JP2008187935A5 - - Google Patents
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Description
本発明は、例えば、環境試料、食品検体などの微生物の迅速検出に使用される、生菌および死菌を異物などの夾雑物と識別して正確に計数できる微生物計数装置、点検用チップなどに関する。 The present invention relates to a microbe counting apparatus, a chip for inspection, and the like, which are used for rapid detection of microorganisms such as environmental samples and food specimens, and can accurately count live bacteria and dead bacteria from foreign substances and other contaminants. .
従来、蛍光色素を用いて微生物の生菌および死菌を検出し、判別する手法の一例として蛍光性酵素基質であるフルオレセイン系蛍光色素による方法が知られている。フルオレセイン系蛍光色素は、細胞や微生物の細胞膜を透過して取り込まれると、細胞質内のエステラーゼ酵素群により加水分解され、フルオレセイン骨格を有する蛍光物質（フルオレセインなど）に変換されて発光機能が発現する。そこで励起光を照射することで生じる光点を生きている細胞や微生物として判断することができる（例えば、特許文献１参照）。
下記、特許文献１において、微生物の生死を判断するための蛍光色素として、エステラーゼ活性指標指示薬であるカルセイン誘導体及びヨウ化プロピジウムを用いた方法が提案されている。これは、微生物を上記２種類の色素で染色し、緑色および赤色の蛍光強度を測定し、その強度の比較を求めることで、生菌であるか死菌であるかをフローサイトメトリーにより判断するというものである。
また、更に別の手法として、土壌や水環境などの夾雑物が多く存在する試料から、発光物の蛍光スペクトルをもとに、細胞を判別することのできる手法が知られている（例えば、特許文献２参照）。
これは、干渉デジタル画像を取得できる顕微蛍光スペクトル測定装置を使用し、ＣＣＤ画像上の画素ごとに得られた分光スペクトルを元に、あらかじめ指定したスペクトル波形と同一な波形をもつ画素を抽出し、必要なスペクトルをもつ部分だけが表示された画像を作ることができるというものである。これを利用すると複雑なバックグラウンド自家蛍光をもつ夾雑物が混在するような試料であっても、目的の蛍光発光物を判別、計測できる。
Conventionally, a method using a fluorescein fluorescent dye, which is a fluorescent enzyme substrate, is known as an example of a method for detecting and discriminating live and dead microorganisms using a fluorescent dye. When the fluorescein-based fluorescent dye is taken in through the cell membrane of a cell or a microorganism, it is hydrolyzed by the esterase enzyme group in the cytoplasm and converted into a fluorescent substance having a fluorescein skeleton (such as fluorescein), thereby exhibiting a luminescent function. Therefore, the light spot generated by irradiating the excitation light can be determined as a living cell or microorganism (see, for example, Patent Document 1).
Patent Document 1 below proposes a method using a calcein derivative and propidium iodide, which are esterase activity index indicators, as fluorescent dyes for determining the viability of microorganisms. In this method, a microorganism is stained with the above-mentioned two types of dyes, the green and red fluorescence intensities are measured, and a comparison of the intensities is obtained to determine whether the microorganism is live or dead by flow cytometry. That's it.
Further, as another method, a method is known that can discriminate cells from a sample in which many impurities such as soil and water environment exist based on the fluorescence spectrum of the luminescent material (for example, patents). Reference 2).
This uses a microscopic fluorescence spectrum measuring device capable of acquiring an interference digital image, and based on the spectral spectrum obtained for each pixel on the CCD image, extracts pixels having the same waveform as the spectrum waveform designated in advance, An image in which only a portion having a necessary spectrum is displayed can be created. By utilizing this, even if the sample is a mixture of impurities with complicated background autofluorescence, it is possible to discriminate and measure the target fluorescent substance.
しかしながら、上記特許文献１のような従来の方法は、２つの試薬の蛍光強度から生菌および死菌を検出するものであるが、必ずしも全ての細胞を検出できているとはいえない。これはエステラーゼ分解性の色素に共通の課題であるが、微生物の種類によっては酵素の発現量が異なり、全く染色されないものが存在し、またそれ以外にも微生物の置かれている環境や活性状態によって染色されやすさに大きな差があり、正確な生菌の検出ができているとはいえないためである。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、高い染色性、標識力を持つ核酸結合性の蛍光性化合物を使用することで、微生物のもつ酵素活性などの不安定要因に影響を受けることなく、安定して高感度な微生物の検出による計数が可能な装置を提供することを目的としている。
また、一般的なフローサイトメータにおいては、当業者に良く知られている事実であるが、微生物を特定するために、蛍光強度ならびに前方散乱光を測定して蛍光強度と粒子の大きさから微生物かどうかを判断している。そのため、装置には蛍光を検出するための検出器の他に、散乱光を検出するための別の検出器を設ける必要が生じ、装置構成が複雑化するという課題がある。
また、発光点の面積を求めるために前方散乱光の強度を求めているが、あくまで面積の代用として用いているに過ぎず、形状によっては面積と散乱光強度との相関性が低下し、正確に計測できないという課題がある。
また、フローサイトメータにおいて複数の染色試薬と複数の励起光源を使用して微生物の検出を行う場合、流路上に複数の励起光源による照射位置が精密に一定間隔おかれている構成と、高い精度で粒子の流速を制御する手段を設け、複数の照射位置を通過するために時間差で出現する同一の粒子由来の発光シグナルを同一の粒子由来のものであるとしてデータを結合する手段と、流速を頻繁にキャリブレーションする工程が必要となる。そのため、このようなフローサイトメータは高価であり、管理方法も複雑多岐になる。そのため、頻繁に使用される手法としては同一の励起光源で励起することが可能な染色試薬を使用し、同時に異なる蛍光を測定するというものである。しかし、このような手法では使用できる染色試薬に制限があるばかりか、染色試薬を最適な励起波長で使用できないため、感度が低下するという課題がある。
また、フローサイトメータの別形態として、同一の照射位置に複数の励起光源を同時に照射し、得られた複雑な合成蛍光スペクトル波形と、蛍光色素の標準スペクトル波形を比較して、蛍光色素ごとのスペクトルを分離し、強度を比較することができるというものがあり、それは当業者に良く知られている。しかし、このような手法では、装置が高価になるうえ、既知の試料のみの評価しか行うことができず、スペクトルの同一性を評価する事が難しい。更に未知試料において自家蛍光の多い場合や、蛍光波長のシフトが見られるような場合には、スペクトル波形の分離が行えず、解析が困難になるという課題がある。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、蛍光強度と粒子の大きさを直接同時に取得できる受像素子を使用して装置構成を簡略化することができ、微生物を捕集し、励起光源の色を切り替えることで簡便かつ容易に異なる染色試薬の画像を取得することができ、また最適波長で使用することができるため、小型でコンパクトかつ高精度である微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、微生物を発光させ画像取得し、発光点として取得された発光物の種類が微生物であるか夾雑物であるかを判定する場合、画像中の微生物と発光している夾雑物とを精度よく判別し、さらに迅速に結果を得るために少量の情報から行われることが求められている。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、画像から発光点を構成する画素の合計値を発光点の面積として求め、更に発光点を構成する画素の輝度値を求め、これらを判定に用いることにより、発光点の面積が微生物よりも大きい夾雑物や、輝度が低い画像のバックグラウンドノイズを除去することができ、精度よく微生物の数を求めることができる微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、面積および輝度の値から生菌または死菌または夾雑物であることを判断する場合、使用者が範囲の設定を簡便に行えると同時に、高い精度で判定する必要がある。
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、判定値の上限値および下限値を定める面積輝度上限値および面積輝度下限値を設けることにより、中心に分布するヒストグラムの形をとるこれらの値を簡便に選択することができるため、簡便で高精度な微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、生菌または死菌の輝度情報を簡便に、かつデータ精度を損なうことなく抽出したいという課題がある。
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、発光点を構成する画素のうち最大輝度値を使用することにより、生菌および死菌は面積が小さいため、最大輝度値を用いることで、ほぼ菌の輝度の特徴を正確に得ることができ、さらに演算処理で使用するメモリ量を減らすことができるため簡便かつ迅速化できる微生物計数装置を提供することができる。
また、発光点が微生物であるか夾雑物であるかを判定するとき、夾雑物の種類によっては発光点の面積が大きいが輝度が低いものが存在し、微生物であるか夾雑物であるかを判定するが、これらをあらかじめ除外して演算処理時間を短縮したいという課題がある。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、発光点のオブジェクトを構成する画素のうちの最大輝度が大きい物は発光点の面積が大きくまた最大輝度が低いものは面積が小さくなるものを微生物として判定に用いることで、面積が大きく輝度が低い夾雑物を発光点の中からあらかじめ除外することができ、短時間で微生物の生菌または死菌を計数できる微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、発光点の輝度値ごとに生菌または死菌とする発光点の面積を設定する場合、簡便かつ精度よく設定できるようにする必要がある。
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、面積の値を、輝度値の一次関数とすることで、直線の傾きと切片の２つの値を指定することにより、簡便かつ精度よく生菌または死菌または夾雑物の判断ができる微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、面積と輝度で生菌または死菌または夾雑物であることを判定する場合、判定する発光点の数が多くなると、２つのデータを持つ必要があるため、処理が遅くなるという課題がある。
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、判定に使用する値を、発光点の面積を輝度で除した値とすることで、面積と輝度の値がなくても同じ精度で判定をすることができ、かつメモリ使用量も半分にすることが可能となるため、迅速化できる微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、微生物は画像上で発光点の面積が非常に小さいため、画像上の見た目や面積の大小では正確に焦点を合わせるのが困難であり、調整作業が複雑化する。そのため、画像を取得した際、画像の焦点位置が適切であるかを正確かつ簡便に判定することが求められている。
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、画像の焦点が合っているときには面積が最小で輝度が最大になることを利用し、発光点の面積を輝度値で除した値によって焦点があっているかを判定することにより、微小な発光点の菌でも正確に焦点深度範囲を判定することができる微生物計数装置を提供することができる。
また、特許文献２のような手法の場合、干渉デジタル画像を取得する顕微蛍光スペクトル測定装置が非常に高価であり、また１画面ごとに測定波長範囲を走査しなければならず、たとえメンブレンフィルタのようなろ過濃縮器具を使用しても、測定時間が非常に長くなってしまう為、現実的ではない。更に測定を行う間、常に強い励起光を照射し続ける必要があるため、蛍光色素が褪色しやすく、安定した計測を常に行うことが求められる微生物検査用途においては使用が困難である。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、ＲＧＢ情報をもった画像から夾雑物を判別するのに必要な色度情報を取得することで、安価な装置で実現でき、更に測定時間も極めて短くて済むため迅速検査に使用することが可能であり、かつ蛍光色素の褪色も抑えることが可能であるために高精度である微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、微生物の発光物の色度情報を得るために、２次元空間での顕微蛍光スペクトルを取得すると、装置構成が複雑化するため、より簡便に取得できる情報から色彩情報を得ることが求められている。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、各波長で取得した画像から各波長の輝度値を読み取ることで、データを取得する装置構成は適当な受光フィルタと受像素子のみで実施することができるため、シンプルかつ小型な装置で、精度を向上させることができる微生物計数装置を実現することができる。
また、蛍光染色を用いた微生物の検出方法において、蛍光発光が微生物由来なのか、もしくは微生物以外の夾雑物に非特異的に吸着したものに由来するのか、さらには自家蛍光に由来するものなのか、蛍光発光の由来を高い精度で検出することができる手法が求められている。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、複数の画像から輝度情報を取得して色度を求め、発光物の蛍光発光が微生物に由来するものであるかどうかを評価して、微生物の数を求める際の夾雑物の存在による悪影響を排除し、高い精度で微生物の数を求めることができる微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、蛍光染色を用いた微生物の検出方法において、蛍光染色による発光を特定するための蛍光スペクトルのような指標を用いて蛍光発光の評価をより簡便に行う手法が求められている。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、励起波長や蛍光波長のクロストークが少ない蛍光染色試薬を使用して、それぞれの蛍光発光に対して、複数の波長の画像を取得し、輝度値を求めることで、限られた励起光源や分光フィルタ、受像素子などの構成要素から、簡便に微生物と夾雑物とを高い精度で識別して評価できる微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、微生物の生菌、死菌を検出する方法において、顕微鏡観察によって蛍光色素が発する蛍光の強度を観察する手法では、作業者ごとの熟練性の違いによる微生物認識精度の誤差が大きい。従って、微生物の発光状態を客観的に数値化することで夾雑物を微生物と誤認識することを防止し、精度良く検出する手法が求められている。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、微生物の発光特性を測定し、色度や色相角などの色彩的特性を示す値にすることで、生菌、死菌の色の違いだけでなく、混入した自家蛍光物質や、色素が非特異的吸着した粒子などの夾雑物の微妙な色の違いを客観的に判断し、精度良く生菌、死菌、微生物以外の夾雑物を判別して微生物を計数するための装置を提供することを目的としている。
また、発光物の色彩的特性をもって、より簡便かつ客観的に微生物を計数できる手法が求められている。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、色度の数値に対して入力手段によって閾値を設定し比較することで、より客観的に微生物か否かを判断し、微生物の計数を行うことができる微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、色彩情報を取得する方法において、発光点が非常に小さいものであった場合、ＲＧＢなど波長が異なる画像の輝度情報を取得するためにカラーＣＣＤのようなカラー情報が取得できる受像素子を使用すると、受像素子上の色感度をもつ素子が並んで配列されていると、同一画素での色情報とはならないため、１画素のズレが精度に影響してしまうような微小な発光体では、正確に色彩的特性を取得することが困難であるという課題がある。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、色度を算出するために必要な波長の異なる画像の輝度値を、それぞれの色ごとに取得した画像から座標に基づいて輝度値を抽出することで、正確に同じ位置の色彩情報を取得することができ、微生物のような微小な発光点であっても、精度良く色彩的特性を取得でき、生菌、死菌、または微生物以外の夾雑物であることを判別することができる微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、さまざまな複数の蛍光染色試薬を使用して、微生物の様々な状態を評価するとき、色彩的特性が様々であるため、目的の細胞集団ごとに色彩的特性の値を設定して計数することが求められている。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、細胞集団が複数あった場合に、それぞれに色彩的特性の値を設定して、判断し、分類することができる微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、画像から色彩的特性を求める場合、これまでは、画像データの量が膨大になってしまい、データの演算時間が長くかかってしまうばかりか、分光フィルタの数、撮像枚数が増えることで、更に膨大な時間を要してしまい、迅速性を低下させてしまうことから、より少ないデータで精度の高い微生物の計数方法が求められている。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、色彩的特性を得るのに必要なＲＧＢの三原色に対し、青色（Ｂ）にあらかじめ発光強度をもたない蛍光染色試薬を使用することや、また青色の波長域に透過性をもたない分光フィルタによる測定条件下において測定すること、さらに青色の輝度値を取得せず、あらかじめ指定した値を代入して使用することで、赤色（Ｒ）および緑色（Ｇ）のみのデータから画像中の発光点のもつ色彩的特性を表現することを可能にし、これにより計測中のメモリ使用量を減らすことができ、迅速に計数が行える微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、微生物を発光点として画像にとらえ、画像から微生物を計数する場合、膨大な画像の画素データを効率的に扱うことが求められている。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、画像から発光点を検出し、画像データから背景を除き、発光点のデータだけを抽出する発光点検出手段を設けることで、膨大な画像データを短時間に扱う事ができ、迅速性を高めた微生物計数装置を提供することができる。
また、微生物の生菌、死菌、異物などの夾雑物のいずれかであることを判断する方法において、微生物の種類や環境の違いにより、生菌のような発光色を示す異物と、死菌のような発光色を示す異物が存在する場合、これらの異物は一つの判断基準で処理することは難しく、処理方法のフローによっては精度が低下し、余計な処理が追加されるなど効率性を欠くという課題がある。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、生菌か死菌であるかを判断する生死判断手段の後段に微生物判断手段を設け、処理を分割することで、生菌や死菌に由来する蛍光発光からこれらと同じような夾雑物に由来する蛍光発光を判別して除外することで精度を向上させ、処理工程を効率的に実行することができる微生物の計数装置を提供することを目的としている。
また、微生物の生菌、死菌、微生物以外の夾雑物のいずれかであることを簡便かつ漏れがないように効果的に判別することができる手法が求められている。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、生死判断手段で発光点の輝度に基づいた２次元のドットプロットを表示し、ドットプロット上の各プロットを分類する分類手段として境界線を作成し、境界線によって分けられた領域に基づいて生菌群か死菌群かを判断した後、微生物判断手段によってプロット領域ごとに、色度から微生物か夾雑物であるかを判断することによって、効果的かつ漏れがないように生菌、死菌の判別が行える微生物の計数装置を提供することを目的としている。
また、ドットプロットは、測定する検体によってプロット上で出現する位置が微妙に異なる可能性があり、測定ごとに最適な境界線を設定する必要がある。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、作成された境界線を保存し、保存された境界線の中から最適なものを選択する事や、また選択された境界線をさらに編集して最適な状態に調整することで、ドットプロットをより精度よく分類し、微生物の計数を高い精度で行える装置を提供することを目的としている。
また、微生物の種類や増殖周期によって、プロットが広く分布している場合や、逆にプロットが密集している場合があり、ドットプロット上のプロット集団の境界が見づらくなってしまうという課題がある。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、ドットプロットの表示軸を対数と常数から選択して変更できる表示軸選択手段を設けることで、プロットが広がっていた場合には対数表示とし、逆に密集している場合には常数表示とすることで、プロットの各集団の境界が見やすくなり、生菌群か死菌群かを精度よく分類して微生物の計数が行える装置を提供することを目的としている。
また、ドットプロットにおいて、微生物の発光量を正確に表現し、精度よく計数することが求められている。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、微生物の発光点の輝度として発光点を形成する画素の輝度の総量である輝度の合計値を用いる事で、微生物の発光状態を正確に表現し、生菌群か死菌群かを精度よく分類して微生物の計数が行える装置を提供することを目的としている。
また、発光点から得られる膨大なデータをできるだけ省略し、演算速度を高速化することが求められている。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、輝度の値を、発光点を形成する画素のうちの最大輝度とし、色度の算出に必要な最大輝度値とドットプロットとの輝度の値を共用することで、ドットプロットで使用する輝度値のデータを省略することができ、よってメモリ使用量を減らせるため、演算処理を高速化して、迅速に計数が行える微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、複数の分光された画像を取得する場合、分光フィルタの機械的寸法や、波長、固定寸法などの機械的誤差により、各画像がＸＹ方向にずれることがあり、画像を統合した時に正確に発光点が重ならず、微生物の正確な計数が行えないという課題がある。
本発明はこのような従来の課題を解決するためのものであり、機械的な誤差を補正するために、あらかじめ複数の画像で発光点を取得できるマーカーを表面に固定した座標補正用チップを使用してその画像から補正値を求め、この補正値を用いて画像の座標を補正する座標補正手段を設けることで、正確に微生物の計数を行える微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、染色された微生物を画像として取得する場合、微生物が媒体中に拡散して浮遊していると、ピントが合いにくく、精度良く輝度を取得することが難しい。更に、複数の画像を取得して、各波長の輝度値を抽出しようとする場合にも、微生物が媒体中に拡散していると、同じ微生物が異なる位置に写ってしまうため、各画像での微生物の一致が難しく、色情報を抽出できなくなるという課題がある。
また、微生物を染色する場合、検体スケールが大きい場合や、検体中の微生物濃度が低い場合には、濃縮するための前処理を行う必要がある。例えば、水道水であれば１００ｍＬあたりの菌数検査が必要であり、さらにはボトリングされた飲料であれば、ボトル１本の容量（例えば５００ｍＬや１．８ｍＬ）での検査が必要になる。このような検体に対しても一定の濃度の蛍光染色試薬で染色処理をする必要があるので、蛍光染色試薬は大量に必要となるため環境負荷影響が大きく、また検体に含まれる成分の影響によって染色力が異なる。従って、安定して染色できるように検体成分を分離して観察することが要求されている。
本発明は、このような従来の課題を解決するためのものであり、検体中の微生物を表面に捕集する捕集手段を用い、捕集手段を固定できる載置手段を設けることで、発光点ごとに色度を精度良く求めることが容易になり、簡便かつ精度の高い微生物の計数が行える装置を提供することを目的としている。
更には、検体をろ過して捕集する捕集手段を用いた場合、メンブレンフィルタなどの表面に微生物を濃縮し、検体中に溶解している染色阻害成分を除去することができ、安定に細胞内での経時的な発光を観察することができ、また、最小量の蛍光染色試薬を使うことで環境負荷影響を最小限に低下させた微生物計数装置を提供することを目的としている。
また、画像の補正値を求める座標補正用チップと、焦点深度の範囲内であるかを判定するための点検用チップは個別に存在すると、点検作業を２度実施する必要が生じるため、検査工数がかかってしまうという課題がある。
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、座標補正と焦点位置の点検を両方実施することができるマーカーを表面に固定した点検用チップとすることで、点検用チップを微生物計数装置の載置手段に載置し、処理を実行することで、同じ操作で簡便に行うことができる検査装置、検査方法を提供することができる。
However, the conventional method as described in Patent Document 1 detects live and dead bacteria from the fluorescence intensities of two reagents, but it cannot be said that all cells can be detected. This is a common problem with esterase-degradable dyes, but depending on the type of microorganism, the expression level of the enzyme may not be stained at all. In addition, the environment and active state where the microorganism is placed are also present. This is because there is a large difference in the ease of staining depending on the type of bacteria, and it cannot be said that live bacteria can be detected accurately.
The present invention is to solve such a conventional problem, and by using a nucleic acid-binding fluorescent compound having high stainability and labeling power, instability factors such as enzyme activity of microorganisms are obtained. It is an object of the present invention to provide a device capable of counting by detecting microorganisms stably and highly sensitively without being affected by the above.
In general flow cytometers, it is a fact well known to those skilled in the art. In order to identify microorganisms, the fluorescence intensity and forward scattered light are measured, and the microorganisms are determined from the fluorescence intensity and the particle size. Judgment whether or not. Therefore, in addition to the detector for detecting fluorescence, the device needs to be provided with another detector for detecting scattered light, and there is a problem that the device configuration becomes complicated.
In addition, the intensity of the forward scattered light is obtained to determine the area of the light emitting point, but it is only used as a substitute for the area, and depending on the shape, the correlation between the area and the intensity of the scattered light decreases, and it is accurate. There is a problem that cannot be measured.
In addition, when detecting microorganisms using multiple staining reagents and multiple excitation light sources in a flow cytometer, the irradiation positions of the multiple excitation light sources are precisely spaced at high intervals on the flow path and high accuracy. Means for controlling the flow rate of the particles, and combining the data with the light emission signals derived from the same particles appearing with a time difference in order to pass through a plurality of irradiation positions as being derived from the same particles, and the flow rate A frequent calibration process is required. Therefore, such a flow cytometer is expensive and the management methods are complicated and varied. Therefore, a frequently used technique is to use staining reagents that can be excited with the same excitation light source and simultaneously measure different fluorescence. However, in such a technique, there are not only limitations on the staining reagent that can be used, but also there is a problem that the sensitivity is lowered because the staining reagent cannot be used at an optimum excitation wavelength.
As another form of flow cytometer, the same irradiation position is simultaneously irradiated with a plurality of excitation light sources, and the complex synthetic fluorescence spectrum waveform obtained is compared with the standard spectrum waveform of the fluorescence dye. Some are able to separate spectra and compare intensities, which are well known to those skilled in the art. However, with such a method, the apparatus becomes expensive, and only a known sample can be evaluated, and it is difficult to evaluate the spectral identity. Furthermore, when there is a lot of autofluorescence in an unknown sample, or when there is a shift in the fluorescence wavelength, there is a problem that the spectral waveform cannot be separated and the analysis becomes difficult.
The present invention is for solving such a conventional problem, and can simplify the apparatus configuration by using an image receiving element that can directly acquire the fluorescence intensity and the particle size simultaneously. Capturing and switching the color of the excitation light source makes it possible to easily and easily acquire images of different staining reagents, and can be used at the optimum wavelength, making it a compact, compact and highly accurate microorganism counting device The purpose is to provide.
