JP2008029205A

JP2008029205A - Diagnostic method using nucleic acid amplification

Info

Publication number: JP2008029205A
Application number: JP2005129830A
Authority: JP
Inventors: Yoshihide Hayashizaki; 崎良英林; Toshizo Hayashi; 利藏林; Yasumasa Mitani; 谷康正三
Original assignee: Dnaform KK; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Dnaform KK; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2005-04-27
Filing date: 2005-04-27
Publication date: 2008-02-14

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for rapidly and accurately detecting a disease-associated cell or a cell originating therefrom, which is contained in a first specimen, from a second specimen. <P>SOLUTION: The method of detecting a disease-associated cell or a cell originating therefrom, which is contained in a first specimen obtained from a subject, from a second specimen comprises (a) a step for detecting a gene mutation associating the disease as described above in a genome contained in the first specimen, (b) a step for detecting the above-described gene mutation in a genome contained in the second specimen and (c) a step for comparing the gene mutation detected in the first specimen with the gene mutation detected in the second specimen. In this method, it is pointed out that a disease-associated cell or a cell originating therefrom, which is contained in the first specimen, is detected from the second specimen in the case where the gene mutations thus detected are the same as each other. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

発明の背景Background of the Invention

発明の分野
本発明は、疾患に関連する細胞または組織の迅速な遺伝子診断法に関する。 FIELD OF THE INVENTION This invention relates to rapid genetic diagnostic methods for cells or tissues associated with disease.

背景技術
様々な疾患において、その疾患に特異的な性質を有する細胞が知られている。例えば、癌細胞としては、同じ組織の癌においても様々な性質のものが知られている。さらに、このような癌細胞の性質によって、治療用薬剤の効果、癌の進行、予後などが異なることが知られている。よって、癌細胞の性質を調べて癌を分子生物学的手法により分類することにより、薬剤の選択、治療法の選択、手術の際の術式の選択などに関連する重要な情報が提供される。 Background Art In various diseases, cells having properties specific to the disease are known. For example, cancer cells having various properties are known even in cancer of the same tissue. Furthermore, it is known that the effects of therapeutic drugs, cancer progression, prognosis, etc. differ depending on the nature of such cancer cells. Therefore, by investigating the nature of cancer cells and classifying cancer by molecular biology techniques, it provides important information related to drug selection, treatment selection, surgical procedure selection, etc. .

疾患に関連する細胞の性質を診断するためには、その疾患の病巣部から組織を採取し、これに含まれる細胞の特性を検査することが考えられる。例えば、癌の診断を行なうためには、癌組織を生検によって採取し、該組織に含まれる細胞の特性を調べることが考えられる。しかし、従来の検査技術では、検査結果が得られるまでに長時間を要する。従って、疾患に関連する細胞または組織の迅速な検査を可能とする技術が必要とされている。 In order to diagnose the nature of a cell associated with a disease, it is conceivable to collect a tissue from the lesion of the disease and examine the characteristics of the cells contained therein. For example, in order to diagnose cancer, it is conceivable to collect cancer tissue by biopsy and examine characteristics of cells contained in the tissue. However, in the conventional inspection technique, it takes a long time to obtain an inspection result. Therefore, there is a need for a technique that enables rapid examination of cells or tissues associated with a disease.

近年、癌などの疾病の分子生物学的な研究が進んでおり、癌細胞などの疾患関連細胞に特異的な遺伝子変異などが数多く見出されている。 In recent years, research on molecular biology of diseases such as cancer has progressed, and many gene mutations specific to disease-related cells such as cancer cells have been found.

一方で、遺伝子中の標的領域を増幅しうる様々な核酸増幅法が開発されており、このような方法としては、最も良く知られているＰＣＲ法（特許文献１：米国特許第４６８３１９５号明細書；特許文献２：米国特許第４６８３２０２号明細書；および特許文献３：米国特許第４８００１５９号明細書）をはじめとして、ＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法（非特許文献１：Trends in Biotechnology 10, pp146-152, 1992）などが知られている。 On the other hand, various nucleic acid amplification methods capable of amplifying a target region in a gene have been developed. As such a method, the most well-known PCR method (Patent Document 1: US Pat. No. 4,683,195) Patent Document 2: US Pat. No. 4,683,202; and Patent Document 3: US Pat. No. 4,800,159), and RT-PCR method using RNA as a template (Non-patent Document 1: Trends in Biotechnology 10, pp146-152, 1992).

核酸増幅方法としてはまた、ＰＣＲ法のような複雑な温度調節を必要としない等温増幅法が知られており、例えば、鎖置換増幅法（ＳＤＡ法；特許文献４：特公平７−１１４７１８号公報）、自己維持配列増幅法（３ＳＲ法）、Ｑβレプリカーゼ法（特許文献５：日本国特許第２７１０１５９号公報）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献６：日本国特許第２６５０１５９号公報）、ＬＡＭＰ法（特許文献７：国際公開第００／２８０８２号パンフレット）、ＩＣＡＮ法（特許文献８：国際公開第０２／１６６３９号パンフレット）、ローリングサークル法、国際公開第２００４／０４００１９号パンフレット（特許文献９）に記載の方法などが知られている。 As a nucleic acid amplification method, an isothermal amplification method that does not require complicated temperature control such as PCR method is known. For example, strand displacement amplification method (SDA method; Patent Document 4: Japanese Patent Publication No. 7-114718) ), Self-sustained sequence amplification method (3SR method), Qβ replicase method (Patent Literature 5: Japanese Patent No. 2710159), NASBA method (Patent Literature 6: Japanese Patent No. 2650159), LAMP method (Patent Literature) 7: International Publication No. 00/28082 pamphlet), ICAN method (Patent Document 8: International Publication No. 02/16639 pamphlet), rolling circle method, International Publication No. 2004/040019 pamphlet (Patent Document 9) Etc. are known.

さらに、核酸増幅法を利用した遺伝子変異の検出法として、上記のＬＡＭＰ法を用いた変異検出法（特許文献１０：特開２００３−１５９１００号公報）、国際公開第０１／３４８３８号パンフレット（特許文献１１）に記載の方法などが知られている。 Furthermore, as a method for detecting a gene mutation using a nucleic acid amplification method, the above-described mutation detection method using the LAMP method (Patent Document 10: JP-A-2003-159100), WO 01/34838 (Patent Document) The method described in 11) is known.

米国特許第４６８３１９５号明細書US Pat. No. 4,683,195 米国特許第４６８３２０２号明細書US Pat. No. 4,683,202 米国特許第４８００１５９号明細書U.S. Pat. No. 4,800,159 特公平７−１１４７１８号公報Japanese Patent Publication No.7-111418 日本国特許第２７１０１５９号公報Japanese Patent No. 2710159 日本国特許第２６５０１５９号公報Japanese Patent No. 2650159 国際公開第００／２８０８２号パンフレットInternational Publication No. 00/28082 Pamphlet 国際公開第０２／１６６３９号パンフレットWO 02/16639 pamphlet 国際公開第２００４／０４００１９号パンフレットInternational Publication No. 2004/040019 Pamphlet 特開２００３−１５９１００号公報JP 2003-159100 A 国際公開第０１／３４８３８号パンフレットInternational Publication No. 01/34838 Pamphlet Trends in Biotechnology 10, pp146-152, 1992Trends in Biotechnology 10, pp146-152, 1992

発明の概要Summary of the Invention

本発明者らは、被験者から得られた第一の検体および第二の検体をサンプルとして、疾患に関連する遺伝子変異を検出し、前記第一の検体と第二の検体との間で検出結果を比較することにより、第一の検体に含まれる疾患に関連する細胞またはこれに由来する細胞を第二の検体において迅速かつ正確に検出することができることを見出した。本発明はこれら知見に基づくものである。 The present inventors detected a genetic mutation associated with a disease using the first specimen and the second specimen obtained from the subject as samples, and the detection result between the first specimen and the second specimen. It was found that cells related to a disease contained in the first specimen or cells derived therefrom can be detected quickly and accurately in the second specimen. The present invention is based on these findings.

従って、本発明の目的は、第一の検体に含まれる疾患関連細胞またはこれに由来する細胞を第二の検体において迅速かつ正確に検出する方法を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for rapidly and accurately detecting a disease-related cell or a cell derived therefrom contained in a first specimen in a second specimen.

そして、本発明による疾患関連細胞の検出法は、被験者からの第一の検体に含まれる疾患に関連する細胞またはこれに由来する細胞を、第二の検体において検出する方法であって、
（ａ）第一の検体に含まれるゲノムにおいて、前記疾患に関連する遺伝子変異を検出する工程、
（ｂ）第二の検体に含まれるゲノムにおいて、前記遺伝子変異を検出する工程、ならびに
（ｃ）第一の検体から検出された遺伝子変異と第二の検体から検出された遺伝子変異とを比較する工程
を含んでなり、検出された遺伝子変異が相互に同一である場合に、第一の検体に含まれる疾患関連細胞またはこれに由来する細胞が第二の検体から検出されたことが示される方法である。 The method for detecting a disease-related cell according to the present invention is a method for detecting a cell related to a disease contained in a first sample from a subject or a cell derived therefrom in a second sample,
(A) detecting a genetic mutation associated with the disease in the genome contained in the first specimen;
(B) detecting the gene mutation in the genome contained in the second specimen, and (c) comparing the gene mutation detected from the first specimen with the gene mutation detected from the second specimen. A method comprising the step of showing that a disease-related cell contained in the first specimen or a cell derived therefrom is detected from the second specimen when the detected gene mutations are identical to each other It is.

本発明によれば、異なる時期に採取された複数の検体、または生体中の異なる部位から採取された複数の検体において、一つの検体に含まれる疾患関連細胞またはこれに由来する細胞が他の検体に含まれているか否かを迅速かつ正確に調べることが可能となる。特に、本発明による検出法は短時間で実施できるため、手術中に検出結果を得ることも可能である。 According to the present invention, among a plurality of specimens collected at different times or a plurality of specimens collected from different sites in a living body, a disease-related cell contained in one specimen or a cell derived therefrom is another specimen. It is possible to quickly and accurately check whether it is included. In particular, since the detection method according to the present invention can be carried out in a short time, it is also possible to obtain a detection result during surgery.

発明の具体的説明Detailed description of the invention

本発明による疾患関連細胞の検出法では、被験者からの第一の検体および第二の検体について、それぞれに含まれるゲノムから、疾患に関連する遺伝子変異が検出される。 In the method for detecting a disease-related cell according to the present invention, a gene mutation associated with a disease is detected from the genome contained in each of the first sample and the second sample from the subject.

第一の検体は、目的とする疾患に関連する細胞を含むものであればよく、その疾患に応じて当業者であれば適宜選択することができる。このような第一の検体としては、例えば、目的とする疾患の治療前における病巣の中心部から採取した組織を用いることができる。第二の検体は、第一の検体に含まれる疾患関連細胞またはこれに由来する細胞の有無またはその量を調べる対象となる検体であり、目的とする疾患に応じて当業者により適宜選択される。例えば、目的とする疾患が癌である場合には、第二の検体は、その癌の原発巣の周辺組織または転移の疑われる部位の組織などとすることができる。また、疾患の病巣部を外科的手術により摘出する場合には、第一の検体を手術の前にバイオプシー等によって採取し、第二の検体を手術中に採取してもよく、あるいは、第一の検体を手術中に採取し、第二の検体を手術後にバイオプシー等によって採取してもよい。 The first specimen only needs to contain cells related to the target disease, and can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the disease. As such a first specimen, for example, a tissue collected from the center of a lesion before treatment of the target disease can be used. The second sample is a sample to be examined for the presence or amount of the disease-related cells or cells derived therefrom contained in the first sample, and is appropriately selected by those skilled in the art depending on the target disease. . For example, when the target disease is cancer, the second specimen can be a tissue around the primary lesion of the cancer or a tissue suspected of metastasis. Further, when the lesion part of the disease is removed by surgical operation, the first sample may be collected by biopsy or the like before the operation, and the second sample may be collected during the operation. The sample may be collected during the operation, and the second sample may be collected by a biopsy or the like after the operation.

本発明の一つの実施態様によれば、第一の検体は目的とする疾患の治療前に採取されたものとされ、第二の検体は前記疾患の治療中または治療後に採取されたものとされる。このような治療は目的とする疾患に応じて当業者により適宜選択されるが、例えば、薬物療法、放射線療法、温熱療法、ホルモン療法、免疫療法、外科的治療等が挙げられる。この実施態様では、治療前に存在していた疾患関連細胞がその疾患の治療により消滅したか否か、または治療による該細胞の数の変化を調べることができ、これにより治療効果を評価することが可能となる。 According to one embodiment of the present invention, the first sample is collected before the treatment of the target disease, and the second sample is collected during or after the treatment of the disease. The Such treatment is appropriately selected by those skilled in the art depending on the target disease, and examples thereof include drug therapy, radiation therapy, thermotherapy, hormonal therapy, immunotherapy, and surgical treatment. In this embodiment, it is possible to examine whether the disease-related cells that existed before the treatment have disappeared due to the treatment of the disease, or the change in the number of the cells due to the treatment, thereby evaluating the therapeutic effect Is possible.

本発明の他の実施態様によれば、第一の検体は目的とする疾患の病巣部から採取されたものとされ、第二の検体は他の部位から採取されたものとされる。この実施態様では、目的とする疾患の病巣部に見られる疾患関連細胞が、病巣部の周辺をはじめとする他の部位に存在するか否か、またはその存在量を調べることができ、これにより該疾患の原発巣から他の部位への転移（例えば、癌転移）を評価することが可能となる。 According to another embodiment of the present invention, the first sample is collected from the lesion of the target disease, and the second sample is collected from another site. In this embodiment, it is possible to examine whether or not disease-related cells found in the lesion of the target disease are present in other sites including the periphery of the lesion, or the abundance thereof. It becomes possible to evaluate metastasis (for example, cancer metastasis) from the primary lesion of the disease to another site.

