JP2008232877A

JP2008232877A - Material for biomolecule immobilization, solid phase to which biomolecule is immobilized, and its manufacturing method

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Publication number: JP2008232877A
Application number: JP2007073984A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Mori; 広行森; Fumihiko Hoshino; 文彦星野; Kazuyuki Nakanishi; 和之中西; Osamu Watanabe; 修渡辺
Original assignee: Toyota Central R&D Labs Inc
Current assignee: Toyota Central R&D Labs Inc
Priority date: 2007-03-22
Filing date: 2007-03-22
Publication date: 2008-10-02

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a material for biomolecules immobilization having stable immobilizing power. <P>SOLUTION: Silicon is made contained in a carbonaceous film to develop immobilizing power to biomolecules. In other words, the immobilizing power of the material for immobilization is made derived not from chemical modification but from the structure of the carbonaceous film itself. <P>COPYRIGHT: (C)2009,JPO&INPIT

Description

本発明は、生体分子を固定化するための固定用材料、生体分子が固定化された固相体及びその製造方法に関する。 The present invention relates to an immobilization material for immobilizing a biomolecule, a solid phase on which the biomolecule is immobilized, and a method for producing the same.

従来より、固相担体に生体分子を固定化して、固相上で生体分子の分析や診断を行ったり、固相上で生体分子の機能を解析したりすることが行われている。固相上での生体分子の分析や機能研究を実現するにあたり、生体分子を固定化するための固定用材料として種々のものが提案されている。 Conventionally, biomolecules are immobilized on a solid phase carrier, and analysis and diagnosis of biomolecules are performed on the solid phase, and functions of biomolecules are analyzed on the solid phase. Various materials have been proposed as immobilization materials for immobilizing biomolecules in order to realize biomolecule analysis and functional studies on a solid phase.

例えば、特許文献1には、ダイヤモンドやダイヤモンドライクカーボン（以下、ＤＬＣ（ＤｉａｍｏｎｄＬｉｋｅＣａｒｂｏｎ）と称す）等といった炭素系物質の表面に活性エステル基を導入することにより、遺伝子あるいはタンパク質などの生体分子を該表面処理層に固定化することが開示されている。 For example, Patent Document 1 discloses that biomolecules such as genes or proteins are introduced by introducing an active ester group on the surface of a carbon-based material such as diamond or diamond-like carbon (hereinafter referred to as DLC (Diamond Like Carbon)). It is disclosed to immobilize on the surface treatment layer.

また、炭素質膜の表面に水酸基などの官能基を付加して化学修飾し、付加した官能基を利用してＤＮＡを固定化することも試みられている（例えば、特許文献２参照）。さらに、炭素質膜の表面にキレート配位子を導入し、この金属キレートを利用してタンパク質を固定化することも試みられている（例えば、特許文献３参照）。 In addition, attempts have been made to chemically modify a surface of the carbonaceous film by adding a functional group such as a hydroxyl group, and immobilize DNA using the added functional group (see, for example, Patent Document 2). Furthermore, it has also been attempted to immobilize proteins using a metal chelate by introducing a chelate ligand on the surface of the carbonaceous film (see, for example, Patent Document 3).

国際公開第０１／７５４４７号パンフレットInternational Publication No. 01/75447 Pamphlet 特許第３６０７１９９号公報Japanese Patent No. 3607199 特開２００４−２０３２８号公報JP 2004-20328 A

しかしながら、上記特許文献１〜３のように、生体分子を固定化しやすくするために炭素質膜の表面に化学修飾を施した場合、その化学修飾処理の安定性や性能が固相上における生体分子の固定状態や固定化量などの固定化能に影響を及ぼしていた。例えば、化学修飾処理が安定性に欠ける場合には、生体分子を固相上に一旦保持させた後であっても、経時変化に伴い生体分子が固相上から脱離してしまうおそれがあった。また、処理条件の変動で化学修飾の程度等にばらつきが生じる場合には、固定化量が変動するおそれもあった。 However, as described in Patent Documents 1 to 3, when the surface of the carbonaceous film is chemically modified to facilitate the immobilization of the biomolecule, the stability and performance of the chemical modification treatment is a biomolecule on the solid phase. It had an effect on the immobilization ability such as the immobilization state and the immobilization amount. For example, when the chemical modification treatment lacks stability, the biomolecule may be detached from the solid phase over time even after the biomolecule is once retained on the solid phase. . In addition, when the degree of chemical modification varies due to variation in processing conditions, the immobilization amount may also vary.

加えて、このような化学修飾を施すことにより繁雑な操作が必要な場合もあるほか、化学修飾のために、炭素質膜の特性、すなわち耐熱性や安定性も十分に発揮することもできず、生体分子の安定性に悪影響を及ぼすおそれもあった。 In addition, complicated operations may be required by applying such chemical modifications, and the characteristics of carbonaceous films, that is, heat resistance and stability cannot be fully exhibited due to chemical modifications. There was also a risk of adversely affecting the stability of biomolecules.

そこで、本発明は、安定した固定化能を備える生体分子の固定用材料を提供することを目的の一つとする。また、一旦固相上に保持した生体分子を安定して固定化し続けることのできる固相体、その製造方法及びその使用方法を提供することを他の目的の一つとする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a biomolecule immobilization material having a stable immobilization ability. Another object is to provide a solid phase body capable of stably immobilizing biomolecules once held on the solid phase, a method for producing the same, and a method for using the solid phase body.

本発明によれば、ケイ素を含有する炭素質膜を備える、生体分子の固定用材料が提供される。 According to the present invention, a biomolecule immobilization material comprising a carbonaceous film containing silicon is provided.

本固定用材料は、前記炭素質膜は、表面にシラノール基を備えていてもよい。この態様において、前記シラノール基は、トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクリルジメチルクロロシラン（ＦＯＣＳ）によって誘導体化後にＸＰＳ分析する誘導体化ＸＰＳ法によってフッ素として検出されるものとすることもできる。 In the present fixing material, the carbonaceous film may have a silanol group on the surface. In this embodiment, the silanol group shall be detected as fluorine by a derivatized XPS method in which XPS analysis is performed after derivatization with tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyldimethylchlorosilane (FOCS). You can also.

さらに、前記シラノール基は、前記誘導体化ＸＰＳ法によって測定するとき、フッ素量として２ａｔ％以上であるとすることもできる。 Furthermore, the silanol group may be 2 at% or more in terms of fluorine when measured by the derivatized XPS method.

本固定用材料は、前記炭素質膜は、非晶質炭素質膜であるとしてもよい。また、前記炭素質膜は、ケイ素を１．５ａｔ％以上３０．０ａｔ％以下含有するとしてもよい。さらに、前記炭素質膜は、全炭素中ｓｐ²混成軌道炭素を４０％ａｔ以上７０ａｔ％以下含有するとしてもよい。 In the present fixing material, the carbonaceous film may be an amorphous carbonaceous film. The carbonaceous film may contain silicon in a range of 1.5 at% to 30.0 at%. Further, the carbonaceous film may contain sp ² hybrid orbital carbon in the total carbon of 40% at or more and 70 at% or less.

また、本固定用材料は、タンパク質の固定化用であるとすることもできる。 The immobilization material can also be used for protein immobilization.

本発明によれば、生体分子が固定化された固相体であって、前記生体分子は、上述するいずれかの固定用材料の前記炭素質膜表面に保持されている、固相体が提供される。 According to the present invention, there is provided a solid phase body in which a biomolecule is immobilized, wherein the biomolecule is held on the surface of the carbonaceous film of any of the fixing materials described above. Is done.

本発明によれば、生体分子が固定化された固相体の製造方法であって、上述するいずれかの固定用材料の前記炭素質膜表面に前記生体分子を接触させることにより前記生体分子を前記炭素質膜に保持させる工程、を備える、製造方法が提供される。 According to the present invention, there is provided a method for producing a solid phase in which a biomolecule is immobilized, wherein the biomolecule is brought into contact with the surface of the carbonaceous film of any of the above-described immobilizing materials. A manufacturing method comprising the step of holding the carbonaceous film is provided.

