質の特異的な中和エピトープを規定する
ラットモノクローナル抗体ＭＡＢ７８８は、マウスＧＤＦ８の生物活性を中和することが報告されている（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，カタログ番号ＭＡＢ７８８，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。この結果を確認するために、本発明者らは、ＧＤＦ８タンパク質に対する中和活性についてモノクローナル抗体をアッセイした。この抗体は、上記の実施例３によって記載されるように特徴付けられた。このアッセイの結果は、下のとおり、表５にまとめられる。

表５によって、この抗体がＧＤＦ８タンパク質の活性を中和し得ることが確認される。この中和免疫応答の特異性を確認するために、ラットモノクローナル抗体を、活性なＧＤＦ８タンパク質のコード領域全体にまたがる１セットの７つの重複するペプチド（ＤＪ１〜７、表２および図１を参照のこと）との反応性についてアッセイした。各々の個々のペプチドに対するモノクローナル抗体の反応性は、ＥＬＩＳＡアッセイによって確認した（実施例４、前出を参照のこと）。

ラットモノクローナル抗体は、精製されたＧＤＦ８プロホルモンおよびＤＪ５ペプチドの両方と特異的に反応した。代表的にはモノクローナル抗体は、単一のエピトープに対して一特異性を有する。ＧＤＦ活性領域ペプチドの間でも、このモノクローナル抗体は、ＤＪ５ペプチドと特異的にかつ排他的に反応する。この結果によって、ＤＪ５ペプチドが、ＧＤＦ８タンパク質の中和エピトープを規定するというさらなる独立した証拠が得られる。

実施例６
オリゴヌクレオチドアニーリングを通じてコートタンパク質へのエピトープを挿入するためのベクターの構築
ＴＭＶコートタンパク質の種々の位置への種々のエピトープのクローニングは、５つの異なるアクセプターベクターを作製することによって簡易にされた（図５）。表７は、それらの特性とともにこれらのベクターを列挙する。これらのベクターは、ＴＭＶのＵ１またはＵ５株についてのコートタンパク質オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の適切な位置に位置されたＮｃｏＩ（５’）およびＮｇｏＭＩＶ（３’）制限部位を含む。ＴＭＶＵ１株については、制限部位の対は、Ｎ末端ループ、アミノ酸１５５と１５６の間（ＧＰＡＴ）およびＣ末端に位置していたが、Ｕ５株については、これは、アミノ酸１５５と１５６との間にのみ位置した（ＴＰＡＴ）。それぞれ「ＣＡＴＧ」および「ＣＣＧＧ」という５’および３’のオーバーハングを有する、ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの任意の対は、これらのアクセプターベクターへ容易にクローニングされ得る。これらの３つのベクターの構築物ｐＬＳＢ２２６８、ｐＬＳＢ２２６９およびｐＬＳＢ２１０９は、Ｐａｌｍｅｒら（２００４年４月；国際特許公開番号ＷＯ２００４／０３２６２２Ａ２）によって記載される。残りの２つのベクターの構築物ｐＬＳＢ２１１０およびｐＬＳＢ１８０６は下に記載される。

＊このベクター上のさらに詳細な情報は、Ｐａｌｍｅｒら（本明細書において参照によって援用される、２００４年４月、ＷＯ２００４／０３２６２２Ａ２）で利用可能である。ｐＬＳＢ２１１０およびｐＬＳＢ１８０６の核酸配列は、コートタンパク質オープンリーディングフレームについてである。
「――――」この破線は、それぞれのアクセプターベクターに挿入される、目的のＧＤＦ８ペプチドドメイン、例えば、ＤＪ５を示す。さらなる天然でない配列は、挿入部位で生成されたアミノ酸に起因する。

ｐＬＳＢ２１１０を生成するために、ＤＮＡの０．８キロベース（ｋｂ）のフラグメントを、ｐＢＴＩ２１５０（Ｐｏｇｕｅら、２００４；米国特許番号ＵＳ６，７３０，３０６号Ｂ１）の誘導体であるプラスミドｐＬＳＢ２１０８から増幅したが、以下のプライマーを用いて、ＡｆｌＩＩＩ制限部位は除去した：

配列番号３７プライマー（ＡｆｌＩＩＩ５’コート）は、Ｕ１コートタンパク質の開始配列を含み、そしてＡｆｌＩＩＩ認識部位には下線を付している。配列番号３８プライマーの場合（ＮｃｏＩ／ＮｇｏＭＩＶ末端でループアウト）、ＮｃｏＩおよびＮｇｏＭＩＶ認識部位には下線を付している。配列番号３９のオリゴヌクレオチド（３０Ｂ７７９２Ｒ）は、ＰｓｔＩ部位のすぐ下流にアニーリングする。このポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）から得られた生成物は、２つのクローニング部位、ＮｃｏＩおよびＮｇｏＭＩＶ、ならびにウイルスの３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を提供するためにＣ末端で改変されたコートタンパク質を含んだ。この０．８ｋｂのＡｆｌＩＩＩ／ＰｓｔＩフラグメントを、ベクターｐＢＴＩ２１５０の８．４ｋｂのＮｃｏＩ／ＰｓｔＩフラグメントに挿入した。得られたプラスミドｐＬＳＢ２１１０によって、Ｕ１コートタンパク質のＣ末端で、ＮｃｏＩおよびＮｇｏＭＩＶオーバーハングの両方を保有する、任意のペプチド配列の挿入が可能になる。

ｐＬＳＢ１８０６を生成するためには、重複するＰＣＲを使用した。０．５ｋｂおよび０．３ｋｂのサイズの２つのＤＮＡフラグメントは、テンプレートとしてプラスミドＢＳＧ１０５７を用いて増幅した（Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅら、米国特許第号ＵＳ６，６５６，７２６Ｂ１）。この０．５ｋｂのフラグメントは、オリゴヌクレオチド

を用いて増幅した。この得られたフラグメントは、Ｕ５コートタンパク質のほとんど（アミノ酸番号１−１５５）を含んだが、２番目のアミノ酸残基（プロリン）は欠く。０．３ｋｂのフラグメントは、オリゴヌクレオチド

を用いて増幅した。このフラグメントは、Ｕ５コートタンパク質のＣ末端の４つのアミノ酸、および３’ＵＴＲを含む。さらに、これはまた、アミノ酸番号１５５と１５６との間に位置する、２つのクローニング部位ＮｃｏＩおよびＮｇｏＭＩＶも保有する。０．５ｋｂおよび０．３ｋｂの両方のフラグメントを精製して、全ての残りのオリゴヌクレオチドを除去した。これらの精製されたＤＮＡフラグメントを一緒に混合して、２つの最も外側のオリゴヌクレオチド、ＡｆｌＩＩＩおよびＪＡＬ３０２を用いてＰＣＲによって増幅した。得られた０．８ｋｂのＡｆｌＩＩＩ／ＰｓｔＩフラグメントは、プラスミドｐＢＴ２１５０由来の８．４ｋｂのＮｃｏＩ／ＰｓｔＩフラグメントに引き続きクローニングした。得られたプラスミドｐＬＳＢ１８０６によって、Ｕ５コートタンパク質の１５５位置（最後の４つのアミノ酸の前）での、ＮｃｏＩおよびＮｇｏＭＩＶオーバーハングの両方を保有する、任意のペプチド配列の挿入が可能になる。

実施例７
２０のアミノ酸ＤＪ５ペプチドを提示するコートタンパク質融合物の構築
最初の５つのＤＪ５タンパク質融合構築物は、表８にまとめる。これらの構築物のうち４つは、ＴＭＶのＵ１株を使用した。２０アミノ酸ＤＪ５ペプチド（ＶＨＱＡＮＰＲＧＳＡＧＰＣＣＴＰＴＫＭＳ；配列番号８）は、コートタンパク質の表面露出されたＮ末端およびＣ末端上に、そしてアミノ酸６５（Ａｓｐ）および６６（Ｓｅｒ）の付随する欠失を伴う、アミノ酸６４（Ｐｒｏ）と６７（Ａｓｐ）との間の表面露出された「６０ｓ」ループ内で融合された。最終のＵ１株融合物において、エピトープは、コートタンパク質のＣ末端の４アミノ酸に対して内部に位置した（ＧＰＡＴ位置）。１つのＵ５株コートタンパク質融合物について、エピトープがまた、Ｃ末端の４つのアミノ酸に対して内部に位置した（ＴＰＡＴ位置）。

これらの５つの位置に、すなわち、実施例６に記載される５つのプラスミドに２０アミノ酸のＤＪ５エピトープを導入するために、１セットのオリゴヌクレオチドを図６Ａに例示されるとおり設計した。プラスミドｐＬＳＢ−ＦＶ１、ｐＬＳＢ−ＦＶ２、ｐＬＳＢ−ＦＶ３、ｐＬＳＢ−ＦＶ４およびｐＬＳＢ−ＦＶ５を生成するために、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドコートタンパク質融合物のクローニングに使用したフォワードおよびリバースのオリゴヌクレオチドの配列を、関連の配列番号とともに、下の表９に示す。

Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍのコドン利用のデータベースが、例えば、本明細書において参照によって援用される、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎでインターネット上で見出されるように、そして図８Ａおよび図８Ｂに例示されるように、当該分野で周知であって、表９のオリゴヌクレオチド（配列番号４５および４６）を設計するために使用された。これによって、ＤＪ５（２０）ペプチドのコドン最適化オリゴヌクレオチドが得られた。これらのオリゴヌクレオチドがアニーリングされた場合、それらは、二本鎖ＤＮＡフラグメントを生成し、これはそれぞれ、適切な５および３の「ＣＡＴＧ」および「ＣＣＧＧ」というオーバーハングを伴った（実施例６で示されるとおり）。次いで、これらのフラグメントを、表７に概説されるアクセプターベクターにクローニングした。この二本鎖ＤＮＡフラグメントの挿入は、種々のコートタンパク質の状況でＤＪ５（２０）ペプチドの位置に生じた。

フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドをアニーリングするために、各々のオリゴヌクレオチドの１００ピコモルを１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で合わせて、水で最終容積２０μＬに調節した。このオリゴヌクレオチド混合物を、３分間９５℃まで加熱して、引き続き１秒あたり０．１℃の速度で徐々に３０℃まで冷却した。この反応物を３０℃で保持して、８０μＬの水を各々のチューブに添加した。各々のライゲーション反応のために、１μＬのアニーリングされたオリゴヌクレオチド混合物（各々のオリゴヌクレオチドの１ピコモルを含有）を使用して、目的の４０ｎｇのプラスミドまたはベクター（ＮｃｏＩおよびＮｇｏＭＩＶ制限酵素（両方ともＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で切断）と、５μＬの２×Ｑｕｉｃｋライゲーション緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄｂｉｏｌａｂｓ）および０．５μＬのＱｕｉｃｋＬｉｇａｓｅ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄｂｉｏｌａｂｓ）と一緒に合わせた。このライゲーション反応容積は、１０μＬに調節して、室温で５分のインキュベーションの後に、２μＬの反応物を１．５ｍＬの微量遠心管に移して、氷上で冷却した。この微量遠心管に、４０μＬのＤＨ５ａコンピテント・セル（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＭＡＸＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標））を添加して、細胞／ライゲーション反応混合物を氷上で３０分間インキュベートした。次いで、その細胞に３７℃で２分間熱ショックを与え、その微量遠心管を直ちに氷に戻した。９５０μＬのＳＯＣ培地（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．）をこの微量遠心管に加えて、これにキャップをして、２００ｒｐｍで水平に、そして３７℃で１時間振盪した。この細胞を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）アガープレート（１プレートあたり５０または１００μＬ）上にプレートし、そして３７℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーを選択して、２ｍＬの一晩培養物を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地中で増殖させた。プラスミドをＤＨ５ａ細胞から精製して、配列決定し、２０アミノ酸ＤＪ５エピトープの配列の存在を確認した。出発ベクターと種々の挿入部位に２０アミノ酸のＤＪ５エピトープを含む最終のベクターとの間の対応を表１０にまとめる。表１１は、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドを提示する翻訳されたコートタンパク質融合物の最終アミノ酸配列、およびそれらの関連する配列番号を示す。

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実施例８
ＤＪ５ペプチドの１２アミノ酸のＮ末端領域を提示するコートタンパク質融合物の構築
２つのさらなるＤＪ５由来コートタンパク質融合構築物を下の表１２にまとめているが、その両方ともＴＭＶのＵ１株を使用した。この融合物は、コートタンパク質の表面露出したＮ末端に融合されるか、またはコートタンパク質のＣ末端の４アミノ酸（ＧＰＡＴ位置）に対して内部に配置されたＤＪ５ペプチドの１２アミノ酸のＮ末端領域（ＶＨＱＡＮＰＲＧＳＡＧＰ；配列番号４４）を提示した。表１２は、植物中でＤＪ５ペプチドの１２アミノ酸のＮ末端領域を提示する組み換えビリオンを発現するために用いたコートタンパク質融合ベクターを示す。

これらの２つの位置に１２アミノ酸のエピトープ（１２マー）を導入するために、１セットの２つのオリゴヌクレオチドを設計して、その配列を下の表１３に、それに関する配列番号とともに示した。フォワードオリゴヌクレオチドおよびリバースオリゴヌクレオチドをアニーリングするためには、実施例７に概説される手順に従った。各々のライゲーション反応については、１ピコモルの各々のオリゴヌクレオチドを含有する１μＬのアニーリングされたオリゴヌクレオチド混合物を使用した。これを目的のプラスミド（ＮｃｏＩおよびＮｇｏｍＩＶ制限酵素で切断）と組み合わせて、そのライゲーション反応プロトコールは、化学的にコンピテントなＤＨ５ａ細胞へのその形質転換とともに、前出の実施例７に詳細であるとおりであった。下の表１３では、プラスミドｐＬＳＢ−ＦＶ６およびｐＬＳＢ−ＦＶ７を生成するための、ＤＪ５ペプチドの１２アミノ酸のＮ末端領域からなるコートタンパク質融合物のクローニングにおいて使用したフォワードおよびリバースプライマーを示す。

細胞を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬＢアガープレート（１プレートあたり５０または１００μＬ）上にプレートして、３７℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーを選択して、２ｍＬの一晩培養物を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地中で増殖させた。このプラスミドをＤＨ５ａ細胞から精製し、そして配列決定して、１２アミノ酸のＤＪ５由来エピトープ配列の存在を確認した。出発ベクターと、２つの選択挿入部位で１２アミノ酸のＤＪ５由来エピトープを含む最終のベクターとの間の対応を、下の表１４にまとめる。下の表１５は、ＤＪ５ペプチドの１２アミノ酸のＮ末端領域を提示する翻訳されたコートタンパク質融合物の最終アミノ酸配列、およびそれらの関連の配列番号を示す。

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実施例９
ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ３、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴＭＶ−ＦＶ５の生成
ウイルスＴＭＶ−ＦＶ１は、プラスミドｐＬＳＢ−ＦＶ１の転写によって生成した。感染性転写物は、製造業者の指示に従って、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）での転写反応から合成した。アガロースゲル電気泳動による転写完全性の確認後、ＲＮＡ転写物を、研磨溶液（ピロリン酸ナトリウムを含むグリシン／リン酸塩緩衝液中に懸濁したベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）／セルライト混合物）と合わせて、これを用いて、２３〜２８日齢の植物のＮｉｃｏｔｉａｎｓｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉に接種した。接種の約５〜１３日後、感染の重篤度に応じて、組み換えウイルスの浸透移行性の動きを、ウイルスを含む葉でのモザイク表現型によって、植物組織中で可視化した。浸透移行性感染した組織を、ウイルス抽出および精製のために回収した。Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ以外の別の宿主植物が、ＴＭＶ−ＦＶ１の生成で使用されてもよいということに注目すべきである。例えば、ＮｉｃｏｔｉａｎａｅｘｃｅｌｓｉａｎａまたはＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍは、２つの可能な別の植物宿主を示す。後の２つの宿主については、組織を、ウイルスの浸透移行伝播後に、接種後２．５〜５週で回収する。

ＴＭＶ−ＦＶ２ウイルスを生成するために、転写物をプラスミドｐＬＳＢ−ＦＶ２から生成して、植物に接種して、ウイルスＴＭＶ−ＦＶ１の生成のために記載されたのと同様の方式で回収した組織を浸透移行性に感染させた。

ＴＭＶ−ＦＶ３ウイルスを生成するために、転写物をプラスミドｐＬＳＢ−ＦＶ３から生成して、植物に接種して、ウイルスＴＭＶ−ＦＶ１の生成のために記載されたのと同様の方式で回収した組織を浸透移行性に感染させた。

ＴＭＶ−ＦＶ４ウイルスを生成するために、転写物をプラスミドｐＬＳＢ−ＦＶ４から生成して、植物に接種して、ウイルスＴＭＶ−ＦＶ１の生成のために記載されたのと同様の方式で回収した組織を浸透移行性に感染させた。

ＴＭＶ−ＦＶ５ウイルスを生成するために、転写物をプラスミドｐＬＳＢ−ＦＶ５から生成して、植物に接種して、ウイルスＴＭＶ−ＦＶ１の生成のために記載されたのと同様の方式で回収した組織を浸透移行性に感染させた。

