JP2008504832A - バクテリオファージにおける組換え遺伝子の産生 - Google Patents
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Abstract
Description
a)該第一のマーカー遺伝子の遺伝子産物が発現されるように該プロモーターが配向されているのであれば細胞および/またはバクテリオファージの増殖のみを許容する選択条件下で、バクテリオファージを含む第一のバクテリア宿主細胞を培養する工程、および、
b)選択条件下で成長および/または増殖した該第一の宿主細胞に由来し、第一のおよび第二の組換えDNA配列を含むバクテリオファージの子孫を単離する工程
を含む方法を提供することによって解決した。
a)1b)で得られたバクテリオファージの子孫を第二のバクテリア宿主細胞に導入する工程、
b)前記第一のマーカー遺伝子の遺伝子産物が発現されないように前記プロモーターが配向されているのであれば細胞および/またはバクテリオファージの増殖を許容する選択条件下で、該バクテリオファージの子孫を含む第二の宿主細胞を培養する工程、および、
c)選択条件下で成長および/または増殖し、第三および第四の組換えDNA配列を含む該第二の宿主細胞に由来するバクテリオファージの子孫を単離する工程を含む。
インビボで高効率でモザイク遺伝子を作るために、2つの選択戦略を開発した。どちらのシステムも、2つの組換え基質が逆の配置でプロモーターに隣接しているコンストラクトを利用する。プロモーターの配向によって、2つの組換え基質のうちの一方または他方が転写され、該基質のさらに下流の遺伝子が同様にこの転写調節を受ける。これらの下流の遺伝子が、それによって特定のプロモーターの配向が選択される適当な条件下で検出され、そして選択される。2つの組換え基質が関与する交差(クロスオーバー)組換えはプロモーターの逆位を導き、特定の下流遺伝子の発現を選択する条件下で組換え体が同定される。
溶菌性選択戦略に基づくシステムは、溶菌性期の間に組換え体を検出する。図1に示すように、異なる配列がクローンされた。選択は、ラムダgam遺伝子の発現または発現がないことに基づく。介在する配列の一方の配向においては、ラムダプロモーターpLからの転写がgam遺伝子を活性化し、イー・コリ(E. coli)recA−の菌叢上に溶菌斑を形成させ、イー・コリP2溶原菌の菌叢上の溶菌斑の形成を妨げる。pLが逆の配向で存在すると、gamの転写が起こらず、P2溶原菌の溶菌性の成長が起こり、recA−宿主の成長が阻害される。
このシステムでは、組換え体は溶菌斑としてよりむしろ、バクテリアの溶原菌−ラムダゲノムをその染色体内に有する細胞−として回収することができる。gam遺伝子の転写を活性化するかわりに、人工的なプロモーターProは一方の配向において抗生物質耐性マーカー(ここでは、スペクチノマイシン)を発現する遺伝子を活性化し、もう一方の配向において抗生物質耐性遺伝子(ここでは、クロラムフェニコール;図2参照)を発現する他の遺伝子を活性化する。
使用された菌株
使用されたイー・コリ菌株を表1に一覧にする。
両方の選択戦略について、標的であるラムダプロファージと相同の配列に隣接する線状DNA断片を作製するため組換えカセットを含むプラスミドを適当な制限酵素を用いて切断した。イー・コリAB1157:λCI854::pKD46細胞が形質転換受容性(コンピテント)とされ、精製した線状DNAを用いて形質転換された。形質転換受容性への誘導に先立って、細胞は、pKD46上にコードされているred−gam複合体の転写を促進するL−アラビノースで処理された。この複合体は、相同的組換えによってシャッフリングカセット(shuffling cassette)のプロファージゲノムへの組み込みを媒介する(Kirill A.ら、PNAS 2000, 97, 6640-6645)。組み込まれたシャッフリングカセットをもつ溶原菌は、適当な抗生物質の存在下、30℃で選択された。ファージのストック品の作製のために、溶原菌は液体培地で許容される温度でOD=0.2まで培養された。この培養物を42℃に10分間移し、その後溶菌が完了するまで37℃に移した。遠心分離の後、クロロホルム(1/500)を上澄みに添加し、得られたファージのストックを4℃で貯蔵した。
野生型およびmutS P2溶原菌(NK5196[P2]誘導体)を、最初のファージストックを用いて感染させ、そして溶菌斑を得るためにリッチ培地に蒔いた。第一ラウンドの組換え体(“フリップ”)を選択するために、これらの溶菌斑からファージを調製し、C600 recA細胞およびNK5196(P2)溶原菌を感染させるために使用した。第二ラウンドの組換え体(“フロップ”)を選択するために、recA宿主に生じた溶菌斑からファージを調製し、そしてC600 recA細胞およびNK5196(P2)溶原菌を再度感染させるために使用した。各宿主上に形成される溶菌斑の相対的な発生頻度が、組換えの発生頻度を決定するために用いられた。