さらに、本発明によれば、生体分子が固定化された固相体の使用方法であって、上記固相体に固定化された前記生体分子に被験試料を供給して前記生体分子と前記被験試料中の成分との相互作用を生じさせる工程と、前記相互作用を検出する工程と、を備える、使用方法が提供される。 Further, according to the present invention, there is provided a method for using a solid phase in which a biomolecule is immobilized, wherein a test sample is supplied to the biomolecule immobilized on the solid phase and the biomolecule and the test are supplied. A method of use is provided comprising the steps of causing an interaction with a component in a sample and detecting the interaction.

本発明の固定用材料は、ケイ素を含有する炭素質膜を備える。 The fixing material of the present invention includes a carbonaceous film containing silicon.

本発明の固定用材料によれば、炭素質膜にケイ素が含有されることで、生体分子に対する固定化能が発現され、生体分子の固定用材料として使用できる。炭素質膜が通常の使用状況、例えば、大気中や水溶液中などの酸化雰囲気に触れることにより、膜表面にシラノール基（Ｓｉ−ＯＨ）が形成され、このシラノール基を介して生体分子を膜表面に固定化すると考えられる。すなわち、本固定用材料の固定化能は、化学修飾によらず炭素質膜自体の構造に由来するため、安定した固定化能を付与しやすく、また、付与した固定化能が安定して維持される。また、化学修飾を必要とすることなく固定用材料の表面に生体分子を固定化することができるため、生体分子に対する悪影響も回避又は抑制される。さらに、本固定用材料は無機的な構造により構成されるため、分解等が起こりにくく化学的に安定である。 According to the immobilizing material of the present invention, the silicon-containing carbonaceous film exhibits immobilization ability for biomolecules and can be used as a biomolecule immobilizing material. When the carbonaceous membrane is exposed to normal use conditions, for example, in an oxidizing atmosphere such as in the air or in an aqueous solution, silanol groups (Si-OH) are formed on the membrane surface, and biomolecules are transferred to the membrane surface via the silanol groups. It is thought to be fixed to. In other words, the immobilization ability of the present immobilization material is derived from the structure of the carbonaceous film itself regardless of the chemical modification, so that it is easy to impart stable immobilization ability, and the imparted immobilization ability is stably maintained. Is done. In addition, since the biomolecule can be immobilized on the surface of the immobilizing material without requiring chemical modification, adverse effects on the biomolecule can be avoided or suppressed. Furthermore, since the fixing material is composed of an inorganic structure, it is chemically stable and hardly decomposes.

本発明の固相体は、生体分子が本発明の固定用材料に固定化されたものである。上述したように、本固定用材料は安定した固定化能を備えているほか、化学的な安定性に優れ分解等しにくい。したがって、本固相体によれば、一旦固相上に保持した生体分子を安定して固定化し続けることができる。また、本発明の固相体の製造方法によれば、一旦固相上に保持した生体分子を安定して固定化し続けることができる固相体を得ることができる。 The solid phase of the present invention is obtained by immobilizing a biomolecule on the fixing material of the present invention. As described above, the present fixing material has a stable immobilizing ability and is excellent in chemical stability and hardly decomposes. Therefore, according to this solid phase body, the biomolecule once held on the solid phase can be stably immobilized. Moreover, according to the method for producing a solid phase of the present invention, a solid phase capable of stably immobilizing biomolecules once held on the solid phase can be obtained.

本発明は、以上のとおり、生体分子の固定用材料、固相体及びその製造方法、その使用方法に関する。以下、本発明の実施の形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。図1には、本発明の固定用材料及び固相体の一例を示す。 As described above, the present invention relates to a biomolecule immobilization material, a solid phase, a method for producing the same, and a method for using the same. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings as appropriate. FIG. 1 shows an example of the fixing material and solid phase body of the present invention.

（生体分子の固定用材料）
本発明の固定用材料は、生体分子を固定化するものである。図１（ａ）に、固定用材料の一例として、生体分子を固定化するための固定用材料１０を示すが、これに限定するものではない。図１（ａ）における固定用材料１０は、基材２と、基材２の表面に形成されケイ素を含有する炭素質膜４とを備える。以下、本固定用材料について順次説明する。 (Material for immobilizing biomolecules)
The immobilizing material of the present invention immobilizes biomolecules. FIG. 1A shows a fixing material 10 for immobilizing a biomolecule as an example of a fixing material, but the present invention is not limited to this. A fixing material 10 in FIG. 1A includes a base material 2 and a carbonaceous film 4 formed on the surface of the base material 2 and containing silicon. Hereinafter, the present fixing material will be sequentially described.

（生体分子）
本発明の対象とする生体分子は、一分子のみを意味するものではなく、二分子以上からなる同種分子の集合体であってもよいし、異種分子との複合体であってもよい。さらに、多数の同種又は異種の分子から構成される、例えば自己組織体などの組織体であってもよい。 (Biomolecule)
The biomolecule which is the subject of the present invention does not mean only one molecule, but may be an assembly of homologous molecules composed of two or more molecules or a complex with different molecules. Further, it may be an organization such as a self-organization composed of a large number of same or different molecules.

生体分子としては、特に限定しないで、動物、植物、微生物、ウイルス等生物体に存在する、生物体が生産する又は生物体が代謝する天然由来の分子、これらを人工的に改変した分子であってもよいし、天然分子に依存しないで人工的に設計した分子であってもよい。また、生物から採取した分子のみならず、人工的に本来的にその分子が存在する生物体以外の生物において生産させた分子であってもよいし、生物体外で人工的に化学合成又は酵素等によって合成した分子であってもよい。 The biomolecule is not particularly limited, and is a naturally occurring molecule that is present in an organism such as an animal, plant, microorganism, or virus, is produced by the organism, or is metabolized by the organism, or a molecule obtained by artificially modifying these. Alternatively, it may be an artificially designed molecule that does not depend on natural molecules. In addition to molecules collected from living organisms, they may be molecules produced artificially in organisms other than the organism in which the molecules originally exist, or may be artificially synthesized outside the organism, chemically synthesized, enzymes, etc. It may be a molecule synthesized by

生体分子としては、典型的には、タンパク質、核酸、糖類、脂質、骨形成材料などの生体材料、各種の生物細胞及びその一部、組織及び生物体自体などの生物材料が挙げられる。また、生体分子は、固相に固定化されるのに際して、他の有機材料及び／又は無機材料等と複合化されていてもよい。これらのうち、本固定用材料に固定化する生体分子はタンパク質であるのが好ましい。 Biomolecules typically include biological materials such as proteins, nucleic acids, saccharides, lipids, osteogenic materials, and various biological cells and parts thereof, tissues and organisms themselves. In addition, the biomolecules may be combined with other organic materials and / or inorganic materials when being immobilized on the solid phase. Of these, the biomolecule to be immobilized on the immobilization material is preferably a protein.

なお、タンパク質とは、任意のサイズ、構造又は機能の、タンパク質、ポリペプチド及びオリゴペプチドを含んでいる。タンパク質としては、例えば、各種タンパク質、酵素、抗原、抗体、レクチン又は細胞膜レセプターが挙げられる。また、抗体は、天然の又は全体的若しくは部分的に合成的に産生された免疫グロブリンを意味する。特異的結合能を保持するその全ての誘導体も包含される。核酸は、１本鎖であっても、２本鎖であってもよい。人工及び天然を問わず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ及び塩基やその他の修飾体を含んでいてもよい。さらにその鎖長も特に限定しない。 The protein includes proteins, polypeptides, and oligopeptides having any size, structure, or function. Examples of the protein include various proteins, enzymes, antigens, antibodies, lectins, and cell membrane receptors. Antibody also refers to a naturally occurring or wholly or partially synthetically produced immunoglobulin. Also included are all derivatives thereof that retain specific binding ability. The nucleic acid may be single-stranded or double-stranded. It may contain DNA, RNA, DNA / RNA hybrids, DNA-RNA chimeras, bases and other modifications, whether artificial or natural. Further, the chain length is not particularly limited.

