JP2008151771A - Micro fluid chip - Google Patents

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彰 若林
Hideyuki Karaki
英行 唐木
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吉弘 沢屋敷
Kota Kato
功太 加藤
Yoshihide Iwaki
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a micro fluid chip capable of obtaining an accurate and highly reliable analytical result in a short time, by a simple operation, without requiring skill. <P>SOLUTION: This micro fluid chip is provided with the first port PT-A for feeding a specimen liquid and a pretreatment reagent, the second port PT-D for feeding a reaction amplification reagent, the third port PT-B and the fourth port PT-C for supplying air pressure into a flow passage, the first flow passage A for mixing the specimen liquid and the pretreatment reagent to generate the first mixture solution, the second flow passage B for heating the first mixture solution, the third flow passage C for joining the reaction amplification reagent to the first mixture solution, the fourth flow passage D immobilization-mounted with an enzyme through which the second mixture solution is passed, the fifth flow passage E for promoting the mixing of the enzyme into the second mixture solution treated in the fourth flow passage D, a plurality of the sixth flow passage F connected to he fifth flow passages E, and for detecting DNA amplification or the like by dissolution and heating of a primer immobilization-mounted in the flow passage, and the seventh flow passage connected to sixth flow passages F and for dispensing the second mixture solution with a constant quantity into the plurality of sixth flow passages F. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、血液等の生体物質を分析するマイクロ流体チップに関する。   The present invention relates to a microfluidic chip for analyzing biological materials such as blood.

近年の分子生物学の進歩により、血液等の生体物質を分析する事により、病気の治療における薬剤投与の効果や副作用の体質による個人差を予知することが可能であることが示されてきており、これを利用して、個人個人にとって最適な治療を施していこうという気運が高まっている。例えば、特定の遺伝子と、特定の治療薬剤の効果や副作用が強く相関することがわかっている場合、この情報を特定の患者の治療に役立てるためには、患者の遺伝子の塩基配列を知る必要がある。内因性遺伝子の変異又は一塩基多型（ＳＮＰ）に関する情報を得るための遺伝子診断は、そのような変異又は一塩基多型を含む標的核酸の増幅及び検出により行なうことができる。このため、サンプル中の標的核酸を迅速且つ正確に増幅及び検出し得る簡便な方法が求められる。   Recent advances in molecular biology have shown that by analyzing biological substances such as blood, it is possible to predict individual differences due to the effects of drug administration and side effects on the treatment of diseases. There is a growing interest in using this to provide optimal treatment for individuals. For example, if it is known that the effect and side effects of a specific gene and a specific therapeutic drug are strongly correlated, it is necessary to know the nucleotide sequence of the patient's gene in order to use this information for the treatment of a specific patient. is there. Genetic diagnosis for obtaining information on endogenous gene mutation or single nucleotide polymorphism (SNP) can be performed by amplification and detection of a target nucleic acid containing such mutation or single nucleotide polymorphism. Therefore, there is a need for a simple method that can rapidly and accurately amplify and detect a target nucleic acid in a sample.

この場合、被検出物質と特異的に結合する抗体又は抗原等のタンパク質或いは一本鎖の核酸をプローブに使い、微粒子、ビーズ、ガラス板等の固相表面に固定し、被検出物質と抗原抗体反応又は核酸ハイブリダイゼーションを行う。そして、酵素等の検知感度の高い標識物質を担持した特異的な相互作用を有する標識化物質、例えば標識化抗体や標識化抗原又は標識化核酸等を用いて、抗原抗体化合物や２本鎖の核酸を検出して、被検物質の有無の検出或いは被検物質の定量を行っている。   In this case, a protein such as an antibody or antigen that specifically binds to the substance to be detected, or a single-stranded nucleic acid is used as a probe and immobilized on a solid surface such as a fine particle, a bead, or a glass plate. Perform reaction or nucleic acid hybridization. Then, using a labeled substance having a specific interaction carrying a labeled substance with high detection sensitivity such as an enzyme, such as a labeled antibody, a labeled antigen or a labeled nucleic acid, an antigen antibody compound or a double-stranded Nucleic acids are detected to detect the presence or absence of the test substance or to quantify the test substance.

