JP2008522144A - ２次元電気泳動による生体分子の同時分離に関する方法及び装置 - Google Patents

Abstract

２次元電気泳動によって生体分子を同時且つ反復可能に分離する方法、及びこれを実行するのに使用し得る装置について、開示する。特に、本発明は、上述の方法及び装置に係り、特定の化学的及び／又は物理的特性に従って他のマトリックス上に前もって順序付けしたタンパク質、及び／又はポリペプチド、及び／又はペプチド成分をマトリックス上に移動し且つ分離し得るものに関する。

Description

本発明は、生体分子の２次元電気泳動による分離方法に係り、特に、非平行な力線（ｌｉｎｅ ｏｆ ｆｏｒｃｅ）を有する電場を適用することにより達成される、生体サンプルに含まれるタンパク質、及び／又はポリペプチド、及び／又はペプチドの分離方法に関する。

生体分子、特にタンパク質を分離するのに、事実、数多くの技術が使用されている。事実、複数の電気泳動技術（例えば、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動、キャピラリー電気泳動、アイソエレクトロフォーカリゼーション（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ））、及びクロマトグラフィー技術（例えば、イオン交換、アフィニティー、ゲル濾過クロマトグラフィー）が使用されている。公知なように、今日、数千のタンパク質を同時に分離する最も有効な分離方法は、２次元電気泳動（２−Ｄ ＰＡＧＥ）であって、この方法は：
アイソエレクトロフォーカリゼーション（ＩＥＦ、第１の次元）、つまり、等電点に従って、ポリアクリルアミドマトリックス上でのタンパク質の分離と；
タンパク質の一定の荷電／質量の比率（ｃｈａｒｇｅ／ｍａｓｓ ｒａｔｉｏ）が達成される平衡と；
分離量に従ってタンパク質を分離する、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ ＰＡＧＥ、第２の次元）を有するポリアクリルアミドゲル上での電気泳動と；
スポット中に含有するタンパク質を可視化する、ゲルの着色と；
得たデータの加工（ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）と；
スポットのサンプリングと；
を有する。

質量分析やその他の公知の技術などの分析により、サンプリングされたタンパク質の次なる同定を行う。

この技術の詳細は、特許文献１に報告されている。上述の方法のフェーズ（ｐｈａｓｅ）をより良好に一体化することについてのさらなる展開は、近年の特許である、特許文献２乃至４に言及されている。

２次元電気泳動は、プロテオミクスの研究分野の基礎とするものであって、その目的は、細胞内で発現されるタンパク質の全体的なセットを同定することである。その目的は、健常な細胞のタンパク質のセットと、病態の細胞のそれとを比較して、後者の病態の源（ｆｏｎｔ）を同定し、従って、新規で特異的な治療剤の開発を補助することである。

公知なように、この技術は、大量の異なる成分が生体サンプル中に存在するものの分離に欠点があり、この制約は、分離される混合物中に少量で存在する成分の可視化を上回るものである。この欠点は、同様の分子量（ＭＷ）及び等電点（ｐＩ）を有するが存在の度合い、つまり検知可能な量が非常に異なるタンパク質、及び／又はポリペプチド、及び／又はペプチドが存在することにある。このことは、試験するサンプルの多くの部分を同定し得る可能性を少なくするとともに、十分に単離されない単一のスポットを手動で等分することが困難であることにも、関係する。

さらなる欠点としては、単一のタンパク質が他のものと十分に分離されない場合、この単一のタンパク質を特徴付け、且つ可能に同定することが困難であることである：単一のタンパク質からなるスポットである可能性のあるものは、同様の特性を有することなるタンパク質によってしばしば形成される。これらのスポットの特徴付け及び同定（例えば、質量分析などの当業者公知の技術を用いて同定されるもの）は、可能性がなく、又はいくつかの場合、より豊富な量で存在するタンパク質のみを同定することともなる。
米国特許第４，０８８，５６１号明細書 特開昭５８−１９３４４６号公報 米国特許第４，８７４，４９０号明細書 国際公開第０２／２６７７３号パンフレット

本発明の目的は、排他的ではなく、生体分子、特に、タンパク質、及び／又はポリペプチド、及び／又はペプチド成分の分離の分離能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を有意に向上させ得るように、上述の欠点を克服することである。

本発明のその他の目的は、良好な分離能を与え、方法の終期において、出発サンプルから単一の成分の抽出をより実用性の高いものとし、従って、これらの成分の特徴付けをより急速に行い得ることを保証し得る、上述の電気泳動技術を提供することである。

