JP2008510454A - 肺癌および乳癌におけるマーカーの同定 - Google Patents
肺癌および乳癌におけるマーカーの同定 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、ともに2004年7月9日に出願され、その全体を参考文献として本明細書中に援用される、米国仮出願60/586,599および60/587,019に基づく優先権を主張する。
1. 発明の属する分野
リンパ節中の癌細胞を診断するための改良方法、およびその様な方法を行う際に有用な組成物および装置を提供する。
癌の初期検出は、一般的に生存率の増加をもたらす。転移性病変は一般的に、免疫組織化学的技術を含む組織学的技術により検出される。転移細胞は一般にリンパ節に浸潤し、そしてその結果、ほとんどの場合において、特定の前哨(sentinel)リンパ節(転移細胞が一般に最初に浸潤するリンパ節)または病期診断用(staging)リンパ節(特定タイプの癌細胞の存在について一般的に解析されるリンパ節)は、各癌タイプについて認識され、そして微小転移を含む病変の存在について解析される。訓練を積んだ組織学者は、しばしば、前哨リンパ節または病期診断用(staging)リンパ節由来の組織から切片を作成しそして染色すると、視覚的に転移性病変を検出することができる。高度に訓練を積んだ組織学者は、しばしば、微小転移を視覚化することができるが、その様な病変を視覚化する能力は、組織学者によって異なる。
本発明は、癌細胞の存在の指標である特定のマーカーの発現を同定することにより、患者における癌細胞の存在を検出するための診断方法に関するものである。
リンパ節における微小転移を含む乳癌細胞および肺癌細胞を同定する際に有用な方法および組成物を提供する。転移の初期検出は、一般的に、患者の生存と関連する。非常に小さな転移が、しばしばリンパ節バイオプシーの組織学的研究においてしばしば見逃され、その結果、結果的に患者の生存の可能性を低下させる偽陰性の結果を生じる。本明細書中で記載される核酸検出アッセイは、ほとんどの事例において、組織学的研究よりは、かなり際だったもの(discriminating)であり(わずかな優秀な組織学者しかリンパ節切片において微小転移を同定することができない)、そしてわずかしか訓練を受けていないテクニシャンのいずれの手にも骨の折れそして繰り返されることである。本明細書中で記載される方法および組成物は、必然的に特異的mRNAマーカーの発現を含む方法および組成物を示すが、このことが、特異的マーカーやその他の当該技術分野において既知のマーカーとの組合せを含む方法および組成物を排除するとはみなされないことを理解すべきである。
上述したように、PCRベースの技術を使用して、所定の組織サンプル中におけるmRNAレベルを定量することができる。その他の配列特異的核酸定量法は、程度の差はあるが、適している可能性がある。一態様において、核酸定量法は、ローリングサークル増幅法である。ローリングサークル増幅法の限定的ではない例は、U.S.特許Nos. 5,854,003;6,183,960;6,344,329;および6,210,884に記載されており、そのそれぞれを、RNA種を検出しそして定量するための方法を教示する範囲で参考文献として本明細書中に援用する。一態様において、パドロック(padlock)プローブが、ローリングサークル増幅プロセスを容易にするために利用される(Nilsson, M. et al. (2002), “Making Ends Meet in Genetic Analysis Using Padlock Probes,” Human Mutation 19:410-415およびSchweitzer, B. et al (2001), “Combining Nucleic Acid Amplification and Detection,” Current Opinion in Biotechnology, 12:21-27を参照)。パドロックプローブは、各末端に1つの標的相補的配列を含む様に設計され、そして2つの末端が、標的配列に対してハイブリダイゼーションに際してそれぞれのすぐ隣に来るように設計される、直鎖オリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドである。プローブにはまた、パドロックプローブスペーサー配列を検出するため、ポリメラーゼプライマー部位を含む標的相補的配列とモレキュラービーコンプローブなどのプローブに対して結合するための部位との間に、スペーサーが含まれる。RNAテンプレートに対して適切にハイブリダイゼーションされる場合、プローブ末端は、次いで、酵素的DNAライゲーションにより結合され、相補的プライマーのポリメラーゼ伸長により増幅することができる環状テンプレートを形成することができる。