C600 hflおよびC600 hfl mutS細胞を、最初のファージストックを用いて感染させ、そして耐性溶原菌を得るためにスペクチノマイシン上に蒔いた。第一ラウンドの組換え体を選択するために、溶原菌が溶解するように誘導し、ファージのストックを調製してC600 hfl細胞を感染させるために使用した。溶原菌がクロラムフェニコールまたはスペクチノマイシンで選択された。
両方の選択戦略について、第一ラウンドおよび第二ラウンドの組換え型分子を特異的なプライマー対を用いてPCRにより増幅させ、標準的な方法で配列決定した。
溶菌性選択戦略を用いたラムダにおける組換え
実施例1
Oxa7−Oxa7、Oxa7−Oxa11およびOxa7−Oxa5組換え基質を有するシャッフリングカセットを含むプラスミドが構築された。図3に、2つの異なるOxa基質を含むプラスミドpMAP188の構造を示す。カセットはプラスミドから切り出され、宿主溶原菌に導入され、この宿主溶原菌は、その後最初のファージストックを作製するために用いられた。組換え実験のための宿主として、2つの異なるラムダ誘導体、λgt11(Young, RAおよびDavis, RW, 1983 PNAS 80:1194-1198)およびλcl857(Hendrix, RWら(編者) Lambda II, 1983, CSH)を含む溶原菌が使用された。表2から、両方のラムダ誘導体を用いて組換え体が産生されること、そして、Oxaの相違の度合いおよびラムダ宿主によって、mutSバックグラウンドにおける方が野生型バックグラウンドにおけるより発生頻度が大体10倍高いことが分かる。
λgt11およびλcl857を用いて野生型およびmutSバックグラウンドで得られた“フリップ”組換え発生頻度。組換えの発生頻度は、(生存しているgam+の総数)/(生存しているgam+の総数+生存しているgam−の総数)として計算し、3つの別個の実験の平均±標準偏差として表した。*Oxa7−Oxa11遺伝子対の組換え頻度が、より高感度の手順を用いて決定された実験の結果。
λgt11およびλcl857を用いて野生型およびmutSバックグラウンドで得られた“フロップ”組換え発生頻度。異なる長さの同一配列のセグメントを有する2つの“フリップ”組換え産物を用いて、Oxa7−11およびOxa7−5基質対が作製された。bp:塩基対;sz:同一配列のサイズ;n.d.:決定せず。
実施例2
ベクターpMA188(図3参照)が大きく、宿主バクテリアに対して有毒のように見え、そしてさらなるクローニングのための好適な制限部位を有さないため、新しいプラスミドpMIX−LAM(図5参照)が構築された。2つの重大な特徴が、このコンストラクトに組み入れられた:1)新規なベクターが、逆にできるプロモーターおよび不可欠なラムダ機能をコードしており、シャッフリングカセットのプロファージゲノムへのターゲティングを許容する遺伝子を含むラムダ配列のいくつかのクラスターを含む;および2)ベクターは、容易なサブクローニングのための特有の部位を供給し、これらの部位は、より複雑な遺伝子または遺伝子クラスターの導入を容易にするために他のマルチクローニングサイトと交換されうる。pMIX−LAMは、マルチクローニングサイトに隣接する逆にできるラムダのpLプロモーター領域を含むpACYC184の誘導体であり、pMAP188をテンプレートとして用いた増幅産物として得ることができる。それはまた、pMAP188から制限断片として単離されるcIおよびcIIIフランキング配列を含む。
この取り組みにおいては、組換え体の確認は個々の細胞(シャッフリングカセットを含む溶原菌)の選択により、該個々の細胞においては2つの組換え基質の間に位置する人工のプロモーターが配向を変更し、組換え基質の下流の2つの抗生物質耐性マーカーのうちの一方または他方を発現させる。図6に、組換えられる遺伝子を含むシャッフリングカセットを有するベクターの必須の特徴を記載する。
Claims (55)
- バクテリオファージおよびバクテリア宿主細胞を含む系において組換え型DNA配列を産生および検出するための方法であって、
該バクテリオファージが、組換えられる第一のおよび第二のDNA配列に隣接するプロモーター、ならびに該第一のDNA配列の下流に位置する少なくとも1つの第一のマーカー遺伝子を含み、
該2つのDNA配列の組換えが、フリップフロップ様式で該プロモーターの逆位を導き、
該プロモーターの配向に応じて、一方のまたは他方のDNA配列およびマーカー遺伝子が転写され得るか、または転写されないかであり、
a)該第一のマーカー遺伝子の遺伝子産物が発現されるように該プロモーターが配向されているのであれば細胞および/またはバクテリオファージの増殖のみを許容する選択条件下で、バクテリオファージを含む第一のバクテリア宿主細胞を培養する工程、および、
