JP2008515929A - 脂質連結部分を予備形成した脂質集合体にマイクロ波を使用して挿入する方法 - Google Patents
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Abstract
平面状脂質一重層若しくは平面状脂質二重層、球状脂質ベシクル、ミセル、又はエマルションエンベロープ一重層などの脂質集合体に、脂質連結部分を挿入する方法が記載される。本方法においては、脂質集合体と脂質連結部分とをマイクロ波照射下で接触させて、脂質連結部分を脂質集合体と会合可能にする。一実施形態では、脂質集合体はリポソームであり、脂質連結部分は脂質ポリマーである。前記方法に従って調製される、脂質層と脂質連結部分とを含む組成物もまた記載される。
Description
本明細書に記載される主題は、脂質の外側表面に脂質ポリマー(lipopolymer)が挿入されている脂質構造体の調製方法に関する。脂質ポリマーは、脂質構造体が形成された後に、脂質ポリマーのポリマー部分が脂質表面から延びるような方法で脂質構造体に組み込まれる。幾つかの実施形態では、脂質ポリマーは、共有結合させた診断用、治療用又はターゲッティング用リガンドを含む。より詳しくは、本明細書に記載される主題は、共有結合させた診断用、治療用又はターゲッティング用リガンドと共に又はそれら無しに脂質二重層に脂質ポリマーが組み込まれている、ミセル及びリポソームなどの脂質構造体を調製する方法に関する。
脂質二重層は、閉じた球状ベシクル状、平面シート状、平たいディスク状、小球状、チューブ状及びらせん状などの様々な異なる構造体を形成する、疎水的相互作用によってまとまっている脂質の集塊である(Kunitake,T.Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.,31:709(1992))。このような脂質二重層集合体は、種々の脂質から自然に生成するものであり、様々な技術分野での用途がある。例えば、平面状脂質二重層の集合体は、ターゲット分析対象物を検出するための光学センサーとして(米国特許第5,616,790号)、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド用のユニークな分離材料、すなわち固定化した人工膜として(Pidgeon,C.et al.、Anal.Biochem.、176:36(1989))、バイオセンサーとして(H.T.Tien et al.in “Molecular Electronics:Biosensors and Biocomputers”、ed.F.T.Hong,Plenum Press,New York(1989)259−268ページ参照)、また脂質−水界面におけるリガンド−受容体相互作用を調べるための平面二重層膜として(国際公開第98/23948;国際公開第01/26800;米国特許第5,922,594号)使用される。リポソームなどの球状の二重層脂質微粒子も、医薬又は診断剤の担体としての用途がある。
多くの場合、脂質二重層に、試験材料又は反応成分を結合する又は固定することが望ましい。例えば、多くの種類の分析化学手法は、1つ以上の反応の成分を固定することによって行うことができる。イムノアッセイ手法は、通常、成分の1つを脂質表面に固定することを必然的に含む。検定試料を脂質表面全面にわたって洗い流すと、固定された成分に対して結合親和性を有する検定試料中の成分が、検出用に捕捉される。
ミセル及びリポソームなどの閉じた球状脂質ベシクルの場合、様々な目的で、分子をベシクルの外側表面に結合させることが多い。例えば、結合させた分子は治療剤であってよいが、そのような薬剤を脂質二重層に結合させることは、その薬剤の薬物動態を変える役割をする(例えば、米国特許第6,326,353号参照)。結合させた分子は、in vivoに投与した後、そのベシクルを所望の部位に導く又は「標的にする」役割をするターゲッティング部分であってよい(例えば、Allen.T.M.,et al.、Biochim.Biophys.Acta、1237:99−108(1995);Blume,G.,et al.、Biochim.Biophys.Acta、1149:180−184(1993);米国特許第6,316,024号、米国特許第6,214,388号参照)。通常、リガンドは、リンカーを介して、多くの場合ポリマー鎖を介してリポソーム表面に結合される。
通常、結合したリガンドを有する脂質ベシクルは、幾つかの手法のうちの1つによって調製される。1つのアプローチは、末端機能化脂質−ポリマー誘導体、すなわち遊離ポリマー末端が反応性である又は「活性化されている」脂質−ポリマーコンジュゲートを含む脂質ベシクルを調製することを必然的に含む(例えば、Zalipsky et al.、Bioconjugate Chem.,4:296(1993);Zalipsky et al.、FEBS Letters、353:71(1994);Zalipsky et al.、J.Control.Rel.、39:163(1996);Zalipsky et al.、Bioconjugate Chem.,8(2):111(1997)参照)。脂質−活性化ポリマーコンジュゲートは、リポソームが形成されている間の脂質混合物に含まれている。リポソームが形成された後は、活性化されたポリマーの末端は所望のリガンドと反応する(Zalipsky et al.、Bioconjugate Chem.,4:296(1993))。このアプローチの欠点は、活性化された末端全てをリガンドと反応させることが困難であることである。また、このアプローチでは、リポソーム組成物から未反応のリガンドを分離する工程が引き続き必要となる。
別のアプローチでは、脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートは調製され、リポソーム形成時に脂質組成物中に含まれる(Zalipsky et al.、Bioconjugate Chem.,8(2):111(1997))。このアプローチは、貴重なリガンドの一部がリポソーム内側の水性の小区画の方を向き、意図する標的との相互作用に利用できないという欠点がある。
また別のアプローチでは、リポソームの懸濁液を脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートのミセル懸濁液と共にインキュベートして、リポソームの二重層に前記コンジュゲートが挿入される(例えば、Uster et al.、FEBS Letters、386:243(1996);Zalipsky et al.、Bioconjugate Chem.,8(2):111(1997);米国特許第5,891,468号、米国特許第6,316,024号参照)。このアプローチでは、もしインキュベーションの条件が好適であり十分時間をかけることができるならば、コンジュゲートの挿入はうまく行われる。ある場合には、長時間のインキュベーション又は挿入達成に必要な温度によって、リガンドの不活性化及び/又はリポソーム成分の放出に至ることがある。
このように、当技術分野においては、予備形成した脂質集合体に所望のリガンドを結合させる方法が必要とされている。
上述の関連技術例及びそれら技術例に関連する限界は、説明のためのものであってそれらに限定しようとするものではない。それら関連技術が有するその他の限界については、本明細書を読み、添付の図面を検討すれば、当業者には明らかとなろう。
以下に記載の本発明の態様及びその実施形態は、例示及び説明を意図したものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
一態様では、予備形成した脂質集合体に脂質連結部分を挿入する方法が提供される。
別の態様では、脂質二重層集合体に脂質−ポリマーを挿入する方法が提供される。
別の態様では、分析手法を実施するに十分な時間又は所望の終点を達成するに十分な時間、脂質連結部分を脂質二重層集合体に固定する方法が提供される。
別の態様では、脂質二重層集合体に脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートを挿入する方法が提供される。
さらに具体的には、一態様では、脂質集合体に脂質連結部分を挿入する方法が記載される。その方法は、脂質集合体と脂質連結部分とを、その脂質連結部分が脂質集合体と会合可能となるに効果的なマイクロ波エネルギーの存在下で接触させることを含む。前記脂質集合体は、合成脂質集合体であっても又は生体脂質集合体であってもよいが、天然又は合成脂質から調製される合成脂質集合体であることが好ましい。
様々な実施形態において、前記脂質集合体はミセル、エマルションエンベロープ一重層、脂質二重層、脂質一重層、リポソーム等である。
一実施形態では、前記脂質集合体はベシクル形成脂質で構成される。一実施形態では、ベシクル形成脂質は、その相転移温度が約50℃を上回りうる。
別の実施形態では、脂質連結部分は、脂質−ポリマー化合物である。より好ましい実施形態では、脂質連結部分は、脂質−ポリエチレングリコール化合物である。他のより好ましい実施形態では、脂質連結部分は、脂質−薬物部分又は脂質−生物学的リガンド部分である。典型的な生物学的リガンドは、抗体又は抗体断片などのペプチド又はタンパク質、また、これに限定されないが、一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNAオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、断片を含む核酸分子、等である。一実施形態では、生物学的リガンドは、細胞表面受容体、血液中病原体などの結合相手に対する結合親和性を有する。
別の実施形態では、脂質連結部分は、脂質−ペプチド模倣部分である。
別の実施形態では、脂質集合体は、封入された治療剤を含有するリポソームである。この実施形態では、脂質連結部分は、脂質−ポリマー、脂質−生物学的リガンド化合物、又は脂質−ポリマー−生物学的リガンドコンジュゲートの形態をとることが好ましい。細胞表面受容体に対して結合親和性を有する生物学的リガンドは代表的な例である。
