JP2008508505A - 生体高分子の精製および分離のためのモノリス状物体 - Google Patents
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Abstract
Description
a)二酸化ケイ素を反応容器に入れる;
b)少なくとも一種類以上のアルカリケイ酸塩およびホウ酸カリウムを含む溶液Aの添加、
c)少なくとも一種類以上の細孔形成剤および水を含む溶液Bの添加、
d)少なくとも一種類の有機アミドの添加、および
e)反応混合物の乾燥。
少なくとも一種類のコロイドシリカゲル0.1〜25%、
水0.1〜30%、
少なくとも一種類の細孔形成剤0.1〜12%、
少なくとも一種類の有機アミド6〜12%、
ホウ酸カリウム0.1〜5%、
少なくとも一種類の遷移金属の塩0〜10%。
ケイ酸カリウム(28/30)50〜60%、
少なくとも一種類のコロイドシリカゲル5〜10%、
水10〜25%、
ポリエチレングリコールおよび/またはジエチレングリコール3〜6%、
ホルムアミドおよび/または尿素5〜10%、
ホウ酸カリウム0.5〜2%、
グリセロール0〜2%および
少なくとも一種類の遷移金属の塩0〜10%。
まず溶液Aおよび溶液Bが調製された(表1参照)。さまざまな量の市販のコロイド二酸化ケイ素を次いで50mlPE容器へ入れ、その中へ溶液Aおよび溶液Bをゾル形成のために連続撹拌しながらゆっくりピペットで加えた。ゲル形成のために、わずかに濁ったしかし沈澱のない反応混合物(RG)に、さまざまな量のホルムアミド(表1参照)を加えた。次に、有機アミドの添加の30分以内に、反応混合物それぞれ150μlを、(たとえば粘着テープなどで)出口を最初閉じた(1)市販のスピンカラムまたは(2)市販のウェルプレートの孔へピペットで加えた。重合後、成型器具の一部の上側の入口もまた覆った。最後に、成型器具を乾燥キャビネット内で20時間40℃に加温した。
(1)スピンカラム中で得られたモノリスはスピンカラムの下部を完全に満たした。クランプ環を挿入することによってモノリスはスピンカラム中に固定され、および血液試料、ラット肝臓組織およびラット脳組織からのゲノムDNAおよびRNAの単離に直接用いられた。
本発明に記載のモノリスの乾燥時間を調べるために、調製したゲルを型器具に入れ、およびこれらを乾燥キャビネット内で約40℃に加温した。形成されたモノリスフリット(成型物体)が乾燥にどれだけの長さ必要かを決定するために毎時間チェックした。実施した実験系列に基づいて、本発明に記載のモノリスは約2時間の反応時間後に硬化しおよび一定の安定性を有したことを実証できた。しかし、それらは、それらを用いて分析結果の成功を得られるような形でシリカ摩耗を防ぐためにはまだ安定性が不十分であった。フリットの完全な性能は17〜20時間後に最初に達成された。
本発明にしたがって調製されたモノリスを互いに比較可能にするため、モノリスを異なる組成の一連の反応混合物から調製しおよびそれらの特性を調べた。この下記の選ばれたものは典型的でありおよび本発明に記載のモノリスの特性を説明するのに役立つ。
a)硫酸銅を含むRNA選択的モノリスの調製
溶液Cの調製のために、硫酸銅15.9mg(フルカ社(Fluka)、スイス、ブーフス(Buchs))および39.8mg酒石酸カリウム(フルカ社、スイス、ブーフス)を水0.5mlに溶解しおよび水酸化カリウム15.0mg(フルカ社、スイス、ブーフス)でゆっくり処理した。結果として生じる青色の懸濁液を、実施例1の通りに調製した溶液A中へボルテックスしながらピペットで加えた。透明青色の溶液が生じた。これを50mlポリエチレン容器に入ったコロイド二酸化ケイ素0.5mlへピペットでゆっくり加えた。次に、同様にボルテックスしながら、水2mlに溶解した360mgのPEG3000および40mgのグリセロールを含む溶液Bをゆっくり加えた。ホルムアミド0.5mlの添加後、各回100μlの溶液を、対応して準備したスピンカラムにピペットで入れ、および乾燥キャビネット中で20時間40℃に加温した。組織試料からの、gDNAを含まないおよび再現可能なRNA単離が達成された。
b) 組織10mg当たり総RNA 19 μg (gDNA 汚染無し)
c) 組織10mg当たり総RNA 19 μg(gDNA 汚染無し)
d) 組織10mg当たり総RNA 20 μg(gDNA 汚染無し)
