JP2008212005A - Primer set for detecting dna marker linking to maize pleiophylly-associated gene locus, and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、トウモロコシ多葉性関連遺伝子座に連鎖するDNAマーカーを検出するプライマーセット、トウモロコシ多葉性自殖系統の育成過程における多葉性個体の幼苗の選抜方法及びトウモロコシ多葉性系統の作出方法に関するものであり、更に詳しくは、多葉性関連遺伝子座に連鎖するDNAマーカーを検出できるプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムDNAに対してPCRを行い、増幅断片長を調べることにより遺伝子型を判別することにより、幼苗段階での雌穂上位葉数の向上した個体の選抜を可能とする新しい多葉性個体の幼苗選抜方法及びトウモロコシ多葉性系統の作出方法に関するものである。 The present invention relates to a primer set for detecting a DNA marker linked to a corn leafy leaf related gene locus, a method for selecting a seedling of a leafy individual in the process of growing a corn leafy self-breeding line, and production of a corn leafy line This method relates to the method, and more specifically, PCR is performed on maize genomic DNA using a primer set that can detect a DNA marker linked to a multilobe-related locus, and the genotype is determined by examining the length of the amplified fragment. Thus, the present invention relates to a new seedling selection method for multileafy individuals and a method for producing a maize multileafy line, which enables selection of individuals having an improved number of upper leaves of ears at the seedling stage.
子実のみならず茎葉部も利用する飼料用トウモロコシにおいては、葉数の増加は、収量増加につながる重要な形質と考えられている。一般に、トウモロコシの最上位の雌穂より上部にある葉の枚数(雌穂上位葉数)は、自殖系統で5〜7枚である。しかしながら、雌穂上位葉数が増加した変異体が見出され、その形質を導入することにより、10枚前後の雌穂上位葉数をもつ多葉性自殖系統が作出されている。 In feed corn, which uses not only the seed but also the stem and leaves, an increase in the number of leaves is considered to be an important trait that leads to an increase in yield. In general, the number of leaves above the top ear of corn (the number of upper leaves of the ear) is 5 to 7 in the inbred line. However, a mutant having an increased number of upper ear leaves was found, and by introducing the trait, a multileaf inbred line having about 10 upper ear leaves was created.
幾つかの報告から、この形質は、多葉性関連遺伝子座(lfy1)と呼ばれる遺伝子座により支配される優性の形質であることが知られていたが、その遺伝子座が、染色体上のどこに座乗するかは明らかにされていない(非特許文献1)。 Several reports have shown that this trait is a dominant trait governed by a locus called the multilobe associated locus (lfy1), but where the locus is located on the chromosome. It is not clarified whether to ride (Non-Patent Document 1).
多葉性の特性は、雄穂出現後で無ければ判別できないが、多葉性関連遺伝子に連鎖するDNAマーカーを活用することが可能となれば、同形質に関し、多葉性個体の幼苗段階での選抜が可能になると考えられ、また、多葉性関連遺伝子のホモ化にも有効と考えられる。 The characteristics of the leafy leaf can only be identified after the appearance of the ear, but if it becomes possible to utilize a DNA marker linked to the leafy associated gene, Selection is possible, and it is also considered effective for homology of multileaf related genes.
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、トウモロコシ多葉性系統957Lと非多葉性系統Na12を両親とする雑種第2世代(F2)を解析集団とし、各種DNAマーカーを用いた連鎖地図の作成及びQTL解析を行った結果、多葉性関連遺伝子座(lfy1)が第3染色体上に座乗することを特定することに成功し、同遺伝子座近傍の増幅断片長多型(AFLP)マーカーをSTS化し、A4M48を見出した。更に、多葉性関連遺伝子座(lfy1)周辺に対して、単純反復配列(SSR)マーカーを追加し、高密度の連鎖地図を作成することにより、多葉性関連遺伝子座(lfy1)に緊密に連鎖するSSRマーカーを見出し、更に研究を重ねて、本発明を完成するに至った。 In such a situation, in view of the above-mentioned prior art, the present inventors set the hybrid second generation (F 2 ) whose parents are the maize multileaf line 957L and the non-leafy line Na12 as the analysis population. As a result of creating a linkage map using various DNA markers and performing QTL analysis, it succeeded in identifying that the multilobe-related locus (lfy1) sits on the third chromosome, and the vicinity of the locus The amplified fragment length polymorphism (AFLP) marker was converted to STS, and A4M48 was found. Furthermore, by adding a simple repeat sequence (SSR) marker around the leafy loci associated locus (lfy1) and creating a high-density linkage map, the lobe associated locus (lfy1) is closely related. The present inventors have found a linked SSR marker and further researched to complete the present invention.
本発明は、トウモロコシの雌穂上位葉数に関連する遺伝子座の解明及び同遺伝子座に連鎖するDNAマーカーの検出を可能にするプライマーセットを提供することを目的とするものである。また、本発明は、該プライマーセットを利用して多葉性個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出する方法及び該方法により作出されたトウモロコシ多葉性系統を提供することを目的とするものである。 An object of the present invention is to provide a primer set that makes it possible to elucidate a locus related to the number of upper leaves of maize ears and to detect a DNA marker linked to the locus. Further, the present invention provides a method for selecting young seedlings of multileaf individuals using the primer set and producing a line having a large number of upper ear spikes in the progeny, and a maize multileaf line produced by the method Is intended to provide.
