JP2008232877A - 生体分子の固定用材料、生体分子が固定化された固相体及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】炭素質膜にケイ素を含有させることで、生体分子に対する固定化能を発現させる。すなわち、固定用材料の固定化能を化学修飾によらず炭素質膜自体の構造に由来させるようにする。
【選択図】なし
Description
本発明の固定用材料は、生体分子を固定化するものである。図1(a)に、固定用材料の一例として、生体分子を固定化するための固定用材料10を示すが、これに限定するものではない。図1(a)における固定用材料10は、基材2と、基材2の表面に形成されケイ素を含有する炭素質膜4とを備える。以下、本固定用材料について順次説明する。
本発明の対象とする生体分子は、一分子のみを意味するものではなく、二分子以上からなる同種分子の集合体であってもよいし、異種分子との複合体であってもよい。さらに、多数の同種又は異種の分子から構成される、例えば自己組織体などの組織体であってもよい。
本固定用材料は炭素質膜4を備える。この炭素質膜4の結晶構造は特に限定せず、結晶質でもよいし非晶質でもよい。好ましくは、sp3混成軌道を持つ炭素(sp3混成軌道炭素)を有する結晶質膜(例えば、ダイヤモンド膜)又は非晶質炭素膜であり、より好ましくは、非晶質炭素膜である。非晶質炭素質膜は、好ましくは、sp3混成軌道を持つ炭素(sp3混成軌道炭素)とsp2混成軌道を持つ炭素(sp2混成軌道炭素)とが混在するアモルファス構造をとる炭素系材料からなる膜である。非晶質炭素は、化学的安定性に優れている点や、UV吸収がない点、赤外線透過性を有する点、タンパク質等の非特異的吸着を防ぐ点などにおいて、生体分子の固定用材料として用いるのに適している。また、非晶質炭素は、粒界がなく、どの部分にも均一に固定化できることから、均一材料としての固定化用に適している。このような非晶質炭素は、一般に、ダイヤモンドライクカーボンとして入手することができる。
本発明における炭素質膜4はケイ素を含有する。ケイ素は、炭素質膜表面だけでなく、その膜厚方向全体にわたり炭素質膜4に存在することができる。本固定用材料のケイ素の少なくとも一部は、炭素質膜4のsp3混成軌道を構成する炭素原子を置換した状態で含まれていると考えられるからである。
炭素質膜4は水素を含有していてもよい。水素の含有量は特に限定しないが、10at%を超えて50at%未満であるのが好ましい。より好ましくは、20at%を超えて30at%未満である。水素を含むことで膜の内部応力を低減することができ、厚膜を形成することが容易となる。
本固定用材料は、炭素質膜4の表面にシラノール基を備えることができる。本固定用材料の炭素質膜4への生体分子の固定化メカニズムは必ずしも明らかでなく本発明を拘束するものではないが、炭素質膜表面に存在するシラノール基と生体分子との相互作用により生体分子を炭素質膜4上に保持することができると考えられる。なお、シラノール基と生体分子との相互作用は特に限定せず、水素結合性相互作用など各種相互作用を採ることができると考えられる。
本発明の固相体は、上述した固定用材料10に上記生体分子を固定化したものである。図1(b)に、固相体の一例として、生体分子6が固定化された固相体20を示す。本固相体20における固定用材料10には、既に説明した上記各種形態の本発明の固定用材料をそのまま適用することができる。したがって、本固相体によれば、生体分子6を炭素質膜4に固定化した固相体20を得ることができ、これにより、本発明の固定用材料において上記した各種の利点を得ることができる。また、本固相体は、いわゆるプロテインチップやDNAチップ等として、炭素質膜表面に固定化した生体分子の機能等を利用した診断や治療等を行うことができる。
本発明の固相体の製造方法は、上述した固定用材料の炭素質膜表面に生体分子を接触させることにより該生体分子を炭素質膜に保持させる工程を備えることができる。なお、本製造方法における固定用材料には、既に説明した本発明の固定用材料における構成、成分、形状や用途などをそのまま適用することができる。したがって、本製造方法における製造工程は、上記各種形態の本発明の固定用材料を製造するための製造工程を含むことができる。
本発明の固相体の使用方法は、上記固相体に固定化された上記生体分子に被験試料を供給して生体分子と被験試料中の成分との相互作用を生じさせる工程と、当該相互作用を検出する工程とを備えることができる。なお、本使用方法における固定用材料には、既に説明した本発明の固定用材料及び固相体における構成、成分、形状や用途などをそのまま適用することができる。したがって、本使用方法における工程は、上記各種形態の本発明の固定用材料及び固相体を使用するための各種工程を含むことができる。