In addition, when acquiring images by emitting light from microorganisms and determining whether the type of luminescent material acquired as a luminescent point is a microorganism or a contaminant, the microorganisms in the image and the luminescent contaminant are accurately identified. It is required to be done from a small amount of information in order to discriminate and obtain results more quickly.
The present invention is to solve such a conventional problem, and obtains the total value of the pixels constituting the light emitting point from the image as the area of the light emitting point, and further obtains the luminance value of the pixel constituting the light emitting point. By using these in the determination, a microorganism counting device that can remove contaminants having an emission point area larger than that of microorganisms and background noise of images with low luminance and can accurately determine the number of microorganisms. The purpose is to provide.
In addition, when determining that the cell is a live bacterium, a dead bacterium, or a contaminant from the values of the area and the luminance, it is necessary for the user to easily set the range and to determine with high accuracy.
The present invention solves such a conventional problem, and takes the form of a histogram distributed in the center by providing an area luminance upper limit value and an area luminance lower limit value that define an upper limit value and a lower limit value of determination values. Since these values can be easily selected, an object is to provide a simple and highly accurate microorganism counting apparatus.
In addition, there is a problem that it is desired to extract luminance information of live or dead bacteria easily and without impairing data accuracy.
The present invention solves such a conventional problem, and by using the maximum luminance value among the pixels constituting the light emitting point, since the area of living bacteria and dead bacteria is small, the maximum luminance value is used. Thus, it is possible to provide a microorganism counting device that can obtain the characteristics of the brightness of bacteria substantially accurately and can reduce the amount of memory used in the arithmetic processing, and can be simply and quickly.
Also, when determining whether a luminescent spot is a microorganism or a contaminant, depending on the type of contaminant, there are those with a large luminescent spot area but a low luminance, and whether it is a microorganism or a contaminant. Although it is determined, there is a problem in that it is desired to reduce the processing time by excluding these in advance.
The present invention is for solving such a conventional problem. Among the pixels constituting the object of the light emitting point, an object having a large maximum luminance has a large area of the light emitting point and a pixel having a low maximum luminance has an area. Microorganisms counting device that can count impurities that have a large area and low brightness from the light emitting point in advance, and can count live or dead microorganisms in a short time The purpose is to provide.
Moreover, when setting the area of the luminescent spot that is viable or dead for each luminance value of the luminescent spot, it is necessary to be able to set it easily and accurately.
The present invention solves such a conventional problem. By setting the area value as a linear function of the luminance value and specifying the two values of the slope of the straight line and the intercept, it is simple and accurate. It is an object of the present invention to provide a microorganism counting apparatus that can often determine whether live bacteria, dead bacteria, or contaminants.
Moreover, when determining that it is a living microbe, a dead microbe, or a contaminant by area and brightness | luminance, since the number of the luminescent points to determine needs to have two data, there exists a subject that a process becomes slow. .
The present invention solves such a conventional problem, and the value used for the determination is a value obtained by dividing the area of the light emitting point by the luminance, so that the same accuracy can be obtained without the area and the luminance value. The object of the present invention is to provide a microorganism counting device that can be made faster because the amount of memory used can be halved.
In addition, since the area of the light emitting point on the image is very small, it is difficult to focus accurately on the appearance and area of the image, and the adjustment work is complicated. Therefore, when an image is acquired, it is required to accurately and easily determine whether the focus position of the image is appropriate.
The present invention solves such a conventional problem, and utilizes the fact that the area is minimized and the luminance is maximized when the image is in focus, and the value obtained by dividing the area of the light emitting point by the luminance value. It is possible to provide a microorganism counting apparatus that can accurately determine the depth of focus range even with a microscopic light-emitting point bacterium by determining whether or not the focal point is in focus.
In the case of the technique as described in Patent Document 2, a microscopic fluorescence spectrum measuring apparatus that acquires an interference digital image is very expensive, and the measurement wavelength range must be scanned for each screen. Even if such a filtration and concentration instrument is used, the measurement time becomes very long, which is not realistic. Further, since it is necessary to continuously irradiate strong excitation light during the measurement, the fluorescent dye is likely to fade, and it is difficult to use in a microbiological examination application that requires stable measurement at all times.
The present invention is for solving such a conventional problem, and can be realized by an inexpensive apparatus by acquiring chromaticity information necessary for discriminating impurities from an image having RGB information. Furthermore, since the measurement time can be extremely short, it can be used for rapid inspection, and the discoloration of the fluorescent dye can be suppressed. .
In addition, if a microscopic fluorescence spectrum in a two-dimensional space is acquired in order to obtain chromaticity information of a luminescent material of a microorganism, the apparatus configuration becomes complicated, and thus it is required to obtain color information from information that can be acquired more easily. ing.
The present invention is to solve such a conventional problem, and an apparatus configuration for acquiring data by reading the luminance value of each wavelength from an image acquired at each wavelength has an appropriate light receiving filter and image receiving element. Since it can be carried out only by the child, a microorganism counting device capable of improving accuracy with a simple and small device can be realized.
In addition, in the method of detecting microorganisms using fluorescent staining, whether the fluorescence emission is derived from microorganisms, non-specifically adsorbed to contaminants other than microorganisms, or is it derived from autofluorescence? Therefore, a method capable of detecting the origin of fluorescence emission with high accuracy is required.
The present invention is for solving such a conventional problem, obtains luminance information from a plurality of images, obtains chromaticity, and determines whether the fluorescence emission of the luminescent material is derived from a microorganism. An object of the present invention is to provide a microbe counting apparatus that can evaluate and eliminate the adverse effects due to the presence of contaminants when determining the number of microorganisms and determine the number of microorganisms with high accuracy.
In addition, in a method for detecting a microorganism using fluorescent staining, a technique for more simply evaluating fluorescence emission using an index such as a fluorescence spectrum for specifying emission by fluorescence staining is required.
The present invention is to solve such a conventional problem, and using a fluorescent staining reagent with little crosstalk between excitation wavelengths and fluorescence wavelengths, images of a plurality of wavelengths are obtained for each fluorescence emission. Provides a microbe counting device that can easily identify and evaluate microbes and contaminants from limited components such as excitation light sources, spectral filters, and image receiving elements The purpose is to do.
Moreover, in the method of detecting the living microbes and dead microbes of a microorganism, the method of observing the intensity of the fluorescence emitted by the fluorescent dye by microscopic observation has a large error in microorganism recognition accuracy due to the difference in skill of each worker. Therefore, there is a need for a method for accurately detecting the luminescence state of microorganisms by preventing them from being mistakenly recognized as microorganisms and detecting them accurately.
The present invention is for solving such a conventional problem, and measures the luminescence characteristics of microorganisms and sets them to values indicating color characteristics such as chromaticity and hue angle. In addition to the difference in color, objective subjugation of contaminants such as mixed autofluorescent substances and non-specifically adsorbed pigments can be objectively determined to accurately detect other than live bacteria, dead bacteria, and microorganisms It is an object of the present invention to provide an apparatus for discriminating foreign matters and counting microorganisms.
In addition, there is a need for a method that can more easily and objectively count microorganisms with the color characteristics of luminescent materials.
The present invention is for solving such a conventional problem, by setting a threshold value by the input means for the numerical value of the chromaticity, comparing more objectively to determine whether it is a microorganism, An object of the present invention is to provide a microorganism counting apparatus capable of counting microorganisms.
In the method of acquiring color information, if the light emitting point is very small, an image receiving element that can acquire color information such as a color CCD in order to acquire luminance information of an image having a different wavelength such as RGB. When used, if the elements having color sensitivity on the image receiving element are arranged side by side, the color information in the same pixel will not be obtained, so that a minute light emitter that causes the deviation of one pixel to affect the accuracy However, there is a problem that it is difficult to accurately obtain the color characteristics.
The present invention is to solve such a conventional problem, and based on the coordinates from the image acquired for each color, the luminance value of the image having a different wavelength necessary for calculating the chromaticity. By extracting the luminance value, it is possible to accurately acquire color information at the same position, and even with minute emission points such as microorganisms, it is possible to acquire color characteristics with high accuracy, Another object of the present invention is to provide a microbe counting apparatus that can discriminate foreign substances other than microorganisms.
In addition, when evaluating various states of microorganisms using various fluorescent staining reagents, the color characteristics vary, so the value of the color characteristics is set for each target cell population and counted. It is demanded.
The present invention is for solving such a conventional problem, and in the case where there are a plurality of cell populations, a microbial count capable of determining, classifying, and setting a color characteristic value for each cell population. The object is to provide a device.
In addition, when obtaining color characteristics from an image, until now, the amount of image data becomes enormous and the calculation time of the data takes longer, and the number of spectral filters and the number of captured images increase. Furthermore, since enormous time is required and rapidity is lowered, there is a need for a highly accurate method for counting microorganisms with less data.
The present invention is for solving such a conventional problem, and for the three primary colors RGB necessary for obtaining color characteristics, a fluorescent staining reagent having no emission intensity in blue (B) in advance is provided. Use it, or measure under measurement conditions with a spectral filter that does not have transparency in the blue wavelength range, and also substitute the specified value without acquiring the blue luminance value. It is possible to express the color characteristics of the light emitting points in the image from the data of only red (R) and green (G), thereby reducing the amount of memory used during measurement and enabling quick counting. An object of the present invention is to provide a microbe counting apparatus capable of performing the above.
In addition, when a microorganism is regarded as an emission point in an image and the microorganism is counted from the image, it is required to efficiently handle pixel data of a huge image.
The present invention is to solve such a conventional problem, by providing a light emission point detecting means for detecting a light emission point from an image and excluding the background from the image data and extracting only the data of the light emission point. Therefore, it is possible to provide a microbe counting apparatus capable of handling a large amount of image data in a short time and improving the speed.
In addition, in a method for determining whether a microorganism is a living microorganism, a dead bacteria, or a foreign substance such as a foreign substance, a foreign substance exhibiting a luminescent color, such as a living microorganism, If there is a foreign substance that exhibits a luminescent color, it is difficult to process these foreign substances with a single criterion, and the accuracy may be reduced depending on the processing method flow, and additional processing may be added. There is a problem of lacking.
The present invention is to solve such a conventional problem, and is provided with a microorganism judging means after the life and death judging means for judging whether the bacteria are viable or dead, and by dividing the processing, Microorganism counting device that can improve accuracy by distinguishing and excluding fluorescent light emission derived from impurities similar to these from fluorescent light emission derived from bacteria and dead bacteria, and can efficiently execute processing steps The purpose is to provide.
In addition, there is a need for a technique that can easily and effectively discriminate whether a microorganism is a living bacterium, a dead bacterium, or a contaminant other than a microorganism.
The present invention is to solve such a conventional problem, and displays a two-dimensional dot plot based on the luminance of the light emitting point by the life / death determining means and classifies each plot on the dot plot. The boundary line is created as follows, and based on the area divided by the boundary line, it is determined whether it is a viable cell group or a dead cell group. It is an object of the present invention to provide a microbe counting apparatus capable of discriminating viable and dead bacteria so as to be effective and free from leakage.
Further, the dot plot may have a slightly different position on the plot depending on the sample to be measured, and it is necessary to set an optimum boundary line for each measurement.
The present invention is for solving such a conventional problem. The created boundary line is stored, and the optimum boundary is selected from the stored boundary lines, and the selected boundary line is selected. The object of the present invention is to provide a device capable of classifying a dot plot with higher accuracy and counting microorganisms with high accuracy by further editing the line and adjusting it to an optimum state.
In addition, depending on the type of microorganism and the growth cycle, plots may be widely distributed, or conversely, plots may be dense, and there is a problem that it is difficult to see the boundaries of the plot group on the dot plot.
The present invention is to solve such a conventional problem, and by providing a display axis selection means capable of selecting and changing the display axis of a dot plot from a logarithm and a constant, the plot is widened. Is a logarithmic display, and conversely when it is dense, it is easy to see the boundaries of each group of plots, and it is possible to count microorganisms by accurately classifying live or dead groups The object is to provide a device.
Moreover, it is required to accurately represent the amount of luminescence of microorganisms and accurately count in the dot plot.
The present invention is to solve such a conventional problem, and by using the total value of the luminance which is the total luminance of the pixels forming the light emitting point as the luminance of the light emitting point of the microorganism, the light emission of the microorganism is achieved. An object of the present invention is to provide an apparatus that can accurately represent the state and accurately classify whether the group is a live or dead group and count microorganisms.
Further, it is required to increase the calculation speed by omitting as much data as possible obtained from the light emission points.
The present invention is to solve such a conventional problem. The luminance value is set to the maximum luminance among the pixels forming the light emitting point, and the maximum luminance value and dot plot necessary for calculating the chromaticity are used. By sharing the brightness value with, the brightness value data used in dot plots can be omitted, thus reducing the amount of memory used. The object is to provide a device.
Also, when acquiring multiple spectral images, each image may shift in the XY direction due to mechanical errors of spectral filters, mechanical errors such as wavelength and fixed dimensions, etc. There is a problem that the emission points do not overlap and accurate counting of microorganisms cannot be performed.
The present invention is to solve such a conventional problem, and in order to correct a mechanical error, a coordinate correction chip in which a marker capable of acquiring a light emitting point in a plurality of images is fixed on the surface in advance is used. An object of the present invention is to provide a microbe counting apparatus capable of accurately counting microbes by providing a coordinate correction means for obtaining a correction value from the image and correcting the coordinates of the image using the correction value.
In addition, when acquiring stained microorganisms as an image, if the microorganisms are diffused and floating in the medium, it is difficult to focus and it is difficult to acquire luminance with high accuracy. Furthermore, when acquiring a plurality of images and extracting the luminance value of each wavelength, if the microorganisms are diffused in the medium, the same microorganisms will be reflected in different positions. There is a problem that it is difficult to match microorganisms and color information cannot be extracted.
In addition, when a microorganism is stained, if the specimen scale is large or the microorganism concentration in the specimen is low, it is necessary to perform a pretreatment for concentration. For example, in the case of tap water, inspection of the number of bacteria per 100 mL is necessary, and in the case of a bottling beverage, inspection with a capacity of one bottle (for example, 500 mL or 1.8 mL) is required. Since it is necessary to stain such specimens with a certain concentration of fluorescent staining reagent, a large amount of fluorescent staining reagent is required, so the impact on the environment is large and the influence of the components contained in the specimen The dyeing power is different. Therefore, it is required to separate and observe specimen components so that they can be stably stained.
The present invention is to solve such a conventional problem, and by using a collecting means for collecting microorganisms in a specimen on the surface, and providing a mounting means for fixing the collecting means, light emission is achieved. An object of the present invention is to provide a device that makes it easy to accurately obtain chromaticity for each point, and that can easily and accurately count microorganisms.
Furthermore, when a collection means for filtering and collecting the sample is used, the microorganisms can be concentrated on the surface of a membrane filter and the like, and the staining inhibitory components dissolved in the sample can be removed. It is an object of the present invention to provide a microbe counting apparatus that can observe luminescence over time in the inside and that can reduce the environmental impact effect to a minimum by using a minimum amount of fluorescent staining reagent.
In addition, if the coordinate correction chip for obtaining the correction value of the image and the inspection chip for determining whether it is within the range of the focal depth are separately present, it is necessary to perform the inspection work twice. There is a problem that it takes.
The present invention solves such a conventional problem, and makes the inspection chip a microorganism by fixing the marker that can perform both the coordinate correction and the focus position inspection on the surface. By mounting on the mounting means of the counting device and executing the processing, it is possible to provide an inspection device and an inspection method that can be easily performed by the same operation.
本発明の微生物計数装置は、上記目的を達成するために、微生物を捕集する捕集手段を載置する載置手段と、生菌および死菌を染色する生死菌染色試薬と死菌を染色する死菌染色試薬を用いて染色された前記捕集手段上の微生物の蛍光画像を取得する蛍光画像取得手段と、前記蛍光画像取得手段により取得された蛍光画像から発光点を検出する発光点検出手段と、前記発光点検出手段により検出された発光点が生菌、死菌、夾雑物のいずれかであることを判断する蛍光評価手段とを備えた微生物計数装置において、前記発光点抽出手段によって抽出された赤色蛍光画像の輝度を赤色の輝度とし、緑色蛍光画像の輝度を緑色の輝度とし、これらの輝度と、入力手段から入力した青色の輝度に基づいて、発光点ごとに色度を算出する色度算出手段を備え、前記色度算出手段から算出された色度の値から生菌または死菌または夾雑物であるかを前記蛍光評価手段により判断することを特徴としたものであり、青色の輝度を毎回取得せずに、あらかじめ標準的な試料を使用して求められた値をパラメータとして使用することで、計測に使用する画像の種類を減らし、データ量を軽減しても色度によるデータの判断精度を落とすことなく測定できるため、迅速かつ精度の高い微生物計数装置を提供することができる。
また、請求項２に記載の微生物計数装置は、微生物を捕集する捕集手段を載置する載置手段と、生菌および死菌を染色する生死菌染色試薬と死菌を染色する死菌染色試薬を用いて染色された前記捕集手段上の微生物の蛍光画像を取得する蛍光画像取得手段と、前記蛍光画像取得手段により取得された蛍光画像から発光点を検出する発光点検出手段と、前記発光点検出手段により検出された発光点が生菌、死菌、夾雑物のいずれかであることを判断する蛍光評価手段とを備えた微生物計数装置において、前記蛍光評価手段で発光点の面積および輝度値から生菌または死菌または夾雑物であるかを判断する面積輝度判断手段を備えることを特徴としたものであり、蛍光染色試薬による発光点の蛍光発光が、微生物由来であるか、微生物以外の夾雑物由来であるかを迅速に判断し、発光点の中から生菌を高い精度で検出し、計数することができる微生物計数装置が得られる。
また、請求項３に記載の微生物計数装置は、請求項２記載の微生物計数装置において、面積輝度判断手段において、生菌または死菌または夾雑物であるかを判定する値の範囲の上限および下限を定める面積輝度上限値および面積輝度下限値を設けることを特徴としたものであり、微生物として設定するパラメータの範囲を明確かつ効率的に選択し、上限値および下限値により範囲を限定することが容易となるため、簡便で精度の高い微生物計数装置が得られる。
また、請求項４に記載の微生物計数装置は、請求項２または３に記載の微生物計数装置において、面積輝度判断手段において、判断に用いる輝度の値が、発光点を構成する画素のうちの最大輝度値であることを特徴としたものであり、微生物の発光を示す輝度の値を精度よく得ることができ、また演算処理のメモリ量を減らすことができるため、迅速かつ精度の高い微生物計数装置が得られる。
また、請求項５に記載の微生物計数装置は、請求項２乃至４のいずれかに記載の微生物計数装置において、面積輝度判断手段において、発光点の輝度の値によって生菌または死菌とする発光点の面積の値を設定することを特徴としたものであり、微生物は種類や増殖期などの状態によって発光輝度が変化し、また画像上の面積も変化するが、輝度が高いものは面積が大きく、輝度が低いものは面積が小さいことを利用し、輝度が低いものは、面積が小さいものを微生物とし、反対に輝度が高いものは、面積が大きいものを微生物とするように、輝度の値によって面積の値を設定することにより、微生物と判定する精度を高め、様々な状態に対しても堅牢性の高い微生物計数装置が得られる。
また、請求項６に記載の微生物計数装置は、請求項２乃至５のいずれかに記載の微生物計数装置において、面積輝度判断手段において生菌または死菌と判断する面積の値を、発光点の輝度値の一次関数によって設定することを特徴としたものであり、輝度が高いものは面積が大きいものを微生物とし、輝度が低いものは面積が小さいものを微生物とするように設定するとき、その上限値および下限値を一次関数で設定すれば、必要な入力値は傾きと切片のみとすることができるため、簡単に範囲を指定でき、更に微調整が可能であるため高精度な微生物計数装置が得られる。
また、請求項７に記載の微生物計数装置は、請求項２乃至４のいずれかに記載の微生物計数装置において、面積輝度判断手段において、発光点の面積を発光点の画素の最大輝度値で除した値を用いて判断することを特徴としたものであり、菌数が多くデータ量が多い場合には、演算処理で使用するメモリ量が多くなるため処理時間が長くなるが、面積と輝度という二つのデータを、面積を輝度で除した値の一つとすることでメモリ使用量を減らすことができるため、演算処理時間を短縮でき、また精度も高い状態を維持することができるため、迅速かつ高精度な微生物計数装置が得られる。
また、請求項８に記載の微生物計数装置は、請求項２乃至７のいずれかに記載の微生物計数装置において、面積輝度判断手段により発光点の面積を輝度で除した値を求め、画像が焦点深度の範囲内であるかを判断する焦点判断手段を設けることを特徴としたものであり、微生物のような発光点の面積が非常に小さくなるものの場合、光学系の焦点位置がわかりにくく、取得した画像の焦点位置が焦点深度の範囲内であったかどうかが判断しづらいが、面積を輝度で除した値を用いることにより、画像の焦点位置があっているどうかを確認することができ、焦点のずれによる画質の悪化、計数精度の低下を防ぐことができる微生物計数装置が得られる。
また、請求項９記載の微生物計数装置は、請求項１乃至８のいずれかに記載の微生物計数装置において、画像の演算処理に用いるパラメータを入力する入力手段を備えることを特徴としたものであり、演算処理に使用する膨大な数のパラメータの入力を簡便かつ効率的に行う事ができ、実用性の高い微生物計数装置が得られる。
また、請求項１０に記載の微生物計数装置は、請求項１乃至９のいずれかに記載の微生物計数装置において、蛍光画像取得手段が励起光源と分光フィルタと拡大レンズと受像素子を備え、青色励起によって緑色蛍光を発する生死菌染色試薬と、緑色励起によって赤色蛍光を発する死菌染色試薬を用い、青色励起光による緑色蛍光画像と、青色励起光による赤色蛍光画像と、緑色励起光または黄色励起光による赤色蛍光画像を取得するようにしたことを特徴としたものであり、青色励起光による緑色蛍光画像を取得することで、紫外光励起などに対して自家蛍光を低減して測定ができるため、自家蛍光によるバックグラウンド輝度が減少し、ＳＮを向上させることができる。また２種類の染色試薬の輝度の取得と色度の取得に使用する励起光源と分光フィルタの組み合わせを最小限に抑える事ができるため、装置構成を簡略化することができ、小型で低コストな微生物計数装置が実現できる。
また、請求項１１記載の微生物計数装置は、請求項１乃至１０のいずれかに記載の微生物計数装置において、発光点検出手段が、画像上の発光点の輝度と座標と面積を抽出する発光点抽出手段と、前記発光点抽出手段により抽出された画像上の発光点の座標を補正する座標補正手段と、補正された座標をもとに複数の画像から同一の発光点を照合し、照合された発光点の各画像の輝度値と面積のデータを結合する発光点照合手段を備えることを特徴としたものであり、画像ごとに発光点を検出して、座標を補正したのち発光点のデータを照合し結合することで、精度よくかつバックグラウンドなどのデータを持たない最小限のデータを扱う事ができるため、メモリ使用量を減らすことによる演算速度の高速化を図ることができ、迅速性の高い微生物計数装置が得られる。
また、請求項１２記載の微生物計数装置は、請求項１乃至１１のいずれかに記載の微生物計数装置において、蛍光評価手段が、発光点ごとに色度を算出する色度算出手段と、発光点の青色励起光による緑色蛍光画像の輝度と緑色励起光または黄色励起光による赤色蛍光画像の輝度に基づいて発光点を生菌群または死菌群に分類する生死判断手段と、生菌群または死菌群に分類された発光点が微生物であるか夾雑物であることを色度で判断する微生物判断手段を備え、発光点が生菌、死菌、夾雑物のいずれかであることを判断するようにしたことを特徴としたものであり、発光物を生菌に近い色の集団と死菌に近い色の集団に分類し、それによって分類された発光物に対して微生物か夾雑物であるかを判断することで、色彩的特性を効果的に扱うことができ、判別工程を効率化し、判別精度を高めた微生物計数装置を実現することができる。
また、請求項１３記載の微生物計数装置は、請求項１２記載の微生物計数装置において、生死判断手段において、青色励起光による緑色蛍光画像のチャンネルの輝度値を第一軸、緑色励起光または黄色励起光による赤色蛍光画像のチャンネルの輝度値を第二軸として２次元のドットプロットを表示するドットプロット表示手段と、前記ドットプロット表示手段により表示された各プロットを生菌群または死菌群に分類する分類手段を備え、前記分類手段により生菌群または死菌群に分類するようにしたことを特徴としたものであり、生菌と死菌では２つの染色試薬による発光強度が異なるが、この特徴をドットプロット上で生菌と死菌を個別に集団化して表示することで、分類手段によってこれらを簡便に分類することができる。これにより画像中の発光点の分布状態を、ドットプロット上の集団の位置と密度から、客観的に判断し、計数すべきものを的確に選択することができるため、精度が高い微生物計数装置を実現する事ができる。
また、請求項１４記載の微生物計数装置は、請求項１１乃至１３のいずれかに記載の微生物計数装置において、発光点照合手段において、画像ごとの発光点データをＲＧＢのチャンネルに割り当てて１枚のカラー画像で出力する結果画像出力手段を設けたことを特徴としたものであり、取得した発光画像を色彩情報に基づいてカラー表示することにより、顕微鏡による確認作業において、発光画像と顕微鏡の像を比較することが容易になるため、発光物の確認作業の正確性を向上させることができる。また熟練者でなくとも発光物の中から微生物を探し出すことが容易になり、検査時間を短縮するとともに測定精度管理の正確性を向上させた微生物検査システムのための微生物計数装置を提供することができる。
また、請求項１５記載の点検用チップは、発光点を取得するためのマーカーを表面に固定し、焦点深度の範囲内であるかを判断するために用いることを特徴としたものであり、焦点位置が適切かどうかをあらかじめ判定することができ、測定精度の管理を容易に行うことができる微生物計数装置が得られる。
また、請求項１６記載の点検用チップは、青色励起光による緑色蛍光画像と、青色励起光による赤色蛍光画像と、緑色励起光または黄色励起光による赤色蛍光画像の全てで発光点を取得できる波長をもったマーカーを表面に固定したことを特徴としたものであり、青色励起光による緑色蛍光画像と、青色励起光による赤色蛍光画像と、緑色励起光または黄色励起光による赤色蛍光画像の３種類の画像の機械的なズレ幅を算出するために、３種類の画像全てで蛍光像を取得できるマーカーを用いて画像を取得し、画像ごとのマーカーの位置関係を比較し、ＸＹ方向の座標の差を求める事で、これらの画像のズレ幅を容易に算出する事ができる画像補正方法を実現するための点検用チップを提供することができる。
また、請求項１７記載の点検用チップは、請求項１５または１６記載の点検用チップにおいて、座標補正と焦点位置の判定の両方に使用できるマーカーを表面に固定したことを特徴としたものであり、画像補正と焦点位置の確認を別々に実施するのではなく、同時に実施できるため装置の点検作業が一回で済み、点検時間、点検工数を減らせるだけでなく、点検漏れも防止できるようになって迅速かつ正確な微生物検査を行うための点検用チップを提供することができる。
In order to achieve the above object, the microorganism counting apparatus of the present invention stains a placing means for placing a collecting means for collecting microorganisms, a living / dead bacteria staining reagent for staining live bacteria and dead bacteria, and dead bacteria. A fluorescence image acquisition means for acquiring a fluorescence image of a microorganism on the collection means stained with a dead bacteria staining reagent, and a light emission point detection for detecting a light emission point from the fluorescence image acquired by the fluorescence image acquisition means Means and a fluorescence evaluation means for judging that the luminescent point detected by the luminescent point detecting means is any one of viable bacteria, dead bacteria, and contaminants. The luminance of the extracted red fluorescent image is set to red luminance, the luminance of the green fluorescent image is set to green luminance, and chromaticity is calculated for each light emitting point based on these luminances and the blue luminance input from the input means. Chromaticity calculation means And the fluorescence evaluation unit determines whether the bacterium is viable, dead, or contaminated from the chromaticity value calculated by the chromaticity calculation unit, and obtains a blue luminance every time. Without using a standard sample as a parameter, reducing the types of images used for measurement and reducing the amount of data, the accuracy of data judgment by chromaticity Since it can measure without dropping, it can provide a quick and highly accurate microbe counting apparatus.