実施例１０
ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ３、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴＭＶ−ＦＶ５の抽出および精製
組み換えウイルスＴＭＶは、回収直後に感染した植物組織から抽出され得る。あるいは、組織は、抽出を行う前に、４℃で２時間〜１４日間、または−２０℃〜−８０℃（数日〜数ヶ月間）保管されてもよい。組織はまた、組織分解を補助するために、抽出前に急速に凍結されてもよい。

感染した植物組織からの組み換えＴＭＶウイルスの精製のためにはいくつかの手順が証明されている。例えば、Ｇａｒｇｅｒら（米国特許第６，０３３，８９５号、同第６，０３７，４５６号および同第６，３０３，７７９号）およびＰｏｇｕｅら（参照によって本明細書に援用される、米国特許第６，７４０，７４０号および同第６，７３０，３０６号）は、感染した組織の抽出後に得られた均質な「グリーン・ジュース（ｇｒｅｅｎｊｕｉｃｅ）」のｐＨ調節および熱処理に基づく方法を開示している。Ｐｏｇｕｅらはまた、植物宿主タンパク質および組み換えＴＭＶの分離を補助するポリエチレンイミン（「ＰＥＩ」）の使用に基づく手順を開示している。抽出および処理の間のエピトープ安定性を改良する（すなわち、タンパク質分解による分解を最小限にする）、そして組み換えビリオンの溶解度を改良するように設計された、これらの手順およびそれらの改変が、ウイルスＴＭＶ−ＦＶ１の精製、ＴＭＶ−ＦＶ２の精製、ＴＭＶ−ＦＶ３の精製、ＴＭＶ−ＦＶ４の精製、およびＴＭＶ−ＦＶ５の精製において用いられた。

Ａ．植物組織からのＴＭＶ−ＦＶ１融合ＶＣＰの精製
ＴＭＶ−Ｆ１は、以下のように植物組織から精製した。浸透移行性に感染された植物組織（葉および柄）を回収して、冷却した抽出緩衝液ＥＢ（１００ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ８、０．８６Ｍの塩化ナトリウム、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）と合わせて、そこに０．０４％（ｗ／ｖ）のメタ重亜硫酸ナトリウムを、緩衝液の容積（ｍＬ）対組織量（ｇ）の比が２：１で添加した。植物組織および抽出緩衝液は、１ＬのＷａｒｉｎｇ（登録商標）ブレンダー中で１分間ホモジナイズして、エーレンマイヤーフラスコに移して、さらにＰｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）（ＢｒｉｎｋｍａｎｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて１分間ホモジナイズした。

このホモジネートを、４層のチーズクロスを通過させて線維を除き、植物抽出物を得て、これを本明細書において以降では「グリーン・ジュース」と呼ぶ。このグリーン・ジュースを遠心分離ボトルに移して、１０，０００Ｇで１０分間遠心分離して、その上清を破棄した。不溶性であったＴＭＶ−ＦＶ１融合ＶＣＰのほとんどは、ペレットとして存在した。そのペレットは、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）の補助（１分のホモジナイゼーション）で、抽出緩衝液ＥＢ中においてもとのグリーン・ジュースの容積に再懸濁した。Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）処置後、再懸濁したペレットを遠心分離ボトルに移して、１０，０００×Ｇで１０分間遠心分離して、その上清を廃棄した。この工程：抽出緩衝液ＥＢ中のペレット再懸濁、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ホモジナイゼーションおよび１０，０００×Ｇで１０分間の遠心分離は、さらに２回繰り返した。これらの反復工程の目的は、植物由来のタンパク質および不溶性のＴＭＶＤＪ５コートタンパク質融合物からの色素の分離をもたらすことであり、これは、比較的高い塩化ナトリウム濃度および緩衝液ＥＢ中の界面活性剤の存在によって容易になった。

白から淡褐色のペレット得るために、植物由来の全ての色素を除去するために必要な繰り返しの回数は、回収された組織の年齢および発現されているＴＭＶコートタンパク質融合物に依存し得る。

緑色の宿主由来色素が、ペレットに会合したままである場合、ＴＭＶコートタンパク質融合物含有ペレットに対するさらなる洗浄を、高いｐＨの緩衝液、例えば、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００および０．０４％（ｗ／ｖ）のメタ重亜硫酸ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリエチルアミン（緩衝液Ｂ１）を使用して行ってもよい。ＴＭＶ−ＦＶ１については、これらのさらなるペレット洗浄を行った。特に、３回の緩衝液ＥＢ洗浄後に得たペレットを、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）の補助（１分のホモジナイゼーション）の補助で緩衝液Ｂ１中でもとのグリーン・ジュース溶液に再懸濁し、次いで、遠心分離ボトルに移して、１０，０００×Ｇで１０分間遠心分離し、その上清を破棄した。このペレットをさらなる緩衝液Ｂ１洗浄に供して、次いで、その得られたペレットを再懸濁し、この時、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）の補助で、１×リン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」），ｐＨ７．４のほぼもとのグリーン・ジュース容積中に再懸濁して、１０，０００×Ｇで１０分間遠心分離して、その上清を破棄した。このペレットのＰＢＳ洗浄を繰り返して、その最終ペレットを１×ＰＢＳのもとのグリーン・ジュース容積のほぼ１０分の一に再懸濁した。２回のＰＢＳ洗浄の目的は、ＴＭＶＤＪ５コートタンパク質融合物含有ペレットから残りの界面活性剤を除去すること、そして最終のＴＭＶコートタンパク質融合調製物が天然のｐＨに近いことを確実にすることであった。

１×ＰＢＳに再懸濁した、グリーン・ジュースのアリコート、廃棄された上清および最終のペレット調製物を、ＰＡＧＥ分析に供した。ＰＡＧＥ分析によって、この上清が含むＴＭＶＤＪ５コートタンパク質融合物は最小量であったが、これは最終ペレット調製物に存在する主なタンパク質種であったことが示された。逆に、植物由来宿主タンパク質のほとんどが、廃棄された上清に存在し、最終のペレットで検出された宿主タンパク質は最小であった。ＴＭＶ−ＦＶ２の精製、ＴＭＶ−ＦＶ４の精製およびＴＭＶ−ＦＶ５の精製に同じ手順を使用して、同じ結果を得た。

Ｂ．植物組織からのＴＭＶ−ＦＶ３融合ＶＣＰの精製
ＴＭＶ−ＦＶ３は、以下のように植物組織から精製された。浸透移行性に感染された葉および柄の組織を、２：１という緩衝液（ｍＬ）対組織（ｇ）比で、冷却緩衝液ＥＢ１（０．０４％（ｗ／ｖ）のメタ重亜硫酸ナトリウム）を含有する０．８６Ｍ塩化ナトリウム）を用いて高い設定で１分間、Ｗａｒｉｎｇ（登録商標）ブレンダー中で浸軟させた。この浸軟させた物質を４層のチーズクロスを通過させて、繊維性物質を除去した。得られたグリーン・ジュースを、リン酸でｐＨ５．０に調節した。ｐＨ調節したグリーン・ジュースを４７℃に加熱して、この温度で５分間保持し、次いで１５℃に冷却した。熱処理したグリーン・ジュースを６，０００×Ｇで３分間遠心分離して、２つの画分、上清Ｓ１およびペレットＰ１を得た。ペレットＰ１画分を、最初のグリーン・ジュースの容積の１／２に等しい水の容積を用いて蒸留水に再懸濁した。再懸濁したペレットＰ１を、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．５に調節して、６，０００×Ｇで３分間遠心分離して、２つの画分、上清Ｓ２およびペレットＰ２を得た。ウイルスは、両方の上清画分Ｓ１およびＳ２から、４％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６，０００および４％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムの添加によって、沈殿させた。４℃でのインキュベーション（１時間）の後、沈殿したウイルスを１０，０００×Ｇで１０分間の遠心分離によって回収した。このウイルスペレットを１×ＰＢＳ，ｐＨ７．４に再懸濁して、１０，０００×Ｇで３分間の遠心分離によって清澄化して、最終の清澄化されたＴＭＶ−ＦＶ３調製物を得た。

このグリーン・ジュースのアリコート、上清Ｓ１およびＳ２ならびに清澄化遠心の前後の最終ウイルス調製物を、ＰＡＧＥ分析に供した。ＰＡＧＥ分析によって、主なコートタンパク質バンドのほとんどが、上清Ｓ１に分配されたグリーン・ジュースに存在し、上清Ｓ２には低レベルで存在したことが示された。上清Ｓ１および上清Ｓ２ならびに最終清澄化遠心のＰＥＧ沈殿によって、ウイルスを、植物宿主タンパク質からさらに精製して、２つの実質的に純粋なＴＭＶ−ＦＶ３ウイルス調製物を得た。回収されたＴＭＶ−ＦＶ３ウイルスのほとんどは、上清Ｓ１のＰＥＧ沈殿後に得られたペレットに存在した。ＴＭＶ−ＦＶ３ウイルスのわずかな部分が、最終清澄化遠心によって、残りの植物宿主タンパク質とともに除去された。

Ｃ．植物組織からのＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴＭＶ−ＦＶ５融合ＶＣＰの精製
ＴＭＶ−ＦＶ３について概説した手順（前出）を、他のＤＪ５エピトープＴＭＶコートタンパク質融合物、すなわちＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴＭＶ−ＦＶ５にあてはめた。ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＢ−ＦＶ２およびＴＭＶ−ＦＶ４については、ＰＡＧＥ分析によって、コートタンパク質のバンドが最初のグリーン・ジュースには存在したが、このバンドが、上清Ｓ１および上清Ｓ２の両方に存在しないこと、そしてＴＭＶコートタンパク質融合物は、ＴＭＶ−ＦＶ３について概説された手順によって回収されなかったことが示された。さらなる分析によって、ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２およびＴＭＶ−ＦＶ４は、不溶性であって、植物の色素およびタンパク質と一緒に、ペレットＰ２に存在することが示された。

不溶性のＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２およびＴＭＶ−ＦＶ４の融合タンパク質を植物由来のタンパク質および色素から精製するために、ＴＭＶ−ＦＶ１について上で概説された手順を使用した。ＴＭＶ−ＦＶ５の場合は、ＴＭＶ−ＦＶ３について概説された手順は最初には成功しなかった。新鮮に回収された感染した組織の抽出を行う場合、ホモジナイゼーションのためにＷａｒｉｎｇ（登録商標）ブレンダーを使用することで、処理の間に生じる分解に起因して、回収された全長ＴＭＶ−ＦＶ５は最小であった。この手順を改変することならびに乳鉢および乳棒で処理した凍結組織で開始して、その後にＰｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ホモジナイゼーションを行うことによって、上清Ｓ１には約３０〜４０％の全長ＴＭＶ−ＦＶ５が存在した。これを、ＰＥＧ沈殿によってさらに濃縮し、そしてこのＴＭＶ−ＦＶ５のうち１５〜１７％は、最終の清澄化遠心後に可溶性のままであって、残りが清澄化ペレットに存在した。清澄化ペレットおよび清澄化されたウイルス調製物の両方が、有意な量の植物宿主タンパク質を含み、これによって、最終生成物は低純度で生じた。

これらの結果によって、出発組織状態（新鮮対凍結）および／または使用される組織分解工程（単数または複数）が、エピトープの安定性にある役割を果たすことが示唆された。

Ｄ．植物組織からのＴＭＶ−ＦＶ５融合ＶＣＰの最適化精製
ＴＭＶ−ＦＶ５は、前出のパートＣの精製方法で部分的な可溶性を示したので、さらなる最適化をＴＭＶ−ＦＶ３手順で行って、最終ＴＭＶ−ＦＶ５ウイルス調製物の回収および純度が改善され得るか否かを決定した。

凍結された、浸透移行性に感染された葉および柄の組織を、２容積の緩衝液ＥＢ１と合わせて、乳棒および乳鉢で浸軟し、その後にＰｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）を用いてさらにホモジナイゼーションを行った。この抽出物は、４層のチーズクロスを濾過させて、得られたグリーン・ジュースを、リン酸でｐＨ５．０に調節した。このｐＨ調節したグリーン・ジュースを、６，０００×Ｇで３分間遠心分離して、２つの画分上清Ｓ１およびペレットＰ１を得た、後者はさらに処理はしなかった。この上清Ｓ１を、水酸化ナトリウムの添加によってｐＨ６に調節して、５％（ｗ／ｖ）の活性炭粉末（例えば、ＮｕｃｈａｒグレードのＳＡ−２０またはＮｏｒｉｔグレードのＫＢ−ＦＦ）とともに４℃で１時間接触させた。次いで、上清Ｓ１を含む活性炭を、水酸化ナトリウムでｐＨ８に調節して、３０００×Ｇで１５分間遠心分離して、その活性炭を除いた。これに由来する上清を、進行させて、４％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６，０００および４％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウムの添加によってＴＭＶ−ＦＶ５を沈殿させた。４℃でのインキュベーション（１時間）後に、沈殿したウイルスを、１０，０００×Ｇで１０分間の遠心分離によって回収した。このウイルスペレットを、１×ＰＢＳ，ｐＨ７．４に再懸濁して、清澄化遠心は行わなかった。

グリーン・ジュースのアリコート、種々の処理段階の上清Ｓ１、再懸濁したペレットＰ１および最終ＴＭＶ−ＦＶ５調製物を、ＰＡＧＥ分析に供した。前に注記したとおり、グリーン・ジュースのコートタンパク質の約４０％が、植物の宿主タンパク質のかなりのレベルとともにこの上清Ｓ１に存在したが、実質的にほとんどの緑色色素がペレットＰ１中に分配していた。ｐＨ６での活性炭処理後、上清中の宿主タンパク質のレベルの実質的な減少があり、ＴＭＶ−ＦＶ５の７０〜８０％が回収された。ｐＨ８の調節および活性炭を除くための遠心分離でＴＭＶ−ＦＶ４の損失は最小限であった。上記のとおり、ｐＨ８の上清からのＰＥＧ沈殿を行って、ＴＭＶ−ＶＦ５をさらに濃縮して、活性炭もｐＨの工程も使用しない同じ手順から得たウイルスよりも満足な純度および顕著な改善を有する最終ウイルス調製物を得た。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析およびウエスタンブロット分析（表１６）を、精製された組み換えウイルスで行って、純度およびエピトープ免疫活性を評価した。ウエスタンブロット分析については、ＧＤＦ８のプロ型に対して惹起されたヤギ抗体を使用した。ヤギ＃６６１（Ｇｏａｔ＃６６１）と記されるこのポリクローナル抗体が、インビトロのＧＤＦ８中和アッセイで中和抗体であることを確認した。ウエスタンブロットはまた、ＰＶＡＳ１３５Ｄ（ＡＴＣＣコレクションから得た）と記された、野生型ＴＭＶに対して惹起されたウサギ抗体で行った。下の表１６は、ＧＤＦ８中和ヤギ＃６６１抗体、および抗ＴＮＶ抗体（ＰＶＡＳ−１３５Ｄ）を用いる、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチド・ヤギ・コートタンパク質融合物の、ウエスタンブロットによる、溶解度、純度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）プロフィールおよび反応性をまとめた。

表１６に列挙された全ての組み換えＴＭＶ融合物は、９０％を超える純度まで首尾よく精製された。ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２およびＴＭＶ−ＦＶ４の場合、精製されたＴＭＶは不溶性であった。ＰＡＧＥによって分析した場合、特徴的なラダーパターンが、３つのＵ１株融合物について観察された。１０〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンゲルでは、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドコートタンパク質融合物について期待されるとおり、最低（単量体）のバンドが約２２ｋＤａで泳動した。この単量体の上のタンパク質のバンドは、４５ｋＤａで泳動して、その上のタンパク質のバンドは６５〜７０ｋＤａで泳動した。ウエスタンブロットによって、これらのバンドのほとんどが、ヤギ＃６６１抗体および抗ＴＭＶＰＶＡＳ−１３５Ｄ抗体によって検出された（２００ｋＤａより大きい、極めて高分子量のバンドは、ゲルからメンブレンへの移動が劣るために常には検出されなかった）。観察された分子量をまとめると、これらの結果によって、さらなるバンドが、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドコートタンパク質融合物の二量体、三量体およびさらに上の多量体に相当することが示される。ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２およびＴＭＶ−ＦＶ４のＰＡＧＥ分析を還元剤の非存在下で行った場合、単量体の割合は減少しており、より高次のオリゴマーの割合が観察可能なほど増大していた。これによって、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドコートタンパク質融合物の間のジスルフィド架橋が存在したことが示唆される。２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドは、２つのシステイン残基を含み、これが、この観察されたさらに高次のオリゴマーの形成に関与しているようである。ＴＭＶ−ＦＶ５については、最終のウイルス調製物は、部分的に可溶であって、ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析の両方で、ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２およびＴＭＶ−ＦＶ４と同じ、還元剤依存性のオリゴマー結合パターンを示した。ＴＭＶＵ５のわずかに改善された溶解度は、Ｕ１株のコートタンパク質に代わるＵ５コートタンパク質の使用に起因し得る。表１５に列挙されるシリーズからの唯一の可溶性のＴＭＶ融合物はＴＭＶ−ＦＶ３であって、ここでは２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドが、Ｕ１株コートタンパク質に対するＮ末端融合物として提示された。ＴＭＶ−ＦＶ３については、このコートタンパク質は、野性型Ｕ１コートタンパク質と同様、ＰＡＧＥゲル上で約１８ｋＤａの質量で泳動した。これによって、エピトープの短縮が示唆された。オリゴマーのラダーは観察されず、そしてウエスタンブロットによって、ＴＭＶ融合物は、抗ＴＭＶＰＶＡＳ１３５Ｄ抗体によって検出されたが、ＧＤＦ８中和ヤギ＃６６１抗体によっては検出されなかった。ヤギ＃６６１抗体との反応性のこの欠失によって、ＴＭＶ−ＦＶ３の場合、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチド融合物のいくつかまたは全ての短縮が支持される。