b)選択条件下で成長および/または増殖した該第一の宿主細胞に由来し、第一のおよび第二の組換えDNA配列を含むバクテリオファージの子孫を単離する工程
を含む方法。 - さらに、
a)1b)で得られたバクテリオファージの子孫を第二のバクテリア宿主細胞に導入する工程、
b)組換えを行い、前記第一のマーカー遺伝子の遺伝子産物が発現されないように前記プロモーターが配向されているのであれば細胞および/またはバクテリオファージの増殖のみを許容する選択条件下で、該バクテリオファージの子孫を含む第二の宿主細胞を培養する工程、および、
c)選択条件下で成長および/または増殖した該第二の宿主細胞に由来し、第三および第四の組換えDNA配列を含むバクテリオファージの子孫を単離する工程
を含む請求項1に記載の方法。 - 2c)で得られた前記バクテリオファージの子孫を、工程1a)ないし1b)または工程1a)ないし1b)に加えて工程2a)ないし2c)の別のサイクルに少なくとも1回供することにより、さらに組換えDNA配列を産生する請求項1または2に記載の方法。
- 前記バクテリオファージを含む第一のおよび/または第二の宿主細胞が、そのゲノム中にプロファージを含むかまたは含まないバクテリア細胞にバクテリオファージを導入することにより産生される請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バクテリオファージがバクテリオファージラムダの誘導体である請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バクテリオファージを含む第一の宿主細胞が、バクテリオファージ配列、プロモーターに隣接する組換えられる2つのDNA配列および前記第一のマーカー遺伝子を含むプラスミドを、そのゲノム中にプロファージを含むバクテリア細胞に導入することにより産生される請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロファージを含むバクテリア細胞へのプラスミドの導入において、プラスミドが相同的組換えを通してゲノムに組み込まれる請求項6に記載の方法。
- 前記プラスミドが、バクテリオファージラムダのpL+Nプロモーター領域およびフランキング配列cI+rexaおよびcIII+IS10を含むプラスミドpACYC184の誘導体であり、宿主溶原菌中のラムダゲノムの標的となりうるプラスミドpMIX−LAMである請求項6または7に記載の方法。
- 前記プラスミドが、低コピー数プラスミドから誘導され、colE1複製開始点ならびにラムダプロファージゲノムへの組み込みを促進する標的配列LGおよびLDを含むpAC−OX−OYである請求項6または7に記載の方法。
- 前記プロモーターがラムダのpLプロモーターである請求項1ないし9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロモーターがプロモーターProである請求項1ないし9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一のマーカー遺伝子が、ラムダ遺伝子、栄養マーカー遺伝子、抗生物質耐性マーカー遺伝子および酵素のサブユニットをコードしている配列からなる群より選択されるものである請求項1ないし11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一のマーカー遺伝子がラムダのgam遺伝子である請求項12に記載の方法。
- 前記フリップポジションのプロモーターからのgam遺伝子の転写が、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)recA宿主細胞の菌叢上に溶菌斑を形成させ、イー・コリ(E. coli)P2溶原性宿主細胞の菌叢上の溶菌斑の形成を妨げる請求項13に記載の方法。
- 前記プロモーターのフロップ配向のためにgam遺伝子の転写がないことが、イー・コリP2溶原性宿主細胞の菌叢上に溶菌斑を形成させ、イー・コリrecA宿主細胞の菌叢上の溶菌斑の形成を妨げる請求項13に記載の方法。
- 前記第一のマーカー遺伝子がCmRである請求項12に記載の方法。
- フリップポジションの前記プロモーターからのCmR遺伝子の転写が、クロラムフェニコールを含む培地上でのバクテリア宿主細胞の成長を許容し、前記プロモーターのフロップ配向のためにCmR遺伝子の転写がないと、クロラムフェニコールを含む培地上でのバクテリア宿主細胞の成長が阻害される請求項16に記載の方法。
- 前記バクテリオファージまたはプラスミドが、組換えられる第二のDNA配列の下流に位置し、プロモーターの配向によって転写され得るか、または転写されない第二のマーカー遺伝子を含む請求項1ないし17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第二のマーカー遺伝子を有するバクテリオファージの子孫を含む第二の宿主細胞が、前記プロモーターが第二のマーカー遺伝子の遺伝子産物が発現されるように配向されているのであれば該細胞および/または該バクテリオファージの増殖のみを許容する選択条件下で培養される請求項18に記載の方法。