溶液Cの調製のために、過マンガン酸カリウム0.0625g(フルカ社(Fluka)、スイス、ブーフス(Buchs))を0.5ml脱イオン水0.5mlに溶解した。過マンガン酸カリウム溶液を、実施例1の通りに調製した溶液A中へボルテックスしながらピペットで加えた。コロイドシリカゲル0.5mlを次いで50mlポリエチレン容器に入れ、および上記のケイ酸カリウムおよび過マンガン酸カリウムの混合物をゆっくりピペットで加えた。その後、再びボルテックスしながら、脱イオン水2mlに溶解した360mgのPEG3000および40mlのグリセロールを含む溶液Bを加えた。最後にホルムアミド0.5mlをゆっくり加え、およびそれぞれ準備したスピンカラムにピペットで入れた。乾燥キャビネット中で20時間40℃の乾燥時間後、結果として生じたモノリスをさまざまな組織からのRNAの単離に使用できた。さまざまな組織試料からの、gDNAを含まないおよび再現可能なRNA単離が達成された。
b)組織10mg当たり総RNA8μg(gDNA汚染無し)
実施例の通りにRG2から調製された本発明に記載のモノリス状物体の表面のコーティングのために、乾燥フィルターまたは分離材料を二種類の異なる溶液に浸漬した。一方ではモノリス状物体を5%四塩化ジルコニウム/THF溶液(L1)に18時間入れ、および他方では5%ジルコニウム(IV)イソプロポキシド−イソプロパノール複合体/エタノール溶液(L2)中に入れた。
比較のために、150μlに加えて、100μlの調製された反応混合物RG2をスピンカラムに入れ、および乾燥キャビネット中で40℃に20時間加温した。次に本発明に記載のモノリス状物体の容量を、キアクイック(QIAQuick)スピンカラム(キアゲン社(QIAGEN GmbH)、ドイツ、ヒルデン(Hilden))の容量と比較した。
b)gDNA10.4μg
c)gDNA8.5μg
d)gDNA10.5μg
この例では、本発明に記載のモノリス状物体(反応混合物RG2から調製)を乾燥キャビネット中で長い保存期間経時させた。調製されたモノリスフリット30個のうち、15個をさらに40時間60℃にて乾燥キャビネット中で乾燥させた(空気循環段階3)。
Claims (13)
- 下記の処理段階を含む方法によって得られるモノリス状物体:
a)二酸化ケイ素を反応容器に入れる;
b)少なくとも一種類以上のアルカリケイ酸塩およびホウ酸カリウムを含む溶液Aの添加、
c)少なくとも一種類以上の細孔形成剤および水を含む溶液Bの添加、
d)少なくとも一種類の有機アミドの添加、および
e)反応混合物の乾燥。 - ホウ素0.1〜0.3%を含む点で特徴づけられる、請求項1に記載の方法によって得られるモノリス状物体。
- ホウ素0.15〜0.25%を含む点で特徴づけられる、請求項1に記載の方法によって得られるモノリス状物体。
- ホウ素0.18〜0.22%を含む点で特徴づけられる、請求項1に記載の方法によって得られるモノリス状物体。
- ポリアルコール、好ましくはエチレングリコール、ジエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール、特に好ましいポリエチレングリコール、グリセロールおよびジグリセロールおよびそれらの混合物が細孔形成剤として用いられる点で特徴づけられる、請求項1に記載の方法によって得られるモノリス状物体。
- ホルムアミドおよび/または尿素が有機アミドとして用いられる点で特徴づけられる、請求項1に記載の方法によって得られるモノリス状物体。
- 反応混合物が最大20時間40℃〜60℃にて乾燥される点で特徴づけられる、請求項1に記載の方法によって得られるモノリス状物体。
- 一種類以上の遷移金属塩を含む水溶液Cが溶液Aに添加される点で特徴づけられる、請求項1に記載の方法によって得られるモノリス状物体。
- 銅、亜鉛および/またはマンガン塩の水溶液が溶液Cとして用いられる点で特徴づけられる、請求項8に記載のモノリス状物体。
- 反応混合物が
ケイ酸カリウム35〜85%、
少なくとも一種類のコロイドシリカゲル0.1〜25%、
水0.1〜30%、
少なくとも一種類の細孔形成剤0.1〜12%、
少なくとも一種類の有機アミド6〜12%、
ホウ酸カリウム0.1〜5%、
少なくとも一種類の遷移金属の塩0〜10%
である点で特徴づけられる、前記請求項のうち一つに記載のモノリス状物体。 - 反応混合物が好ましくは
ケイ酸カリウム(28/30)50〜60%、
少なくとも一種類のコロイドシリカゲル5〜10%、
水10〜25%、
ポリエチレングリコールおよび/またはジエチレングリコール3〜6%、
ホルムアミドおよび/または尿素5〜10%、
ホウ酸カリウム0.5〜2%、
グリセロール0〜2%および
少なくとも一種類の遷移金属の塩0〜10%
である点で特徴づけられる、前記請求項のうち一つに記載のモノリス状物体。 - 生体高分子の精製および分離のためのクロマトグラフィー分離材料としての、前記請求項のうち一つに記載のモノリス状物体の使用。
- 生体高分子の選択的分離のためのクロマトグラフィー分離材料としての、前記請求項のうち一つに記載のモノリス状物体の使用。
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