（炭素質膜）
本固定用材料は炭素質膜４を備える。この炭素質膜４の結晶構造は特に限定せず、結晶質でもよいし非晶質でもよい。好ましくは、ｓｐ³混成軌道を持つ炭素（ｓｐ³混成軌道炭素）を有する結晶質膜（例えば、ダイヤモンド膜）又は非晶質炭素膜であり、より好ましくは、非晶質炭素膜である。非晶質炭素質膜は、好ましくは、ｓｐ³混成軌道を持つ炭素（ｓｐ³混成軌道炭素）とｓｐ²混成軌道を持つ炭素（ｓｐ²混成軌道炭素）とが混在するアモルファス構造をとる炭素系材料からなる膜である。非晶質炭素は、化学的安定性に優れている点や、ＵＶ吸収がない点、赤外線透過性を有する点、タンパク質等の非特異的吸着を防ぐ点などにおいて、生体分子の固定用材料として用いるのに適している。また、非晶質炭素は、粒界がなく、どの部分にも均一に固定化できることから、均一材料としての固定化用に適している。このような非晶質炭素は、一般に、ダイヤモンドライクカーボンとして入手することができる。 (Carbonaceous film)
The fixing material includes a carbonaceous film 4. The crystal structure of the carbonaceous film 4 is not particularly limited, and may be crystalline or amorphous. Preferably, crystalline film having carbon (sp ³ hybridized carbon) having sp ³ hybrid orbital (e.g., diamond film) is or amorphous carbon film, more preferably, an amorphous carbon film. Amorphous carbonaceous film, the carbon-based preferably taking an amorphous structure coexist and carbon (sp ² hybridized carbon) having sp ² hybrid orbital and carbon (sp ³ hybridized carbon) having sp ³ hybrid orbital It is a film made of a material. Amorphous carbon is used as a biomolecule immobilization material because of its excellent chemical stability, lack of UV absorption, infrared transparency, and prevention of non-specific adsorption of proteins. Suitable for use. Amorphous carbon is suitable for fixing as a uniform material because it has no grain boundaries and can be fixed uniformly in any part. Such amorphous carbon is generally available as diamond-like carbon.

本発明における炭素質膜４が非晶質炭素からなる場合、全炭素量中ｓｐ²混成軌道炭素を４０％以上７０％以下含有するのが好ましい。また、ｓｐ³混成軌道炭素は、３０％以上６０％以下であるのが好ましい。 When the carbonaceous film 4 in the present invention is made of amorphous carbon, it is preferable to contain sp ² hybrid orbital carbon in the total amount of carbon in the range of 40% to 70%. The sp ³ hybrid orbital carbon is preferably 30% or more and 60% or less.

なお、本明細書において、全炭素中のｓｐ²混成軌道炭素又はｓｐ³混成軌道炭素の含有率は、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）により測定した値を示す。具体的には、固体ＮＭＲとしてマジックアングルスピニングを行う高出力デカップリング法（ＨＤ−ＭＡＳ）を用いた。この手法によれば、¹³ＣＮＭＲスペクトルにおいて、ｓｐ²混成軌道炭素に起因するピークが１３０ｐｐｍ付近に見られ、ｓｐ³混成軌道炭素に起因するピークが３０ｐｐｍ付近に見られる。したがって、それぞれのピークとベースラインとにより囲まれる部分の面積比を求め、その面積比から全炭素量におけるｓｐ²混成軌道炭素及びｓｐ³混成軌道炭素の含有率を算出することができる。 In the present specification, the content of sp ² hybrid orbital carbon or sp ³ hybrid orbital carbon in the total carbon is a value measured by a nuclear magnetic resonance method (NMR). Specifically, a high-power decoupling method (HD-MAS) that performs magic angle spinning as solid-state NMR was used. According to this technique, in the ¹³ C NMR spectrum, a peak due to sp ² hybrid orbital carbon is seen near 130 ppm, and a peak due to sp ³ hybrid orbital carbon is seen near 30 ppm. Therefore, the area ratio of the portion surrounded by each peak and the baseline can be obtained, and the content ratio of sp ² hybrid orbital carbon and sp ³ hybrid orbital carbon in the total carbon amount can be calculated from the area ratio.

（ケイ素）
本発明における炭素質膜４はケイ素を含有する。ケイ素は、炭素質膜表面だけでなく、その膜厚方向全体にわたり炭素質膜４に存在することができる。本固定用材料のケイ素の少なくとも一部は、炭素質膜４のｓｐ³混成軌道を構成する炭素原子を置換した状態で含まれていると考えられるからである。 (Silicon)
The carbonaceous film 4 in the present invention contains silicon. Silicon can be present in the carbonaceous film 4 not only on the surface of the carbonaceous film but also throughout the film thickness direction. This is because it is considered that at least a part of silicon of the fixing material is contained in a state where carbon atoms constituting the sp ³ hybrid orbital of the carbonaceous film 4 are substituted.

本固定用材料においては、ケイ素は炭素質膜４の内部にも表層と同程度に含まれていることが好ましい。膜内にもケイ素が含まれていると、新たな炭素質膜表面を露出させることにより、その露出面に新たなシラノール基を形成することができる。このため、一旦生体分子を固定化させた後に炭素質膜の表層を研磨等することによって除去することで、固定化能を新たに発現させて本固定用材料１０を再利用することができる。 In the present fixing material, silicon is preferably contained in the carbonaceous film 4 to the same extent as the surface layer. When silicon is also contained in the film, a new silanol group can be formed on the exposed surface by exposing a new carbonaceous film surface. For this reason, once the biomolecules are immobilized, the surface layer of the carbonaceous film is removed by polishing or the like, so that the immobilization ability can be newly developed and the present fixing material 10 can be reused.

炭素質膜４は、付与したい固定化能の大きさや固定化すべき生体分子の種類に応じてケイ素量を含むことができる。炭素質膜中のケイ素量はシラノール基に対応する傾向にあり、シラノール基量は固定化能に対応する傾向にある。したがって、大きな固定化能を付与したり高密度に固定したい場合のほか、固定化しにくい生体分子の場合には、ケイ素含有量を増加させることで適度な固定化能を付与することができる。 The carbonaceous film 4 can contain an amount of silicon according to the size of the immobilization ability to be imparted and the type of biomolecule to be immobilized. The amount of silicon in the carbonaceous film tends to correspond to silanol groups, and the amount of silanol groups tends to correspond to immobilization ability. Therefore, in addition to the case where it is desired to give a large immobilization ability or immobilization at a high density, in the case of a biomolecule that is difficult to immobilize, an appropriate immobilization ability can be imparted by increasing the silicon content.

本固定用材料は、炭素質膜中のケイ素由来のシラノール基により生体分子を炭素質膜表面に固定化することができる。一般に、ガラス系材料のようにマトリックス自体がＳｉ系である場合、その表面には多数のシラノール基が存在し、その一部は縮合反応によりシロキサン(Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ)結合が形成されていると考えられる。これに対し、本固定用材料は、マトリックスが炭素質膜であるため、シラノール基もガラス系材料ほど多くなく、また、縮合も抑制されるため、生体分子に対して適度な固定化能を発揮することができると考えられる。 This immobilization material can immobilize biomolecules on the carbonaceous film surface by silanol groups derived from silicon in the carbonaceous film. In general, when the matrix itself is Si-based, such as a glass-based material, a large number of silanol groups exist on the surface, and a siloxane (Si-O-Si) bond is formed in part of the matrix by a condensation reaction. it is conceivable that. On the other hand, since the matrix is a carbonaceous film, the fixing material does not have as many silanol groups as a glass-based material and also suppresses condensation, so that it exhibits an appropriate fixing ability for biomolecules. I think it can be done.

ケイ素の含有量は特に限定しないが、１．５ａｔ％以上３０ａｔ％以下であるのが好ましい。１．５ａｔ％以上であれば、生体分子６を検出するのに十分な量の生体分子６を炭素質膜表面に固定化することができる。また、３０ａｔ％以下であれば、生体分子６を炭素質膜表面に過剰に固定化しないため良好な検出感度を維持することができる。より好ましくは、１０ａｔ％以上３０ａｔ％以下である。１０ａｔ％以上であれば、生体分子６を検出するのにより十分な量の生体分子６を炭素質膜表面に固定化することができ、より検出感度の高い固定化材料を得ることができる。 The silicon content is not particularly limited, but is preferably 1.5 at% or more and 30 at% or less. If the amount is 1.5 at% or more, a sufficient amount of biomolecule 6 for detecting biomolecule 6 can be immobilized on the surface of the carbonaceous film. Moreover, if it is 30 at% or less, the biomolecule 6 is not excessively immobilized on the surface of the carbonaceous film, so that good detection sensitivity can be maintained. More preferably, it is 10 at% or more and 30 at% or less. If it is 10 at% or more, a sufficient amount of biomolecule 6 can be immobilized on the surface of the carbonaceous film to detect biomolecule 6, and an immobilization material with higher detection sensitivity can be obtained.