別の実施形態では、その外側表面から脂質連結部分が延びているリポソームを含むリポソーム組成物を調製する方法が記載される。この方法は、リポソームの懸濁液と脂質連結部分のミセル懸濁液とを、前記脂質連結部分がリポソームと会合可能となるに効果的なマイクロ波エネルギー源の存在下で接触させることを含む。
一実施形態では、前記マイクロ波エネルギー源は、約500〜50,000ジュールの範囲のエネルギー、より好ましくは約10,000〜40,000ジュールの範囲のエネルギーを提供する。
別の実施形態では、前記リポソームは、封入された治療剤を有している。
また別の実施形態では、前記脂質連結部分は、脂質−ポリエチレングリコール部分などの脂質−ポリマー部分である。別の実施形態では、前記脂質連結部分は、脂質−薬物部分である。別の実施形態では、前記脂質連結部分は、脂質−生物学的リガンド部分又は脂質−ポリマー−生物学的リガンドコンジュゲートである。
また本発明の別の態様では、脂質層と脂質連結部分とを含む脂質集合体が開示される。前記脂質連結部分は、マイクロ波エネルギー源照射によって、前記脂質層と安定して会合している。様々な実施形態において、前記脂質連結部分は、脂質ポリマー又は脂質ポリマー−リガンドである。一実施形態では、脂質集合体はリポソームを含まない。
先に記載した態様及び実施形態の例に加え、更なる態様及び実施形態が、添付の図面を参照し、以下の説明を検討することによって明らかとなろう。
1.定義
「マイクロ波」とは、周波数約300MHzから300GHz、波長約1メートル(m)〜1ミリメートル(mm)の範囲の電磁スペクトルを意図している。好ましい実施形態では、マイクロ波は、周波数約800MHzから300GHz、波長約37.5センチメートル(cm)〜1ミリメートル(mm)の範囲の電磁スペクトルを意図している。
「マイクロ波」とは、周波数約300MHzから300GHz、波長約1メートル(m)〜1ミリメートル(mm)の範囲の電磁スペクトルを意図している。好ましい実施形態では、マイクロ波は、周波数約800MHzから300GHz、波長約37.5センチメートル(cm)〜1ミリメートル(mm)の範囲の電磁スペクトルを意図している。
「マイクロ波オーブン照射」とは、これに限定されないが、食物又は飲料を加熱又は調理するために使用されるマイクロ波オーブンに代表されるようなマイクロ波オーブンでの照射を意図している。このようなオーブンは、通常、約2.45GHzで作動し、その波長は1mmから30cmの範囲である。
「生体関連リガンド」とは、受容体又は病原体などの結合相手と特異的に結合する能力のある分子のことを言う。リガンドの細胞受容体への結合は、一般に、高い結合親和性、すなわちKm>105を特徴としており、例えば、受容体の機能の変化(例えば、イオンチャンネルの開口)によって、又は受容体近傍の環境の変化(例えば、表面プラズモン共鳴による結合の検出)として検出することができる。脂質二重層に組み込むためのリガンドは、化学的に合成するか、組換えによって生成するか、細胞から精製するか、又はその他の手段によって得ることができる。
「受容体」とは、生体関連リガンドと特異的に相互作用する能力のある分子を意図している。細胞において、受容体は通常、細胞の脂質二重層膜と会合している。本明細書に記載した各種手法を使用して脂質二重層に組み込むための受容体は、化学的に合成する、組換えによって生成する、細胞から精製するなどによって得ることができる。
結合が、あるタンパク質が別のタンパク質に「非特異的に」くっつくことに起因しているのではなく、受容体の結合部位とリガンドとの間の分子の相互作用に起因している場合、その結合は「特異的」である。
「脂質ポリマー」とは、「脂質−ポリマー」と交換可能に使用され、親水性ポリマー鎖に共有結合している疎水性部分を意図している。幾つかの好ましい例では、前記疎水性部分は、2つの炭化水素鎖を有する脂質である。「脂質−ポリマー−コンジュゲート」又は「脂質ポリマー−コンジュゲート」とは、結合した又は会合したリガンドを有する脂質ポリマーのことを言う。前記リガンドは、例えば、生体関連リガンド、診断用リガンド、反応性部分、治療用化合物などであってよい。
II.調製方法
脂質連結部分が組み込まれた脂質集合体の調製方法が提供される。前記脂質集合体は、通常、ひとまとめにして脂質「層」と呼ばれる脂質一重層又は脂質二重層を有する集合体である。脂質連結部分は、脂質連結部分の疎水性部分、一般には脂質が集合体の脂質層に挿入され、そして、脂質連結部分の反対の部分が集合体の表面から、例えば外部の媒体の中へ延びるような方法で、集合体の脂質層に組み込まれる。脂質連結部分の種々の例については、以下に検討する。用語「脂質連結」における「脂質」とは、脂質で代表されるようないかなる疎水性部分をも包含するものとする。前記疎水性部分は、1つ、2つ若しくはそれ以上の炭化水素鎖を有する脂質であってよく、又はコレステロール若しくはそのアナログなどの炭化水素鎖を欠く疎水性部分であってもよい。実質的には、脂質集合体に組み込むのに好適な疎水性部分はいずれも好適であり、また企図されるものである。疎水性の「脂質」は、選択された部分、例えば、これらに限定されないが、薬物、ポリマー、親水性ポリマー、タンパク質、ペプチド、核酸(RNA、DNA、一本鎖、二本鎖)、炭水化物などに好適な化学的結合を介して結合される。本発明を限定しない具体的な例を以下に挙げる。
脂質連結部分が組み込まれた脂質集合体の調製方法が提供される。前記脂質集合体は、通常、ひとまとめにして脂質「層」と呼ばれる脂質一重層又は脂質二重層を有する集合体である。脂質連結部分は、脂質連結部分の疎水性部分、一般には脂質が集合体の脂質層に挿入され、そして、脂質連結部分の反対の部分が集合体の表面から、例えば外部の媒体の中へ延びるような方法で、集合体の脂質層に組み込まれる。脂質連結部分の種々の例については、以下に検討する。用語「脂質連結」における「脂質」とは、脂質で代表されるようないかなる疎水性部分をも包含するものとする。前記疎水性部分は、1つ、2つ若しくはそれ以上の炭化水素鎖を有する脂質であってよく、又はコレステロール若しくはそのアナログなどの炭化水素鎖を欠く疎水性部分であってもよい。実質的には、脂質集合体に組み込むのに好適な疎水性部分はいずれも好適であり、また企図されるものである。疎水性の「脂質」は、選択された部分、例えば、これらに限定されないが、薬物、ポリマー、親水性ポリマー、タンパク質、ペプチド、核酸(RNA、DNA、一本鎖、二本鎖)、炭水化物などに好適な化学的結合を介して結合される。本発明を限定しない具体的な例を以下に挙げる。
本明細書においては、前記調製方法は、脂質連結部分として脂質ポリマーを使用する例で表される。以下に記載する一実施形態では、脂質ポリマーはさらにリガンドを含む。前記リガンドは、生体関連リガンド、診断用分子又は反応性部分であってよい。前記リガンドは一般に脂質ポリマーに共有結合しているが、静電的引力又はファンデルワールス引力などによって脂質ポリマーと「会合」している可能性もある。共有結合している場合のリガンドは、脂質ポリマーにおけるポリマーの遊離末端に結合していてよい。また、脂質ポリマーの脂質がリン脂質の場合、リガンドは、3価のホスホジエステル結合に結合していてもよい。前記リガンドは、治療活性を有するか又は治療活性は有しないがターゲッティングリガンド若しくは結合リガンドとして作用する、生体関連リガンドであってよい。前記リガンドはまた、蛍光タグから放射線増感剤にまでわたる診断用化合物であってもよい。前記リガンドは、有機薬物などの治療用化合物であってもよい。本発明は、リガンドが、脂質ポリマーが脂質構造体に組み込まれた後に反応可能な反応性部分であることも企図するものである。さらに付け加えられるリガンド例を以下に記載する。
脂質ポリマーがリガンド、特に生体関連リガンドを含んでいる実施形態では、好ましい配置は、リガンドが脂質ポリマーにおけるポリマーの遊離末端に結合している配置である。脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートは、本明細書で後述する方法を使用して、コンジュゲートの脂質部分を脂質集合体の脂質層に挿入することによって脂質集合体に結合される。前記脂質層には複数の脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートが挿入されることが好ましいが、結合されたコンジュゲートの数又は密度は、後にさらに詳しく記載するように、コンジュゲートの脂質の、層の脂質に対する割合を選択することによって、制御し得ることは理解されよう。挿入された脂質ポリマーコンジュゲートは、アッセイを完了する又は所望のターゲットに結合するなどの最終的な結果を得るために十分な時間、脂質層集合体と会合した状態又は脂質層集合体の中に固定された状態にある。
脂質層は、様々な手法によって、また、種々の脂質及び脂質混合物から容易に形成される。平面状脂質二重層の調製については、例えば、Hanke,W.とSchlue,W.R.、Planar Lipid Bilayers、D.B.Sattelle、Ed.、Academic Press(1993)及び国際公開第98/23948に記載されている。脂質ベシクルの調製については、例えば、Szoka F.とPapahadjopoulos,D.Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9:467(1980)に記載されている。脂質層の脂質は、生物学的膜から精製した天然脂質及び/又は合成脂質を含むことができる。天然脂質の例としては、これらに限定されないが、市販の大豆由来脂質抽出物であるアゾレクチン(Azolectin)(Sigma社製、セントルイス、ミズーリー州)、卵の黄身から精製されるホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。合成脂質は、頭部基及び炭化水素組成に不純物のない脂質、又は生体膜には通常存在しない脂質であってよい。好ましい脂質としては「ベシクル形成脂質」が挙げられる。ここでベシクル形成脂質とは、安定なミセル又はリポソーム組成物の一部を形成する能力があり且つ通常疎水性の炭化水素鎖を1つ若しくは2つ又はステロイド基を1つ含む任意の脂質のことを言い、それらはアミン、酸、エステル、アルデヒド又はアルコールなどの化学的反応性を有する基をその極性頭部基に有していてよい。代表的な合成及び天然ベシクル形成脂質については、後に記載する。