実施例１１
ＭＡＬＤＩによるＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ３、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴＭＶ−ＦＶ５の特徴付け
ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析に加えて、ウイルス調製物を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭａｔｒｉｘＡｓｓｉｓｔｅｄＬａｓｅｒＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−飛行時間（ＴｉｍｅｏｆＦｌｉｇｈｔ）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて特徴付けた（表１７）。ＰＥＧ沈殿して、再懸濁したウイルス調製物を、シナピン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｌ）溶液に希釈して、この希釈は、ウイルス濃度に依存して１：１〜１：２０の範囲に希釈して、１〜１．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得た。シナピン酸を０．１％の水性トリフルオロ酢酸／アセトニトリル（容積で７０／３０）中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。シナピン酸処理したサンプル（１．０μｌ）を、ステンレス鋼のＭＡＬＤＩプレート表面に加えて、室温で風乾させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは、線形方式で作動するＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤＥ−ＰＲＯ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）で得た。３３７ｎｍで作動するパルス・レーザーを、イオン化のために遅発性の抽出方式で用いた。９０％の格子電圧で２５ｋＶの加速電圧および０．１％のガイドワイヤ電圧を用いた。約１００のスキャンを行って、２，０００という低質量ゲートで質量範囲２，０００〜１５６，０００Ｄａにまたがって平均した。イオン原および鏡面圧は、それぞれ約１．２×１０^−７および１．６×１０^−７Ｔｏｒｒであった。全てのスペクトルは、標準としてウマのアポミオグロビン（１６，９５２Ｄａ）およびインスリン（５７３４Ｄａ）を用いて２ポイント・フィットを用いて質量較正した。下の表１７は、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチド融合物について、ＭＡＬＤＩによる、理論的な分子量および実測の分子量のまとめを示す。

ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴＭＶ−ＦＶ５については、コートタンパク質融合物のＮ末端Ｍｅｔ残基が除去されて、隣接するアミノ酸がアセチル化される場合に、実測の分子量は、理論的な分子量とマッチした。ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴＭＶ−ＦＶ５上のインタクトな２０アミノ酸のＤＪ５エピトープの存在を、表１６で報告された正の抗ＧＤＦ８ウエスタンブロットと一緒にすれば、これらのＴＭＶ融合物の４つ全てが可能性のあるワクチン候補物であったことが確認された。Ｎ末端融合のために、１７，７４５Ｄａという質量のＴＭＶ−ＦＶ３を得て、これによって、複数の短縮可能性を代表した。ＴＭＶ−ＦＶ３のトリプシン消化物に対して液体クロマトグラフィーを行い、タンデム型質量分析により、解像されたペプチドフラグメントの分析を行うことによって、ＴＭＶ−ＦＶ３のＣ末端がインタクトであること、そしてＤＪ５エピトープが切断されて、最後のＣ末端セリンのみが残り、これがアセチル化されたことが確認された。この融合物では、２０アミノ酸のＤＪ５エピトープを保持できず、そして抗ＧＤＦ８ヤギ＃６６１抗体によるウエスタンブロットでは検出されなかったので、これは、ワクチン候補物としてはさらに追及しなかった。ＴＭＶ−ＦＶ３がＤＪ５エピトープを欠く質量分析およびＰＡＧＥ分析による単一のバンドとしてのその泳動（表１６）によって確認して、ＤＪ５エピトープ内のアミノ酸残基が、架橋およびより高次のオリゴマー形成を担っていたことが示される。上記で示されるとおり、ＤＪ５エピトープ内の２つのシステインは、この架橋化に関与する可能性の最も高いアミノ酸であると考えられた。

実施例１２
ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７の抽出および精製
精製され（実施例１０を参照のこと）、そして質量スペクトルによって特徴付けられた（実施例１１）５つの２０アミノ酸のＤＪ５ペプチド融合物のうち４つが、可能性のあるワクチン候補物、すなわち、ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ４およびＴＭＶ−ＦＶ５として特定された。しかし、これらの４つのＴＭＶ融合物は、不溶性であった。ＴＭＶ融合物の不溶性は、コートタンパク質の架橋を生じた、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドの存在と相関していたので、オリゴマー形成は、ＴＭＶ融合の不溶性に関連していたという仮説がなされた。さらに、ＤＪ５ペプチドに存在する２つのシステインは、この架橋を担うと考えられ、そのためこれらの２つの残基が排除された２つの新規な構築物が提唱された。２つの新規な構築物ｐＬＳＢ−ＦＶ６およびｐＬＳＢ−ＦＶ７は、Ｕ１コートタンパク質に対して、それぞれＮ末端およびＧＰＡＴ融合物として、ＤＪ５ペプチドのＮ末端の１２アミノ酸を提示するように設計した。

実施例１０に挙げた同じ位置は、抽出の前の組織回収および貯蔵に関して、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７にもあてはまる。前出の実施例１０に注記されるとおり、感染した植物組織からの組み換えＴＭＶウイルスの精製についてはいくつかの手順が実証されている。抽出および処理の間のエピトープ安定性を改良する（すなわち、タンパク質分解による分解を最小限にする）、そしてビリオンの溶解度を改善するように設計された、これらの手順およびそれらの改変を、ウイルスＴＭＶ−ＦＶ６の精製、およびＴＭＶ−ＦＶ７の精製において用いた。

ＴＭＶ−ＦＶ７については、実施例１０においてＴＭＶ−ＦＶ３について概説した手順を、新鮮に回収した、浸透移行性に感染した植物組織から開始して使用した。処理中のサンプルおよび最終の清澄化ウイルス調製物のＰＡＧＥ分析によって、上清Ｓ１に分配されたグリーン・ジュースにはＴＭＶ−ＦＶ７の約８０％が存在し、残りは上清Ｓ２に存在したことが示された。上清Ｓ１のみをＰＥＧ沈殿およびその後の最終清澄化遠心のために前にとって、この遠心ではある程度の残りの宿主タンパク質を沈殿させ、精製されたＴＭＶ−ＦＶ７のほとんどが可溶性のまま。残った
実施例１０のＴＭＶ−ＦＶ３について概説した手順を、ＴＭＶ−ＦＶ６の精製のために使用して、新鮮に回収した組織から出発したとき、上清Ｓ１には極低レベルの生成物しか存在せず、ここではＴＭＶ−ＦＶ６のほとんどがペレットＰ２と会合していた。次いで、このプロトコールを改変して、その結果、浸透移行性に感染した組織を抽出の前に凍結させ、そして組織浸軟を、乳鉢および乳棒の補助で行った。これらの変更したＰＡＧＥ分析によって、ＴＭＶ−ＦＶのうち約３０％が上清Ｓ１に分配されて、残りは、上清Ｓ２およびペレットＰ２において検出されたことが示された。上清Ｓ１は、前出の実施例１０に記載されたとおりＰＥＧ沈殿させて、濃縮したウイルスを、清澄化遠心に供した。清澄化遠心ペレットに分配されたＴＭＶ−ＦＶ６、およびＰＡＧＥ分析によって、植物宿主タンパク質の混入が最小限であることが示された。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析、およびウエスタンブロット分析（表１８）を、精製された組み換えウイルスで行って純度を評価した。ウエスタンブロット分析については、ＧＤＦ８のプロ型に対して惹起されたヤギ抗体を使用した。この抗体は、ヤギ＃６６１と呼ばれ、インビトロでＧＤＦ８中和アッセイにおいて中和することが確認された。ウエスタンブロットはまた、ＰＶＡＳ１３５Ｄと呼ばれる、野性型ＴＭＶに対して惹起されたウサギ抗体［ＡＴＣＣコレクション（ＡＴＣＣＮｏ．ＰＶＡＳ１３５Ｄから入手］でも行った。下の表１８は、溶解度、純度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）プロフィールについてのデータ、ならびにＧＤＦ８中和ヤギ＃６６１抗体および抗ＴＭＶ抗体（ＰＶＡＳ− １３５Ｄ）との反応性を、短縮された１２アミノ酸のＤＪ５ペプチドコートタンパク質融合物について、ウエスタンブロットによって示す。

表１８に列挙される組み換えＴＭＶ融合物は両方とも、９０％より大きい純度まで首尾よく精製された。ＴＭＶ−ＦＶ６の場合は、最終の精製されたウイルスは部分的に可溶であったが、ＴＭＶ−ＦＶ７は完全に可溶性であった。ＰＡＧＥによって分析した場合、ＴＭＶ融合物の両方とも単一のバンドとして泳動して、これらのコートコートタンパク質融合物は、抗ＴＭＶＰＶＡＳ−１３５および抗ＧＤＦ８ヤギ＃６６１抗体の両方によって検出された。最小またはそれほど高くない分子量の種は、ＰＡＧＥまたはウエスタンブロットによって検出され、このことは、コートタンパク質架橋において２つのＤＪ５エピトープシステインによって果たされる仮説の役割を支持した。観察された改善された溶解度によって、また、重合化は組み換えＴＭＶビリオンの高分子会合を担っていたことも示される。

実施例１３
ＭＡＬＤＩによるＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７の特徴づけ
ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析に加えて、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７ウイルスの調製物は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭａｔｒｉｘＡｓｓｉｓｔｅｄＬａｓｅｒＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎＩｏｎｉｚａｔｉｏｎ）−飛行時間（ＴｉｍｅｏｆＦｌｉｇｈｔ）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて特徴付けた（表１９）。ＰＥＧ沈殿して、シナピン酸に再懸濁したウイルスの調製およびスポッティングは、実施例１１に概説したとおりであった。ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤＥ−ＰＲＯ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）で得たＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルはまた、質量標準としてウマアポミオグロビンおよびインスリンを用いて、実施例１１に記載されるように行った。下の表１９は、短縮された１２アミノ酸ＤＪ５ペプチド融合物について、ＭＡＬＤＩによる、理論的および実測された分子量のまとめを示す。

ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７の両方について、実測の分子量は、コートタンパク質の融合物のＮ末端Ｍｅｔ残基が除去され、そして隣接するアミノ酸がアセチル化された場合について、理論的な分子量とマッチした。ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７上のインタクトな１２アミノ酸のＤＪ５エピトープの存在を、表１８に報告された正の抗ＧＤＦ８ウエスタンブロットのデータとまとめると、これらのＴＭＶ融合物が両方とも潜在的なワクチン候補物であることが確認された。

実施例１４
ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７のＥＬＩＳＡによる特徴付け
ウエスタンブロットによる免疫分析に加えて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）をまた、可溶性および部分的に可溶性のＤＪ５ペプチド融合物、すなわちＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７を用いて行った。ＴＭＶ融合物は、抗体との接触前には変性されないので、ＥＬＩＳＡによって、アセンブルされた組み換えビリオンの状況ではエピトープの認識および接触性の評価が可能になる。ＥＬＩＳＡは２つの形式で行った；ＥＬＩＳＡプレート上にＴＭＶ融合物をコーティングすることによって、および抗ＴＭＶＰＶＡＳ−１３５Ｄ抗体を用いてサンドイッチ形式で組み換えＴＭＶ融合物を提示することによって。組み換えＴＭＶ融合物の検出のためには３つの抗体を使用した：
−ヤギ（Ｇｏａｔ）＃６６１。このヤギポリクローナル抗体は、精製された組み換えＧＤＦ８プロホルモン（実施例２を参照のこと）ＧＤＦ８に対して惹起され、そしてインビトロのＧＤＦ８中和アッセイにおいて中和することが確認された（実施例３を参照のこと）。

−ウサギ（Ｒａｂｂｉｔ）＃１２８６。このウサギポリクローナル抗体は、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチド（配列番号８）のキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）結合体に対して惹起され、ＥＬＩＳＡ形式ではこのペプチドを認識し得るが、インビトロにおいてＧＤＦ８中和することはできなかった。

−ラット（Ｒａｔ）ＭＡＢ７８８（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）。このモノクローナル抗マウスＧＤＦ８抗体は、ハイブリドーマから精製され、このハイブリドーマは、精製されたＮＳＯ由来組み換えマウスＧＤＦ８で免疫されたラットから得られたＢ細胞とのマウス骨髄腫の融合から生じた。このモノクローナル抗体は、マウスＧＤＦ８の生物活性を中和できた。

間接的なＥＬＩＳＡのためには、組み換えＴＭＶ融合物ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６またはＴＭＶ−ＦＶ７を、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で希釈して、これを用いて、９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＭａｘＳｏｒｂ，Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩（１ウェルあたり５０μＬ）コーティングした。最大２００ｎｇの標的抗原を、２倍連続希釈を行ってコーティングした。コントロールとしてＧＤＦ８プロホルモン（実施例１を参照のこと）を使用して、１ウェルあたり最大１００ｎｇとした。２倍連続希釈はまた、ＧＤＦ８プロホルモンを用いて行った。コーティング溶液を除去して、プレートを５％（ｗ／ｖ）の脂肪粉乳を含有する１×ＴＢＳＴ緩衝液（ＴＷＥＥＮ（商標）２０によるＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）を用いて室温で１〜２時間ブロックした（１ウェルあたり２００μＬのブロッキング溶液）。このウェルを１×ＴＢＳＴを用いて２回洗浄して、そして０．５％（ｗ／ｖ）の脂肪粉乳を含む１×ＴＢＳＴ中で希釈した５０μｌの抗体（ヤギ＃６６１、ラットＭＡＢ７８８またはウサギ＃１２８６）を１ウェルあたりに添加した。全ての抗体は、ウサギ＃１２８６以外は１：１０００の希釈で使用し、この抗体は１：１００で使用した。一次抗体との室温での１時間のインキュベーション後に、プレートを１×ＴＢＳＴで５回洗浄して、５０μＬの適切なセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化二次抗体を、０．５％（ｗ／ｖ）の脂肪粉乳を含有する１×ＴＢＳＴ中で１：１０，０００の希釈で添加した。このプレートを室温で１時間二次抗体とともにインキュベートして、１×ＴＢＳＴで５回洗浄して、１ウェルあたり５０μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベジジン基質溶液を添加した。ＨＲＰ触媒反応を５〜２０分間進行させて、１Ｎの硫酸の５０μLの添加によって停止させた。プレートの吸光度（ＯＤ）は、９６ウェルプレート分光光度計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）中で４５０ｎｍで読み取った。

二抗体サンドイッチ（ＤＡＳ）ＥＬＩＳＡのために、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で１：５００に希釈した５０μｌの抗ＴＭＶポリクローナル抗体ＰＶＡＳ−１３５Ｄを用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘＳｏｒｂ，Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩コーティングした。このコーティング溶液を、取り出して、そのウェルを、５％（ｗ／ｖ）脂肪粉乳を含有する２００μＬの１×ＴＢＳＴ緩衝液を用いて室温で１〜２時間ブロックした。ブロッキング工程後に、このウェルを５回洗浄して、ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６またはＴＭＶ−ＦＶ７を含有する５０μＬの組み換えＴＭＶビリオン溶液を１ウェルあたりに添加した（１×ＴＢＳＴと０．２％（ｗ／ｖ）脂肪粉乳を緩衝液として使用した）。最大１１ピコモルのコートタンパク質を１ウェルあたりに使用して、各々のプレートには組み換えビリオンの２倍連続希釈を存在させた。コーティングされたＰＶＡＳ−１３５Ｄ抗体によるＴＭＶビリオンの捕獲を可能にするために、プレートを室温で１時間インキュベートした。過剰なＴＭＶビリオンは、１×ＴＢＳＴを用いてプレートを５回洗浄することによって除去し、そして一次抗体（０．５％（ｗ／ｖ）脂肪粉乳を含有する１×ＴＢＳＴ中で１：１０００希釈したヤギ＃６６１またはラットＭＡＳ７８８のいずれか）を、室温で１時間のインキュベーションの間に添加した。次いで、プレートを１×ＴＢＳＴで５回洗浄して、５０μＬの適切なセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化二次抗体を０．５％（ｗ／ｖ）の脂肪粉乳含有する１×ＴＢＳＴ中で１：１０，０００の希釈で添加した。そのプレートを、室温で１時間二次抗体とともにインキュベートして、１×ＴＢＳＴを用いて５回洗浄し、そして１ウェルあたりに５０μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質溶液を添加した。ＨＲＰ触媒反応は、５〜２０分間進行させて、５０μｌの１Ｎ硫酸の添加によって停止させた。このプレートの吸光度を、４５０ｎｍで９６−ウェルプレートＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）で読みとった。サンドイッチＥＬＩＳＡも行って、ここではラットＭＡＢ７８８抗体（１：１０００希釈）を捕獲抗体として使用した。これらのＥＬＩＳＡについて、使用した一次抗体は、ヤギ＃６６１抗体であった。これらのサンドイッチＥＬＩＳＡはまた、１ウェルあたり１１ピコモルの最高濃度で存在したＧＤＦ８プロホルモン陽性コントロールを含み、ここでは２倍階段希釈を行った。間接的ＥＬＩＳＡおよびＤＡＳＥＬＩＳＡの両方についてのＥＬＩＳＡデータを下の表２０にまとめており、これは、間接的および二抗体サンドイッチＥＬＩＳＡデータのまとめを示す。間接的なＥＬＩＳＡではピコモルあたりの反応は、ＣＨＯＧＤＦ８プロホルモン陽性コントロールに対して報告される。