なお、炭素質膜４中におけるケイ素の定量は、公知の電子プローブ微小部分析法（ＥＰＭＡ），Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ），オージェ電子分光法（ＡＥＳ）及びラザフォード後方散乱法（ＲＢＳ）などを用いて行うことができる。 The silicon in the carbonaceous film 4 is quantified by known electron probe microanalysis (EPMA), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), Auger electron spectroscopy (AES), Rutherford backscattering method (RBS), etc. Can be used.

（水素）
炭素質膜４は水素を含有していてもよい。水素の含有量は特に限定しないが、１０ａｔ％を超えて５０ａｔ％未満であるのが好ましい。より好ましくは、２０ａｔ％を超えて３０ａｔ％未満である。水素を含むことで膜の内部応力を低減することができ、厚膜を形成することが容易となる。 (hydrogen)
The carbonaceous film 4 may contain hydrogen. The hydrogen content is not particularly limited, but is preferably more than 10 at% and less than 50 at%. More preferably, it is more than 20 at% and less than 30 at%. By containing hydrogen, the internal stress of the film can be reduced, and a thick film can be easily formed.

なお、炭素質膜４中における水素量は、例えば、弾性反跳粒子検出法（ＥＲＤＡ）を用いて算出することができる。具体的には、２Ｍｅｖのヘリウムイオンビームを炭素質膜４の表面に照射し、これによりはじき出された水素を半導体検出器によって検出することにより固定化層中の水素量（ａｔ％）を測定することができる。 The amount of hydrogen in the carbonaceous film 4 can be calculated using, for example, an elastic recoil detection method (ERDA). Specifically, the surface of the carbonaceous film 4 is irradiated with a 2 MeV helium ion beam, and the amount of hydrogen (at%) in the fixed layer is measured by detecting the hydrogen ejected by the semiconductor detector with a semiconductor detector. be able to.

（シラノール基）
本固定用材料は、炭素質膜４の表面にシラノール基を備えることができる。本固定用材料の炭素質膜４への生体分子の固定化メカニズムは必ずしも明らかでなく本発明を拘束するものではないが、炭素質膜表面に存在するシラノール基と生体分子との相互作用により生体分子を炭素質膜４上に保持することができると考えられる。なお、シラノール基と生体分子との相互作用は特に限定せず、水素結合性相互作用など各種相互作用を採ることができると考えられる。 (Silanol group)
The present fixing material can have a silanol group on the surface of the carbonaceous film 4. The immobilization mechanism of the biomolecule to the carbonaceous film 4 of the present immobilizing material is not always clear and does not restrict the present invention. However, the biomolecule is interacted with the silanol group present on the surface of the carbonaceous film and the biomolecule. It is considered that molecules can be held on the carbonaceous film 4. Note that the interaction between the silanol group and the biomolecule is not particularly limited, and it is considered that various interactions such as a hydrogen bonding interaction can be taken.

炭素質膜４表面のシラノール基を検出するには、例えば、末端基にハロゲンを持つシランカップリング剤を用いてシラノール基に化学修飾を行ったのちＸＰＳ分析する方法や、着目する官能基（シラノール基）と指標となる元素を含んだ試薬との置換反応の後にＸＰＳ分析して指標元素を検出することによりシラノール基を検出する誘導体化ＸＰＳ法等により行うことができる。好ましくは、誘導体化ＸＰＳ法である。この手法によれば、微量のシラノール基であっても高感度に検出することができる。 In order to detect the silanol group on the surface of the carbonaceous film 4, for example, a method of performing XPS analysis after chemically modifying the silanol group using a silane coupling agent having a halogen at the terminal group, or a functional group of interest (silanol) Group) and a reagent containing an element serving as an indicator, followed by XPS analysis and detection of the indicator element by XPS analysis. The derivatized XPS method is preferable. According to this method, even a very small amount of silanol group can be detected with high sensitivity.

誘導体化ＸＰＳ法は、具体的には以下の手順で行うことができる。すなわち、まず、指標となる元素（フッ素など）を含む誘導体化試薬をクロロホルム等の溶媒で例えば１％希釈した溶液中に試料を誘導化するのに十分な時間（例えば、１時間）浸漬し、その後、適当な溶媒、例えば、試薬を溶解した前記溶媒で洗浄する。洗浄にあたっては、超音波洗浄等により残存する誘導体化試薬をできるだけ除去することが好ましい。次いで、洗浄後の試料をＸＰＳ装置内に入れ、指標元素の定量を行う。これにより、炭素質膜４の表面に存在するＳｉ−ＯＨ基の生成量を間接的に求めることができる。なお、ケイ素を含まない以外は試料と同一組成の対照試料を準備して、試料と同等の条件で指標元素を定量し、対照試料について得られた指標元素量を試料について得られた指標元素量から差分した数値を指標元素量とすることで、測定値の精度及び再現性を確保することが好ましい。 Specifically, the derivatized XPS method can be performed by the following procedure. That is, first, a derivatization reagent containing an index element (such as fluorine) is dipped in a solution diluted with, for example, 1% of a solvent such as chloroform for a sufficient time (for example, 1 hour) to derivatize the sample, Then, it wash | cleans with a suitable solvent, for example, the said solvent which melt | dissolved the reagent. In washing, it is preferable to remove the remaining derivatization reagent as much as possible by ultrasonic washing or the like. Next, the cleaned sample is placed in an XPS apparatus, and the indicator element is quantified. Thereby, the production amount of Si—OH groups existing on the surface of the carbonaceous film 4 can be obtained indirectly. Prepare a control sample with the same composition as the sample except that it does not contain silicon, quantify the index element under the same conditions as the sample, and use the amount of index element obtained for the control sample as the amount of index element obtained for the sample. It is preferable to ensure the accuracy and reproducibility of the measured value by using the numerical value difference from the value as the index element amount.

誘導体化ＸＰＳ法によりシラノール基を検出する場合、誘導体化試薬としては、例えば、トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチル−１，１，１-トリクロロシランやトリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチルジメチルクロロシラン（ＦＯＣＳ）を用いることができる。好ましくは、ＦＯＣＳである。ＦＯＣＳは、反応部位が１ヶ所であるために重合反応がおきにくく、且つフッ素を複数含むことで微量のシラノール基をより高感度に検出することができる。 When the silanol group is detected by the derivatization XPS method, examples of the derivatization reagent include tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1,1,1-trichlorosilane and tridecafluoro-1, 1,2,2-tetrahydrooctyldimethylchlorosilane (FOCS) can be used. Preferably, it is FOCS. Since FOCS has one reaction site, the polymerization reaction is difficult to occur, and a small amount of silanol groups can be detected with higher sensitivity by containing a plurality of fluorine atoms.

本固定用材料が備える炭素質膜４表面のシラノール基量は特に限定しない。誘導体化試薬としてＦＯＣＳを用いて誘導体化ＸＰＳ分析を行った場合、好ましくはフッ素量として１ａｔ％以上であり、より好ましくは２ａｔ％以上であり、さらに好ましくは４ａｔ％以上である。４ａｔ％以上であれば、生体分子を膜表面に確実に保持することができる。 The amount of silanol groups on the surface of the carbonaceous film 4 provided in the fixing material is not particularly limited. When derivatization XPS analysis is performed using FOCS as a derivatization reagent, the fluorine amount is preferably 1 at% or more, more preferably 2 at% or more, and further preferably 4 at% or more. If it is 4 at% or more, the biomolecule can be reliably held on the membrane surface.