Further, the microorganism counting apparatus according to claim 2 is provided with a placing means for placing a collecting means for collecting microorganisms, a living / dead bacteria staining reagent for staining live bacteria and dead bacteria, and a dead bacteria for staining dead bacteria. A fluorescence image acquisition means for acquiring a fluorescence image of a microorganism on the collection means stained with a staining reagent; a light emission point detection means for detecting a light emission point from the fluorescence image acquired by the fluorescence image acquisition means; In a microbe counting apparatus comprising: a fluorescence evaluation unit that determines whether a light emission point detected by the light emission point detection unit is a live cell, a dead cell, or a contaminant, an area of a light emission point by the fluorescence evaluation unit And an area luminance judging means for judging whether it is a living bacterium, a dead bacterium or a contaminant from the luminance value, and the fluorescence emission at the luminescent point by the fluorescent staining reagent is derived from a microorganism, Contamination other than microorganisms Quickly determine whether the origin to detect live cells with high accuracy from among the light emitting points, the microorganism counting apparatus is obtained which can be counted.
Further, the microorganism counting apparatus according to claim 3 is the microorganism counting apparatus according to claim 2, wherein the area luminance determining means determines whether the microorganism is a live cell, a dead cell, or a contaminant. The area luminance upper limit value and the area luminance lower limit value are determined, and a range of parameters set as a microorganism is clearly and efficiently selected, and the range can be limited by the upper limit value and the lower limit value. Since it becomes easy, a simple and highly accurate microorganism counting device can be obtained.
The microorganism counting device according to claim 4 is the microorganism counting device according to claim 2 or 3, wherein the luminance value used for the determination in the area luminance determining means is a maximum value of the pixels constituting the light emitting point. It is characterized by the luminance value, and since the luminance value indicating the luminescence of the microorganism can be obtained with high accuracy and the memory amount of the arithmetic processing can be reduced, the microorganism counting device can be quickly and highly accurate. Is obtained.
Further, the microorganism counting apparatus according to claim 5 is the microorganism counting apparatus according to any one of claims 2 to 4, wherein the area luminance determining means emits light that is viable or dead by the luminance value of the light emitting point. It is characterized by setting the value of the area of the point, and the emission luminance of microorganisms changes depending on the type and growth phase, and the area on the image also changes. Large and low-luminances use the small area, and low-luminance ones that have a small area are microorganisms, and conversely high ones that have a large area are microorganisms. By setting the area value according to the value, it is possible to improve the accuracy of determination as a microorganism and to obtain a microorganism counting apparatus having high robustness against various states.
Further, the microorganism counting apparatus according to claim 6 is the microorganism counting apparatus according to any one of claims 2 to 5, wherein the area brightness determination means determines the value of the area as viable or dead as the emission point. It is characterized in that it is set by a linear function of the luminance value. When the luminance is set so that the high area is the microorganism, the low luminance is the microorganism, the small area is the microorganism. If the upper and lower limits are set with a linear function, the necessary input values can be only the slope and intercept, so the range can be specified easily and fine adjustment is possible, so a highly accurate microbe counting device Is obtained.
The microorganism counting device according to claim 7 is the microorganism counting device according to any one of claims 2 to 4, wherein the area luminance determining means divides the area of the light emitting point by the maximum luminance value of the pixel of the light emitting point. When the number of bacteria is large and the amount of data is large, the amount of memory used in the calculation process increases and the processing time becomes long. Since the memory usage can be reduced by making the two data one of the values obtained by dividing the area by the brightness, the calculation processing time can be shortened and the high accuracy state can be maintained. A highly accurate microbe counting apparatus can be obtained.
Further, the microorganism counting apparatus according to claim 8 is the microorganism counting apparatus according to any one of claims 2 to 7, wherein the area luminance determination means obtains a value obtained by dividing the area of the light emitting point by the luminance, and the image is focused. It is characterized by providing a focus judgment means to judge whether it is within the depth range, and it is difficult to understand the focal position of the optical system when the area of the light emitting point such as microorganisms is very small It is difficult to determine whether the focus position of the image is within the depth of focus range, but by using the value obtained by dividing the area by the brightness, it is possible to confirm whether the focus position of the image is correct. It is possible to obtain a microorganism counting device that can prevent deterioration in image quality due to deviation and decrease in counting accuracy.
A microorganism counting apparatus according to claim 9 is the microorganism counting apparatus according to any one of claims 1 to 8, further comprising input means for inputting parameters used for image calculation processing. Therefore, it is possible to input a huge number of parameters used for arithmetic processing simply and efficiently, and a highly practical microorganism counting apparatus can be obtained.
The microorganism counting apparatus according to claim 10 is the microorganism counting apparatus according to any one of claims 1 to 9, wherein the fluorescence image acquisition means includes an excitation light source, a spectral filter, a magnifying lens, and an image receiving element, Using live and dead bacteria staining reagent that emits green fluorescence by excitation and death bacteria staining reagent that emits red fluorescence by green excitation, green fluorescence image by blue excitation light, red fluorescence image by blue excitation light, green excitation light or yellow excitation It is characterized by acquiring a red fluorescent image by light, and by acquiring a green fluorescent image by blue excitation light, it is possible to measure by reducing autofluorescence against ultraviolet light excitation, etc. Background luminance due to autofluorescence is reduced, and SN can be improved. In addition, since the combination of the excitation light source and spectral filter used to acquire the luminance and chromaticity of the two types of staining reagents can be minimized, the apparatus configuration can be simplified, and the size and cost can be simplified. A microorganism counting device can be realized.
The microorganism counting device according to claim 11 is the microorganism counting device according to any one of claims 1 to 10, wherein the light emission point detecting means extracts the luminance, coordinates and area of the light emission point on the image. The extraction means, the coordinate correction means for correcting the coordinates of the light emission points on the image extracted by the light emission point extraction means, and the same light emission points are collated from a plurality of images on the basis of the corrected coordinates. It is characterized by comprising a light emission point collating means for combining the brightness value and area data of each image of the light emission point, and after detecting the light emission point for each image and correcting the coordinates, the light emission point data By collating and combining data, it is possible to handle the minimum amount of data with no precision such as background data. Therefore, the calculation speed can be increased by reducing the amount of memory used. High Biological counting device can be obtained.
The microorganism counting device according to claim 12 is the microorganism counting device according to any one of claims 1 to 11, wherein the fluorescence evaluation unit includes a chromaticity calculating unit that calculates chromaticity for each light emitting point, and a light emitting point. A life-and-death determination means for classifying the light emission point into a viable cell group or a dead cell group based on the luminance of the green fluorescence image by the blue excitation light and the luminance of the red fluorescence image by the green or yellow excitation light; It is equipped with a microorganism judging means for judging whether the luminescent spot classified into the fungal group is a microorganism or a contaminant by chromaticity, and judges whether the luminescent spot is a live bacteria, a dead bacteria, or a contaminant. The luminescent materials are classified into a group having a color close to viable bacteria and a group having a color close to dead bacteria, and the luminescent materials thus classified are microorganisms or contaminants. The color characteristics are effectively handled. It can, streamline determination step, it is possible to realize a microorganism counting apparatus with improved discrimination accuracy.
The microorganism counting apparatus according to claim 13 is the microorganism counting apparatus according to claim 12, wherein in the life / death determining means, the luminance value of the channel of the green fluorescence image by the blue excitation light is set to the first axis, the green excitation light or the yellow excitation. A dot plot display means for displaying a two-dimensional dot plot with the luminance value of the channel of the red fluorescent image by light as the second axis, and each plot displayed by the dot plot display means is classified into a live cell group or a dead cell group Classification means, and classified by the classification means into a viable cell group or a dead cell group, and the luminescence intensity by the two staining reagents differs between the live cell and the dead cell, By displaying the characteristics by separately grouping live and dead bacteria on a dot plot, the classification means can easily classify them. This makes it possible to objectively determine the distribution state of the light emission points in the image from the position and density of the group on the dot plot, and to select exactly what should be counted, thus realizing a highly accurate microorganism counting device. I can do it.
Further, the microorganism counting apparatus according to claim 14 is the microorganism counting apparatus according to any one of claims 11 to 13, wherein the light emission point collating means assigns the light emission point data for each image to the RGB channels, and A result image output means for outputting a color image is provided, and the obtained emission image is displayed in color based on the color information, so that the emission image and the microscope image can be displayed in a confirmation operation using a microscope. Since it becomes easy to compare, the accuracy of the confirmation work of the luminescent material can be improved. It is also possible to provide a microorganism counting apparatus for a microorganism testing system that makes it easy for non-experts to find microorganisms from luminescent materials, shortens the testing time, and improves the accuracy of measurement accuracy management. it can.
The inspection chip according to claim 15 is characterized in that a marker for acquiring a light emitting point is fixed on the surface and used for judging whether the depth is within the range of the focal depth. Whether or not the position is appropriate can be determined in advance, and a microorganism counting device that can easily manage the measurement accuracy is obtained.
The inspection chip according to claim 16 has a wavelength capable of acquiring a light emitting point in all of a green fluorescent image by blue excitation light, a red fluorescent image by blue excitation light, and a red fluorescent image by green excitation light or yellow excitation light. Is characterized in that a marker having a surface is fixed on the surface, and is of three types: a green fluorescence image by blue excitation light, a red fluorescence image by blue excitation light, and a red fluorescence image by green excitation light or yellow excitation light In order to calculate the mechanical misalignment width of the images, images are acquired using markers that can acquire fluorescent images with all three types of images, the positional relationship of the markers for each image is compared, and the coordinates in the XY directions are compared. By obtaining the difference, it is possible to provide an inspection chip for realizing an image correction method capable of easily calculating the deviation width of these images.
The inspection chip according to claim 17 is characterized in that in the inspection chip according to claim 15 or 16, a marker that can be used for both coordinate correction and determination of a focal position is fixed on the surface. , Image correction and focus position check are not performed separately, but can be performed at the same time, so the inspection work of the device can be done only once, not only reducing inspection time and inspection man-hours, but also preventing inspection omissions Thus, it is possible to provide an inspection chip for performing a quick and accurate microorganism test.
本発明の微生物計数装置によれば、微生物判断手段によって、蛍光染色試薬の蛍光発光が、微生物由来であるか、微生物以外の夾雑物由来であるかを判別することができる。
また、微生物有無を迅速に検査できる検査システムを構築し、食品や化成品、水などの製造、物流システムを効率化することができる。
また、蛍光染色試薬の蛍光発光を精度良く評価することにより、より確実に微生物だけを検出することができる。
また、微生物の検査の熟練者でなくとも、発光画像から微生物有無の判断を容易に行うことができる。
また、発光画像の確認を容易に行うことができるため、迅速な微生物検査システムの精度を向上し、検査時間を短縮することで、効率化を図ることができる。
また、視覚的に微生物の存在を示すことで、微生物衛生管理に対する作業者の意識を向上させることにつながり、衛生管理システムの品質を向上させることができる。
また、微生物だけを検出することにより、検査結果の確実性が向上し、微生物汚染の少ない食品や化成品、水などの製品を提供することができる。
また、微生物だけを検出することにより、より確実に微生物の発酵工程を管理することができ、品質の安定した製品を提供することができる。
また、微生物だけを検出することにより、廃水や土壌などの汚染処理の工程管理が迅速に行えるようになり、効率化された処理技術が実現できる。
また、微生物の計測のために色度、色相角、彩度、明度などの色彩的特性を使用することで、蛍光発光を高い判別精度で評価することができる。
また、色彩的特性を示す値に対して閾値を設けることで、判断の客観性を高めることができる。
また、色彩的特性を示す値に対して閾値を設けることで、微生物か否かの判別を微生物判断手段により自動化することができる。
また、さまざまな状態や、種類、また環境状態が異なる微生物集団に対して、それぞれ最適な閾値を設定することによって、複雑なミクロフローラを形成した試料から生菌、死菌をそれぞれ集団ごとに検出することができる。
また、生菌または死菌であることを判断する工程を行う生死判断手段と、微生物と微生物以外の夾雑物であることを判断する微生物判断手段をそれぞれ別に設けることで、生菌か死菌か夾雑物かの判別を効率化することができる。
また、生菌、死菌それぞれの蛍光発光に対して、最適な色彩特性値を設定することで、夾雑物を微生物と誤って計測しない精度を高め、より確実に微生物だけを検出することができる。
また、日常管理が簡便な衛生検査システムを構築することができる。
According to the microorganism counting apparatus of the present invention, it is possible to determine whether the fluorescence emission of the fluorescent staining reagent is derived from microorganisms or impurities other than microorganisms by the microorganism judging means.
In addition, an inspection system capable of quickly inspecting the presence or absence of microorganisms can be constructed, and the production and distribution systems for food, chemical products, water, etc. can be made more efficient.
Further, by accurately evaluating the fluorescence emission of the fluorescent staining reagent, it is possible to detect only microorganisms more reliably.
Moreover, even if it is not an expert of a microbe test | inspection, determination of the presence or absence of microbe can be easily performed from a light emission image.
Further, since the luminescent image can be easily confirmed, efficiency can be improved by improving the accuracy of the rapid microorganism testing system and shortening the testing time.
In addition, visually indicating the presence of microorganisms leads to an improvement in the worker's awareness of microbial hygiene management, and the quality of the hygiene management system can be improved.
In addition, by detecting only microorganisms, the reliability of the test results is improved, and products such as foods, chemical products, and water with little microbial contamination can be provided.
Further, by detecting only microorganisms, the fermentation process of microorganisms can be managed more reliably, and a product with stable quality can be provided.
Further, by detecting only microorganisms, it becomes possible to quickly manage the process of contamination treatment of waste water, soil, etc., and an efficient treatment technique can be realized.
Further, by using chromatic characteristics such as chromaticity, hue angle, saturation, and brightness for the measurement of microorganisms, fluorescence emission can be evaluated with high discrimination accuracy.
Further, by providing a threshold value for the value indicating the color characteristic, the objectivity of the determination can be enhanced.
Further, by providing a threshold value for the value indicating the color characteristic, it is possible to automatically determine whether or not the microorganism is a microorganism by the microorganism determination means.
In addition, by setting optimal thresholds for microbial populations with different conditions, types, and environmental conditions, live and dead bacteria can be detected for each population from a sample that has formed a complex microflora. can do.
In addition, it is possible to determine whether a living or dead microorganism by providing a living and dead judging means for performing a process for judging whether it is a living or dead bacteria and a microorganism judging means for judging that it is a microorganism and a contaminant other than a microorganism. It is possible to improve the efficiency of determining whether it is a contaminant.
In addition, by setting optimal color characteristic values for the fluorescence emission of live and dead bacteria, it is possible to increase the accuracy of measuring impurities as microorganisms and to detect only microorganisms more reliably. .
In addition, a hygiene inspection system that can be easily managed daily can be constructed.