疾患に関連する細胞は、その疾患に関連する遺伝子変異、好ましくはその疾患に特異的な遺伝子変異を有するものであり、目的とする疾患に応じて当業者により適宜選択される。様々な疾患についてこれに関連する遺伝子変異が知られており、当業者であればこれらの疾患と遺伝子変異との組み合わせを適宜利用することが可能である。このような遺伝子変異としては、例えば、癌に特異的なｐ５３遺伝子における変異が挙げられる。また、疾患関連細胞に由来する細胞は、疾患関連細胞そのものではないものの、該疾患の原発巣以外の部位において疾患関連細胞から***し、増殖した細胞である。従って、疾患関連細胞に由来する細胞は、疾患関連細胞と同じ遺伝子型を有する。 A cell associated with a disease has a gene mutation associated with the disease, preferably a gene mutation specific to the disease, and is appropriately selected by those skilled in the art depending on the target disease. Genetic mutations related to this are known for various diseases, and those skilled in the art can appropriately use combinations of these diseases and genetic mutations. Examples of such gene mutations include mutations in the p53 gene specific for cancer. A cell derived from a disease-related cell is not a disease-related cell itself, but is a cell that has proliferated by dividing from a disease-related cell at a site other than the primary lesion of the disease. Accordingly, cells derived from disease-related cells have the same genotype as disease-related cells.

本発明の好ましい実施態様によれば、疾患関連細胞は癌細胞または類癌腫細胞とされる。この実施態様では、第一の検体および第二の検体に含まれるゲノムにおいて、癌に特異的な遺伝子変異が検出される。第一の検体を原発巣の癌組織とし、第二の検体を原発巣の周辺部からの組織とすることにより、癌の浸潤または転移を評価することができる。また、第一の検体を原発巣の癌組織とし、第二の検体を他の部位からの組織とすることにより、その部位への癌の転移を評価することができる。さらに、第一の検体を原発巣の癌組織とし、第二の検体を他の部位に存在する癌組織とすることにより、その部位に存在する癌組織が前記原発巣からの転移癌であるか否かを評価することができる。 According to a preferred embodiment of the present invention, the disease-related cell is a cancer cell or a carcinoma cell. In this embodiment, cancer-specific gene mutations are detected in the genomes contained in the first specimen and the second specimen. Cancer invasion or metastasis can be evaluated by using the first specimen as a cancer tissue of the primary lesion and the second specimen as a tissue from the periphery of the primary lesion. In addition, by using the first specimen as a primary cancer tissue and the second specimen as a tissue from another site, metastasis of cancer to that site can be evaluated. Further, whether the first specimen is a cancer tissue at the primary lesion and the second specimen is a cancer tissue present at another site, so that the cancer tissue present at that site is metastatic cancer from the primary lesion. You can evaluate whether or not.

癌細胞に特異的な遺伝子変異は数多く知られているが、中でも最も多いのがｐ５３遺伝子の変異である。この遺伝子から発現するｐ５３タンパク質は転写因子の一つであり、細胞周期、アポトーシス、およびＤＮＡ修復の制御を行ない、個体レベルでの変異の蓄積（癌化など）を防ぐ役割を果たしている。ヒトの癌では、その５０％以上の症例においてｐ５３遺伝子の変異が見られ、その中の８０％がアミノ酸置換を伴う点突然変異である。この変異率は他に知られている癌遺伝子と比較してかなり高くなっている。ｐ５３タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質であり、癌で見られる変異の多くはＤＮＡ結合ドメインに集中している。さらに、ｐ５３遺伝子の中でも際だって変異の集中するホットスポットが報告されている（Lopez M et al., Use of cytological specimens for p53 gene alteration detection in oral squamous cell carcinoma risk patients. Clin. Oncol. (R Coll Radiol). 2004 Aug; 16(5): 366-70；Soussi T et al., Reassessment of the TP53 mutation database in human disease by data mining with a library of TP53 missense mutations, Hum. Mutat. 25(1): 6-17, 2004；Sudhir Srivastava, et al., Biomarkers for Early Detection of Colon Cancer, Clinical Cancer Research vol. 7, 1118, 2001；Thierry Soussi, et al., Significance of TP53 Mutation in Human Cancer: A Critical Analysis of Mutations at CpG Dinucleotides, Human. Mutation Vol.21, 192, 2003）。また、臓器によって変異の頻度や変異のおこりやすい位置は異なる。ヒトの癌の中で、ｐ５３遺伝子の変異の頻度が高いものは、肺癌、大腸癌、膵臓癌などであり、これらの癌の７０％近くに変異が見られる。例えば、大腸癌に多く見られるｐ５３遺伝子中の変異は、第１７５コドン、第２４８コドン、および第２７３コドンに見られるＣＧでの変異であり、次いで第１９６コドン、第２１３コドン、第２４５コドン、第２８２コドンなどに変異が集中する傾向がある。点突然変異の種類にも明確な傾向があり、圧倒的にＧＣからＡＴへのトランスバージョンが多い。本発明による検出法においては、このような遺伝子変異のいずれか１つまたは２以上の組み合わせを用いることができる。 Many gene mutations specific to cancer cells are known, but the most common are mutations in the p53 gene. The p53 protein expressed from this gene is one of transcription factors, and controls the cell cycle, apoptosis, and DNA repair, and plays a role in preventing the accumulation of mutations (such as canceration) at the individual level. In human cancers, mutations in the p53 gene are seen in more than 50% of the cases, 80% of which are point mutations with amino acid substitutions. This mutation rate is considerably higher than other known oncogenes. The p53 protein is a DNA binding protein, and many of the mutations found in cancer are concentrated in the DNA binding domain. In addition, a hot spot in which mutations are markedly concentrated in the p53 gene has been reported (Lopez M et al., Use of cytological specimens for p53 gene alteration detection in oral squamous cell carcinoma risk patients. Clin. Oncol. (R Coll 2004 Aug; 16 (5): 366-70; Soussi T et al., Reassessment of the TP53 mutation database in human disease by data mining with a library of TP53 missense mutations, Hum. Mutat. 25 (1): 6-17, 2004; Sudhir Srivastava, et al., Biomarkers for Early Detection of Colon Cancer, Clinical Cancer Research vol. 7, 1118, 2001; Thierry Soussi, et al., Significance of TP53 Mutation in Human Cancer: A Critical Analysis of Mutations at CpG Dinucleotides, Human. Mutation Vol. 21, 192, 2003). Moreover, the frequency of mutation and the position where the mutation is likely to occur vary depending on the organ. Among human cancers, those having a high frequency of mutations in the p53 gene are lung cancer, colon cancer, pancreatic cancer and the like, and mutations are found in nearly 70% of these cancers. For example, mutations in the p53 gene that are common in colorectal cancer are mutations in CG found at codons 175, 248, and 273, followed by codons 196, 213, 245, There is a tendency for mutations to concentrate at the 282nd codon and the like. There is also a clear tendency for the type of point mutation, and there are overwhelmingly many transversions from GC to AT. In the detection method according to the present invention, any one or a combination of two or more of such gene mutations can be used.

癌組織を摘出するための外科的手術では、実際の病巣部を直接観察することができ、より正確で細かな組織像の観察が可能となる。その際に医師が知りたい情報は、例えば、浸潤の程度、複数個の病巣が観察される場合におけるそれらの起源の同一性、転移の可能性などである。本発明による検出法によれば、これらの情報を手術中に得ることが可能となる。例えば、肺癌の摘出手術においては、原発巣の癌組織を第一の検体とし、胸腔内を洗浄して得られる洗浄液を第二の検体とすることにより、洗浄液中に存在する原発巣由来の癌細胞の有無を調べることができ、これにより、癌転移について正確に把握することが可能となる。癌転移についての正確な情報は、術式の決定に非常に有用である。また、原発巣の癌組織を第一の検体とし、原発巣の周辺部からの組織を第二の検体とすることにより、癌の浸潤および転移の有無を調べることができる。このような情報は、術式の決定、術後の治療法の選択、投与薬剤の選択、治療効果の判定などに有用である。 In a surgical operation for removing a cancer tissue, an actual lesion can be directly observed, and a more accurate and detailed tissue image can be observed. Information that the doctor wants to know at this time is, for example, the degree of infiltration, the identity of their origin when multiple lesions are observed, the possibility of metastasis, and the like. According to the detection method of the present invention, it is possible to obtain such information during surgery. For example, in the operation for removing lung cancer, the primary tissue cancer tissue is used as the first specimen, and the washing liquid obtained by washing the thoracic cavity is used as the second specimen. The presence or absence of cells can be examined, which makes it possible to accurately grasp cancer metastasis. Accurate information about cancer metastasis is very useful in determining surgical procedures. Further, by using the cancer tissue of the primary lesion as the first specimen and the tissue from the periphery of the primary lesion as the second specimen, the presence or absence of cancer invasion and metastasis can be examined. Such information is useful for determining a surgical procedure, selecting a postoperative treatment method, selecting a drug to be administered, and determining a therapeutic effect.

遺伝子変異の検出は、当技術分野において周知の標準的な方法、例えば、ＰＣＲを用いる方法、マイクロアレイを用いる方法、インベーダー法、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法、プライマーエクステンション法などによって行なうことができる。 Detection of gene mutation can be performed by standard methods well known in the art, such as a method using PCR, a method using a microarray, an invader method, a TaqMan PCR method, a primer extension method, and the like.

本発明の好ましい実施態様によれば、遺伝子変異の検出は、核酸増幅法によって行なわれる。核酸増幅法では、変異にかかるヌクレオチド残基を含む少なくとも一種のプライマーを用いることにより、増幅産物の有無によってその変異を検出することが可能となる。例えば、変異にかかるヌクレオチド残基として変異型のものを含むプライマーを用いる場合には、増幅産物の存在により該変異の存在が示される。このような方法では、目的とする遺伝子変異の有無が検出されるだけでなく、存在する変異型遺伝子を定量することも可能である。また、変異にかかるヌクレオチド残基として野生型のものを含むプライマーを用いる核酸増幅反応を同時に行なうことにより、野生型遺伝子と変異型遺伝子の存在比率を知ることも可能である。 According to a preferred embodiment of the present invention, the detection of the gene mutation is performed by a nucleic acid amplification method. In the nucleic acid amplification method, it is possible to detect the mutation based on the presence or absence of the amplification product by using at least one kind of primer including the nucleotide residue involved in the mutation. For example, when a primer containing a mutant type nucleotide residue is used, the presence of the mutation indicates the presence of the mutation. In such a method, it is possible not only to detect the presence or absence of the targeted gene mutation, but also to quantify the existing mutant gene. It is also possible to know the abundance ratio of the wild-type gene and the mutant gene by simultaneously performing a nucleic acid amplification reaction using a primer containing a wild-type nucleotide residue for mutation.

核酸増幅法としては、当業者に公知のいかなる方法を用いてもよいが、好ましくは等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするものとされる。このような等温核酸増幅法としては、例えば、ＬＡＭＰ法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）、ＩＣＡＮ法（国際公開第０２／１６６３９号パンフレット）、ＳＤＡ法（特公平７−１１４７１８号公報）、自立複製法、ＮＡＳＢＡ法（日本国特許第２６５０１５９号公報）、ＴＭＡ法、Ｑβレプリカーゼ法（日本国特許第２７１０１５９号公報）、国際公開第２００４／０４００１９号パンフレットに記載の方法等が挙げられる。 As a nucleic acid amplification method, any method known to those skilled in the art may be used, but preferably the target nucleic acid can be amplified by a reaction under isothermal conditions. Examples of such isothermal nucleic acid amplification methods include the LAMP method (International Publication No. 00/28082 pamphlet), the ICAN method (International Publication No. 02/16639 pamphlet), the SDA method (Japanese Patent Publication No. 7-114718), Examples thereof include a self-replicating method, NASBA method (Japanese Patent No. 2650159), TMA method, Qβ replicase method (Japanese Patent No. 2710159), and the method described in International Publication No. 2004/040019 pamphlet.

ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度条件下に保つことをいう。さらに、「ほぼ一定の温度条件」とは、設定された温度を正確に保持することのみならず、酵素およびプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。一定の温度条件下での核酸増幅反応は、使用する酵素の活性を維持できる温度に保つことにより実施することができる。また、この核酸増幅反応において、プライマーが標的核酸にアニーリングするためには、例えば、反応温度を、そのプライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、もしくはそれ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。従って、この温度は、好ましくは、約２０℃〜約７５℃であり、さらに好ましくは、約３５℃〜約６５℃とする。 Here, “isothermal” refers to maintaining an approximately constant temperature condition such that the enzyme and the primer can substantially function. Furthermore, the “substantially constant temperature condition” means that not only the set temperature is accurately maintained but also a temperature change that does not impair the substantial functions of the enzyme and the primer is allowed. To do. The nucleic acid amplification reaction under a certain temperature condition can be carried out by keeping the temperature at which the activity of the enzyme used can be maintained. In this nucleic acid amplification reaction, in order for the primer to anneal to the target nucleic acid, for example, the reaction temperature is preferably set to a temperature near or below the melting temperature (Tm) of the primer, The level of stringency is preferably set in consideration of the melting temperature (Tm) of the primer. Therefore, this temperature is preferably about 20 ° C to about 75 ° C, more preferably about 35 ° C to about 65 ° C.

本発明の特に好ましい実施態様によれば、等温核酸増幅法として、本発明者らによって開発された核酸増幅法が用いられる。該方法では、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも２種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである前記プライマーセットが用いられる。 According to a particularly preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid amplification method developed by the present inventors is used as the isothermal nucleic acid amplification method. In the method, a primer set comprising at least two kinds of primers capable of amplifying a target nucleic acid sequence, wherein the first primer contained in the primer set is a sequence (A A complementary sequence (Bc) of the sequence (B) which comprises a sequence (Ac ′) which hybridizes to the sequence (A)) at the 3 ′ end portion and which is 5 ′ to the sequence (A) in the target nucleic acid sequence A hybridizing sequence (B ′) is included on the 5 ′ side of the sequence (Ac ′), and the second primer included in the primer set is a 3 ′ end of a complementary sequence of the target nucleic acid sequence. A folded sequence (D-Dc ′) comprising a sequence (Cc ′) that hybridizes to the partial sequence (C) at the 3 ′ end portion and two nucleic acid sequences that hybridize to each other on the same strand 5 ′ side of the sequence (Cc ′) The above-mentioned primer set is used.