表２０について：＋＋＋＋は、ＧＤＦ８プロホルモンコントロールに匹敵する応答を示す。使用した一次抗体を列挙する。サンドイッチＥＬＩＳＡについては、得られた最高の応答は、ＦＶ７構築物であって、これを＋＋＋＋に設定した。他の融合物についてのデータは、これに対して報告される。Ｃ；捕獲抗体、１３５Ｄ；ＰＶＡＳ−１３５Ｄ抗ＴＭＶＰＡｂ；１°、一次抗体。

直接ＥＬＩＳＡ形式で試験したＴＭＶ−ＦＶ５については、ウサギ＃１２８６抗体を検出に使用した場合、ＧＤＦ８プロホルモンコントロールと同様の様式で融合物を滴定した。対照的に、一次抗体としてヤギ＃６１１またはラットＭＡＢ７８８抗体を使用した場合には最小の応答しか得られなかった。サンドイッチＥＬＩＳＡ方式では、応答はＴＭＶ−ＦＶ７に比較して弱かった。しかし、捕獲のために使用したＰＶＳ−１３５Ｄ抗体は、ＴＭＶのＵ１株に対して惹起され、そしてＴＭＶ−ＦＶ５はＵ５株に基づくことに注意しなければならない。

１２アミノ酸のＤＪ５由来ペプチド融合物（ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７）の両方を、直接ＥＬＩＳＡ形式で３つの抗ＧＤＦ８／ＤＪ５抗体のすべてによって検出し、両方の融合物についての応答プロフィールは同様であって、１ピコモルあたりのＯＤ応答は、ＴＭＶ−ＦＶ７についてよりもわずかに高かった。しかし、これは単に、この融合物の溶解度の改善を反映し得る。ウサギ＃１２８６検出では、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７の両方に対する応答は、ＧＤＦ８プロホルモンコントロールに対して匹敵していた。ヤギ＃６６１およびラットＭＡｂの場合は、ＧＤＦ８プロホルモンコントロールに対する応答は、２〜３倍高かった。二抗体サンドイッチＥＬＩＳＡについては、Ｎ末端融合物は、全ての場合に示した応答が劣っていた；おそらく、その凝集状態から生じる捕獲が劣ることに起因する。Ｃ末端（ＧＰＡＴ）融合物については、応答は、一次抗体としてヤギ＃６６１およびラットＭＡＢ７８８の両方を用いて得られ、これは、ＰＶＡＳ−１３５Ｄポリクローナルで捕獲されている。抗ＧＤＦ８捕獲および検出（ラットＭＡＢ７８８捕獲およびヤギ＃６６１検出）では、ＴＭＶ−ＦＶ７が示した１ピコモルあたりのＯＤ応答は、ＧＤＦ８プロホルモンコントロールよりも大きかった。これは、各々の捕獲されたロッドが２０００コピーを超える反応性エピトープを示し、シグナル増幅を生じたという事実を反映し得る。実施例１２で考察されたウエスタンブロットのデータと一緒にして、ＥＬＩＳＡデータによって、２０アミノ酸のＤＪ５エピトープの１２アミノ酸のＮ末端部分は、全長ＧＤＦ８タンパク質に対して抗体を中和することによって認識され、従って実行可能なワクチン候補物であると考えられるということが示される。

実施例１５
動物試験およびワクチン製造のためのＴＭＶコートタンパク質融合物の選択
表８および１２に詳細に示される、全部で７つの候補組み換えＴＭＶＤＪ５融合物を、Ｎ．ｂｅｎｉｈａｍｉａｎａ中でのそれらの発現および２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドまたは全長のＧＤＦ８プロホルモンに対する一連の抗体に対する免疫反応性について評価した。累積データに基づいて、下の表２１に列挙される構築物を、製造のために、動物の一連のトライアルにおける試験のために、定量、滅菌および不活性化された組み換えビリオンの十分な量を生成するために、進行させた。

この選択の背景の理由は以下のとおりであった。ＤＪ５ペプチドの１２アミノ酸Ｎ末端領域を提示する融合物、すなわちＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７は、植物中での蓄積に関して最も所望される特徴、抽出および精製を保有した。ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによる免疫反応性の分析によって、これらの改変したＤＪ５ペプチドＴＭＶ融合物は、ＧＤＦ８を中和する、ヤギ＃６６１およびラットＭＡＢ７８８抗体によって認識されることが実証されたので、両方ともワクチン製造のために進行させた。これらの２つのワクチンを完成するために、考慮した２０アミノ酸のＤＪ５融合物は、Ｎ末端（ＴＭＶ−ＦＶ３）またはＧＰＡＴ／ＴＰＡＴ位置（ＴＭＶ−ＦＶ１およびＴＭＶ−ＦＶ５）のいずれかにエピトープを担持するものであった。ＴＭＶ−ＦＶ３の場合のエピトープ短縮に起因して（実施例１０および１１を参照のこと）、ＴＭＶ−ＦＶ１およびＴＭＶ−ＦＶ５を選択した。この選択によってまた、可溶性（ＴＭＶ−ＦＶ７）から部分的に可溶性（ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ５）から不溶性（ＴＭＶ−ＦＶ１）までの種々の物理的形態のワクチンを比較することが可能になる。

動物の使用のための４つのＴＭＶＤＪ５融合物の製造のために、使用した手順は、実施例１０および実施例１２に概説したとおりであって、以下の改変を伴った。このプロセスの全ての段階で、注射用水（ＷＦＩ）を使用して、全ての試薬は、専用のストックからであった。ウイルス調製物を処理するために用いた実験室ウエアはできるだけ、２２５℃で最低６時間焼いた。これが不可能である場合、実験室ウエアは、１０％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に２０分間浸漬して、ＷＦＩ中で徹底的にリンスして、１２１℃で２０分間オートクレーブした。

最終の組み換えウイルスを、滅菌のリン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁した。この調製物を、滅菌して、ＴＭＶゲノムＲＮＡを、二元性エチレンイミン（「ＢＥＩ」）で処理することによって不活化した。要するに、０．１ＭのＢＥＩストック溶液を、最終濃度の５ｍＭのＢＥＩに添加した。サンプルを、持続して混合しながら３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後、ＢＥＩを３モル過剰のチオ硫酸ナトリウムの添加によって中和した。ＢＥＩ不活性化ＴＭＶＤＪ５融合調製物のタンパク質含量は、アミノ酸分析（ＡＡＡ）によって確認し、ｐＨは、１０％（ｖ／ｖ）の５０ｍＭのリン酸２水素カリウム溶液の添加によってほぼ７．４に調節し、そして調製物を、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水で１ｍｇ／ｍＬに希釈して、その後に２ｍＬの滅菌ガラスバイアルにアリコートした。最終のバイアル生成物を、下の実施例１６に概説されるようにリリース試験した。

実施例１６
動物試験のためのＴＭＶコートタンパク質融合ワクチンの特徴づけ
バイアルにいれたワクチンＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７を、一連の試験に供して、同一性、純度、無菌性、ＴＭＶゲノムＲＮＡ不活化および内毒素の非存在を確認した。使用したアッセイおよびリリースの基準は、下に簡略にまとめる。

各々のワクチンの分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定して、リリースのためには理論的なＭＷ±０．０５％内にあてはまらなければならない。全てのワクチンを１６％のＴｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。電気泳動後に、ゲルをクマーシー・ブリリアント・ブルー（ＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅ）で染色して、デンシトメトリーで分析した。ＴＭＶＤＪ５コートタンパク質融合物のバンド（単数または複数）は、検出可能な総タンパク質の９０％以上を構成しなければならない。各々のワクチンの同一性を、トリプシン消化ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって確認した。少なくとも４つの固有の変更されていないトリプシン消化したペプチドフラグメントの分子量は、対応する理論的な未同定のトリプシンのペプチドフラグメントの分子量±０．５に適合しなければならず、そしてトリプシンのペプチドフラグメントは、ＤＪ５ペプチド融合物の完全性を確認しなければならない。ワクチンの最終タンパク質濃度は、アミノ酸分析を用いて決定して、これによってまた、ＴＭＶＤＪ５融合物のアミノ酸組成が得られた。溶液中のワクチンの外見は、視覚検査によって確認して、バイアルに入れられた生成物のｐＨは、較正されたｐＨ計（受容可能な範囲、ｐＨ７．４＋／−０．４）を用いて標準的な方法によって決定した。

ＴＭＶの感染性は、局所病変宿主植物、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍｖａｒ．ｘａｎｔｈｉ，「Ｇｌｕｒｋ」を用いて測定した。局所病変アッセイは、Ｇｌｕｒｋ植物で播種後４〜６週間で行った。アッセイしたサンプルのうち１００μｌを、研磨剤として使用した炭化ケイ素を用いて葉ごとに接種した。サンプルを三連で泳動して、局所病変を接種の４〜６日後にスコア付けした。リリースに必要であったのは局所病変の検出が１未満であることであった。生体負荷の決定のために１０μＬおよび１００μＬのサンプルを、ラミナー・フローのフードの下で無菌技術を用いて、ＬＢ栄養寒天上にプレートした。このプレートを反転させて、室温で４日間インキュベートさせた。コロニーの数を４日のインキュベーション後に記録し、次いでプレートをさらに４日間、３３℃のインキュベーターに動かし、２回目のスコア付けをした。リリースのために、コロニー形成単位は検出されてはならない。最終的に、バイアルに入れられたＴＭＶＤＪ５融合物の内毒素含量は、ＬｉｍｕｌｕｓＡｍｅｂｏｃｙｔｅＬｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）アッセイを用いて決定した。諸元を満たすために、各々のワクチン用量は、１０ＥＵ以下の内毒素を送達すべきである。４つのワクチンについてのリリース試験の結果を下の表２２Ａおよび表２２Ｂにまとめる。

動物試験のために生成したワクチンロットの結果は以下のとおりであった。ＴＭＶ−ＦＶ１については、１ｍｇ／ｍLという標的タンパク質濃度を有する、全部で２４のバイアルを調製した（１ｍＬ／バイアル）。還元条件下でのＰＡＧＥ分析によって、ＢＥＩ処理後の精製されたワクチンに存在する単量体レベルが減少すると考えられた。これはおそらく、ＢＥＩ不活性化で使用された高いｐＨ条件によって生じるジスルフィド結合形成の増大に起因し得る。ＢＥＩ処理が融合物の抗原性に影響するか否かを確認するために、ウエスタンブロットを、以下の抗体；ＰＶＡＳ１３５Ｄ（抗ＴＭＶ）、ヤギ＃６６１、ウサギ＃１２８６およびラットＭＡＢ７８８を用いてＢＥＩ処理前後の両方のサンプルで行った。４つの抗体全てで観察されたプロフィールは、実質的に同一であって、ＢＥＩの前後のサンプルは両方とも予想されるオリゴマーのラダーを含んだ。ＥＬＩＳＡは、精製された融合物の粒子性の性質のせいで行わなかった。バイアルに入れたＴＭＶ−ＦＶ１の質分析を完了させて、リリースデータは、表２２Ａおよび表２２Ｂにまとめる。この融合物は、リリース基準の全てを合格した。純度の場合には、これは、ＰＡＧＥゲルとウエスタンブロットのオリゴマーのプロフィールとの間の１対１の対応に基づいて、９０％より大きいと見積もられた。しかし、正確な純度パーセントは、報告されていない。なぜなら、各々の個々のバンドのトリプシン消化の確認は行われていないからである。

ＴＭＶ−ＦＶ５については、全部で９つのバイアルを、１ｍｇ／ｍＬという標的タンパク質濃度で、調製した（１．４ｍＬ／バイアル）。融合物に対してＢＥＩ処理の決定的な影響があったか否かを決定するために、検出のためにＧＤＦ８中和ラットＭＡＢ７８８を用いてウエスタンブロットを行った。ＢＥＩ処理の前のサンプルについては、単一のバンドが観察された。しかし、ＢＥＩ処理後、ＢＥＩ処理の間のアルカリｐＨ条件の結果であり得るジスルフィド架橋の増大におそらく起因して、オリゴマーのラダーが存在した。また、ＢＥＩ単量体種については、ウエスタンブロットによって二重線が証明された。ウエスタンブロットデータは、全長ＭＡＬＤＩデータと相関しており、これは、複数の短縮物での生成物を示した。二重線の両方のバンドは、抗体に対して反応性であって、これは、短縮された生成物がある程度の抗原性を保持したことを示唆している。直接ＥＬＩＳＡを、３つの抗ＤＪ５／ＧＤＦ８抗体（ヤギ＃６６１、ウサギ＃１２８６およびラットＭＡＢ７８８）および１つの抗ＴＭＶ抗体（ＰＶＡＳ１３５Ｄ）を用いてサンプル上で行った。プレ−ＢＥＩサンプルは、ＢＥＩ処理した最終生成物よりも実質的に反応性であった。これについて可能な説明は、ＴＭＶ融合物の架橋は、エピトープの接近性を減少させるか、そして／またはビリオンの溶解度を減少させ、これがマイクロタイタープレート上のコーティングレベルの低下を生じるということである。バイアルに入れられたＴＭＶ−ＦＶ５の品質分析を終わらせて、リリースデータを表２２Ａおよび表２２Ｂにまとめる。純度の場合には、これは、ＰＡＧＥゲルとウエスタンブロットのオリゴマーのプロフィールとの間の１対１の対応に基づいて、９０％より大きいと見積もられた。しかし、正確な純度パーセントは、報告されていない。なぜなら、各々の個々のバンドのトリプシン消化の確認は行われていないからである。上で注記されたとおり、ＢＥＩ処理した最終生成物における短縮種は、ウエスタンブロットによって免疫反応性であった。さらに、ゲルおよび液体のトリプシン質量マッピングによって、この短縮された種は、Ｃ末端の２つのアミノ酸を除いてＤＪ５エピトープの全てを保持していたことが示された（ＭＳ）。従って、このワクチン候補物は、動物試験について進行させた。

ＴＭＶ−ＦＶ６については、全部で９つのバイアルを、１ｍｇ／ｍＬという標的タンパク質濃度で、調製した（１．４ｍＬ／バイアル）。融合物に対してＢＥＩ処理の決定的な影響があったか否かを決定するために、検出のためにＧＤＦ８中和ラットＭＡｂを用いて、ＢＥＩの前後のサンプルに対してウエスタンブロットを行った。両方のサンプルについて、単一のバンドが観察された。直接のＥＬＩＳＡをまた、３つの抗ＤＪ５／ＧＤＦ８抗体および１つの抗ＴＭＶ抗体を用いて行った。ＢＥＩの前後の両方のサンプルで同様のプロフィールが観察された。ウエスタンブロットのデータとまとめて、これらの結果によって、ＢＥＩ処理後のエピトープに対して決定的な改変はないことが示される。表２２Ａおよび表２２Ｂは、バイアルに入れたＴＭＶ−ＦＶ６についての品質分析からのリリースデータをまとめる。ワクチン生成物は、リリース基準の全てを通過し、そして動物試験へ進めた。

ＴＭＶ−ＦＶ７については、全部で３２のバイアルを、１ｍｇ／ｍＬという標的タンパク質濃度で、調製した（１ｍＬ／バイアル）。ＤＪ５融合物に対してＢＥＩ処理の決定的な影響があったか否かを決定するために、以下の抗体を用いてウエスタンブロットを行った；ＰＶＡＳ１３５Ｄ（抗ＴＭＶ）、ヤギ＃６６１、ウサギ＃１２８６およびラットＭＡＢ７８８。ＢＥＩの前後の両方のサンプルを、４つの抗体全てによって検出して、融合物は、単一のバンドとして泳動した。さらに、この融合物は可溶性であったので、直接捕獲ＥＬＩＳＡおよび二抗体サンドイッチ（ＤＡＳ）ＥＬＩＳＡの両方を行って、ＢＥＩ処理から生じる、エピトープに対する変更が、未変性のコートタンパク質およびアセンブリされたビリオンの状況で検出され得るか否かを決定した。ＣＨＯ由来ＧＤＦ８プロホルモン（実施例１）を、正のコントロールとして使用した。ＤＡＳＥＬＩＳＡについては、ほぼ同一のプロフィールが、ＢＥＩ処理の前後のサンプルの両方について得られ、このことは、ＢＥＩ処理が生成物の抗原性に有する影響が最小限であることを示す。同様に、直接の捕獲ＥＬＩＳＡについては、ＢＥＩ処理した生成物は、未処理の融合物に匹敵しており、４つの抗体のうち３つについては、ＢＥＩ処理後のサンプルは、わずかに高いＯＤ読み取りを生じた。バイアルに入れられた生成物の品質分析を終わらせて、ＴＭＶ−ＦＶ７は、リリース基準の全てを通過し（表２Ａおよび表２２Ｂ）、従って、動物試験へ進めた。