本方法においては、脂質集合体、通常、脂質一重層又は脂質二重層が調製される。脂質集合体は、必要ならば脂質層を形成し支持するように処理された脂質層適合性の表面又は基板、例えば酸化シリコンウェハ又はフューズドシリカウェハに支持させることができる。或いはまた、脂質集合体は、ミセル又はリポソーム又はエマルションエンベロープ一重層などの、基板に支持されない自己支持型とすることができる。
1つの研究においては、実施例1に記載するように、ドキソルビシンを含有するリポソームを調製し、マイクロ波オーブンにてインキュベート時間を変えながらインキュベートした。マイクロ波エネルギーへの曝露後にリポソームから放出されたドキソルビシンの量を測定することによって、また、同曝露後にリポソーム中のドキソルビシンの量を測定することによって、このリポソームの安定性を評価した。さらに、マイクロ波エネルギー存在下でのインキュベーションの前後におけるリポソームの大きさを測定した。
測定結果から、マイクロ波照射下で30秒、45秒、60秒及び90秒間、ドキソルビシンを含有するリポソームをインキュベートしても、リポソームからの薬物の放出は誘発されないことが明らかとなった。また上記インキュベーションによって、リポソーム粒子の大きさにも変化は生じなかった。マイクロ波下でのインキュベーションの前後で、リポソーム中のドキソルビシン濃度は3.8mMであり、リポソームの粒子径は90nmであった。このように、使用した出力レベル(510W:総エネルギー45.9kJ)においては、最長90秒間までの時間長のマイクロ波照射によってリポソームは依然として完全であった。
実施例2は、予備形成したリポソームへの脂質−ポリマー−ターゲッティングリガンドコンジュゲートの挿入を促進するために、マイクロ波照射を使用した研究について記載するものである。リポソームは、実施例1Aに記載の通りに調製したものであり、HSPC、コレステロール及びmPEG−DSPEから構成されたものである。DSPE−PEG−リガンドを含む脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートを実施例2Aに記載の通りに調製した。リガンドはc−erbB−2受容体エピトープに結合親和性を有する一本鎖Fv(scFv)抗体断片(国際公開第99/55367)とした。DSPE−PEG−scFvコンジュゲートのミセル懸濁液とリポソームの懸濁液とを、リン脂質1μモル当たりscFvリガンド6μgの固定濃度とし、全リン脂質の濃度を47μモル/mLとして混合した。混合物を、温度、溶媒(エタノール)、超音波照射、時間及びマイクロ波照射などを含めて様々な異なる条件下におき、コンジュゲートのリポソーム脂質二重層への挿入の度合いを分析した。インキュベーションの条件及び挿入の結果は、表1にまとめて示す。
表1は、室温及び37℃では、最長72時間のインキュベートでもリポソーム脂質二重層にDSPE−PEG−scF5コンジュゲートが挿入されなかったことを示している。37℃で24時間インキュベートした試料を除き、エタノールを0.1%及び0.5%の濃度で添加してもコンジュゲートのリポソーム二重層への挿入は促進されなかった。ターゲッティングコンジュゲートをリポソームと共に60℃で1時間インキュベートすると、コンジュゲートの73%がリポソームの二重層に挿入された(コンジュゲートの27%は遊離、未挿入の状態)。室温にて、超音波処理器でコンジュゲートとリポソームを10分間及び20分間インキュベーションしたが、コンジュゲートはリポソームに挿入されなかった(表1には示さず)。
引き続き表1を参照すると、マイクロ波照射しながら30秒から90秒の範囲でインキュベートすると挿入が高レベルで行われており、45秒間超及び90秒未満の間のマイクロ波照射後には、80%を上回る遊離コンジュゲートが挿入され、採用したエネルギーレベルではコンジュゲートの減少も見られない。図1Aは、マイクロ波照射下でインキュベートした試料に関する結果をプロットした図であり、遊離で未挿入のDSPE−PEG−scFv脂質ポリマーコンジュゲートの量を、マイクロ波オーブンでマイクロ波照射に曝露した時間に対してプロットしたものである。図1Bは、関連のプロット図であり、インキュベーション媒体中の遊離で未挿入のDSPE−PEG−scFvコンジュゲートの全量を、マイクロ波インキュベーション時間の関数として示した図である。図1Aは、マイクロ波源からの出力510Wに30秒間曝露すると、脂質ポリマーコンジュゲートの77%がリポソームに挿入され、脂質ポリマーコンジュゲートの減少もなかったことを示している(表1の最右の欄、図1B参照)。60℃で1時間加熱した後も同程度の挿入が達成されている(表1参照)ことは、比較のポイントとして注目に値する。さらに、マイクロ波照射曝露時間を90秒にまで増大すると、コンジュゲートの全量は全く損失せずに、脂質ポリマーコンジュゲートの88%が挿入される。この出力レベルで3分間マイクロ波照射すると、脂質ポリマーコンジュゲートの全量は減少せずに、挿入量が低下(50%)した。10分間マイクロ波照射すると、脂質ポリマーコンジュゲートの50%が分解した。この挿入プロファイルは、試験した全試料体積(200〜1000μL)に関して得られたものである。
リポソーム懸濁媒体中の遊離脂質ポリマーコンジュゲートの濃度を1ヶ月間モニターすることによって、DSPE−PEG−scFv脂質ポリマーコンジュゲートをマイクロ波挿入することによって調製した免疫リポソームの安定性を評価した。定期的に試料を採取し、高圧液体クロマトグラフィーによって遊離脂質ポリマーコンジュゲートの存在を分析した。対照として、DSPE−PEG−scFvコンジュゲートのミセル懸濁液を、リポソーム非存在下で同等のマイクロ波照射条件(580W=34.8kJで1分間照射)にさらした。結果を表2A及び表2Bに示す。これらの表には、DSPE−PEG−scFvコンジュゲートの全量(リポソーム結合及び遊離)、懸濁媒体中の遊離DSPE−PEG−scFvコンジュゲートの量、コンジュゲート全量に対する遊離DSPE−PEG−scFvコンジュゲートのパーセンテージ(表2A)、並びにリポソームの非存在下で、単独でマイクロ波照射に曝露したDSPE−PEG−scFvコンジュゲートの全量(表2B)がまとめてある。
表2Aは、マイクロ波照射への1分間の曝露によってリポソームに挿入されたDSPE−PEG−scFvコンジュゲートは安定であって、4℃に保持した場合、8〜11日間は安定して挿入された状態にあったことを示している。この期間は、遊離コンジュゲート(リポソームの二重層と会合していない)の濃度が、全コンジュゲート量の約20%であった。約11日経過後、さらに4℃で保管すると、懸濁媒体中の遊離コンジュゲートは失われることなくそのレベルが増大した。表2Bは、脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートは安定であって、1分間のマイクロ波照射では明らかに影響されていないことを示している。
別の研究では、マイクロ波照射法を使用して、予備形成したリポソームに脂質−ポリマー(「脂質ポリマー」)コンジュゲートを挿入した。ここで、脂質ポリマーコンジュゲートは、DSPEのホスホジエステルの遊離価標に4−ヒドロキシクマリン(HC)が連結した状態のPEG−DSPE脂質ポリマーであった。図2Aに示すコンジュゲートは、実施例3Aに記載の、また、図2Bに示した反応スキームに従って調製した。水性溶液中では、脂質ポリマーコンジュゲート、DSPE−HC−PEGは、臨界ミセル濃度を下回る濃度(〜3μM)ではほとんど蛍光を発しないが、ミセル又はリポソームなどの脂質の環境に挿入された途端、その蛍光強度は挿入された脂質ポリマーコンジュゲートの量に比例して増大する。このように、脂質ポリマーコンジュゲートは、脂質の環境に化合物が挿入されたことを決定する診断用リガンド又はプローブとしての役目をする。
プラセボリポソームをPEG−HC−DSPEの溶液と混合し、最大出力510Wで15秒、30秒、45秒及び60秒間それぞれ操作したマイクロ波オーブンにて、マイクロ波照射に曝露した(実施例3B)。この曝露時間の直後に、蛍光を測定した。また、マイクロ波照射への曝露後5時間まで1時間ごとに蛍光を測定し、さらに曝露21時間後にも蛍光を測定した。結果を図3に示す。
図3から分かるように、脂質−ポリマーコンジュゲートのリポソームへの挿入は、マイクロ波照射への曝露時間が長くなるにつれて増大した。マイクロ波照射への曝露1時間後から5時間後までの1時間ごとの蛍光強度によって明白であるように、マイクロ波照射後の蛍光強度はほとんど変化しなかった。各インキュベーション時間ごとの蛍光の絶対値も、21時間保管後も著しく変化していなかった。このことは、挿入された蛍光性コンジュゲートがリポソームの二重層に残留していたことを示唆するものである。
60秒間マイクロ波照射に曝露した後の蛍光性PEG−HC−DSPE脂質ポリマーコンジュゲートの挿入の程度を、SEC−HPLCを使用して測定した結果、蛍光性脂質ポリマーコンジュゲート全量の85%がリポソームに挿入されていると測定された。