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
(1)多葉性関連遺伝子座に連鎖するDNAマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ第3染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座(lfy1)に連鎖するDNAマーカーを検出できることを特徴とするプライマーセット。
(2)多葉性関連遺伝子座(lfy1)から10センチモルガンの範囲内に位置するDNAマーカーを検出できる、前記(1)に記載のプライマーセット。
(3)上記DNAマーカーが、AFLPマーカーのA4M48である、前記(2)に記載のプライマーセット。
(4)配列表の配列番号1〜6の順方向プライマー及び7〜12の逆方向プライマーの中から選択される一対の塩基配列から構成される、前記(1)から(3)のいずれかに記載のプライマーセット。
(5)前記(1)から(4)のいずれかに記載のプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムDNAに対してPCRを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別する方法。
(6)前記(5)に記載の方法により、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出することを特徴とするトウモロコシ多葉性系統の作出方法。
(7)前記(6)に記載の方法により作出された飼料用トウモロコシであって、雌穂上位葉数を多くしたことで特徴付けられるトウモロコシ多葉性系統。
The present invention for solving the above-described problems comprises the following technical means.
(1) A primer set for detecting a DNA marker linked to a multilobe-related gene locus, and detecting a DNA marker linked to a multilobe-related gene locus (lfy1) seated on corn chromosome 3 Primer set characterized by being able to.
(2) The primer set according to (1) above, which can detect a DNA marker located within a range of 10 centmorgans from the multileaf associated gene locus (lfy1).
(3) The primer set according to (2), wherein the DNA marker is AFLP marker A4M48.
(4) In any one of the above (1) to (3), which is composed of a pair of base sequences selected from the forward primer of SEQ ID NO: 1-6 and the reverse primer of 7-12: The primer set described.
(5) Presence or absence of the leafy lobe-related gene locus of the investigated individual by performing PCR on the corn genomic DNA using the primer set according to any one of (1) to (4) above and examining the length of the amplified fragment How to identify.
(6) By using the method according to (5) above, a young corn seedling of an individual having a multilobe-related gene locus is selected, and a line having a large number of upper ear leaves in its progeny is produced. How to create sex lines.
(7) A corn for feed produced by the method according to (6) above, characterized by increasing the number of upper lobes of ears.
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、多葉性関連遺伝子座に連鎖するDNAマーカーを検出するためのプライマーセットであって、トウモロコシ第3染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座(lfy1)に連鎖するDNAマーカーを検出できることを特徴とするものである。
Next, the present invention will be described in more detail.
The present invention relates to a primer set for detecting a DNA marker linked to a multilobe-related gene locus, comprising a DNA marker linked to a multilobe-related gene locus (lfy1) seated on corn chromosome 3 It can be detected.
本発明では、多葉性関連遺伝子座(lfy1)から10センチモルガンの範囲内に位置するDNAマーカーを検出できること、上記プライマーセットが、配列表の配列番号1〜6の順方向プライマー及び7〜12の逆方向プライマーの中から選択される一対の塩基配列から構成されること、を好ましい実施の態様としている。 In the present invention, it is possible to detect a DNA marker located within the range of 10 centmorgans from the multilobe-related gene locus (lfy1), the primer set includes forward primers of SEQ ID NOs: 1 to 6 and 7 to 12 in the Sequence Listing. It is a preferred embodiment that it is composed of a pair of base sequences selected from the reverse primers.
また、本発明は、上記プライマーセットを用いてトウモロコシゲノムDNAに対してPCRを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別する方法の点、及び、上記方法により、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出する方法の点、更に、上記方法により作出されたトウモロコシ多葉性系統の点、に特徴を有するものである。 In addition, the present invention provides a method for identifying the presence or absence of a leafy loci associated with a research individual by performing PCR on corn genomic DNA using the above primer set and examining the length of the amplified fragment, The method of selecting young seedlings of individuals having a leafy loci-related locus by the method and producing a line with a large number of upper ear spikes in the progeny, and further, a corn leafy line produced by the above method It is characterized by a point.
本発明は、トウモロコシの雌穂上位葉数に関与する遺伝子座(lfy1)に連鎖し、遺伝子型の判定に利用可能なDNAマーカーを検出できるプライマーセットを提供するものである。以下、本発明のプライマーセット及びその新しい利用手法について説明する。 The present invention provides a primer set that is capable of detecting a DNA marker that is linked to a gene locus (lfy1) involved in the number of corn ear upper leaves and can be used for genotype determination. Hereinafter, the primer set of this invention and its new utilization method are demonstrated.
本発明では、多葉性関連遺伝子座に対し、緊密に連鎖するDNAマーカーを複数個見出しているが、本発明が対象とするDNAマーカーは、これらに限定されるものではなく、多葉性関連遺伝子座(lfy1)に緊密に連鎖するものであれば同様に使用することができる。 In the present invention, a plurality of DNA markers closely linked to the leafy loci-related gene locus are found, but the DNA marker targeted by the present invention is not limited to these, and the leaflet-related loci are not limited thereto. Any one that is closely linked to the locus (lfy1) can be used as well.