本発明の請求項１記載の発明は、微生物を捕集する捕集手段を載置する載置手段と、生菌および死菌を染色する生死菌染色試薬と死菌を染色する死菌染色試薬を用いて染色された前記捕集手段上の微生物の蛍光画像を取得する蛍光画像取得手段と、前記蛍光画像取得手段により取得された蛍光画像から発光点を検出する発光点検出手段と、前記発光点検出手段により検出された発光点が生菌、死菌、夾雑物のいずれかであることを判断する蛍光評価手段とを備えた微生物計数装置において、前記発光点抽出手段によって抽出された赤色蛍光画像の輝度を赤色の輝度とし、緑色蛍光画像の輝度を緑色の輝度とし、これらの輝度と、入力手段から入力した青色の輝度に基づいて、発光点ごとに色度を算出する色度算出手段を備え、前記色度算出手段から算出された色度の値から生菌または死菌または夾雑物であるかを前記蛍光評価手段により判断することを特徴とする微生物計数装置であり、青色の輝度の計測を省略するようにしたので、装置構成や、計測画像を省略できるため、装置の小型化と迅速化ができるという作用を有する。
また、請求項２記載の発明は、微生物を捕集する捕集手段を載置する載置手段と、生菌および死菌を染色する生死菌染色試薬と死菌を染色する死菌染色試薬を用いて染色された前記捕集手段上の微生物の蛍光画像を取得する蛍光画像取得手段と、前記蛍光画像取得手段により取得された蛍光画像から発光点を検出する発光点検出手段と、前記発光点検出手段により検出された発光点が生菌、死菌、夾雑物のいずれかであることを判断する蛍光評価手段とを備えた微生物計数装置において、前記蛍光評価手段で発光点の面積および輝度値から生菌または死菌または夾雑物であるかを判断する面積輝度判断手段を備えることを特徴としたものであり、面積と輝度の関係から微生物の特徴と外れる夾雑物由来の発光点を判別することができる。これは波長などの色彩的特性など別の特徴パラメータによる判別手段とは独立して実行することができるため、組み合わせて使用することで蛍光染色試薬による発光点の蛍光発光が微生物由来であるか微生物以外の夾雑物由来であるかを判断するためのアルゴリズムを効率化し、演算速度を速めることができるだけでなく、発光点の中から生菌を検出する精度を高めることができるという作用を有する。
また、請求項３記載の発明は、請求項２記載の発明において、面積輝度判断手段において、生菌または死菌または夾雑物であるかを判定する値の範囲の上限および下限を定める面積輝度上限値および面積輝度下限値を設けることを特徴としたものであり、微生物として設定するパラメータの範囲を明確かつ効率的に選択し、上限値および下限値により範囲を限定することが容易となるため、操作を簡便にすることができ、また精度を高めることができるという作用を有する。
また、請求項４記載の発明は、請求項２または３に記載の発明において、面積輝度判断手段において、判断に用いる輝度の値が、発光点を構成する画素のうちの最大輝度値であることを特徴としたものであり、微生物の発光を示す輝度の値を精度よく得ることができ、また演算処理のメモリ量を減らすことができるため、精度を高めつつ、演算処理を高速化することができるという作用を有する。
また、請求項５記載の発明は、請求項２乃至４のいずれかに記載の発明において、面積輝度判断手段において、発光点の輝度の値によって生菌または死菌とする発光点の面積の値を設定することを特徴としたものであり、微生物は種類や増殖期などの状態によって発光輝度が変化し、また画像上の面積も変化するが、輝度が高いものは面積が大きく、輝度が低いものは面積が小さいことを利用し、輝度が低いものは、面積が小さいものを微生物とし、反対に輝度が高いものは、面積が大きいものを微生物とするように、輝度の値によって面積の値を設定することにより、微生物と判定する精度を高め、様々な状態に対しても堅牢性を高めることができるという作用を有する。
また、請求項６記載の発明は、請求項２乃至５のいずれかに記載の発明において、面積輝度判断手段において生菌または死菌と判断する面積の値を、発光点の輝度値の一次関数によって設定することを特徴としたものであり、輝度が高いものは面積が大きいものを微生物とし、輝度が低いものは面積が小さいものを微生物とするように設定するとき、その上限値および下限値を一次関数で設定することで、必要な入力値は傾きと切片のみとすることができるようになり、精度を高めつつ設定操作を簡便化することができるという作用を有する。
また、請求項７記載の発明は、請求項２乃至４のいずれかに記載の発明において、面積輝度判断手段において、発光点の面積を発光点の画素の最大輝度値で除した値を用いて判断することを特徴としたものであり、菌数が多くデータ量が多い場合には、演算処理で使用するメモリ量を低減し、演算処理時間を短縮するため、迅速に検査結果が得られるという作用を有する。
また、請求項８記載の発明は、請求項２乃至７のいずれかに記載の発明において、面積輝度判断手段により発光点の面積を輝度で除した値を求め、画像が焦点深度の範囲内であるかを判断する焦点判断手段を設けることを特徴としたものであり、微生物のような発光点の面積が非常に小さくなるものであっても、面積を輝度で除した値を用いることにより、画像の焦点位置が適切かどうかを容易に確認することができ、焦点位置による計数誤差を低減することができるため、計数結果の確度を高めることができるという作用を有する。
また、請求項９記載の発明は、請求項１乃至８のいずれかに記載の発明において、画像の演算処理に用いるパラメータを入力する入力手段を備えることを特徴とする微生物計数装置であり、演算処理に使用する膨大な数のパラメータの入力を簡便に行えるため、一度に大量のデータを処理する事が可能となり、迅速化できるという作用を有する。
また、請求項１０記載の発明は、請求項１乃至９のいずれかに記載の発明において、蛍光画像取得手段が励起光源と分光フィルタと拡大レンズと受像素子を備え、青色励起によって緑色蛍光を発する生死菌染色試薬と、緑色励起によって赤色蛍光を発する死菌染色試薬を用い、青色励起光による緑色蛍光画像と、青色励起光による赤色蛍光画像と、緑色励起光または黄色励起光による赤色蛍光画像を取得するようにしたことを特徴とする微生物計数装置であり、自家蛍光を低減して測定できるため、ＳＮが向上し、また２種類の染色試薬の輝度の取得と色度の取得に使用する励起光源と分光フィルタの組み合わせを最小限に抑える事ができるため、装置構成を簡略化し、小型化できるという作用を有する。
また、請求項１１記載の発明は、請求項項１乃至１０のいずれかに記載の発明において、発光点検出手段が、画像上の発光点の輝度と座標と面積を抽出する発光点抽出手段と、前記発光点抽出手段により抽出された画像上の発光点の座標を補正する座標補正手段と、補正された座標をもとに複数の画像から同一の発光点を照合し、照合された発光点の各画像の輝度値と面積のデータを結合する発光点照合手段を備えることを特徴とする微生物計数装置であり、画像ごとに発光点を検出して、座標を補正したのち発光点のデータを照合し結合することで、バックグラウンドなどのデータを含まない最小限のデータを扱う事ができるため、演算処理を行う演算手段のメモリ使用量を減らすことによる演算速度の高速化を図ることができ、微生物計数を迅速化できるという作用を有する。
また、請求項１２記載の発明は、請求項項１乃至１１のいずれかに記載の発明において、蛍光評価手段が、発光点ごとに色度を算出する色度算出手段と、発光点の青色励起光による緑色蛍光画像の輝度と緑色励起光または黄色励起光による赤色蛍光画像の輝度に基づいて発光点を生菌群または死菌群に分類する生死判断手段と、生菌群または死菌群に分類された発光点が微生物であるか夾雑物であることを色度で判断する微生物判断手段を備え、発光点が生菌、死菌、夾雑物のいずれかであることを判断するようにしたことを特徴とする微生物計数装置であり、生菌、死菌ごとに最適な条件でその計数を行うため、計数の精度を高めることができるという作用を有する。
また、請求項１３記載の発明は、請求項１２記載の発明において、生死判断手段において、青色励起光による緑色蛍光画像のチャンネルの輝度値を第一軸、緑色励起光または黄色励起光による赤色蛍光画像のチャンネルの輝度値を第二軸として２次元のドットプロットを表示するドットプロット表示手段と、前記ドットプロット表示手段により表示された各プロットを生菌群または死菌群に分類する分類手段を備え、前記分類手段により生菌群または死菌群に分類するようにしたことを特徴とする微生物計数装置であり、ドットプロット上の位置と集団の密度から、発光状態を客観的に捉えることができ、検体ごとに菌の種類や、状態が異なる場合にも、生菌および死菌を計数する精度を高める事ができるという作用を有する。
また、請求項１４記載の発明は、請求項１１乃至１３のいずれかに記載の発明において、発光点照合手段において、画像ごとの発光点データをＲＧＢのチャンネルに割り当てて１枚のカラー画像で出力する結果画像出力手段を設けたことを特徴とする微生物計数装置であり、取得した発光画像を色彩情報に基づいてカラー表示することにより、発光点の種類ごとに色分け処理をすることなく、画像中の生菌、死菌を確認する事ができ、よって計数の迅速性を高めることができるという作用を有する。
また、請求項１５記載の発明は、発光点を取得するためのマーカーを表面に固定し、焦点深度の範囲内であるかを判断するために用いることを特徴としたものであり、点検用チップを用いて画像を取得し、焦点判断手段によって装置の焦点位置が適切かどうかをあらかじめ簡便に判定することができ、測定精度の管理頻度を上げて品質管理の精度を高めることができるという作用を有する。
また、請求項１６記載の発明は、青色励起光による緑色蛍光画像と、青色励起光による赤色蛍光画像と、緑色励起光または黄色励起光による赤色蛍光画像の全てで発光点を取得できる波長をもったマーカーを表面に固定したことを特徴とする点検用チップであり、青色励起光による緑色蛍光画像と、青色励起光による赤色蛍光画像と、緑色励起光または黄色励起光による赤色蛍光画像の３種類の画像に含まれるＸＹ方向の機械的なズレを補正するための座標補正値を、マーカーの位置関係から容易に算出する事ができる。すなわち、装置に座標補正のための点検用チップを載置するだけで、画像の取得からマーカーの位置の算出、補正値の算出までの一連の動作を自動で処理させることも可能となり、画像補正の簡便性を向上させることができるという作用を有する。また、機械的な誤差を高度な加工技術で管理することなく、装置固有の特性値として補正することで精密画像測定が可能となるため、簡便で低コストに微生物計数ができるという作用を有する。
また、請求項１７記載の発明は、請求項８または１６記載の発明において、座標補正と焦点位置の判定の両方に使用できるマーカーを表面に固定したことを特徴としたものであり、座標補正と焦点位置の確認を別々に実施するのではなく、一度の点検操作で２つの検査項目を同時に完了することができるため、品質管理方法を簡便化することができるという作用を有する。
（実施の形態１）
まず、微生物を含む試料を測定するために、スライドグラスや、培養ディッシュ、マルチウェルプレート、またはろ過膜や、測定に適した形状を持つセルの観察面表面の表側、もしくは裏側の一方に微生物を固定する。固定は、ポリ−Ｌ−リジンのような試薬や、ゼラチンなどの粘着性、付着性をもった高分子材料を表面に薄く塗布し、微生物を含んだ試料を滴下し、表面に吸着させる。またメンブレンフィルタのようなろ過膜の場合、上方から液体試料を吸引してろ過し、メンブレンフィルタ表面に微生物を平面状に捕捉し、固定する。本発明において、最も好適に実施するものとしては、このようなろ過膜を使用することで、以下の染色や洗浄などの操作が簡便かつ微生物を流失することなく扱うことができるのでよい。また、メンブレンフィルタは、薄く、小さいため、そのままでは取り扱いが容易でない。そのため、専用の支持台、吸引口付きのホルダーを使用したり、もしくは膜に支持体を取り付けるか、一体化させたデバイスとすることで容易に膜を取り扱うことができる。
また本発明において微生物を含有するか含有する可能性のある検体は液状検体であるが、検査対象が飲料水などの液状サンプルの場合は、それ自体が液状検体となる。検査対象が野菜や肉をはじめとする食材などの固体サンプルの場合は、それをホモジナイズして液状検体としたり、その表面から綿棒などを用いて細胞および微生物を採取し、これを生理食塩水や燐酸緩衝液などに遊離させて液状検体としたりする。また、まな板などの調理器具などが検査対象となる場合、その表面から綿棒などを用いて微生物を採取し、これを生理食塩水などに遊離させて液状検体とする。こうした液状検体をメンブレンフィルタで吸引および加圧濾過、また場合によっては超音波を利用して加振ろ過することでメンブレンフィルタ上に細胞および微生物を捕捉することができる。
また、微生物の捕集は、メンブレンフィルタ表面以外にも、プレパラート表面や、可視光の透過性が高く、平面性の高いプレートの表面や、プレートとプレートの間隙、もしくは粘着性を持ったシート状、ディスク状のチップデバイス表面、平板培地表面、もしくはシャーレやディッシュ、マルチウェルプレートなどの表面、電極材料や吸着材料の表面などで行う。このとき、微生物の固定は、遠心力や、静電気力、誘電泳動力、疎水力などの物理吸着力以外にも、ゼラチンなどの接着成分によるものや、抗原・抗体反応、リガンド・レセプターの反応などの生物的な結合力を用いることができる。
また、微生物への蛍光染色試薬の浸透性を調整するために、必要に応じて、適当な濃度の２価金属錯体や、１価カチオン、カチオン性界面活性剤を混合した水溶液などを液体試料に混合させるか、もしくは捕集手段の上方から細胞および微生物に接触させた後、ろ過するか、または下方から細胞および微生物に接触させてもよい。これにより、細胞および微生物の蛍光染色試薬に対する細胞膜透過性を一定に保たせることができる。
また、蛍光染色試薬を混合する液体試料に粘性をもたせることで、微生物試料に試薬を接触させた後、微生物細胞の表面を覆うように試薬を付着させることができ、顕微画像上でのサイズが大きくなり、蛍光強度を増加させることができる。これにより、低倍率で広い範囲を高速に走査する場合にも、十分に強い輝度で、かつ大きな面積で微生物の発光像を取得することができる。
なお、２価金属錯体としては、エチレンジアミン四酢酸などを０．５から１００ｍＭ程度の濃度範囲にて使用する。
なお、１価カチオンとしては、カリウム塩、ナトリウム塩などを０．０５から５％の濃度範囲にて使用することができる。
なお、カチオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０やＴｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの細胞に対して侵襲性が低いものが使用でき、これらを０．０１から１％程度の濃度範囲にて使用する。
なお、粘性を持たせる成分として、Ｄ（−）−マンニトールやＤ（−）−ソルビトールやグリセリンなどの多価アルコール類を１０から７０％の濃度範囲で使用し、あるいはシリコンオイルなどを使用することができる。
次に染色手段として、乾燥防止成分を混合し、生死菌染色試薬または死菌染色試薬のいずれか、または両方を一定濃度含む染色試薬を固定表面に一定量滴下する。
蛍光色素は、核酸結合性の構造をもつが好ましく、生死菌染色試薬として使用するものは、紫外励起で青色蛍光を発するものであれば、例えば１，４−ジアミジノ−２−フェニルインドール、青色励起で緑色蛍光または黄緑色蛍光、黄色蛍光を発するものであれば、例えばアクリジンオレンジ、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジや、ＳＹＴＯ９、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ２１、ＳＹＴＯ２４、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｉ、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩＩ、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄなどのポリメチン架橋非対称シアニン色素系化合物が使用できる。また、用途によってはグラム陽性菌を染色し、グラム陰性菌は染色されないヨウ化ヘキシジウムなどの生死菌染色試薬を使用することも有効である。
また、死菌染色試薬としては、青色励起により緑色蛍光を発するものであれば、例えばアクリジン２量体、チアゾールオレンジ２量体、オキサゾールイエロー２量体などのモノメチン架橋非対称シアニン色素２量体や、ＳＹＴＯＸＧｒｅｅｎ、ＴＯ−ＰＲＯ−１などのモノメチン架橋非対称シアニン色素系化合物、緑色励起または黄色励起により赤色蛍光を発するものであれば、例えばヨウ化プロピジウム、臭化ヘキシジウム、臭化エチジウム、ＬＤＳ−７５１、ＳＹＴＯＸＯｒａｎｇｅなどのポリメチン架橋非対称シアニン色素などが使用できる。
これらの蛍光色素は、緑色蛍光や黄緑色蛍光、黄色蛍光、オレンジ色蛍光、赤色蛍光などをもつものであれば、青色の領域に蛍光強度を持たないため、色彩的特性を取得する場合にも青色の受光手段を省略して微生物の計数を行うことができる。
なお、これらの蛍光色素は、細胞および微生物を含む試料に対して、あらかじめ０．１から１００μＭとなるようを混合して細胞および微生物に作用させるか、もしくは、時間を置かずまたは適当な時間間隔を開けて所定の濃度で細胞および微生物に作用させることとする。
なお、メンブレンフィルタ上に捕捉した細胞および微生物の表面が、測定中に乾燥し、発光強度が変化することを防ぐための手段として、染色試薬には１０から６０％ｗ／ｖのグリセロールや、１０から９０％ｖ／ｖのＤ（−）−マンニトールやＤ（−）−ソルビトールなどの多価アルコール類のいずれかを１種類以上混合させておく。
なお、ポリビニルアルコールを１０から８０％程度の適当な濃度にて試料に混合するか、もしくは後から液状のポリビニルアルコールでフィルタ表面を覆い、乾燥固化させることで、蛍光発光を比較的安定に保存することができる。
また、蛍光染色試薬に、染色ろ過操作を阻害しない一定の粘性を与えることで、発光物の表面に試薬を付着させる事ができる。発光物の表面に試薬を付着させることによって、レンズ効果によって発光点を増強する事ができ、低倍率の画像であっても、検出するのに十分な輝度と面積を得る事ができる。
なお、粘性を与える物としては、乾燥防止剤として使用するグリセロールや、Ｄ（−）−マンニトールやＤ（−）−ソルビトールなどの多価アルコール類が適している。
捕集手段として適しているメンブレンフィルタとしては、例えば、孔径が０．２μｍ〜１μｍのポリカーボネート製など公知のものを用いることができる。メンブレンフィルタは、そのままではろ過作業などの取り扱いが困難なため、台を設けるか、メンブレンフィルタに直接枠を取り付けたものが適している。
このような捕集手段を装置に固定するために、装置には載置手段を設ける。これは、捕集手段の向きを定め、捕集手段が測定中に振動によって外れないようにするためのものである。また、捕集手段は、光軸方向に対して垂直に固定するようにする。また、メンブレンフィルタ表面の平面性を高めるために、メンブレンフィルタの裏側より、平面性の高いステージを押し当てることで、常に一定の平面性が得られるようにする。
このような捕集手段表面の画像を取得するための蛍光画像取得手段には、蛍光色素に対して特定の波長を照射するための励起光源、分光フィルタを使用する。分光フィルタは、例えば、励起光を分光する励起フィルタ、励起光の成分を除去する為のハイパスフィルタ、試料から発せられる蛍光から特定の波長成分を取り出すための受光フィルタなどで構成される。蛍光画像の取得は、例えば、蛍光色素に対して特定の波長を照射するための励起光源、励起光を分光する励起フィルタ、励起光を直径３ｍｍ程度に集光する為の集光レンズ、励起光の成分を除去する為のハイパスフィルタ、試料から発せられる蛍光から特定の波長成分を取り出すための受光フィルタ、それを拡大する為のレンズユニット（拡大レンズ）、蛍光像を画像の電気信号に変換するためのＣＣＤやＣＭＯＳなどの受像素子により行う。
蛍光染色試薬として使用する蛍光色素の主な発光波長であるが、例えば、青色励起の場合には、波長が４７０ｎｍから５１０ｎｍ付近の波長成分を含む励起光を照射した場合、波長が５１０ｎｍから５４０ｎｍ付近の蛍光を発する。緑色励起の場合には、波長が５１０ｎｍから５５０ｎｍ付近の波長成分を含む励起光を照射した場合、波長が５６０ｎｍから６２０ｎｍ付近の蛍光を発する。黄色励起の場合には、波長が５４０ｎｍから５８０ｎｍ付近の波長成分を含む励起光を照射した場合、波長が５９０ｎｍから６３０ｎｍ付近の蛍光を発する。
そのため、検出手段である励起光源として、発光ダイオードを使用する場合、青色のものでは、好ましくは４８０ｎｍ付近の波長を発することができるもの、緑色のものでは、好ましくは５３０ｎｍ付近の波長を発することができるもの、黄色のものでは、好ましくは５６０ｎｍ付近の波長を発することができるものを使用する。
なお、発光ダイオードを使用する場合、励起光の成分が広帯域に渡る場合が多く、蛍光画像のバックグラウンドの増加の要因となりうるため、適切な分光フィルタを使用して、特定の波長成分を切り出して使用する。
また、励起光源としてレーザーを用いる場合には、青色のものでは、好ましくは４７５ｎｍ付近の波長を発することができるもの、緑色のものでは、好ましくは５３５ｎｍ付近の波長を発することができるものを使用する。
また、励起光源としてハロゲンランプや水銀ランプを使用する場合には、染色試薬の励起波長に合わせて最適な分光フィルタを使用するのがよい。また、０．１から１０ｎｍの波長分解能を有する反射型や透過型の回折格子により、最適な角度を与え、任意の波長を含む励起光を取り出すことができる。
集光レンズは、蛍光染色された細胞および微生物が展開されているメンブレンフィルタに対し、照射範囲が、例えば直径が３ｍｍ程度の一定面積となるよう励起光を照射することができるものがよい。さらに光を散乱させるための拡散板などを一次側に組み合わせることでより均一な励起光を照射することもできる。
サンプルに照射された励起光により発生した蛍光は、ハイパスフィルタを通過することで、色彩的特性は損なわれず、効果的に励起光由来の光成分がカットされる。
当該蛍光はレンズユニットを通し、受像素子としての赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）、青色（Ｂ）の３原色を取得できるＲＧＢ３種類の蛍光フィルタを含む３ＣＣＤなどの電荷結合素子ユニットを用いて露光時間０．１秒から１０秒程度の露光時間でＲＧＢ３色からなる画像撮影することにより取得される。なお、受像素子として単板カラーＣＣＤを用いてもよい。
取得する色の輝度情報は、蛍光染色試薬である蛍光色素の蛍光波長範囲であれば、使用可能である。例えばシアニン色素であるＳＹＢＲＧｒｅｅｎの場合、極大蛍光波長は５２１ｎｍであるが、蛍光スペクトルは６２０ｎｍ付近まで広がっており、生死菌染色試薬として使用した場合、５３０ｎｍ付近の緑色（Ｇ）を画像（ａ）、６１０ｎｍ付近の赤色（Ｒ）を画像（ｂ）として取得することができ、（ａ）、（ｂ）を使用して微生物と夾雑物との判別が行える。
また、単板モノクロＣＣＤやＣＭＯＳを使用した場合、適切な受光フィルタを切り替えて使用することで、必要な波長の輝度情報を含む画像を取得することができる。このとき、別の利点として、同一のＣＣＤを使用することで、異なるＣＣＤによる感度特性の差の影響は全く受けずに測定を行うことが可能となり、感度補正を行う工程を省略することができる。
これらの操作により取得された複数の蛍光画像は、演算手段であるマイコンや外部端末上のプログラムによって処理される。
演算手段には、画像からドット欠けなどの輝点を除去するための輝点除去手段を設ける。また、画像から発光点を抽出するための発光点抽出手段、抽出した発光点の座標を補正する座標補正手段、複数の画像から同一の発光点を照合し、照合されたデータを結合（統合）する発光点照合手段からなる発光点検出手段を設ける。さらに、結合されたデータを出力する出力手段があり、色度を算出する色度算出手段と、染色試薬の輝度より微生物の生死を判別する生死判断手段と、そして色彩的特性を表す変数によって発光点が微生物もしくは夾雑物であることを判別する微生物判断手段からなる蛍光評価手段を設ける。また、測定した画像の有効面積を算出する有効エリア算出手段を設け、そしてそれらの演算処理に使用する変数を入力する入力手段を設ける。
これらの演算手段に備えられた手段は、プログラムのグラフィックユーザーインターフェース上に、ボタンやチェックボックスで選択したり、またプルダウンメニューと呼ばれる多項目の表示、選択手段によって容易に選択し、使用することができる。
まず、輝点除去手段であるが、これはＣＣＤなどの受像素子に見られる画素ピクセルの感度ムラや、感度消失した部分によるドット欠けと呼ばれる現象を有する輝点を除去するための手段である。ドット欠けの輝点が画像上に現れると、微生物の発光点と間違える恐れがあるか、または微生物の発光点を取得できない原因となり、誤差の要因となりうる。そのためこのような輝点は除去する必要があるが、輝点除去用の画像として、光源を照射しない暗視野画像を、露光時間をサンプル測定と同程度かもしくは長めに設定して取得し、輝点のみが写っている画像を得る。そして発光点を写した各画像から輝点画像を減算したり、周辺画素と比較して埋めてしまうことにより、輝点のみを削除することが可能となる。そのようにして輝点を除去した画像を以下において使用する。
発光点抽出手段で、画像中に含まれる発光点のうち、設定された面積、輝度の範囲に該当するものを抽出する。例えば、面積を２から１５、輝度を１５から２５５とすると、面積が１６以上であるような大きい夾雑物はあらかじめカウントから除外することができ、また輝度が１４以下のバックグラウンドノイズ（暗ノイズ）を除去することができる。この閾値は、レンズの倍率や、励起光源の強度、露光時間などにより最適な値が変化するため、微生物を最適に抽出できる値は、あらかじめ検証して確認することが必要である。
微生物と判定する精度を高めるために、面積輝度判断手段を用いる。微生物は画像上では非常に面積が小さい発光点として検出されるが、種類や培養状態によっては発光輝度が高く、面積が大きいものがある。微生物細胞の大きさは種類や栄養状態などによって若干異なるが、細胞が大きいものは発光輝度が高く、細胞が小さい種類の微生物は発光輝度が低く得られる。また、レンズなどの光学系の倍率にもよるが、微生物１個の大きさが使用する受像素子の１画素相当の面積よりも小さい場合、画像上の微生物由来の発光点の大きさは、実際の微生物の大きさではなく、発光強度が強いために受像素子上で隣接する画素が輝度を持った結果として面積が大きくなる。そのため、微生物由来の発光点の画像上の面積と輝度は一定の相関を持つようになる。一方、夾雑物などの発光物に比べると、微生物は試薬が細胞内に濃縮されるため、面積の割りには発光輝度が高い。逆に、夾雑物などは表面に付着して発光するが、この場合、面積に対する発光輝度が割合低いものが多い。この輝度と面積の関係を調べると、微生物として特徴的な傾きをもった一次相関の関係にあることがわかる。面積輝度判断手段は、これを利用し、輝度が低いものは面積が小さいもの、輝度が高いものは面積が大きいものを発光点の中から微生物の生菌または死菌として判定するものである。発光点の持つ面積と輝度値の情報と、輝度値ごとの面積の上限値および下限値を比較し、範囲内であれば微生物と判定する。この上限値および下限値は、輝度の一次関数とし、設定方法としては傾きと切片を指定することで使用する。
（数式１）
｛（下限値の切片）＋（下限値の傾き）×輝度値｝≦面積≦｛（上限値の切片）＋（上限値の傾き）×輝度値｝
また、面積輝度判断手段では、面積を輝度値で除した値を使用しても同様に精度よく夾雑物の中から微生物を判定することができる。さらに、この面積を輝度値で除した値は、焦点位置が合うほど小さくなる。焦点判断手段では、微生物固有の数値をあらかじめ調べて比較することで、取得した画像の焦点位置が合っていたのかを計数後に数値で判断することができる。
また、焦点判断手段により、微生物の計数前にあらかじめ発光の小さい蛍光性の粒子の画像から焦点位置が合っていて装置が正常に計数できる状態であるかを判定することができる。
これらの処理は、汎用的な画像処理ソフトウェアであるＩｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ（商標）などを利用して実行できる。また、同様の処理を組み込んだプログラムを使用することもできる。
次に発光点照合手段によって、抽出された発光点の数値データと、異なる輝度情報を含む同位置の発光点の数値データとが、座標をもとに比較、照合され、結合される。
このとき、異なる輝度情報を含む画像とは、異なる受光フィルタで取得された画像のことを指すが、画像間では受光フィルタの特性や、機械的誤差に起因する座標ズレがわずかに生じる為、そのまま画像のピクセル座標を照合した場合、一致しないことがある。そこで、一方の座標に画像ズレを補正する座標補正値を補って照合させる座標補正手段を設けるのだが、特に機械的誤差については温湿度などの使用環境の影響により、使用するごとに座標ズレの値が変化してしまう場合がある。そのため、座標補正値を測定毎に更新して使用することで、測定ごとに最適な値を使用することが有効である。