実施例１７
４℃で６ヶ月の貯蔵でのＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７についての安定性研究
４つのＢＥＩ処理し、バイアルに入れられたＴＭＶＤＪ５融合物を６ヶ月の安定性研究に供して、４℃での保管で候補ワクチンの完全性を評価した。６ヶ月の期間というのは、動物研究でワクチンを評価する時間枠をカバーしていた。約１ヶ月の間隔で６つの時点の全てで採取して、バイアルに入れたワクチンは、ＰＡＧＥゲル、ウエスタンブロットおよびＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析法によって分析した。ウエスタンブロット分析については、抗ＧＤＦ８ヤギ＃６６１抗体を使用した。６ヶ月の時点の間のＰＡＧＥ分析およびウエスタンブロットのデータを表２３にまとめており、そして全ての時点についてのＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析情報を表２４にまとめる。

詳細には、下の表２３は、４℃で保管したＤＪ５ペプチドのコートタンパク質融合物のＰＡＧＥ分析およびウエスタンブロット分析のまとめを提供する。このデータは、６ヶ月の研究の最終時点についてである。

ＴＭＶ−ＦＶ６、ＴＭＶ−ＦＶ７およびＴＭＶ−ＦＶ１については、ＰＡＧＥプロフィールは、６ヶ月の安定性研究の経過にわたって維持された。同様にウエスタンブロットプロフィールについて、リリースサンプルに対して逸脱は観察されなかった。ＰＡＧＥプロフィールに対する、ウエスタンブロットによって検出されたバンド数の相違は、より高分子量のバンド（２００ｋＤａより大）に相当し、これは、膜にはあまり移動されない。ＴＭＶ−ＦＶ５の場合、単量体種は、実施例１６に注記されるようにリリースサンプル中で二重であった。安定性研究の経過にまたがって、単量体の二重線におけるより低い分子量種への段階的なシフトは、ＰＡＧＥ分析によって観察された。しかし、両方の単量体種とも、分析の６ヶ月のウインドウにまたがってウエスタンブロットによる免疫反応性を保持した。ＴＭＶ−ＦＶ５のより高分子量のオリゴマー種はまた、ウエスタンブロットによって証明された。しかし、６ヶ月の時点の間、ＴＭＶ−ＦＶ５の推定上の二量体のみが、おそらく移行が弱いことに起因して、ウエスタンブロットによって可視であった：４〜６のバンドが代表的には検出された。

下の表２４は、ＭＷＭＡＬＤＩ分析をリリースサンプルについて（Ｒ）そしてＢＥＩ処理してバイアルに入れられたワクチンについての安定性研究を通じて採取した６つのサンプルについて示す。リリースサンプルについては、主なピークのみを報告する。

質量分析の分析（表２４、上）によって、注記した改変を有する全長の種がＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７の両方について存在し、そしてコートタンパク質への１つのＢＥＩの添加に相当する、さらなる大きいピークも欠失されたことが示された。これらの２つの種は、安定性研究を通じて維持された。ＴＭＶ−ＦＶ１については、ほとんどのスペクトルにおける主要なピーク（時点３〜６）は、予想よりも約１７０Ｄａ大きかった。これは、１つのコートタンパク質あたり４または５ＢＥＩ部分の付加に相当する。しかし、ＴＭＶ−ＦＶ１サンプルのスペクトル量は劣っていたことに注意しなければならない。ｐＬＳＢ−ＦＶ５の場合、最小の全長種は、１時点の後に検出された。観察された２つの主な種は、１９１３０＋／−１００Ｄａおよび１７７１９Ｄａというおよその分子量を有した。ＴＭＶ−ＦＶ５についてのリリースサンプルは、正に同定された１９０３８Ｄａの種を含み、そして２０アミノ酸のＤＪ５エピトープのほとんどを保有することが示された（実施例１６）。１７７１９Ｄａの種は、ＴＭＶＵ５よりもわずか２〜３アミノ酸大きい種（１７，４８９Ｄａ，Ｍｅｔ切断）に相当し、従って、単量体二重線の低い方のバンドには対応せず、これによって、これが１９，１３０＋／−１００Ｄａ種であることが示唆される。ウエスタンブロットによれば、この１９．１ｋＤａの種は免疫反応性を保持していた。

全体として、このデータによって、ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７が、４℃の保管で少なくとも６ヶ月間安定であったことが示される。ＴＭＶ−ＦＶ５の場合、分解が４℃での保管で生じ、１９．１ＫＤａというおよその分子量を有する主な種が得られた。この短縮生成物は、保管で安定と考えられ、そしてウエスタンブロットのデータから、ＧＤＦ８中和ヤギ＃６６１抗体と免疫反応性であった。

実施例１８
ＧＤＦ８中和抗体に結合し得るＤＪ５ペプチド領域における洗練
ウエスタンブロット分析の経過の間に、ＧＤＦ８中和ラットモノクローナル抗体（ＭＡＢ７８８）は、Ｕ１コートタンパク質と強力に反応することが確認された。観察された応答は、この融合物を並行に分析した場合、ＴＭＶ−ＦＶ７と匹敵すると思われた。対照的に、これもＧＤＦ８中和であるヤギ＃６６１ポリクローナル血清は、Ｕ１コントロールとは弱くしか反応しなかった。Ｕ５株コートタンパク質がウエスタンブロット分析に含まれた場合、ラットＭＡＢ７８８抗体では交差反応性は検出されなかった。この結果によって、間接的なＥＬＩＳＡによるＵ１およびＵ５コートタンパク質に対するラットモノクローナル抗体反応性の比較が促された（表２５）。このＥＬＩＳＡについては、ラットＭＡＢ７８８を最初に１：２０に希釈した；Ｕ５コートタンパク質に対する交差反応性は検出されず、このことは、ウエスタンブロットデータを支持しているが、Ｕ１コートタンパク質は１：１６２０の終点希釈で検出された。ＴＭＶＤＪ５ペプチド融合物陽性コントロール（ＴＭＶ−ＦＶ７）に対する応答は、３倍高かった。間接的なＥＬＩＳＡでは、ビリオンは、ＥＬＩＳＡプレート表面に吸着され、これは、ウイルス構造のいくつかの破壊を生じることが期待される工程である。

ラットＭＡＢ７８８の反応性における明確な相違は、ＴＭＶＵ１とＴＭＶ−ＦＶ７との間でＥＬＩＳＡ形式で観察されたが、ウエスタンブロットによる反応性は匹敵していたので、ラットモノクローナル抗体によって検出された推定のＴＭＶＵ１エピトープは、ウイルス構造に対して内部であったと仮定された。この仮説を試験するために、二抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを行った（表２５）が、ここではＴＭＶＵ１またはＴＭＶ−ＦＶ７のいずれかが、抗ＴＭＶポリクローナル抗体による捕獲を通じてインタクトなビリオンとして提示された。吸着されたＴＭＶＵ１に対するＥＬＩＳＡとは対照的に、インタクトなビリオンとして提示された場合、野性型Ｕ１ウイルスに対する最小の交差反応性が存在し、これによって、ＴＭＶ−ＦＶ７ビリオンに対する反応性が、提示されたＤＪ５−由来のエピトープに特異的であったことが示された。この結果によって、推定上のＵ１エピトープが、インタクトなビリオンに曝された表面ではないという仮説が支持された。

下の表２５は、以下のように、ＴＭＶＵ１コートタンパク質およびＵ５コートタンパク質に対する抗ＧＤＦ８ラットモノクローナル抗体（ＭＡＢ７８８）およびヤギ＃６６１ポリクローナル抗体の反応性を比較するために、間接的ＥＬＩＳＡおよびＤＡＳＥＬＩＳＡについての終点希釈の結果を示す。

表２５については、ＴＭＶ−ＦＶ７は、陽性コントロールとして含まれた。ＤＡＳＥＬＩＳＡについては、ＴＭＶＵ１またはＴＭＶ−ＦＶ７ビリオンは、抗ＴＭＶポリクローナル抗体ＰＶＡＳ１３５Ｄを用いて捕獲された。陰性コントロールとして、ヤギ前採血血清を使用した。全てのＥＬＩＳＡについて、抗原は５μｇ／ｍＬで使用した。ラットおよびヤギの抗体は最初に１：２０に希釈して、各々について、２連で３倍階段希釈を行った。終点希釈は最高の希釈としてとって、ここではＯＤ読み取りはバックグラウンドの２倍であった。

Ｕ１およびＵ５ＴＭＶコートタンパク質に対するラットＭＡＢ７８８の反応性における硬直した相違に起因して、ＤＪ５ペプチドのＮ末端の１２アミノ酸との２つのコートタンパク質配列のアラインメントを行なった（図６Ｂ）。このアラインメントによって、ＤＪ５ペプチドおよびＵ１コートタンパク質が、プロリンの存在によってＵ５コートタンパク質の場合に破壊される、共通の４つのアミノ酸配列ＱＡＮＰ（配列番号５８）を共有したことが示された。ウイルスのＸ線回折構造から、ＱＡＮＰ（天然のヒト前駆体ＧＤＦ８の残基３２９〜残基３３２）は、考察されたウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡのデータと一致して、ビリオンの内面に位置している（図６Ｃ）。全体として、このデータによって、Ｕ１コートタンパク質との観察されたラットＭＡＢ７８８交差反応性についての説明、そしてＤＪ５ペプチド内の本質的でかつ必須のアミノ酸配列であって、それに対して中和抗体が惹起され得るアミノ酸配列を描写するのにおける補助が得られる。

興味深い事に、ヤギ＃６６１ポリクローナル抗体は、ウエスタンブロットおよび間接的なＥＬＩＳＡ形式の両方でＵ１コートタンパク質に対して示す反応性が最小である。ラットモノクローナル抗体と同様に、この抗体は、インビトロの転写活性アッセイでＧＤＦ８を中和し得る（実施例３）。ヤギ＃６６１血清は、ＴＭＶ−ＦＶ７と強力に反応するので、これによって、ＧＤＦ８中和抗体を生成し得るＤＪ５ペプチドのＮ末端の１２アミノ酸のＤＪ５ペプチド内に他の領域が存在することが示され得る。

実施例１９
キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に対する化学的融合物に対して比較したＴＭＶに対する分子融合物の状況でのＤＪ５ペプチド提示の優位性
ＤＪ５ペプチドを同定した最初の調査的な研究の間、ＧＤＦ８中和ラットモノクローナル抗体（ＭＡＢ７８８，Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）およびヤギ＃６６１抗体を、２つのウサギ由来のハイパー免疫血清（表２６）に比較した。ウサギ抗体は、ＳＰ２またはＤＪ５ペプチドのいずれかのＫＬＨ結合体に対して惹起された。図７によって、ＳＰ２ペプチドがＣ末端でＱＡＮＰ（配列番号５８）残基を含むことが示される。Ｕ１コートタンパク質とのラットＭＡＢ７８８の交差反応性（実施例１８）によって、中和応答を生じるのにおけるＱＡＮＰ（配列番号５８）残基の重要性の強力な証拠が得られた。しかし、どのウサギ血清も、ＧＤＦ８中和できないが、それらは、それらのそれぞれのペプチド免疫原をＥＬＩＳＡ形式で認識した。また、ＥＬＩＳＡ方式でのこのペプチドに対するヤギ＃６６１およびラットＭＡＢ７８８の相対的な応答も興味深い。どの抗体もＤＪ４ペプチドを検出せず、ここではＱＡＮＰのプロリン残基（配列番号５８）は存在しなかった（図７）が、それらは、ＳＰ２に対して反応性が弱く、ＤＪ５エピトープに対して反応性であった。対照的に、ウサギ＃９２血清（ＳＰ２ペプチド抗原）は、ＤＪ４に対して反応性で、ＤＪ５に対して非反応性であった。これによって、ＧＤＦ８のこの領域が提示される状況は、中和応答の生成に重要であり得ることが示唆される。

下の表２６は、市販のそして自家製の抗体の選択のための相対的なＥＬＩＳＡおよびＧＤＦ８中和のまとめを示す。

＊ＧＤＦ成熟領域＝ヒト／ブタ／ニワトリ／ラットのアミノ酸配列。プロＧＤＦ８＝ＧＤＦ８プロホルモンヒトアミノ酸配列
＊＊ＫＬＨに結合されたペプチド
ヤギ＃６６１、ラットＭＡＢ７８８およびウサギ＃１２８６抗体における相違をさらに検討するために、一連のＥＬＩＳＡを以下の標的に対して行った：
・ＢＳＡに結合体化されたＤＪ５（２０）ペプチド（ＢＳＡ−ＤＪ５（２０）、図７を参照のこと）。
・ＢＳＡに結合体化されたＤＪ５（１２）ペプチド（ＢＳＡ−ＤＪ５（１２）、図７を参照のこと）。
・ＢＳＡに結合体化されたＤＪ５（８）ペプチド（ＢＳＡ−ＤＪ５（８）、図７を参照のこと）。
・ＢＳＡ単独。
・Ｕ１コートタンパク質に対するＧＰＡＴ融合物としてのＤＪ５（１２）を示すＴＭＶ−ＦＶ７。このビリオンは、ウサギ抗ＴＭＶＵ１ポリクローナルＰＶＡＳ１３５Ｄを使用する二抗体サンドイッチ形式でインタクトなロッドとして提示された。
・プロＧＤＦ８ＦＬＡＧ、哺乳動物細胞が生成して、アフィニティー精製されたＧＤＦ８。

下の表２７は、ＥＬＩＳＡコーティングおよび１ウェルあたりに存在するＤＪ５ペプチドの推定ピコモル数のまとめを示す。

（ａ）ＢＳＡは、全部で５９個のリジンε−アミン基を保有する（これらのうちわずか３０〜３５が代表的には誘導体化に利用可能である）。グルタルアルデヒド結合体化反応については、ペプチドが２倍モル過剰で存在し、そして全ての遊離のリジンがロードされたとみなした、すなわちＢＳＡ１分子あたり３５のペプチド提示。
（ｂ）ＣＨＯ由来プロＧＤＦ８ＦＬＡＧ（ＦＬＡＧタグ化ＧＤＦ８プロホルモン）については、精製された物質は、５０ｋＤａのプロポリペプチドおよび完全処理された１２．５ｋＤａのＧＤＦ８の８０：２０の比の異種混合物であった。
（ｃ）１ウェルあたりに吸着された標的抗原のピコモルを算出するのに、コーティング溶液に存在する全てのタンパク質がプレートに結合したとみなした。全ての抗原について、２５０ｎｇがコーティング溶液に存在し、そして使用したＮｕｎｃＭａｘｉＳｏｒｐプレートは５００〜６００ｎｇＩｇＧ／ｃｍ^２という吸着能力を有し、そして０．６ｃｍ^２の表面積がコーティング溶液と接触した。
（ｄ）ウェルに添加されたＴＭＶ−ＦＶ７の全てが、コーティングのＰＶＡＳ１３５Ｄ抗体によって捕獲されたと仮定する。
（ｅ）１ウェルあたりにコーティングされたＧＤＦ８の理論的な最大ピコモル数は、１２．５ｋＤａ種に対して処理されたＧＤＦ８プロホルモン１００％であった。

下の表２８は、一連のＤＪ５−由来ペプチド−ＢＳＡ結合体、ＧＤＦ８プロホルモン（プロＧＤＦ８ＦＬＡＧ）およびＴＭＶ−ＦＶ７（二抗体サンドイッチの形式で提示）に対する反応性に関して、ヤギ＃６６１、ウサギ＃１２８６およびラットＭＡＢ７８８抗体のＥＬＩＳＡ終点希釈比較を示す。

ＴＭＶＵ１／ＰＶＡＳ１３５Ｄ二抗体サンドイッチは陰性コントロールとして存在しなかったが、前出の表２５は、ビリオンとして示された場合に、ラットＭＡＢ７８８またはヤギ＃６６１抗体のいずれかによるＵ１コートタンパク質に対する反応性が最小であることを示すということに注意のこと。表２８のデータについては、ヤギ＃６６１およびラットモノクローナルＭＡＢ７８８抗体は最初に、１：１０に希釈して、各々について三倍階段希釈を二連で行った。精製されたラットモノクローナル抗体については、１：１０希釈が５０μｇ／ｍＬという抗体濃度に相当した。ウサギ＃１２８６抗体の場合、最初の希釈は１：１０００であった。終点希釈は、ＯＤ読み取りがバックグラウンドの２倍である最高希釈とした。ＮＤはウサギポリクローナルとして測定せず（ｎｏｔｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）、ビリオン捕獲のために使用した。

ラットモノクローナル抗体については、しかし、ＢＳＡに結合体化された全長ＤＪ５ペプチド、ＤＪ５（２０）に対する反応性は弱かったが、それより短いＤＪ５由来ペプチドも検出されなかった。対照的に、１ウェルあたり約１０倍低いレベルのＤＪ５ペプチド（ＤＪ５（２０）ＢＳＡに対して）を示したＧＤＦ８プロホルモンについては、終点希釈は２ｌｏｇ_１０倍高かった。また、ＴＭＶ−ＦＶ７に対する強力な反応性があり、終点希釈は、ＧＤＦ８プロホルモンについてわずか３倍低いだけであった。ＴＭＶ−ＦＶ７については、１３ピコモルが、約２倍のＧＤＦ８値、１ウェルあたり最大のＤＪ５含量であることが確認されたが、このことは、コーティング抗体によるビリオンの１００％捕獲を仮定する。