本発明において「ハイブリダイズする」とは、プライマーがストリンジェントな条件下で標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸以外の核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明によるプライマーとその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、使用するプライマーの融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを行なうと、プライマーを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、市販のプライマー構築ソフト、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Whitehead Institute for Biomedical Research社製）などを用いて設計することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある標的核酸にハイブリダイズするプライマーは、その標的核酸に相補的な核酸分子の全部または一部の配列を含んでなるものである。 In the present invention, “hybridize” means that the primer hybridizes to the target nucleic acid under stringent conditions and does not hybridize to nucleic acid molecules other than the target nucleic acid. The stringent conditions can be determined depending on the melting temperature Tm (° C.) of the duplex of the primer according to the present invention and its complementary strand, the salt concentration of the hybridization solution, etc., for example, J. Sambrook, Reference can be made to EF Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). For example, when hybridization is performed at a temperature slightly lower than the melting temperature of the primer to be used, the primer can be specifically hybridized to the target nucleic acid. Such a primer can be designed using commercially available primer construction software, such as Primer 3 (manufactured by Whitehead Institute for Biomedical Research). According to a preferred embodiment of the present invention, a primer that hybridizes to a target nucleic acid comprises a sequence of all or part of a nucleic acid molecule complementary to the target nucleic acid.

前記第一のプライマーによる核酸合成の作用機序を図１に模式的に示す。まず、鋳型となる核酸中の標的核酸配列を決定し、その標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）、および配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）を決定する。第一のプライマーは、配列（Ac'）を含んでなり、さらにその５’側に配列（B'）を含んでなる。配列（Ac'）は、配列（A）にハイブリダイズするものであり、配列（B'）は、配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズするものである。ここで、第一のプライマーは、前記配列（Ac'）と前記配列（B'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を含んでいてもよい。このようなプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせると、プライマー中の配列（Ac'）が標的核酸配列の配列（A）にハイブリダイズした状態となる（図１(a)）。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的核酸配列の相補配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の５’末端側に存在する配列（B'）が、同核酸中に存在する配列（Bc）にハイブリダイズし、これにより、合成された核酸の５’末端部分においてステム−ループ構造が形成される。その結果、鋳型核酸上の配列（A）が一本鎖となり、この部分に先の第一のプライマーと同一の配列を有する他のプライマーがハイブリダイズする（図１(b)）。その後、鎖置換反応により、新たにハイブリダイズした第一のプライマーからの伸長反応が起こると同時に、先に合成された核酸が鋳型核酸から分離される（図１(c)）。 The action mechanism of nucleic acid synthesis by the first primer is schematically shown in FIG. First, a target nucleic acid sequence in a nucleic acid to be a template is determined, and a sequence (A) at the 3 ′ end portion of the target nucleic acid sequence and a sequence (B) existing on the 5 ′ side of the sequence (A) are determined. . The first primer includes a sequence (Ac ′) and further includes a sequence (B ′) on the 5 ′ side thereof. The sequence (Ac ′) hybridizes to the sequence (A), and the sequence (B ′) hybridizes to the complementary sequence (Bc) of the sequence (B). Here, the first primer may include an intervening sequence that does not affect the reaction between the sequence (Ac ′) and the sequence (B ′). When such a primer is annealed to the template nucleic acid, the sequence (Ac ′) in the primer is hybridized to the sequence (A) of the target nucleic acid sequence (FIG. 1 (a)). When a primer extension reaction occurs in this state, a nucleic acid containing a complementary sequence of the target nucleic acid sequence is synthesized. Then, the sequence (B ′) present on the 5 ′ end side of the synthesized nucleic acid hybridizes to the sequence (Bc) present in the nucleic acid, and thereby the stem in the 5 ′ end portion of the synthesized nucleic acid. -A loop structure is formed. As a result, the sequence (A) on the template nucleic acid becomes a single strand, and another primer having the same sequence as the first primer hybridizes to this portion (FIG. 1 (b)). Thereafter, an extension reaction from the newly hybridized first primer occurs by the strand displacement reaction, and at the same time, the previously synthesized nucleic acid is separated from the template nucleic acid (FIG. 1 (c)).

上記の作用機序において、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズする現象は、典型的には、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。上記第一のプライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステム−ループ構造を形成することができる。このステムループ構造は安定的には存在しないが、その構造の形成により剥き出しとなった相補鎖部分（鋳型核酸上の配列（A））に同一の他のプライマーが結合し、すぐさまポリメラーゼが伸長反応を行うことにより、先に合成された鎖が置換されて遊離すると同時に、新たな二本鎖核酸を生成することができる。 In the above mechanism of action, the phenomenon in which the sequence (B ′) hybridizes to the sequence (Bc) typically occurs due to the presence of complementary regions on the same strand. In general, when a double-stranded nucleic acid is dissociated into a single strand, partial dissociation starts from its terminal or other relatively unstable part. In the double-stranded nucleic acid generated by the extension reaction using the first primer, the base pair of the terminal portion is in an equilibrium state of dissociation and binding at a relatively high temperature, and the double strand is maintained as a whole. In such a state, when a sequence complementary to the dissociated portion of the terminal is present on the same strand, a stem-loop structure can be formed as a metastable state. Although this stem-loop structure does not exist stably, the same other primer binds to the complementary strand part (sequence (A) on the template nucleic acid) exposed by the formation of the structure, and the polymerase immediately extends. By performing the above, a previously synthesized strand is replaced and released, and at the same time, a new double-stranded nucleic acid can be generated.

本発明の好ましい実施態様における第一のプライマーの設計基準は次のとおりである。まず、プライマーの伸長により鋳型核酸の相補鎖が合成された後に新たなプライマーが効率よく同鋳型核酸にアニーリングするためには、合成された相補鎖の５’末端におけるステム−ループ構造形成により、鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とする必要がある。そのためには、配列（Ac'）の塩基数Ｘと標的核酸配列中における前記配列（A）と前記配列（B）に挟まれた領域の塩基数Ｙとの差（Ｘ−Ｙ）の、Ｘに対する割合（Ｘ−Ｙ）／Ｘが重要となる。ただし、鋳型核酸上において配列（A）よりも５’側に存在する、プライマーのハイブリダイズとは関係無い部分まで一本鎖とする必要はない。また、新たなプライマーが効率よく鋳型核酸にアニーリングするためには、上述のステム−ループ構造形成を効率よく行なうことも必要となる。そして、効率の良いステム−ループ構造形成、すなわち、効率の良い配列（B'）と配列（Bc）とのハイブリダイゼーションには、前記配列（B'）と前記配列（Bc）との間の距離（Ｘ＋Ｙ）が重要となる。一般に、プライマー伸長反応のための最適温度は最高でも７２℃付近であり、そのような低い温度では、伸長鎖が長い領域にわたって解離することは困難である。従って、配列（B'）が配列（Bc）に効率よくハイブリダイズするためには、両配列の間の塩基数は少ないほうが好ましいと考えられる。一方で、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズして鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とするためには、配列（B'）と配列（Bc）との間の塩基数は多い方が好ましいと考えられる。 The design criteria for the first primer in the preferred embodiment of the present invention are as follows. First, in order for a new primer to efficiently anneal to the template nucleic acid after the complementary strand of the template nucleic acid is synthesized by extension of the primer, the template is formed by forming a stem-loop structure at the 5 ′ end of the synthesized complementary strand. The part of the sequence (A) on the nucleic acid needs to be a single strand. For this purpose, the difference (X−Y) between the base number X of the sequence (Ac ′) and the base number Y of the region sandwiched between the sequence (A) and the sequence (B) in the target nucleic acid sequence is expressed as X The ratio (X−Y) / X to is important. However, it is not necessary to make a single strand up to the portion which is present 5 ′ from the sequence (A) on the template nucleic acid and which is not related to primer hybridization. In addition, in order for a new primer to efficiently anneal to a template nucleic acid, it is also necessary to efficiently perform the above-described stem-loop structure formation. For efficient stem-loop structure formation, that is, efficient hybridization between the sequence (B ′) and the sequence (Bc), the distance between the sequence (B ′) and the sequence (Bc) (X + Y) is important. In general, the optimum temperature for the primer extension reaction is at most around 72 ° C., and at such a low temperature, it is difficult for the extended strand to dissociate over a long region. Therefore, in order for the sequence (B ′) to efficiently hybridize to the sequence (Bc), it is considered preferable that the number of bases between both sequences is small. On the other hand, in order for the sequence (B ′) to hybridize to the sequence (Bc) and to make the portion of the sequence (A) on the template nucleic acid a single strand, the sequence (B ′) and the sequence (Bc) It is considered that a larger number of bases between is preferred.

以上のような観点から、本発明の好ましい実施態様による前記第一のプライマーは、プライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の間に介在配列が存在しない場合において、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは５０以下、さらに好ましくは４８以下、さらに好ましくは４２以下とされる。 From the above viewpoints, the first primer according to a preferred embodiment of the present invention is the (X−) in the case where no intervening sequence exists between the sequence (Ac ′) and the sequence (B ′) constituting the primer. Y) / X is −1.00 or more, preferably 0.00 or more, more preferably 0.05 or more, more preferably 0.10 or more, and 1.00 or less, preferably 0.75 or less, It is designed to be preferably 0.50 or less, more preferably 0.25 or less. Further, (X + Y) is preferably 15 or more, more preferably 20 or more, more preferably 30 or more, and preferably 50 or less, more preferably 48 or less, and further preferably 42 or less.

また、プライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の間に介在配列（塩基数はＹ’）が存在する場合には、本発明の好ましい実施態様による前記第一のプライマーは、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ＋Ｙ’）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは１００以下、さらに好ましくは７５以下、さらに好ましくは５０以下とされる。 Further, when there is an intervening sequence (base number Y ′) between the sequence (Ac ′) and the sequence (B ′) constituting the primer, the first primer according to a preferred embodiment of the present invention is {X- (YY ')} / X is -1.00 or more, preferably 0.00 or more, more preferably 0.05 or more, more preferably 0.10 or more, and 1.00 or less, It is designed to be preferably 0.75 or less, more preferably 0.50 or less, and still more preferably 0.25 or less. Further, (X + Y + Y ′) is preferably 15 or more, more preferably 20 or more, more preferably 30 or more, and is preferably 100 or less, more preferably 75 or less, and even more preferably 50 or less.

前記第一のプライマーは、与えられた条件下で必要な特異性を維持しながら標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。このプライマーの鎖長は、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは２０〜６０ヌクレオチドとする。また、前記第一のプライマーを構成する配列（Ac'）と配列（B'）の長さは、それぞれ、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは７〜３０ヌクレオチドである。また、必要に応じて、配列（Ac'）と配列（B'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。 The first primer has a chain length that allows base pairing with a target nucleic acid while maintaining the required specificity under given conditions. The primer has a chain length of preferably 15 to 100 nucleotides, more preferably 20 to 60 nucleotides. Moreover, the lengths of the sequence (Ac ′) and the sequence (B ′) constituting the first primer are preferably 5 to 50 nucleotides, more preferably 7 to 30 nucleotides, respectively. If necessary, an intervening sequence that does not affect the reaction may be inserted between the sequence (Ac ′) and the sequence (B ′).

前記第二のプライマーは、上述のように、前記標的核酸配列の相補配列（第一のプライマーがハイブリダイズする鎖に対して反対側の鎖）の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである。このような第二のプライマーの構造は、例えば、図２に示すようなものであるが、図２に示される配列やヌクレオチド数に限定されるものではない。第二のプライマーを構成する配列（Cc'）の長さは、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。また、前記折返し配列（D-Dc'）の長さは、好ましくは２〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは４〜６０ヌクレオチド、さらに好ましくは６〜４０ヌクレオチドであり、折返し配列の内部におけるハイブリダイゼーションによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは２〜５００ｂｐ、より好ましくは２〜５０ｂｐ、さらに好ましくは２〜３０ｂｐ、さらに好ましくは３〜２０ｂｐである。折返し配列（D-Dc'）のヌクレオチド配列はいかなる配列であってもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは標的核酸配列にハイブリダイズしない配列とされる。また、必要に応じて、配列（Cc'）と折返し配列（D-Dc'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。 As described above, the second primer hybridizes to the sequence (C) of the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the target nucleic acid sequence (the strand opposite to the strand to which the first primer hybridizes). A folded sequence (D-Dc ') comprising two nucleic acid sequences that hybridize to each other on the same strand, and 5' of the sequence (Cc '). On the side. The structure of such a second primer is, for example, as shown in FIG. 2, but is not limited to the sequence or the number of nucleotides shown in FIG. The length of the sequence (Cc ′) constituting the second primer is preferably 5 to 50 nucleotides, more preferably 10 to 30 nucleotides. The length of the folded sequence (D-Dc ′) is preferably 2 to 1000 nucleotides, more preferably 2 to 100 nucleotides, still more preferably 4 to 60 nucleotides, and even more preferably 6 to 40 nucleotides. The number of nucleotides of base pairs formed by hybridization within the sequence is preferably 2 to 500 bp, more preferably 2 to 50 bp, still more preferably 2 to 30 bp, and further preferably 3 to 20 bp. The nucleotide sequence of the folded sequence (D-Dc ′) may be any sequence and is not particularly limited, but is preferably a sequence that does not hybridize to the target nucleic acid sequence. If necessary, an intervening sequence that does not affect the reaction may be inserted between the sequence (Cc ′) and the folded sequence (D-Dc ′).