より一般的には、先に示したように、マイクロ波照射法を使用して、脂質−ポリマー(「脂質ポリマー」)、すなわちいずれのリガンドも欠いている脂質ポリマーを、リポソームなどの予備形成した脂質構造体に挿入することもできる。この広い技術思想は、実施例4に記載される別の研究、すなわち卵黄ホスファチジルコリンの脂質二重層を有し蛍光標識を含んでいるリポソームを、脂質ポリマーDSPE−PEGのミセル懸濁液と共にインキュベートした研究で説明する。リポソームの脂質二重層に組み込まれる図4A〜4Bに示すような2つの異なる蛍光標識を使用して、2つの研究を行った。図4Aは7−ヘプタデシル−4−ヒドロキシクマリン(C17HC)の構造を示し、図4Bは1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE−HC)の構造を示す。これら蛍光性脂質標識の少量を、リポソーム形成の間に脂質に含ませた。DSPE−PEG脂質ポリマーのミセルをリポソームに添加し、この混合物に90秒間マイクロ波(510W)照射へ曝露し、次いで、挿入されたDSPE−PEGの量を、HC部分の見かけのpKaの変化によって測定した。
C17HCで標識されたリポソームに関する結果を表3に示す。この研究では、比較評価の基準として、室温における(マイクロ波照射無しの)同様のリポソームへのDSPE−PEG(MW2000ドルトン)脂質ポリマーの挿入も測定した。
表3は、90秒間のマイクロ波照射への曝露によっても、5時間の室温でのインキュベーションによっても、類似した程度にpKa値が上昇することを示しており、このことは類似レベルでの挿入を示唆するものである。C17HCのpKaの上昇は、DSPE−PEG脂質ポリマーがリポソーム二重層に挿入されていたこと、及びリポソーム表面がさらに負に荷電されたことを示している。C17HCの見かけのpKa値をインキュベーション期間の48時間後にも測定したが、リポソームの表面電位は著しくは変化していないことが分かった。このことは、挿入された脂質ポリマーがリポソームと会合したままの状態にあったことを示唆するものである。
DOPE−HCで標識したリポソームに関しては、結果を表4に示す。DOPE−HC標識卵黄PCリポソームを、マイクロ波照射下、90秒間、DSPE−PEG(MW2000ドルトン)コンジュゲートと共にインキュベートした。脂質ポリマーの挿入の程度を、実施例4に記載のように、見かけのpKaから算出した。
見かけのpKaの絶対値は小さくなっているが、その相対的変化は、C17HCで標識したリポソームについて実施した研究で測定された変化(表3)と質的に同じである。絶対値が小さくなっていることは、DOPE−HCの蛍光物質がC17HCの場合と比べて(表面から)離れた位置にあることを示すものである。室温で48時間保管後、リポソームの見かけのpKa値に著しい変化はなかった(結果は示していない)。このことは脂質ポリマーがリポソーム二重層と会合したままの状態にあったことを示唆するものである。
またこの研究では、EPCリポソームの試料を遊離のポリエチレングリコール(PEG、分子量2000ドルトン)と組み合わせ、マイクロ波オーブンにて、容量60%(総容量850W)で90秒間マイクロ波を照射した。リポソームへの遊離のPEG(すなわち、脂質部分又は疎水性部分を欠いているPEG)の挿入は認められなかった。
マイクロ波照射法は実質上いかなる脂質連結部分であっても予備形成した脂質集合体への挿入に使用できることは、当業者には明らかであろう。前記例は脂質連結部分をマイクロ波照射によって挿入することを説明するものであり、それら例においては、脂質連結部分は脂質−ポリマー又は脂質−ポリマー−リガンドである。脂質連結部分は脂質−リガンド部分であってもよい。脂質集合体は任意の脂質構造体であってよく、好ましくは、主として合成脂質を含み且つ脂質二重層を有する構造体である。しかし、脂質集合体は、天然又は生体の脂質を含むものであってもよく、脂質一重層であってもよい。
前述の例は、調製方法を例証するために脂質ポリマー又は脂質ポリマー−リガンドコンジュゲートを中心としたが、様々な脂質連結部分が企図されること、また、脂質ポリマーは単に代表例にすぎないことは十分理解されよう。例えば、治療薬(後に挙げるような)を疎水性部分に結合させ、次いで脂質構造体に挿入することができる。ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物なども疎水性部分に結合させ、次いで脂質構造体に挿入することができる。これら代表例として例示した部分を選択された脂質に結合させることは、化学者の通常の技量の範囲内で十分成し得ることである。
III.実用性
本発明の挿入法は、多種多様な脂質ポリマー及び脂質ポリマー−リガンドコンジュゲートを脂質集合体に結合させる又は挿入するのに使用される。脂質集合体は閉じた球状ベシクル、平面シート、平べったいディスク、小球、チューブ、又はらせんの形態をしていてよい。好ましい実施形態では、脂質集合体は脂質ベシクル又は脂質平面シートである。
本発明の挿入法は、多種多様な脂質ポリマー及び脂質ポリマー−リガンドコンジュゲートを脂質集合体に結合させる又は挿入するのに使用される。脂質集合体は閉じた球状ベシクル、平面シート、平べったいディスク、小球、チューブ、又はらせんの形態をしていてよい。好ましい実施形態では、脂質集合体は脂質ベシクル又は脂質平面シートである。
1.脂質二重層ベシクル
リポソームとも呼ばれる脂質二重層ベシクルは、水相を包み込むように同心的に配置された脂質二重層を含む球状粒子である。リポソームは、水相又は脂質二重層に含有される治療剤又は診断剤の送達ビヒクルとして使うことができる。薬物にもよるが、薬物をリポソームに封入された形態で送達することには、例えば、薬物毒性が減弱する、薬物動態が変わる、又は薬物の溶解性が向上するなどの様々な利点がある。親水性ポリマー鎖の表面コーティングを含むように製剤化されたリポソーム、いわゆるステルス(Stealth(登録商標))リポソーム又は長期滞留性リポソーム又は立体安定化リポソームには、単核食細胞系によるリポソームの除去が減ることも一部寄与し、血中滞留期間が長いというさらなる利点がある(米国特許第5,013,556号)。長期の存続期間は、リポソームがその注入部位から所望のターゲット域又は細胞に到達するために必要であることが多い。
リポソームとも呼ばれる脂質二重層ベシクルは、水相を包み込むように同心的に配置された脂質二重層を含む球状粒子である。リポソームは、水相又は脂質二重層に含有される治療剤又は診断剤の送達ビヒクルとして使うことができる。薬物にもよるが、薬物をリポソームに封入された形態で送達することには、例えば、薬物毒性が減弱する、薬物動態が変わる、又は薬物の溶解性が向上するなどの様々な利点がある。親水性ポリマー鎖の表面コーティングを含むように製剤化されたリポソーム、いわゆるステルス(Stealth(登録商標))リポソーム又は長期滞留性リポソーム又は立体安定化リポソームには、単核食細胞系によるリポソームの除去が減ることも一部寄与し、血中滞留期間が長いというさらなる利点がある(米国特許第5,013,556号)。長期の存続期間は、リポソームがその注入部位から所望のターゲット域又は細胞に到達するために必要であることが多い。
本明細書に記載の方法に従って、親水性ポリマー鎖の外側表面コーティングを有するリポソームを調製することができる。前記のように、脂質ポリマーは、マイクロ波照射に曝露している間に予備形成したリポソームに挿入される。脂質ポリマーは、その脂質部分がリポソームの脂質二重層に挿入されそのポリマー部分がリポソームの表面から離れて外部の媒体中へ延びるようにして、外側脂質二重層に組み込まれる。
ターゲッティング用、治療用、及び/又は診断用リガンドを有するリポソーム、いわゆる「免疫リポソーム」も、本明細書に記載の方法を使用して調製することができる。先に言及したように、結合したリガンドは、血中滞留期間が短い小分子などの治療剤、又はリポソーム及び封入されたペイロードを特定の組織又は細胞に誘導するターゲッティング用部分とすることができる。リガンドは、通常ポリマーの遊離末端に結合することによって、又は脂質がリン脂質である場合にはホスホジエステルの遊離価標に結合することによって、脂質−ポリマーと結合又は会合している。
本発明の方法で使用するのに好適なリポソームとしては、主としてベシクル形成脂質で構成されるリポソームが挙げられる。ベシクル形成脂質とは、ゲルから液晶相への相転移温度範囲を上回る温度で、自然発生的に脂質二重層を形成するような脂質のことを言う。一般に、そのような脂質は、疎水性部分及び親水性部分の断面積がほぼ同じであることによりラメラ相にぎっしり詰まることが可能となる、などの、自然発生的な二重層形成を可能にする幾つかの特徴を有している。コレステロール及びその種々のアナログなどの、脂質二重層に安定して組み込まれ得る脂質は、二重層が形成される間にその脂質二重層に組み込むことができる。ベシクル形成脂質は、2つの炭化水素鎖、通常アシル鎖と、極性又は非極性の頭部基とを有する脂質であることが好ましい。ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール及びスフィンゴミエリンなどのリン脂質を含め、種々の合成及び天然に存在するベシクル形成脂質があるが、これらのベシクル形成脂質においては、2つの炭化水素鎖は、通常炭素原子約14〜22個の範囲の長さを有し、飽和又は様々な程度の不飽和度を有する。アシル鎖の飽和度が様々である前記脂質及びリン脂質は、購入することもできるし又は公開されている方法によって調製することもできる。その他の好適な脂質としてはリン脂質、スフィンゴ脂質、グリコ脂質、及びコレステロールなどのステロールが挙げられる。
陽イオン性脂質もまた使用することができるが、陽イオン性脂質は、リポソームを形成する、脂質混合物の主要でない成分として又は主要な若しくは唯一の成分として含まれていてよい。陽イオン性脂質は、通常、ステロール、アシル鎖又はジアシル鎖などの親油性成分を有し、その脂質は全体として正電荷を帯びている。脂質の頭部基が正電荷を帯びていることが好ましい。一価の陽イオン性脂質の代表例としては、1,2−ジオレイルオキシ−3−(トリメチルアミノ)プロパン(DOTAP)、N−[1−(2,3−ジテトラデシルオキシ)プロピル]−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)、N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、3[N−(N’,N’−ジメチルアミノエタン)カルバモイル]コレステロール(DC−Chol)、及びジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDAB)が挙げられる。