炭素質膜４は、単独で固定用材料を構成してもよいが、好ましくは、図１（ａ）に示すように、適当な基材２の表面の一部又は全部に膜化されたものである。 The carbonaceous film 4 may constitute a fixing material alone, but is preferably a film formed on a part or all of the surface of an appropriate substrate 2 as shown in FIG. It is.

なお、炭素質膜４は、図１（ａ）のように基材２の表面に直接形成されるものに限らず、例えば、基材２と炭素質膜４との間に１又は２以上の他の層を介して間接的に接合していてもよい。このような他の層としては、例えば、基材２と炭素質膜４との接合状態を向上させるために用いる層などが挙げられる。 Note that the carbonaceous film 4 is not limited to the one directly formed on the surface of the substrate 2 as shown in FIG. 1A, and, for example, one or two or more between the substrate 2 and the carbonaceous film 4. You may join indirectly through another layer. Examples of such other layers include a layer used for improving the bonding state between the base material 2 and the carbonaceous film 4.

炭素質膜４が基材２の上に備えられる場合、基材２の三次元形態は特に限定されない。フィルム状体、シート状体、板状体の他、球状、不定形状、針状、棒状、薄片状等の各種の粒子形態を採ることもできる。また、基材２の材質も特に限定されない。基材２の材質としては、例えば、炭素鋼、合金鋼、鋳鉄、アルミニウム合金、チタン合金等の金属系；超鋼、アルミナ、窒化珪素等のセラミックス系；ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラス、鉛ガラス等のガラス系；ポリイミド、ポリアミド等の樹脂系などを用いることができる。 When the carbonaceous film 4 is provided on the base material 2, the three-dimensional form of the base material 2 is not particularly limited. In addition to a film-like body, a sheet-like body, and a plate-like body, various particle forms such as a spherical shape, an indefinite shape, a needle shape, a rod shape, and a flake shape can also be adopted. Moreover, the material of the base material 2 is not particularly limited. Examples of the material of the base material 2 include metal systems such as carbon steel, alloy steel, cast iron, aluminum alloy, and titanium alloy; ceramic systems such as super steel, alumina, and silicon nitride; soda lime glass, borosilicate glass, and lead glass. Glass systems such as: resin systems such as polyimide and polyamide can be used.

炭素質膜４の厚み及び固定用材料１０の厚みは特に限定しない。炭素質膜４の厚みは、少なくとも０．０１μｍ以上であって１０μｍ以下であるのが好ましい。０．０１μｍ以上であれば、所望の部分に欠陥なく炭素質膜を作製することが容易になる。また、１０μｍ以下であれば、膜中の応力によって生じる剥離を防ぐことができる。また、炭素質膜４の表層除去による再利用を考慮した場合には、膜厚は１μｍ以上であることが好ましい。 The thickness of the carbonaceous film 4 and the thickness of the fixing material 10 are not particularly limited. The thickness of the carbonaceous film 4 is preferably at least 0.01 μm and not more than 10 μm. If it is 0.01 micrometer or more, it will become easy to produce a carbonaceous film without a defect in a desired part. Moreover, if it is 10 micrometers or less, the peeling which arises by the stress in a film | membrane can be prevented. In consideration of reuse by removing the surface layer of the carbonaceous film 4, the film thickness is preferably 1 μm or more.

炭素質膜４は、その表面粗さ（十点平均粗さ（Ｒｚ））は特に限定しない。好ましくは、Ｒｚｊｉｓ３μｍ以下であり、より好ましくはＲｚｊｉｓ１μｍ以下である。なお、十点平均粗さＲｚの算出方法は、ＪＩＳＢ０６０１（１９９４）に規定された方法に従ったものであり、触針式の表面粗さ計により測定した値を示す。 The surface roughness (ten-point average roughness (Rz)) of the carbonaceous film 4 is not particularly limited. Rzjis is preferably 3 μm or less, more preferably Rzjis 1 μm or less. The ten-point average roughness Rz is calculated according to the method defined in JIS B 0601 (1994), and indicates a value measured with a stylus type surface roughness meter.

このような炭素質膜を製造する方法は特に限定しない。例えば、プラズマＣＶＤ法、イオンプレーティング法、スパッタリング法など既に公知のＣＶＤ法（化学気相成長法）又はＰＶＤ法（物理気相成長法）により形成することができる。このうち、プラズマＣＶＤ法により形成するのが好ましい。プラズマＣＶＤ法は、反応ガスにより成膜するため、複雑な形状の基材に対しても容易に成膜することができる。また、成膜装置の構造も単純で安価である。このプラズマＣＶＤ法としては、高周波放電を利用する高周波プラズマＣＶＤ法や、直流放電を利用する直流プラズマＣＶＤ法、マイクロ波放電を利用するマイクロ波プラズマＣＶＤ法などが挙げられるが、最も安価な装置である直流プラズマＣＶＤ法が好ましい。 The method for producing such a carbonaceous film is not particularly limited. For example, it can be formed by a known CVD method (chemical vapor deposition method) or PVD method (physical vapor deposition method) such as a plasma CVD method, an ion plating method, or a sputtering method. Among these, it is preferable to form by plasma CVD method. Since the plasma CVD method forms a film using a reactive gas, it can be easily formed even on a substrate having a complicated shape. Further, the structure of the film forming apparatus is simple and inexpensive. Examples of the plasma CVD method include a high frequency plasma CVD method using a high frequency discharge, a direct current plasma CVD method using a direct current discharge, and a microwave plasma CVD method using a microwave discharge. Some direct current plasma CVD methods are preferred.

プラズマＣＶＤ法によりケイ素を含有する非晶質炭素を成膜する場合、反応ガスは、炭素原料としてメタン、アセチレン、ベンゼンなどの炭化水素ガス等を用いることができる。また、ケイ素原料としては、Ｓｉ（ＣＨ₃）₄［ＴＭＳ］，ＳｉＨ₄，ＳｉＣｌ₄，ＳｉＨ₂Ｆ₄などのケイ素化合物ガスを用いることができる。また、キャリアガスとしては、アルゴンガス、水素ガスなどを用いることができ、好ましくはアルゴンガスと水素ガスとを用いる。アルゴンガスに水素ガスを混入することにより、成膜中の膜表面へのイオン衝撃が低減されるため、水素を高い割合で含有し且つ適切な割合のｓｐ²混成軌道炭素及びｓｐ³混成軌道炭素を持つ非晶質炭素質膜を容易に形成することができる。 When the amorphous carbon containing silicon is formed by plasma CVD, a hydrocarbon gas such as methane, acetylene, or benzene can be used as the reaction gas. Further, as a silicon raw material, a silicon compound gas such as Si (CH ₃ ) ₄ [TMS], SiH ₄ , SiCl ₄ , SiH ₂ F ₄ can be used. As the carrier gas, argon gas, hydrogen gas, or the like can be used, and preferably argon gas and hydrogen gas are used. By mixing hydrogen gas into the argon gas, ion bombardment to the film surface during film formation is reduced, so that a high proportion of hydrogen and sp ² hybrid orbital carbon and sp ³ hybrid orbital carbon in appropriate proportions are contained. It is possible to easily form an amorphous carbonaceous film having

なお、成膜する際のガス濃度、基材の温度、圧力、成膜時間などの各種条件は、作製したい非晶質炭素質膜の膜組成、表面粗さ、膜厚等に応じて適宜設定すればよい。例えば、所望の割合の炭素の結合形態を有する非晶質炭素質膜を作製するには、反応ガス中の炭化水素ガスやケイ素化合物ガスの濃度を適宜設定するとしてもよい。 Various conditions such as gas concentration during deposition, substrate temperature, pressure, and deposition time are appropriately set according to the film composition, surface roughness, film thickness, etc. of the amorphous carbonaceous film to be produced. do it. For example, in order to produce an amorphous carbonaceous film having a desired form of carbon bonding, the concentration of hydrocarbon gas or silicon compound gas in the reaction gas may be set as appropriate.