本発明では、これらのDNAマーカーを検出できるプライマーペアの構築に成功した。そして、該プライマーペアを用いてトウモロコシゲノムDNAに対してPCRを行ったところ、多葉性系統と非多葉性系統では、塩基数の異なったDNA断片が増幅されることが判明した。このため、増幅断片長を調査することで、同マーカーの座乗する領域が多葉性系統と非多葉性系統のどちらに由来するかが判定され、結果として、調査個体の多葉性関連遺伝子座(lfy1)の有無が識別可能となることが分かった。 In the present invention, a primer pair capable of detecting these DNA markers has been successfully constructed. When PCR was performed on maize genomic DNA using the primer pair, it was found that DNA fragments having different base numbers were amplified in multileafy and non-leafy lines. Therefore, by investigating the length of the amplified fragment, it is determined whether the region on which the marker is seated is derived from a multileafy line or a non-leafy line. It was found that the presence or absence of the locus (lfy1) can be identified.
上記のDNAマーカーの遺伝子型の判定に用いるゲノムDNAの抽出法には、特別な制約は無く、植物の葉片からのDNA抽出で一般的に用いられるCTAB法などを必要に応じて改変し、実施すればよい。また、市販のDNA抽出キットを用いることも適宜可能である。また、DNAマーカーのDNA断片増幅のためのPCRの条件は、例えば、後記する実施例に例示されているが、これらに制限されるものではなく、プライマーペアや使用機器に合わせて任意に変更することができる。同様に、電気泳動条件も変更可能であり、また、増幅断片長の差が十分にあれば、アガロースゲルを用いることもできる。 The genomic DNA extraction method used for the determination of the genotype of the above DNA marker is not particularly limited, and the CTAB method generally used for DNA extraction from plant leaf pieces is modified and implemented as necessary. do it. It is also possible to use a commercially available DNA extraction kit as appropriate. The PCR conditions for amplifying the DNA fragment of the DNA marker are exemplified in the examples described later, but are not limited thereto, and may be arbitrarily changed according to the primer pair and the equipment used. be able to. Similarly, the electrophoresis conditions can be changed, and an agarose gel can be used if there is a sufficient difference in the length of the amplified fragments.
本発明では、ゲノムDNAの抽出手法、DNA断片増幅のためのPCR条件、電気泳動条件等は、任意に設定することができる。本発明によれば、上述のように、本発明の特定のプライマーペアを用いて上記DNAマーカーを検出し、該DNAマーカーを指標として多葉性関連遺伝子座(lfy1)の有無を識別し、個体の幼苗を選抜することで、その後代において雌穂上位葉数の多い多葉性系統を作出することが可能となる。 In the present invention, genomic DNA extraction techniques, PCR conditions for DNA fragment amplification, electrophoresis conditions, and the like can be arbitrarily set. According to the present invention, as described above, the DNA marker is detected using the specific primer pair of the present invention, and the presence or absence of the multilobe-related gene locus (lfy1) is identified using the DNA marker as an index. By selecting the young seedlings, it becomes possible to produce a multileaf line with a large number of upper ear spikes in its progeny.
本発明の方法でPCRに供するトウモロコシ系統としては、多葉性関連遺伝子座(lfy1)を有する多葉性系統を片親として用いた系統であればいずれの系統でも使用することができる。DNAマーカーに関しては、好適には、例えば、育種素材として用いる多葉性系統と非多葉性系統間で増幅断片長に明確な差があるものを用いる必要がある。 As a maize line subjected to PCR by the method of the present invention, any line can be used as long as it is a line using a multi-leaf line having a multi-leaf associated locus (lfy1) as a single parent. Regarding the DNA marker, it is preferable to use a DNA marker having a clear difference in the length of the amplified fragment between, for example, a multileaf line used as a breeding material and a non-leafy line.
本発明において、多葉性関連遺伝子座の推定のために用いる解析集団としては、例えば、多葉性系統957Lと非多葉性系統Na12の雑種第2世代(F2)の集団個体が例示されるが、これらに制限されるものではなく、適宜の多葉性系統と非多葉性系統の雑種第2世代の集団個体が用いられる。各個体の雌穂上位葉数の観測とDNA抽出を行い、後の解析に用いる。雌穂上位葉数は、最上位の雌穂よりも上位の葉数を計測する。 In the present invention, examples of the analysis population used for estimating the leafy loci-related loci include, for example, population individuals of the hybrid second generation (F 2 ) of the leafy line 957L and the nonleafy line Na12. However, the present invention is not limited thereto, and a suitable second-generation hybrid individual of a multileafy line and a non-multileafy line is used. Observe the number of upper lobes of each individual and extract DNA for later analysis. The number of upper leaves of the ear is measured as the number of leaves higher than the uppermost ear.
次に、連鎖地図の作成には、好適には、例えば、制限酵素断片長多型(RFLP)マーカー、増幅断片長多型(AFLP)マーカー及び単純反復配列(SSR)マーカーが用いられる。RFLP解析は、例えば、トウモロコシのゲノム由来及びcDNA由来のプローブを用い、例えば、GEヘルスケアバイオサイエンス社製のECLサザンハイブリシステムにより多型分析を行うことで実施することができる。 Next, for example, a restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP) marker, an amplified fragment length polymorphism (AFLP) marker, and a simple repeat sequence (SSR) marker are preferably used for the creation of a linkage map. The RFLP analysis can be performed, for example, by using a corn genome-derived and cDNA-derived probe and performing polymorphism analysis using, for example, an ECL Southern hybrid system manufactured by GE Healthcare Bioscience.