別の群は、それ自身でミセルを形成し、そして、コレステロール又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)などの他の脂質の存在下でリポソームを形成する、DOSPA、DOGSなどの多価の陽イオン性脂質である。その他の多価の陽イオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、又はポリリシンもしくは、その他のポリアミン、例えばスペルミン、などの多価の陽イオン性分子で誘導体化されたその他のリン脂質などの中性脂質であってよい。
ベシクル形成脂質を選択して、特定の程度の流動性又は強直性を達成すること、血清中でのリポソームの安定性を制御すること、後に説明するようにターゲッティング用コンジュゲートの挿入に効果的な条件を制御すること、及び/又はリポソーム内に捕捉された薬物の放出速度を制御することができる。より強直な脂質二重層又はゲル状(秩序だった固体)相の二重層を有するリポソームは、例えば長い飽和アシル鎖有する脂質、したがって比較的高い相転移温度範囲、例えば>37℃から最高60℃までの温度範囲を有する脂質など、比較的強直な脂質を使うことによって達成される。このような脂質は、脂質二重層により優れた膜強直性を付与する一因となる。コレステロールなどのその他の脂質成分も、脂質二重層を液体秩序相に変換することによって脂質二重層構造体の膜強直性に寄与していることが知られている。
一方、高い脂質流動性は、比較的流動性の脂質、典型的な例では、液相から液晶相への相転移温度範囲が比較的低い、例えば37℃又はそれより低い脂質相を有する脂質を組み込むことによって達成される。このような脂質は、主たる中鎖(C14)、炭化水素鎖を2本有する脂質であるか、又は不飽和炭化水素鎖を1本若しくは2本する脂質であってよい。
リポソームは、ベシクル形成脂質ではない脂質ポリマーを形成するために親水性ポリマーで誘導体化されたベシクル形成脂質を含むことができる。例えば、米国特許第5,013,556号に記載されているように、リポソーム組成物にこのような誘導体化された脂質が含まれると、リポソームの周りに親水性ポリマー鎖の表面コーティングが形成される。親水性ポリマー鎖の表面コーティングは、このようなコーティングを有していないリポソームに比べて、in vivoでのリポソームの血中滞留期間を長くする効果がある。
親水性ポリマーで誘導体化するのに好適なベシクル形成脂質としては、先に挙げた脂質のいずれも挙げられるが、特に、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)などのリン脂質類が挙げられる。
ベシクル形成脂質で誘導体化するのに好適な親水性ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパラギン酸アミド及び親水性ペプチド配列が挙げられる。このようなポリマーは、ホモポリマーとして又はブロック若しくはランダムコポリマーとして採用することができる。
好ましい親水性ポリマー鎖はポリエチレングリコール(PEG)であり、好ましくは分子量が500〜10,000ドルトンの範囲のPEG鎖、より好ましくは分子量が750〜10,000ドルトンの範囲のPEG鎖、さらに好ましくは分子量が750〜5,000ドルトンの範囲のPEG鎖である。メトキシ又はエトキシでキャップされたPEGのアナログもまた好ましい親水性ポリマーであり、例えば120〜20,000ドルトンの種々のポリマーサイズが市販されている。
親水性ポリマーを使用して誘導体化されるベシクル形成脂質の調製については、例えば米国特許第5,395,619号に記載されている。このような誘導体化された脂質を含むリポソームの調製についても記載があるが、記載されている調製においては、通常、このような誘導体化された脂質はリポソーム製剤に1〜20モル%含まれる(米国特許第5,013,556号参照)。要約すると、リポソームは、Szoka,F.Jr.,et al.、Ann.Rev.Biophys.Bioeng.、9:467(1980)に詳細に記載されているような種々の手法によって調製されるが、本発明を支持して調製されるリポソームの具体例は先に挙げた。一般に、リポソームは多重層ベシクル(MLV)であって、簡単な脂質膜水和法によって形成することができる。この手法では、好適な有機溶媒に溶解した先に詳述したような種類のリポソーム形成脂質の混合物を容器内で蒸発させて薄膜を形成し、次いで、その薄膜を水性媒体で覆う。脂質膜水和によって、通常約0.1〜10ミクロンの範囲のサイズのMLVが形成される。
リポソームは、リポソーム表面上に親水性ポリマー鎖の表面コーティングを形成するために、親水性ポリマーで誘導体化したベシクル形成脂質を含み得る。リポソーム形成時に、脂質混合物に対して、約1〜20モル%範囲の脂質−ポリマーコンジュゲートを添加すると、ポリマー鎖がリポソームの脂質二重層の内側及び外側両表面から延びるようになる。ポリマーで誘導体化された脂質の調製法及びポリマーでコーティングされたリポソームの形成法については、米国特許第5,013,556号、米国特許第5,631,018号及び米国特許第5,395,619号に記載されているが、それらを参照によって本明細書に組み込む。親水性ポリマーを脂質に安定に結合させてもよいこと、又は不安定な連結を介して脂質に結合させることによって、ポリマーでコーティングされたリポソームが、血流にのって循環しながら又は刺激に反応してポリマー鎖のコーティングを放出することを可能にしてもよいことは理解されよう。
リポソームは治療剤又は診断剤を含むこともできるが、そのような薬物の例は後に記載する。選択された薬物は、(i)脂質膜を薬物の水溶液と水和させることによって水溶性化合物を受動的に捕捉する、(ii)薬物を含有する脂質膜を水和させることによって親油性化合物を受動的に捕捉する、及び(iii)リポソームの内側/外側pH勾配に逆らってイオン化性の薬剤を添加するなどの方法を含めた、標準的な方法でリポソームに組み込まれる。逆相蒸発法などのその他の方法も好適である。
リポソームを形成した後、リポソームを小型化することによって、実質的に均質なサイズ範囲を有するリポソーム群、一般に約0.01〜0.5ミクロンの範囲、より好ましくは0.03〜0.40ミクロンの範囲のリポソーム群を得ることができる。REV及びMLVを分粒するための1つの効果的な方法は、リポソームの水性懸濁液を、エタノールと共に又はエタノール無しで、0.03〜0.2ミクロン範囲の選択された均一な孔径を有する、通常は0.05ミクロン、0.08ミクロン、0.1ミクロン又は0.2ミクロンの均一な孔径を有する一連のポリカーボネート膜を通して排出することである。膜の孔径は、特に同じ膜で2回以上の排出を行って調製される場合には、その膜を使った排出により生成されるリポソームの最大サイズにほぼ一致する。多くの場合、排出は、孔径が大きいフィルターから始めて、段階的に行われる。均質化法もまた、リポソームを100nm以下のサイズに小型化するのに有用である(Martin,F.J.、SPECIALIZED DRUG DELIVERY SYSTEMS−MANUFACTURING AND PRODUCTION TECHNOLOGY、P.Tyle、Ed.、Marcel Dekker、New York,pp.267〜316(1990))。
リポソームを形成した後、本明細書に記載するマイクロ波照射法を使用して、脂質二重層に脂質連結部分を組み込む。通常、脂質二重層には、同じ又は異なる複数の脂質連結部分が組み込まれる。予備形成しておいたリポソームと脂質連結部分を混合し、次いでマイクロ波を照射して、リポソームの二重層の外側一重層への脂質連結部分の挿入を達成する。脂質連結部分を挿入すると、脂質連結部分(すなわち「部分」)の脂質部と正反対の部分が脂質表面から外側に向かうような状態で、脂質集合体の脂質二重層に脂質部分が固定されることになり、このようにして「部分」の外側表面コーティングが得られる。脂質ポリマー−リガンドコンジュゲート又は脂質−薬物−リガンドコンジュゲートの場合のように、脂質連結部分にリガンドを結合させる実施形態では、リガンドはやはり脂質の表面から外側に向かう状態となり、それによってそのコンジュゲートの受容体又は結合相手と相互作用が可能になる。
所望の挿入率、所与の部分がその結合作用又は治療作用などに悪影響を受けることなく安全に加熱されるような温度、並びに脂質及び脂質組成物の相転移温度を低くする程度などを含めた幾つかの変数に基づいて、脂質構造体への脂質連結部分の挿入を達成するのに効果的な照射条件が決定されることは理解されよう。
先に言及したように、リガンドは、細胞受容体、血中を循環する病原体などに結合親和性を有する分子とすることができる。リガンドはまた、治療用又は診断用分子、特に、遊離型で投与された場合の血中滞留期間が短い分子とすることができる。
一実施形態では、リガンドは生物学的リガンドであり、好ましくは、細胞受容体に結合親和性を有する生物学的リガンドである。生物学的リガンドの代表例としては、CD4、葉酸、インスリン、LDL、ビタミン類、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク、E、L及びPセレクチンなどのセレクチン類、Flk−1,2、FGF、EGF、インテグリン、特にα4β1、αVβ3、αVβ1、αVβ5、αVβ6インテグリン、HER2並びにその他の各種受容体に対する結合親和性を有する分子が挙げられる。好ましいリガンドとしては、抗体及びF(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fvなどの抗体断片(重鎖及び軽鎖の可変領域からなる断片)並びにscFv(ペプチドリンカーによって重鎖及び軽鎖の可変領域が連結している組換え一本鎖ポリペプチド分子)などを含めた、タンパク質及びペプチドが挙げられる。リガンドは、小分子のペプチド模倣分子であってもよい。