これら第一のプライマーおよび第二のプライマーによる核酸増幅反応について考えられる作用機序を、図３（図３ａおよび図３ｂ）を用いて説明する。なお、図３では、説明を簡略化するため、ハイブリダイズする２つの配列を相互に相補的な配列としているが、これにより本発明が限定されるものではない。まず、第一のプライマーが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、該プライマーの伸長反応が起きる（図３(a)）。次いで、伸長鎖（−）上においてステム−ループ構造が形成され、これにより一本鎖となった標的核酸センス鎖上の配列（A）に新たな第一のプライマーがハイブリダイズし（図３(b)）、該プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（−）が脱離する。次に、脱離した伸長鎖（−）上の配列（C）に第二のプライマーがハイブリダイズし（図３(c)）、該プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（＋）が合成される（図３(d)）。生成した伸長鎖（＋）の３’末端と伸長鎖（−）の５’末端ではステム−ループ構造が形成され（図３(e)）、遊離型の３’末端である伸長鎖（＋）のループ先端から伸長反応が起こると同時に、前記伸長鎖（−）が脱離する（図３(f)）。ループ先端からの前記伸長反応により、伸長鎖（＋）の３’側に配列（A）および配列（Bc）を介して伸長鎖（−）が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列（A）および配列（Bc）に第一のプライマーがハイブリダイズし（図３(g)）、その伸長反応により伸長鎖（−）が生成する（図３(h)および(i)）。また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の３’末端に存在する折返し配列によって遊離型の３’末端が提供され（図３(h)）、そこからの伸長反応により（図３(i)）、両端に折返し配列を有し、第一および第二のプライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図３(j)）。この一本鎖核酸では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図３(k)）、同様の伸長反応が繰り返され、１回の伸長反応あたり２倍の鎖長となる（図３(l)および(m)）。また、図３(i)において脱離した第一のプライマーからの伸長鎖（−）では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図３(n)）、そこからの伸長反応により、両端にステム−ループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図３(o)）。この一本鎖核酸においても、３’末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供されるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。このようにして自動的に延長される一本鎖核酸には、第一のプライマーおよび第二のプライマーに由来する配列が伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）との間に含まれているため、各プライマーがハイブリダイズして伸長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖が顕著に増幅される。 A possible mechanism of action for the nucleic acid amplification reaction by the first primer and the second primer will be described with reference to FIG. 3 (FIGS. 3a and 3b). In FIG. 3, for simplification of description, the two sequences to be hybridized are complementary to each other, but the present invention is not limited thereby. First, the first primer hybridizes to the sense strand of the target nucleic acid, and the primer extension reaction occurs (FIG. 3 (a)). Next, a stem-loop structure is formed on the extended strand (−), and thereby a new first primer hybridizes to the sequence (A) on the target nucleic acid sense strand that has become a single strand (FIG. 3 ( b)), the extension reaction of the primer occurs, and the previously synthesized extended strand (−) is eliminated. Next, the second primer hybridizes to the sequence (C) on the released extended strand (−) (FIG. 3 (c)), the extension reaction of the primer occurs, and the extended strand (+) is synthesized. (FIG. 3 (d)). A stem-loop structure is formed at the 3 ′ end of the generated extended strand (+) and the 5 ′ end of the extended strand (−) (FIG. 3 (e)), and the extended strand (+) which is the free 3 ′ end. At the same time, an extension reaction occurs from the loop tip of the above, and the extension chain (-) is detached (FIG. 3 (f)). By the extension reaction from the loop tip, a hairpin-type double-stranded nucleic acid in which the extension strand (−) is bonded to the 3 ′ side of the extension strand (+) via the sequence (A) and the sequence (Bc) is generated, The first primer hybridizes to the sequence (A) and the sequence (Bc) (FIG. 3 (g)), and an extended chain (−) is generated by the extension reaction (FIG. 3 (h) and (i)). . In addition, a free 3 ′ end is provided by the folded sequence present at the 3 ′ end of the hairpin type double-stranded nucleic acid (FIG. 3 (h)), and by an extension reaction therefrom (FIG. 3 (i)), A single-stranded nucleic acid having a folded sequence at both ends and alternately containing an extended strand (+) and an extended strand (−) through the sequences derived from the first and second primers is generated (FIG. 3 (j )). In this single-stranded nucleic acid, since the free 3 ′ end (starting point of complementary strand synthesis) is provided by the folded sequence present at the 3 ′ end (FIG. 3 (k)), the same extension reaction is repeated, The chain length is doubled per extension reaction (FIGS. 3 (l) and (m)). In addition, in the extended strand (−) from the first primer desorbed in FIG. 3 (i), the free 3 ′ end (the complementary strand synthesis origin) is provided by the folded sequence present at the 3 ′ end. For this reason (FIG. 3 (n)), stem-loop structures are formed at both ends by the extension reaction therefrom, and the extension strand (+) and the extension strand (-) are alternately included via the sequence derived from the primer. Single-stranded nucleic acid is produced (FIG. 3 (o)). In this single-stranded nucleic acid as well, the complementary strand synthesis starting point is sequentially provided by the loop formation at the 3 'end, so that elongation reactions occur one after another. The single-stranded nucleic acid thus automatically extended contains sequences derived from the first primer and the second primer between the extended strand (+) and the extended strand (−). Therefore, it is possible for each primer to hybridize to cause an extension reaction, and thereby the sense strand and the antisense strand of the target nucleic acid are significantly amplified.

前記プライマーセットは、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする第三のプライマーであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しない第三のプライマーをさらに含んでなるものとしてもよい。 The primer set further includes a third primer that hybridizes to the target nucleic acid sequence or its complementary sequence, and does not compete with other primers for hybridization to the target nucleic acid sequence or its complementary sequence. It is good also as what consists of.

本発明において「競合しない」とは、そのプライマーが標的核酸にハイブリダイズすることによって他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意味する。 In the present invention, “non-competing” means that the primer does not interfere with the provision of the complementary strand synthesis starting point by hybridizing to the target nucleic acid.

第一のプライマーおよび第二のプライマーにより標的核酸が増幅された場合には、上述のように、増幅産物は標的核酸配列とその相補配列とを交互に有するものとなる。その増幅産物の３’末端には折返し配列またはループ構造が存在し、これにより提供される相補鎖合成起点から次々に伸長反応が起こっている。第三のプライマーは、このような増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的配列にアニ−リングすることができる。これにより、増幅産物中の標的核酸配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、核酸増幅反応がより迅速に行われるようになる。 When the target nucleic acid is amplified by the first primer and the second primer, as described above, the amplification product has the target nucleic acid sequence and its complementary sequence alternately. A folded sequence or a loop structure exists at the 3 'end of the amplified product, and extension reactions occur one after another from the complementary strand synthesis starting point provided thereby. The third primer can be annealed to the target sequence present in the single-stranded portion when such an amplification product is partially in a single-stranded state. As a result, a new complementary strand synthesis starting point is provided in the target nucleic acid sequence in the amplification product, and an extension reaction takes place therefrom, so that the nucleic acid amplification reaction is performed more rapidly.

第三のプライマーは必ずしも１種類に限定されるわけではなく、核酸増幅反応の迅速性および特異性を向上させるためには２種類以上の第三のプライマーを同時に用いてもよい。これら第三のプライマーは、典型的には第一のプライマーおよび第二のプライマーとは異なる配列からなるが、これらのプライマーと競合しない限りにおいて、部分的に重なる領域にハイブリダイズするものとしてもよい。第三のプライマーの鎖長は、好ましくは２〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜３０ヌクレオチドとされる。 The third primer is not necessarily limited to one type, and two or more types of third primers may be used simultaneously in order to improve the speed and specificity of the nucleic acid amplification reaction. These third primers typically comprise a different sequence from the first primer and the second primer, but may hybridize to partially overlapping regions as long as they do not compete with these primers. . The chain length of the third primer is preferably 2 to 100 nucleotides, more preferably 5 to 50 nucleotides, and even more preferably 7 to 30 nucleotides.

第三のプライマーは、第一のプライマーおよび第二のプライマーによる核酸増幅反応をより迅速に進めるための補助的な働きをその主目的とするものである。従って、第三のプライマーは、第一のプライマーおよび第二のプライマーの各３’末端のＴｍよりも低いＴｍを有するものとすることが好ましい。また、第三のプライマーの増幅反応液への添加量は、第一のプライマーおよび第二のプライマーのそれぞれの添加量よりも少ない方が好ましい。 The third primer mainly serves as an auxiliary function for proceeding the nucleic acid amplification reaction by the first primer and the second primer more rapidly. Therefore, the third primer preferably has a Tm lower than the Tm of each 3 'end of the first primer and the second primer. Moreover, it is preferable that the addition amount of the third primer to the amplification reaction solution is smaller than the addition amounts of the first primer and the second primer.

前記プライマーセットを利用して遺伝子変異の有無を判定するためには、変異部位が前記配列（A）、前記配列（B）または前記配列（C）に含まれるようにプライマーセットを設計することができる。これにより、増幅産物の有無を確認することによって前記変異の有無を判定することが可能となり、また、増幅産物を定量することにより前記変異を有する遺伝子の量を決定することが可能となる。 In order to determine the presence or absence of gene mutation using the primer set, the primer set should be designed so that the mutation site is included in the sequence (A), the sequence (B) or the sequence (C). it can. Thereby, it is possible to determine the presence or absence of the mutation by confirming the presence or absence of the amplification product, and it is possible to determine the amount of the gene having the mutation by quantifying the amplification product.

本発明の一つの実施態様によれば、前記プライマーセットは、変異に係るヌクレオチド残基が前記配列（A）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（A）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（A）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。変異に係るヌクレオチド残基は、好ましくは前記配列（A）の５’末端（第一のプライマーにおける３’末端に対応する）に含まれるものとされる。また、第一のプライマーに含まれる配列（Ac'）は、前記配列（A）に相補的な配列とすることが好ましい。 According to one embodiment of the present invention, the primer set is designed so that nucleotide residues related to mutation are included in the sequence (A). In this embodiment, when the target nucleic acid sequence is contained in the nucleic acid sample, the first primer anneals to the sequence (A) in the nucleic acid amplification reaction, so that an amplification product is obtained. If the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence that is different from the target nucleic acid sequence at the mutation site, it will be difficult for the first primer to anneal to the sequence (A) in the nucleic acid amplification reaction. Or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. The nucleotide residue involved in the mutation is preferably contained in the 5 'end (corresponding to the 3' end in the first primer) of the sequence (A). The sequence (Ac ′) contained in the first primer is preferably a sequence complementary to the sequence (A).

本発明の他の実施態様によれば、前記プライマーセットは、変異に係るヌクレオチド残基が前記配列（C）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（C）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（C）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。変異に係るヌクレオチド残基は、好ましくは前記配列（C）の５’末端（第二のプライマーにおける３’末端に対応する）に含まれるものとされる。また、第二のプライマーに含まれる配列（Cc'）は、前記配列（C）に相補的な配列とすることが好ましい。 According to another embodiment of the present invention, the primer set is designed so that nucleotide residues related to mutation are included in the sequence (C). In this embodiment, when the target nucleic acid sequence is contained in the nucleic acid sample, the second primer anneals to the sequence (C) in the nucleic acid amplification reaction, so that an amplification product is obtained. If the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence that differs from the target nucleic acid sequence at the mutation site, it will be difficult for the second primer to anneal to the sequence (C) in the nucleic acid amplification reaction. Or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. The nucleotide residue involved in the mutation is preferably contained in the 5 'end (corresponding to the 3' end in the second primer) of the sequence (C). The sequence (Cc ′) contained in the second primer is preferably a sequence complementary to the sequence (C).

本発明の他の実施態様によれば、前記プライマーセットは、変異に係るヌクレオチド残基が前記配列（B）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上の配列（Bc）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、変異部位において標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応における上記ステム−ループ構造の形成が困難となるため、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。第一のプライマーに含まれる配列（B'）は、前記配列（B）と同一の配列とすることが好ましい。 According to another embodiment of the present invention, the primer set is designed so that nucleotide residues related to mutation are included in the sequence (B). In this embodiment, when the nucleic acid sample contains the target nucleic acid sequence, the nucleic acid amplification reaction includes the first primer after annealing to the sequence (A) and the extension reaction. Since the sequence (B ′) to be hybridized to the sequence (Bc) on the extended strand, a stem-loop structure is efficiently formed. Formation of this efficient stem-loop structure allows other first primers to anneal to the template, and the mechanism of action shown in FIG. 1 proceeds efficiently, resulting in an amplification product. On the other hand, when the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence that is different from the target nucleic acid sequence at the mutation site, the formation of the stem-loop structure in the nucleic acid amplification reaction becomes difficult, which is shown in FIG. The mechanism of action is disturbed and no amplification product is obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. The sequence (B ′) contained in the first primer is preferably the same sequence as the sequence (B).

上述の配列（B）における変異の検出について、さらに詳細に説明する。図１に示す作用機序において、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズする現象は、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。第一のプライマーによる伸長反応によって生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステム−ループ構造を形成することができる。しかし、このステム−ループ構造は安定的には存在せず、特に、そのステムを形成する配列（B'）と配列（Bc）部分との間に相補的でないヌクレオチドが存在する場合には、非常に不安定となり、あるいは、ステムが全く形成されない。この場合には、鋳型上の配列（A）とプライマー中の配列（Ac'）とのハイブリダイゼーションの方が優位となり、配列（A）の部分が一本鎖とならないため、次の第一のプライマーがアニーリングできなくなる。そのため、図１に示される連続した反応を起こすことが極めて困難となる。 The detection of the mutation in the above-mentioned sequence (B) will be described in more detail. In the mechanism of action shown in FIG. 1, the phenomenon that the sequence (B ′) hybridizes to the sequence (Bc) occurs due to the presence of complementary regions on the same strand. In general, when a double-stranded nucleic acid is dissociated into a single strand, partial dissociation starts from its terminal or other relatively unstable part. In the double-stranded nucleic acid produced by the extension reaction with the first primer, the base pair of the terminal portion is in an equilibrium state of dissociation and binding at a relatively high temperature, and the double-stranded nucleic acid is maintained as a whole. In such a state, when a sequence complementary to the dissociated portion of the terminal is present on the same strand, a stem-loop structure can be formed as a metastable state. However, this stem-loop structure does not exist stably, especially if there are non-complementary nucleotides between the sequence (B ′) and the sequence (Bc) part forming the stem. Or the stem is not formed at all. In this case, the hybridization between the sequence (A) on the template and the sequence (Ac ') in the primer is superior, and the sequence (A) does not become a single strand. Primer cannot be annealed. Therefore, it is extremely difficult to cause the continuous reaction shown in FIG.