テンプレートのコンカテマーの何千ものコピーを、各プライマーにより生成することができ、もともとのRNAテンプレートの検出および定量が可能になる。例えば、限定的ではないが、モレキュラービーコンプローブまたは標的配列の蓄積を検出することができるその他のプローブを使用することにより、定量を自動化することができる。異なるスペーサーを有するパドロックプローブを使用して、増幅されたスペーサーに結合した際に異なる色の蛍光を発する異なるモレキュラービーコンに結合させることにより、この自動化反応を多重化することができる。パドロックプローブ配列は、交差反応性が限定的かまたはない状態で、特異的な結合を確実にするため、標的RNAの独特な部分を標的する。RCAは、増幅が1つの温度で行われる等温性の方法である。
可能性のあるマーカーの同定:
広範囲の文献および公共データベースの調査を、何らかの可能性のあるマーカーを同定するために行った。この調査のための情報源には、PubMed、OMIM、UniGene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、GeneCards(http://bioinfo.weizmann.ac.il/cards)、およびCGAP(http://cgap.nci.nih.gov)が含まれる。調査の基準はいくらかフレキシブルであったが、目的は、腫瘍中で中程度〜高度の発現を伴い、そして正常リンパ節中で低度の発現を伴う遺伝子を同定することであった。さらに、腫瘍中で亢進調節されたことが報告された遺伝子および限定的な分布を有する遺伝子が、有用である可能性があると考えられた。最終的には、癌精巣抗原およびhTERTなどの癌特異的であることが報告された遺伝子を評価した。
組織試料は、IRBの承認を受けたプロトコルを介して、University of Pittsburgh Medical Centerの組織バンクから取得した。すべての試料を、液体窒素中で急速冷凍し、そしてその後凍結切片用にOCT中に包埋した。20個の5-ミクロンの切片を、RNA単離のために各組織から切り出した。さらに、切片を切り出し、そしてRNA単離用の切片の最初、途中(RNA用に10番目と11番目の切片の間)、そして最後を、H&E解析およびIHC解析用にスライド上においた。各試料から採取した3種類のH&Eスライドすべてを、腫瘍の存在および腫瘍%を確認するため、そして何らかの混入組織の存在を同定するため、病理的検査に供した。非染色スライドのすべては、-20℃で保存した。免疫組織化学的評価を、AE1/AE3抗体カクテル(DAKO, Carpinteria, CA)、およびVector Elite ABCキットおよびVector AEC Chromagen(Vecta Laboratories, Burlingame, CA)を使用して行った。IHCをH&E組織学を確認するために必要とされるように使用した。
スクリーニングを、2段階で行った。すべての可能性のあるマーカーを一次スクリーニング段階に投入し、そして癌を有さない患者から得た6個の原発腫瘍および10個の良性リンパ節において発現を解析した(1プール当たり2個のリンパ節RNAを有する5つのRNAプール)。リンパ節転移検出のための良好な特徴を示したマーカーが、二次スクリーニング段階に移された。二次スクリーニングは、20〜25個の原発腫瘍、20〜25個の組織学的に陽性のリンパ節、そして21個の癌を有さない良性リンパ節についての発現解析から構成される。
RNAを、RNeasyミニキット(Qiagen, Valencia, CA)を本質的に製造者により記載された通りに使用して単離した。唯一の修飾は、溶解試薬の用量を2倍にしそして2工程でカラムに充填した点であった。このことにより、おそらくは組織切片中のOCTから希釈した結果として、より良好なRNA収率および精製度を提供することが見いだされた。表Cに示されるプローブおよびSuperscript II(Invitrogen, Carlsbad, CA)逆転写酵素を使用するランダムヘキサマープライミングによるかまたは配列特異的プライミングによるかのいずれかにより、逆転写を100-μl反応容量中で行った。一次スクリーニング用に、各500ngのRNAを有する3種類の逆転写反応を行った。cDNAを組み合わせて、そしてQPCRを反応あたり20 ng RNA等量を使用して行った。二次スクリーニング用に、原発腫瘍および陽性リンパ節についてのRNA入力は、同様に500 ngであった。しかしながら、良性のリンパ節については、RNA入力は、QPCR反応あたり80 ng RNAに相当する、2000 ngであった。