本発明のその他の目的は、出発サンプルの単一の成分をより正確に同定し得るのに適した電気泳動技術を提供することである。

本発明のさらなる目的は、再現可能な様式で、経済的且つ容易に使用し得る電気泳動技術を提供することである。また、本発明のさらに他の目的は、サンプルのロスを軽減しつつ、サンプルの精製／濃縮を行う前段階のステップを最小限とする電気泳動技術を提供することである。

これらの目的、及びその他の目的は、本発明の電気泳動技術によって、満足されるものであって、生体サンプルに含まれる生体分子、特に、特定の化学的及び／又は物理的特徴に従って前もって順序付けされた、タンパク質、及び／又はポリペプチド、及び／又はペプチド成分の分離に適用可能である。

本発明者らにより達成した経験から認識されたように、手段的な観点から、生体サンプルの分離における分解能の制約、特に、同様の特徴（例えば、分子量及び／又は等電点）を有する異なるタンパク質成分については、平行な力線を特徴とする電場の適用、特に２−Ｄ ＰＡＧＥの結果に基づくものである。

本願において提案する本発明は、２次元型の電気泳動技術に関するものであって、特定の化学的及び／又は物理的特徴に従って他のマトリックスＡ上で前もって順序付けされた、生体サンプルのタンパク質、及び／又はポリペプチド、及び／又はペプチド成分をマトリックスＢ上で、移動し且つ分離し得る、非平行な力線を有する電場を用いることを特徴とする。

従って、本発明の目的は、少なくとも１つのサンプルに含まれる生体分子を同時に分離する、２次元電気泳動の方法であって、
前記生体分子が前記生体サンプルに含まれ、化学的及び／又は物理的特性に従って順序付けされる、少なくとも１つの第１マトリックスから、非平行な力線を有する電場の適用により誘導される前記生体分子の移動及び分離の両方を行って、前記生体分子が互いに分離される少なくとも１つの第２マトリックスへと移動するステップを少なくとも有する。

本発明のさらなる目的は、少なくとも１つの生体サンプルに含まれる生体分子を同時に分離する、２次元電気泳動装置であって、当該装置は、前記生体分子が前記生体サンプルに含まれ、化学的及び／又は物理的特性に従って順序付けされる、少なくとも１つの第１マトリックスの内部に、並びに、前記生体分子が分離される第２マトリックスの内部に、非平行な力線を有する少なくとも１つの電場を発生し、この電場によって、前記生体分子が前記第１マトリックスから前記第２マトリックスへと移動され、前記生体分子が分離されることを特徴とする。

斯かる方法、及びこの方法を実行する装置は、同様な化学的及び／又は物理的特徴を有するタンパク質、及び／又はポリペプチド、及び／又はペプチドの分離、並びに蛋白性の性質の成分を有する生体サンプルの特徴付けに好ましく使用される。

本発明の電気泳動の方法及び装置の目的及び利点は、以下の詳細な記載から、よりよく理解され、これにより、本発明の本質的な側面及びその可能な実施例について、言及する。

生体サンプルに含まれる生体分子を同時に分離する、本発明による電気泳動の方法は、十分に支持した十分なマトリックスにおいて、斯かる生体分子、特に、タンパク質、及び／又はポリペプチド、及び／又はペプチドを、非平行な力線を有する電場の適用によって、分離するステップを有し、この方法は、電場の力線が少なくとも２つの電極によって決定付けられ、その少なくとも１つが、正の電荷を有し、少なくとも１つは、負の電荷を有する装置によって実現される２次元電気泳動の方法である。斯かる力線は、検討対象である生体サンプル、又は複数のサンプルを含有する第１のマトリックスＡ、並びに生体分子の成分、特に蛋白性を有するものを移動し分離する第２のマトリックスＢにおいて、斯かる電極の好都合な幾何学的配置、及び／又は上記のマトリックスの形状、及び／又は電極に対する配置、及び／又は斯かる電極と斯かるマトリックスとの間に含まれる導電材料（電解緩衝液）によって、決定される。

電気泳動セル内での好適な配置の例を提供するため、非平行な力線の電場を得るように、パンチ型の電極Ｋ（Ｊと反対の電荷を伴う）を配置した中心の周囲に沿った平面上に、電極Ｊを配置してもよい。

公知なように、電気泳動セルの内部には、異なる要素（容器、マトリックス、電解緩衝液）が存在しており、電極によって発生した電場の力線の方向及び形状に影響を与える可能性がある；従って、再現可能な力線が得られ、実行される生体サンプルの分離の型に適合されるように、上述の要素を順応させ且つ配置することが必要である。