- 前記第二のマーカー遺伝子が、栄養マーカー遺伝子、抗生物質耐性マーカー遺伝子および酵素のサブユニットをコードしている配列からなる群より選択されるものである請求項18または19に記載の方法。
- 前記第二のマーカー遺伝子がSpecRである請求項20に記載の方法。
- フロップポジションの前記プロモーターからのSpecR遺伝子の転写が、スペクチノマイシンを含む培地上でのバクテリア宿主細胞の成長を許容し、前記プロモーターのフリップ配向のためにSpecR遺伝子の転写がないと、スペクチノマイシンを含む培地上でのバクテリア宿主細胞の増殖が阻害される請求項21に記載の方法。
- 前記バクテリア宿主細胞が、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌またはラン藻の細胞である請求項1ないし22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記グラム陰性細菌がイー・コリである請求項23に記載の方法。
- 前記バクテリア宿主細胞が機能性ミスマッチ修復システムを有するものである請求項1ないし24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バクテリア宿主細胞が、一過的または永久的にミスマッチ修復システムを欠損しているものである請求項1ないし24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ミスマッチ修復システムの一過的または永久的な欠損が、ミスマッチ修復システムに関わる1または複数の遺伝子の変異、欠損、および/または誘発性の発現または抑制、ミスマッチ修復システムを飽和させる薬剤による処理および/またはミスマッチ修復システムを包括的にノックアウトする薬剤による処理によるものである請求項26に記載の方法。
- 前記バクテリア細胞が、変異したmutS遺伝子および/または変異したmutL遺伝子を有するものである請求項26または27に記載の方法。
- 前記組換えられる第一のおよび第二のDNA配列が、少なくとも2つのヌクレオチドが異なるものである請求項1ないし28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えられる第一のおよび第二のDNA配列が、天然に存在する配列および/または人工的な配列である請求項1ないし29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えられる第一のおよび/または第二のDNA配列が、ウイルス、バクテリア、植物、動物および/またはヒト由来のものである請求項30に記載の方法。
- 前記組換えられる第一のおよび第二のDNA配列が、各々、1または複数の蛋白をコードしている配列および/または1または複数の非コード配列を含む請求項1ないし31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えられる第一のおよび/または第二のDNA配列のバクテリオファージまたはプラスミドへの挿入が、個々のDNA配列を含む断片を、少なくとも1つの制限酵素で予め切断したバクテリオファージまたはプラスミドの部位にクローニングすることにより行われる請求項1ないし32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えられる第一のおよび/または第二のDNA配列のバクテリオファージまたはプラスミドへの挿入が、それぞれのDNA配列を含み、バクテリオファージまたはプラスミドの配列と相同の配列に隣接する断片の相同的組換えにより行われる請求項1ないし32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えDNA配列を含むバクテリオファージの子孫が溶菌斑から単離される請求項1ないし34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えDNA配列を含むバクテリオファージの子孫が、バクテリアの溶原菌から単離される請求項1ないし34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一のバクテリア宿主細胞のバクテリオファージの子孫に含まれる第一のおよび第二の組換えDNA配列、および/または第二のバクテリア宿主細胞のバクテリオファージの子孫に含まれる第三のおよび第四の組換え配列が単離されおよび/または分析される請求項1ないし36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換えDNA配列が、PCRにより増幅され、および/または制限酵素による切断によって単離される請求項37に記載の方法。