この種の技術として、例えば特許文献１に開示される細菌芽胞処理チップ及び細菌芽胞処理装置は、芽胞を形成した細菌を含む試料が供給される注入口と、注入口に供給された試料に導入される発芽促進剤を保管する発芽促進液保管部と、試料と発芽促進剤とを混合した液に導入される溶解液を保管する溶解液保管部と、試料と発芽促進剤と溶解液とを混合し、試料から遺伝子が溶出される遺伝子溶出部と、溶出遺伝子と結合する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、遺伝子抽出部に導入される溶離液を保管する溶離液保管部と、溶離液により溶離された遺伝子が導入される反応部とを備え、取扱いが容易で安価、且つ細菌芽胞から遺伝子の抽出・分析までが一括して自動化できるように図られている。   As this type of technology, for example, a bacterial spore processing chip and a bacterial spore processing device disclosed in Patent Document 1 are introduced into an inlet supplied with a sample containing bacteria that have formed spores, and introduced into the sample supplied to the inlet A germination promoting liquid storage unit for storing a germination promoter to be stored, a solution storage part for storing a solution introduced into a liquid in which the sample and the germination promoter are mixed, a sample, a germination promoting agent, and a solution A gene elution part that mixes and elutes genes from the sample, a gene extraction part that includes a gene binding carrier that binds to the eluted gene, a cleaning liquid storage part that stores the cleaning liquid introduced into the gene extraction part, and a gene extraction part It is equipped with an eluent storage part that stores the eluent to be introduced and a reaction part into which the gene eluted by the eluent is introduced, and it is easy to handle and inexpensive, and everything from bacterial spores to gene extraction / analysis is integrated. Automation It has been attempted to kill.

また、特許文献２に開示される核酸増幅基板は、ガラス板からなる第一層とシリコンゴムからなる第二層が積層されたものである。第二層には、第一層との接触面側に微細な溝加工が施され、第一層と第二層の間で空隙が形成されている。核酸増幅基板では、空隙のパターン（溝パターン）によって４系統の核酸増幅・分離流路が形成されている。核酸増幅・分離流路は、反応液溜部と電気泳動部を有し、これらの周辺に反応液往復流路、反応液吸引路、核酸供給路が設けられたものである。反応液溜部は、正面視が略正方形の空隙内にジグザクで迷路状の流路を設けたものである。これにより、基板上でＰＣＲ等の核酸増幅反応を行う核酸増幅基板において、核酸増幅反応工程において反応液が洩れることのないように図られている。   The nucleic acid amplification substrate disclosed in Patent Document 2 is a laminate in which a first layer made of a glass plate and a second layer made of silicon rubber are laminated. The second layer is finely grooved on the contact surface side with the first layer, and a gap is formed between the first layer and the second layer. In the nucleic acid amplification substrate, four types of nucleic acid amplification / separation flow paths are formed by void patterns (groove patterns). The nucleic acid amplification / separation flow path has a reaction liquid reservoir and an electrophoresis part, and a reaction liquid reciprocating flow path, a reaction liquid suction path, and a nucleic acid supply path are provided around these. The reaction liquid reservoir is provided with a zigzag labyrinth-like flow path in a gap that is substantially square in front view. Thus, in a nucleic acid amplification substrate that performs a nucleic acid amplification reaction such as PCR on the substrate, the reaction solution is prevented from leaking in the nucleic acid amplification reaction step.

さらに、特許文献３に開示される生体物質検査デバイスは、試薬類・送液系用のエレメントを搭載した、検体ごとのマイクロリアクタなるチップ・コンポーネント、デバイス本体である制御・検出コンポーネントとを別個にシステム構成することにより、極微量分析、増幅反応に対して、クロス・コンタミネーション、キャリーオーバー・コンタミネーションが生じ難く図られている。   Furthermore, the biological material testing device disclosed in Patent Document 3 is a system in which a chip component, which is a microreactor for each specimen, and a control / detection component, which is a device main body, are equipped with elements for reagents and a liquid delivery system. By configuring, cross contamination and carry-over contamination are unlikely to occur with respect to trace analysis and amplification reaction.

特開２００５−２５３３６５号公報JP 2005-253365 A 特開２００６−１１５７４１号公報JP 2006-115741 A 特開２００６−１２５９９０号公報JP 2006-125990 A 特開２００５−１６０３８７号公報JP 2005-160387 A