しかしながら、斯かる電極は、電極自体のうち、平面の領域内で連続的又は不連続な電場が実質的に発生するような様式で配置され、電気泳動の分離を実行するサンプルの型に応じて、非平行な力線、好ましくは電場自体の極性に従った、可変な持続時間及び強度の、分岐の又は収束性の電場を発生するように、配置される。

発生する電場の特性は、分離に影響を与える。従って、印加する電圧の選択は、操作者によって決定される適用の時間、マトリックスの寸法及び電極間の距離、システムの伝導度、並びに所望する分離の質的レベルに依存し、一般的に、分離する必要のあるサンプルの型に応じて、約３０〜６００Ｖである。

２次元電気泳動の分離を達成するため、出発物質である生体サンプル又は各種サンプルは、蛋白性材料の電気泳動用として公知の以下の手法によって、処理されてもよい。この場合、検討対象である生体サンプルは、前もって、及び多くの場合、非平行な力線の電場によって電気泳動の分離を行う前に、以下の処理を施される。つまり：
生体分子、特にタンパク質、及び／又はポリペプチド、及び／又はペプチドを、その化学的又は物理的特徴を基礎として第１マトリックス上での第１の分離を行う処理と；
これらの生体分子に、一定の電荷／質量比率を提供するさらなる処理と；
が施される。

第１の次元、つまりマトリックスＡでの分離は、ゾーン電気泳動、ディスク電気泳動、イソタコフォレシス（ｉｓｏｔａｃｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、又はアイソエレクトロフォーカリゼーションによって、両性溶解緩衝液、又はｐＨ傾斜のいずれかの条件で、好適な連続又は粒状の抗対流性のマトリックス上に固定化して、行われてもよい。斯かるマトリックスは、限定的ではないが、ポリアクリルアミド、アガロース、酢酸ゲル、架橋デキストランであってもよい。さらに、斯かる第１の次元用の抗対流性マトリックスは、従来のプラスティック性の支持体（例えば、ゲルボンドＰＡＧ、ゲルボンドアガロース）によって、又は電流に透過性を有する多孔性支持体（例えば、セルロース酢酸シート、ナイロンメッシュ、グラスファイバーシート）によって、支持されてもよい。

本発明の２次元電気泳動に使用可能な第２マトリックスは、連続又は不連続な緩衝液の存在下、分子の質量に基づいて、タンパク質／ペプチド（ネーティブな状態、又は変性剤存在下のいずれか）の分離を最適化するように、一定の濃度のポリマー、又は空隙率がグラジエントのポリマーに代えてもよい。斯かるポリマーは、例えば、アクリルアミドと、ビスアクリルアミド、アガロース、及び／又は酢酸セルロースの混合物であってもよい。

非平行な力線の電場が発生する領域は、第３マトリックス（例えば、アガロース）を添加してもよい、第１のマトリックスＡと第２のマトリックスＢとの間の間質腔（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｓｐａｃｅ）に関して、マトリックスＡとマトリックスＢとの間を連続としてもよく、マトリックスＡからマトリックスＢへのサンプルの移動を可能とする。

他の態様において、第２の次元用に電気泳動セルに好適に挿入される、第１のマトリックスＡは、非平行な力線によって得られる、第１のマトリックスＡと非常に近接して配置された第２のマトリックスＢの、ｉｎ ｓｉｔｕにおける直接重合によって、第２の電気泳動用のマトリックスＢに融合され、これにより、種々の間質腔が消失する。

任意に、上記のサンプルは、サンプルを加熱する熱変性を前もって施されてもよく、或いは、サンプルを例えば、尿素、チオ尿素、界面活性剤、及び／若しくは有機溶媒、又はこれらの混合物などの変性剤と処理することにより、又は例えば、β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、又はトリブチルフォスフィンなどの還元剤による還元によって、前もって化学的に変性されてもよい。その他、変性及び／又は還元の後、サンプルは、任意に、アルキル化されてもよい。このアルキル化剤としては、例えば、ヨードアセタミド、アクリルアミド、Ｎ−置換アクリルアミド、又はビニル−ピリジンであってもよい。

従って、本発明の２次元電気泳動は：
１．生体サンプルを調製すること；
２．化学的及び／又は物理的特徴に従って、生体分子、特に、サンプルの、タンパク質、及び／又は、及び／又はペプチド成分を順序付けするように、第１のマトリックスＡにおいて、第１の分離を行うこと；
３．電荷に基づいて、マトリックスに含まれる各成分を均一化するように、マトリックスＡを処理すること；
４．マトリックスＡを、少なくともひとつの電極と、少なくとも第２の電極に近接して配置された少なくとも１つの第２のマトリックスＢとの間に配置されるように、装置にマトリックスＡを挿入すること；
５．マトリックスが配置され、且つ電場が誘導される、装置の内部の電極の領域に、電解溶液を添加すること；及び
６．化学的及び／又は物理的特徴に従って前もって順序付けされた、タンパク質、及び／又はポリペプチド、及び／又はペプチドを、マトリックスＡからマトリックスＢへと移動するのに適した、非平行の力線を有する電場を適用して、さらなる分離を行うこと；
を提供する。