また、炭素質膜４を基板２上に形成するにあたり、品質等を良好にするための前処理を基板２に対して適宜行うとしてもよい。このような前処理としては、例えば、基板２と炭素質膜４との密着性を向上させることを目的として基材２の表面に微細な凹凸を形成する処理（凹凸形成処理）等が挙げられる。この凹凸形成処理は、例えば、ＣＶＤ成膜装置を用いて水素ガスとアルゴンガスとを炭素質膜表面にスパッタリングすることにより行う。また、本処理を行うことにより、厚膜の炭素質膜を得ることができる。 In forming the carbonaceous film 4 on the substrate 2, pretreatment for improving the quality and the like may be appropriately performed on the substrate 2. Examples of such pretreatment include a process of forming fine irregularities on the surface of the base material 2 for the purpose of improving the adhesion between the substrate 2 and the carbonaceous film 4 (unevenness forming process). . This uneven | corrugated formation process is performed by sputtering hydrogen gas and argon gas on the carbonaceous film surface using a CVD film-forming apparatus, for example. Moreover, a thick carbonaceous film can be obtained by performing this process.

その他、本発明において使用可能なケイ素を含有する炭素質膜としては、特開２００７−２３３５６号公報、特開２００５−３３６４５６号公報及び特開２００５−３１４４５４号公報に記載の非晶質炭素質膜を用いることができる。また、本明細書には、特開２００７−２３３５６号公報、特開２００５−３３６４５６号公報及び特開２００５−３１４４５４号公報に記載されるすべての事項が引用により取り込まれるものとする。 Other examples of the carbon-containing film containing silicon that can be used in the present invention include amorphous carbonaceous films described in JP-A-2007-23356, JP-A-2005-336456, and JP-A-2005-314454. Can be used. In addition, in this specification, all matters described in Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 2007-23356, 2005-336456, and 2005-314454 are incorporated by reference.

このような本発明の固定用材料は、目的とする生体分子の精製や同定、定性又は定量等に用いたり、あるいは、目的とする生体分子の発現、相互作用、翻訳後修飾などといった生体分子の機能解析等に用いたりすることができる。すなわち、本固定用材料は、いわゆるプロテインチップやＤＮＡチップ等として診断や治療等に利用することができる。 Such a fixing material of the present invention is used for purification, identification, qualification or quantification of the target biomolecule, or for the expression, interaction, post-translational modification of the target biomolecule. It can be used for functional analysis. That is, the fixing material can be used for diagnosis and treatment as a so-called protein chip or DNA chip.

（固相体）
本発明の固相体は、上述した固定用材料１０に上記生体分子を固定化したものである。図１（ｂ）に、固相体の一例として、生体分子６が固定化された固相体２０を示す。本固相体２０における固定用材料１０には、既に説明した上記各種形態の本発明の固定用材料をそのまま適用することができる。したがって、本固相体によれば、生体分子６を炭素質膜４に固定化した固相体２０を得ることができ、これにより、本発明の固定用材料において上記した各種の利点を得ることができる。また、本固相体は、いわゆるプロテインチップやＤＮＡチップ等として、炭素質膜表面に固定化した生体分子の機能等を利用した診断や治療等を行うことができる。 (Solid phase)
The solid phase of the present invention is obtained by immobilizing the biomolecule on the fixing material 10 described above. FIG. 1B shows a solid phase body 20 on which a biomolecule 6 is immobilized as an example of the solid phase body. As the fixing material 10 in the solid phase body 20, the fixing materials of the present invention having the various forms described above can be applied as they are. Therefore, according to the present solid phase body, it is possible to obtain the solid phase body 20 in which the biomolecule 6 is immobilized on the carbonaceous film 4, and thereby obtain various advantages described above in the fixing material of the present invention. Can do. In addition, the solid phase can be used as a so-called protein chip, DNA chip, or the like for diagnosis or treatment using the function of biomolecules immobilized on the surface of the carbonaceous film.

（固相体の製造方法）
本発明の固相体の製造方法は、上述した固定用材料の炭素質膜表面に生体分子を接触させることにより該生体分子を炭素質膜に保持させる工程を備えることができる。なお、本製造方法における固定用材料には、既に説明した本発明の固定用材料における構成、成分、形状や用途などをそのまま適用することができる。したがって、本製造方法における製造工程は、上記各種形態の本発明の固定用材料を製造するための製造工程を含むことができる。 (Method for producing solid phase)
The method for producing a solid phase of the present invention can comprise a step of holding a biomolecule on the carbonaceous membrane by bringing the biomolecule into contact with the surface of the carbonaceous membrane of the fixing material described above. In addition, the structure, component, shape, application, and the like in the fixing material of the present invention described above can be applied as they are to the fixing material in the manufacturing method. Therefore, the manufacturing process in this manufacturing method can include the manufacturing process for manufacturing the fixing material of the present invention in the various forms described above.

なお、本固相体には本固定用材料を用いていることから、本製造方法により生体分子を炭素質膜上に固定化して固相体を作製したのち当該炭素質膜表面を研磨等することにより、本製造方法により新たな生体分子を炭素質膜表面に再度固定化することができる。 In addition, since this immobilization material is used for this solid phase body, after immobilizing a biomolecule on the carbonaceous film by this production method to produce a solid phase body, the surface of the carbonaceous film is polished or the like Thus, a new biomolecule can be re-immobilized on the surface of the carbonaceous film by this production method.

（固相体の使用方法）
本発明の固相体の使用方法は、上記固相体に固定化された上記生体分子に被験試料を供給して生体分子と被験試料中の成分との相互作用を生じさせる工程と、当該相互作用を検出する工程とを備えることができる。なお、本使用方法における固定用材料には、既に説明した本発明の固定用材料及び固相体における構成、成分、形状や用途などをそのまま適用することができる。したがって、本使用方法における工程は、上記各種形態の本発明の固定用材料及び固相体を使用するための各種工程を含むことができる。 (How to use solid phase)
The method of using the solid phase of the present invention comprises a step of supplying a test sample to the biomolecule immobilized on the solid phase to cause an interaction between the biomolecule and a component in the test sample, Detecting an action. In addition, the structure, component, shape, use, etc. in the fixing material and solid phase body of the present invention described above can be applied as they are to the fixing material in the method of use. Therefore, the process in this usage method can include the various processes for using the fixing material and solid phase of the present invention in the various forms described above.

以下、本発明を具体例を挙げて説明するが、本発明は以下に例示する具体例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described with specific examples. However, the present invention is not limited to the specific examples illustrated below.

［生体分子の固定用材料の作製］
プラズマＣＶＤ成膜装置（日本電子工業（株）製、型番：ＪＰＥ−４６８−ＨＶＭＳ−６０１）を用いて、基材の表面にケイ素含有非晶質炭素質膜（以下、ＤＬＣ−Ｓｉ膜と称する）を形成した。基材としては、オーステナイト系ステンレス鋼ＳＵＳ３０４（ＨＶ２００）製のブロック試験片（６．３ｍｍ×１５．７ｍｍ×１０．１ｍｍ）を用いた。具体的には、まず、成膜装置内に設置された基台の上にブロック試験片を配置して成膜装置を密閉したのち、装置内のガスを排気した。次に、装置内に水素ガスを１５ｓｃｃｍ導入し、ガス圧を約１３３Ｐａとした。その後、装置内面に設けたステンレス製陽極板と基台との間に２００Ｖの直流電圧を印加して放電を開始した。そして、基材の温度が５００℃になるまでイオン衝撃による昇温を行った。続いて、窒素ガス５００ｓｃｃｍ及び水素ガス４０ｓｃｃｍを装置内に導入し、圧力約８００Ｐａ、電圧４００Ｖ（電流１．５Ａ）、温度５００℃でプラズマ窒化処理を１時間行った。基材の断面組織を観察したところ、窒化深さは３０μｍであった。 [Production of biomolecule immobilization material]
Using a plasma CVD film forming apparatus (manufactured by JEOL Ltd., model number: JPE-468-HVMS-601), a silicon-containing amorphous carbonaceous film (hereinafter referred to as a DLC-Si film) is formed on the surface of the substrate. ) Was formed. As the base material, a block test piece (6.3 mm × 15.7 mm × 10.1 mm) made of austenitic stainless steel SUS304 (HV200) was used. Specifically, first, a block test piece was placed on a base installed in the film forming apparatus to seal the film forming apparatus, and then the gas in the apparatus was exhausted. Next, 15 sccm of hydrogen gas was introduced into the apparatus, and the gas pressure was set to about 133 Pa. Thereafter, discharge was started by applying a DC voltage of 200 V between the stainless steel anode plate provided on the inner surface of the apparatus and the base. And it heated up by ion bombardment until the temperature of the base material became 500 degreeC. Subsequently, 500 sccm of nitrogen gas and 40 sccm of hydrogen gas were introduced into the apparatus, and plasma nitriding was performed at a pressure of about 800 Pa, a voltage of 400 V (current of 1.5 A), and a temperature of 500 ° C. for 1 hour. When the cross-sectional structure of the substrate was observed, the nitriding depth was 30 μm.