プラズマCVD成膜装置(日本電子工業(株)製、型番:JPE−468−HVMS−601)を用いて、基材の表面にケイ素含有非晶質炭素質膜(以下、DLC−Si膜と称する)を形成した。基材としては、オーステナイト系ステンレス鋼SUS304(HV200)製のブロック試験片(6.3mm×15.7mm×10.1mm)を用いた。具体的には、まず、成膜装置内に設置された基台の上にブロック試験片を配置して成膜装置を密閉したのち、装置内のガスを排気した。次に、装置内に水素ガスを15sccm導入し、ガス圧を約133Paとした。その後、装置内面に設けたステンレス製陽極板と基台との間に200Vの直流電圧を印加して放電を開始した。そして、基材の温度が500℃になるまでイオン衝撃による昇温を行った。続いて、窒素ガス500sccm及び水素ガス40sccmを装置内に導入し、圧力約800Pa、電圧400V(電流1.5A)、温度500℃でプラズマ窒化処理を1時間行った。基材の断面組織を観察したところ、窒化深さは30μmであった。
実施例1,2及び比較例1の各試料表面におけるシラノール基の存在を確認するために、誘導体化XPS法によりシラノール分析を行った。具体的には、まず、誘導体化試薬であるトリデカフルオロ−1,1,2,2−テトラヒドロオクチルジメチルクロロシラン(FOCS)をクロロホルムで1%に希釈した溶液中に各試料を1時間浸漬した。次に、クロロホルムにより2回繰り返し洗浄し、2分間超音波洗浄を行った。その試料をXPS装置(アルバック・ファイ(株)製、型番:PHI−5500−MC)内に入れ、フッ素量を求めた。その結果を表1に示す。なお、表1におけるフッ素量は、対照試料としての比較例1のフッ素量を差分した値を示す。
0.1−500ng/mLの各濃度のビオチン化抗体溶液1μL(緩衝液:TPBS(0.01% Tween20,リン酸緩衝食塩液)を実施例1、2及び比較例1、2の各試料表面に滴下し、これを真空乾燥した。その後、試料をTPBS溶液に浸漬し、5分間撹拌することによって洗浄した。この洗浄操作は3回繰り返した。この試料を1%のゼラチンを含むTPBS溶液に30分間浸漬してブロッキング処理を行った。その後、0.1μg/mLアルカリフォスファターゼ標識アビジン及び1%のゼラチンを含むTPBS溶液に30分間浸し反応させた。さらに、これをTPBS溶液に浸漬し、5分間撹拌することによって洗浄した。この洗浄操作は3回繰り返した。その後、純水で軽くすすいだ後、N2ブローにより試料を乾燥させた。この試料表面に化学発光溶液(CDP−star with emerald II)を滴下してギャップカバーグラスにより試料上面をカバーした後、化学発光検出器(アイシン精機(株)製、型番:LV−400)によりビオチン化抗体溶液を滴下した部分(スポット)に生ずる化学発光の強度を測定した。ビオチン化抗体溶液の滴下濃度を横軸に、スポットの化学発光強度を縦軸にとったときの対応関係から傾きを算出した。その結果を表2に示す。また、各試料の検出感度を表2に示す。
Claims (11)
- ケイ素を含有する炭素質膜を備える、生体分子の固定用材料。
- 前記炭素質膜は、表面にシラノール基を備える、請求項1に記載の固定用材料。
- 前記シラノール基は、トリデカフルオロ−1,1,2,2−テトラヒドロオクリルジメチルクロロシラン(FOCS)によって誘導体化後にXPS分析する誘導体化XPS法によってフッ素として検出される、請求項2に記載の固定用材料。
- 前記シラノール基は、前記誘導体化XPS法によって測定するとき、フッ素量として2at%以上である、請求項2又は3に記載の固定用材料。
- 前記炭素質膜は、非晶質炭素質膜である、請求項1〜4のいずれかに記載の固定用材料。
- 前記炭素質膜は、ケイ素を1.5at%以上30.0at%以下含有する、請求項1〜5のいずれかに記載の固定用材料。
- 前記炭素質膜は、全炭素中sp2混成軌道炭素を40%at以上70at%以下含有する、請求項1〜6のいずれかに記載の固定用材料。
- タンパク質の固定化用である、請求項1〜7のいずれかに記載の固定用材料。
- 生体分子が固定化された固相体であって
前記生体分子は、請求項1〜7のいずれかに記載の固定用材料の前記炭素質膜表面に保持されている、固相体。 - 生体分子が固定化された固相体の製造方法であって、
請求項1〜7のいずれかに記載の固定用材料の前記炭素質膜表面に前記生体分子を接触させることにより前記生体分子を前記炭素質膜に保持させる工程、を備える、製造方法。 - 生体分子が固定化された固相体の使用方法であって、
請求項9に記載の固相体に固定化された前記生体分子に被験試料を供給して前記生体分子と前記被験試料中の成分との相互作用を生じさせる工程と、
前記相互作用を検出する工程と、
を備える、使用方法。
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