この２次元電気泳動は、非平行な力線を有する電場を、互いに続いて配置された少なくとも２つのマトリックスを有する領域に適用することを提供し、この領域には、少なくとも第１のマトリックスＡが少なくとも１つの第１の電極に近接し、少なくとも１つの第２のマトリックスＢが、第１のマトリックスＡと、第１の電極と異なる電荷を有する少なくとも１つの第２の電極との間に配置される。

２次元電気泳動が終了すると、各タンパク質は、可視化され、且つマトリックスＢからサンプリングされてもよく、これらは、分離され、且つシークエンシング、及び／又は質量分析、及び／又は当業者に公知のその他の方法によって、同定される。

本発明による方法は、生体サンプルの特徴付けに使用されてもよく、ここで、分離されたタンパク質は、デンシトメトリー、オートラジオグラフィー、ケミルミネッセンス、又はフルオレッセンスによって可視化されてもよく、或いは同定作業が行われる前に、生物学的活性によって検討されてもよい。

従って、第１の態様において、本発明は、１つ以上の生体サンプルを、その成分、特に、特定の化学的及び／又は物理的特徴に従って前もって順序付けされた、タンパク質、及び／又はポリペプチド、及び／又はペプチドの成分に、電気泳動装置の内部で分離することを可能とし、この電気泳動装置は：
非平行な力線を有する電場を発生するのに適した少なくとも２つの電極と；
電極間の領域を内部に有する少なくとも１つの平面であって、非平行な力線を特徴とする電場が発生され、この平面は、各電極間の領域に、互いに近接して配置された少なくとも１つ以上のマトリックスを有するのに適した少なくとも１つの支持体を有し、（ｉ）生体分子、特に、１つ以上のサンプルに由来する、タンパク質、及び／又はポリペプチド、及び／又はペプチド成分が特定の化学的及び／又は物理的特徴に従って、前もって順序付けされる、第１のマトリックスＡと、（ｉｉ）上述の生体サンプルに由来する生体分子が、上記の第１のマトリックスＡで実行したものについてさらなる分離が実行されるように、上記の第１のマトリックスＡから分離させる第２のマトリックスＢとである。任意に、第１のマトリックスＡ及び第２のマトリックスＡは、それぞれが個々の分離した支持体上に配置されてもよく、各マトリックス用の支持体が異なる場合であっても、これらは、同様の平面に含まれ、各電極に対して同様の幾何学性を保持する。斯かる平面は、独立に、水平方向又は垂直方向であってもよい；
装置の一部であっても、外部に結合されたものであってもよい、電場用の少なくとも１つの電源と；
任意に、サーモスタットなどの、システムを所定の一定の温度に保持し得る少なくとも１つの手段と；
を有する。サーモスタットに代えて、装置は、温度調節された設定中に配置されてもよい。

所望の２次元電気泳動の分離を得る目的で、電気泳動用のマトリックスが配置される領域を有する平面は、形状が蛋白性の材料を所望に同時に分離するのに必要な達成しようとする非平行な力線の電場の発生を可能するように適合される限り、例えば、円形、又はその他の形状などの、種々の形状を有してもよい。

可能な実施例において、装置の構造は、実質的に、電気泳動用の円筒セルであり、内部に電極を有する。このセルが閉口されている場合、これは、電極が配置され、電極間に含まれる部分の範囲をさらに定める。さらに、斯かるセルは、短絡が発生せず、或いは適当な電源によって発生した電流が電極間に含まれる領域を通過して分散しないとともに、安全に使用することを保証するように、電気的に非伝導性の公知の種々の材料製であってもよい。斯かる材料は、例えば、ポリメチルアクリレート、ポリカーボネート、ポリプロピレン、又はポリエチレンなどのポリマーや、ガラス、弾性体であってもよい。

さらに、セルは、電流を電極に接続する電気コネクターを有してもよい。

好適な実施例において、セルは、非平行な力線の電場を発生するさらに異なる領域を有してもよい。好ましくは、電場を発生するこの領域は、生体サンプルから蛋白性の材料を分離するのに一般的に使用される種類の十分な支持体上に配置されたマトリックスであって、このマトリックスは、例えば、ポリアクリルアミドの混合物から構成されてもよく、且つ分離の種類に応じた種々の密度を有してもよい。この場合において、異なる生体サンプルからの生体分子の同時の分離を達成してもよい。