さらに、前記プライマーセットを利用して核酸配列における配列の欠失または挿入の有無を検出するためには、欠失または挿入に係る部位が、配列（A）、配列（B）もしくは配列（C）に含まれるか、または配列（A）と配列（B）との間に配置されるようにプライマーセットを設計することができる。これにより、増幅産物の有無を確認することによって配列の欠失または挿入の有無を判定することが可能となり、また、増幅産物を定量することにより前記欠失または挿入を有する遺伝子の量を決定することが可能となる。 Furthermore, in order to detect the presence or absence of sequence deletion or insertion in the nucleic acid sequence using the primer set, the site related to the deletion or insertion is sequence (A), sequence (B) or sequence (C). The primer set can be designed to be contained in or between sequence (A) and sequence (B). This makes it possible to determine the presence or absence of a sequence deletion or insertion by confirming the presence or absence of an amplification product, and determine the amount of the gene having the deletion or insertion by quantifying the amplification product. It becomes possible.

本発明の一つの実施態様によれば、前記プライマーセットは、欠失または挿入に係る部位が前記配列（A）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（A）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第一のプライマーが配列（A）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。第一のプライマーに含まれる配列（Ac'）は、前記配列（A）に相補的な配列とすることが好ましい。 According to one embodiment of the present invention, the primer set is designed such that a site related to deletion or insertion is included in the sequence (A). In this embodiment, when the target nucleic acid sequence is contained in the nucleic acid sample, the first primer anneals to the sequence (A) in the nucleic acid amplification reaction, so that an amplification product is obtained. When the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence due to deletion / insertion, it becomes difficult for the first primer to anneal to the sequence (A) in the nucleic acid amplification reaction. No amplification product is obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. The sequence (Ac ′) contained in the first primer is preferably a sequence complementary to the sequence (A).

本発明の他の実施態様によれば、前記プライマーセットは、欠失または挿入に係る部位が前記配列（C）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（C）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において第二のプライマーが配列（C）にアニーリングすることが困難となるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。第二のプライマーに含まれる配列（Cc'）は、前記配列（C）に相補的な配列とすることが好ましい。 According to another embodiment of the present invention, the primer set is designed such that a site related to deletion or insertion is included in the sequence (C). In this embodiment, when the target nucleic acid sequence is contained in the nucleic acid sample, the second primer anneals to the sequence (C) in the nucleic acid amplification reaction, so that an amplification product is obtained. When the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence due to deletion / insertion, it becomes difficult for the second primer to anneal to the sequence (C) in the nucleic acid amplification reaction. No amplification product is obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. The sequence (Cc ′) contained in the second primer is preferably a sequence complementary to the sequence (C).

本発明の他の実施態様によれば、前記プライマーセットは、欠失または挿入に係る部位が前記配列（B）に含まれるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上の配列（Bc）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応における上記ステム−ループ構造の形成が困難となるため、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。その詳細は、本発明による変異検出について上述したとおりである。また、第一のプライマーに含まれる配列（B'）は、前記配列（B）と同一の配列とすることが好ましい。 According to another embodiment of the present invention, the primer set is designed such that a site related to deletion or insertion is included in the sequence (B). In this embodiment, when the nucleic acid sample contains the target nucleic acid sequence, the nucleic acid amplification reaction includes the first primer after annealing to the sequence (A) and the extension reaction. Since the sequence (B ′) to be hybridized to the sequence (Bc) on the extended strand, a stem-loop structure is efficiently formed. Formation of this efficient stem-loop structure allows other first primers to anneal to the template, and the mechanism of action shown in FIG. 1 proceeds efficiently, resulting in an amplification product. On the other hand, when the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence due to deletion / insertion, the formation of the stem-loop structure in the nucleic acid amplification reaction becomes difficult. The indicated mechanism of action is hindered and no amplification product is obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. The details are as described above for the mutation detection according to the present invention. The sequence (B ′) contained in the first primer is preferably the same sequence as the sequence (B).

本発明の好ましい実施態様によれば、前記プライマーセットは、欠失または挿入に係る部位が前記配列（A）と前記配列（B）との間に配置されるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上の配列（Bc）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、第一のプライマーに含まれる配列（B'）と伸長鎖上の配列（Bc）とが適切な距離を維持していないため、核酸増幅反応における上記ステム−ループ構造の形成が困難となる。従って、この場合には、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。 According to a preferred embodiment of the present invention, the primer set is designed so that a site for deletion or insertion is arranged between the sequence (A) and the sequence (B). In this embodiment, when the nucleic acid sample contains the target nucleic acid sequence, the nucleic acid amplification reaction includes the first primer after annealing to the sequence (A) and the extension reaction. Since the sequence (B ′) to be hybridized to the sequence (Bc) on the extended strand, a stem-loop structure is efficiently formed. Formation of this efficient stem-loop structure allows other first primers to anneal to the template, and the mechanism of action shown in FIG. 1 proceeds efficiently, resulting in an amplification product. On the other hand, when the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence due to deletion / insertion, the sequence (B ′) contained in the first primer and the sequence on the extended strand (Bc ) Does not maintain an appropriate distance, it becomes difficult to form the stem-loop structure in the nucleic acid amplification reaction. Therefore, in this case, the mechanism of action shown in FIG. 1 is hindered, and no amplification product is obtained, or the amount of amplification product obtained is significantly reduced.

本発明の他の実施態様によれば、前記プライマーセットは、欠失または挿入に係る部位が前記配列（A）と前記配列（C）との間に配置されるように設計される。この実施態様では、核酸試料中に標的核酸配列が含まれている場合には、核酸増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後に該プライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上の配列（Bc）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、図１に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方で、核酸試料中に、欠失／挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が含まれている場合には、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。例えば、配列（A）と配列（C）との間における長い配列の挿入により標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれている場合には、核酸増幅の速度（効率）が著しく低減されるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。また、配列（A）と配列（C）との間における配列の欠失により標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれており、かつこの欠失により配列（B）の一部または全部が失われている場合には、第一のプライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上にハイブリダイズできないため、ステム−ループ構造の形成が不可能となるか、または困難となるため、図１に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。さらに、配列（A）と配列（C）との間における配列の欠失により標的核酸配列とは異なる核酸配列が核酸試料中に含まれており、かつこの欠失による配列（B）の部分的欠失が生じない場合にも、核酸増幅の速度（効率）が低減されるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。 According to another embodiment of the present invention, the primer set is designed such that a site related to deletion or insertion is located between the sequence (A) and the sequence (C). In this embodiment, when the nucleic acid sample contains the target nucleic acid sequence, the nucleic acid amplification reaction includes the first primer after annealing to the sequence (A) and the extension reaction. Since the sequence (B ′) to be hybridized to the sequence (Bc) on the extended strand, a stem-loop structure is efficiently formed. Formation of this efficient stem-loop structure allows other first primers to anneal to the template, and the mechanism of action shown in FIG. 1 proceeds efficiently, resulting in an amplification product. On the other hand, when the nucleic acid sample contains a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence due to deletion / insertion, an amplification product is not obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. For example, when a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence is contained in the nucleic acid sample due to insertion of a long sequence between the sequence (A) and the sequence (C), the speed (efficiency) of nucleic acid amplification is remarkably high. As a result, no amplification product is obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. Further, a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence is contained in the nucleic acid sample due to the deletion of the sequence between the sequence (A) and the sequence (C), and a part of the sequence (B) is caused by this deletion. Alternatively, when all of them are lost, the sequence (B ′) contained in the first primer cannot hybridize on the extended strand, making it impossible or difficult to form a stem-loop structure. Therefore, the mechanism of action shown in FIG. 1 is hindered and no amplification product is obtained, or the amount of amplification product obtained is significantly reduced. Furthermore, a nucleic acid sequence different from the target nucleic acid sequence is contained in the nucleic acid sample due to the deletion of the sequence between the sequence (A) and the sequence (C), and a part of the sequence (B) due to this deletion Even when no deletion occurs, the rate (efficiency) of nucleic acid amplification is reduced, so that no amplification product is obtained or the amount of amplification product obtained is significantly reduced.

核酸増幅反応に用いられるポリメラーゼは、鎖置換（strand displacement）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。核酸増幅反応において使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、さらに、Vent DNAポリメラーゼ、Vent (Exo-) DNAポリメラーゼ、DeepVent DNAポリメラーゼ、DeepVent (Exo-) DNAポリメラーゼ、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Z-Taq DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Pfu turbo DNAポリメラーゼ、KOD DNAポリメラーゼ、9°Nm DNAポリメラーゼ、Therminater DNAポリメラーゼ等が挙げられる。 The polymerase used in the nucleic acid amplification reaction only needs to have a strand displacement activity (strand displacement ability), and any of normal temperature, intermediate temperature, and heat resistance can be suitably used. Further, this polymerase may be either a natural body or a mutant with artificial mutation. Examples of such a polymerase include DNA polymerase. Furthermore, it is preferable that the DNA polymerase has substantially no 5 '→ 3' exonuclease activity. Examples of such a DNA polymerase include thermophilic Bacillus bacteria such as Bacillus stearothermophilus (hereinafter referred to as “B.st”) and Bacillus caldotenax (hereinafter referred to as “B.ca”). Examples include mutants lacking the 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity of the derived DNA polymerase, Klenow fragment of E. coli derived DNA polymerase I, and the like. Examples of the DNA polymerase used in the nucleic acid amplification reaction include Vent DNA polymerase, Vent (Exo-) DNA polymerase, DeepVent DNA polymerase, DeepVent (Exo-) DNA polymerase, Φ29 phage DNA polymerase, MS-2 phage DNA polymerase, Z -Taq DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, Pfu turbo DNA polymerase, KOD DNA polymerase, 9 ° Nm DNA polymerase, Therminater DNA polymerase and the like.

核酸増幅反応に用いられるその他の試薬としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide)やベタイン（N,N,N-trimethylglycine）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。 Other reagents used in the nucleic acid amplification reaction include, for example, catalysts such as magnesium chloride, magnesium acetate, magnesium sulfate, substrates such as dNTP mix, Tris-HCl buffer, tricine buffer, sodium phosphate buffer, potassium phosphate buffer, etc. Can be used. Furthermore, additives such as dimethyl sulfoxide and betaine (N, N, N-trimethylglycine), acidic substances described in International Publication No. 99/54455 pamphlet, cation complexes and the like may be used.

核酸増幅反応において、核酸の増幅効率を高めるために、融解温度調整剤を反応溶液中に添加することができる。核酸の融解温度（Tm）は、一般的に、核酸中の二本鎖形成部分の具体的なヌクレオチド配列によって決定される。反応溶液中に融解温度調整剤を添加することにより、この融解温度を変化させることができ、従って、一定の温度下では、核酸における二本鎖形成の強度を調整することが可能となる。一般的な融解温度調整剤は、融解温度を下げる効果を有する。このような融解温度調整剤を添加することにより、２本の核酸の間の二本鎖形成部分の融解温度を下げることができ、換言すれば、その二本鎖形成の強度を下げることが可能となる。従って、前記核酸増幅反応においてこのような融解温度調整剤を反応溶液中に添加すると、強固な二本鎖を形成するＧＣの豊富な核酸領域や複雑な二次構造を形成する領域において効率的に二本鎖部分を一本鎖とすることが可能となり、これにより、プライマーによる伸長反応が終わった後に次のプライマーが目的領域にハイブリダイズしやすくなるため、核酸の増幅効率を上げることができる。本発明において用いられる融解温度調整剤およびその反応溶液中での濃度は、ハイブリダイゼーション条件に影響を与える他の反応条件、例えば塩濃度、反応温度等を考慮して、当業者により適切に選択される。従って、融解温度調整剤は特に制限されるものではないが、好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの任意の組み合わせとされ、より好ましくはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とされる。 In the nucleic acid amplification reaction, a melting temperature adjusting agent can be added to the reaction solution in order to increase the amplification efficiency of the nucleic acid. The melting temperature (Tm) of a nucleic acid is generally determined by the specific nucleotide sequence of the double stranded portion in the nucleic acid. By adding a melting temperature adjusting agent to the reaction solution, this melting temperature can be changed. Therefore, under a certain temperature, the intensity of double strand formation in the nucleic acid can be adjusted. A general melting temperature adjusting agent has an effect of lowering the melting temperature. By adding such a melting temperature adjusting agent, the melting temperature of the duplex forming part between two nucleic acids can be lowered, in other words, the strength of the duplex formation can be lowered. It becomes. Therefore, when such a melting temperature adjusting agent is added to the reaction solution in the nucleic acid amplification reaction, it is efficiently used in a GC-rich nucleic acid region that forms a strong double strand or a region that forms a complex secondary structure. The double-stranded portion can be made into a single strand, and this makes it easy for the next primer to hybridize to the target region after the extension reaction with the primer is completed, so that the nucleic acid amplification efficiency can be increased. The melting temperature adjusting agent used in the present invention and its concentration in the reaction solution are appropriately selected by those skilled in the art in consideration of other reaction conditions that affect the hybridization conditions, such as salt concentration, reaction temperature, etc. The Therefore, the melting temperature adjusting agent is not particularly limited, but is preferably dimethyl sulfoxide (DMSO), betaine, formamide or glycerol, or any combination thereof, more preferably dimethyl sulfoxide (DMSO). .

