JP2008187955A - 乳酸菌およびこれを用いる製麹方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)FERMP−21074の乳酸菌、ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)FERMP−21075の乳酸菌、またはウィッセラ・チバリア(Weissella cibaria)FERMP−21076の乳酸菌である。
【選択図】図2
Description
そこで本発明は、上記課題を解決すべくなされたものであり、その目的とするところは、特に製麹工程でBacillus属菌数の低減化が可能な乳酸菌およびこれを用いた製麹方法を提供する。
すなわち、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)FERMP−21074の乳酸菌。
ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)FERMP−21075の乳酸菌。
ウィッセラ・チバリア(Weissella cibaria)FERMP−21076の乳酸菌。
バチルス属(Genus Bacillus)の菌に対する抗菌性を有するラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)の乳酸菌。
バチルス属(Genus Bacillus)の菌に対する抗菌性を有するロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)の乳酸菌。
バチルス属(Genus Bacillus)の菌に対する抗菌性を有するウィッセラ・チバリア(Weissella cibaria)の乳酸菌。
Bacillus cereus菌に対しても有効な抗菌性を有する。
上記の乳酸菌を固体培地に麹菌と共に接種して培養することによって、Bacillus属を低減した麹を製造することができる。
本発明では、製麹工程でのBacillus属菌数の低減化を目的に、製麹時に抗菌性乳酸菌を利用するにあたっては、製麹環境に適応し、蒸米上で増殖旺盛な乳酸菌であることが望ましいと考え、抗菌性乳酸菌の分離源を使用目的の生育環境に近い米麹に求めた。実際には、長野県内の数箇所の味噌工場から収集した米麹を分離源とし、分離した乳酸菌について、Bacillus属に対する抗菌性の検索を行い、またその利用について検討した。
1)米麹中からの乳酸菌の分離
長野県内の味噌工場から収集した米麹を分離源とし、BCP加プレートカウント寒天培地にカビサイジン(100mg力価/l)とアジ化ナトリウム(100PPM)を加えた分離培地を用い、重層法にて30℃、3日間培養後のBCPが変色したコロニーを乳酸菌として分離した。分離した乳酸菌は、純粋分離を繰り返した後、Difco Lactobacilli MRS Broth(以下MRS)に寒天を1.5wt%加えた高層培地で保存し、以後の試験に用いた。
米麹中より分離した乳酸菌の抗菌性試験は、一般抗菌薬感受性試験法に準じた方法によるカップ(円筒)法を用い(図1)、味噌から分離のコロニーの形状および色が異なるBacillus属5株(A〜E)を指示菌とし、カップ周辺のBacillus属の生育阻止円の有無で判定した。すなわち、標準寒天平板培地(グルコース1%添加)を30℃で2時間表面乾燥させ、それに味噌から分離したBacillus族の培養液(普通ブイヨン培地で培養)を0.1〜0.2ml塗沫後、直ちに殺菌済みのプラスチックカップ(直径1cm、高さ1cm)を差し込み、そのカップ内に、米麹より分離の乳酸菌をMRS培地で30℃、72時間培養後遠心分離して、pH6.8前後に調整した上澄液を0.1〜0.2ml添加し、30℃、72時間後のカップ周辺のクリアゾーンを観察した。
抗菌性が認められた乳酸菌と思われる菌株を、生理的手法と分子生物学的手法によって同定試験を行った。
イ.生理的諸性質
乳酸菌実験マニュアルに従って、グラム染色、カタラーゼ反応、形態観察、生育温度、耐塩性等を調べた。炭素源の資化性試験はAPI 50 CH(日本ビオメリュー社製)を用いて行った。
ロ.16SrRNAの塩基配列の解析
16SrRNA遺伝子の塩基配列解析および相同性検索を常法により行った。
イ.フラスコでの製麹
蒸米100gを500mlの三角フラスコに入れ、120℃、5分間殺菌後、麹汁斜面培地で純粋培養した麹菌胞子の懸濁液を約106(cfu/g)と、Bacillus cereus JCM2152T(普通ブイヨン培地で培養)を約105(cfu/g)とを接種し、乳酸菌接種区分ではさらに抗菌性を示したNo.7、No.8、No.12株の培養液(MRS培地)を約106(cfu/g)を接種し、また対照区では分離株で抗菌性を示さなかった菌株の中からNo.11(未同定)を選び、同様に接種した。それを30℃の恒温室で43時間製麹を行った。
ロ.小型通風製麹機での製麹
蒸米10Kgに常法通り種麹菌を種付けし、味噌から分離したBacillus D株の培養液を約104(cfu/g)接種(噴霧)した対照区と、さらにそこへ乳酸菌No.12の培養液を約105(cfu/g)噴霧した試験区を設け、小型通風製麹機を用い43時間製麹を行った。
乳酸菌の生菌数の測定は、1)の分離培地と同じ培地を用い、重層法にて30℃、3日間培養後のBCPが変色したコロニー乳酸菌として測定した。
Bacillus属の生菌数は、標準寒天培地にカビサイジン(100mg力価/l)を加えた培地を用いて常法どおり行った。