ＴＭＶ−ＦＶ７対ＤＪ５（１２）ＢＳＡ結合体に対するラットＭＡＢ７８８の反応性の明確な相違は、特に興味深い。なぜなら両方の場合に同じペプチドが提示されるからである。ＤＪ５（１２）については、ＢＳＡに対するググタルアルデヒド結合は、ペプチドのＮ末端の最初のアミノ基を介する。これは、ペプチドのＱＡＮＰ（配列番号５８）残基に対する接近性を立体的に妨害し得る（図７）。これは、ＤＪ５（２０）ペプチドが、弱くても検出されるという事実によって支持される。ＤＪ５（２０）については、リジン（Ｋ）は、ペプチドのＣ末端領域に存在し、そしてペプチドのＮ末端領域の改善された提示を生じるはずである別の結合部位である。別の説明は、ＴＭＶコートタンパク質に対する分子融合の状況におけるＱＮＡＰ（配列番号５８）残基の提示によって、エピトープは、より「天然（ｎａｔｉｂｅ）」の高次構造をとることが可能になるということである。後者の仮説は、上記の表２６に提示されるＧＤＦ８中和データによって支持される。表２６は、ＫＬＨに結合体化されたＳＰ２およびＤＪ５ペプチドが、ＧＤＦ８中和抗体を生成できないが、両方について、ＱＡＮＰ（配列番号５８）領域は、ペプチドＮ末端および／または反応性リジンに対するその位置のおかげで、十分に提示されるはずであることを示す（図７）。しかし、ＤＪ５ペプチドがＴＭＶの状況で提示される場合、強力な免疫応答がヤギおよびブタの両方で観察され（実施例２０および２１を参照のこと）、そして血清は、インビトロの転写アッセイに基づいてＧＤＦ８中和であった。

ヤギ＃６６１抗体については、種々の標的抗原に対する全体的な応答プロフィールは、ラットＭＡＢ７８８モノクローナルと質的に同様であった。しかし、ＤＪ５（２０）−ＢＳＡ結合体とＧＤＦ８プロホルモンとの間の応答の相違は、ＤＪ５（２０）−ＢＳＡに対する１０倍高い終点希釈のおかげで、ラットモノクローナル抗体についてよりも１ｌｏｇ_１０低かった。さらに、ヤギ＃６６１抗体は、ＤＪ５（１２）およびＤＪ５（８）ペプチドＢＳＡ結合体との反応性が弱かったが、ＴＭＶ−ＦＶ７に対する終点希釈は、ＤＪ５（１２）−ＢＳＡについてよりも依然として２ｌｏｇ_１０倍高かった。ＤＪ５（２０）−ＫＬＨ結合体に対して惹起されたウサギ＃１２８６ポリクローナル抗体については、終点希釈は、ＤＪ５（２０）−ＢＳＡ結合体について最大であったが、ＧＤＦ８プロホルモン、ＤＪ５（１２）−ＢＳＡおよびＤＪ５（８）−ＢＳＡに対する応答は、同様であった。ウサギ＃１２８６の場合、終点希釈データは、標的としてＴＭＶ２２６４については利用不能であった。なぜならサンドイッチで使用された捕獲抗体はウサギ由来であったからである。

ＧＤＦ８中和ヤギ＃６６１抗体での結果によって、分子融合物の状況でのＤＪ５領域からのペプチドの提示は、このペプチドが中和抗体の生成のために適切な高次構造をとることを可能にするという仮説がさらに支持される。ウサギ＃１２８６のデータから、ＫＬＨペプチド結合体は、強力な免疫原であるということが明らかであるが、このポリクローナル抗体がＧＤＦ８を中和できないことによって、このペプチドは、グルタルアルデヒド結合体の状況で提示された場合、適切な高次構造をとれないということが示唆される。

実施例２０
ＴＭＶ２６６５、ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６、ＴＭＶ−ＦＶ７またはプロＧＤＦ８タンパク質を用いる免疫後のヤギからの採血の血清学的分析
上記のＴＭＶ融合ベクターの免疫原性を測定するために、２つのさらなる研究を、ヤギを用いて行った。各々の研究は、場所の点を除いて同一であった：１つは、ＰｒｏＳｃｉ，Ｉｎｃ．により本発明者らの指示のもとで行い（ヤギ研究（Ｇｏａｔｓｔｕｄｙ）＃１）、そしてもう一方は、自家で行って、盲検とした（ヤギ研究（ＧｏａｔＳｔｕｄｙ＃２））。成体の乳用ヤギを各々の研究に用いた。各々の研究は以下のとおり行なった：
ヤギに、下の表２９に示されるとおり２ｍＬのワクチンをワクチン接種した。初回のワクチン（０日目）は、完全フロイントアジュバントを含んだが、その後のワクチン用量は、不完全フロイントアジュバントを含んだ。第一のワクチン接種は、首の右側で皮下（ＳＱ）に与えた。その後のワクチン接種は、首の右側と左側の間で変更した。血液サンプルは、０日、２８日、４９日、６３日、７７日および９１日に、真空にしたＳＳＴ血液採取試験管を用いて頸静脈の静脈穿刺によって動物から収集した。血液は、室温で最低２時間凝固させて、遠心分離して、血清を収集した。血清サンプルには動物番号、標本のタイプ、収集日および研究番号を表示した。血清は、−１０℃以下で、アッセイするまで保管した。

試験したワクチン、その物理的形態は以下であった：
・ＧＤＦ８Ｐ２−Ｃｔｅｒｍ（Ｐ２）−可溶性の球状タンパク質
・ＴＭＶ−ＦＶ１−不溶性の沈殿物
・ＴＭＶ−ＦＶ５−可溶性ビリオンおよび沈殿したビリオンの混合物
・ＴＭＶ−ＦＶ６−凝集されたビリオンのロッド
・ＴＭＶ−ＦＶ７−可溶性ビリオンのロッド
ヤギ研究＃１については、動物を最初のワクチン接種の前に採血して（「前採血（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ」）、３度目のワクチン接種の１週後（「採血（ｂｌｅｅｄ）１」）、そして三度目のワクチン接種の２週後（「採血２」）に採血した血清をＥＬＩＳＡによって分析した。ＥＬＩＳＡについては、以下の標的を使用した：
・直接コーティングしたタバコモザイクウイルス（Ｕ１またはＵ５型、ワクチンＴＭＶ足場に相当する）
・ウサギ抗ＴＭＶＵ１ポリクローナルＰＶＡＳ１３５Ｄを使用する、二抗体サンドイッチ（ＤＡＳ）形式でインタクトなロッドとして提示されたタバコモザイクウイルス（Ｕ１またはＵ５型、ワクチンＴＭＶ足場に相当する）
・ＢＳＡに対して結合体化したＤＪ５（２０）ペプチド（図７を参照のこと）。
・ＢＳＡに対して結合体化されたＤＪ５（１２）ペプチド（図７を参照のこと）。
・ＢＳＡに対して結合体化されたＤＪ５（８）ペプチド（図７を参照のこと）。
・ＣＨＯで発現され、精製されたＦＬＡＧタグ化ＧＤＦ８プロホルモン。

間接的なＴＭＶＥＬＩＳＡについては、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で５μｇ／ｍＬに希釈した５０μＬのＴＭＶＵ１またはＴＭＶＵ５を用いて、４℃で一晩または週末にわたって、９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）をコーティングした。コーティング溶液を取り出して、プレートを、０．５％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（商標）２０および２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いて室温で２時間ブロックした（１ウェルあたり２００μＬのブロッキング溶液）。このウェルを１×ＴＢＳＴ緩衝液（ＴＷＥＥＮ（商標）２０を含有するＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）を用いて２回洗浄して、１ウェルあたりに２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む１×ＰＢＳに希釈した５０μＬのヤギ血清を添加した。各々の血清についての３倍階段希釈は、１：５０の初回希釈で開始して行った。ＧＤＦ８Ｐ２−Ｃｔｅｒｍ前採血血清を、全てのプレート上で陰性コントロールとして使用した。

室温で血清との１時間のインキュベーション後、マイクロタイタープレート洗浄器（ＳｋａｔｒｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、このプレートを０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム，２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００で洗浄した。５０μＬのウサギ抗ヤギＨＲＰ結合体化二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ中で１：１０，０００の希釈で添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートして、プレート洗浄器で洗浄し、そして１ウェルあたり５０μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベジジン基質溶液を添加した。ＨＲＰ触媒反応は、５〜２０分間進行させて、５０μＬの１Ｎの硫酸を添加することによって停止させた。このプレート吸光度（ＯＤ）は、９６ウェルプレート分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍで読み取った。

二抗体サンドイッチ（ＤＡＳ）ＥＬＩＳＡについては、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で１：４０００に希釈した５０μＬの抗ＴＭＶポリクローナル抗体ＰＶＡＳ−１３５Ｄを用いて、４℃で一晩または週末にわたって、９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）をコーティングした。コーティング溶液を取り出して、このウェルを、０．５％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（商標）２０、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する２００μＬの１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）を用いて室温で１時間ブロックした。このブロック工程の後、このウェルを１×ＴＢＳＴ緩衝液を用いて２回洗浄して、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ中で５μｇ／ｍＬまで希釈した５０μＬのＴＭＶＵ１またはＴＭＶＵ５のいずれかを、１ウェルあたりに添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートし、次いで、マイクロタイタープレート洗浄器（ＳｋａｔｒｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム，２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００で洗浄した。ヤギ抗体の添加および希釈、二次抗体の添加、ならびにＥＬＩＳＡプレートの発色は、間接的なＴＭＶＥＬＩＳＡについて概説されたプロトコールに従って行った。

ＣＨＯ由来ＧＤＦ８プロホルモンに対するヤギ研究＃１血清の反応性を測定するために、ＥＬＩＳＡはＧＤＦ８プロホルモンでプレートを直接コーティングすることによって行った。ＧＤＦ８は、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で５μｇ／ｍＬに希釈して、１ウェルあたり５０μＬを使用して、４℃で一晩、９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）をコーティングした。ＥＬＩＳＡプロトコールにおける全ての引き続く工程は、間接的なＴＭＶＥＬＩＳＡについて概説されたとおりであった。

ＤＪ５ペプチドに対するＥＬＩＳＡについて（図７）、３つのペプチドであるＤＪ５（２０）、ＤＪ５（１２）およびＤＪ５（８）を、キャリアＢＳＡに結合体化させた。要するに、ペプチドを５０％のＤＭＳＯ中で１ｍｇ／ｍＬに再懸濁して、ＢＳＡおよびグルタルアルデヒドと合わせて、全ての結合対反応について１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１％のグルタルアルデヒドという最終濃度を得た。種々の反応におけるペプチドの最終濃度は以下であった：ＤＪ５（８）、１ｍｇ／ｍＬ；ＤＪ５（１２）、１．４ｍｇ／ｍＬ；およびＤＪ５（２０），２．６ｍｇ／ｍＬ。この反応は、４℃で一晩回転させ、引き続き、１×ＰＢＳに対して透析して未反応のペプチドを除いた。結合は、１０〜２０％のＴｒｉｓ−グリシンゲルでのＰＡＧＥ分析によって確認した。マイクロタイタープレート（９６ウェル）を、３つのＤＪ５ペプチド−ＢＳＡ結合体の各々を用いて４℃で一晩コーティングして、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で５μｇ／ｍＬに希釈した。マイクロタイタープレートコーティングの後に、間接的ＴＭＶＥＬＩＳＡについて概説された手順に従ってＥＬＩＳＡを行った。

ヤギ研究＃１についての抗ＴＭＶ応答のデータを、表３０に表の形式でまとめる。予想どおり、ＴＭＶに対する応答は、Ｐ２ワクチン接種動物では観察されなかった。ＴＭＶペプチド融合物ワクチンについては、抗ＴＭＶ血清の終点希釈における２〜３ｌｏｇ_１０の増大が、間接的ＥＬＩＳＡおよびＤＡＳのＥＬＩＳＡの両方の形式でほとんどのワクチンについて観察された。ＴＭＶ−ＦＶ５ワクチン接種動物の場合は、ＤＡＳ応答は顕著に低かった。これは単に、ＴＭＶＵ１に対して惹起されたポリクローナル抗体であるＰＶＡＳ１３５Ｄ抗体によるＴＭＶＵ５ウイルスの捕獲が劣ることを反映しているのかもしれない。三度目のワクチン接種後、抗ＴＭＶ応答は、ＴＭＶ−ＦＶ６ワクチン接種動物において最高であって、ＴＭＶ−ＦＶ１ワクチン接種動物において応答が最低であると考えられた。この相違は、異なるワクチン形態に起因し得る：ＴＭＶ−ＦＶ６は、溶液中で凝集するインタクトな部分的に可溶性のビリオンとして存在するが、ＴＭＶ−ＦＶ１は、不溶性の沈殿物であって、ここではＴＭＶのロッド様構造が損なわれるようであった。下の表３０は、ヤギ研究＃１由来の血清を試験する、抗ＴＭＶの間接的ＥＬＩＳＡおよび二抗体サンドイッチ（ＤＡＳ）ＥＬＩＳＡについての終点希釈データのまとめを示す。

表３０に示されたデータについては、採血１および採血２は、それぞれ３度目のワクチン接種の７および１４日後に採取した。血清は最初に１：５０に希釈して、各々の血液について二連で３倍階段希釈を行った。終点希釈は、ＯＤ読み取り値がバックグラウンドの２倍であった最高希釈とした。（−）は、ＯＤ読み取りがバックグラウンドの２倍より下であったことを示す。Ｕ１コントロールおよびＵ５コントロールは、それぞれＴＭＶＵ１またはＴＭＶＵ５を含むウェルに相当しており、これを、Ｐ２前採血血清でプローブしたが、これはバックグラウンドにおけるプレート間の変動を説明するために全てのプレート上に存在した。

２０アミノ酸のＤＪ５エピトープを使用する、ヤギ研究＃１由来の血清についてのペプチド特異的ＥＬＩＳＡの結果を、１２のＮ末端および８つのＣ末端のアミノ酸のペプチドと一緒にして、表３１にまとめる。２０アミノ酸のＤＪ５ペプチドのＥＬＩＳＡについて、ＴＭＶペプチド融合ワクチンによって生成された免疫応答は、観察された抗ＴＭＶＵ１応答と極めて接近しており、ＴＭＶ−ＦＶ６ワクチンは、ＴＭＶ−ＦＶ１ワクチンでの１ｌｏｇ_１０の増大に比較して血清終点希釈の２．５ｌｏｇ_１０の増大を生じた。ＧＤＦ８タンパク質を用いる免疫によって生成された応答は、ＴＭＶ−ＦＶ１ワクチンの応答に匹敵していた。ＤＪ５の１２アミノ酸のＮ末端領域を捕獲抗原として使用した場合、血清にまたがるその応答プロフィールは、全長ＤＪ５ペプチド（ＤＪ５（２０））で得られたエピトープと匹敵していたが、終点希釈は、約１ｌｏｇ_１０倍低かった。対照的に、ＤＪ５のＣ末端の８アミノ酸に対する応答は、全てのワクチンについて最小であった。このデータは、ＤＪ５の推定の中和エピトープが、そのペプチドのＮ末端領域に位置するという仮説を支持する。ＤＪ５（２０）対ＤＪ５（１２）−ＢＳＡの結合体に対する終点希釈における１ｌｏｇ_１０の相違は、実施例１９に考察されるように、エピトープの接近性に起因し得る。下の表３１は、ヤギ研究＃１由来の血清を試験する、抗ＤＪ５間接的ＥＬＩＳＡについての終点希釈データのまとめを示す。

表３１によって提示されるデータについては、ＢＳＡに結合体化されたペプチドのアミノ酸配列ＢＳＡ（ＤＪ５（２０）、ＤＪ５（１２）およびＤＪ５（８））を、図７に図示する。３つのペプチドＢＳＡ結合体についての十分なコーティング条件は、前出の表２７に記載した。採血１および採血２は、それぞれ３回目のワクチン接種後７日および１４日で採取した。血清は最初に１：５０に希釈して、各々の採血について３倍階段希釈を二連で行った。終点希釈は、ＯＤ読み取り値がバックグラウンドの２倍であった最高希釈とした。前採血Ｐ２コントロールは、バックグラウンドにおけるプレート間の変動を説明するために全てのプレート上に存在させた。