AFLP解析は、Vosらの方法及びMyburgらの方法に従って実施することができる。ゲノムDNAの制限酵素消化は、好適には、例えば、EcoRI及びMseI、もしくはPstI及びMseIの組合せで行い、EcoRIプライマー及びPstIプライマーは、蛍光色素で標識して使用される。 AFLP analysis can be performed according to the method of Vos et al. And the method of Myburg et al. The restriction enzyme digestion of genomic DNA is preferably performed with, for example, EcoRI and MseI or a combination of PstI and MseI, and the EcoRI primer and the PstI primer are used after being labeled with a fluorescent dye.
多型の検出は、例えば、DNAアナリシスシステム LIC−4200L−2(アロカ社製)で行うことができる。SSR多型解析では、Maize Genetics and Genomics Database(MaizeGDB,http://www.maizegdb.org/)に登録、公開されたSSRマーカーを用いることができる。各SSRマーカーのプライマーペアのうち、フォワードプライマーは、例えば、IRD800蛍光色素で標識することができる。しかし、これらに制限されるものではなく、AFLPやSSRでの多型検出には、任意の機器及び蛍光色素を用いることができる。 The polymorphism can be detected by, for example, DNA analysis system LIC-4200L-2 (manufactured by Aloka). In the SSR polymorphism analysis, SSR markers registered and published in Maize Genetics and Genomics Database (MaizeGDB, http://www.maizeggdb.org/) can be used. Among the primer pairs of each SSR marker, the forward primer can be labeled with, for example, an IRD800 fluorescent dye. However, the present invention is not limited to these, and any device and fluorescent dye can be used for polymorphism detection by AFLP or SSR.
SSR増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、例えば、MaizeGDBに記載の通りの条件で実施する。PCRの条件としては、例えば、1)94℃ 5分、2)94℃ 1分間、65℃ 1分間、72℃ 1.5分間 2サイクル、3)94℃ 1分間、65℃(1サイクル毎に1℃下げる)1分間、72℃ 1.5分間 10サイクル、4)94℃ 1分間、55℃ 1分間、72℃ 1.5分間 30サイクル、5)72℃ 7分間、の条件が例示されるが、これに制限されるものではなく、好適な条件を任意に設定することができる。多型の検出は、例えば、DNAアナリシスシステム LIC−4200L−2で実施する。 Polymerase chain reaction (PCR) for SSR amplification is performed under conditions as described in, for example, MaizeGDB. PCR conditions include, for example, 1) 94 ° C. for 5 minutes, 2) 94 ° C. for 1 minute, 65 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1.5 minutes, 2 cycles, 3) 94 ° C. for 1 minute, 65 ° C. (every cycle) 1) 72 ° C 1.5 minutes 10 cycles 4) 94 ° C 1 minute 55 ° C 1 minute 72 ° C 1.5 minutes 30 cycles 5) 72 ° C 7 minutes However, the present invention is not limited to this, and suitable conditions can be set arbitrarily. The detection of the polymorphism is performed by, for example, the DNA analysis system LIC-4200L-2.
上記RFLP、AFLP及びSSRの多型解析の結果をもとに、QTL解析ソフトウェアMapmanagerQTXを用いて、連鎖解析及び多葉性に関するQTL解析を行う。本発明では、第3染色体上に多葉性関連遺伝子座(lfy1)が存在し、更に、AFLPマーカーの1つA4M48がlfy1に連鎖することが見出された。そこで、A4M48マーカーの増幅断片の塩基配列を決定し、同マーカーの多型解析を効率的に行うためのプライマーセットを新たに設計した(STS化)。 Based on the results of the polymorphism analysis of the above RFLP, AFLP and SSR, QTL analysis software MapmanagerQTX is used to perform linkage analysis and QTL analysis on multileaf nature. In the present invention, it was found that there is a multilobe associated locus (lfy1) on chromosome 3 and that one AFLP marker, A4M48, is linked to lfy1. Therefore, the base sequence of the amplified fragment of the A4M48 marker was determined, and a primer set for efficiently performing polymorphism analysis of the marker was newly designed (STS conversion).
このプライマーセットを用いてPCRを行うと、例えば、非多葉性系統Na12のゲノムDNAを鋳型とした時、282塩基対の断片を増幅するが、多葉性系統957LのゲノムDNAを鋳型とすると、280塩基対の断片を増幅し、増幅断片長の違いから、同マーカーの遺伝子型が判定可能となる。他の非多葉性系統及び多葉性系統の場合についても、増幅断片長の違いから同様に同マーカーの遺伝子型を判定することが可能である。 When PCR is performed using this primer set, for example, a 282 base pair fragment is amplified when genomic DNA of non-leafy strain Na12 is used as a template, but when genomic DNA of leafy strain 957L is used as a template. A 280 base pair fragment is amplified, and the genotype of the marker can be determined from the difference in amplified fragment length. In the case of other non-multileafy lines and multileafy lines, the genotype of the same marker can be similarly determined from the difference in the length of the amplified fragments.