6)麹のプロテアーゼ活性と乳酸量の測定
麹のプロテアーゼ活性は蔭山変法で、乳酸量はBarker,Summerson法で行った。
1)抗菌性乳酸菌の分離株と同定
製麹工程においてBacillus属などの汚染防止に対して、抗菌性乳酸菌を利用する場合は、その乳酸菌が製麹初期において、蒸米上で旺盛に増殖することが必須条件となる。そこで抗菌性乳酸菌の分離源を使用目的の生育環境に近い米麹中に求め、分離およびBacillus属に対する抗菌性菌の検索を行った(前記カップ法)。
その結果、表1および図1にみられるように分離株No.7、8、12が、味噌より分離のBacillus属5株に対して抗菌性を示した。図1において、No.12と表記したカップは、分離株No.12を接種した株であり、カップ内およびその周辺にクリアゾーンが見られ、Bacillus属を低減し、Bacillus属に対する抗菌性を有していることがわかる。なお、図1におけるカップCには、分離株で抗菌性を示さなかった菌株を接種した対照区であり、クリアゾーンを示さず、Bacillus属に対する抗菌性を示していない。また、同様のカップ法によって、No.7、およびNo.8の菌株の抗菌性も確認された。
表2
また、No.7、No.8、No.12はいずれもグラム染色において陽性を示し、カタラーゼ試験では陰性を示した。
以上、分離株の16SrRNA遺伝子シーケンスの解析と表現形質から、No.7は、Leuconostoc citreum (以下Leu. Citreum L7)、No.8は、Weissella cibaria (以下W. cibaria L8)、No.12は、Lactobacillus fermentum(以下Lb. fermentum L12)とそれぞれ同定された。
味噌より分離したBacillus5株に対して、抗菌性が認められた乳酸菌Leu. Citreum L7(No.7)、W. cibaria L8(No.8)、Lb. fermentum L12(No.12)各々について、製麹中でのBacillus cereus JCM2152T(以下B.cereus)に対する抗菌作用を、製麹時に他の菌の影響がないフラスコ製麹で検討した。
このフラスコ製麹実施結果により比較的高温でも生育可能なことが明らかとなったLb. fermentum L12を用いて通風製麹を行った。
通常の製麹条件に近い小型通風製麹機を用い、蒸米10Kgを製麹してLb. fermentum L12接種によるBacillus属の抑制効果を検討した。
その製麹経過を図3(a)〜(d)に示した。製麹時にLb. fermentum L12を105(cfu/g)レベル接種した区分の生酸菌数(乳酸菌)は、19時間後には107(cfu/g)レベルに達していた(図3(a))。対照区は乳酸菌を接種していないが、製麹作業工程から混入した乳酸菌と思われる生酸菌が105(cfu/g)程度まで増殖がみられたものの、Bacillusの菌数は、接種菌数に近い104(cfu/g)付近のままであった。これに対し、Lb. fermentum L12を接種した区分は、19時間後にBacillusの菌数が数個以内(10倍希釈)に激減していた。今回のLb. fermentum L12の接種菌数が105(cfu/g)レベルであったので、この接種菌数を106(cfu/g)レベルに増加させれば、さらにBacillus属の抑制効果が期待できる。
また、製麹中の乳酸量は、Lb. fermentum L12接種区分でも最大値が15mg/100g程度で対照区と大差なく、抗菌作用が期待できるほどのものではなかった。したがって、製麹中のpHの推移も両者間に大きな相違はみられなかった(図3(c)、(d))。
しかしながら、製麹過程における細菌の増殖は、引き込み後、比較的初期の18時間付近で最高菌数に達し、以後製麹後半のAw(水分活性)の低下により細菌の増殖は停止に向かうことから、製麹前半にLb. fermentum L12の抗菌性が作用していれば、Bacillus属の増殖の抑制が十分可能と考えられる。
Claims (8)
- ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)FERMP−21074の乳酸菌。
- ロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)FERMP−21075の乳酸菌。
- ウィッセラ・チバリア(Weissella cibaria)FERMP−21076の乳酸菌。
- バチルス属(Genus Bacillus)の菌に対する抗菌性を有するラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)の乳酸菌。
- バチルス属(Genus Bacillus)の菌に対する抗菌性を有するロイコノストック・シトレウム(Leuconostoc citreum)の乳酸菌。
- バチルス属(Genus Bacillus)の菌に対する抗菌性を有するウィッセラ・チバリア(Weissella cibaria)の乳酸菌。
- バチルス属(Genus Bacillus)の菌がセレウス菌(Bacillus cereus)である請求項4〜6のうちのいずれか1項記載の乳酸菌。
- 請求項1〜6のうちのいずれか1項記載の乳酸菌を固体培地に麹菌と共に接種して培養を行うことを特徴とする製麹方法。
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