すべての定量的PCRを、ABI Prism 7700配列検出装置(Applied Biosystems, Foster City, CA)で行った。マーカー遺伝子の相対発現を、以前に記載されたデルタ-CT法を使用して、そしてβ-グルクロニダーゼを内在性対照遺伝子として、計算した。すべてのアッセイは、5’ヌクレアーゼハイブリダイゼーションプローブを用いた用途のために設計されたが、コストを抑えるため一次スクリーニングをSYBER Green定量を使用して行った。アッセイは、ABI Primer Express Version 2.0ソフトウェアを使用して設計され、そして可能である場合、cDNA特異性を提供するため、アンプリコンはエクソン結合部にかかっていた。すべてのプライマー対を、60、62および64℃のアニーリング温度で、増幅特異性(ゲル上で単一バンドを生成)について試験した。さらに、PCR効率は、一次スクリーニングに使用する前に、SYBER green定量を使用して推定した。効率のさらなる最適化およびより正確な推定を、二次スクリーニングにおいて使用されるすべてのアッセイのため、5’ヌクレアーゼプローブを用いて行った。
SYBR Green I-ベースのQPCRに関して、各50μl反応物は、1×TaqManバッファA(Applied Biosystems)、300 nMの各dNTP、3.5 mM MgCl2、0.06 units/μlのAmplitaq Gold(Applied Biosystems)、0.25X SYBR Green I(Molecular Probes, Eugene, OR)および200nMの各プライマーを含有した。増幅プログラムは、最初に95℃のTaq活性化段階を12分間行い、その後95℃の変性を15秒間、60または62または64℃でのアニーリング/伸長を60秒、そして増幅された特異的PCR生成物のTmよりも2〜4℃低い温度で10秒のデータ回収工程を1サイクルとして40サイクル行う、2段階を含む(Tom B. Morrison, et al, 1998)。増幅後、60℃〜95℃まで、20分かけて温度を上昇させながら蛍光データを回収することにより、溶融曲線解析を行った。
プローブベースのQPCRを以前に記載されたように行った(Godfrey, et al., Clin Cancer Res. 2001 Dec., 7(12):4041-8)。概説すると、200 nMのプローブ濃度および60℃、または62℃、または64℃で60秒のアニーリング/伸長段階により、反応を行った。二次スクリーニングにおいて評価した、遺伝子についてのプライマーおよびプローブの配列(IDT, Coralville, IAより購入)を、以下の表Bに列挙する。
一次スクリーニングにおいて、溶融曲線から得たデータを、ABI Prism 7700 Dissociation Curve Analysis 1.0ソフトウェア(Applied Biosystems)を使用して解析した。溶融曲線の一次導関数を使用して、生成物のTmを決定し、ならびに特異的生成物が各サンプル中に存在することを確認した。一般的には、二重にしたPCR反応中でサンプルを解析し、そして平均Ct値を発現解析において使用した。しかしながら、二次スクリーニングにおいては、各個体の良性リンパ節について三重にした反応を行い、そしてサンプルについてのバックグラウンド発現の最高値を得るため、最低のCt値を相対発現の計算において使用した。
CK7、CK19、MGB1、MGB2、PIP、およびTACSTD1の発現レベルを、実施例1に記載した方法により決定した。図12は、原発腫瘍、腫瘍陽性リンパ節および良性リンパ節におけるCK7、CK19、MGB1、MGB2、PIP、およびTACSTD1の発現レベルを示す散布図である。図13A-Oは、2マーカーシステムが、リンパ節中の良性細胞と悪性細胞とを識別する能力を示す散布図を提供する。表DおよびEは、図12および図13A-Oのグラフを生成した際の生データを提供する。このデータは、前哨リンパ節中でのCK7、CK19、MGB1、MGB2、PIPおよびTACSTD1マーカー単独の発現または組合せの発現が、前哨リンパ節中の乳癌に由来する悪性細胞の存在と強力な相関を有することを示す。