細胞表面受容体又はその断片もリガンドとして使うことができることは、理解されよう。
リガンドは、文献(米国特許第6,180,134号、Zalipsky,S.et al、FEBS Lett.、353:71(1994)、Zalipsky et al、Bioconjugate Chem.、4:296(1993)、Zalipsky et al、J.Control.Rel.、39:153(1996)、Zalipsky et al、Bioconjugate Chem.、8(2):111(1997))に公開されている合成反応スキームを使用して、容易に脂質又はポリマーで誘導体化した脂質に結合される。リガンドとポリマー又は脂質との間の連結は、安定な共有結合或いはpHの変化又は還元剤及び/若しくはSH部分含有分子の存在などの刺激に反応して分解する解除可能な結合である。
リポソームはまた、捕捉された状態の治療剤又は診断剤を含んでいてよい。捕捉されたとは、薬剤がリポソームの水性の核及び水性の空間に封入されていること、薬剤が並びにリポソームの脂質二重層に捕捉されていることを含む。本発明の組成物に使用することを企図した薬物は多岐にわたるが、治療用及び診断用に好適な本発明を限定しない薬物の例としては、ステロイド、免疫抑制剤、抗ヒスタミン剤、非ステロイド系抗喘息薬、非ステロイド系抗炎症薬、シクロオキシゲナーゼ−2阻害剤、細胞毒性薬、抗ウイルス薬、遺伝子治療薬、放射線治療薬、及び造影剤などが挙げられる。
一実施形態では、捕捉された治療薬は細胞毒性薬剤である。このような細胞毒性薬剤は、これらに限定されないが、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン及びイダルビシン、並びにそれらの塩及びアナログを含めたアンスラサイクリン系の抗生物質とすることができる。このような細胞毒性薬は、シスプラチンン、カルボプラチン、オルマプラチン、オキサリプラチン、ゼニプラチン、エンロプラチン、ロバプラチン、スピロプラチン、((−)−(R)−2−アミノメチルピロリジン(1,1−シクロブタンジカルボキシラート)プラチナ)、(SP−4−3(R)−1,1−シクロブタン−ジカルボキシラート(2−)−(2−メチル−1,4−ブタンジアミン−N,N’)プラチナ)、ネダプラチン、及び(ビス−アセタート−アミン−ジクロロ−シクロヘキシルアミン−プラチナ(IV))などのプラチナ化合物であってもよい。細胞毒性薬は、これらに限定されないが、トポテカン、イリノテカン、(7−(4−メチルピペラジノ−メチレン)−10,11−エチレンジオキシ−20(S)カンプトテシン)、7−(2−(N−イソプロピルアミノ)エチル)−(20S)−カンプトテシン、9−アミノカンプトテシン及び9−ニトロカンプトテシンなどを含めた、トポイソメラーゼ1阻害剤であってもよい。細胞毒性薬はまた、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンロイロシン(vinleurosine)、ビンロジシン、ビノレルビン及びビンデシンなどのビンカアルカロイドであってもよい。捕捉された治療剤は、アンジオスタチン、エンドスタチン及びTNFαなどの血管新生阻害剤とすることもできる。
2.平面状脂質二重層
別の実施形態では、脂質二重層は、好適な基板上に支持されている平面状に広がる脂質二重層である。平面状脂質二重層は、当技術分野で知られている手法を使用して作られる。例えば、ガラス、石英、雲母などの基板を選び、リン脂質二重層を1回に一層ずつ空気−水の境界面から堆積させるか、又は予備形成しておいたリポソーム同士の融合によって堆積させる。(Groves,J.及びDustin,M.、J.Immunological Mtds、278:19(2003))。二重層は、基板上にパターン又はグリッド状に形成することができるが、この場合、基板上には、異なる二重層組成物及び/又は異なるリガンドがグリッドパターン状に配置される。基板上に二重層を形成したら、脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲート又は脂質−リガンドコンジュゲートの形態をした選択されたリガンドを、マイクロ波照射下で平面二重層の表面又は特定の表面領域をコンジュゲートと接触させることによって、平面二重層に挿入する。
別の実施形態では、脂質二重層は、好適な基板上に支持されている平面状に広がる脂質二重層である。平面状脂質二重層は、当技術分野で知られている手法を使用して作られる。例えば、ガラス、石英、雲母などの基板を選び、リン脂質二重層を1回に一層ずつ空気−水の境界面から堆積させるか、又は予備形成しておいたリポソーム同士の融合によって堆積させる。(Groves,J.及びDustin,M.、J.Immunological Mtds、278:19(2003))。二重層は、基板上にパターン又はグリッド状に形成することができるが、この場合、基板上には、異なる二重層組成物及び/又は異なるリガンドがグリッドパターン状に配置される。基板上に二重層を形成したら、脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲート又は脂質−リガンドコンジュゲートの形態をした選択されたリガンドを、マイクロ波照射下で平面二重層の表面又は特定の表面領域をコンジュゲートと接触させることによって、平面二重層に挿入する。
IV.実施例
以下の実施例は、本明細書に記載の発明をさらに詳しく説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
以下の実施例は、本明細書に記載の発明をさらに詳しく説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
材料
脂質、すなわちジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、コレステロール、部分水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)及びメトキシ(ポリエチレングリコール)−ジステアロイルホスファチジルコリン(mPEG−DSPE)をAvanti Polar Lipids,Inc.社(アラバマ州アラバスター)から入手した。
脂質、すなわちジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、コレステロール、部分水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)及びメトキシ(ポリエチレングリコール)−ジステアロイルホスファチジルコリン(mPEG−DSPE)をAvanti Polar Lipids,Inc.社(アラバマ州アラバスター)から入手した。
(実施例1)
マイクロ波照射の間の脂質粒子の安定性
A.リポソームの調製
部分水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、コレステロール及びメトキシ(ポリエチレングリコール)−ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン(mPEG−DSPE)(モル比55:40:5)から、脂質膜水和法によってリポソームを調製し、次いで膜排出した(Gabizon,et al、J.Natl.Cancer Inst.、81(19):1484(1989))。丸底フラスコにて、脂質をクロロホルム/メタノール混合物に溶解した。ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒を除去し、脂質の薄膜を形成した。100mM硫酸アンモニウムと1mMデフェロキサミンの水溶液中で前記脂質膜を激しく振とうして多重層リポソームを形成した。続いて、高圧又は中圧押し出し機を使い、孔径0.2μmから0.05μmのポリカーボネート膜を孔径の大きいものから通過させて段階的にリポソームを排出した。粒径70〜100nmの範囲のベシクルが得られた。粒径は動的光散乱によって測定した。
マイクロ波照射の間の脂質粒子の安定性
A.リポソームの調製
部分水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、コレステロール及びメトキシ(ポリエチレングリコール)−ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン(mPEG−DSPE)(モル比55:40:5)から、脂質膜水和法によってリポソームを調製し、次いで膜排出した(Gabizon,et al、J.Natl.Cancer Inst.、81(19):1484(1989))。丸底フラスコにて、脂質をクロロホルム/メタノール混合物に溶解した。ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒を除去し、脂質の薄膜を形成した。100mM硫酸アンモニウムと1mMデフェロキサミンの水溶液中で前記脂質膜を激しく振とうして多重層リポソームを形成した。続いて、高圧又は中圧押し出し機を使い、孔径0.2μmから0.05μmのポリカーボネート膜を孔径の大きいものから通過させて段階的にリポソームを排出した。粒径70〜100nmの範囲のベシクルが得られた。粒径は動的光散乱によって測定した。