上記の電極は、当業者公知の種々の材料から作製され、例えば、白金でコートしたチタンであってもよいが、電極として機能するのに適したその他の材料を除外するものではない。正の電極は、負の電極に対して共通の平面である位置に好ましく配置される。電場が発生する、電極間に配置されるマトリックスは、同一の電極で区切られ、好ましくは、同心円で区切られる。全体としてのセルは、実質的に、円筒形若しくは平行四辺形、又は本発明の目的に適したその他の形態であってもよい。

さらに、非平行な力線の電場が発生する、各マトリックスで形成された異なる領域は、垂直、又は隣り合って重なるように、好ましく配置されてもよい。電極が配置される装置の部分は、電極間、及び非平行な力線の電場が発生する領域に配置されるマトリックス間の連続的な電荷の移動を可能とする電解溶液中に浸漬される。このようにして、分離される蛋白性の材料は、電位差の作用下で移動する。

電解溶液の温度は、調節され、好ましくは、システムを一定の所定の温度に保持するのに適した適当なサーモスタットにより、調節される。

また、装置は、独自の電源を有してもよく、外部電源に接続されてもよい。

本発明の技術を実行する様式は、以下の詳細な記載により、よく開示される通りであって、好適で、非限定的ないくつかの形態を示す添付した図面について、述べる。

図１は、円形の王冠（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｃｒｏｗｎ）の形態で、非平行で分岐した力線の電場を、互いに電気的に異なる２つの電極によって、放射状に拡散して発生する領域を図示したものであって、符号１は、少なくとも１つの電極が配置される電場の外側の部分であり、符号２は、少なくとも１つの第２の電極が配置され上記の第１のものとは異なる電荷を有する内側の部分であり、符号３は、電場によって発生した力線であり、符号４は、電場自体である。

図２は、円形のセクターの形態で、放射状に拡散する力線の電場が少なくとも２つの電極によって発生する領域を概略的に示すものであって、符号１、２、３及び４は、図１と同様のものである。

従って、添付した各図面を参照すると、本発明の目的である、上記の電気泳動の方法を実行するのに使用される装置は、非平行な力線３を特徴とする少なくとも１つの電場４を有し、これは、例えば、カソード２などの少なくとも１つの電極に接続され、且つ例えば、アノード１などの少なくとも１つの第２の電極に接続された電源によって得られるものである。

図３は、生体分子、特に特定の化学的及び／又は物理的特徴に従って順序付けされたタンパク質、及び／又はポリペプチド、及び／又はペプチドを、電源１２に接続された、上述の少なくとも２つの電極１及び２によって発生する、放射線状で、非平行な力線の電場によって、分離するのに使用される、サーモスタット制御された装置の概略図を示し、特に、図３は、リッド８、及び支持ベース７によってその先端を区切られた円筒構造を示す。この支持ベース７は：
冷凍液（ｒｅｆｒｉｇａｔｉｎｇ ｌｉｑｕｉｄ）と；
冷凍効果を拡散するファン１１と；
冷凍液とサーモスタットとのやりとりのためのホール９と；
ファン１１の機能を支持する電源１０と；
を有する。

この装置は、例えば、内部に、生体サンプルを分離する６つの領域を有する。各領域には、化学的及び／又は物理的特徴に従って前もって順序付けされた、生体サンプルが存在し得る各電極２の周囲に符号１３のマトリックスＡ（以下、マトリックスＡ１３とも称する。）が設置され、且つ、個々の支持体１５上であって、電極１とマトリックスＡ１３とで区切られた領域に符号１４のマトリックスＢが設置され、これは、非平行な力線の電場の作用により、マトリックスＡ１３から離れて、生体サンプルの分離を同定するのに適したものであって、従って、生体サンプルをそれぞれの成分に分離する。

本発明の範囲から逸脱することなく、ファン１１、及び冷凍液と、サーモスタット及びファン１１の電源１０とのやりとりのためのホール９は、基底部とは異なる電気泳動セルの一部に局在化されてもよい。

例を提供するため、本発明の方法に従った、生体サンプルについての電気泳動分析について、従来の２次元電気泳動と比較して、言及する。

線維芽細胞のタンパク質の電気泳動分離に関する例
培養したヒト線維芽細胞から蛋白サンプルを得、これを、８Ｍの尿素、４％のＣｈａｐｓ、２％のＩＰＧ緩衝液（ｐＨ４〜７）、及び６０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する蒸留水の溶液に溶解し、これを使用した。