CEA、CK7、CK19、LUNX、PVA、SCCA1.2、SFTPB、およびTACSTD1の発現レベルを、実施例1に記載した方法により決定した。図14は、原発腫瘍、腫瘍陽性リンパ節および良性リンパ節におけるCEA、CK7、CK19、LUNX、PVA、SCCA1.2、SFTPB、およびTACSTD1の発現レベルを示す散布図である。図15A〜BBは、2マーカーシステムが、リンパ節中の良性細胞と悪性細胞とを識別する能力を示す散布図を提供する。図16は、別個の組織学的型における肺癌を検出するための、3マーカーの最良の組合せのプロットである。表FおよびGは、図14および15A-BBのグラフを生成した際の生データを提供する。このデータは、前哨リンパ節中でのCEA、CK7、CK19、PVA、SCCA1.2、SFTPB、およびTACSTD1マーカー単独の発現または組合せの発現が、前哨リンパ節中の肺癌に由来する悪性細胞の存在と強力な相関を有することを示す。
材料と方法
実施例2において概説したように、広範囲な文献調査およびデータベース調査により、乳癌におけるリンパ節転移の検出のための潜在的なmRNAマーカーを同定した。一次スクリーニングにより、6個の原発性***腫瘍および癌を有さない患者から得た10個の良性リンパ節において、43個の潜在的なマーカーの相対発現を解析した。6個のマーカーが、リンパ節転移検出についての良好な特徴を示したため、25個の原発腫瘍、27個の組織学的に陽性のリンパ節、そして癌を有さない患者から得た21個の良性リンパ節(73人の別個の患者)において発現を解析する、二次スクリーニング段階へと進行した。分類特性に基づいて、迅速な多重化リアルタイムPCRアッセイを使用して、乳癌を有する別個の患者に由来する90個のSLNの外部評価研究のために、4個のマーカーを選択した。最終的に、9個の組織学的に陰性のリンパ節および9個の組織学的に陽性なリンパ節を、完全に自動化しそして迅速なRNA単離およびリアルタイムPCRアッセイを使用して、GeneXpert(登録商標)上で解析した。
マーカースクリーニングおよびGeneXpert(登録商標)研究のための組織は、University of Pittsburgh Medical Centerの組織バンクから取得し、そしてマーカー検証実験のためのSLNは、Medical University of South Carolinaで始められたMinimally Invasive Molecular Staging of Breast Cancer Trial (MIMS)から得た。
すべての組織を、液体窒素中で瞬間凍結し、そして-80℃で使用するまで保存し、使用時に、クリオスタットでの凍結切片作成のため、それらを最適切断温度(OCT)コンパウンド中に包埋した。マーカースクリーニングおよびGeneXpert(登録商標)研究のため、40個の5-ミクロンの切片をRNA単離のために切り出した。RNA単離用の切片の最初、中間、そして最後から得た追加の切片を、H&E解析およびIHC解析のために切り出した。各試料から得た3つのH&Eスライドすべてについて、2人の病理学者により、病理学的検討を行った。すべての非染色スライドを、-20℃で保存し、そしてH&E組織構造を確認するために必要である場合には、IHC評価のために使用した(AE1/AE3汎サイトケラチン抗体カクテルを使用した)。
スクリーニングおよび検証実験のため、製造者により記載された様にRNeasyミニキット(Qiagen, Valencia, CA)を使用して、RNAを単離した。唯一の変更点は、溶解試薬の容量を二倍にし、そして2工程でカラム上に充填した点であった。すべてのRNAは、Ambionから入手したDNA不含キットを使用して、DNAse処理された。
マーカースクリーニング研究のため、cDNAをランダムヘキサマーを使用して合成した。定量的リアルタイムPCRを、ABI Prism 7700 Sequence検出装置上で行い、各マーカー遺伝子の発現をΔCt計算を使用して、内在性対照遺伝子β-グルクロニダーゼに対して測定した。コストを抑えるため、一次スクリーニングをSYBR greenを用いた定量を使用して行った。二次スクリーニングにおいて、5’ヌクレアーゼハイブリダイゼーションプローブを使用して、アッセイの特異性を上昇させた。すべてのアッセイを、ABI Primer Express Version 2.0ソフトウェアを使用して設計し、そして可能である場合、cDNA特異性を提供するため、アンプリコンはエクソン結合部にかかっていた。陰性対照を、各PCRプレート中でインキュベートした。Universal Human Reference RNA(Stratagene, La Jolla, CA)とヒト胎盤、甲状腺、心臓、結腸、PCI13細胞株、およびSKBR3細胞株から得たRNAとの混合物が、マーカースクリーニングプロセスにおけるすべての遺伝子についてのユニバーサル陽性発現対照として機能した。