また、多葉性関連遺伝子座(lfy1)に、より緊密に連鎖するマーカーを見出すために、例えば、MaizeGDBで公開されたSSRマーカーのうち、Bin番号3.08〜3.09に座乗し、本解析集団の親系統であるNa12と957L間で多型に違いが見られるものを選抜する。上述の解析集団に対し、これらのマーカーの多型解析を行い、高密度の連鎖地図を作成する。この連鎖地図を、QTL解析ソフトMapQTLで再びQTL解析を行う。 In addition, in order to find a marker that is more closely linked to the multilobe-related gene locus (lfy1), for example, among the SSR markers published in MaizeGDB, sit on Bin numbers 3.08 to 3.09, Those having a difference in polymorphism between Na12 and 957L, which are the parent lines of this analysis group, are selected. Polymorphism analysis of these markers is performed on the above-mentioned analysis population, and a high-density linkage map is created. This linkage map is again subjected to QTL analysis using QTL analysis software MapQTL.
本発明では、5つのSSRマーカー(umc1578、umc1361、bnlg1496、mmc0001、umc1641)が、A4M48マーカーと同程度或いはより緊密にlfy1に連鎖していることが見出された。本発明では、これらのDNAマーカーを検出可能にするためのプライマーペアを構築した。これらのDNAマーカーは、すべて、MaizeGDBにおいて公開されているSSRマーカーであり、同ウェブサイトでこれらのマーカーに関するより詳細な情報や、他のマーカーの情報を得ることができる。 In the present invention, it has been found that five SSR markers (umc1578, umc1361, bnlg1496, mmc0001, umc1641) are linked to lfy1 as much as or more closely than the A4M48 marker. In the present invention, primer pairs were constructed to enable detection of these DNA markers. These DNA markers are all SSR markers published in MaizeGDB, and more detailed information on these markers and information on other markers can be obtained on the same website.
上述のA4M48マーカー及び5つのSSRマーカーによる選抜効果を検証するために、例えば、3つの集団が用いられる。この場合、例えば、多葉性系統914Lと3系統の異なる非多葉性自殖系統(例えば、TD16、KK8、KK11)とのF1を更に各々の非多葉性系統と交配した戻し交配第1世代(BC1世代)を用いて、各集団90個体を養成し、雌穂上位葉数の計測とlfy1近傍マーカーによる遺伝子型調査を行う手法が例示される。 In order to verify the selection effect by the above-mentioned A4M48 marker and five SSR markers, for example, three populations are used. In this case, for example, the backcrossing in which F 1 of the multileafy line 914L and three different non-leafy inbred lines (eg, TD16, KK8, KK11) are further crossed with each non-leafy line An example is a method of training 90 individuals in each group using 1 generation (BC 1 generation), measuring the number of upper lobes of the ear, and genotyping using lfy1 neighborhood markers.
上記手法では、各集団で調査するlfy1近傍マーカーは、914Lとそれぞれの非多葉性系統間で増幅断片長に違いがあり、遺伝子型の判定が可能であることを事前に確認したものが用いられる。非多葉性系統を反復親とする戻し交配の場合、遺伝子型としては、多葉性型と非多葉性型のへテロ及び非多葉性型のホモが出現し得る。 In the above method, the lfy1 vicinity marker to be investigated in each population is the one that has been confirmed in advance that there is a difference in the amplified fragment length between 914L and each non-leafy line, and that genotype can be determined. It is done. In the case of backcrossing in which a non-leafy line is a recurrent parent, genotypes of multi-leaf type and non-leafy type hetero and non-leafy type homozygos may appear.
A4M48マーカーの遺伝子型がヘテロを示したグループと非多葉性のホモを示したグループ間で平均雌穂上位葉数を比較すると、3集団とも、多葉性型と非多葉性型のヘテロの方が、非多葉性型ホモよりも雌穂上位葉数が有意に多いことが示され、A4M48マーカーによる選抜効果が見出された。 Comparing the average number of upper ear spikes between the group that showed heterogeneity in the A4M48 marker genotype and the group that showed non-leafy homozygosity, the three populations showed a heterogeneity between the leafy type and the non-leafy type. It was shown that the number of upper leaves in the ear was significantly higher than that of the non-multileaf homozygote, and the selection effect by the A4M48 marker was found.
同様の結果は、調査した4つのSSRマーカーでも見られ、DNAマーカーによる多葉性個体の選抜が有効であることが分かった。また、調査したマーカーを連鎖解析すると、umc1578、bnlg1496、mmc0001はlfy1から1cM以内に座乗し、A4M48は、7cM、umc1361は、7〜8cMの位置に座乗していることが見出された。 Similar results were also observed for the four SSR markers examined, and it was found that selection of multileaf individuals using DNA markers was effective. Further, when the investigated markers were linked, it was found that umc1578, bnlg1496, and mmc0001 were seated within 1 cM from lfy1, A4M48 was seated at 7 cM, and umc1361 was seated at 7-8 cM. .
本発明は、多葉性関連遺伝子座に連鎖するDNAマーカーを検出することにより、調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別し、それにより、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出する手法を確立したことに最大の特徴を有するものである。本発明において、幼苗の選抜、後代の作出に関する方法及び手段については、常法に従って適宜選択、利用することができる。 The present invention discriminates the presence or absence of a multilobe-related gene locus in a research individual by detecting a DNA marker linked to the multilobe-related gene locus, whereby a seedling of an individual having a multileafy gene locus The most characteristic feature is that a method for selecting a line and producing a line with a large number of upper ear leaves in its progeny has been established. In the present invention, methods and means relating to selection of seedlings and production of progeny can be appropriately selected and used according to conventional methods.