さらに、核酸増幅反応において、酵素安定化剤を反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。本発明において用いられる酵素安定化剤は、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などの、当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されない。 Furthermore, in the nucleic acid amplification reaction, an enzyme stabilizer can be added to the reaction solution. Thereby, since the enzyme in the reaction solution is stabilized, the amplification efficiency of the nucleic acid can be increased. The enzyme stabilizer used in the present invention may be any known in the art, such as glycerol, bovine serum albumin, saccharides, etc., and is not particularly limited.

さらに、核酸増幅反応において、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの酵素の耐熱性を増強するための試薬を、酵素安定化剤として反応溶液中に添加することもできる。これにより、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の合成効率および増幅効率を高めることが可能となる。このような試薬は当技術分野において知られているいかなるものであってもよく、特に制限されないが、好ましくは糖類、より好ましくは単糖またはオリゴ糖、さらに好ましくはトレハロース、ソルビトールもしくはマンニトール、またはこれらの２種以上の混合物とされる。 Furthermore, in the nucleic acid amplification reaction, a reagent for enhancing the heat resistance of an enzyme such as DNA polymerase or reverse transcriptase can be added to the reaction solution as an enzyme stabilizer. As a result, the enzyme in the reaction solution is stabilized, so that the nucleic acid synthesis efficiency and amplification efficiency can be increased. Such a reagent may be any known in the art and is not particularly limited, but is preferably a saccharide, more preferably a mono- or oligosaccharide, more preferably trehalose, sorbitol or mannitol, or these It is set as the mixture of 2 or more types.

本発明の好ましい実施態様によれば、核酸増幅反応はミスマッチ認識タンパク質の存在下で行なわれ、これにより、より正確に変異を検出することが可能となる。 According to a preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid amplification reaction is performed in the presence of a mismatch recognition protein, which makes it possible to detect mutations more accurately.

細菌や酵母等には、ＤＮＡの２本鎖において部分的に対合できない（ミスマッチ）塩基対が生じたときに、これを修復するための機構があることが既に知られている。この修復は「ミスマッチ結合タンパク質」（「ミスマッチ認識タンパク質」とも称される）と呼ばれるタンパク質によって行なわれるものであり、ＭｕｔＳタンパク質（特表平９−５０４６９９号公報）、ＭｕｔＭタンパク質（特開２０００−３００２６５号公報）、ＧＦＰ（Green Fluorescence Protein）に結合したＭｕｔＳタンパク質（国際公開第９９／０６５９１号パンフレット）などの様々なミスマッチ結合タンパクの使用が報告されている。さらに、近年、ミスマッチ結合タンパク質を利用してミスマッチを検出する遺伝子診断法が開発されている（M. Gotoh et al., Genet. Anal., 14, 47-50, 1997）。核酸中における特定のヌクレオチドにおける多型および突然変異の検出法としては、例えば、変異のない対照核酸と、変異が存在することが疑われる被検核酸とをハイブリダイズさせ、そこにミスマッチ認識タンパク質を導入することによりミスマッチを検出する方法が知られている。 It is already known that bacteria, yeast, and the like have a mechanism for repairing a base pair that cannot be partially matched (mismatched) in a double strand of DNA. This repair is performed by a protein called “mismatch binding protein” (also referred to as “mismatch recognition protein”). MutS protein (Japanese Patent Publication No. 9-504699), MutM protein (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-300265) The use of various mismatch binding proteins such as MutS protein (International Publication No. 99/06591 pamphlet) bound to GFP (Green Fluorescence Protein) has been reported. Furthermore, in recent years, genetic diagnostic methods for detecting mismatches using mismatch binding proteins have been developed (M. Gotoh et al., Genet. Anal., 14, 47-50, 1997). As a method for detecting polymorphisms and mutations at specific nucleotides in nucleic acids, for example, a control nucleic acid having no mutation is hybridized with a test nucleic acid suspected of having the mutation, and a mismatch recognition protein is added thereto. A method of detecting a mismatch by introducing it is known.

本発明において「ミスマッチ」とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）（ＲＮＡの場合はウラシル（Ｕ））から選択される一組の塩基対が正常な塩基対（ＡとＴの組み合わせ、またはＧとＣの組み合わせ）ではないことを意味する。ミスマッチには、１つのミスマッチのみならず、複数の連続したミスマッチ、１または複数の塩基の挿入および／または欠失により生じるミスマッチ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。 In the present invention, “mismatch” means that a pair of base pairs selected from adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and thymine (T) (uracil (U) in the case of RNA) is normal. It means that it is not a correct base pair (a combination of A and T, or a combination of G and C). Mismatches include not only one mismatch, but also multiple consecutive mismatches, mismatches caused by insertion and / or deletion of one or more bases, and combinations thereof.

遺伝子変異の検出のための核酸増幅反応においても、これらのミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、その特異性（正確さ）を向上させることができる。核酸増幅反応においては、相互に相補的でない２つのヌクレオチド配列の間で少量のヘテロ二本鎖構造が生ずることがある。本発明において「ヘテロ二本鎖構造」とは、実質的には相補的な二本鎖構造であるが、１または複数のミスマッチを有することにより非相補的な領域を含む二本鎖構造を意味する。このようなヘテロ二本鎖構造により、本来的には生成しないはずの誤った増幅産物がもたらされる。そこで、核酸増幅反応に用いられる反応液中にミスマッチ結合タンパク質を添加しておけば、上記のようなヘテロ二本鎖構造にこのミスマッチ結合タンパク質が結合し、その後の増幅反応が妨げられる。従って、ミスマッチ結合タンパク質を利用することにより、誤った増幅産物の生成を防ぐことが可能となる。 Also in the nucleic acid amplification reaction for detecting gene mutation, the specificity (accuracy) can be improved by using these mismatched proteins. In nucleic acid amplification reactions, a small amount of heteroduplex structure may occur between two nucleotide sequences that are not complementary to each other. In the present invention, the “heteroduplex structure” means a duplex structure that is substantially a complementary duplex structure but includes a non-complementary region by having one or more mismatches. To do. Such a heteroduplex structure results in a false amplification product that would not otherwise be produced. Therefore, if a mismatch binding protein is added to the reaction solution used for the nucleic acid amplification reaction, the mismatch binding protein binds to the heteroduplex structure as described above, and the subsequent amplification reaction is hindered. Therefore, by using a mismatch binding protein, it is possible to prevent generation of an erroneous amplification product.

本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸におけるミスマッチを認識し、そのミスマッチの部位に結合することが可能なタンパク質であればよく、例えば、当業者に公知のいずれのものであってもよい。また、本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、二本鎖核酸中のミスマッチを認識しうる限り、野生型タンパク質のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質（変異体）であってもよい。このような変異体は、自然界において生じることもあるが、人為的に作製することも可能である。タンパク質にアミノ酸変異を導入する方法としては、多くの方法が知られている。例えば、部位特異的変異導入法としては、 W.P. DengとJ.A. Nickoloffの方法（Anal. Biochem., 200, 81, 1992）、K.L. MakamayeとF. Ecksteinの方法（Nucleic Adids Res., 14, 9679-9698, 1986）などが知られており、ランダム変異導入法としては、基本的な修復系を欠損した大腸菌 XL1-Red 株（Stratagene社）を用いる方法、亜硝酸ナトリウム等を用いて化学的に塩基を修飾する方法（J.-J. Diaz et al., BioTechnique, 11, 204-211, 1991）などが知られている。このようなミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＭ、ＭｕｔＳおよびそれらの類似体など、多くのものが知られている（Radman,M.et al.,Annu.Rev.Genet.20:523-538(1986);Radaman,M.etal.,Sci.Amer.,August 1988,pp40-46;Modrich,P.,J.Biol.Chem.264:6597-6600(1989)； Lahue,R.S. et al.,Science 245:160-164(1988);Jiricny,J.et al,.Nucl.Acids Res.16:7843-7853(1988);Su,S.S.et al.,J.Biol.Chem.263;6829-6835(1988);Lahue,R.S.et al.,Mutat.Res.198:37-43(1988);Dohet,C.et al.,Mol.Gen.Gent.206:181-184(1987); Jones,M.et al.,Gentics 115:605-610(1987)； Salmonella typhimuriumのＭｕｔｓ（Lu,A.L.,Genetics 118:593-600(1988);HaberL.T. et al.,J.Bacteriol.170:197-202(1988);Pang,P.P.et al.,J.Bacteriol.163:1007-1015(1985)）；およびPriebe S.D.et al.,J.Bacterilo.170:190-196(1988)）。本発明に用いられるミスマッチ結合タンパク質は、好ましくはＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、または酵母に由来するものとされ、より好ましくはＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、またはＭｕｔＬとされる。 The mismatch binding protein used in the present invention may be any protein that recognizes a mismatch in a double-stranded nucleic acid and can bind to the mismatch site, such as any known to those skilled in the art. Also good. In addition, in the mismatch binding protein used in the present invention, one or more amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence of the wild-type protein as long as the mismatch in the double-stranded nucleic acid can be recognized. Alternatively, it may be a protein (variant) having an amino acid sequence. Such mutants may occur in nature but can also be made artificially. Many methods are known for introducing amino acid mutations into proteins. For example, site-directed mutagenesis methods include WP Deng and JA Nickoloff (Anal. Biochem., 200, 81, 1992), KL Makamaye and F. Eckstein (Nucleic Adids Res., 14, 9679-9698). , 1986) are known, and random mutagenesis methods include the use of E. coli XL1-Red strain (Stratagene) deficient in the basic repair system, and the use of sodium nitrite and other chemical bases. A modification method (J.-J. Diaz et al., BioTechnique, 11, 204-211, 1991) is known. Many such mismatch binding proteins are known, such as MutM, MutS and their analogs (Radman, M. et al., Annu. Rev. Genet. 20: 523-538 (1986)). Radaman, M. etal., Sci. Amer., August 1988, pp40-46; Modrich, P., J. Biol. Chem. 264: 6597-6600 (1989); Lahue, RS et al., Science 245: 160-164 (1988); Jiricny, J. et al ,. Nucl. Acids Res. 16: 7843-7853 (1988); Su, SSet al., J. Biol. Chem. 263; 6829-6835 (1988) Lahue, RSet al., Mutat. Res. 198: 37-43 (1988); Dohet, C. et al., Mol. Gen. Gent. 206: 181-184 (1987); Jones, M. et al , Gentics 115: 605-610 (1987); Salmonella typhimurium Muts (Lu, AL, Genetics 118: 593-600 (1988); HaberL.T. Et al., J. Bacteriol. 170: 197-202 (1988) Pang, PP et al., J. Bacteriol. 163: 1007-1015 (1985)); and Priebe SD et al., J. Bacterilo. 170: 190-196 (1988)). The mismatch binding protein used in the present invention is preferably derived from MutS, MutH, MutL, or yeast, more preferably MutS, MutH, or MutL.

ミスマッチ結合タンパク質は、一本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の一本鎖核酸への結合は、一本鎖結合タンパク質により阻害されることが知られている。従って、核酸増幅反応においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、一本鎖結合タンパク質を併用することが好ましい。また、ミスマッチ結合タンパク質は、ミスマッチを含まない二本鎖核酸にも結合することがあり、このようなミスマッチ結合タンパク質の誤った結合は、あらかじめ活性剤を用いてミスマッチ結合タンパク質を活性化しておくことにより阻害されることが知られている。従って、核酸増幅反応においてミスマッチ結合タンパク質を用いる場合には、活性剤によりあらかじめ活性化されたものを用いることが好ましい。 It is known that mismatch binding proteins may also bind to single-stranded nucleic acids, and binding of such mismatch binding proteins to single-stranded nucleic acids is inhibited by single-stranded binding proteins. Therefore, when a mismatch binding protein is used in the nucleic acid amplification reaction, it is preferable to use a single-stranded binding protein in combination. Mismatch binding proteins may also bind to double-stranded nucleic acids that do not contain mismatches. Such misbinding of mismatch binding proteins must be activated using an activator in advance. It is known to be inhibited by Therefore, when using a mismatch binding protein in a nucleic acid amplification reaction, it is preferable to use a protein activated in advance by an activator.

一本鎖核酸にミスマッチ結合タンパク質が結合するのを阻害するために使用する一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）は、当技術分野において公知の任意のＳＳＢとすることができる。好ましいＳＳＢとしては、エシェリキア・コリ、ショウジョウバエ、およびアフリカツメガエルに由来する一本鎖結合タンパク質、およびＴ４バクテリオファージ由来の遺伝子３２タンパク質、ならびに他の種に由来するこれらの相当物が挙げられる。この場合に使用されるミスマッチ結合タンパク質としては、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、ＨｅｘＡ、ＭＳＨ１〜６、Ｒｅｐ３、ＲＮａｓｅＡ、ウラシル−ＤＮＡグリコシダーゼ、Ｔ４エンドヌクレアーゼVII、レゾルバーゼなどが挙げられ、好ましくはＭｕｔＳ、ＭＳＨ２もしくはＭＳＨ６、またはこれらの２種以上の混合物とされ、より好ましくはＭｕｔＳとされる。 The single stranded binding protein (SSB) used to inhibit the binding of the mismatch binding protein to the single stranded nucleic acid can be any SSB known in the art. Preferred SSBs include single chain binding proteins from Escherichia coli, Drosophila, and Xenopus, and the gene 32 protein from T4 bacteriophage, and their equivalents from other species. Examples of the mismatch binding protein used in this case include MutS, MutH, MutL, HexA, MSH1-6, Rep3, RNaseA, uracil-DNA glycosidase, T4 endonuclease VII, resolvase, etc., preferably MutS, MSH2 or MSH6, or a mixture of two or more of these, more preferably MutS.