24枚のOCT包埋組織の5-μm切片を、800μlのGeneXpert(登録商標)溶解バッファー(Cepheid, Sunnyvale, CA)中で切断した。溶解バッファーは、0.22-μmシリンジフィルター(Osmonics Inc, West borough, MA)を通して濾過し、そしてGeneXpert(登録商標)カートリッジ中に充填した。RNA単離、逆転写、そしてQRT-PCRの自動化プロセスは、GeneXpert(登録商標)上でおこなった。
マーカーを評価するために使用した特徴は、感度、特異性、分類精度、そして陰性適中率および陽性適中率であった。評価には、マーカーの分布を特徴付け、そしてlog-正規分布に対してデータを適合させることを試験することが含まれた。個別のマーカーについては、分類精度を最大にするカットオフ値を決定した。分類精度が100%であった場合、最大に発現する良性のリンパ節と最低に発現する組織学的に陽性のリンパ節との中間点にカットオフ値を設定した。マーカーを対結合(paired combinations)においても評価し、そして各対について線形予測規則(linear prediction rule)を生成した。規則は、線形境界の上および下での近似確率(fitted probabilities)を均一にする線形予測値(linear predictor)に対応していた。すなわち、境界線上の点は、陽性のリンパ節および陰性のリンパ節について割り当てられた数値スコアの中間の予測確率を有した。
一次マーカースクリーニング:
原発腫瘍中および良性リンパ節中での中央値相対発現を、一次スクリーニングにおいて含まれた43個の潜在的マーカーのすべてについて計算した(表H)。
二次スクリーニングにおいて使用された25個の原発性乳癌試料の組織学的評価から、75%の中央値腫瘍%(5〜95%の範囲)が示された。27個の組織学的に陽性のリンパ節中の中央値腫瘍%は80%であった(5〜95%の範囲)。乳腺腫瘍、陽性リンパ節、および良性リンパ節における二次スクリーニングに含まれた6個のマーカーの相対的発現は、図12に示される。各マーカーの分類特性(病理学的検討と比較した)は、表Iにまとめる。
二次スクリーニングにおいて試験された選択されたマーカーの分類精度をさらに検証するため、90個の乳癌前哨リンパ節の別個の検証用セットを、予め解析した(図19Aおよび19B)。さらに、手術中解析の可能性を示すため、迅速な多重化QRT-PCRを使用して、SmartCycler(登録商標)装置(Cepheid)でこの研究を行った。サーモサイクラープラットフォームにおけるこの変化に由来する、相対発現計算値におけるわずかな差異が観察されたが(データは示さず)、QRT-PCR解析の頑健性を間接的に評価するための努力において、二次スクリーニングからの分類アルゴリズムを補正率(correction factors)なしで検証用セットデータに対して適用した。
別個の患者から得た18個のリンパ節試料を、マーカーTACSTD1およびPIPについて、完全に自動化されたQRT-PCRアッセイを用いて評価した(図19Aおよび19B)。組織学的検討の結果、9個の陽性リンパ節(60〜95%腫瘍)および9個の陰性リンパ節から構成されたことが確認された。二次スクリーニングセットから得たデータに基づいて、決定規則を使用して線形決定規則または等確率等高線解析のいずれかにより予め解析された場合、多重化GeneXpert(登録商標)アッセイは、18個の試料すべてを、アッセイあたり35分以内に正確に(100%)特徴づけた。完全に自動化された迅速なQRT-PCRアッセイは、転移性乳癌の存在についてリンパ節を正確に特徴づけたと我々は結論づける。
Claims (60)
- (a) TACSTD1に特異的な第一のmRNA種が、リンパ節から調製されたRNAサンプル中で過剰であるか;
(b) CK19に特異的な第一のmRNA種およびPIPおよびMGB1の一方に特異的な第二のmRNA種が、リンパ節から調製されたRNAサンプル中で過剰であるか;または
(c) CK7に特異的な第一のmRNA種およびPIP、MGB1およびMGB2の1つに特異的な第二のmRNA種が、リンパ節から調製されたRNAサンプル中で過剰であるか、
を決定することを含む、患者のリンパ節中の乳癌細胞の存在の指標となるマーカーの発現を同定する方法であって、mRNA種の過剰が、リンパ節中での転移性の乳腺細胞の指標である、前記方法。 - TACSTD1に特異的な第一のmRNA種が、リンパ節から調製されたRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することを含む、請求項1に記載の方法。
- CK19に特異的な第二のmRNA種がRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することをさらに含み、その場合、そのmRNA種の過剰が、リンパ節中の転移性の乳腺細胞の存在の指標である、請求項2に記載の方法。