座標を補正するための補正値は、あらかじめ取得した位置補正用画像から補正値を読み取ることにより取得する。位置補正用画像は、取得する全ての波長域において写りこむ蛍光体を使用して撮像する。取得する波長が緑色と赤色であれば、長波長側の赤色の蛍光粒子が使用でき、同程度の発光強度が得られるように励起光源の強度と露光時間を調節して撮影を行う。また、補正値を自動で算出させるような処理の場合には、蛍光体の個数が多くなると演算する数も多くなり、時間がかかってしまうため、蛍光体の個数が画面あたり５から５０個の範囲内であれば、１から数分程度と比較的短時間で補正値を求めることができる。蛍光体の個数がこのような個数になるように、蛍光粒子の懸濁液を一定量メンブレンフィルタにろ過することにより、位置補正用画像を取得するための座標補正用の点検用チップを作製する。また、これを校正用チップとして長期的に繰返し使用したい場合には、蛍光粒子を高分子などで固定するか、金属蒸着することによって金属薄膜で覆ってしまうことにより固定しておくこと。これにより蛍光粒子は繰返し使用しても外れずに位置が一定になる。また、校正用チップとしては、その他にも、蛍光性の樹脂をマスキングして微小パターンやスポットを形成させるなどしたものも有効である。
このようにして作製された校正用チップは、装置に設置されて実際の計測と同じようにして画像を撮像する。これにより、モーターの位置制御誤差やバックラッシュなどの機械的誤差、フィルタやレンズの製造誤差、装置を組み上げる際の製造誤差に由来する光軸のズレなどで発生する画像の座標ズレを再現した画像を取得し、その補正値を求めて実際の計測で使用することで、位置精度が高められる。
また、この座標補正用の点検用チップに使用する蛍光粒子を微生物と近い大きさのものとすることで、焦点位置が合っているかどうかを判断するための点検用チップとしても使用できる。焦点位置を合わせるための画像で検出できる発光特性を持つものが使用できるが、これは座標補正用のものを使用することがよい。プログラムの構成を、座標補正値の算出と続けて焦点位置の判断を実行できるようにすることで、座標補正操作と同じタイミングで装置の焦点位置の検査も行うことができるようになり、検査作業を一元化することができる。
画像中に見られる微生物の発光点を示すオブジェクトの面積は、拡大レンズ系の合計が２００から３００倍程度のときは、受像素子上で１から２０ピクセル程度になる。これは微生物の細胞１個の直径が０．６から５μｍ程度であるときに撮像された値である。一方、微生物細胞が２から複数個繋がっていた場合、発光点のオブジェクトの面積は大きくなり、２０ピクセルを越えるものも見られる。このような大きな発光点のオブジェクトは、共焦点光学系などの特殊な光学系を使用しない限りは、殆どの場合一つのオブジェクトとして検出され、二つのオブジェクトを分離して検出することが難しい。このとき問題となるのは、二つのオブジェクトが異なる発光特性をもつ場合に、各画像を比較して発光点を照合して輝度を結合したときに、同一のオブジェクトとして検出される、隣り合った微生物の発光輝度を誤って結合してしまうと、本来の微生物の発光特性とは全く異なる不正確なデータが形成されてしまうという恐れがあることである。そのような事例を防止するためには、発光点の座標をオブジェクトの最大輝度値を示す座標とし、画像間の発光点を照合するときは、その座標から非常に近傍に限定された誤差範囲エリア内にあるもう一方の画像の座標をもつ発光点とのみ結合されるようにすることが必要である。
同一の発光点のオブジェクトとして抽出されているものであっても、照合した場合に一致しないことがありうる。そのとき結合する輝度データが存在しなくなってしまうことを防止するために、照合するもう一方の画像に一致する発光点が検出されなかった場合に、もう一方の画像中の同じ座標のピクセルの輝度値を抽出し、この値を結合させることが有効である。これにより、発光点が一方の画像でしか抽出されなかった場合でも、輝度情報を欠如させることなく、精度よく照合データを作成することができることになる。
また、最終菌数の検出精度にも関連するが、生菌と死菌が繋がって存在している場合、上記のような工程を持たせなければ、オブジェクトを死菌として検出してしまう可能性があるが、上記のような工程より生菌と死菌が繋がったものとして検出することができるようになり、培養法などとの相関性が向上することに繋がる。
照合されて結合されたデータは、出力手段によりデータファイルとして出力される。この時点でデータファイルとして保存することで、この後の工程を一度にまとめて処理することも可能となるため、演算プログラムの構成が効率化される。この工程は、各撮像位置ごとに実施され、全ての撮像位置を走査したのちに、各撮像位置の出力ファイルを読み込んで、全領域の照合データの作成に使用される。
発光点の輝度情報をもつデータファイルに対して、生死判断手段によって発光点が生菌群であるか、もしくは死菌群であるかいずれかに分類される。このとき、発光点が生菌群、もしくは死菌群であることを示すパラメータをデータに付加することで、以降の微生物か夾雑物かを判断する処理が簡略化され、演算処理プログラムを効率化することができる。尚、パラメータとは生菌群であれば１、死菌群であれば２であるというように、発光点のデータに数値を付加することにより行うこととする。
生菌群であるか死菌群であるかを判断する為には、以下のようにグラフを使用することが望ましい。まず、発光点のデータのうち、生死菌染色試薬の輝度値と、死菌染色試薬の輝度値から、ドットプロットを作成するドットプロット表示手段を設ける。これは、横軸に生死菌染色試薬の輝度値、縦軸に死菌染色試薬の輝度値をとり、検出された発光点毎にプロットしていくもので、２次元ヒストグラムとも呼ばれる手法であり、２種類の試薬によってどのような２つの発光強度のバランスをもった微生物の集団がどのくらい存在するのかを可視化するのに有効な手法である。尚、ドットプロットの表示は、画像処理を行うプログラムのグラフィックユーザーインターフェース上に行うことが良く、発光点のデータファイルを読み出した場合に表示させるようにするとよい。輝度値として使用する値は、オブジェクトの最大輝度値や、平均輝度値、合計輝度値を使用することができ、プロットの表示軸は、表示軸選択手段によって常数、対数を選択して適切なものを使用できる。蛍光強度は強いものと弱いものとで１０倍以上、場合によれば１００倍以上の輝度の差があることが多く、全体を表示するためには対数軸で表示するほうがよい。しかしながら、プロットは近接している場合が多く、ある一部分を拡大して見たい場合や、近接したプロットを境界線で分ける場合には、常数軸で表示しているほうがよい場合がある。そこで、表示軸選択手段を設けて表示軸を対数と常数で切り替えることができるようにすることで、いずれの場合にも必要に応じて使用することができる。
次に、表示されたドットプロット上のプロットを集団ごとに分類する分類手段を設ける。分類手段は、プロットを分類するための境界線を作成する境界線作成手段と、境界線によって分けられた生菌領域、死菌領域から、発光点がどちらの領域であるかを判断し、生菌群か死菌群であるかを判断する領域判断手段を備える。境界線は、１本ないし複数本の直線や曲線、多角線などをカーソルなどで自由に作成することができるものとし、プロットを見ながら、プロットの集団を分類しやすいように作製する。なお、境界線の作製工程は、簡単に行えるようにグリッドなどを使用したり、輪郭やプロットにトラップさせるような機能を持たせると容易であり、かつ正確に行うことができる。
また、多角線を境界線とする場合には、線が交差しないように、一方の方向のみに作製可能とすると確実である。
作製した境界線は、取り消すことや、境界線保存手段によって保存することができるようにし、境界線選択手段によって繰り返し使用することができるようにする。また、選択した境界線の頂点を一部変更したり、頂点を追加するなど、編集する事ができる境界線編集手段を設けることで、検体ごとに更に適切な分類結果を得る事ができるようになる。
次に、作製した境界線をもとに、境界線に相当する閾値を算出する。算出された閾値に対して、グラフの上、左側にあるものが死菌群、反対が生菌群として分類し、パラメータを与えて処理する。
発光点が生菌群か死菌群のいずれかに判断された後、微生物判断手段によって夾雑物由来の発光点を分離除外する場合は、以下の処理を行う。微生物と夾雑物の判別は、入力手段によって指定された色度の閾値と、算出された発光点の色度を比較する事によってなされる。
色度は、ＲＧＢの輝度値より色度算出手段によって演算されて得られる。色彩的特長を示す表色系としては、Ｌａｂ表色系や、ＬＣｈ表色系、ＸＹＺ表色系などの表色系が使用される。ここではＸＹＺ表色系に基づいた色度を用いる。取得される輝度はＲＧＢの色空間のものであるため、このＲＧＢそれぞれの輝度値から、ＸＹＺ表色系への変換が数式２によって行われる。
（数式２）
Ｘ＝０．３９３３×Ｒ／２５５＋０．３６５１×Ｇ／２５５＋０．１９０３×Ｂ／２５５
Ｙ＝０．２１２３×Ｒ／２５５＋０．７０１０×Ｇ／２５５＋０．０８５８×Ｂ／２５５
Ｚ＝０．０１８２×Ｒ／２５５＋０．１１１７×Ｇ／２５５＋０．９５７０×Ｂ／２５５
ｘ＝Ｘ／（Ｘ＋Ｙ＋Ｚ）
ｙ＝Ｙ／（Ｘ＋Ｙ＋Ｚ）
式中のＲ、Ｇ、Ｂはそれぞれ赤色蛍光輝度値、緑色蛍光輝度値、青色蛍光輝度値であることを示す。これにより細胞および微生物または夾雑物かの判断に必要な値として、最終的にｘ、ｙの値が算出される。
発光点毎に算出された色度の値であるが、発光点にはそれぞれ生菌群であるか死菌群であるかを判別するためのパラメータが与えられており、生菌群であった場合には、生菌群に対して設定された色度閾値と比較し、死菌群であった場合には、死菌群に対して設定された色度閾値と比較して、それぞれの場合において夾雑物に由来する発光点が除外される。夾雑物が除外され、生菌、死菌として判断されたものは、積算され、カウントされる。
ポジションごとのカウント値は、その都度表示させることが良く、これにより計測途中であっても最終結果の目安を得ることができるようになり、カウント値が多い場合などであっても、直ちに衛生管理工程の改善や、迅速な出荷停止判断に移れるため、作業の効率化につなげられる。
また、取得した画像、演算して合成したカラー画像もカウント結果の表示に合わせて表示させることが良く、これにより、カウント値が正しく求められる画像であるかを使用者が判断することができる。
カラー画像の発光点は、取得した白黒画像の強度をもとに色彩情報に近い色で表示されることで、画像確認を容易に行えるようになる。また、カラー画像に加え、それぞれの波長を示す白黒画像も選択して表示できるよう、プログラム上のボタンなどを配しておくことがよい。
次に、このカウント値をもとに、実際に使用した検体に含まれる単位量あたり（例えば、１ｍＬや１ｇなど）の菌数の総数を算出する。そのためには、測定した画像のうち、画像処理して使用した有効エリア面積を有効エリア算出手段にて求める。測定に使用した有効エリアは、画像の補正値を変数とした関数で求められる。尚、有効エリア面積は、補正値が決まっていれば先に求める事もできる。
画像の縦の長さをＰ、横の長さをＱ、縦方向の座標補正値をα、横方向の座標補正値をβとすると、１画面あたりの有効エリア画素数Ｍは数式３のように表される。
（数式３）
Ｍ ＝（Ｐ−α）×（Ｑ−β）
また、有効エリア面積は、レンズ系の倍率などから、画素あたりの面積を求め、画素あたりの面積をｓとするとし、測定視野数をＮとして、１画面あたりの有効エリア面積Ｓと全有効面積は数式４のように表される。
（数式４）
Ｓ ＝ Ｍ×ｓ
全有効面積：Ｓ×Ｎ
得られた面積に対して、微生物の捕集手段の固定部分の表面積（例えば、メンブレンフィルタの全面積）の値を割り返す。これにより得られた数値を、カウント菌数に掛け合わせることで、最終的な、微生物の生菌または死菌の総数を算出し、菌数を求めることができる。
以上のようにして発光物の検出を行った後、迅速検査の場合には、検出された発光物が微生物であるかどうか顕微鏡などを用いて判断し、結果の妥当性を評価することが必要である。そのため、測定に使用したメンブレンフィルタなどを蛍光顕微鏡で観察する。
顕微鏡を使用して、メンブレンフィルタ表面から発光画像の発光物と同じものを観察するためには、まず顕微鏡で観察する際のメンブレンフィルタの向きと、微生物計数装置で測定した画像の向きとが同じ方向になるように揃えることが重要である。向きが異なると、顕微鏡像に見られる発光物の集団と、取得した発光画像との配置が異なって見えてしまうため、同一の視野や同一の発光物を特定するのが困難になる。そこで、メンブレンフィルタに樹脂などの枠を設け、その枠に目印をつけ、同様に顕微鏡のステージにも目印をつけてそれらを合わせることで、顕微鏡の像と、微生物計数装置の像を揃えることができるようにするのがよい。
尚、この目印は３箇所以上、中心から非対称に設けると、一致する向きは一つしかなく必ず同じ位置に合わせられるようになり、僅かな載置角度の誤差も防止できる。
さらに、この目印を凸部とし、顕微鏡にステージにこれに対応する凹部を設け、凸部と凹部がかみ合うようにはめるようにすれば、精密な調整が、簡便に、効率的に実施できる。
また、メンブレンフィルタ表面のうち計測領域の全領域を、１００倍程度の高倍率の対物レンズで観察する場合、メンブレンフィルタの枠がメンブレンフィルタ表面よりも高いと、高倍率の対物レンズは焦点深度が浅いため、レンズと枠が接触してしまい、枠付近のメンブレンフィルタ表面は、焦点があわないために観察することが困難になる。また、メンブレンフィルタの面積が直径１ｃｍ程度と小さければ、ほぼ中心部分でしか焦点が合わなくなってしまい、発光物の判断が困難である。そこで、メンブレンフィルタの面積をやや大きくし、メンブレンフィルタの枠とレンズが接触することなく観察が行えるように、枠から一定の距離を隔てた範囲において検体をろ過できるように、また枠から一定の距離の範囲内では検体をろ過できないように、メンブレンフィルタの上方もしくは下方から中心部に穴を設けたフィルムを重ね合わせるようにすれば、メンブレンフィルタの中心部分において検体をろ過できるようになり、よって、全ての発光物が高倍率の対物レンズで観察でき、判断することができるようになる。
また、同様の目的で、メンブレンフィルタを固定する枠と台座の寸法をあらかじめ調整し、メンブレンフィルタ下方の台座の孔径を、メンブレンフィルタ上方の枠のフィルタ押さえ部分よりも小さくすることで、ろ過部分をメンブレンフィルタの中心部分に限定させることができるようになる。
顕微鏡で観察される複数の発光物から、微生物として判断した発光点を容易に確認できるように、微生物として検出している発光点の色を表示する表示手段を微生物計数装置に設ける。表示手段は、プログラム上で小さなウィンドウ枠内に背景を暗黒色で、その中に微生物細胞とするオブジェクトを微生物の色彩特性で表示する。この表示色は、微生物として判断する時の色彩的特性の閾値の値をリンクさせておくことで、パラメータを変更した場合でも、表示色を自動で変更することができる。
以上の手法を用いて、試料中や細胞培養液に含まれていた微生物の生死を判別し夾雑物と分離して、計数することができるのである。
図１は、本発明を好適に実施するための微生物計数装置の一態様を示す概念図である。この微生物計数装置１は、蛍光画像取得手段として励起光源２、励起フィルタ３、集光レンズ４、ハイパスフィルタ５、受光フィルタ６、レンズユニット７、受像素子８を含む。励起光源２から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起フィルタ３で分光する。分光された励起光は集光レンズ４を経て検査台９にセットされた微生物を捕集する捕集手段としてのメンブレンフィルタ１０（別途の操作によりメンブレンフィルタ上に核酸結合性の蛍光色素で染色された微生物を捕捉してあるもの）上に集光される。励起光源２から発せられた励起光は、集光レンズ４によって集光されるが、その際、集光レンズ４によって励起光は直径３ｍｍ程度の微小な一定面積に集光されるようにするのがよい。励起光により発する蛍光は、励起光成分を除去するためにハイパスフィルタ５を経て、さらに蛍光から特定の波長成分を取り出すための受光フィルタ６を経て、レンズユニット７により拡大され、受像素子８であるＣＣＤユニット１１に到達し、電気信号化される。これにより得られた信号は画像化され、演算手段１２によって画像処理される。
図２は、演算手段１２における演算工程フローを示した図である。輝点除去手段１３、発光点抽出手段１４、座標補正手段１５、発光点照合手段１６、出力手段１７、蛍光評価手段１８、そして有効エリア算出手段１９から構成されている。
まず座標補正用画像を読み込んで座標補正値を算出する。次に閾値などの変数を入力し、輝点除去手段１３によって輝点を除去した画像を作成する。続いて、発光点抽出手段１４により画像中の発光点を特定し、数値データを抽出する。画像によっては座標補正手段１５により座標を補正する。異なる輝度情報を含む発光点のデータは、発光点照合手段１６によって照合し、結合される。これにより集合された数値データは、出力手段１７によってデータファイルに出力され、保存される。データファイルに対して、色度算出手段２０によって、発光点ごとに色度を算出する。そして生死判断手段２１によって発光点が生菌群であるか死菌群であるかを判別し、発光点毎に生菌群もしくは死菌群のフラグを立てる。微生物判断手段２２により、検出したフラグについて、生菌群と死菌群のそれぞれに対して設定した微生物であるか夾雑物であるかを判断するための閾値と照合して微生物であるか夾雑物であるかを判別する。さらに、判定精度を上げるため、発光点の面積と輝度値の値から微生物であるか夾雑物であるかを判定するための面積輝度判断手段２３により、面積が大きく輝度が低い夾雑物を微生物のカウントから除外して、最終的に菌数を算出し、出力する。これらの処理は画像処理をプログラミングされたマイコン等で実行でき、外部接続した端末などによって操作されるソフトウェアと通信して行うこともできる。
図３（ａ）は、微生物判断手段における判断の一例を示す表である。具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉを含む水検体をメンブレンフィルタにろ過し、生死菌染色試薬としての蛍光色素であるＳＹＴＯ９と、死菌染色試薬としての蛍光色素であるヨウ化プロピジウムを用いて染色したものを、単板モノクロＣＣＤと、青色励起光照射におけるＧ輝度画像とＲ輝度画像を取得したデータの一例を示す表である。このとき、Ｂ輝度画像は、励起光の波長と重なるために取得できないので、入力手段から数値を代入して使用している。この変数は、最適な値に調整することができる。
図３（ｂ）に示される動作は、ＲＧＢの輝度から、ＸＹＺ表色系の（ｘ、ｙ）の値への変換を示す。この工程はまず、ＲＧＢの輝度を測定する手段によって取得されたＲＧＢそれぞれの輝度値から、リニアＲＧＢへの変換、ガンマ補正がなされる。これにさらに視覚的特性を重み付けし、微生物または夾雑物かの判断に必要な値として、最終的にｘ、ｙの値が求められる。このとき、例えば光学フィルタによって青色（Ｂ）をカットし、緑色（Ｇ）および赤色（Ｒ）のみが取得されるような条件の場合には、青色の感度は得られないものとして、Ｂの輝度値については、あらかじめ実験によって最適化された固定値をかわりに使用することや、またはＲまたはＧの輝度値による関数を設定して使用することもできる。これにより得られた色度の値に対して閾値と比較することで、微生物であるか夾雑物であるかを判別する。なお、このときの閾値は実験により決定する。
図４は、色度の表示手段を示す。微生物の色度は、あらかじめプログラム上で閾値を設定しておいて判断に使用するが、このとき微生物と判断される色彩が表示される。プログラムのグラフィックユーザーインターフェースとなるメインウィンドウ２４に含まれるか、もしくは別ウィンドウにて、表示ウィンドウ２５、色彩表示オブジェクト２６、背景２７が配置される。図４では、これらがメインウィンドウ２４に含まれる場合を示す。色彩表示オブジェクト２６は、楕円形、円形などの閉曲線や矩形などであり、微生物と判断する色彩特性のパラメータとリンクして表示色が変更される。背景色は、顕微鏡画像と比較しやすいよう、暗黒色になっている。
図５は、点検用チップの上面図および断面図およびメンブレンフィルタ表面の拡大図を示す。点検用チップ２８は、例えば平面性の高いメンブレンフィルタ２９表面に蛍光粒子３２を固定したものが使用できる。点検用チップには、微生物などの試料の計数に使用するための捕集手段と同じ形状のものを使用するとよい。これにより、載置手段の形状が複雑化せず、共有させることができる。メンブレンフィルタ２９表面には、金属膜などで覆い、フィルタろ材の自家蛍光を低減化する処理を施しておくことで、低い背景になる画像を取得できてよい。このメンブレンフィルタ２９表面に、蛍光粒子３２を固定するのだが、この蛍光粒子３２は、取得する画像全てで発光がみられるものを使用する。波長としては、青色励起光で緑色蛍光および赤色蛍光を発し、さらに加えて緑色励起光で赤色蛍光を発するものがよく、例えば、広帯域の可視光に吸収域と蛍光を持つものがよい。これら全てを発するものであれば、取得する全ての画像に対応しており、それぞれの波長で取得された画像上にある同じ粒子の発光点の座標を重ね合わせることで座標補正値の算出を行い、座標補正手段を実行することができる。
The invention according to claim 1 of the present invention is a placing means for placing a collecting means for collecting microorganisms, a living and dead bacteria staining reagent for staining live bacteria and dead bacteria, and a dead bacteria staining reagent for staining dead bacteria. A fluorescence image acquisition means for acquiring a fluorescence image of a microorganism on the collection means stained using a fluorescent light; a light emission point detection means for detecting a light emission point from the fluorescence image acquired by the fluorescence image acquisition means; and the light emission A red fluorescent light extracted by the light emission point extracting means in a microorganism counting device comprising: a fluorescence evaluation means for judging that the light emission point detected by the point detection means is any one of viable bacteria, dead bacteria, and contaminants; Chromaticity calculation means for calculating the chromaticity for each light emitting point based on the brightness of the image and the brightness of the green fluorescent image as the brightness of green and the brightness of the blue light input from the input means. The chromaticity calculating hand It is a microbe counting apparatus characterized in that it is judged by the fluorescence evaluation means whether it is a living bacterium, a dead bacterium or a contaminant from the chromaticity value calculated from the above, and measurement of blue luminance is omitted. Therefore, since the apparatus configuration and the measurement image can be omitted, the apparatus can be reduced in size and speeded up.
The invention described in claim 2 is provided with a placing means for placing a collecting means for collecting microorganisms, a living and dead bacteria staining reagent for staining live bacteria and dead bacteria, and a dead bacteria staining reagent for staining dead bacteria. Fluorescence image acquisition means for acquiring a fluorescence image of microorganisms on the collection means stained using, a luminescence point detection means for detecting a luminescence point from the fluorescence image acquired by the fluorescence image acquisition means, and the luminescence inspection And a fluorescence evaluation means for judging that the luminescence point detected by the exit means is any one of viable bacteria, dead bacteria, and contaminants. It is characterized in that it is provided with area luminance judgment means for judging whether it is live bacteria, dead bacteria or impurities, and distinguishing emission points derived from foreign substances that deviate from the characteristics of microorganisms from the relationship between area and luminance. be able to. This can be performed independently from the discrimination means based on other characteristic parameters such as color characteristics such as wavelength. Therefore, when used in combination, the fluorescence emission at the emission point by the fluorescent staining reagent is derived from microorganisms. Not only can the algorithm for judging whether it is derived from other impurities be efficient, the calculation speed can be increased, but also the accuracy of detecting viable bacteria from the light emitting point can be increased.
The invention described in claim 3 is the area luminance upper limit for determining the upper limit and the lower limit of the value range in which the area luminance determining means determines whether the bacteria are viable, dead, or contaminants in the invention according to claim 2. Value and area luminance lower limit value is provided, and the range of parameters set as microorganisms is clearly and efficiently selected, and it becomes easy to limit the range by the upper limit value and the lower limit value, The operation can be simplified and the accuracy can be increased.