本発明では、上記DNAマーカーを検出できる特定のプライマーセットが提供されるが、多葉性関連遺伝子座(lfy1)から10センチモルガンの範囲内に位置するDNAマーカーを検出できるものであれば同様に使用することができる。本発明では、DNAマーカーとしては公知のDNAマーカーでも利用可能であるが、トウモロコシ第3染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座(lfy1)に緊密に連鎖するDNAマーカーを検出できるプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムDNAに対してPCRを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座の有無を識別し、それにより、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代において雌穂上位葉数の多い系統を作出する方法は、従来技術からは予期し得ない新規手法である。 In the present invention, a specific primer set capable of detecting the above DNA marker is provided. Similarly, any primer set capable of detecting a DNA marker located within the range of 10 centmorgans from the multileaf associated locus (lfy1) is used. Can be used. In the present invention, a known DNA marker can be used as a DNA marker. However, a primer set capable of detecting a DNA marker closely linked to the multilobe-related gene locus (lfy1) seated on corn chromosome 3 is used. Using corn genomic DNA, PCR is performed, and the length of the amplified fragment is examined to identify the presence or absence of the leafy loci associated with the individual being investigated, thereby selecting the seedlings of individuals having the leafy loci However, a method for producing a line having a large number of upper ear leaves in the progeny is a novel method that cannot be expected from the prior art.
本発明により、次のような効果が奏される。
(1)本発明により、トウモロコシ第3染色体上に座乗する多葉性関連遺伝子座(lfy1)に連鎖するDNAマーカーを検出可能とするプライマーセットを提供することができる。
(2)本発明により提供されるプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムDNAに対してPCRを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座(lfy1)の有無を識別することができる。
(3)それにより、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代においてトウモロコシ多葉性系統を効率的かつ確実に作出することが可能となる。
The present invention has the following effects.
(1) According to the present invention, it is possible to provide a primer set capable of detecting a DNA marker linked to a multileafy loci (lfy1) locused on corn chromosome 3.
(2) It is possible to identify the presence or absence of the multilobe associated gene locus (lfy1) of the individual to be investigated by performing PCR on corn genomic DNA using the primer set provided by the present invention and examining the length of the amplified fragment it can.
(3) Thereby, it becomes possible to select a young seedling of an individual having a multileafy-related gene locus, and to efficiently and reliably produce a maize multileafy line in its progeny.
次に、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited at all by these Examples.
1)解析集団
多葉性関連遺伝子座の推定のため、多葉性系統957Lと非多葉性系統Na12の雑種第2世代(F2)集団80個体を養成し、各個体の雌穂上位葉数の観測とDNA抽出を行い、後の解析に用いた。雌穂上位葉数は、最上位の雌穂よりも上位の葉数を計測した。
1) Analytical population For the estimation of multilobe-related loci, 80 hybrid second-generation (F 2 ) populations of multileaf line 957L and non-leafy line Na12 were trained, and the upper ear leaves of each individual Number observation and DNA extraction were performed and used for later analysis. The number of upper leaves of the ear was measured as the number of leaves higher than the uppermost ear.
2)連鎖地図作成
連鎖地図の作成には、制限酵素断片長多型(RFLP)マーカー、増幅断片長多型(AFLP)マーカー及び単純反復配列(SSR)マーカーを用いた。RFLP解析は、米国ミズーリ大学より分譲されたトウモロコシのゲノム由来及びcDNA由来のプローブを用い、ECLサザンハイブリシステム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)により多型分析を行った。
2) Creation of a linkage map For the creation of a linkage map, a restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP) marker, an amplified fragment length polymorphism (AFLP) marker and a simple repeat sequence (SSR) marker were used. For RFLP analysis, polymorphism analysis was performed by the ECL Southern Hybrid System (manufactured by GE Healthcare Bioscience) using corn genome-derived and cDNA-derived probes sold by the University of Missouri, USA.
AFLP解析には、Vosらの方法(Nucleic Acids Res.23:4407−4414(1995))及びMyburgらの方法(BioTechniques 30:348−357(2001))に則り行った。ゲノムDNAの制限酵素消化は、EcoRI及びMseI、もしくはPstI及びMseIの組合せで行い、EcoRIプライマー及びPstIプライマーは、IRD700或いはIRD800蛍光色素(アロカ社製)で標識されたものを用いた。 The AFLP analysis was performed according to the method of Vos et al. (Nucleic Acids Res. 23: 4407-4414 (1995)) and the method of Myburg et al. (BioTechniques 30: 348-357 (2001)). Restriction enzyme digestion of genomic DNA was performed with a combination of EcoRI and MseI, or PstI and MseI, and EcoRI and PstI primers were labeled with IRD700 or IRD800 fluorescent dye (Aloka).
多型の検出は、DNAアナリシスシステム LIC−4200L−2(アロカ社製)で行った。SSR多型解析は、Maize Genetics and Genomics Database(MaizeGDB,http://www.maizegdb.org/)に登録、公開されたSSRマーカーを用いた。各SSRマーカーのプライマーペアのうち、フォワードプライマーは、IRD800蛍光色素で標識した。 The polymorphism was detected with a DNA analysis system LIC-4200L-2 (Aloka). For SSR polymorphism analysis, SSR markers registered and published in Maize Genetics and Genomics Database (MaizeGDB, http://www.maizeggdb.org/) were used. Of each SSR marker primer pair, the forward primer was labeled with an IRD800 fluorescent dye.