リポソーム懸濁液をクロマトグラフィーのカラムで濾過することにより、捕捉されなかった硫酸アンモニウム及びデフェロキサミンを除去した。ドキソルビシンを生理食塩水に溶かし(4mg/mL)、濾過後のリポソーム懸濁液と混合した。リポソーム−ドキソルビシン混合物を60℃で1時間インキュベートした。ドキソルビシンのリポソーム内への添加は、硫酸アンモニウムが作り出すプロトン濃度勾配の結果として生じた(Haran et al.、Biochem.Biophy.Acta、1151(2):201(1993))。インキュベーション期間の終わりに、リポソーム懸濁液をカチオン交換樹脂を通過させることによって、捕捉されなかったドキソルビシンを除去した。
B.マイクロ波照射
容量850WのSpectraマイクロ波オーブン(N KOR−802B型、フランス製)にて、出力レベル510W(全容量の60%)で、インキュベーション時間を変えながらリポソームをインキュベートした。マイクロ波照射に対するリポソームの安定性を評価するために、捕捉されているドキソルビシンの放出を測定した。具体的には、Dowex×50×4−400カチオン交換樹脂の存在下及び非存在下で、リポソームから放出されるドキソルビシンの量とリポソーム内ドキソルビシンの量とをそれぞれ測定した(Aldrich Chemical Co.,Inc.USA;Druckman et al.、Biochim.Biophys.Acta、980:381(1989);Amselem et al.、J.Pharm.Sci.79:1045(1990))。ALV−5000/EPP複合デジタル相関器を備えたHigh Performance Particle Sizer ALV−NIBS/HPPS(ALV−Laser Vertriebsgesellschaft GmbH社製、Langen、独国)でサイズを測定することによって、インキュベーション前後のリポソームの完全性を評価した。結果を図1に示す。
容量850WのSpectraマイクロ波オーブン(N KOR−802B型、フランス製)にて、出力レベル510W(全容量の60%)で、インキュベーション時間を変えながらリポソームをインキュベートした。マイクロ波照射に対するリポソームの安定性を評価するために、捕捉されているドキソルビシンの放出を測定した。具体的には、Dowex×50×4−400カチオン交換樹脂の存在下及び非存在下で、リポソームから放出されるドキソルビシンの量とリポソーム内ドキソルビシンの量とをそれぞれ測定した(Aldrich Chemical Co.,Inc.USA;Druckman et al.、Biochim.Biophys.Acta、980:381(1989);Amselem et al.、J.Pharm.Sci.79:1045(1990))。ALV−5000/EPP複合デジタル相関器を備えたHigh Performance Particle Sizer ALV−NIBS/HPPS(ALV−Laser Vertriebsgesellschaft GmbH社製、Langen、独国)でサイズを測定することによって、インキュベーション前後のリポソームの完全性を評価した。結果を図1に示す。
(実施例2)
予備形成しておいたリポソームへの脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートの挿入
A.コンジュゲートの調製
先に記載の手法(米国特許第6,180,134号;Zalipsky,S.et al、FEBS Lett.,353:71(1994))を使い、c−erbB−2受容体エピトープ に結合親和性を有する一本鎖Fv(scFv)抗体断片(PCT/US99/07395、世界特許機構特許99/55367として公開)を、反応性PEG−DSPEコンジュゲートと反応させて脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートを調製した。つまり、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン(DSPE)と、ヘテロ二官能性PEG誘導体、すなわちN−ヒドロキシ−スクシンイミジル−PEG−マレイミドとを反応させて、DSPE−PEG−マレイミドコンジュゲートを生成する。遊離PEG末端のマレイミド基は、タンパク質のチオール部分に対して反応性である。scFv抗体断片を、DSPE−PEG−マレイミドと反応させてDSPE−PEG−scFvコンジュゲートを生成する。
予備形成しておいたリポソームへの脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートの挿入
A.コンジュゲートの調製
先に記載の手法(米国特許第6,180,134号;Zalipsky,S.et al、FEBS Lett.,353:71(1994))を使い、c−erbB−2受容体エピトープ に結合親和性を有する一本鎖Fv(scFv)抗体断片(PCT/US99/07395、世界特許機構特許99/55367として公開)を、反応性PEG−DSPEコンジュゲートと反応させて脂質−ポリマー−リガンドコンジュゲートを調製した。つまり、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン(DSPE)と、ヘテロ二官能性PEG誘導体、すなわちN−ヒドロキシ−スクシンイミジル−PEG−マレイミドとを反応させて、DSPE−PEG−マレイミドコンジュゲートを生成する。遊離PEG末端のマレイミド基は、タンパク質のチオール部分に対して反応性である。scFv抗体断片を、DSPE−PEG−マレイミドと反応させてDSPE−PEG−scFvコンジュゲートを生成する。
B.コンジュゲートの挿入
リポソームを実施例1Aに記載のように調製した。但し、これらリポソームはドキソルビシンを含んでいなかった。予備形成しておいたリポソームとDSPE−PEG−scFvコンジュゲートのミセルの懸濁液を、全リン脂質の濃度47μモル/mL、ターゲッティング用リガンドの割合をリン脂質1μモル当たり6μgとして、プラスチック製マイクロチューブ(試料体積100μLに対して1.7mL容量、MCT−175−C、Axygen、米国;その他の全試料体積に対して15mL容量、Miniplast、イスラエル)の中で混合した。試料は、以下のインキュベーション条件のうちの1つに従って処理した。
1.60℃で60分間。
2.室温(約25℃)で72時間。
3.37℃で72時間。
4.0.1%又は0.5%エタノール存在下、室温(約25℃)又は37℃で時間を変えて。
5.室温(約25℃)で超音波処理器(Laboratory Supplies Co.,Inc.社製、G112SPIT型、600V、80KC、5AMP)中、10分又は20分。
6.試料体積100μL、300μL、500μL及び1000μLに関して、Spectraマイクロ波オーブン中、510Wで30秒、45秒、1分、1.5分、3分及び10分間インキュベート。
リポソームを実施例1Aに記載のように調製した。但し、これらリポソームはドキソルビシンを含んでいなかった。予備形成しておいたリポソームとDSPE−PEG−scFvコンジュゲートのミセルの懸濁液を、全リン脂質の濃度47μモル/mL、ターゲッティング用リガンドの割合をリン脂質1μモル当たり6μgとして、プラスチック製マイクロチューブ(試料体積100μLに対して1.7mL容量、MCT−175−C、Axygen、米国;その他の全試料体積に対して15mL容量、Miniplast、イスラエル)の中で混合した。試料は、以下のインキュベーション条件のうちの1つに従って処理した。
1.60℃で60分間。
2.室温(約25℃)で72時間。
3.37℃で72時間。
4.0.1%又は0.5%エタノール存在下、室温(約25℃)又は37℃で時間を変えて。
5.室温(約25℃)で超音波処理器(Laboratory Supplies Co.,Inc.社製、G112SPIT型、600V、80KC、5AMP)中、10分又は20分。
6.試料体積100μL、300μL、500μL及び1000μLに関して、Spectraマイクロ波オーブン中、510Wで30秒、45秒、1分、1.5分、3分及び10分間インキュベート。
インキュベーションの後、予備形成しておいたリポソームへのコンジュゲート挿入の程度を、SEC−HPLC(カラム:TSKG4000SWxl、7.8mm×30cm、8μm;ガードカラム:TSKGELxl、6mm×4cm;移動相:0.1MNaH2PO4と0.1%SDS水溶液;流速:1.0mL/分;波長:215nm;注入体積:50μL;分析時間:20分)を使用して測定し、同時に懸濁媒体中のコンジュゲート(リポソームに挿入されていない)の量及び回収されたターゲッティング用リガンドの全量を分析した。結果を表1及び図1A〜1Bで要約する。
(実施例3)
リポソームへの蛍光脂質−ポリマーコンジュゲートの挿入
A.蛍光性脂質ポリマープローブの調製:DSPE−HC−PEG
ホスホルアミドジエステルが連結した7−ヒドロキシクマリンとmPEG−DSPEのコンジュゲート(図2A)を、図2Bに示す反応スキームに従って調製した。ジクロロメタンに溶解したmPEG−DSPEを、塩化オキサリルと触媒量のDMFで処理した。この溶液を蒸発乾固し、残渣を再度ジクロロメタンに溶解し、氷冷した後、トリエチルアミン、1−Boc−1,3−ジアミノプロパンで処理した。15分後に、反応を完了した。この溶液を蒸発させ、Boc−アミノプロピルホスホラミデート生成物、をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール、95:5)によって精製した。Boc基の除去を、4MHClのジオキサン溶液中1時間かけて達成した後、アミノプロピル官能基化mPEG−DSPEを、ジクロロメタン中で過剰量の7−ヒドロキシクマリニルアセテートのスクシンイミジルエステルで処理した。3時間後、mPEG−7HC−DSPam生成物、をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール、95:5)によって精製した。総括収率は約50%であった。この材料について、NMR、MS及び分光蛍光分析によって特徴付けを行った。
リポソームへの蛍光脂質−ポリマーコンジュゲートの挿入
A.蛍光性脂質ポリマープローブの調製:DSPE−HC−PEG