According to a fourth aspect of the present invention, in the invention according to the second or third aspect, the luminance value used for the determination in the area luminance determining means is a maximum luminance value among the pixels constituting the light emitting point. The brightness value indicating the luminescence of the microorganism can be obtained with high accuracy, and the memory amount of the arithmetic processing can be reduced, so that the arithmetic processing can be speeded up while improving the accuracy. Has the effect of being able to.
Further, the invention according to claim 5 is the invention according to any one of claims 2 to 4, wherein the area luminance determining means determines the area value of the light emitting point to be viable or dead by the luminance value of the light emitting point. The emission brightness changes depending on the type and growth phase of microorganisms, and the area on the image also changes, but those with high brightness have a large area and low brightness. The value of the area depends on the value of the brightness so that the thing with a small area uses the small area, the thing with the small area becomes the microorganism, and the thing with the high brightness, on the contrary, the thing with the large area becomes the microorganism. By setting this, it has the effect | action that the precision which determines with microorganisms can be improved and robustness can be improved also with respect to various states.
The invention according to claim 6 is the linear function according to any one of claims 2 to 5, wherein the area value determined by the area luminance determination means is a linear function of the luminance value of the light emitting point. When setting so that a thing with a high brightness is a microorganism with a large area, and a thing with a low area is a microorganism with a small area, the upper limit value and the lower limit value are set. Is set as a linear function, the necessary input values can be set only to the slope and the intercept, and the setting operation can be simplified while improving the accuracy.
According to a seventh aspect of the invention, in the invention according to any one of the second to fourth aspects, the area luminance determining means uses a value obtained by dividing the area of the light emitting point by the maximum luminance value of the pixel of the light emitting point. It is characterized by judgment, and when the number of bacteria is large and the amount of data is large, the amount of memory used in the arithmetic processing is reduced and the arithmetic processing time is shortened, so that the test result can be obtained quickly. Has an effect.
According to an eighth aspect of the present invention, in the invention according to any one of the second to seventh aspects, a value obtained by dividing the area of the light emitting point by the luminance is obtained by the area luminance determining means, and the image is within the range of the depth of focus. It is characterized by providing a focus judgment means for judging whether or not, even if the area of the luminescent point such as a microorganism is very small, by using the value obtained by dividing the area by the brightness, Whether the focal position of the image is appropriate can be easily confirmed, and counting errors due to the focal position can be reduced, so that the accuracy of the counting result can be increased.
The invention described in claim 9 is the microorganism counting apparatus according to any one of claims 1 to 8, further comprising an input means for inputting a parameter used for image calculation processing. Since an enormous number of parameters used for processing can be easily input, a large amount of data can be processed at a time, thereby speeding up the operation.
According to a tenth aspect of the present invention, in the invention according to any one of the first to ninth aspects, the fluorescence image acquisition means includes an excitation light source, a spectral filter, a magnifying lens, and an image receiving element, and emits green fluorescence by blue excitation. Using a live and dead bacteria staining reagent and a dead bacteria staining reagent that emits red fluorescence by green excitation, green fluorescence image by blue excitation light, red fluorescence image by blue excitation light, and red fluorescence image by green excitation light or yellow excitation light The microbe counting apparatus is characterized in that the SN can be improved because autofluorescence can be reduced and used for acquiring the luminance and chromaticity of two types of staining reagents. Since the combination of the excitation light source and the spectral filter can be minimized, the device configuration can be simplified and the size can be reduced.
The invention according to claim 11 is the light emitting point extracting means according to any one of claims 1 to 10, wherein the light emitting point detecting means extracts the luminance, coordinates and area of the light emitting point on the image. A coordinate correction unit that corrects the coordinates of the light emission points on the image extracted by the light emission point extraction unit, and collates the same light emission points from a plurality of images based on the corrected coordinates, A microbe counting device comprising a light emission point collating means for combining the brightness value and area data of each image, detecting the light emission point for each image, correcting the coordinates, and then obtaining the light emission point data. By collating and combining, it is possible to handle the minimum amount of data that does not include background data, etc., so it is possible to increase the calculation speed by reducing the memory usage of the calculation means that performs calculation processing. , Microbiology An effect that can be faster.
The invention according to claim 12 is the invention according to any one of claims 1 to 11, wherein the fluorescence evaluation means includes chromaticity calculation means for calculating chromaticity for each light emitting point, and blue excitation of the light emitting point. A life / death judgment means for classifying the light emission point into a live or dead group based on the brightness of the green fluorescence image by light and the brightness of the red fluorescence image by green excitation light or yellow excitation light; It is equipped with a microorganism judging means for judging whether the classified luminescent spot is a microorganism or a contaminant by chromaticity, and judges whether the luminescent spot is a live microorganism, a dead bacteria, or a contaminant. This is a microorganism counting device characterized in that the counting is performed under the optimum conditions for each of live and dead bacteria, so that the accuracy of counting can be increased.
According to a thirteenth aspect of the present invention, in the twelfth aspect of the present invention, the life / death determining means sets the luminance value of the green fluorescent image channel by blue excitation light to the first axis, red fluorescence by green excitation light or yellow excitation light. A dot plot display means for displaying a two-dimensional dot plot with the brightness value of the channel of the image as the second axis, and a classification means for classifying each plot displayed by the dot plot display means into a live bacteria group or a dead bacteria group A microorganism counting apparatus characterized in that the classification means classifies the group into a live bacteria group or a dead bacteria group, and from the position on the dot plot and the density of the population, the light emission state can be objectively captured In addition, even when the type and state of the bacteria are different for each specimen, it has the effect of increasing the accuracy of counting live and dead bacteria.
The invention according to claim 14 is the invention according to any one of claims 11 to 13, wherein the light emission point collating means assigns the light emission point data for each image to RGB channels and outputs it as a single color image. As a result, the microbe counting apparatus is provided with an image output means, and displays the obtained luminescent image in color based on the color information, so that it is possible to display in the image without performing color classification processing for each type of luminescent spot. Live bacteria and dead bacteria can be confirmed, and thus the speed of counting can be increased.
Further, the invention according to claim 15 is characterized in that a marker for acquiring a light emitting point is fixed on the surface and used for judging whether it is within the depth of focus range. The image can be acquired using the method, and it can be easily determined beforehand whether the focus position of the apparatus is appropriate by the focus determination means, and the accuracy of quality control can be improved by increasing the frequency of measurement accuracy management. Have.
The invention according to claim 16 has a wavelength capable of acquiring the emission point in all of the green fluorescence image by blue excitation light, the red fluorescence image by blue excitation light, and the red fluorescence image by green excitation light or yellow excitation light. The inspection chip is characterized in that the marker is fixed on the surface, and is of three types: a green fluorescence image by blue excitation light, a red fluorescence image by blue excitation light, and a red fluorescence image by green excitation light or yellow excitation light It is possible to easily calculate a coordinate correction value for correcting a mechanical shift in the X and Y directions included in the image from the positional relationship of the markers. In other words, it is possible to automatically process a series of operations from image acquisition to marker position calculation and correction value calculation simply by placing an inspection chip for coordinate correction on the apparatus. It has the effect | action that the simplicity of can be improved. In addition, precise image measurement can be performed by correcting the mechanical error as a characteristic value unique to the apparatus without managing the mechanical error with an advanced processing technique, so that the microorganisms can be counted easily and at low cost.
The invention according to claim 17 is characterized in that, in the invention according to claim 8 or 16, a marker that can be used for both coordinate correction and determination of a focal position is fixed on the surface. Rather than confirming the focal position separately, two inspection items can be completed simultaneously with a single inspection operation, so that the quality control method can be simplified.
(Embodiment 1)
First, in order to measure a sample containing microorganisms, microorganisms are placed on the front or back of the observation surface of a slide glass, culture dish, multiwell plate, filtration membrane, or cell having a shape suitable for measurement. Fix it. For immobilization, a reagent such as poly-L-lysine or a polymer material having adhesiveness or adhesion such as gelatin is thinly applied to the surface, and a sample containing microorganisms is dropped and adsorbed on the surface. In the case of a filtration membrane such as a membrane filter, a liquid sample is sucked from above and filtered, and microorganisms are captured and fixed on the surface of the membrane filter in a flat shape. In the present invention, it is most preferable to use such a filtration membrane because the following operations such as staining and washing can be handled easily and without losing microorganisms. Further, since the membrane filter is thin and small, it is not easy to handle as it is. For this reason, the membrane can be handled easily by using a dedicated support base, a holder with a suction port, or by attaching a support to the membrane or forming an integrated device.
In the present invention, the specimen containing or possibly containing the microorganism is a liquid specimen. However, when the test object is a liquid sample such as drinking water, the specimen itself is a liquid specimen. If the object to be inspected is a solid sample such as vegetables or meat, homogenize it to obtain a liquid sample, or collect cells and microorganisms from the surface using a cotton swab, etc. It is released into a phosphate buffer or the like to make a liquid sample. When a cooking utensil such as a cutting board is an object to be inspected, microorganisms are collected from the surface using a cotton swab or the like and released into physiological saline or the like to obtain a liquid sample. Cells and microorganisms can be captured on the membrane filter by suction and pressure filtration of such a liquid sample with a membrane filter, or in some cases by vibration filtration using ultrasonic waves.
In addition to the membrane filter surface, microorganisms can be collected in the form of a preparation surface, a highly transparent surface of visible light, a highly flat plate surface, a gap between plates, or a sticky sheet. It is performed on the surface of a disk-shaped chip device, the surface of a flat plate medium, the surface of a petri dish, a dish, a multiwell plate or the like, the surface of an electrode material or an adsorbing material. At this time, microorganisms can be fixed by means of adhesive force such as gelatin, antigen / antibody reaction, ligand / receptor reaction, etc. in addition to physical force such as centrifugal force, electrostatic force, dielectrophoretic force and hydrophobic force. Can be used.
In addition, in order to adjust the permeability of the fluorescent staining reagent to the microorganism, an aqueous solution mixed with a divalent metal complex, a monovalent cation, or a cationic surfactant at an appropriate concentration is used as a liquid sample as necessary. After mixing or contacting the cells and microorganisms from above the collection means, they may be filtered or contacted from below with the cells and microorganisms. Thereby, the cell membrane permeability with respect to the fluorescent staining reagent of a cell and microorganisms can be kept constant.
In addition, by making the liquid sample mixed with the fluorescent staining reagent viscous, the reagent can be attached so as to cover the surface of the microbial cell after contacting the reagent with the microbial sample, and the size on the microscopic image is reduced. The fluorescence intensity can be increased by increasing the fluorescence intensity. Thereby, even when a wide range is scanned at a high speed with a low magnification, a luminescence image of a microorganism can be obtained with a sufficiently strong luminance and a large area.
In addition, as a bivalent metal complex, ethylenediaminetetraacetic acid or the like is used in a concentration range of about 0.5 to 100 mM.
As the monovalent cation, potassium salt, sodium salt and the like can be used in a concentration range of 0.05 to 5%.
As the cationic surfactant, those having low invasiveness to cells such as Tween 20, Tween 60, Tween 80, Triton X-100 can be used, and these are used in a concentration range of about 0.01 to 1%. .
In addition, polyhydric alcohols such as D (-)-mannitol, D (-)-sorbitol and glycerin are used in a concentration range of 10 to 70%, or silicon oil or the like is used as a component for imparting viscosity. Can do.
Next, as a staining means, a drying prevention component is mixed, and a fixed amount of a staining reagent containing a fixed concentration of either a live or dead bacteria staining reagent or a killed bacteria staining reagent or both is dropped onto the fixed surface.
Fluorescent dyes preferably have a nucleic acid binding structure, and those used as viable and dead bacteria staining reagents are those that emit blue fluorescence under ultraviolet excitation, such as 1,4-diamidino-2-phenylindole, blue excitation If it emits green fluorescence, yellow-green fluorescence, or yellow fluorescence, for example, acridine orange, oxazole yellow, thiazole orange, polymethine bridges such as SYTO9, SYTO13, SYTO16, SYTO21, SYTO24, SYBRGreen I, SYBR Green II, SYBR Gold Asymmetric cyanine dye-based compounds can be used. Further, depending on the use, it is also effective to use a viable and dead bacteria staining reagent such as hexididium iodide that stains Gram-positive bacteria and does not stain Gram-negative bacteria.
In addition, as a dead bacteria staining reagent, as long as it emits green fluorescence by blue excitation, for example, monomethine cross-linked asymmetric cyanine dye dimer such as acridine dimer, thiazole orange dimer, oxazole yellow dimer, Monomethine-bridged asymmetric cyanine dye-based compounds such as SYTOXGreen and TO-PRO-1, and those that emit red fluorescence upon green or yellow excitation, such as propidium iodide, hexium bromide, ethidium bromide, LDS-751, SYTOX Orange Polymethine cross-linked asymmetric cyanine dyes such as can be used.
If these fluorescent dyes have green fluorescence, yellow-green fluorescence, yellow fluorescence, orange fluorescence, red fluorescence, etc., they do not have fluorescence intensity in the blue region. It is possible to count microorganisms by omitting the blue light receiving means.
These fluorescent dyes are mixed with the sample containing cells and microorganisms in advance so as to have a concentration of 0.1 to 100 μM, and are allowed to act on the cells and microorganisms. To act on cells and microorganisms at a predetermined concentration.
As a means for preventing the surface of cells and microorganisms captured on the membrane filter from drying out during measurement and changing the luminescence intensity, 10 to 60% w / v glycerol or 10 To 90% v / v of one or more polyhydric alcohols such as D (-)-mannitol and D (-)-sorbitol.
Fluorescence emission is stored relatively stably by mixing polyvinyl alcohol into the sample at an appropriate concentration of about 10 to 80%, or by covering the filter surface with liquid polyvinyl alcohol and drying and solidifying afterwards. be able to.
Moreover, the reagent can be made to adhere to the surface of the luminescent material by giving the fluorescent staining reagent a certain viscosity that does not inhibit the staining filtration operation. By attaching a reagent to the surface of the luminescent material, the light emission point can be enhanced by the lens effect, and sufficient brightness and area for detection can be obtained even for low magnification images.
In addition, as a thing which gives viscosity, polyhydric alcohols, such as glycerol used as an anti-drying agent, D (-)-mannitol, D (-)-sorbitol, are suitable.
As the membrane filter suitable as the collecting means, for example, a known filter such as a polycarbonate having a pore diameter of 0.2 μm to 1 μm can be used. Since it is difficult to handle a membrane filter as it is, it is suitable to use a membrane filter or to attach a frame directly to the membrane filter.
In order to fix such collecting means to the apparatus, the apparatus is provided with mounting means. This is to determine the direction of the collecting means so that the collecting means does not come off by vibration during measurement. The collecting means is fixed perpendicular to the optical axis direction. In addition, in order to improve the flatness of the membrane filter surface, a constant flatness is always obtained by pressing a stage with high flatness from the back side of the membrane filter.
An excitation light source and a spectral filter for irradiating the fluorescent dye with a specific wavelength are used for the fluorescent image acquisition means for acquiring the image of the surface of the collection means. The spectral filter includes, for example, an excitation filter that splits excitation light, a high-pass filter that removes components of excitation light, and a light-receiving filter that extracts specific wavelength components from fluorescence emitted from a sample. The acquisition of the fluorescence image is, for example, an excitation light source for irradiating the fluorescent dye with a specific wavelength, an excitation filter for dispersing the excitation light, a condensing lens for condensing the excitation light to a diameter of about 3 mm, and excitation light. A high-pass filter for removing the component of light, a light receiving filter for extracting a specific wavelength component from the fluorescence emitted from the sample, a lens unit (magnifying lens) for enlarging it, and converting the fluorescence image into an electrical signal of the image For this purpose, an image receiving element such as a CCD or CMOS is used.
This is the main emission wavelength of the fluorescent dye used as the fluorescent staining reagent. For example, in the case of blue excitation, when the excitation light containing a wavelength component in the vicinity of 470 nm to 510 nm is irradiated, the wavelength is in the vicinity of 510 nm to 540 nm. Emits fluorescence. In the case of green excitation, when excitation light including a wavelength component having a wavelength of 510 nm to 550 nm is irradiated, fluorescence having a wavelength of 560 nm to 620 nm is emitted. In the case of yellow excitation, when excitation light including a wavelength component having a wavelength of 540 to 580 nm is irradiated, fluorescence having a wavelength of 590 to 630 nm is emitted.
Therefore, when a light emitting diode is used as an excitation light source as a detection means, a blue light source can emit a wavelength of preferably around 480 nm, and a green light source preferably emits a wavelength of around 530 nm. Among those that can be produced or yellow, those that can emit a wavelength around 560 nm are preferably used.
In addition, when using a light emitting diode, the excitation light component often covers a wide band, which may cause an increase in the background of the fluorescent image. Therefore, use an appropriate spectral filter to cut out a specific wavelength component. use.
When a laser is used as the excitation light source, a blue light source that can emit a wavelength of preferably around 475 nm is used, and a green light source that can emit a wavelength of preferably around 535 nm is used. .
When a halogen lamp or a mercury lamp is used as the excitation light source, it is preferable to use an optimum spectral filter in accordance with the excitation wavelength of the staining reagent. In addition, the reflection angle or transmission type diffraction grating having a wavelength resolution of 0.1 to 10 nm can give an optimum angle and extract excitation light including an arbitrary wavelength.
The condensing lens is preferably one that can irradiate the membrane filter on which the fluorescently stained cells and microorganisms are spread so that the irradiation range is a constant area of, for example, a diameter of about 3 mm. Furthermore, more uniform excitation light can be irradiated by combining a diffuser plate for scattering light on the primary side.
The fluorescence generated by the excitation light applied to the sample passes through the high-pass filter, so that the color characteristics are not impaired, and the light component derived from the excitation light is effectively cut.
The fluorescence passes through the lens unit, and a charge coupled device unit such as 3CCD including three types of RGB fluorescent filters capable of acquiring three primary colors of red (R), green (G), and blue (B) as an image receiving device is used. The exposure time is acquired by photographing an image composed of three colors of RGB with an exposure time of about 0.1 to 10 seconds. A single-plate color CCD may be used as the image receiving element.
The luminance information of the color to be acquired can be used as long as it is in the fluorescence wavelength range of the fluorescent dye that is the fluorescent staining reagent. For example, in the case of SYBRGreen which is a cyanine dye, the maximum fluorescence wavelength is 521 nm, but the fluorescence spectrum extends to around 620 nm, and when used as a viable and dead bacteria staining reagent, green (G) around 530 nm is obtained as an image (a), Red (R) near 610 nm can be obtained as an image (b), and microbes and contaminants can be distinguished using (a) and (b).
In addition, when a single-plate monochrome CCD or CMOS is used, an image including luminance information of a necessary wavelength can be acquired by switching and using an appropriate light receiving filter. At this time, as another advantage, by using the same CCD, it becomes possible to perform measurement without being affected by the difference in sensitivity characteristics between different CCDs, and the step of performing sensitivity correction can be omitted. .
A plurality of fluorescent images acquired by these operations are processed by a microcomputer as a computing means or a program on an external terminal.
The computing means is provided with bright spot removing means for removing bright spots such as missing dots from the image. Also, a light emission point extracting means for extracting light emission points from the image, a coordinate correction means for correcting the coordinates of the extracted light emission points, collating the same light emission points from a plurality of images, and combining (integrating) the collated data A light emitting point detecting means comprising a light emitting point collating means is provided. Furthermore, there is an output means for outputting the combined data, chromaticity calculation means for calculating chromaticity, life / death determination means for determining the viability of microorganisms from the brightness of the staining reagent, and light emission by a variable representing a color characteristic Fluorescence evaluation means is provided which comprises microorganism determination means for determining whether a point is a microorganism or a contaminant. In addition, an effective area calculating means for calculating the effective area of the measured image is provided, and an input means for inputting variables used for the arithmetic processing is provided.
The means provided in these calculation means can be selected and used by selecting buttons or check boxes on the graphic user interface of the program, or by displaying and selecting multiple items called pull-down menus. it can.
First, there is a bright spot removing means, which is a means for removing bright spots having a phenomenon called dot unevenness due to a non-uniform sensitivity of a pixel pixel seen in an image receiving element such as a CCD or a loss of sensitivity. . If a dot-deficient luminescent spot appears on the image, it may be mistaken for a luminescent point of a microorganism, or the luminescent point of a microorganism cannot be obtained, which may cause an error. For this reason, it is necessary to remove such bright spots, but as a bright spot removal image, a dark field image that is not irradiated with a light source is acquired by setting the exposure time to be the same as or longer than that of the sample measurement. Get an image with only points. Then, it is possible to delete only the bright spot by subtracting the bright spot image from each image in which the light emitting points are copied, or by embedding it by comparing with the surrounding pixels. The image in which the bright spots are removed in this way is used below.
The light emission point extracting means extracts the light emission points included in the image corresponding to the set area and luminance range. For example, if the area is 2 to 15 and the luminance is 15 to 255, a large foreign object having an area of 16 or more can be excluded from the count in advance, and background noise (dark noise) having a luminance of 14 or less. Can be removed. Since the optimum value of this threshold value varies depending on the magnification of the lens, the intensity of the excitation light source, the exposure time, and the like, it is necessary to verify and confirm in advance the value at which microorganisms can be optimally extracted.
In order to increase the accuracy of determining microorganisms, area luminance determination means is used. Microorganisms are detected as luminescent spots with a very small area on the image, but there are those with a high luminescent brightness and a large area depending on the type and culture state. The size of microbial cells varies slightly depending on the type, nutritional state, and the like, but those with large cells have high luminescence brightness, and microorganisms with small cells have low luminescence brightness. Depending on the magnification of an optical system such as a lens, when the size of one microorganism is smaller than the area corresponding to one pixel of the image receiving element used, the size of the emission point derived from the microorganism on the image is: Since the intensity of light emission is strong, not the actual size of microorganisms, the area increases as a result of the brightness of adjacent pixels on the image receiving element. For this reason, the area on the image of the emission point derived from the microorganism and the luminance have a certain correlation. On the other hand, compared to luminescent materials such as impurities, microorganisms have higher emission luminance than the area because the reagents are concentrated in the cells. On the other hand, impurities or the like adhere to the surface and emit light, but in this case, there are many cases where the emission luminance with respect to the area is low. Examining the relationship between the brightness and the area, it can be seen that there is a linear correlation with a characteristic inclination as a microorganism. The area luminance determination means uses this to determine a low luminance item having a small area and a high luminance item having a large area as a living or dead microorganism from the light emitting points. The information on the area and luminance value of the light emitting point is compared with the upper limit value and lower limit value of the area for each luminance value. The upper limit value and the lower limit value are linear functions of luminance, and are used by specifying a slope and an intercept as a setting method.
(Formula 1)
{(Lower limit intercept) + (lower limit slope) × luminance value} ≦ area ≦ {(upper limit intercept) + (upper limit slope) × luminance value}
In addition, the area luminance determination means can determine microorganisms from impurities in the same manner even if a value obtained by dividing the area by the luminance value is used. Further, the value obtained by dividing the area by the luminance value becomes smaller as the focal position is matched. In the focus determination means, it is possible to determine by numerical value after counting whether the focal position of the acquired image is correct by examining and comparing the numerical value specific to the microorganism in advance.
Further, it is possible to determine whether the focus position is in a state where the apparatus can be normally counted by the focus determination means from the image of fluorescent particles having a small light emission before counting the microorganisms.
These processes can be executed using Image Pro Plus (trademark), which is general-purpose image processing software. It is also possible to use a program incorporating similar processing.
Next, the numerical data of the extracted light emitting points and the numerical data of the light emitting points at the same position including different luminance information are compared, collated and combined by the light emitting point collating means based on the coordinates.
At this time, an image including different luminance information refers to an image acquired by a different light receiving filter, but there is a slight difference in coordinates between the images due to the characteristics of the light receiving filter and mechanical errors. If the pixel coordinates of the image are collated, they may not match. Therefore, coordinate correction means is provided to check the coordinates of one of the coordinates by correcting the coordinate correction value to correct the image shift. Especially for mechanical errors, due to the influence of the usage environment such as temperature and humidity, the coordinate shift is changed every time it is used. The value may change. Therefore, it is effective to use the optimum value for each measurement by updating and using the coordinate correction value for each measurement.