捕獲抗原としてＧＤＦ８プロホルモンを使用するＥＬＩＳＡも行って、ＤＪ５領域をその天然の状態で認識し得る抗体を惹起するＴＭＶＤＪ５ペプチド融合ワクチンの能力を評価した。表３２はその結果をまとめる。ＴＭＶＤＪ５ペプチド融合ワクチンの全てがＧＤＦ８を認識する抗体を惹起し、ここで３度目のワクチンの１週後（採血１）に観察された終点希釈は、前採血に対して１．５〜２ｌｏｇ_１０の増大であった。観察された力価は、全てのＴＭＶワクチンについて採血２で、ＴＭＶ−ＦＶ６を除いて低下したが、力価は維持された。ＦＶ６ワクチンはまた、最高の終点希釈力価を生じ、これは、抗ＴＭＶおよび抗ペプチドのＥＬＩＳＡを反映しており、そしてＰ２ワクチン接種動物において観察されたものに匹敵する応答を生じた。ＥＬＩＳＡプレートをコーティングするために使用したＦＬＡＧ標的ＧＤＦ８プロホルモンタンパク質の大部分が、通常インビボにおいてフリン（ｆｕｒｉｎ）プロテアーゼ活性によって切断される、ＧＤＦ８のプロポリペプチド領域を保有している。成熟ＧＤＦ８は、種全体にまたがって高度に保存されているが、プロポリペプチド領域は、よりアミノ酸異質性を示す。従って、これらの研究において、陽性コントロール抗原として使用される、ＧＤＦ８Ｐ２のＣ−ｔｅｒｍ（ヒト配列）の大部分は、免疫されたヤギの免疫系によって非自己としてみられるようである。これが観察されたＥＬＩＳＡ血清終点希釈に影響する程度は、未知であるが、この事実は、異なるワクチン群の間の応答を評価および比較することを考慮する必要がある。下の表３２は、ヤギ研究＃１由来の血清を試験する、抗ＧＤＦ８ＥＬＩＳＡの終点希釈データのまとめを示す。

表３２については、ＧＤＦ８のウェルコーティング条件は、前出の表２７に記載のとおりであった。採血１および採血２は、それぞれ三番目のワクチン接種の７および１４日後に採取した。血清は最初に１：５０に希釈して、各々の採血について三倍階段希釈を二連で行った。終点希釈は、ＯＤ読み取り値がバックグラウンドの２倍であった最高希釈とした。

ヤギ研究＃２については、三度目のワクチン接種の７日後の採血を、以下の標的に対してＥＬＩＳＡ形式で評価した：
・直接コーティングしたタバコモザイクウイルス（Ｕ１型のみ）
・ＢＳＡに結合体化されたＤＪ５（２０）ペプチド（図７を参照のこと）
・ＢＳＡに結合体化されたＤＪ５（１２）ペプチド（図７を参照のこと）
ＤＪ５（８）ペプチドは、ヤギ研究＃１について観察されたこの領域に対する応答が劣ることに基づいて、省略した。この研究については、前採血サンプルは利用できず、従って、ヤギ研究＃１からのＰ２前採血を、各々のプレート上の陰性コントロールとして使用した。結果を表３３にまとめる。ＢＳＡに結合体化された全長ＤＪ５ペプチド（ＤＪ５（２０））については、可溶性のＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７ワクチンで最高の終点希釈が得られたが、不要性のＴＭＶ−ＦＶ１ワクチンに対する応答は、１ｌｏｇ_１０低かった。最初の研究と一緒にして、このデータによって、より可溶性のワクチン型であるほど、より強力なＤＪ５特異的な応答を生じ得ることが示唆される。最初の研究については、ＴＭＶＵ１またはＤＪ５ペプチドのいずれかがＥＬＩＳＡ標的抗原であった場合に得られた終点希釈の間に良好な相関が存在した。しかし、本研究では、ＴＭＶ−ＦＶ１ワクチンは、ＴＭＶ−ＦＶ７ワクチンに匹敵する、最高の抗ＴＭＶ応答の１つを生じたが、他の２つのワクチンＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ５についての終点希釈は、３倍低いだけであった。このことは、ワクチンの形態、すなわち、可溶性対沈殿型の間の関係を示しており、そして観察された免疫応答は、ＴＭＶ足場の場合には明快ではないかもしれない。第一の研究でのように、ＤＪ５（１２）ＢＳＡ結合体に対する応答は、ＦＶ７では得られた終点希釈が匹敵したことを除けば、２０アミノ酸ＤＪ５ペプチドについて１〜２ｌｏｇ_１０低かった。下の表３３は、ヤギ研究＃２についての非盲検の結果のまとめを示しており、これは抗ＴＭＶＵ１のＥＬＩＳＡによる血清終点希釈、および全長ＤＪ５ペプチド（２０アミノ酸；ＤＪ５（２０））およびＮ末端の１２アミノ酸（ＤＪ５（１２））のＢＳＡ結合体に対するＥＬＩＳＡにおける血清終点希釈を比較している。

表３３については、種々の標的についてのウェルコーティング条件は、前出の表２７に記載のとおりであった。血清サンプルは、三番目のワクチン接種の７および１４日後に採取した。血清は最初に１／５０に希釈して、各々の採血について三倍階段希釈を二連で行った。終点希釈は、ＯＤ読み取り値がバックグラウンドの２倍であった最高希釈とした。（−）は、ＯＤ読み取りがバックグラウンドの２倍より下であったことを示す。

ヤギ研究＃１およびヤギ研究＃２から得られた血清を使用して、ウエスタンブロットは、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）に記載されたとおりに行った。還元および非還元ＰＡＧＥを、５％βメルカプトエタノールを含有する還元サンプル緩衝液を用いた以外は同じ方式で行った。ウエスタンブロットのデータのまとめは、表３４に示す。

ヤギ研究＃１およびヤギ研究＃２由来の種々のヤギ抗血清はまた、下のとおり、インビトロの転写活性化アッセイによって特徴付けた。ＧＤＦ８生体中和を定量的に測定するために用いられるインビトロの転写活性アッセイは本質的に、Ｔｈｉｅｓら（ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ１８，２５１（２００１））のアッセイである。９６ウェル組織培養物処理した照度計ＶｉｅｗＰｌａｔｅ（商標）アッセイプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬｉｆｅａｎｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に、１．０×１０^５細胞／ウェルのＡ２０４Ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ−８２）を播種して、３７℃、５％ＣＯ_２、加湿チャンバ中でインキュベートした。完全Ａ２０４培養培地は、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地、１０％ウシ胎仔血清、２％のＬ−グルタミンおよび１％のＰｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐからなる。８０％を超えるコンフルエンスに達した際、細胞を、ＦＵＧＥＮＥトランスフェクション試薬（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の製造業者によって推奨されるプロトコールを用いてプラスミドｐＤＰＣ４−ルシフェラーゼおよびＨＣＭＶＩＥ−ｌａｃＺの混合物で一過性にトランスフェクトして、３７℃、５％ＣＯ_２、加湿チャンバ中で１６時間インキュベートした。プラスミドｐＤＰＣ４−ルシフェラーゼは、異種プロモーターレポーター構築物に対してＧＤＦ８応答性を付与する、ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（ＰＡＩ−１）由来の、４コピーのＣＡＧＡボックスを含む。

プラスミドＨＣＭＶＩＥ−ｌａｃＺは、構成的なヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターの制御下にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む。この遺伝子は、トランスフェクション効率の正規化のコントロールとして付加される。次いで、細胞を１００ｎｇ／ウェルのＧＤＦ８タンパク質（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で処理して、さらに１６時間、３７℃，５％ＣＯ_２、加湿チャンバでインキュベートした。ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼは、デュアル・ライト・ルシフェラーゼ・アッセイ（Ｄｕａｌ−ＬｉｇｈｔＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙ）（Ｔｒｏｐｉｘ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を用いて処理された細胞中で定量した。

各々のサンプルは二連（２ウェル）で行った。各々のウェルについてのシグナルは、ルシフェラーゼシグナルをβガラクトシダーゼシグナルで割って１００倍したものとして算出した。サンプルのシグナルは、２つのウェルの平均として算出した。

ヤギ血清サンプルの生体中和活性を試験するために、２００μＬの血清由来のＩｇＧを細胞の処理の前にＧＤＦ８タンパク質とともに（４℃で約１６時間）インキュベートした。阻害パーセントは、１００−（１００×サンプルのシグナル）／（ＧＤＦ８単独でのシグナル−ＧＤＦ添加なしのシグナル）として計算した。

インビトロ転写活性アッセイの結果は、下の表３４にまとめる。各々のワクチン名称についてのデータは、ヤギ研究＃１およびヤギ研究＃２について得られた結果の累積である。成熟ＧＤＦ−８のデータとは、１２．５ｋＤａの成熟ＧＤＦ−８が標的抗原として用いられるウエスタンブロットをいう。

ＥＬＩＳＡデータと一致して、全ての抗原が、標準的なウエスタンブロット法によって試験した場合、処置したヤギでＧＤＦ８特異的な免疫応答を惹起した。生体中和について試験した場合、免疫されたヤギ由来のいくつかの血清は中和された（ＴＭＶ−ＦＶ５、−ＦＶ６および−ＦＶ７）が、抗原ＴＭＶ−ＦＶ１およびＰｒｏＧＤＦ８Ｐ２は、中和抗体をアッセイで検出可能として惹起しなかった。

抗体特異性の１つのさらなる試験では、抗原ＴＭＶ−ＦＶ５（ＤＪ５（２０）−ＴＭＶＵ５−ＴＰＡＴ）は、非変性ウエスタンブロット形式で非変性ＧＤＦ８を認識し得る抗体を惹起できたことが確認された。比較の目的のために、全ての確認された中和抗体−その１つはインビボで生物学的活性が報告された（Ａ１６）はまた、ＧＤＦ８の非変性型と反応する。

このアッセイにおけるＧＤＦ８抗原の非変性型は、科学会ではより「天然（ｎａｔｉｖｅ）」のＧＤＦ８であると認識されており、従って、その推論は、この形式で反応する抗体が生物学的に関連する可能性が高いということである。

これは、ＧＤＦ８の天然型と反応性である抗体を惹起し、かつバイオアッセイで中和し得る組み換えＧＤＦ８ペプチドの初めての実証である。

実施例２１
ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６、ＴＭＶ−ＦＶ７またはプロＧＰＦ８タンパク質での免疫後のブタからの採血の血清学的分析
ブタでの研究のために（ブタ研究＃１）、全部で６つのワクチンを、野性型ＴＭＶＵ１コントロールと一緒に試験した。各々のワクチンまたはコントロールを、２つのアジュバントのうちの１つにおいて２５０μｇの用量で投与して、全部で１４の組み合わせを得た。考慮したアジュバントは、全ての免疫で与えられたＥｍｕｎａｄｅ（水中油型エマルジョン）、または第一のワクチン用量とともに投与された完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、およびその後のワクチン接種のための不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）のいずれかであった。この盲検研究のために、ワクチン／アジュバントの組み合わせ１つあたりに１匹の動物、そして全部で１５匹の動物について１匹の免疫されていないコントロールとした。試験したワクチンは以下であった：
・ＧＤＦ８Ｐ２−Ｃｔｅｒｍ（Ｐ２）
・ＧＤＦ８プロホルモン
・野性型ＴＭＶＵ１
・ＴＭＶ−ＦＶ１
・ＴＭＶ−ＦＶ５
・ＴＭＶ−ＦＶ６
・ＴＭＶ−ＦＶ７
３度目のワクチン接種の７日後に得た血清を、ヤギ研究＃２、すなわちタバコモザイクウイルス（Ｕ１型のみ）、ＤＪ５（２０）ペプチドＢＳＡ結合体、およびＤＪ５（１２）ペプチドＢＳＡ結合体からの血清について使用した同じ標的に対してＥＬＩＳＡ形式で評価した（図７を参照のこと）。マイクロタイタープレートを、標的抗原を、５μｇ／ｍＬで炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で用いて４℃で一晩コーティングした。使用したＥＬＩＳＡプロトコールは、間接的なＴＭＶＥＬＩＳＡ（実施例２０）について概説したものであって、以下の改変をともなった：ウサギ抗ブタＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を、二次抗体としてウサギ抗ヤギ二次抗体の代わりに用いた。その結果を表３５に表形式でまとめる。予想どおり、抗ＴＭＶ応答は、ＴＭＶワクチン接種動物に特異的であって、終点希釈力価は、ワクチン／アジュバント組み合わせのほとんどについてコントロール動物よりも少なくとも２ｌｏｇ_１０高かった。ＴＭＶ−ＦＶ５／フロイントアジュバント組み合わせについては、動物には健康を考慮してわずか２用量しか与えず、そして試験した血清は、第二のワクチン接種の４週後であって、これが観察された応答の低さを説明する。一般には、抗ＴＭＶ免疫応答は、より強力なフロイントアジュバントとともに投与されたワクチンについては、ＴＭＶ−ＦＶ６では逆であったことを除いて、大きかった。ＤＪ５（２０）−ＢＳＡ結合体ＥＬＩＳＡについて、ＧＤＦ８およびＰ２ワクチン接種した動物の血清は、ワクチン接種していないおよびＴＭＶＵ１ワクチン接種したコントロール以下の終点希釈力価を有した。ＴＭＶＤＪ５ペプチドワクチンを投与された動物については、最高の応答は、コントロールよりも１ｌｏｇ_１０高く、一般には、フロイントのアジュバントと組み合わせて投与されたワクチンについて高かった。ワクチン−ＦＶ６についてのみ両方のアジュバントの応答は同様であった。２つのヤギ研究で観察されたとおり、ＤＪ５（１２）−ＢＳＡ結合体のＥＬＩＳＡプレートでの血清の終点希釈は、ＤＪ５（２０）ＥＬＩＳＡに対して、応答した全ての動物で低かった。

ヤギ研究＃２およびブタ研究＃１のＥＬＩＳＡは、並行して処理した。血清終点希釈はヤギ由来血清で実質的に高かったという観察に注意のこと；ヤギ研究でのＥＬＩＳＡは、ブタの研究のＥＬＩＳＡについての２０分間に比較して、５分間発色させられただけであった。このことは、ヤギで得られた抗キャリアおよびペプチド特異的免疫応答が、ブタで観察されたよりも大きかったことを示唆する。成熟ヤギＧＤＦ８タンパク質配列は、ブタ、ウシおよびヒトを含む他の哺乳動物種の配列とは１アミノ酸ずつ異なる；ＤＪ５領域においてＱＡＮＰ（配列番号５８）残基に対してＣ末端であるアルギニンはリジンによって置換される。従って、現在の研究で使用したヒトＧＤＦ８は、ＴＭＶの表面上に提示されたＤＪ５ペプチドと一緒になって、ヤギの真の自己抗原ではなかった。ヤギおよびブタの両方で使用したワクチン用量は同一であったので、これは、ヤギで観察されたさらに強固な応答についての１つの可能性のある説明であり得る。しかし、免疫応答がブタで観察されたという事実は有望である。下の表３５には、ブタ研究＃１についての非盲検の結果のまとめを示しており、ここでは抗ＴＭＶＵ１のＥＬＩＳＡによる血清終点希釈、ならびに全長ＤＪ５ペプチド（２０アミノ酸；ＤＪ５（２０））およびＮ末端の１２アミノ酸（ＤＪ５（１２））のＢＳＡ結合体に対するＥＬＩＳＡにおける血清終点希釈を比較している。

表３５については、種々の標的についてのウェルコーティング条件は、前出の表２７に記載のとおりであった。血清サンプルは、三番目のワクチン接種の７日後に採取した。血清は最初に１：５０に希釈して、各々の採血について三倍階段希釈を二連で行った。終点希釈は、ＯＤ読み取り値がバックグラウンドの２倍であった最高希釈とした。（−）は、ＯＤ読み取りがバックグラウンドの２倍より下であったことを示す。（Ｅ）は、Ｅｍｕｎａｄｅアジュバント；（Ｆ）は、フロイントのアジュバント。

実施例２２
植物におけるＧＤＦ８プロホルモンの発現のためのＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ベクターの構築
ｐＬＳＢ２６６１を生成するために、ＦＬＡＧタグ化ＧＤＦ８（ヒトミオスタチンプロホルモン遺伝子）含有フラグメントを、ＰＣＲによってプラスミド１２０２−３７．３９から増幅した。使用した２つのオリゴヌクレオチドの正確な配列は、それらの関連する配列番号と一緒に、下の表３６に示す。プラスミド１２０２−３７．３９は、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）へＦＬＡＧ−タグ化ヒトｐｒｏＧＤＦ８のヌクレオチド配列を挿入することによって生成された。

このＰＣＲ増幅フラグメントは、ＧＤＦ８プロホルモンの全体的ＯＲＦを含み、その後ろにＦＬＡＧエピトープが続いた。このインサートは、ＰａｃＩおよびＳａｌＩで消化され、そして引き続き、ＢＳＧ１０３７（緑色蛍光タンパク質を発現するＴＭＶベクター；Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅら、米国特許第６，６５６，７２６号Ｂ１）の誘導体である、ベクターＤＮ１５の９．５ｋｂのＰａｃＩ／ＸｈｏＩフラグメントに連結され、これは、レプリカーゼタンパク質中でアミノ酸＃１１７７での「Ｄ」から「Ｎ」の変化（Ｄ１１７７Ｎ）、および移動タンパク質中にアミノ酸＃３０での「Ｐ」〜「Ｒ」の変化（Ｐ３０Ｒ）を含む。これは、プラスミドｐＬＳＢ２６６１の生成を生じ、そしてｐＬＳＢ２６６１におけるＦＬＡＧ−タグ化ＧＤＦ８プロホルモンＯＲＦ領域は、配列決定され確認された（配列番号６１）。下の表３７は、得られた配列に基づいて、ｐＬＳＢ２６６１から発現されたＦＬＡＧタグ化ＧＤＦ８プロホルモン（プロＧＤＦ８ＦＬＡＧ）の最終アミノ酸配列を示す。