プラズマ窒化処理後、装置内に水素ガスとアルゴンガスとを３０ｓｃｃｍずつ導入し、圧力約５３３Ｐａ、電圧３００Ｖ（電流１．６Ｖ）、温度５００℃でスパッタリングし、基材の表面に微細な凹凸を形成した（凹凸形成処理）。凸部の幅は６０ｎｍ、高さは３０ｎｍであった。次に、反応ガスとしてＴＭＳガス及びメタンガスを表１に示す流量で装置内に導入し、さらに水素ガス及びアルゴンガスを３０ｓｃｃｍずつ導入することにより、圧力約５３３Ｐａ、電圧３２０Ｖ（電流１．８Ｖ）、温度５００℃で成膜した。その際、膜厚が２．５〜３．０μｍとなるよう成膜時間を制御した。これにより、ブロック試験片の表面にケイ素含有量の異なるＤＬＣ−Ｓｉ膜が形成された２種類の試料を得た。これを生体分子の固定用材料とした。各試料の組成を表１に示す。

After the plasma nitriding treatment, hydrogen gas and argon gas are introduced into the apparatus at 30 sccm at a time, and sputtering is performed at a pressure of about 533 Pa, a voltage of 300 V (current of 1.6 V), and a temperature of 500 ° C. to form fine irregularities on the surface of the substrate. (Unevenness forming process). The width of the convex portion was 60 nm and the height was 30 nm. Next, TMS gas and methane gas as the reaction gas are introduced into the apparatus at a flow rate shown in Table 1, and hydrogen gas and argon gas are further introduced at a rate of 30 sccm at a pressure of about 533 Pa, voltage 320 V (current 1.8 V), The film was formed at a temperature of 500 ° C. At that time, the film formation time was controlled so that the film thickness was 2.5 to 3.0 μm. Thereby, two types of samples in which DLC-Si films having different silicon contents were formed on the surface of the block test piece were obtained. This was used as a biomolecule fixing material. Table 1 shows the composition of each sample.

なお、ＤＬＣ−Ｓｉ膜中のケイ素量は、ラザフォード後方散乱法（ＲＢＳ）により定量した。また、ＤＬＣ−Ｓｉ膜中の水素量は、弾性反跳粒子検出法（ＥＲＤＡ）により定量した。 Note that the amount of silicon in the DLC-Si film was quantified by Rutherford backscattering (RBS). Further, the amount of hydrogen in the DLC-Si film was quantified by an elastic recoil detection method (ERDA).

また、比較のため、上記ブロック試験片にケイ素を含有しない非晶質炭素質膜（以下、ＤＬＣ膜と称する）をカソードアーク式イオンプレーティング装置により成膜した。これにより得られた試料を比較例１とした。また、上市されているスライドガラス型タンパク質固定化用基板（ＦｕｌｌＭｏｏｎＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社製、製品名「ＰｒｏｔｅｉｎＳｌｉｄｅｓ」、品番：ＰＲＴ２５）を比較例２とした。 For comparison, an amorphous carbonaceous film (hereinafter referred to as a DLC film) containing no silicon was formed on the block test piece using a cathode arc ion plating apparatus. The sample thus obtained was designated as Comparative Example 1. Further, a commercially available slide glass type protein immobilization substrate (manufactured by Full Moon BioSystems, product name “Protein Slides”, product number: PRT25) was used as Comparative Example 2.

２．シラノール基の検出
実施例１，２及び比較例１の各試料表面におけるシラノール基の存在を確認するために、誘導体化ＸＰＳ法によりシラノール分析を行った。具体的には、まず、誘導体化試薬であるトリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクチルジメチルクロロシラン（ＦＯＣＳ）をクロロホルムで１％に希釈した溶液中に各試料を１時間浸漬した。次に、クロロホルムにより２回繰り返し洗浄し、２分間超音波洗浄を行った。その試料をＸＰＳ装置（アルバック・ファイ(株)製、型番：ＰＨＩ−５５００−ＭＣ）内に入れ、フッ素量を求めた。その結果を表１に示す。なお、表1におけるフッ素量は、対照試料としての比較例１のフッ素量を差分した値を示す。 2. Detection of Silanol Group In order to confirm the presence of the silanol group on the surface of each sample of Examples 1 and 2 and Comparative Example 1, silanol analysis was performed by a derivatized XPS method. Specifically, first, each sample was immersed for 1 hour in a solution obtained by diluting tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyldimethylchlorosilane (FOCS), which is a derivatization reagent, to 1% with chloroform. Next, it was repeatedly washed with chloroform twice and subjected to ultrasonic cleaning for 2 minutes. The sample was placed in an XPS apparatus (manufactured by ULVAC-PHI Co., Ltd., model number: PHI-5500-MC), and the amount of fluorine was determined. The results are shown in Table 1. In addition, the amount of fluorine in Table 1 shows a value obtained by subtracting the amount of fluorine in Comparative Example 1 as a control sample.

表１に示すように、実施例１及び実施例２のＤＬＣ−Ｓｉ膜表面にはフッ素が検出された。また、その量は、ＤＬＣ−Ｓｉ膜中のケイ素量が多い実施例２の方が実施例１よりも多かった。一方、ケイ素を含有していない比較例１のＤＬＣ膜表面には、フッ素が検出されなかった。これらのことから、非晶質炭素質膜中にケイ素を含有することにより、非晶質炭素質膜表面にシラノール基が形成されることが示唆された。また、膜表面におけるシラノール基量は、非晶質炭素質膜中のケイ素の含有量に対応し、ケイ素量が多いと膜表面のシラノール基量が多くなる傾向にあることが認められた。 As shown in Table 1, fluorine was detected on the DLC-Si film surfaces of Examples 1 and 2. In addition, the amount of Example 2 with a larger amount of silicon in the DLC-Si film was larger than that of Example 1. On the other hand, no fluorine was detected on the surface of the DLC film of Comparative Example 1 containing no silicon. From these, it was suggested that silanol groups are formed on the surface of the amorphous carbonaceous film by containing silicon in the amorphous carbonaceous film. The amount of silanol groups on the film surface corresponds to the silicon content in the amorphous carbonaceous film, and it was recognized that the amount of silanol groups on the film surface tends to increase when the amount of silicon is large.

３．タンパク質の固定化能の評価
０．１−５００ｎｇ／ｍＬの各濃度のビオチン化抗体溶液１μＬ（緩衝液：ＴＰＢＳ（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０，リン酸緩衝食塩液）を実施例１、２及び比較例１、２の各試料表面に滴下し、これを真空乾燥した。その後、試料をＴＰＢＳ溶液に浸漬し、５分間撹拌することによって洗浄した。この洗浄操作は３回繰り返した。この試料を１％のゼラチンを含むＴＰＢＳ溶液に３０分間浸漬してブロッキング処理を行った。その後、０．１μｇ／ｍＬアルカリフォスファターゼ標識アビジン及び１％のゼラチンを含むＴＰＢＳ溶液に３０分間浸し反応させた。さらに、これをＴＰＢＳ溶液に浸漬し、５分間撹拌することによって洗浄した。この洗浄操作は３回繰り返した。その後、純水で軽くすすいだ後、Ｎ₂ブローにより試料を乾燥させた。この試料表面に化学発光溶液（ＣＤＰ−ｓｔａｒｗｉｔｈｅｍｅｒａｌｄＩＩ）を滴下してギャップカバーグラスにより試料上面をカバーした後、化学発光検出器（アイシン精機（株）製、型番：ＬＶ−４００）によりビオチン化抗体溶液を滴下した部分（スポット）に生ずる化学発光の強度を測定した。ビオチン化抗体溶液の滴下濃度を横軸に、スポットの化学発光強度を縦軸にとったときの対応関係から傾きを算出した。その結果を表２に示す。また、各試料の検出感度を表２に示す。