The correction value for correcting the coordinates is acquired by reading the correction value from the position correction image acquired in advance. The position correction image is picked up using a phosphor that is reflected in all the wavelength ranges to be acquired. If the wavelengths to be acquired are green and red, red fluorescent particles on the long wavelength side can be used, and photographing is performed by adjusting the intensity of the excitation light source and the exposure time so as to obtain the same emission intensity. In the case of processing for automatically calculating the correction value, the number of phosphors increases as the number of phosphors increases, and it takes time. Therefore, the number of phosphors is 5 to 50 per screen. If it is within the range, the correction value can be obtained in a relatively short time of about 1 to several minutes. A check chip for coordinate correction for obtaining a position correction image is prepared by filtering a certain amount of the suspension of fluorescent particles through a membrane filter so that the number of phosphors becomes such a number. . In addition, when it is desired to repeatedly use this as a calibration chip in the long term, the fluorescent particles should be fixed with a polymer or the like or covered with a metal thin film by metal deposition. Thereby, even if it uses repeatedly, the position becomes constant, without removing. In addition, as a calibration chip, a chip formed by masking a fluorescent resin to form a minute pattern or a spot is also effective.
The calibration chip thus fabricated is installed in the apparatus and images are taken in the same manner as actual measurement. This reproduces the coordinate deviation of the image that occurs due to mechanical error such as motor position control error and backlash, filter and lens manufacturing error, and optical axis shift caused by manufacturing error when assembling the device. The position accuracy can be improved by obtaining the correction value and using it in actual measurement.
Further, by making the fluorescent particles used in the inspection chip for coordinate correction have a size close to that of the microorganism, it can also be used as an inspection chip for determining whether or not the focal position is correct. Although the thing with the light emission characteristic which can be detected with the image for adjusting a focus position can be used, it is good to use the thing for coordinate correction. By making it possible to execute the determination of the focal position following the calculation of the coordinate correction value in the program configuration, the focal position of the device can be inspected at the same timing as the coordinate correction operation, and the inspection work Can be unified.
The area of the object showing the luminescence point of the microorganism seen in the image is about 1 to 20 pixels on the image receiving element when the total of the magnifying lens system is about 200 to 300 times. This is a value taken when the diameter of one microbial cell is about 0.6 to 5 μm. On the other hand, when two or more microbial cells are connected to each other, the area of the object of the light emission point becomes large, and some objects exceed 20 pixels. Such an object having a large light emitting point is detected as one object in most cases unless a special optical system such as a confocal optical system is used, and it is difficult to detect two objects separately. The problem at this time is that when two objects have different light emission characteristics, adjacent images are detected as the same object when the luminance is compared by comparing the light emission points by comparing the images. If the emission luminance of microorganisms is mistakenly combined, inaccurate data that is completely different from the emission characteristics of the original microorganisms may be formed. In order to prevent such a case, the coordinates of the light emitting point are the coordinates indicating the maximum luminance value of the object, and when collating the light emitting point between images, an error range area limited to the very vicinity from the coordinates. It is necessary to be coupled only with the light emitting point having the coordinates of the other image inside.
Even objects extracted as objects having the same light emission point may not match when collated. In order to prevent the luminance data to be combined from being lost at that time, the luminance of the pixel of the same coordinate in the other image is detected when the light emitting point matching the other image to be compared is not detected. It is useful to extract values and combine these values. As a result, even when the light emitting point is extracted from only one image, the collation data can be created with high accuracy without losing the luminance information.
In addition, although related to the detection accuracy of the final number of bacteria, there is a possibility that an object will be detected as dead if it does not have the above-mentioned process when living and dead bacteria are connected. However, it becomes possible to detect that the living and dead bacteria are connected by the above-described process, and the correlation with the culture method and the like is improved.
The collated and combined data is output as a data file by the output means. By saving as a data file at this time, it is possible to process the subsequent processes all at once, thereby increasing the efficiency of the configuration of the arithmetic program. This process is performed for each imaging position, and after scanning all the imaging positions, an output file for each imaging position is read and used to create collation data for the entire area.
With respect to the data file having the luminance information of the light emitting point, the light emitting point is classified into either a viable cell group or a dead cell group by the life / death determining means. At this time, by adding a parameter indicating that the luminescent point is a group of live bacteria or dead bacteria to the data, the process of determining whether it is a subsequent microorganism or a contaminant is simplified, and the calculation processing program is made more efficient. can do. The parameter is set by adding a numerical value to the light emission point data such that the parameter is 1 for the live bacteria group and 2 for the dead bacteria group.
In order to determine whether the group is a viable group or a dead group, it is desirable to use a graph as follows. First, dot plot display means for creating a dot plot from the luminance value of the viable and dead bacteria staining reagent and the luminance value of the dead bacteria staining reagent in the light emission point data is provided. This is a technique called a two-dimensional histogram, in which the horizontal axis represents the luminance value of the live and dead bacteria staining reagent, the vertical axis represents the luminance value of the dead bacteria staining reagent and plots each detected light emission point. This is an effective technique for visualizing how many microorganisms have a balance between two luminescence intensities by using two kinds of reagents. The dot plot is preferably displayed on a graphic user interface of a program that performs image processing, and may be displayed when a data file of light emission points is read out. The value used as the brightness value can be the maximum brightness value, average brightness value, or total brightness value of the object, and the display axis of the plot is appropriate by selecting a constant or logarithm by the display axis selection means Can be used. In many cases, there is a luminance difference of 10 times or more between strong and weak fluorescence intensity, and in some cases 100 times or more. In order to display the whole, it is better to display on the logarithmic axis. However, there are many cases where plots are close to each other, and when it is desired to enlarge a part of the plot or when the adjacent plots are separated by boundary lines, it may be better to display them with a constant axis. Therefore, by providing a display axis selection means so that the display axis can be switched between a logarithm and a constant, it can be used as needed in either case.
Next, a classifying means for classifying the plots on the displayed dot plots for each group is provided. The classifying means determines which area the luminescent spot is from the boundary line creating means for creating a boundary line for classifying the plot, and the viable and dead cell areas divided by the boundary line. An area determination means for determining whether the group is a fungus group or a dead bacteria group is provided. The boundary line is created so that one or a plurality of straight lines, curves, polygonal lines and the like can be freely created with a cursor or the like so that the group of plots can be easily classified while viewing the plot. Note that the boundary line can be easily and accurately performed by using a grid or the like so that it can be easily performed or by providing a function of trapping the outline or plot.
In addition, when a polygonal line is used as a boundary line, it is certain that the polygonal line can be produced only in one direction so that the lines do not intersect.
The produced boundary line can be canceled or stored by the boundary line storage means, and can be repeatedly used by the boundary line selection means. In addition, it is possible to obtain a more appropriate classification result for each specimen by providing boundary editing means that can be edited, such as changing some vertices of selected boundary lines or adding vertices. Become.
Next, a threshold value corresponding to the boundary line is calculated based on the produced boundary line. With respect to the calculated threshold value, those on the left side of the graph are classified as dead bacteria groups, and the opposite is classified as live bacteria groups, and processing is performed by giving parameters.
After the luminescent point is determined to be either a live cell group or a dead cell group, the following processing is performed when the luminescent point derived from impurities is separated and excluded by the microorganism determining unit. The discrimination between microorganisms and contaminants is made by comparing the chromaticity threshold specified by the input means with the calculated chromaticity of the light emitting point.
The chromaticity is obtained by calculating the chromaticity calculation means from the RGB luminance values. As the color system showing the color features, a color system such as Lab color system, LCh color system, or XYZ color system is used. Here, chromaticity based on the XYZ color system is used. Since the acquired luminance is in the RGB color space, conversion from the RGB luminance values to the XYZ color system is performed using Equation 2.
(Formula 2)
X = 0.3933 × R / 255 + 0.3651 × G / 255 + 0.1903 × B / 255
Y = 0.2123 × R / 255 + 0.7010 × G / 255 + 0.0858 × B / 255
Z = 0.0182 × R / 255 + 0.1117 × G / 255 + 0.9570 × B / 255
x = X / (X + Y + Z)
y = Y / (X + Y + Z)
R, G, and B in the formula indicate a red fluorescence luminance value, a green fluorescence luminance value, and a blue fluorescence luminance value, respectively. As a result, the values of x and y are finally calculated as values necessary for determining whether the cells and microorganisms or impurities are present.
It is a chromaticity value calculated for each luminescent point, but each luminescent point is given a parameter to determine whether it is a viable group or a dead group. In each case, compare with the chromaticity threshold set for the live bacteria group, and in the case of the dead bacteria group, compare with the chromaticity threshold set for the dead bacteria group. In FIG. 5, light emitting points derived from impurities are excluded. Contaminants are excluded, and those judged as live or dead are added up and counted.
The count value for each position should be displayed each time, so that you can get a guide to the final result even during the measurement, and even if the count value is large, hygiene management immediately Since the process can be improved and a quick decision to stop shipping can be made, the work efficiency can be improved.
In addition, the acquired image and the color image obtained by calculation and synthesis are preferably displayed in accordance with the display of the count result, whereby the user can determine whether the count value is obtained correctly.
The light emission point of the color image is displayed in a color close to the color information based on the intensity of the acquired black and white image, so that the image can be easily confirmed. In addition to the color image, it is preferable to arrange a button on the program so that a monochrome image indicating each wavelength can be selected and displayed.
Next, based on this count value, the total number of bacteria per unit amount (for example, 1 mL, 1 g, etc.) contained in the actually used specimen is calculated. For this purpose, the effective area area used for the image processing is obtained from the measured images by the effective area calculation means. The effective area used for the measurement is obtained by a function using the correction value of the image as a variable. Note that the effective area can be obtained first if the correction value is determined.
Assuming that the vertical length of the image is P, the horizontal length is Q, the vertical coordinate correction value is α, and the horizontal coordinate correction value is β, the number of effective area pixels M per screen is given by Equation 3. It is expressed in
(Formula 3)
M = (P−α) × (Q−β)
Also, the effective area area is obtained by calculating the area per pixel from the magnification of the lens system, the area per pixel is s, the number of fields of view is N, and the effective area area S per screen and the total effective area. Is expressed as Equation 4.
(Formula 4)
S = M × s
Total effective area: S × N
The value of the surface area (for example, the total area of the membrane filter) of the fixed portion of the microorganism collecting means is divided with respect to the obtained area. By multiplying the numerical value obtained in this way by the number of counted bacteria, the final total number of living or dead microorganisms can be calculated to obtain the number of bacteria.
After detecting the luminescent material as described above, in the case of rapid inspection, it is necessary to judge whether the detected luminescent material is a microorganism using a microscope and to evaluate the validity of the result. It is. Therefore, the membrane filter used for the measurement is observed with a fluorescence microscope.
In order to observe the same luminescent material as the luminescent image from the membrane filter surface using a microscope, the direction of the membrane filter when observing with the microscope is the same as the direction of the image measured with the microbe counting device. It is important to align the direction. If the directions are different, the arrangement of the luminescent materials seen in the microscopic image and the arrangement of the acquired luminescent images appear different, and it is difficult to specify the same field of view and the same luminescent materials. Therefore, it is possible to align the microscope image and the microbe counting device image by providing a frame such as resin on the membrane filter, marking the frame, and marking the microscope stage as well. It is good to be able to do it.
If the marks are provided at three or more positions asymmetrically from the center, there is only one matching direction so that the marks can always be adjusted to the same position, and a slight error in the mounting angle can be prevented.
Further, if this mark is a convex portion, and a concave portion corresponding to this is provided in the microscope so that the convex portion and the concave portion are engaged with each other, precise adjustment can be carried out simply and efficiently.
In addition, when observing the entire measurement area of the membrane filter surface with an objective lens having a high magnification of about 100 times, if the membrane filter frame is higher than the membrane filter surface, the high magnification objective lens has a depth of focus. Since it is shallow, the lens and the frame come into contact with each other, and the membrane filter surface in the vicinity of the frame is difficult to observe because it is out of focus. Further, if the area of the membrane filter is as small as about 1 cm in diameter, it becomes difficult to focus on only the central portion, making it difficult to determine the luminescent material. Therefore, the area of the membrane filter is slightly increased so that the specimen can be filtered within a certain distance from the frame so that observation can be performed without contact between the membrane filter frame and the lens. If a film with a hole in the center is overlapped from above or below the membrane filter so that the sample cannot be filtered within the distance range, the sample can be filtered at the center of the membrane filter. All of the luminescent materials can be observed and judged with a high-magnification objective lens.
For the same purpose, adjust the dimensions of the frame and pedestal for fixing the membrane filter in advance, and make the hole diameter of the pedestal below the membrane filter smaller than the filter holding part of the frame above the membrane filter. It becomes possible to limit to the center part of the membrane filter.
Display means for displaying the color of the luminescent spot detected as a microorganism is provided in the microorganism counting device so that the luminescent spot determined as a microorganism can be easily confirmed from a plurality of luminescent materials observed with a microscope. The display means displays an object to be a microbial cell in a small window frame on the program in a small window frame with the color characteristics of the microorganism. The display color can be automatically changed even if the parameter is changed by linking the threshold value of the color characteristic when judging as a microorganism.
Using the above method, it is possible to discriminate the life and death of the microorganisms contained in the sample and the cell culture solution, separate them from the foreign substances, and count them.
FIG. 1 is a conceptual diagram showing an embodiment of a microorganism counting apparatus for suitably carrying out the present invention. The microorganism counting apparatus 1 includes an excitation light source 2, an excitation filter 3, a condensing lens 4, a high-pass filter 5, a light receiving filter 6, a lens unit 7, and an image receiving element 8 as fluorescent image acquisition means. In order to extract a target wavelength from the excitation light emitted from the excitation light source 2, the light is split by the excitation filter 3. The split excitation light passes through the condenser lens 4 and is collected with a membrane filter 10 as a collecting means for collecting microorganisms set on the examination table 9 (by a separate operation, the membrane filter is stained with a nucleic acid-binding fluorescent dye. Collected on the captured microorganism). The excitation light emitted from the excitation light source 2 is condensed by the condensing lens 4. At this time, the condensing lens 4 is adapted to condense the excitation light onto a small fixed area having a diameter of about 3 mm. Is good. The fluorescence emitted by the excitation light is enlarged by the lens unit 7 through the high-pass filter 5 to remove the excitation light component, and further through the light receiving filter 6 for extracting a specific wavelength component from the fluorescence. It reaches a certain CCD unit 11 and is converted into an electrical signal. The signal thus obtained is converted into an image, and image processing is performed by the calculation means 12.
FIG. 2 is a diagram showing a calculation process flow in the calculation means 12. It comprises a bright spot removing means 13, a light emitting point extracting means 14, a coordinate correcting means 15, a light emitting point collating means 16, an output means 17, a fluorescence evaluating means 18, and an effective area calculating means 19.
First, a coordinate correction image is read and a coordinate correction value is calculated. Next, a variable such as a threshold value is input, and an image from which the bright spot is removed by the bright spot removing unit 13 is created. Subsequently, the light emission point extraction means 14 identifies light emission points in the image and extracts numerical data. Depending on the image, the coordinate correction means 15 corrects the coordinates. The light emission point data including different luminance information is collated by the light emission point collating means 16 and combined. The numerical data collected in this way is output to the data file by the output means 17 and stored. For the data file, the chromaticity calculation means 20 calculates the chromaticity for each light emitting point. Then, the life / death determining means 21 determines whether the light emission point is a live cell group or a dead cell group, and sets a flag of the live cell group or the dead cell group for each light emission point. Whether or not the detected flag is a microorganism by comparing it with a threshold value for determining whether the detected flag is a microorganism or a contaminant set for each of the live and dead bacteria groups. Is determined. Further, in order to increase the determination accuracy, the area luminance determination means 23 for determining whether the luminescent point is a microorganism or a contaminant from the area of the light emission point and the value of the luminance value, the contaminant having a large area and a low luminance is removed from the microorganism. It is excluded from the count, and finally the number of bacteria is calculated and output. These processes can be executed by a programmed microcomputer or the like, and can also be performed by communicating with software operated by an externally connected terminal or the like.
FIG. 3A is a table showing an example of determination by the microorganism determination unit. Specifically, E.I. A water sample containing E. coli is filtered through a membrane filter, and stained with SYTO9, which is a fluorescent dye as a viable and dead bacteria staining reagent, and propidium iodide, which is a fluorescent dye as a dead bacteria staining reagent. And a table showing an example of data obtained by acquiring a G luminance image and an R luminance image in blue excitation light irradiation. At this time, since the B luminance image cannot be acquired because it overlaps the wavelength of the excitation light, a numerical value is substituted from the input means and used. This variable can be adjusted to an optimal value.
The operation shown in FIG. 3B shows conversion from RGB luminance to (x, y) values in the XYZ color system. In this step, first, the RGB luminance values acquired by the means for measuring RGB luminance are converted into linear RGB and gamma correction is performed. The visual characteristics are further weighted, and the values of x and y are finally obtained as values necessary for the determination of whether the substance is a microorganism or a contaminant. At this time, for example, when blue (B) is cut by an optical filter and only green (G) and red (R) are acquired, it is assumed that blue sensitivity cannot be obtained, and the luminance of B As for the value, a fixed value optimized in advance by experiment can be used instead, or a function based on a luminance value of R or G can be set and used. By comparing the obtained chromaticity value with a threshold value, it is determined whether it is a microorganism or a contaminant. The threshold value at this time is determined by experiment.
FIG. 4 shows chromaticity display means. The chromaticity of the microorganism is used for determination by setting a threshold in advance in the program. At this time, the color determined to be a microorganism is displayed. A display window 25, a color display object 26, and a background 27 are arranged in a main window 24 serving as a graphic user interface of the program or in a separate window. FIG. 4 shows a case where these are included in the main window 24. The color display object 26 is a closed curve such as an ellipse or a circle, a rectangle, or the like, and the display color is changed by linking with a parameter of color characteristics determined to be a microorganism. The background color is dark black so that it can be easily compared with the microscopic image.
FIG. 5 shows a top view and a sectional view of the inspection chip and an enlarged view of the membrane filter surface. As the inspection chip 28, for example, a chip in which fluorescent particles 32 are fixed on the surface of a membrane filter 29 having high flatness can be used. The inspection chip may have the same shape as the collecting means for use in counting samples such as microorganisms. Thereby, the shape of the mounting means is not complicated and can be shared. By covering the surface of the membrane filter 29 with a metal film or the like and performing a process for reducing the autofluorescence of the filter medium, an image with a low background may be obtained. Fluorescent particles 32 are fixed on the surface of the membrane filter 29. As the fluorescent particles 32, those that emit light in all acquired images are used. As the wavelength, it is preferable to emit green fluorescence and red fluorescence with blue excitation light, and further emit red fluorescence with green excitation light. For example, those having an absorption region and fluorescence in broadband visible light are preferable. If it emits all of these, it corresponds to all images to be acquired, and the coordinate correction value is calculated by superimposing the coordinates of the emission points of the same particles on the images acquired at the respective wavelengths. Coordinate correction means can be executed.