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実施例２３
植物において発現されたＧＤＦ８プロホルモンの生成および特徴づけ
ＦＬＡＧタグ化ＧＤＦ８プロホルモンをプラスミドｐＬＳＢ２６６１の転写によって生成した。転写合成、完全性の検証および植物への接種は、実施例９に記載のとおり行った。実施例９に注記のとおり、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ以外の別の宿主植物を、ＦＬＡＧタグ化ＧＤＦ８プロホルモンの生成において使用してもよい。例えば、Ｎ．ｅｘｃｅｌｓｉａｎａまたはＮ．ｔａｂａｃｕｍは、２つの潜在的な別の植物宿主に相当する。接種後日数（ｐｏｓｔｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）（ＤＰＩ）の関数としてＧＤＦ８プロホルモンの発現のレベルを評価するために、浸透移行性に感染された組織の葉の穿孔を５ＤＰＩ〜８ＤＰＩに採取した。この葉の穿孔サンプルを、処理するまで−２０℃で保管した。ｐＬＳＢ２６６１を接種された植物について採取した葉の穿孔サンプルに加えて、未接種の植物、およびＧＦＰを発現するＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ベクターを接種した植物を、コントロールとしてサンプリングした。

葉の穿孔サンプルをＰＡＧＥローディン色素中でホモジナイズして、ＰＡＧＥゲルおよびウエスタンブロット分析で分析した。ウエスタンブロットを、抗ＧＤＦ８ヤギ＃６６１ポリクローナルまたは抗ＦＬＡＧモノクローナル（Ｓｉｇｍａ）のいずれかでプローブした。ＰＡＧＥゲルから、ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）由来Ｕ５コートタンパク質（約２０ｋＤａ）に相当する固有のバンドおよび発現されたＧＦＰ（約３０ｋＤａ）は、ＧＦＰコントロールについて６および８ＤＰＩ（分析した２つの時点）で検出可能であった。これらのバンドの両方とも、未感染のコントロールの場合には存在しなかった。ｐＬＳＢ２６６１感染植物については、Ｕ５コートタンパク質のバンドは、８ＤＰＩでのみ検出可能であったが、植物は５ＤＰＩで症候性であった。他の固有のバンドは、時間経過にまたがってＰＡＧＥゲルで証明された。ヤギ＃６６１抗体を使用するウエスタンブロットについては、約５０ｋＤａで泳動する固有のバンドは、ｐＬＳＢ２６６１接種植物については、７および８ＤＰＩで存在した。このバンドは、５０ｋＤａの分子量を有する未処理のＧＤＦ８プロホルモンに相当する可能性が最も高い。ヤギ＃６６１抗体はまた、同じＤＰＩ範囲にまたがって検出された高分子量の種と交差反応した。未感染およびＧＦＯコントロールのレーンにおける非特異的な交差反応性は最小であった。並行なウエスタンブロットを抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体でプローブした場合、植物宿主タンパク質との交差反応性は大きかった。しかし、ｐＬＳＢ２６６１感染組織からの抽出物を含むレーンについては、ヤギ＃６６１抗体で観察された同じ高いＭＷの種は、スクリーニングした全てのＤＰＩで検出され、同様の分子量の交差反応するバンドはいずれのコントロールにも存在しなかった。５０ｋＤａの種がまた、７および８ＤＰＩで検出されたが、弱い交差反応性バンドが全てのサンプル中で同時に移動した。このデータをまとめると、ＧＤＦ８プロホルモン発現は、植物においてＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）−に基づく発現を用いて得られたということ、および未処理のプロホルモンが主な種として蓄積したということが示される。さらに、高分子量の抗ＦＬＡＧおよび抗ＧＤＦ８反応性種が存在し、これは、ＧＤＦ８プロホルモンの架橋型に相当し得る。しかし、ｐＬＳＢ２６６１ベクターで得られたプロＧＤＦ８ＦＬＡＧ蓄積のレベルは、タンパク質の大規模な経済的な精製および回収を可能にするには不十分であった。ベクター最適化のさらなる相互作用は、植物中のｐｒｏＧＤＦ８蓄積を改善するのに可能であることが注目されるべきである。例えば、天然のプロＧＤＦ８シグナル配列は、植物由来のシグナル配列、例えば、伸長またはαアミラーゼシグナル配列によって、置換されてもよく、このタンパク質は、タンパク質のＣ末端で小胞体（ＥＲ）保持シグナル、例えば、ＫＤＥＬ配列の付加によって小胞体（ＥＲ）で保持され得、そしてプロＧＤＦ８ＯＲＦのコドン利用は、最適化され得、その結果Ｎ．ｔａｂａｃｕｍまたはＴＭＶの好ましいコドン利用が使用される。さらに、これらの異なるストラテジーは、蓄積をさらに改善するために組み合わされ得る。

本発明の多くの改変および変化は、当業者に明白であるとおり、その趣旨および範囲から逸脱することなく行なわれ得る。本明細書に記載される特定の実施形態は、例示としてのみ提供され、そして本発明は、添付の特許請求であって、そのような特許請求が題される等価物の全範囲とともにその範囲によってのみ限定されるものである。多数の引用文献が、本明細書に引用されており、これには、その開示がその全体が参照によって援用される、公開されたおよび／またはインターネットで公開された核酸およびポリペプチド／タンパク質配列のＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号を含む。

図１は、前駆体ＧＤＦ８配列の残基２６６〜３７５由来である、ＧＤＦ８活性領域（すなわち、成熟ＧＤＦ８）における、重複するペプチドＤＪ１〜ＤＪ７を図示する。図２は、引用されたさらなる動物種の前駆体ＧＤＦ８タンパク質に位置されるような、アナログの２０残基のペプチドに比較したヒトＤＪ５ペプチド配列（配列番号８）のアラインメントを図示する。３２１〜３４７のアミノ酸残基位置は、ヒト前駆体ＧＤＦ８に基づく。Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号（本発明において参照によって援用される）は、各々の個々の種の公開されたタンパク質配列全体を特定する。整列されたペプチドは以下の配列番号を有する。

図３は、トバモウイルスの遺伝子組織化および遺伝子発現ストラテジーを概説する。トバモウイルスは、約６．４ｋｂのゲノムＲＮＡを有する。ゲノムＲＮＡは、ｍＲＮＡとして用いられて、レプリカーゼタンパク質を生成するように翻訳される。ＴＭＶは、２つのレプリカーゼタンパク質を生成し、ここでより大きいタンパク質（１８３ｋＤａ）は、アンバー（ＵＡＧ）停止コドンの翻訳リードスルーによって生成される。全てのトバモウイルスは、２つのより小さいコターミナル（ｃｏｔｅｒｍｉｎａｌ）サブゲノム（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を産生する。このコートタンパク質は、最も３’側のｓｇＲＮＡ（１７ｋＤａ）によってコードされ、そしてより大きい（３０ｋＤａ）のｓｇＲＮＡによる移動タンパク質である。ビリオンＲＮＡおよびｓｇＲＮＡはキャッピングされる。トバモウイルスＲＮＡは、ポリアデニル化されないが、３’末端にｔＲＮＡ様構造を含む。図４は、ＴＭＶのゲノム構造ならびにＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｓの構築物および有用性を図示する。（１）は、ＴＭＶゲノムのｃＤＮＡコピー、ならびに、それぞれ移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＰ）およびコートタンパク質（ＣＰ）をコードするサブゲノムメッセンジャーＲＮＡの発現を駆動する２つのサブゲノムのプロモーターの位置（曲がった矢印）を示す。レプリカーゼタンパク質は、ゲノムＲＮＡから翻訳される。ＧＥＮＥＷＡＲＥ（登録商標）ベクター（３）は、さらなるサブゲノムのＲＮＡプロモーターおよび外来遺伝子（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列によって図示される）の挿入のためのマルチクローニング部位の挿入（２）によって構築される。図５は、ＤＪ５エピトープのコートタンパク質融合物の生成に使用された５つのアクセプターベクター（ｐＬＳＢ２２６８、ｐＬＳＢ２２６９、ｐＬＳＢ２１０９、ｐＬＳＢ２１１０およびｐＬＳＢ１８０６）を図示する。５つのベクター全てが同じベースのベクター（ｐＢＴＩ２１５０）由来であった。コートタンパク質を囲む領域はまた、さらに詳細に示すために拡大されている。略号：Ｕ１およびＵ５は、ウイルスのコートタンパク質が、それぞれＴＭＶのＵ１およびＵ５株由来であったことを示す。図６Ａは、ＴＭＶのＵ１およびＴＭＶのＵ５というコートタンパク質株へＤＪ５エピトープをクローニングするために使用されたオリゴヌクレオチド対の全般的な設計を図示する。注：ｎ１ｎ２ｎ３などは、フォワードオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドに相当し、そしてリバースオリゴヌクレオチドにおけるｎ−１ｎ−２ｎ−３などは、フォワードヌクレオチドのリバースの相補体である。フォワード鎖およびリバース鎖を開示している。図６Ｂは、ＴＭＶのＵ１コートタンパク質（配列番号５６）、ＴＭＶのＵ５コートタンパク質（配列番号５７）およびＧＤＦ８由来のＤＪ５ペプチドの末端の１２アミノ酸（配列番号４４）についてのアミノ酸配列アラインメントを図示する。図６Ｃは、ＴＭＶのＵ１コートタンパク質の線図を図示しており、これには表面露出したＮ末端およびＣ末端領域と、ＱＡＮＰ（配列番号５８）残基とを一緒にして、強調している。「ＶＩＳ」は、ウイルス内部表面を示しており、そして「ＶＯＳ」はウイルスの外側表面を示す。図７は、ＤＪ５領域におけるＧＤＦ８アミノ酸配列（配列番号１の残基３１９〜３４６）を図示しており、そしてＤＪ５（２０）、ＤＪ５（１２）、ＤＪ５（８）、ＳＰ２およびＤＪ４エピトープが示される。「Ｎｔｅｒｍ」とは、配列のＮ末端を記しており；「Ｃｔｅｒｍ」は、Ｃ末端を記す。図８Ａおよび図８Ｂは一緒に、Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍのコドン利用を図示する。このコドン利用の表が、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチド（配列番号４５および配列番号４６）および１２アミノ酸のＤＪ５ペプチド（配列番号５２および配列番号５３）のコートタンパク質融合物の生成のためのコドン最適化オリゴヌクレオチドの作成に使用された。各々のアミノ酸に使用したコドンに下線を引く。図８Ａおよび図８Ｂは一緒に、Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍのコドン利用を図示する。このコドン利用の表が、２０アミノ酸のＤＪ５ペプチド（配列番号４５および配列番号４６）および１２アミノ酸のＤＪ５ペプチド（配列番号５２および配列番号５３）のコートタンパク質融合物の生成のためのコドン最適化オリゴヌクレオチドの作成に使用された。各々のアミノ酸に使用したコドンに下線を引く。図９Ａおよび図９Ｂはいっしょに、ＧＤＦ８プロホルモン（配列番号１）をコードする天然のＤＮＡ配列（配列番号２）を図示する。このＤＮＡは、当該分野で周知であるが、本明細書においては単に簡便のために提供する。図９Ａおよび図９Ｂはいっしょに、ＧＤＦ８プロホルモン（配列番号１）をコードする天然のＤＮＡ配列（配列番号２）を図示する。このＤＮＡは、当該分野で周知であるが、本明細書においては単に簡便のために提供する。図１０は、酵母の好ましいコドンを用いて配列番号１を逆翻訳することによって得られる、実施例１によって例示されるコドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号３）を図示する。

Claims

融合タンパク質であって：
（ａ）配列番号１のアミノ酸残基３２７〜３４６を含む、ＧＤＦ８ペプチドドメイン、またはＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントと；
（ｂ）植物ウイルスコートタンパク質、または植物ウイルスコートタンパク質の少なくとも１つのフラグメントと；
を含む、融合タンパク質。
前記植物ウイルスコートタンパク質がトバモウイルスコートタンパク質である、請求項１に記載の融合タンパク質。
前記ＧＤＦ８ペプチドドメインまたは前記ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントが、前記コートタンパク質のフラグメントに融合され；前記トバモウイルスがタバコモザイクウイルス株Ｕ１またはＵ５である、請求項２に記載の融合タンパク質。
配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５４および配列番号５５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の融合タンパク質。
前記ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントが配列番号１のアミノ酸残基３２９〜３３２を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
前記ＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントが配列番号１のアミノ酸残基３２７〜３３８を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
請求項１に記載の融合タンパク質であって、
（ａ）前記コートタンパク質が一本鎖のプラス−センス植物ＲＮＡウイルス由来であり；
（ｂ）前記ＧＤＦ８ペプチドドメインが、
（ｉ）該コートタンパク質のＮ末端
（ｉｉ）該コートタンパク質のＣ末端
（ｉｉｉ）該コートタンパク質のＣ末端由来の４つのアミノ酸、および
（ｉｖ）該コートタンパク質の外部に露出されたループ領域内；
からなる群より選択される位置で該コートタンパク質に融合され；
、該融合タンパク質が、アジュバントがあっても無くても、ＧＤＦ８に対する免疫応答を惹起する、融合タンパク質。
前記ＧＤＦ８ペプチドドメインが、１つ以上のアミノ酸置換を含み、
配列番号１のアミノ酸残基３２７と残基３４６との間に５つ以下のアミノ酸置換が存在し、
該融合タンパク質が、ラットモノクローナル抗体７８８に対して特異的に結合する、請求項１に記載の融合タンパク質。
前記ＧＤＦ８ペプチドドメインが、配列番号１の残基３２８、３２９、３３１、３３３、３３５、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される位置にアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
請求項９に記載の融合タンパク質であって、
（ａ）アミノ酸残基３２８がＨｉｓ、ＬｅｕまたはＡｓｎであり；
（ｂ）アミノ酸残基３２９がＧｌｎまたはＬｙｓであり；
（ｃ）アミノ酸残基３３１がＡｓｎまたはＳｅｒであり；
（ｄ）アミノ酸残基３３３がＡｒｇまたはＬｙｓであり；かつ
（ｅ）アミノ酸残基３３５がＳｅｒ、ＰｒｏまたはＴｈｒである、
融合タンパク質。
前記融合タンパク質が、ラットモノクローナル抗体７８８に対して特異的に結合する条件で、残基３２７〜残基３４６の間に１つ以下のアミノ酸置換を含む、請求項１０に記載の融合タンパク質。
抗ＧＤＦ８抗体の特異的な中和エピトープを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
前記抗ＧＤＦ８抗体が、ラット抗ＧＤＦ８モノクローナル抗体７８８およびヤギ抗ＧＤＦ８ポリクローナル抗血清のＩｇＧ画分からなる群より選択される、請求項１２に記載の融合タンパク質。
アジュバントがあっても無くても、脊椎動物の免疫系に提示される場合、ＧＤＦ８に対する免疫応答を惹起する、請求項１に記載の融合タンパク質。
ヒトＧＤＦ８由来の約４〜約１６個連続するアミノ酸残基を含む、ＧＤＦ８ペプチドの抗原性フラグメントを含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
配列番号２のヌクレオチド１１１２〜ヌクレオチド１１７１を含む、請求項１６に記載の核酸。
請求項１６に記載の核酸を含む複製可能ベクター。
プラスミド、ファージ、コスミドおよびウイルスからなる群より選択される、請求項１８に記載の複製可能なベクター。
トバモウイルスである、請求項１９に記載の複製可能ベクター。
ＴＭＶ−ＦＶ１、ＴＭＶ−ＦＶ２、ＴＭＶ−ＦＶ３、ＴＭＶ−ＦＶ４、ＴＭＶ−ＦＶ５、ＴＭＶ−ＦＶ６およびＴＭＶ−ＦＶ７からなる群より選択されるタバコモザイクウイルスである、請求項２０に記載の複製可能ベクター。
請求項１８に記載の複製可能ベクターを含む宿主細胞。
植物細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
請求項２３に記載の宿主細胞を含むタバコ植物。
ＧＤＦ８ペプチドドメインまたはＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントを含む融合タンパク質を生成する方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項２２に記載の宿主細胞を培養する工程と；
（ｂ）コードされた融合タンパク質を発現する工程と、
を包含する、方法。
融合タンパク質を回収する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
ＧＤＦ８ペプチドドメインまたはＧＤＦ８ペプチドドメインの抗原性フラグメントを含む融合タンパク質を生成する方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項２１に記載のタバコモザイクウイルスを用いてタバコ植物を感染させてこれによって該タバコモザイクウイルスを複製させる工程と；
（ｂ）該複製されたタバコモザイクウイルスを収集する工程と、
を包含する、方法。
前記収集された植物ウイルスから前記融合タンパク質を単離する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
請求項２６に記載の方法によって生成される、融合タンパク質。
請求項２７に記載の方法によって生成される、融合タンパク質。
請求項１に記載の融合タンパク質を含む、ワクチン組成物。
アジュバントをさらに含む、請求項３１に記載のワクチン組成物。
動物における抗ＧＤＦ８免疫応答を惹起する方法であって、請求項３１に記載のワクチン組成物の有効量を該動物に投与する工程を包含する、方法。
動物においてＧＤＦ８活性を下方制御する方法であって、請求項３１に記載のワクチン組成物の有効量を用いて該動物を免疫する工程を包含する、方法。