- MGB1に特異的な第二のmRNA種がRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することをさらに含み、その場合、そのmRNA種の過剰が、リンパ節中の転移性の乳腺細胞の存在の指標である、請求項2に記載の方法。
- MGB2に特異的な第二のmRNA種がRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することをさらに含み、その場合、そのmRNA種の過剰が、リンパ節中の転移性の乳腺細胞の存在の指標である、請求項2に記載の方法。
- PIPに特異的な第二のmRNA種がRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することをさらに含み、その場合、そのmRNA種の過剰が、リンパ節中の転移性の乳腺細胞の存在の指標である、請求項2に記載の方法。
- CK7に特異的な第二のmRNA種がRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することをさらに含み、その場合、そのmRNA種の過剰が、リンパ節の転移性の乳腺細胞の存在の指標である、請求項2に記載の方法。
- CK19に特異的な第一のmRNA種およびPIPおよびMGB1の一方に特異的な第二のmRNA種が、リンパ節から調製されたRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することを含み、その場合、それらのmRNA種の過剰が、リンパ節の転移性の乳腺細胞の存在の指標である、請求項1に記載の方法。
- 第二のmRNA種がPIPに特異的なものである、請求項8に記載の方法。
- 第二のmRNA種がMGB1に特異的なものである、請求項8に記載の方法。
- CK7に特異的な第一のmRNA種、およびPIP、MGB1およびMGB2の1つに特異的な第二のmRNA種が、リンパ節から調製されたRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 第二のmRNA種がPIPに特異的なものである、請求項11に記載の方法。
- 第二のmRNA種がMGB1に特異的なものである、請求項11に記載の方法。
- 第二のmRNA種がMGB2に特異的なものである、請求項11に記載の方法。
- RNAサンプル中のmRNA種のレベルを定量すること、そして1またはそれ以上のmRNA種がRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定すること、を含む、請求項1に記載の方法。
- 核酸増幅アッセイを使用して、1またはそれ以上のmRNA種が、RNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定する、請求項1に記載の方法。
- 核酸増幅アッセイが、PCRアッセイおよび等温式増幅アッセイの一つである、請求項16に記載の方法。
- 核酸増幅アッセイが、RT-PCRアッセイ、QRT-PCRアッセイ、ローリングサークル増幅アッセイ、および核酸配列ベースの増幅アッセイからなる群から選択されるアッセイである、請求項17に記載の方法。
- アッセイが、RT-PCRアッセイである、請求項17に記載の方法。
- RT-PCRアッセイが、CK7、CK19、MGB1、MGB2、PIPおよびTACSTD1の1またはそれ以上に特異的な1またはそれ以上のプライマー対を使用する、請求項19に記載の方法。
- プライマー対が、表Bに開示されたCK7、CK19、MGB1、MGB2、PIPおよびTACSTD1プライマーの1またはそれ以上の少なくとも約10個の連続した核酸から本質的になる、請求項20に記載の方法。
- アッセイが多重化アッセイである、請求項16に記載の方法。
- CK7、CK19、PVA、SCCA1.2、SFTPBおよびTACSTD1の一つに特異的な第一のmRNA種が、リンパ節から調製されたRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することを含み、その場合、そのmRNA種の過剰がリンパ節中の転移性の肺細胞の存在の指標である、患者のリンパ節中の肺癌細胞の存在の指標であるマーカーの発現を同定する方法。
- CK7に特異的な第一のmRNA種がリンパ節から調製されたRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することを含み、その場合、そのmRNA種の過剰がリンパ節中の転移性の肺細胞の存在の指標である、請求項23に記載の方法。