（実施例１）
図１に示す微生物計数装置を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉを含む菌液と、水道水（塩素除去済み）の中の菌数を測定した。まず、これらの液体試料を、孔径が０．４５μｍ、直径９ｍｍの黒色メンブレンフィルタに表面を金属蒸着したものの上方からピペットにて滴下し、吸引ろ過した。メンブレンフィルタは、そのままでは表面に触れてしまう恐れがあり、扱いにくいため、周囲を樹脂枠で覆い、一体化させたものを使用した（図５を参照のこと）。吸引ろ過圧は、吸引の程度が弱すぎるとろ過できず、吸引の程度が高すぎると微生物へのダメージとなってしまうばかりか、メンブレンフィルタが破損することがあるため、１００から４００Ｔｏｒｒ付近のポンプ圧に設定して行った。メンブレンフィルタ上に液体試料をろ過するとき、計数のしやすさや、精度の点から、微生物などの発光物はできるだけ均一に分散させる必要がある。そのため、メンブレンフィルタのろ過性能を均一にするために、メンブレンフィルタ下方の吸引口にろ紙などを挟み、吸引圧を拡散して、吸引圧がフィルタ全体に均一にかかるようにして行った。また、それとは別に、メンブレンフィルタのポアの通過抵抗を減少させるため、液体試料をろ過する前に、少量の界面活性剤希釈液（Ｔｗｅｅｎ２００．１％）をろ過した。液体試料は、Ｅ．ｃｏｌｉ菌液の場合は０．１ｍＬ、水道水の場合は２０ｍＬろ過した。
続いてメンブレンフィルタ上に捕集された微生物に対して、蛍光染色を行った。染色試薬は、生死菌染色試薬であるＳＹＴＯ２４と、死菌染色試薬であるＳＹＴＯＸＯｒａｎｇｅ（いずれも商品名）を使用した。これらの染色試薬は、空気中で光を吸収して分解しやすいため、ジメチルスルホキシドにて５００μＭに調整し、少量ずつマイクロチューブに分注してストック液とし、保管した。保管は、マイクロチューブ内に窒素を封入し、マイナス２０℃のフリーザーにて暗所保管した。必要本数を解凍し、それぞれの試薬１０μＬに対して希釈液を全量が１ｍＬになるように加え、混合した。この希釈液は、試薬の溶解性、保存性、細胞への浸透性、乾燥防止性に優れ、低自家蛍光性である必要があるが、このような条件を満たすものとして、Ｄ−ソルビトールを蒸留水で５０％程度に希釈しＴｒｉｓ−ＨＣｌと少量の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０）を混合したものを使用した。
終濃度５μＭに調整した試薬は、１種類ずつ微生物が捕集されたメンブレンフィルタ上方から滴下し、常温にて数分間染色し、余剰の試薬は吸引ろ過にて除去した。染色順序は限定されず、生死菌染色試薬、死菌染色試薬いずれから行っても同様に染色することができる。
染色したのち、余剰試薬を吸引によってできる限り除去した後、メンブレンフィルタを微生物計数装置に設置し、計測を行った。
微生物計数装置は、図１に記載されたものであるが、今回、青色発光ダイオード（約４７０ｎｍ）と、緑色発光ダイオード（約５３０ｎｍ）を使用し、受光フィルタとして緑色は５３０から５５０ｎｍに透過性をもつものと、赤色は５９０から６１０ｎｍに透過性を持つものを使用した。なお、光源には、光束を撮像範囲に照射しやすいよう集光レンズを設けている。
また、メンブレンフィルタの設置ステージには着脱可能な機構を設け、さらにステージ部材を平面性が高いものとし、これをメンブレンフィルタの裏側から押し当てることで、フィルタの平面性を高め、かつ画像取得のためのピントがフィルタ上に合う高さに固定できるようにし、ピント調節を不要とした。メンブレンフィルタを固定したステージは、モーター駆動のＸＹステージにより移動可能であり、プログラムによってあらかじめ指定した位置への移動を連続的に行うことができるものとした。
メンブレンフィルタ表面の蛍光画像の取得は、メンブレンフィルタの上方に設置された赤外カットフィルタを施した単板モノクロＣＣＤカメラと、拡大レンズ系にて行った。画像を取得する際には、励起光となるＬＥＤが点灯して照射され、受光フィルタを切り替えて目的の波長の画像を取得できるものとし、これらのカメラ、光源、フィルタ、およびステージは、動作をプログラムされたマイコンを使用して制御されるものとした。
画像の取得は、同一の位置で（ａ）青色励起、緑色蛍光、（ｂ）青色励起、赤色蛍光、（ｃ）緑色励起、赤色蛍光、の３種類の画像を、露光時間が０．１から１０秒程度で連続的に取得し、ステージによって次の撮像領域に移動し、同様に画像を取得するものとした。また、測定の最初には、発光ダイオードを点灯させずに画像を取得し、ドット欠けのみを含む画像を取得しておいた。
尚、焦点位置はレンズ高さによってあらかじめ調整するが、焦点位置の確認には捕集手段のメンブレンフィルタ表面に蛍光粒子を固定した点検用チップを作製し、この画像を取得して判断した。
図６は点検用チップの高さと取得した画像のオブジェクト面積を最大輝度値で除した値とのグラフと焦点深度範囲の判定方法を示す。グラフは、点検用チップとレンズとの焦点距離を変えながら各位置での画像を取得し、画像中の発光点の面積と最大輝度値から面積を最大輝度値で除した値を求め、高さごとにプロットしたものである。蛍光粒子として、青色励起光で緑色蛍光と赤色蛍光をもち、緑色励起光で赤色蛍光をもつ赤色蛍光粒子（最大吸収波長が５４０ｎｍ、吸収域が５００から５７０ｎｍ、最大蛍光波長が６１０ｎｍ、蛍光域が５５０から６６０ｎｍ）のものを使用した。焦点深度範囲を判定するための画像は、光学系の色収差が補正されたものであれば３種類の画像全てで取得する必要はない。通常、波長が短いほうが焦点深度の範囲が狭いため、複数の波長を観察する場合にはもっとも波長の短い組み合わせを選択すれば使用する全ての波長で焦点深度範囲に入るといえる。この場合、青色励起光で緑色蛍光の画像を使用した。このとき、焦点位置に近いほど値が低下した曲線が得られるため、値が小さいほど焦点位置に近いことを示す。取得した画像から有効な焦点深度の範囲を設定し、そのときの焦点深度範囲の判定上限値を示す線３３として使用することで、焦点深度の範囲であるかの判定を行うことができる。これらは、プログラムソフトに焦点判断手段として組み込み、点検用チップの画像の取得と連動して実行されるようにするものとした。
画像を全て取得した後、演算手段によりドット欠けの除去、発光点の抽出、照合が行われ、発光点ごとに輝度値および面積を求めたデータを作成した。
図７はＥ．ｃｏｌｉと水道水中の微粒子の最大輝度値と面積のグラフおよび面積輝度判断手段による分類方法を示す。得られた輝度値を横軸に、面積を縦軸にとり、プロットした。Ｅ．ｃｏｌｉを示すプロット３４は傾き０．０５の一次相関を示したが、水道水中の微粒子を示すプロット３５は傾き０．６５の相関であり、大きく異なった。これに対し、面積輝度上限値を示す一次直線３６と、面積輝度下限値を示す一次直線３７を設け、この範囲内に入るものを微生物と判定することとしたが、このとき、面積輝度上限値の切片は５、傾き０．０４とし、面積輝度下限値の切片は−２、傾き０．０４に設定した。
図８の（ａ）はＥ．ｃｏｌｉと水道水中にみられる発光点について、生死菌染色試薬であるＳＹＴＯ２４の蛍光波長である青励起による緑蛍光の輝度と、死菌染色試薬であるＳＹＴＯＸＯｒａｎｇｅの蛍光波長である緑色励起による赤蛍光の輝度を２軸におき、ドットプロットを作成したものである。
このとき、任意に設定できる境界線として、ｃがｙ＝１００、ｄがｘ＝ｙのような直線を設定し、ｃより小さく、かつｄより小さい領域を生菌群、それ以外の領域を死菌群として指定し、該当する領域の発光点に対してフラグを立て、発光点の分類を行った。
次に、生菌群として分類された発光点データの集団を、ＸＹＺ表色系における色度データのうち、ｘとｙの値をグラフ上にプロットした（図８の（ｂ））。このとき、Ｅ．ｃｏｌｉ生菌がｘ＜０．３７、ｙ＞０．５４の領域に分布していたのに対し、水道水中の発光物はｘが０．３から０．６、ｙが０．３から０．６と幅広い領域に分布していることが確認された。このとき、閾値は、Ｅ．ｃｏｌｉの値を参考に設定し、ｘはｅ＝０．３７、ｙはｆ＝０．５４として、ｘ＜ｅ、ｙ＞ｆの領域に分類された集団を微生物として判別し、水道水中に含まれる夾雑物と区別した。その結果、検出された発光点のうち夾雑物に由来する発光点の大半を分離することができ、水道水では図８の（ａ）のとおり生死判断手段によって１００個の発光点から生菌群として３２個の発光点が抽出されたが、さらに図８の（ｂ）によってそのうちの８個が微生物の生菌であると判別することができた。
この閾値は一例であるが、染色に使用する蛍光色素の種類や、濃度、希釈する溶液の極性などによっても閾値は変わることから、使用が想定される環境に最も適した値をあらかじめ設定しておくことが好ましい。
なお、最終菌数の妥当性については、培養困難である菌も存在する為、適切な培養方法、培地の種類を複数組み合わせて使用し、評価することが望ましい。
（実施例２）
図９はＥ．ｃｏｌｉについての、生死判断手段における生菌と死菌を判別するための閾値の設定方法の設定結果である（境界線として多角線を用いた例）。照合されて結合された発光点の輝度情報のうち、第１と第２の染色試薬の輝度をｘ軸とｙ軸にとり、データを対応させたドットプロット表示手段３８と、さらにこのドットプロット上において、カーソル３９を操作して、プロットを分類するための閾値を設定するための多角線の始点４０、頂点ａ４１、頂点ｂ４２、終点４３を設定した。設定された多角線４４は、プログラム上で演算され、閾値が求められた。判別を行い、計数した結果、生菌群１２０個、死菌群８０個として簡便に測定することができた。
（実施例３）
図１０はＥ．ｃｏｌｉについての、生死判断手段における生菌と死菌を判別するための閾値の設定方法の設定結果である（境界線として多角形を用いた例）。表示したドットプロット表示手段３８に対して、カーソル３９を操作して、選択したい領域の多角形の始点４５と、頂点ａ４６から頂点ｂ４７と頂点ｃ４８を経て頂点ｄ４９を連続的に設定し、頂点の最後は、始点と一致させて多角形を設定した。設定された多角形５０に対して、閾値が自動的に算出され、領域をチェックボックスで死菌として指定したところ、死菌数は７８個として検出できた。
（実施例４）
図１１はＥ．ｃｏｌｉについての、生死判断手段における生菌と死菌を判別するための閾値の設定方法の設定結果である（境界線として楕円形を用いた例）。表示したドットプロット表示手段３８に対して、カーソル３９を操作して、選択したい領域の楕円形の中心５１と、長軸５２または短軸５３と、長軸の長さ５４と、長軸の角度５５を設定した。楕円形ａ５６と楕円形ｂ５７を、それぞれ死菌、損傷菌として設定したところ、死菌数が７２個、損傷菌が９個であると検出された。
この集団ごとに楕円の中心座標と長軸の長さと角度の数値を抽出することで、これらを微生物の集団の特性を示す特徴パラメータとして集団を定義できる。それぞれの値は、様々な菌種や、様々な活性状態のものを示すものであり、値を比較することによって、例えば同じ死菌であっても、損傷度合いや、微生物の損傷のしやすさなどを比較することが可能となる。図１１の場合、楕円の長軸の傾きが大きく、死菌染色試薬で強く染色された楕円形ａ５６で囲まれた領域の方が、死菌の損傷度が高いものであると推定することができた。
（実施例５）
図１２はＥ．ｃｏｌｉについての、生死判断手段における生菌と死菌を判別するための閾値の設定方法の設定結果（領域指定による分類方法の例）である。図１２（ａ）はＥ．ｃｏｌｉの２蛍光の輝度ドットプロット表示手段３８においてＡ、Ｆ、Ｋ、Ｐを指定した場合の選択される領域を示す図であり、図１２（ｂ）はドットプロット表示手段３８の領域と番号を示す図である。表示したドットプロット表示手段３８に対して、あらかじめ縦横をＮ＝５、Ｍ＝５、合計２５領域に分割し、輝度がそれぞれ５０ずつになるようあらかじめ各領域に番地を設け、それぞれに番号（Ａ〜Ｙ）を定めた。次に、プロット結果から、死菌領域をＡ、Ｆ、Ｋ、Ｐとして設定して、領域内の死菌数を算出したところ、９７個が検出された。
Example 1
Using the microorganism counting apparatus shown in FIG. The number of bacteria in the bacterial solution containing E. coli and tap water (chlorine removed) was measured. First, these liquid samples were dropped with a pipette from the top of a black membrane filter having a pore diameter of 0.45 μm and a diameter of 9 mm deposited on a surface, and suction filtered. Since the membrane filter may touch the surface as it is and is difficult to handle, the membrane filter was used by covering the periphery with a resin frame and integrating them (see FIG. 5). The suction filtration pressure cannot be filtered if the degree of suction is too weak, and if the degree of suction is too high, it will not only damage microorganisms, but the membrane filter may be damaged, so a pump around 100 to 400 Torr. The pressure was set. When filtering a liquid sample on a membrane filter, it is necessary to disperse luminescent materials such as microorganisms as uniformly as possible from the viewpoint of easy counting and accuracy. Therefore, in order to make the filtration performance of the membrane filter uniform, filter paper or the like is sandwiched in the suction port below the membrane filter, and the suction pressure is diffused so that the suction pressure is uniformly applied to the entire filter. Separately, in order to reduce the passage resistance of the membrane filter pores, a small amount of surfactant diluent (Tween 200.1%) was filtered before the liquid sample was filtered. The liquid sample is E. coli. In the case of E. coli bacterial solution, 0.1 mL was filtered, and in the case of tap water, 20 mL was filtered.
Subsequently, fluorescent staining was performed on the microorganisms collected on the membrane filter. As the staining reagent, SYTO24, which is a viable and dead bacteria staining reagent, and SYTOX Orange (both trade names), which are dead bacteria staining reagents, were used. Since these staining reagents absorb light easily in the air and are easily decomposed, they were adjusted to 500 μM with dimethyl sulfoxide, and dispensed into microtubes in small amounts as stock solutions and stored. For storage, nitrogen was sealed in a microtube and stored in a dark place with a minus 20 ° C. freezer. The required number was thawed, and the diluent was added to 10 μL of each reagent so that the total amount was 1 mL, and mixed. This diluted solution must be excellent in reagent solubility, storage stability, cell permeability, and drying prevention properties, and should have low autofluorescence. D-sorbitol is distilled as a material satisfying such conditions. Diluted to about 50% with water and mixed with Tris-HCl and a small amount of surfactant (Tween 20) were used.
Reagents adjusted to a final concentration of 5 μM were dropped from above the membrane filter where microorganisms were collected one by one, stained at room temperature for several minutes, and excess reagents were removed by suction filtration. The order of staining is not limited, and the staining can be performed in the same manner regardless of whether the staining reagent is viable or dead.
After staining, the excess reagent was removed as much as possible by suction, and then the membrane filter was placed in a microorganism counter and measured.
The microbe counting apparatus is the same as that shown in FIG. 1, but this time, a blue light emitting diode (about 470 nm) and a green light emitting diode (about 530 nm) are used, and the green color is transmissive from 530 to 550 nm as a light receiving filter. Those having a red color and those having a transmittance from 590 to 610 nm were used. The light source is provided with a condensing lens so that the light beam can be easily irradiated onto the imaging range.
In addition, the membrane filter installation stage is provided with a detachable mechanism, and the stage member has high flatness, and this is pressed from the back side of the membrane filter to improve the flatness of the filter and to acquire images. Therefore, the focus can be fixed at a height that fits on the filter, eliminating the need for focus adjustment. The stage to which the membrane filter is fixed can be moved by a motor-driven XY stage, and can be continuously moved to a position designated in advance by a program.
The fluorescence image on the surface of the membrane filter was obtained using a single plate monochrome CCD camera with an infrared cut filter installed above the membrane filter and a magnifying lens system. When acquiring an image, the LED that is the excitation light is turned on and illuminated, and the light receiving filter can be switched to acquire an image of the desired wavelength. These cameras, light sources, filters, and stages operate as follows. It was controlled using a programmed microcomputer.
Images are acquired at the same position using three types of images (a) blue excitation, green fluorescence, (b) blue excitation, red fluorescence, and (c) green excitation, red fluorescence, with an exposure time from 0.1. The image is continuously acquired in about 10 seconds, moved to the next imaging region by the stage, and similarly acquired. In addition, at the beginning of the measurement, an image was acquired without turning on the light emitting diode, and an image including only dot missing was acquired.
The focal position is adjusted in advance according to the lens height. To confirm the focal position, an inspection chip in which fluorescent particles are fixed on the membrane filter surface of the collecting means was prepared, and this image was acquired and judged.
FIG. 6 shows a graph of the height of the inspection chip and the value obtained by dividing the object area of the acquired image by the maximum luminance value and a method for determining the depth of focus range. The graph obtains an image at each position while changing the focal length between the inspection chip and the lens, obtains the area of the light emitting point in the image and the maximum luminance value by dividing the area by the maximum luminance value, and calculates the height. Plotted for each. As fluorescent particles, red fluorescent particles having green fluorescence and red fluorescence with blue excitation light and red fluorescence with green excitation light (maximum absorption wavelength is 540 nm, absorption range is 500 to 570 nm, maximum fluorescence wavelength is 610 nm, fluorescence range is 550 to 660 nm) was used. Images for determining the depth of focus range need not be acquired for all three types of images as long as the chromatic aberration of the optical system is corrected. Usually, the shorter the wavelength, the narrower the depth of focus range. Therefore, when observing a plurality of wavelengths, it can be said that if the combination of the shortest wavelengths is selected, all the wavelengths used will fall within the focal depth range. In this case, an image of green fluorescence with blue excitation light was used. At this time, since a curve having a lower value is obtained as the position is closer to the focal position, the smaller the value, the closer to the focal position. By setting an effective focal depth range from the acquired image and using it as the line 33 indicating the determination upper limit value of the focal depth range at that time, it is possible to determine whether it is the focal depth range. These are incorporated in the program software as focus determination means, and are executed in conjunction with the acquisition of the inspection chip image.
After all the images were acquired, dot missing removal, light emission point extraction, and collation were performed by the calculation means, and data for which the luminance value and area were obtained for each light emission point was created.
FIG. The maximum luminance value and area graph of fine particles in E. coli and tap water and the classification method by area luminance judging means are shown. The obtained luminance values were plotted on the horizontal axis and the area on the vertical axis. E. The plot 34 indicating E. coli showed a linear correlation with a slope of 0.05, whereas the plot 35 showing fine particles in tap water was a correlation with a slope of 0.65, which was greatly different. On the other hand, a primary straight line 36 indicating the area luminance upper limit value and a primary straight line 37 indicating the area luminance lower limit value are provided, and those within this range are determined as microorganisms. At this time, the area luminance upper limit value is determined. The intercept was set to 5 and the slope was 0.04, and the intercept of the area luminance lower limit value was set to -2 and the slope was 0.04.
(A) in FIG. As for the luminescent spots seen in E. coli and tap water, the brightness of green fluorescence due to blue excitation, which is the fluorescence wavelength of SYTO24, which is a dying bacteria staining reagent, and the red fluorescence due to green excitation, which is the fluorescence wavelength of SYTOX Orange, which is a death bacteria staining reagent. This is a dot plot created with brightness on two axes.
At this time, as a boundary line that can be arbitrarily set, a straight line such that c is y = 100 and d is x = y is set, and an area that is smaller than c and smaller than d is a viable group, and other areas are dead. Designated as a fungal group, flags were set for the luminescent spots in the corresponding area, and the luminescent spots were classified.
Next, the value of x and y among the chromaticity data in the XYZ color system was plotted on the graph for the group of luminous point data classified as the viable bacteria group ((b) of FIG. 8). At this time, E.I. E. coli live bacteria were distributed in the region of x <0.37 and y> 0.54, whereas the luminescent materials in tap water had x of 0.3 to 0.6 and y of 0.3 to 0.00. 6 was confirmed to be distributed over a wide area. At this time, the threshold value is E.E. The value is set with reference to the value of E. coli, x is e = 0.37, y is f = 0.54, and the group classified into the region of x <e, y> f is identified as a microorganism and included in tap water Distinguishable from impurities. As a result, most of the luminescent spots derived from the impurities can be separated out of the detected luminescent spots, and in tap water, the viable cell group is derived from 100 luminescent spots by the life / death determining means as shown in FIG. As a result, 32 light-emitting points were extracted, and it was possible to determine that 8 of them were viable microorganisms by (b) of FIG.
This threshold is an example, but the threshold varies depending on the type of fluorescent dye used for staining, the concentration, the polarity of the solution to be diluted, and so on. It is preferable to keep it.
In addition, since there are bacteria that are difficult to culture, the appropriateness of the final number of bacteria is preferably evaluated by using a combination of appropriate culture methods and types of media.
(Example 2)
FIG. It is the setting result of the setting method of the threshold value for discriminating between live bacteria and dead bacteria in the viability determination means for E. coli (example using a polygonal line as a boundary line). Of the luminance information of the light emission points that have been collated and combined, the dot plot display means 38 in which the luminances of the first and second staining reagents are taken on the x-axis and the y-axis and the data correspond to each other, and further on this dot plot By operating the cursor 39, the starting point 40, the vertex a41, the vertex b42, and the end point 43 of the polygonal line for setting the threshold value for classifying the plot are set. The set polygonal line 44 was calculated on the program, and a threshold value was obtained. As a result of discriminating and counting, it was possible to easily measure as 120 live bacteria groups and 80 dead bacteria groups.
(Example 3)
FIG. It is a setting result of the setting method of the threshold value for discriminating between live bacteria and dead bacteria in the viability determination means for E. coli (example using a polygon as a boundary line). By operating the cursor 39 on the displayed dot plot display means 38, the polygon starting point 45 of the area to be selected and the vertex d49 are set continuously from the vertex a46 through the vertex b47 and vertex c48, and the vertex Finally, a polygon was set to match the starting point. A threshold value was automatically calculated for the set polygon 50, and when the area was designated as dead by a check box, the number of dead bacteria could be detected as 78.
Example 4
FIG. It is the setting result of the setting method of the threshold value for discriminating between live bacteria and dead bacteria in the viability determination means for E. coli (example using an ellipse as a boundary line). By operating the cursor 39 on the displayed dot plot display means 38, the elliptical center 51 of the area to be selected, the long axis 52 or the short axis 53, the long axis length 54, and the angle of the long axis 55 was set. When the ellipse a56 and the ellipse b57 were set as dead bacteria and damaged bacteria, respectively, 72 dead bacteria and 9 damaged bacteria were detected.
By extracting numerical values of the center coordinates of the ellipse and the length and angle of the major axis for each group, the group can be defined as a feature parameter indicating the characteristics of the group of microorganisms. Each value indicates a variety of bacterial species and various active states. By comparing the values, for example, even the same dead bacteria, the degree of damage and the ease of microbial damage. Etc. can be compared. In the case of FIG. 11, it can be estimated that the area surrounded by the ellipse a56 that has a large ellipse major axis and is strongly stained with the killed bacteria staining reagent has a higher degree of damage to the killed bacteria. did it.
(Example 5)
FIG. 6 is a setting result of a threshold value setting method (an example of a classification method by region designation) for discriminating between viable and dead bacteria in a viability determination means for E. coli. FIG. FIG. 12B is a diagram showing areas to be selected when A, F, K, and P are designated in the two-fluorescence luminance dot plot display means 38 of E. coli. FIG. 12B shows the areas and numbers of the dot plot display means 38. FIG. For the displayed dot plot display means 38, the vertical and horizontal directions are divided in advance into N = 5 and M = 5, for a total of 25 areas, and addresses are provided in advance in each area so that the luminance is 50 each, and a number (A To Y). Next, from the plot results, dead cells were set as A, F, K, and P, and the number of dead cells in the region was calculated. As a result, 97 cells were detected.
本発明は、細胞および微生物を含んだ検体から蛍光染色を用いて微生物の生菌および死菌を検出して計数するための装置であって、従来から知られている装置と比較してより正確性を持たせた計数を行うことができる微生物計数装置、点検用チップを提供することができ、医療用、食品工場用、家庭用、業務用、産業用などの微生物計数、微生物計数による環境管理などの用途にも適用できる。 The present invention is an apparatus for detecting and counting microorganisms living and dead from a specimen containing cells and microorganisms using fluorescent staining, and is more accurate than a conventionally known apparatus. Microbiological counting device and inspection chip that can perform counting with certain characteristics can be provided, microbial counting for medical use, food factory use, home use, business use, industrial use, etc., environmental management by microbial counting It can be applied to other uses.
１ 微生物計数装置
２ 励起光源
３ 励起フィルタ
４ 集光レンズ
５ ハイパスフィルタ
６ 受光フィルタ
７ レンズユニット
８ 受像素子
９ 検査台
１０ メンブレンフィルタ
１１ ＣＣＤユニット
１２ 演算手段
１３ 輝点除去手段
１４ 発光点抽出手段
１５ 座標補正手段
１６ 発光点照合手段
１７ 出力手段
１８ 蛍光評価手段
１９ 有効エリア算出手段
２０ 色度算出手段
２１ 生死判断手段
２２ 微生物判断手段
２３ 面積輝度判断手段
２４ メインウィンドウ
２５ 表示ウィンドウ
２６ 色彩表示オブジェクト
２７ 背景
２８ 点検用チップ
２９ メンブレンフィルタ
３０ メンブレンフィルタ押さえリング
３１ 点検用チップ外枠
３２ 蛍光粒子
３３ 焦点深度範囲の判定上限値を示す線
３４ Ｅ．ｃｏｌｉを示すプロット
３５ 水道水中の微粒子を示すプロット
３６ 面積輝度上限値を示す一次直線
３７ 面積輝度下限値を示す一次直線
３８ ドットプロット表示手段
３９ カーソル
４０ 始点
４１ 頂点ａ
４２ 頂点ｂ
４３ 終点
４４ 多角線
４５ 始点
４６ 頂点ａ
４７ 頂点ｂ
４８ 頂点ｃ
４９ 頂点ｄ
５０ 多角形
５１ 中心
５２ 長軸
５３ 短軸
５４ 長軸の長さ
５５ 長軸の角度
５６ 楕円形ａ
５７ 楕円形ｂ
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Microorganism counter 2 Excitation light source 3 Excitation filter 4 Condensing lens 5 High pass filter 6 Light receiving filter 7 Lens unit 8 Image receiving element 9 Inspection table 10 Membrane filter 11 CCD unit 12 Calculation means 13 Bright spot removal means 14 Luminescence point extraction means 15 Coordinate correction means 16 Luminescent point matching means 17 Output means 18 Fluorescence evaluation means 19 Effective area calculation means 20 Chromaticity calculation means 21 Life / death judgment means 22 Microorganism judgment means 23 Area luminance judgment means 24 Main window 25 Display window 26 Color display object 27 Background 28 Inspection Chip 29 Membrane Filter 30 Membrane Filter Holding Ring 31 Inspection Chip Outer Frame 32 Fluorescent Particles 33 Line 34 Showing the Upper Limit of Depth of Focus Range E. Plot 35 showing E. coli Plot showing fine particles in tap water Primary line 37 showing area luminance upper limit value Primary line 38 showing area luminance lower limit value Dot plot display means 39 Cursor 40 Start point 41 Vertex a
42 Vertex b
43 End point 44 Polygon line 45 Start point 46 Vertex a
47 Vertex b
48 Vertex c
49 Vertex d
50 polygon 51 center 52 major axis 53 minor axis 54 major axis length 55 major axis angle 56 oval a
57 oval b
Claims (17)
前記蛍光評価手段で発光点の面積および輝度値から生菌または死菌または夾雑物であるかを判断する面積輝度判断手段を備えることを特徴とする微生物計数装置。 On the above-mentioned collecting means stained with a placing means for collecting a collecting means for collecting microorganisms, and a living and dead bacteria staining reagent for staining live and dead bacteria and a dead bacteria staining reagent for staining dead bacteria. A fluorescence image acquisition means for acquiring a fluorescence image of the microorganism, a light emission point detection means for detecting a light emission point from the fluorescence image acquired by the fluorescence image acquisition means, and a light emission point detected by the light emission point detection means. In a microbe counting apparatus provided with a fluorescence evaluation means for judging whether it is any of bacteria, dead bacteria, and contaminants,
A microbe counting apparatus, comprising: an area brightness judgment means for judging whether the fluorescence evaluation means is a live bacterium, a dead bacterium, or a contaminant from the area and brightness value of a light emitting point.
The inspection chip according to claim 15 or 16, wherein a marker that can be used for both coordinate correction and determination of a focal position is fixed on a surface.
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