ミスマッチ結合タンパク質を活性化するための活性剤は、当業者であれば適宜選択することができるため、特に限定されないが、好ましくは、ＡＴＰ(アデノシン５'−三リン酸)、ＡＤＰ(アデノシン５'−二リン酸)、ＡＴＰ−γ−Ｓ(アデノシン５'−Ｏ−(３−チオ三リン酸))、ＡＭＰ−ＰＮＰ(アデノシン５'−[β,γ−イミド]三リン酸)などの化合物とされ、あるいは、ミスマッチ結合タンパク質に結合できるヌクレオチドの一つとされる。ミスマッチ結合タンパク質の活性化は、ミスマッチ結合タンパク質と活性剤とを、室温で数秒間から数分間インキュベートすることにより行うことができる。 The activator for activating the mismatch binding protein can be appropriately selected by those skilled in the art and is not particularly limited. However, preferably, ATP (adenosine 5′-triphosphate), ADP (adenosine 5 ′) -Diphosphate), ATP-γ-S (adenosine 5′-O- (3-thiotriphosphate)), AMP-PNP (adenosine 5 ′-[β, γ-imide] triphosphate) and the like Or one of the nucleotides that can bind to the mismatch binding protein. Activation of the mismatch binding protein can be performed by incubating the mismatch binding protein and the active agent at room temperature for several seconds to several minutes.

核酸増幅法によって得られた増幅産物の存在は、多くのあらゆる方法により検出が可能である。一つの方法は、一般的なゲル電気泳動による特定のサイズの増幅産物の検出である。この方法では、例えば、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等の蛍光物質により検出できる。他の方法としては、ビオチンのような標識を有する標識プローブを用い、これを増幅産物にハイブリダイズさせることにより検出することもできる。ビオチンは、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼのような酵素に結合したアビジン等との結合により検出可能である。さらに別の方法としては、免疫クロマトグラフを用いる方法がある。この方法では、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマトグラフ媒体を用いることが考案されている（イムノクロマトグラフィー法）。上記増幅断片と標識プローブとをハイブリダイズさせ、該増幅断片のさらに異なる配列とハイブリダイズ可能な捕捉用プローブをクロマト媒体に固定しておけば、その固定した部分でトラップすることができ、クロマト媒体での検出が可能となる。その結果、肉眼的にシンプルな検出が可能となる。さらに、本発明者らによる核酸増幅法では、核酸増幅反応における増幅効率が非常に高いため、増幅の副産物としてピロリン酸が生じることを利用して、増幅産物を間接的に検出することもできる。このような方法としては、例えば、ピロリン酸が反応溶液中のマグネシウムと結合することによりピロリン酸マグネシウムの白色沈澱が生じることを利用して、反応溶液の白濁を目視で観察する方法がある。また、他の方法としては、ピロリン酸がマグネシウムなどの金属イオンと強く結合して不溶性塩を形成することにより、反応溶液中のマグネシウムイオン濃度が著しく減少することを利用する方法がある。この方法では、マグネシウムイオン濃度に応じて色調が変化する金属指示薬（例えば、Eriochrome Black T、Hydroxy Naphthol Blue等）を反応溶液に添加しておくことにより、反応溶液の色の変化を目視で観察することにより、増幅の有無を検出することが可能となる。さらに、Calceinなどを利用することにより、増幅反応に伴う蛍光の増大を目視で観察することができるため、リアルタイムでの増幅産物の検出が可能となる。 The presence of the amplification product obtained by the nucleic acid amplification method can be detected by many various methods. One method is the detection of amplification products of a specific size by general gel electrophoresis. In this method, for example, it can be detected by a fluorescent substance such as ethidium bromide or cyber green. As another method, it is also possible to detect by using a labeled probe having a label such as biotin and hybridizing it to the amplification product. Biotin can be detected by binding to fluorescently labeled avidin, avidin bound to an enzyme such as peroxidase, and the like. As yet another method, there is a method using an immunochromatograph. In this method, it has been devised to use a chromatographic medium utilizing a label detectable with the naked eye (immunochromatography method). If the amplified fragment and the labeled probe are hybridized, and a capture probe capable of hybridizing with a further different sequence of the amplified fragment is fixed to the chromatographic medium, the trapped portion can be trapped. Detection with is possible. As a result, it is possible to perform simple detection with the naked eye. Furthermore, in the nucleic acid amplification method by the present inventors, the amplification efficiency in the nucleic acid amplification reaction is very high, so that the amplification product can be indirectly detected by utilizing the fact that pyrophosphate is generated as a byproduct of amplification. As such a method, for example, there is a method of visually observing the white turbidity of the reaction solution by utilizing the fact that pyrophosphoric acid is bonded to magnesium in the reaction solution to cause white precipitation of magnesium pyrophosphate. As another method, there is a method utilizing the fact that the concentration of magnesium ions in the reaction solution is remarkably reduced by forming an insoluble salt by strongly binding pyrophosphate to metal ions such as magnesium. In this method, a metal indicator (for example, Eriochrome Black T, Hydroxy Naphthol Blue, etc.) whose color tone changes according to the magnesium ion concentration is added to the reaction solution, and the color change of the reaction solution is visually observed. This makes it possible to detect the presence or absence of amplification. Furthermore, by using Calcein or the like, it is possible to visually observe the increase in fluorescence accompanying the amplification reaction, so that the amplification product can be detected in real time.

本発明による検出法では、次いで、第一の検体から検出された遺伝子変異と第二の検体から検出された遺伝子変異とが比較される。この比較において、検出されたこれらの遺伝子変異が相互に同一である場合には、第一の検体に含まれる疾患関連細胞またはこれに由来する細胞が第二の検体から検出されたことが示される。 In the detection method according to the present invention, the gene mutation detected from the first sample is then compared with the gene mutation detected from the second sample. In this comparison, when these detected gene mutations are identical to each other, it indicates that a disease-related cell contained in the first specimen or a cell derived therefrom was detected from the second specimen. .

本発明による検出法によれば、目的とする疾患の治療前に採取された検体を第一の検体とし、該疾患の治療中または治療後に採取された検体を第二の検体とすることにより、その治療効果を評価することが可能となる。従って、本発明によれば、被験者における疾患の治療の効果を評価する方法が提供され、該方法は、（ａ）被験者から前記疾患の治療前に採取した第一の検体に含まれるゲノムにおいて、前記疾患に関連する遺伝子変異を検出する工程、（ｂ）被験者から前記疾患の治療中または治療後に採取した第二の検体に含まれるゲノムにおいて、前記遺伝子変異を検出する工程、ならびに（ｃ）第一の検体から検出された遺伝子変異と第二の検体から検出された遺伝子変異とを比較する工程を含んでなる。この方法では、検出された遺伝子変異が相互に異なるか、または第二の検体において前記遺伝子変異が検出されない場合に、治療の効果が高いものと評価される。前記治療は、目的とする疾患に応じて当業者により適宜選択されるが、例えば、薬物療法、放射線療法、温熱療法、ホルモン療法、免疫療法、外科的治療等が挙げられる。 According to the detection method of the present invention, the sample collected before the treatment of the target disease is the first sample, and the sample collected during or after the treatment of the disease is the second sample, The therapeutic effect can be evaluated. Therefore, according to the present invention, there is provided a method for evaluating the effect of treatment of a disease in a subject, the method comprising: (a) a genome contained in a first specimen collected from the subject before the treatment of the disease, Detecting a genetic mutation associated with the disease, (b) detecting the genetic mutation in a genome contained in a second specimen collected from the subject during or after the treatment of the disease, and (c) Comparing a genetic mutation detected from one specimen with a genetic mutation detected from a second specimen. In this method, when the detected gene mutation is different from each other or the gene mutation is not detected in the second specimen, it is evaluated that the therapeutic effect is high. Although the said treatment is suitably selected by those skilled in the art according to the target disease, for example, drug therapy, radiation therapy, thermotherapy, hormonal therapy, immunotherapy, surgical treatment and the like can be mentioned.

また、本発明による検出法によれば、目的とする疾患の病巣部から採取された検体を第一の検体とし、他の部位から採取された検体を第二の検体とすることにより、該疾患の原発巣から他の部位への転移（例えば、癌転移）を評価することが可能となる。従って、本発明によれば、被験者における疾患の原発巣から他の部位への転移を評価する方法が提供され、該方法は、（ａ）被験者の前記疾患の原発巣から採取した第一の検体に含まれるゲノムにおいて、前記疾患に関連する遺伝子変異を検出する工程、（ｂ）被験者の他の部位から採取した第二の検体に含まれるゲノムにおいて、前記遺伝子変異を検出する工程、ならびに（ｃ）第一の検体から検出された遺伝子変異と第二の検体から検出された遺伝子変異とを比較する工程を含んでなる。この方法では、検出された遺伝子変異が相互に同一である場合に、疾患の原発巣から他の部位への転移があるものと評価される。本発明の好ましい実施態様によれば、前記疾患は癌または腫瘍とされ、これらの他の部位への転移が評価される。また、原発巣の癌組織または腫瘍組織を第一の検体とし、原発巣の周辺部の組織を第二の検体とすることにより、癌または腫瘍の浸潤を評価することもできる。さらに、原発巣の癌組織を第一の検体とし、他の部位に存在する癌組織を第二の検体とすることにより、その部位に存在する癌組織が前記原発巣からの転移癌であるか否かを評価することができる。 Further, according to the detection method of the present invention, a sample collected from the lesion of the target disease is used as the first sample, and a sample collected from another site is used as the second sample, thereby providing the disease. It is possible to evaluate metastasis from the primary lesion to other sites (for example, cancer metastasis). Therefore, according to the present invention, there is provided a method for evaluating metastasis of a disease from a primary lesion in a subject to another site, the method comprising: (a) a first specimen collected from the primary lesion of the subject in the subject Detecting a genetic mutation associated with the disease in the genome contained in (b), (b) detecting the genetic mutation in the genome contained in the second specimen collected from another part of the subject, and (c) ) Comprising a step of comparing the genetic mutation detected from the first specimen with the genetic mutation detected from the second specimen. In this method, when the detected gene mutations are identical to each other, it is evaluated that there is metastasis from the primary lesion site to another site. According to a preferred embodiment of the present invention, the disease is cancer or tumor, and metastasis to these other sites is evaluated. Further, cancer or tumor invasion can be evaluated by using a cancer tissue or tumor tissue at the primary lesion as the first specimen and a tissue around the primary lesion as the second specimen. Further, whether the cancer tissue present in the site is a metastatic cancer from the primary lesion by setting the cancer tissue in the primary site as the first specimen and the cancer tissue present in another part as the second specimen. You can evaluate whether or not.

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.

実施例１：ｐ５３遺伝子の変異を指標とした大腸癌の原発病巣部とその周辺組織の分析
本実施例では、大腸癌患者から得た組織を検体として用いて、核酸増幅法によりヒトｐ５３遺伝子（配列番号１）中の変異を調べた。検査の対象とする変異は、同遺伝子中の第１７５コドン、第２１３コドン、第２４５コドン、第２４８コドン、および第２７３コドン（図４中の囲み部分）におけるヌクレオチド置換とした。 Example 1: Analysis of the primary lesion of colorectal cancer and surrounding tissues using p53 gene mutation as an index In this example, human p53 gene ( The mutation in SEQ ID NO: 1) was examined. The mutations to be examined were nucleotide substitutions at the 175th codon, 213rd codon, 245th codon, 248th codon, and 273rd codon (boxed in FIG. 4) in the same gene.

核酸増幅反応には、下記の配列を有するプライマーを用いた。 In the nucleic acid amplification reaction, primers having the following sequences were used.

フォワードプライマー：
175F-W：5'-GGCAGCGCCTTCTACAAGCAGTCACAGCAC-3'（配列番号２）；
175F-M：5'-GGCAGTGCCTTCTACAAGCAGTCACAGCAC-3'（配列番号３）；
213F-W：5'-ATGTCGAAAAAATTTGCGTGTGGAGTATTT-3'（配列番号４）；
213F-M：5'-ATGTCAAAAAAATTTGCGTGTGGAGTATTT-3'（配列番号５）；
245F-W：5'-GATGCCGCCCATCCACTACAACTACATGTG-3'（配列番号６）；
245F-M1：5'-GATGTCGCCCATCCACTACAACTACATGTG-3'（配列番号７）；
245F-M2：5'-GATGCTGCCCATCCACTACAACTACATGTG-3'（配列番号８）；
248F-W：5'-CCTCCGGTTCAACTACATGTGTAACAGTTC-3'（配列番号９）；
248F-M1：5'-CCTCTGGTTCAACTACATGTGTAACAGTTC-3'（配列番号１０）；
248F-M2：5'-CCTCCAGTTCAACTACATGTGTAACAGTTC-3'（配列番号１１）；
273F-W：5'-AAACACGCACTGGTAATCTACTGGGACGGA-3'（配列番号１２）；
273F-M1：5'-AAACATGCACTGGTAATCTACTGGGACGGA-3'（配列番号１３）；
273F-M2：5'-AAACACGCACTGGTAATCTACTGGGACGGA-3'（配列番号１４）。 Forward primer:
175F-W: 5′-GGCAG C GCCTTCTACAAGCAGTCACAGCAC-3 ′ (SEQ ID NO: 2);
175F-M: 5'-GGCAG T GCCTTCTACAAGCAGTCACAGCAC-3 '(SEQ ID NO: 3);
213F-W: 5'-ATGTC G AAAAAATTTGCGTGTGGAGTATTT-3 '(SEQ ID NO: 4);
213F-M: 5'-ATGTC A AAAAAATTTGCGTGTGGAGTATTT-3 '(SEQ ID NO: 5);
245F-W: 5'-GATG CC GCCCATCCACTACAACTACATGTG-3 '(SEQ ID NO: 6);
245F-M1: 5'-GATG T CGCCCATCCACTACAACTACATGTG-3 '(SEQ ID NO: 7);
245F-M2: 5'-GATGC T GCCCATCCACTACAACTACATGTG-3 '(SEQ ID NO: 8);
248F-W: 5'-CCTC CG GTTCAACTACATGTGTAACAGTTC-3 '(SEQ ID NO: 9);
248F-M1: 5′-CCTC T GGTTCAACTACATGTGTAACAGTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 10);
248F-M2: 5'-CCTCC A GTTCAACTACATGTGTAACAGTTC-3 '(SEQ ID NO: 11);
273F-W: 5'-AAACA CG CACTGGTAATCTACTGGGACGGA-3 '(SEQ ID NO: 12);
273F-M1: 5′-AAACA T GCACTGGTAATCTACTGGGACGGA-3 ′ (SEQ ID NO: 13);
273F-M2: 5′-AAACAC G CACTGGTAATCTACTGGGACGGA-3 ′ (SEQ ID NO: 14).