ホスホルアミドジエステルが連結した7−ヒドロキシクマリンとmPEG−DSPEのコンジュゲート(図2A)を、図2Bに示す反応スキームに従って調製した。ジクロロメタンに溶解したmPEG−DSPEを、塩化オキサリルと触媒量のDMFで処理した。この溶液を蒸発乾固し、残渣を再度ジクロロメタンに溶解し、氷冷した後、トリエチルアミン、1−Boc−1,3−ジアミノプロパンで処理した。15分後に、反応を完了した。この溶液を蒸発させ、Boc−アミノプロピルホスホラミデート生成物、をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール、95:5)によって精製した。Boc基の除去を、4MHClのジオキサン溶液中1時間かけて達成した後、アミノプロピル官能基化mPEG−DSPEを、ジクロロメタン中で過剰量の7−ヒドロキシクマリニルアセテートのスクシンイミジルエステルで処理した。3時間後、mPEG−7HC−DSPam生成物、をシリカゲルクロマトグラフィー(クロロホルム−メタノール、95:5)によって精製した。総括収率は約50%であった。この材料について、NMR、MS及び分光蛍光分析によって特徴付けを行った。
B.リポソームへの脂質ポリマープローブの挿入
実施例1に記載の条件に従い、マイクロ波オーブンにて、実施例1Aに記載のように調製したがドキソルビシンは含んでいないリポソームを、蛍光性脂質ポリマープローブDSPE−HC−PEGと共に、15秒、30秒、45秒又は60秒間インキュベートした。インキュベーションの後、LS550Bルミネセンス分光装置(Perkin Elmer社製、コネチカット州、Norwalk)を使用して各試料の蛍光を測定した。その後5時間の間に1時間ごとに蛍光を測定し、さらに室温(22℃)にて21時間保管後の蛍光も測定した。結果を図3に示す。
実施例1に記載の条件に従い、マイクロ波オーブンにて、実施例1Aに記載のように調製したがドキソルビシンは含んでいないリポソームを、蛍光性脂質ポリマープローブDSPE−HC−PEGと共に、15秒、30秒、45秒又は60秒間インキュベートした。インキュベーションの後、LS550Bルミネセンス分光装置(Perkin Elmer社製、コネチカット州、Norwalk)を使用して各試料の蛍光を測定した。その後5時間の間に1時間ごとに蛍光を測定し、さらに室温(22℃)にて21時間保管後の蛍光も測定した。結果を図3に示す。
(実施例4)
ホスファチジルコリンリポソームへの脂質−ポリマーコンジュゲートの挿入
卵黄ホスファチジルコリン(EPC)で構成され、pH感受性プローブ、7−ヘプタデシル−4−ヒドロキシクマリン(C17HC)(図4A)又は1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE−HC)(図4B)、で標識されたリポソームを薄膜水和法によって調整し、次いで排出法を使用して小型化した。つまり、EPCと、前記pH感受性プローブのうちの1つを、丸底フラスコ中で有機溶媒に溶解した。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、水性バッファと水和して多重層リポソームを形成している脂質薄膜を形成した。リポソーム懸濁液をポリカーボネート膜による膜排出によって分粒し、平均径100nmとした。
ホスファチジルコリンリポソームへの脂質−ポリマーコンジュゲートの挿入
卵黄ホスファチジルコリン(EPC)で構成され、pH感受性プローブ、7−ヘプタデシル−4−ヒドロキシクマリン(C17HC)(図4A)又は1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE−HC)(図4B)、で標識されたリポソームを薄膜水和法によって調整し、次いで排出法を使用して小型化した。つまり、EPCと、前記pH感受性プローブのうちの1つを、丸底フラスコ中で有機溶媒に溶解した。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、水性バッファと水和して多重層リポソームを形成している脂質薄膜を形成した。リポソーム懸濁液をポリカーボネート膜による膜排出によって分粒し、平均径100nmとした。
DSPE−PEG(PEG分子量2000ドルトン)のコンジュゲートを購入した。DSPE−PEGコンジュゲートのミセル懸濁液を前記標識したEPCリポソームの懸濁液と混合し、出力60%で作動させた従来のマイクロ波オーブン(Spectra、容量850W)にて、マイクロ波照射下で90秒間インキュベートした。コンジュゲート挿入の程度を、HC部分の見かけのpKaの変化によって測定した。結果を表3に示す。
C17HCで標識したリポソームに関しては、C17HCの見かけのpKaを、バルクpHの関数としての、励起波長380/330(放出波長450nm)の割合の変化から算出した(Zuidam and Barenholz、Biochim Biophys Acta、1329(2):211〜22(1997))。LS−50Bルミネセンス分光装置(Perkin Elmer社製、コネチカット州、Norwalk)を使用して蛍光を測定した。比較評価の基準として、室温で同じリポソームにDSPE−PEGを挿入し、その挿入の程度を測定した。結果を表4に示す。
DOPE−HCで標識したリポソームに関しては、DOPE−HCの見かけのpKaを、バルクpHの関数としての、励起波長370/408(放出波長480nm)の割合の変化から算出した。マイクロ波照射への曝露直後と曝露後48時間後に、LS−50Bルミネセンス分光装置(Perkin Elmer社製、コネチカット州、Norwalk)を使用して蛍光を測定した。結果を表4に示す。
多数の代表例としての態様及び実施形態について議論してきたが、当業者ならば、それらに施されるある程度の修正、変更、付加、及び部分的な組合せに思い至るであろう。したがって、以下に添付の特許請求の範囲及び本明細書で後に記載する特許請求の範囲は、それら修正、変更、付加、及び部分的な組合せを、それらがその真の精神及び範囲内にあるという理由から含むものとする。
Claims (37)
- 脂質集合体に脂質連結部分を挿入する方法であって、
脂質集合体と脂質連結部分とを、前記脂質連結部分が前記脂質集合体と会合するのに効果的なマイクロ波エネルギーの存在下で接触させること
を含む方法。 - 前記脂質集合体が合成脂質集合体である請求項1に記載の方法。
- 前記脂質集合体がミセルである請求項1に記載の方法。
- 前記脂質集合体が脂質二重層を含む請求項1に記載の方法。
- 前記脂質集合体が脂質一重層を含む請求項1に記載の方法。
- 前記脂質集合体がエマルションである請求項1に記載の方法。
- 前記脂質集合体がリポソームである請求項1に記載の方法。
- 前記脂質集合体がベシクル形成脂質を含む請求項1に記載の方法。
- 前記ベシクル形成脂質の相転移温度が約50℃を上回る請求項8に記載の方法。
- 前記脂質連結部分が脂質−ポリマー部分である請求項1に記載の方法。
- 前記脂質連結部分が脂質−ポリエチレングリコール部分である請求項10に記載の方法。
- 前記脂質連結部分が脂質−薬物部分である請求項1に記載の方法。
- 前記脂質連結部分が脂質−生物学的リガンド部分である請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的リガンドが、ペプチド、タンパク質及び核酸から成る群から選択される請求項13に記載の方法。
- 前記ペプチド又はタンパク質が抗体又は抗体断片である請求項14に記載の方法。
- 前記生物学的リガンドが細胞表面受容体に対して結合親和性を有している請求項13に記載の方法。
- 前記脂質連結部分が脂質−ペプチド模倣部分である請求項1に記載の方法。
- 前記脂質集合体が、封入された治療剤を含有するリポソームである請求項1に記載の方法。
- 前記脂質連結部分が脂質−生物学的リガンド部分である請求項18に記載の方法。
- 前記生物学的リガンドが細胞表面受容体に対して結合親和性を有している請求項19に記載の方法。
- 前記脂質連結部分が脂質−炭水化物部分である請求項1に記載の方法。
- 脂質層と脂質連結部分とを含む脂質集合体であって、前記脂質層と前記脂質連結部分とをマイクロ波エネルギーの存在下でインキュベートする工程によって得られる脂質集合体。
- 前記脂質連結部分が脂質ポリマーである請求項22に記載の脂質集合体。
- 前記脂質連結部分が脂質ポリマー−リガンドである請求項22に記載の脂質集合体。
- 一重層を含む請求項22に記載の脂質集合体。
- 前記脂質連結部分が脂質二重層を含む請求項22に記載の脂質集合体。
- 脂質連結部分がリポソームの二重層と会合しているリポソームを含んでいるリポソーム組成物の調製方法であって、
脂質連結部分とリポソームとの会合を達成するのに効果的なマイクロ波エネルギーの存在下で、前記リポソームの懸濁液と、前記脂質連結部分のミセル懸濁液とを接触させること
を含む方法。 - 前記リポソームが、封入された治療剤を有している請求項27に記載の方法。
- 前記脂質連結部分が脂質−ポリマー部分である請求項27に記載の方法。
- 前記脂質連結部分が脂質−ポリエチレングリコール部分である請求項27に記載の方法。
- 前記脂質連結部分が脂質−薬物部分である請求項27に記載の方法。
- 前記脂質連結部分が脂質−生物学的リガンド部分である請求項27に記載の方法。
- 前記生物学的リガンドが、ペプチド、タンパク質及び核酸から成る群から選択される請求項32に記載の方法。
- 前記ペプチド又はタンパク質が抗体又は抗体断片である請求項33に記載の方法。
- 前記生物学的リガンドが細胞表面受容体に対して結合親和性を有している請求項32に記載の方法。
- 前記脂質連結部分が脂質−ペプチド模倣部分である請求項27に記載の方法。
- 前記脂質連結部分が脂質−炭水化物部分である請求項27に記載の方法。
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