3. Evaluation of protein immobilization ability 1 μL of biotinylated antibody solution (buffer solution: TPBS (0.01% Tween20, phosphate buffered saline)) at various concentrations of 0.1 to 500 ng / mL was used in Examples 1, 2 and Comparative Examples The sample was dropped onto the surface of each of the samples 1 and 2 and dried in a vacuum.Then, the sample was immersed in a TPBS solution and washed by stirring for 5 minutes.This washing operation was repeated 3 times. Blocking treatment was performed by immersing in a TPBS solution containing gelatin for 30 minutes, followed by a reaction by immersing in a TPBS solution containing 0.1 μg / mL alkaline phosphatase-labeled avidin and 1% gelatin for 30 minutes. immersed in TPBS solution and washed by stirring for 5 minutes. this washing operation was repeated three times. then, rinsed lightly with pure water, N ₂ The sample was dried by lowing, and a chemiluminescence solution (CDP-star with emerald II) was dropped onto the surface of the sample and the upper surface of the sample was covered with a gap cover glass, and then a chemiluminescence detector (Aisin Seiki Co., Ltd., The intensity of chemiluminescence generated at the portion (spot) where the biotinylated antibody solution was dropped was measured according to the model number: LV-400). The slope was calculated from the corresponding relationship, and the result is shown in Table 2. The detection sensitivity of each sample is shown in Table 2.

まず、実施例１、２と比較例１とを比較すると、表２に示すように、上記対応関係の傾きは、実施例１及び２においては比較例１の２倍以上の値であった。また、検出感度については、実施例１、２は同等であったのに対し、比較例１ではその２５分の１であった。これらのことから、非晶質炭素質膜に含有されるケイ素がタンパク質に対する固定化能の発現に寄与していることがわかった。また、ＤＬＣ膜にはシラノール基が検出されなかったのに対し、ＤＬＣ−Ｓｉ膜表面にはシラノール基が検出されたことから、ＤＬＣ−Ｓｉ膜では、シラノール基とタンパク質との相互作用によりタンパク質を膜表面に固定化したと考えられた。 First, when Examples 1 and 2 were compared with Comparative Example 1, as shown in Table 2, the slope of the correspondence relationship was more than twice that of Comparative Example 1 in Examples 1 and 2. In addition, the detection sensitivity of Examples 1 and 2 was the same, whereas that of Comparative Example 1 was 1/25 of the detection sensitivity. From these facts, it was found that silicon contained in the amorphous carbonaceous film contributes to the expression of protein immobilization ability. In addition, silanol groups were not detected in the DLC film, whereas silanol groups were detected on the surface of the DLC-Si film. Therefore, in the DLC-Si film, the protein was not absorbed by the interaction between the silanol group and the protein. It was thought that it was immobilized on the membrane surface.

また、実施例１と実施例２とを比較した場合、実施例１においても固定化力及び検出感度が良好であったことから、ＦＯＣＳを用いて誘導体化ＸＰＳ分析を行った場合のフッ素量として４ａｔ％以上のシラノール基が膜表面に形成されていれば、タンパク質を膜表面に確実に保持できるといえる。 Moreover, when Example 1 and Example 2 were compared, since the immobilization force and detection sensitivity were also good in Example 1, the amount of fluorine when derivatized XPS analysis was performed using FOCS If silanol groups of 4 at% or more are formed on the film surface, it can be said that the protein can be reliably retained on the film surface.

実施例１，２及び比較例２では、表２に示すように、傾き及び検出感度とも同等の値であった。したがって、ＤＬＣ−Ｓｉ膜においては、上市されている従来のタンパク質固定用材料（スライドグラス型タンパク質固定化用基板）と同等の固定化能を有することが認められた。 In Examples 1 and 2 and Comparative Example 2, as shown in Table 2, the slope and the detection sensitivity were equivalent values. Therefore, it was confirmed that the DLC-Si film has the same immobilization ability as a conventional protein immobilization material (slide glass type protein immobilization substrate) on the market.

本発明の固定用材料及び固相体の一例を示す図。図１（ａ）は固定用材料、図１（ｂ）は固相体を示す。The figure which shows an example of the fixing material and solid-phase body of this invention. FIG. 1A shows a fixing material, and FIG. 1B shows a solid phase body.

符号の説明Explanation of symbols

２基板、４炭素質膜、６生体分子、１０固定用材料、２０固相体 2 substrate, 4 carbonaceous film, 6 biomolecule, 10 fixing material, 20 solid phase body

Claims

ケイ素を含有する炭素質膜を備える、生体分子の固定用材料。 A material for immobilizing biomolecules, comprising a carbonaceous film containing silicon.

前記炭素質膜は、表面にシラノール基を備える、請求項１に記載の固定用材料。 The fixing material according to claim 1, wherein the carbonaceous film has a silanol group on a surface thereof.

前記シラノール基は、トリデカフルオロ−１，１，２，２−テトラヒドロオクリルジメチルクロロシラン（ＦＯＣＳ）によって誘導体化後にＸＰＳ分析する誘導体化ＸＰＳ法によってフッ素として検出される、請求項２に記載の固定用材料。 The immobilization according to claim 2, wherein the silanol group is detected as fluorine by a derivatization XPS method in which XPS analysis is performed after derivatization with tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyldimethylchlorosilane (FOCS). Materials.

前記シラノール基は、前記誘導体化ＸＰＳ法によって測定するとき、フッ素量として２ａｔ％以上である、請求項２又は３に記載の固定用材料。 The fixing material according to claim 2 or 3, wherein the silanol group has a fluorine content of 2 at% or more as measured by the derivatized XPS method.

前記炭素質膜は、非晶質炭素質膜である、請求項１〜４のいずれかに記載の固定用材料。 The fixing material according to claim 1, wherein the carbonaceous film is an amorphous carbonaceous film.

前記炭素質膜は、ケイ素を１．５ａｔ％以上３０．０ａｔ％以下含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の固定用材料。 The fixing material according to claim 1, wherein the carbonaceous film contains silicon at 1.5 at% or more and 30.0 at% or less.

前記炭素質膜は、全炭素中ｓｐ²混成軌道炭素を４０％ａｔ以上７０ａｔ％以下含有する、請求項1〜６のいずれかに記載の固定用材料。 The fixing material according to any one of claims 1 to 6, wherein the carbonaceous film contains sp ² hybrid orbital carbon in all carbons in a range of 40% at to 70at%.

タンパク質の固定化用である、請求項1〜７のいずれかに記載の固定用材料。 The immobilization material according to any one of claims 1 to 7, which is used for immobilizing proteins.

生体分子が固定化された固相体であって
前記生体分子は、請求項１〜７のいずれかに記載の固定用材料の前記炭素質膜表面に保持されている、固相体。 A solid phase body in which a biomolecule is immobilized, and the biomolecule is held on the surface of the carbonaceous film of the fixing material according to claim 1.

生体分子が固定化された固相体の製造方法であって、
請求項１〜７のいずれかに記載の固定用材料の前記炭素質膜表面に前記生体分子を接触させることにより前記生体分子を前記炭素質膜に保持させる工程、を備える、製造方法。 A method for producing a solid phase in which a biomolecule is immobilized,
A manufacturing method comprising the step of holding the biomolecule on the carbonaceous film by bringing the biomolecule into contact with the surface of the carbonaceous film of the fixing material according to claim 1.

生体分子が固定化された固相体の使用方法であって、
請求項９に記載の固相体に固定化された前記生体分子に被験試料を供給して前記生体分子と前記被験試料中の成分との相互作用を生じさせる工程と、
前記相互作用を検出する工程と、
を備える、使用方法。 A method of using a solid phase on which a biomolecule is immobilized,
Supplying a test sample to the biomolecule immobilized on the solid phase body according to claim 9 to cause an interaction between the biomolecule and a component in the test sample;
Detecting the interaction;
Use method comprising.