リバースプライマー：
R1：5'-GGATATATATATATCCAGATTCTCTTCCTCTGTGCG-3'（配列番号１５）；
R2：5'-GGATATATATATATCCCTGGAGTCTTCCAGTGTGAT-3'（配列番号１６）；
R3：5'-GGATATATATATATCCCTCAGGCGGCTCATAGGGCA-3'（配列番号１７）；
R4：5'-GGATATATATATATCCCATCGCTATCTGAGCAGCGC-3'（配列番号１８）。 Reverse primer:
R1: 5'-GGATATATATATATCC AGATTCTCTTCCTCTGTGCG- 3 '(SEQ ID NO: 15);
R2: 5'-GGATATATATATATCC CTGGAGTCTTCCAGTGTGAT- 3 '(SEQ ID NO: 16);
R3: 5'-GGATATATATATATCC CTCAGGCGGCTCATAGGGCA- 3 '(SEQ ID NO: 17);
R4: 5′-GGATATATATATATCC CATCGCTATCTGAGCAGCGC- 3 ′ (SEQ ID NO: 18).

フォワードプライマーの名称の最初に付された番号は、検査の対象となるｐ５３遺伝子中のコドン番号を示している。また、フォワードプライマーの配列中、下線を付した箇所は検査対象の変異にかかるヌクレオチド残基である。さらに、「Ｆ」はフォワードプライマーを示し、「Ｒ」はリバースプライマーを示す。また、「Ｗ」はそのプライマーが野生型の配列を含むことを意味し、「Ｍ」はそのプライマーが変異型の配列を含むことを意味する。 The number given at the beginning of the name of the forward primer indicates the codon number in the p53 gene to be examined. In the forward primer sequence, the underlined portion is the nucleotide residue involved in the mutation to be examined. Further, “F” represents a forward primer, and “R” represents a reverse primer. “W” means that the primer contains a wild type sequence, and “M” means that the primer contains a mutant type sequence.

フォワードプライマーは、その３’末端側にある配列（約２０ｍｅｒ）が鋳型にアニーリングし、５’末端側にある配列（１０ｍｅｒ）がそのプライマーによる伸長鎖上の、該プライマーの３’末端残基の１６塩基下流から始まる領域にハイブリダイズするように設計されている。リバースプライマーは、その３’末端側にある配列（２０ｍｅｒ）が鋳型にアニーリングし、５’末端側にある配列（１６ｍｅｒ）がその領域内で折り畳まれる構造をとるように設計されている。フォワードプライマーは変異にかかるヌクレオチド残基を含んでいるため、核酸増幅反応による増幅産物の有無によって、変異にかかる残基がそのフォワードプライマーに含まれているものか否かを判定することが可能となる。 The forward primer has a 3 ′ terminal sequence (about 20 mer) annealed to the template, and a 5 ′ terminal sequence (10 mer) of the 3 ′ terminal residue of the primer on the extended strand of the primer. It is designed to hybridize to a region starting from 16 bases downstream. The reverse primer is designed so that the sequence on the 3 'end side (20mer) is annealed to the template, and the sequence on the 5' end side (16mer) is folded within the region. Since the forward primer contains nucleotide residues involved in the mutation, it is possible to determine whether the residues involved in the mutation are contained in the forward primer based on the presence or absence of amplification products from the nucleic acid amplification reaction. Become.

２名の大腸癌患者（症例１および症例２）から手術によって摘出されたヒト大腸癌組織の原発病巣中心部、近縁部、遠隔部、転移部などの部位から生検針を用いて癌組織を採取し、それぞれの組織を１ｍｌの水に懸濁した。これらのサンプルにつき、それぞれ１μｌの懸濁液を核酸増幅反応に用いた。 Using a biopsy needle to remove cancerous tissue from sites such as the central lesion, close part, distant part, metastasis, etc. of human colorectal cancer tissues removed by surgery from two colorectal cancer patients (Case 1 and Case 2) Harvested and each tissue was suspended in 1 ml of water. For each of these samples, 1 μl of the suspension was used for the nucleic acid amplification reaction.

上述の組織懸濁液（１μｌ）を、次の組成を有する反応液（２４μＬ）：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２０ｍＭ，ｐＨ８．８）、ＫＣｌ（１０ｍＭ）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（１０ｍＭ）、ＭｇＳＯ_４（８ｍＭ）、ＤＭＳＯ（３％）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（１％）、ｄＮＴＰ（１．４ｍＭ）、ＭｕｔＳ（１μｇ）、それぞれ２０００ｎＭのプライマー対、サイバーグリーン（０．０１μｌ／ｍｌ）、および８ＵのＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＷＥＮＧＬＡＮＤＢｉｏＬａｂｓ）を含有；に添加し、これを６０℃で２０分間インキュベートした。この増幅反応は、リアルタイムＰＣＲ装置（ストラタジーン社製）を用いて行った。 The above tissue suspension (1 μl) was added to a reaction solution (24 μL) having the following composition: Tris-HCl (20 mM, pH 8.8), KCl (10 mM), (NH ₄ ) ₂ SO ₄ (10 mM), MgSO ₄ (8 mM), DMSO (3%), Triton X-100 (1%), dNTP (1.4 mM), MutS (1 μg), 2000 nM primer pair, Cyber Green (0.01 μl / ml), and 8 U, respectively Of Bst DNA polymerase (NEW ENGLAND BioLabs) was added to and incubated at 60 ° C. for 20 minutes. This amplification reaction was performed using a real-time PCR apparatus (Stratagene).

図５に示すグラフは、症例１の原発巣中心部の組織における増幅反応の経時変化を示す。下記の表１および表２は、それぞれ症例１および症例２について、増幅反応を行った結果をまとめたものである。これらの表において、増幅反応の結果は、増幅産物の増加速度が速いもの（グラフにおいて曲線の立ち上がりが速いもの）から順に、＋＋＋，＋＋，＋，および±とし、全く増幅が見られなかったものを−とした。 The graph shown in FIG. 5 shows the change over time of the amplification reaction in the tissue at the center of the primary lesion of case 1. Tables 1 and 2 below summarize the results of amplification reactions for Case 1 and Case 2, respectively. In these tables, the amplification reaction results are ++++, ++, +, and ± in descending order of the increase rate of the amplification product (the curve has a fast rise), and no amplification was observed. -.

症例１では、癌病巣の中心部には第２４８コドン（アルギニンをコードするコドン）に点突然変異が見つかり、病巣近縁部からも同様の突然変異が見つかったことから、近縁部への癌細胞の浸潤があると考えられた。遠隔部には癌細胞を示す突然変異は観察されなかった。 In Case 1, a point mutation was found at the 248 codon (codon encoding arginine) in the center of the cancer lesion, and a similar mutation was also found in the vicinity of the lesion. There was thought to be cell infiltration. No mutations indicating cancer cells were observed in the remote area.

症例２では、主な病巣と近縁部に第２４５コドン（グリシンをコードするコドン）に点突然変異が見つかったが、すこし離れた位置にあった転移巣と思われる組織からはこの変異は検出されず、第２４８コドンに変異が見つかった。このことから、転移巣の癌組織は原発巣からの転移ではなく、由来が異なる癌細胞であることが示唆された。 In case 2, a point mutation was found at codon 245 (codon encoding glycine) in the immediate vicinity of the main lesion, but this mutation was detected from tissue that appeared to be a metastatic lesion located at a distant location. Instead, a mutation was found at the 248th codon. This suggests that the cancer tissue of the metastatic lesion is not a metastasis from the primary lesion but a cancer cell with a different origin.

図１は、第一のプライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。FIG. 1 is a diagram schematically showing the action mechanism of a nucleic acid amplification reaction using a first primer. 図２は、第二のプライマーの構造を例示した図である。FIG. 2 is a diagram illustrating the structure of the second primer. 図３ａは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。FIG. 3a is a diagram schematically showing the action mechanism of the nucleic acid amplification reaction using the first primer and the second primer. 図３ｂは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いた核酸増幅反応の作用機序を模式的に示した図である。FIG. 3b is a diagram schematically showing the action mechanism of the nucleic acid amplification reaction using the first primer and the second primer. 図４は、ヒトｐ５３遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）中の変異部位を示す図である。FIG. 4 is a diagram showing mutation sites in the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the human p53 gene. 図５は、症例１の原発巣中心部の組織における増幅反応の経時変化を示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing the change over time of the amplification reaction in the tissue at the center of the primary lesion of case 1.

Claims

被験者からの第一の検体に含まれる疾患に関連する細胞またはこれに由来する細胞を、第二の検体において検出する方法であって、
（ａ）第一の検体に含まれるゲノムにおいて、前記疾患に関連する遺伝子変異を検出する工程、
（ｂ）第二の検体に含まれるゲノムにおいて、前記遺伝子変異を検出する工程、ならびに
（ｃ）第一の検体から検出された遺伝子変異と第二の検体から検出された遺伝子変異とを比較する工程
を含んでなり、検出された遺伝子変異が相互に同一である場合に、第一の検体に含まれる疾患関連細胞またはこれに由来する細胞が第二の検体から検出されたことが示される、方法。 A method for detecting in a second specimen a cell associated with or derived from a disease contained in a first specimen from a subject, comprising:
(A) detecting a genetic mutation associated with the disease in the genome contained in the first specimen;
(B) detecting the gene mutation in the genome contained in the second specimen, and (c) comparing the gene mutation detected from the first specimen with the gene mutation detected from the second specimen. A disease-related cell contained in the first specimen or a cell derived therefrom is detected from the second specimen when the detected gene mutation is identical to each other. Method.

第一の検体が前記疾患の治療前に採取されたものであり、第二の検体が前記疾患の治療中または治療後に採取されたものである、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the first specimen is collected before the treatment of the disease, and the second specimen is collected during or after the treatment of the disease.

前記治療が、薬物療法、放射線療法、温熱療法、ホルモン療法、免疫療法、および外科的治療からなる群より選択されるものである、請求項２に記載の方法。 The method of claim 2, wherein the treatment is selected from the group consisting of drug therapy, radiation therapy, hyperthermia, hormone therapy, immunotherapy, and surgical treatment.

第一の検体が前記疾患の病巣部から採取されたものであり、第二の検体が他の部位から採取されたものである、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the first specimen is collected from a lesion site of the disease and the second specimen is collected from another site.

前記疾患関連細胞が、癌細胞または類癌腫細胞である、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the disease-related cell is a cancer cell or a carcinoma cell.

遺伝子変異の検出が核酸増幅法によって行なわれる、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the detection of the gene mutation is performed by a nucleic acid amplification method.

前記核酸増幅法が、等温下での反応によって標的核酸の増幅を可能とするものである、請求項６に記載の方法。 The method according to claim 6, wherein the nucleic acid amplification method enables amplification of a target nucleic acid by a reaction under isothermal conditions.

核酸増幅法に用いられるプライマーセットが、標的核酸配列を増幅しうる少なくとも２種のプライマーを含んでなるプライマーセットであって、
前記プライマーセットに含まれる第一のプライマーが、標的核酸配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的核酸配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含んでなるものであり、
前記プライマーセットに含まれる第二のプライマーが、前記標的核酸配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含んでなり、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含んでなるものである、請求項７に記載の方法。 The primer set used in the nucleic acid amplification method is a primer set comprising at least two kinds of primers capable of amplifying a target nucleic acid sequence,
The first primer included in the primer set comprises a sequence (Ac ′) that hybridizes to the sequence (A) of the 3 ′ end portion of the target nucleic acid sequence at the 3 ′ end portion, and The sequence (B ′) hybridizes to the complementary sequence (Bc) of the sequence (B) existing 5 ′ to the sequence (A) on the 5 ′ side of the sequence (Ac ′). ,
The second primer included in the primer set comprises a sequence (Cc ′) that hybridizes to the sequence (C) of the 3 ′ end portion of the complementary sequence of the target nucleic acid sequence at the 3 ′ end portion, and The method according to claim 7, comprising a folded sequence (D-Dc ′) containing two nucleic acid sequences that hybridize to the same strand on the 5 ′ side of the sequence (Cc ′).

前記プライマーセットが、前記標的核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズする第三のプライマーであって、標的核酸配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しない第三のプライマーをさらに含んでなるものである、請求項８に記載の方法。 The primer set further includes a third primer that hybridizes to the target nucleic acid sequence or its complementary sequence, and does not compete with other primers for hybridization to the target nucleic acid sequence or its complementary sequence. 9. The method of claim 8, wherein

核酸増幅法において鎖置換能を有するポリメラーゼが使用される、請求項７に記載の方法。 The method according to claim 7, wherein a polymerase having strand displacement ability is used in the nucleic acid amplification method.

核酸増幅法が融解温度調整剤の存在下で行われる、請求項７に記載の方法。 The method according to claim 7, wherein the nucleic acid amplification method is performed in the presence of a melting temperature adjusting agent.

融解温度調整剤が、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ホルムアミドもしくはグリセロール、またはこれらの２種以上の混合物である、請求項１１に記載の方法。 12. The method according to claim 11, wherein the melting temperature adjusting agent is dimethyl sulfoxide, betaine, formamide or glycerol, or a mixture of two or more thereof.

核酸増幅反応がミスマッチ結合タンパク質の存在下で行われる、請求項７に記載の方法。 The method according to claim 7, wherein the nucleic acid amplification reaction is performed in the presence of a mismatch binding protein.