SSR増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、MaizeGDBに記載の通り、以下の条件で行った。1)94℃ 5分、2)94℃ 1分間、65℃ 1分間、72℃ 1.5分間 2サイクル、3)94℃ 1分間、65℃(1サイクル毎に1℃下げる)1分間、72℃ 1.5分間 10サイクル、4)94℃ 1分間、55℃ 1分間、72℃ 1.5分間 30サイクル、5)72℃ 7分間。多型の検出は、DNAアナリシスシステム LIC−4200L−2で行った。 Polymerase chain reaction (PCR) for SSR amplification was performed under the following conditions as described in Maize GDB. 1) 94 ° C. for 5 minutes, 2) 94 ° C. for 1 minute, 65 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1.5 minutes, 2 cycles, 3) 94 ° C. for 1 minute, 65 ° C. (down 1 ° C. for each cycle) for 1 minute, 72 ° C 1.5 minutes 10 cycles, 4) 94 ° C 1 minute, 55 ° C 1 minute, 72 ° C 1.5 minutes 30 cycles, 5) 72 ° C 7 minutes. The polymorphism was detected with the DNA analysis system LIC-4200L-2.
上記RFLP、AFLP及びSSRの計247マーカーの多型解析の結果をもとに、QTL解析ソフトウェアMapmanagerQTX(Manly,KF,Cudmore,Jr,RH,Meer,JM(2001)Mammalian Genome 12: 930−932)を用いて、連鎖解析及び多葉性に関するQTL解析を行った。 Based on the results of polymorphism analysis of a total of 247 markers of RFLP, AFLP, and SSR, QTL analysis software MapmanagerQTX (Manly, KF, Cudmore, Jr, RH, Meer, JM (2001) Mammalian Genome 12: 930-932) Was used to perform linkage analysis and QTL analysis for multilobes.
その結果、第3染色体上に多葉性関連遺伝子座(lfy1)が存在し、更に、AFLPマーカーの1つA4M48がlfy1に連鎖することが示された。そこで、A4M48マーカーの増幅断片の塩基配列を決定し、同マーカーの多型解析を効率的に行うためのプライマーセットを新たに設計した(STS化)。このプライマーセットは、順方向プライマーLEF:5’−GGATGAGAACTATAGACA−3’(配列番号1)、及び逆方向プライマーLER:5’−TATGCCATGCCCTTTTT−3’(配列番号7)からなる。 As a result, it was shown that a multilobe associated locus (lfy1) is present on the third chromosome, and that one AFLP marker, A4M48, is linked to lfy1. Therefore, the base sequence of the amplified fragment of the A4M48 marker was determined, and a primer set for efficiently performing polymorphism analysis of the marker was newly designed (STS conversion). This primer set consists of a forward primer LEF: 5'-GGATGAGAACTATAGACA-3 '(SEQ ID NO: 1) and a reverse primer LER: 5'-TATGCCATGCCCCTTTTT-3' (SEQ ID NO: 7).
このプライマーセットを用いてPCRを行うと、非多葉性系統Na12のゲノムDNAを鋳型とした時、282塩基対の断片を増幅するが、多葉性系統957LのゲノムDNAを鋳型とすると、280塩基対の断片を増幅し、増幅断片長の違いから、同マーカーの遺伝子型が判定可能となる(図1)。 When PCR is performed using this primer set, a 282 base pair fragment is amplified when the genomic DNA of the non-leafy line Na12 is used as a template. A base pair fragment is amplified, and the genotype of the marker can be determined from the difference in length of the amplified fragment (FIG. 1).
また、lfy1に、より緊密に連鎖するマーカーを見出すため、MaizeGDBで公開されたSSRマーカーのうち、Bin番号3.08〜3.09に座乗し、本解析集団の親系統であるNa12と957L間で多型に違いが見られるものを選抜した。上述の解析集団に対し、これらのマーカーの多型解析を行い、高密度の連鎖地図を作成した。 In addition, in order to find a marker linked more closely to lfy1, among the SSR markers published in MaizeGDB, they sit on Bin numbers 3.08 to 3.09, and Na12 and 957L, which are the parent lines of this analysis group The ones with differences in polymorphism were selected. Polymorphism analysis of these markers was performed on the above analysis group to create a high-density linkage map.
この連鎖地図を、QTL解析ソフトMapQTL(Van Ooijen,J.W.,M.P. Boer,R.C. Jansen,C.Maliepaard,2002.MapQTL4.0,Software for the calculation of QTL positions on genetic maps.Plant Research International,Wageningen,the Netherlands)で再びQTL解析を行った。 QTL analysis software MapQTL (Van Ooijen, JW, MP Boer, RC Jansen, C. Marypaard, 2002. MapQTL4.0, Software for the Calfontation of QT QTL analysis was performed again at Plant Research International, Wageningen, the Netherlands.