- バクテリオファージおよびバクテリア宿主細胞を含む系においてハイブリッド遺伝子を産生する方法であって、
請求項1ないし38のいずれか一項に記載の方法を行い、このして得られたハイブリッド遺伝子が、バクテリア細胞に、またはバクテリア細胞の菌叢上に形成された溶菌斑に含まれるバクテリオファージの子孫から選択および/または単離される、方法。 - 前記単離されたハイブリッド遺伝子が分析され、および/または少なくとも1つの調節単位を機能的に制御した条件下で発現ベクターに挿入される請求項39に記載の方法。
- バクテリオファージおよびバクテリア宿主細胞を含む系においてハイブリッド遺伝子によってコードされているハイブリッド蛋白を産生する方法であって、
請求項1ないし38のいずれか一項に記載の方法を実施することでハイブリッド遺伝子が形成され、該ハイブリッド遺伝子にコードされたハイブリッド蛋白が、バクテリア細胞または発現によってバクテリア細胞の菌叢上に形成された溶菌斑から選択され、および/または単離される、方法。 - 前記ハイブリッド蛋白をコードするハイブリッド遺伝子が単離され、少なくとも1つの調節単位を機能的に制御した条件下で発現ベクターに挿入される請求項41に記載の方法。
- 前記挿入されたハイブリッド遺伝子を含む発現ベクターが、適当な宿主細胞に導入される請求項42に記載の方法。
- 前記発現ベクターを含む宿主細胞が、ハイブリッド蛋白の発現を許容する条件下で培養される請求項43に記載の方法。
- 請求項1ないし38のいずれか一項に記載の方法により、または請求項39もしくは40に記載の方法により得られるハイブリッド遺伝子。
- 請求項45に記載のハイブリッド遺伝子によってコードされており、請求項41ないし44のいずれか一項に記載の方法により得ることのできる蛋白。
- SpecRマーカーおよびCmRマーカーに隣接するプロモーターProを含むバクテリオファージラムダの誘導体であって、
第一の外来DNA配列を挿入するために、少なくとも第一のおよび第二の制限部位がプロモーターとSpecRマーカーとの間に位置し、第二の外来DNA配列を挿入するために、少なくとも第三のおよび第四の制限部位がプロモーターとCmRマーカーとの間に位置する、バクテリオファージラムダの誘導体。 - プラスミドpACYC184の誘導体であり、バクテリオファージラムダのpL+Nプロモーター領域ならびにフランキング配列cI+rexaおよびcIII+IS10、pL+N断片を含むプロモーターに隣接するマルチクローニングサイトMCS1およびMCS2、ならびに、CmRマーカー遺伝子を含み、宿主溶原菌中のラムダゲノムの標的となりうるプラスミドpMIX−LAM。
- 低コピー数プラスミドから誘導され、colE1複製開始点、マーカー遺伝子CmRおよびSpecRならびにラムダプロファージゲノムへの組み込みを促進する標的配列LGおよびLDを含む、プラスミドpAC−OX−OY。
- 少なくとも、プロモーターpLおよびgam遺伝子を含むバクテリオファージラムダのDNA、またはそのバクテリオファージを含むイー・コリrecA菌株の細胞を含む第一の容器、イー・コリrecA菌株の細胞を含む第二の容器、および、イー・コリP2溶原性菌株の細胞を含む第三の容器を含む、キット。
- 少なくとも、プラスミドpMIX−LAMのDNAまたはプラスミドpMIX−LAMを含むイー・コリrecA菌株の細胞を含む第一の容器、イー・コリrecA菌株の細胞を含む第二の容器、およびイー・コリP2溶原性菌株の細胞を含む第三の容器を含む、キット。
- 少なくとも、請求項47に記載のバクテリオファージ誘導体のDNAまたは請求項47に記載のバクテリオファージ誘導体を含むイー・コリ菌株の細胞を含む第一の容器、およびイー・コリ菌株の細胞を含む第二の容器を含む、キット。
- 少なくとも、プラスミドpAC−OX−OYのDNAまたはプラスミドpAC−OX−OYを含むイー・コリ菌株の細胞を含む第一の容器、およびイー・コリ菌株の細胞を含む第二の容器を含む、キット。
- 前記イー・コリ菌株の細胞がmutSである請求項50ないし53のいずれか一項に記載のキット。
- 請求項1ないし38のいずれか一項に記載の組換え型DNA配列を産生および/または検出する方法における、請求項39もしくは40に記載のハイブリッド遺伝子を産生する方法における、または請求項41ないし44のいずれか一項に記載のハイブリッド蛋白を産生する方法における、プラスミドpMIX−LAM、プラスミドpAC−OX−OY、プロモーターpLおよびgam遺伝子を含むバクテリオファージラムダ、または請求項47に記載のバクテリオファージの使用。
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