上記の両方の技術において、固定化されたｐＨのグラジエント（この例では、分離範囲は、ｐＨ４〜７）を含有するポリアクリルアミドのマトリックスに、上記の蛋白サンプルを導入し、その後、アイソエレクトロフォーカリゼションによって、それぞれの等電点を基礎として、各成分に分離した。その後、上述の各成分について、一定の荷電／質量比率を最適化するように、このサンプルを、緩衝液で処理した。

緩衝液の成分：
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．８
６Ｍ 尿素
３０％ グリセロール
２％ ＳＤＳ
０．００２％ ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）

従来の２次元電気泳動においては、第１マトリックスに含有されるサンプルは、平行な力線を特徴とする電場の適用によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行するように設計された、方形の第２のポリアクリルアミドマトリックスに移動され、ここで、試験されるべきサンプルの各成分が、それぞれの分子量の作用によって、さらに分離される。

本発明の方法によれば、等電点を基礎として、分離され、且つ平衡化された、サンプルの各成分を含有する第１マトリックスは、円形とされ、円形の王冠の形態の電場の内部に設置され、ここで、試験されるべきサンプルの各成分は、分子量の作用によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実行するように設計された円形の王冠の形態の第２のポリアクリルアミドマトリックスにおいて、さらに分離される。

上記の両方の実験において、第２マトリックスの特徴は、以下の通りである：
成分：
１０％ アクリルアミド
０．４％ Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド
１％ ドデシル硫酸ナトリウム
４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）
０．５％ 過硫酸アンモニウム

両方の実験において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを終了した後、マトリックス及びこれに含まれるサンプルについて、以下のステップを行った：
（ｉ）クマシーブルーを用いた染色を、室温で４時間行った。
（ｉｉ）メタノール及び酢酸を含有する水溶液を用いて、室温で２４時間、脱色を行った。

最後に、トランスミッションスキャナー（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｓｃａｎｎｅｒ）を用いて、デジタル画像の取得を行う。

従来の方法及び本発明の方法を用いて行った各電気泳動間の差異は、ブロモフェノールブルーのトレーサーによって、それぞれ、図４及び図５に示す。図４において、矢印は、電気泳動を行った方向を示す。図５において、電気泳動を行った後のトレーサーが観察される。図６及び図７において、従来の方法（図６）を用いて行った一群のタンパク質のスポットと、本発明の方法（図７）を用いて行った一群のタンパク質のスポットとの差が認められる：つまり、本発明の技術によって、各スポット間の相対距離が、放射状に分離するため、増加し、分離能の増加が可能となる。斯かる放射状の分離がない場合には、図面に示すように、図７で観察されるようなスポットを互いに区別することは不可能である。

本発明を示し、且つ本発明を限定する目的ではなく提示した本発明の実施例の幾つかの形態について言及したが、本発明の種々の改変及び変法は、上述の観点から、当業者には明らかであろう。いずれにしても、本発明は、添付した特許請求の範囲の包含される全ての改変及び変法を包含することを意図するものである。

２つの電極で発生する放射状に拡散する電場の例の概略図である。 ２つの電極で発生する放射状に拡散する、円形の一部の形態である電場の例の概略図である。 生体分子、特に、特定の化学的及び／又は物理的特徴に従って順序付けされた、タンパク質、及び／又はポリペプチド、及び／又はペプチドを、放射状に拡散する非平行な力線の電場によって、分離するのに適した装置の可能な実施例の概略図である。 従来の２次元電気泳動によって分離した線維芽細胞のタンパク質を、ブロモフェノールブルーで発色した移動先端である。 本発明による２次元電気泳動によって分離した線維芽細胞のタンパク質を、ブロモフェノールブルーで発色した移動先端である。 従来の２次元電気泳動によって、分子量を基礎として分離した線維芽細胞のタンパク質の分離像である。 本発明による２次元電気泳動によって、分子量を基礎として分離した線維芽細胞のタンパク質の分離像である。

符号の説明

１ 電極
２ 電極
３ 力線
４ 電場
７ 支持ベース
８ リッド
９ ホール
１０ 電源
１１ ファン
１２ 電源
１３ マトリックスＡ
１４ マトリックスＢ
１５ 支持体

Claims (30)