- CK19に特異的な第一のmRNA種が、リンパ節から調製されたRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することを含み、その場合、そのmRNA種の過剰がリンパ節中の転移性の肺細胞の存在の指標である、請求項23に記載の方法。
- PVAに特異的な第一のmRNA種が、リンパ節から調製されたRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することを含み、その場合、そのmRNA種の過剰がリンパ節中の転移性の肺細胞の存在の指標である、請求項23に記載の方法。
- SCCA1.2に特異的な第一のmRNA種が、リンパ節から調製されたRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することを含み、その場合、そのmRNA種の過剰がリンパ節中の転移性の肺細胞の存在の指標である、請求項23に記載の方法。
- SFTPBに特異的な第一のmRNA種が、リンパ節から調製されたRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することを含み、その場合、そのmRNA種の過剰がリンパ節中の転移性の肺細胞の存在の指標である、請求項23に記載の方法。
- TACSTD1に特異的な第一のmRNA種が、リンパ節から調製されたRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することを含み、その場合、そのmRNA種の過剰がリンパ節中の転移性の肺細胞の存在の指標である、請求項23に記載の方法。
- SFTPBに特異的な第二のmRNA種がRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することをさらに含み、その場合、そのmRNA種の過剰がリンパ節中の肺細胞の存在の指標である、請求項29に記載の方法。
- PVAに特異的な第三のmRNA種が、RNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することをさらに含み、その場合、そのmRNA種の過剰がリンパ節中の肺細胞の存在の指標である、請求項30に記載の方法。
- SCCA1.2に特異的な第三のmRNA種が、RNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することをさらに含み、その場合、そのmRNA種の過剰がリンパ節中の肺細胞の存在の指標である、請求項30に記載の方法。
- PVAに特異的な第二のmRNA種が、RNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することをさらに含み、その場合、そのmRNA種の過剰がリンパ節中の肺細胞の存在の指標である、請求項29に記載の方法。
- SCCA1.2に特異的なmRNA種が、RNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することをさらに含み、その場合、そのmRNA種の過剰がリンパ節中の肺細胞の存在の指標である、請求項29に記載の方法。
- CEA、CK7、CK19、PVA、SCCA1.2、SFTPBおよびTACSTD1の1つまたはそれ以上に特異的な第一のmRNA種とは異なる1またはそれそれ以上の追加のmRNA種が、RNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することをさらに含み、その場合、第一のmRNA種の過剰および1またはそれそれ以上の追加のmRNA種の過剰がリンパ節中の肺細胞の存在の指標である、請求項23に記載の方法。
- RNAサンプル中のmRNA種のレベルを定量し、そして1またはそれ以上のmRNA種がRNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定することを含む、請求項23に記載の方法。
- 核酸増幅アッセイを使用して、1またはそれ以上のmRNA種が、RNAサンプル中で過剰であるかどうかを決定する、請求項23に記載の方法。
- 核酸増幅アッセイが、PCRアッセイおよび等温式増幅アッセイの一つである、請求項37に記載の方法。
- 核酸増幅アッセイが、RT-PCRアッセイ、QRT-PCRアッセイ、ローリングサークル増幅アッセイおよび核酸配列ベースの増幅アッセイからなる群から選択されるアッセイである、請求項38に記載の方法。
- アッセイがRT-PCRアッセイである、請求項38に記載の方法。
- RT-PCRアッセイが、CEA、CK7、CK19、PVA、SCCA1.2、SFTPBおよびTACSTD1の1つまたはそれ以上に特異的な1またはそれ以上のプライマー対を使用する、請求項40に記載の方法。