その結果、5つのSSRマーカー(umc1578、umc1361、bnlg1496、mmc0001、umc1641)が、A4M48マーカーと同程度或いはより緊密にlfy1に連鎖していることが示された(図2)。そこで、本発明では、これらのDNAマーカーを検出可能にするためのプライマーペアを構築した(表1)。これらのDNAマーカーは、すべて、MaizeGDBにおいて公開されているSSRマーカーであり、同ウェブサイトでこれらのマーカーに関するより詳細な情報や、他のマーカーの情報を得ることができる。 As a result, it was shown that five SSR markers (umc1578, umc1361, bnlg1496, mmc0001, umc1641) were linked to lfy1 to the same extent or more closely than the A4M48 marker (FIG. 2). Therefore, in the present invention, primer pairs were constructed to enable detection of these DNA markers (Table 1). These DNA markers are all SSR markers published in MaizeGDB, and more detailed information on these markers and information on other markers can be obtained on the same website.
上述のA4M48マーカー及び5つのSSRマーカーによる選抜効果を検証するため、3つの集団を用いた。これらは、多葉性系統914Lと3系統の異なる非多葉性自殖系統(TD16、KK8、KK11)とのF1を更に各々の非多葉性系統と交配した戻し交配第1世代(BC1世代)であり、各集団90個体を養成し、雌穂上位葉数の計測とlfy1近傍マーカーによる遺伝子型調査を行った。 Three populations were used to verify the selection effect with the A4M48 marker and the five SSR markers described above. These are multilobed line 914L and three systems of different non multilobed inbred (TD16, KK8, KK11) and F 1 and further backcrossing were crossed with non multilobed line of each first generation (BC 1 generation), 90 individuals were trained in each group, and the number of upper lobes of the ear was measured and the genotype was investigated using the lfy1 neighborhood marker.
各集団で調査するlfy1近傍マーカーは、914Lとそれぞれの非多葉性系統間で増幅断片長に違いがあり、遺伝子型の判定が可能であることを事前に確認した、A4M48、umc1578、umc1361、bnlg1496及びmmc0001の5つのマーカーを用いた。非多葉性系統を反復親とする戻し交配の場合、遺伝子型としては、多葉性型と非多葉性型のへテロ及び非多葉性型のホモが出現し得る。 The lfy1 neighborhood marker to be investigated in each population is A4M48, umc1578, umc1361, which has been confirmed in advance that there is a difference in amplified fragment length between 914L and each non-leafy line, and genotype determination is possible. Five markers were used: bnlg 1496 and mmc0001. In the case of backcrossing in which a non-leafy line is a recurrent parent, genotypes of multi-leaf type and non-leafy type hetero and non-leafy type homozygos may appear.
A4M48マーカーの遺伝子型がヘテロを示したグループと非多葉性のホモを示したグループ間で平均雌穂上位葉数を比較した。その結果、3集団とも、多葉性型と非多葉性型のヘテロの方が、非多葉性型ホモよりも雌穂上位葉数が有意に多いことが示され、A4M48マーカーによる選抜効果が示された(表2)。 The average number of upper ear leaves was compared between the group in which the genotype of the A4M48 marker showed heterogeneity and the group in which non-multileaf homology was shown. As a result, it was shown that the number of upper leaves in the ear was significantly higher in the three populations than in the non-leafy type homozygous in the multileaf type and non-leafy type hetero, and the selection effect by the A4M48 marker Was shown (Table 2).
同様の結果は、供試した4つのSSRマーカーでも見られ、DNAマーカーによる多葉性個体の選抜が有効であることが示された。また、調査したマーカーを連鎖解析した結果、umc1578、bnlg1496、mmc0001は、lfy1から1cM以内に座乗し、A4M48は、7cM、umc1361は、7〜8cMの位置に座乗していることが示された。 Similar results were also observed with the four SSR markers tested, indicating that the selection of multileaf individuals using DNA markers is effective. As a result of linkage analysis of the investigated markers, it was shown that umc1578, bnlg1496, and mmc0001 are seated within 1 cM from lfy1, A4M48 is seated at 7 cM, and umc1361 is seated at 7 to 8 cM. It was.
以上詳述したように、本発明は、トウモロコシ多葉性関連遺伝子座に連鎖するDNAマーカーを検出するプライマーセット及びその使用に係るものであり、本発明により、トウモロコシ第3染色体上の多葉性関連遺伝子座(lfy1)に連鎖するDNAマーカーを検出可能とするプライマーセットを提供することができる。本発明により提供されるプライマーセットを用いてトウモロコシゲノムDNAに対してPCRを行い、増幅断片長を調べることにより調査個体の多葉性関連遺伝子座(lfy1)の有無を識別すること、それにより、多葉性関連遺伝子座を有する個体の幼苗を選抜し、その後代においてトウモロコシ多葉性系統を効率的かつ確実に作出することができる。 As described above in detail, the present invention relates to a primer set for detecting a DNA marker linked to a corn multileaf leaf-related gene locus and the use thereof. A primer set that enables detection of a DNA marker linked to the relevant gene locus (lfy1) can be provided. PCR is performed on maize genomic DNA using the primer set provided by the present invention, and the presence or absence of the leafy loci associated locus (lfy1) of the investigated individual is examined by examining the length of the amplified fragment, thereby A seedling of an individual having a leafy leaf related locus can be selected, and a maize leafy line can be efficiently and reliably produced in its progeny.
Claims (7)
A feed corn produced by the method according to claim 6, characterized by increasing the number of upper ear spike leaves.
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2007
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