1. 少なくともひとつの生体サンプルに含まれる生体分子を同時に分離する２次元電気泳動の方法であって、
   少なくとも１つの第１マトリックスから、少なくとも１つの第２マトリックスに移動するステップを少なくとも有し、
   前記第１マトリックスにおいて、前記生体分子は、前記生体サンプルに含まれ、且つ化学的及び／又は物理的特徴に従って順序づけされ、
   前記第２マトリックスにおいて、前記生体分子は、互いに分離され、
   前記の生体分子の移動及び分離は、非平行な力線を有する電場の適用によって、誘導されることを特徴とする２次元電気泳動の方法。
2. 前記のサンプルに含まれる生体分子の第１の分離を第１マトリックス上で実行するように、前記のサンプルを処理するステップと；
   前記生体分子に一定の荷電／質量の比率を与えるように、前のステップで得たサンプルを含有する前記第１マトリックスを処理するステップと；
   をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の２次元電気泳動の方法。
3. 第１の次元における分離は、ゾーン電気泳動、ディスク電気泳動、イソタコフォレシス、両性の溶解性緩衝液におけるアイソエレクトロフォーカリゼーション、又は適した抗対流マトリックスを介した固定化されたｐＨのグラジエントにより、行われることを特徴とする請求項２に記載の２次元電気泳動の方法。
4. 前記抗対流マトリックスは、連続的、又は顆粒化されたものであり、且つポリアクリルアミド、アガロース、酢酸ゲル、又は架橋デキストランからなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の２次元電気泳動の方法。
5. 前記の第１の次元用の前記抗対流マトリックスは、電流に透過性を有するプラスティック支持体又は多孔性支持体に支持されていることを特徴とする請求項３に記載の２次元電気泳動の方法。
6. 前記支持体は、プラスティック製の場合、ゲルボンドＰＡＧ、及びゲルボンドアガロースからなる群から選択され、多孔性支持体の場合、酢酸セルロースシート、ナイロンメッシュ、及びガラス繊維シートからなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の２次元電気泳動の方法。
7. 第２の次元用に電気泳動セルに十分に挿入される、前記第１マトリックスは、２つのマトリックス間の間質腔を消失するように、前記第２マトリックスの直接ｉｎ ｓｉｔｕ重合によって、前記第２マトリックスに融合されていることを特徴とする請求項１に記載の２次元電気泳動の方法。
8. 前記第２マトリックスは、連続又は不連続な緩衝液が存在する、一定の濃度のポリマー、又は多孔質のグラジエントの状態であるポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の２次元電気泳動の方法。
9. 前記ポリマーは、アクリルアミド、ビスアクリルアミド、アガロース、及び酢酸セルロースの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の２次元電気泳動の方法。
10. ２次元電気泳動の分離の前に、前記のサンプルをさらに処理するステップであって、任意で変性及び／又は還元を行うステップを有することを特徴とする請求項１に記載の２次元電気泳動の方法。
11. 前記変性は、熱的であり、且つサンプルを加熱することにより、誘導され、又は変性剤及び／若しくは還元剤を添加することにより得られる化学的なものであることを特徴とする請求項１０に記載の２次元電気泳動の方法。
12. 前記変性剤は、尿素、チオ尿素、界面活性剤、及び／若しくは有機溶媒、又はこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の２次元電気泳動の方法。
13. 前記還元剤は、β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、及びトリブチルフォスフィンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の２次元電気泳動の方法。
14. 電気泳動の分離の前に、前記サンプルをさらに処理するステップであって、任意で、変性及び／又は還元を行い、続いてアルキル化を行うステップを有することを特徴とする請求項１に記載の２次元電気泳動の方法。
15. 前記アルキル化は、ヨードアセタミド、アクリルアミド、Ｎ−置換アクリルアミド、及びビニルピリジンからなる群から選択された薬剤で実行され得ることを特徴とする請求項１４に記載の２次元電気泳動の方法。
16. 請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の方法を使用することを特徴とする、生体複合サンプルを特徴付けることを特徴とする方法。
17. 前記第２マトリックスに含まれる生体サンプルを可視化し、電気泳動的に分離するステップをさらに有することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. 前記可視化は、デンシトメトリー、オートラジオグラフィー、ケミルミネッセンス、蛍光取得、又は生物活性による検討によって、実行され得ることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