- プライマー対が、表B中に開示した、CEA、CK7、CK19、PVA、SCCA1.2、SFTPBおよびTACSTD1プライマーの1またはそれ以上の少なくとも約10個の連続した核酸から本質的になる、請求項41に記載の方法。
- アッセイが多重化アッセイである、請求項37に記載の方法。
- 包装材料、および:
(a) CEA、CK19、MGB1、MGB2、PIPおよびTACSTD1の1つまたはそれ以上に特異的な1またはそれ以上の核酸(ここで、包装材料が、1またはそれ以上の核酸を、患者のリンパ節中の乳癌細胞の存在の指標であるマーカーの発現を同定する方法において使用することができることを示すしるしを含む);または
(b) CEA、CK7、CK19、PVA、SCCA1.2、SFTPBおよびTACSTD1の1つまたはそれ以上に特異的な1またはそれ以上の核酸(ここで、包装材料が、1またはそれ以上の核酸を、患者のリンパ節中の肺癌細胞の存在の指標であるマーカーの発現を同定する方法において使用することができることを示すしるしを含む);
を含む、製品。 - CEA、CK19、MGB1、MGB2、PIPおよびTACSTD1の1つまたはそれ以上に特異的な1またはそれ以上の核酸を含み、包装材料が、1またはそれ以上の核酸を、患者のリンパ節中の乳癌細胞の存在の指標であるマーカーの発現を同定する方法において使用することができることを示すしるしを含む、請求項44に記載の製品。
- CEA、CK7、CK19、PVA、SCCA1.2、SFTPBおよびTACSTD1の1つまたはそれ以上に特異的な1またはそれ以上の核酸を含み、包装材料が、1またはそれ以上の核酸を、患者のリンパ節中の肺癌細胞の存在の指標であるマーカーの発現を同定する方法において使用することができることを示すしるしを含む、請求項44に記載の製品。
- 1またはそれ以上の核酸が、配列特異的核酸検出アッセイまたは配列特異的核酸増幅アッセイにおいて使用するための1またはそれ以上のプライマーである、請求項44に記載の製品。
- プライマーが、PCRプライマーセット、NASBAプライマーおよびRCAプライマーの一つである、請求項47に記載の製品。
- プライマーが、PCRプライマーセットである、請求項47に記載の製品。
- 1またはそれ以上の核酸が、基材に接着されている、請求項44に記載の製品。
- 基材が、1またはそれ以上の核酸の2またはそれ以上についてのアレイである、請求項50に記載の製品。
- 1またはそれ以上の核酸がプローブである、請求項44に記載の製品。
- 1またはそれ以上のプライマーを使用する配列特異的核酸検出アッセイまたは配列特異的核酸増幅アッセイの生成物の蓄積を検出する際に使用するための検出可能プローブをさらに含む、請求項44に記載の製品。
- 1またはそれ以上の核酸が、カートリッジ中に含有される、請求項44に記載の製品。
- (a) CEA、CK19、MGB1、MGB2、PIPおよびTACSTD1の1つまたはそれ以上に特異的な1またはそれ以上のプライマーまたはプローブ、および乳癌を有すると診断されたかまたは有することが疑われる患者のリンパ節から抽出したRNA;または
(b) CEA、CK7、CK19、PVA、SCCA1.2、SFTPBおよびTACSTD1の1つまたはそれ以上に特異的な1またはそれ以上のプライマーまたはプローブ、および肺癌を有すると診断されたかまたは有することが疑われる患者のリンパ節から抽出したRNA;
を含む、組成物。 - CEA、CK19、MGB1、MGB2、PIPおよびTACSTD1の1つまたはそれ以上に特異的な1またはそれ以上のプライマーまたはプローブ、および乳癌を有すると診断されたかまたは有することが疑われる患者のリンパ節から抽出したRNA、を含む、請求項55に記載の組成物。
- CEA、CK7、CK19、PVA、SCCA1.2、SFTPBおよびTACSTD1の1つまたはそれ以上に特異的な1またはそれ以上のプライマーまたはプローブ、および肺癌を有すると診断されたかまたは有することが疑われる患者のリンパ節から抽出したRNAを含む、請求項55に記載の組成物。
- 1またはそれ以上のプライマーまたはプローブが、基材に接着される、請求項55に記載の組成物。
- 基材が、1またはそれ以上のプライマーまたはプローブの2またはそれ以上のアレイである、請求項58に記載の組成物。
- ポリメラーゼ;リボ核酸またはデオキシリボ核酸またはその類似体;および対照核酸;の1またはそれ以上をさらに含む、請求項55に記載の組成物。
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