19. 少なくとも１つの生体サンプルに含まれる生体分子を同時に分離する２次元電気泳動の方法であって：
    生体サンプルを調製するステップと；
    化学的及び／又は物理的特徴に従って、前記のサンプルに含まれる生体分子を順序付けするように、少なくとも１つの第１マトリックス上で最初に分離を行うステップと；
    荷電に基づいて、前記のサンプルの前記生体分子を均一にするように、前記第１マトリックスを処理するステップと；
    少なくとも１つの電極を有する装置に前記第１マトリックスを挿入し、前記第１マトリックスを、前記電極の第１電極と、前記電極の第２電極に近接して設置された少なくとも１つの第２マトリックスとの間に設置するステップと；
    前記装置の内部であって、前記の電極間に含まれ、非平行な力線を有する電場が発生する前記のマトリックスを有する領域に、電解溶液を添加するステップと；
    前記の電極第の領域に、非平行な力線を有する少なくとも１つの電場を発生するステップであって、前記マトリックスは、前記第１マトリックス上で前もって順序付けされた前記生体分子を、さらなる分離を行う前記第２マトリックスに移動するように、設置される、ステップと；
    を有することを特徴とする２次元電気泳動の方法。
20. 少なくとも１つの生体サンプルに含まれる生体分子を同時に分離する２次元電気泳動の装置であって、
    当該装置は、前記生体サンプルの前記生体分子が、化学的及び／又は物理的特徴に従って、順序付けされる、少なくとも１つの第１マトリックスの内部と、前記生体分子が分離される、少なくとも１つの第２マトリックスの内部とで、非平行な力線を有する電場を発生し、
    前記の発生した電場によって、前記生体分子は、前記第１マトリックスから第２マトリックスに移動し、且つ前記生体分子が分離されることを特徴とする装置。
21. 前記電極及び／又は前記マトリックスの適切な幾何学性、及び／又は前記電極に対する設置、及び／又は前記電極と前記マトリックスとの間の導電材料によって規定される、力線を有する電場を発生する少なくとも２つの電極を有することを特徴とする請求項２０に記載の電気泳動装置。
22. 前記の少なくとも２つの電極は、互いに近接するように設置された前記第１マトリックス及び第２マトリックス並びに導電材料を含むのに適した領域内に設置されることを特徴とする請求項２１に記載の電気泳動装置。
23. 前記電極の第１のものは、外周に沿った平面上に設置され、
    前記電極の第２のものは、前記外周の中心に設置され、
    前記第２の電極は、パンチ型の電極であり、前記第１の電極と反対の電荷を有することを特徴とする請求項２０又は２１に記載の電気泳動装置。
24. 前記第１マトリックスは、第３のマトリックスを保持するのに適した間質腔によって、前記第２マトリックスと分離され、前記第３のマトリックスは、前記第１マトリックスと第２マトリックスとが連続するように、適合されることを特徴とする請求項２０に記載の電気泳動装置。
25. 前記の非平行な力線を有する電場は、分離されるサンプルに依存した、持続時間及び強度の点で、連続又は不連続であることを特徴とする請求項２０に記載の電気泳動装置。
26. 電気泳動の全体の間、温度を制御するのに適することを特徴とする請求項２０に記載の電気泳動装置。
27. 少なくとも１つの生体サンプルに含まれる生体分子を同時に分離する２次元電気泳動の装置であって、
    少なくとも１つの平面上の特定の領域において、電場を発生するのに適した、少なくとも２つの電極を有し、
    前記電場は、非平行な力線を有し、
    前記の少なくとも１つの平面は、前記の電極間の前記の特定の領域において、互いに近接するように設置された１つ以上のマトリックスを有するのに適した少なくとも１つの支持体を有し、
    （ｉ）少なくとも１つの第１マトリックスであって、１つ以上の生体サンプルに由来する前記生体分子を、化学的及び／又は物理的特徴に従って前もって順序付けし、少なくとも１つの前記第１電極に近接して設置される、第１マトリックスと；
    （ｉｉ）少なくとも１つの第２マトリックスであって、前記生体サンプルに由来する前記生体分子を、前記第１マトリックスで得られたものに対してさらに分離するように、前記第１マトリックスから移動させ、前記第１マトリックスと、少なくとも１つの前記第２電極に近接した間に設置される、第２マトリックスと；
    （ｉｉｉ）導電材料として使用される電解溶液と；
    （ｉｖ）当該装置自体の一部であっても外的に接続され得るものであってもよい、電場用の少なくとも１つの電源と；
    をさらに有することを特徴とする装置。
28. 一定の温度を保持するのに適した少なくとも１つの手段をさらに有することを特徴とする請求項２７に記載の、生体分子を同時に分離する２次元電気泳動の装置。
29. 前記電場は、前記電極の適切な幾何学性、及び／又は前記マトリックスの形状、及び／又は前記電極に対する設置、及び／又は前記電極と前記マトリックスとの間の導電材料の形状によって規定される非平行な力線を有することを特徴とする請求項２７又は２８に記載の、生体分子を同時に分離する２次元電気泳動の装置。
30. 生体サンプルを特徴づけるための、請求項１乃至１９のいずれか一項に記載の方法の、又は請求項２０乃至２９のいずれか一項に記載の装置の、使用。