しかしながら、特定の遺伝子の塩基配列を知る従来の方法としては、ＤＮＡシーケンサーや、ＮＤＡマイクロアレイ等が知られているが、これらには、一般的に装置やチップのコストが高く、検査に要する時間も長い等、種々の問題があった。すなわち、特許文献１においては、遺伝子の抽出、分析を一括して自動化できるが、単一の項目のみしか検出できないという問題があった。
また、特許文献２においては、複数の項目を一括して検査できるが、遺伝子の抽出、検体の分注、増幅に必要な試薬の準備は前処理として行う必要があり、手動操作で行う場合は操作が煩雑な上、熟練が必要であり、誤操作によるコンタミ等により間違った結果を得てしまう危険性があった。自動操作で行う場合、装置が複雑、大型化し、高価になるという問題があった。
さらに、特許文献３においては、複数の項目を一括して検査できるチップが開示されているが、予め設定された圧力に達すると液体の通過を許可するための送液制御部や、流路内の液体の逆流を防止する逆流防止部等の複雑な立体的構造を必要とし、回路が非常に複雑であり、多項目の検査を行おうとした場合、高価なチップになってしまうという問題があった。
一方、特許文献４にはターゲット遺伝子のみを増幅し、これを比較的簡便な検出系で分析する核酸の増幅法及び核酸増幅用プライマーセットが提案されているが、この反応を一般の生化学分析で用いられているマイクロチューブを用いたピペット操作による方法で行う場合、試薬類の準備、ピペッティングの操作、装置への出し入れ等、操作が煩雑であるとともに、熟練が必要であるという問題があった。特に、複数のターゲット遺伝子を分析する場合、操作の煩雑さにより薬液のとり間違いやコンタミの危険性が増大し、検査結果の信頼性が不足するという問題があった。 However, as a conventional method for knowing the base sequence of a specific gene, a DNA sequencer, an NDA microarray, or the like is known. There were various problems such as being long. That is, in Patent Document 1, gene extraction and analysis can be automated together, but there is a problem that only a single item can be detected.
In Patent Document 2, a plurality of items can be examined at once, but the preparation of reagents necessary for gene extraction, sample dispensing, and amplification must be performed as a pretreatment, The operation is complicated and requires skill, and there is a risk that an incorrect result may be obtained due to contamination due to an erroneous operation. When the automatic operation is performed, there is a problem that the apparatus becomes complicated, large, and expensive.
Further, Patent Document 3 discloses a chip capable of inspecting a plurality of items at once. However, when a preset pressure is reached, a liquid feed control unit for permitting the passage of liquid, This requires a complicated three-dimensional structure such as a backflow prevention unit that prevents the backflow of liquid, and the circuit is very complicated. When a multi-item inspection is attempted, an expensive chip is required. It was.
On the other hand, Patent Document 4 proposes a nucleic acid amplification method and a nucleic acid amplification primer set in which only a target gene is amplified and analyzed with a relatively simple detection system. When using the pipetting method using the microtubes used in the above, there are problems such as preparation of reagents, pipetting operation, loading and unloading into and from the apparatus, as well as complicated operations. It was. In particular, when analyzing a plurality of target genes, there is a problem in that the complexity of the operation increases the risk of taking a chemical solution and the risk of contamination, resulting in insufficient reliability of the test results.

本発明は上記状況に鑑みてなされたもので、熟練を要さない簡単な操作で、正確かつ信頼性の高い分析結果を低コスト、短時間で得られるマイクロ流体チップを提供することを目的としている。   The present invention has been made in view of the above situation, and an object thereof is to provide a microfluidic chip capable of obtaining accurate and reliable analysis results at low cost and in a short time by a simple operation that does not require skill. Yes.

本発明の上記目的は、下記構成により達成される。
（１） 複数種の核酸配列を検出するための流路を備えたマイクロ流体チップであって、
核酸を含む検体液と第１液とを投入する第１ポートと、
第２液を投入する第２ポートと、
前記流路内に空気圧を供給する第３ポートと、
前記第１ポートから投入された検体液と前記第１液とを混合して第１混合液を生成する第１の流路（Ａ）と、
前記第１混合液を加熱する第２の流路（Ｂ）と、
前記第２の流路（Ｂ）で処理された前記第１混合液に第２液を合流させる第３の流路（Ｃ）と、
前記第３の流路（Ｃ）で合流された第２混合液が通過することにより溶解する第1固体を実装した第４の流路（Ｄ）と、
前記第４の流路（Ｄ）で処理される第２混合液への前記第１固体の混合を助長する第５の流路（Ｅ）と、
前記第５の流路（Ｅ）に接続され、流路内に固化実装された第２固体を有する第６の流路（Ｆ）と、
前記複数の第６の流路に接続され前記第５の流路（Ｅ）で処理された第２混合液を前記複数の第６の流路（Ｆ）それぞれに定量分注するための第７の流路（Ｇ）と、
を有して構成されるマイクロ流体チップ。 The above object of the present invention is achieved by the following configurations.
(1) A microfluidic chip provided with a flow path for detecting a plurality of types of nucleic acid sequences,
A first port for introducing a sample liquid containing nucleic acid and a first liquid;
A second port for charging the second liquid;
A third port for supplying air pressure into the flow path;
A first flow path (A) for mixing the sample liquid introduced from the first port and the first liquid to generate a first mixed liquid;
A second flow path (B) for heating the first mixed liquid;
A third flow path (C) for joining the second liquid to the first mixed liquid treated in the second flow path (B);
A fourth flow path (D) mounted with a first solid that dissolves when the second mixed liquid merged in the third flow path (C) passes;
A fifth channel (E) that facilitates the mixing of the first solid into the second mixture to be processed in the fourth channel (D);
A sixth channel (F) connected to the fifth channel (E) and having a second solid solidified and mounted in the channel;
A seventh mixture for dispensing quantitatively the second mixed liquid connected to the plurality of sixth channels and processed in the fifth channel (E) into each of the plurality of sixth channels (F). A flow path (G) of
A microfluidic chip having a structure.

このマイクロ流体チップによれば、検体液と第1液とを投入する第１ポート、第２液を投入する第２ポート、流路内に空気圧を供給する第３ポートに加え、各種試薬との混合、混合液の定量分注のための流路を構成手段として備えることにより、有限な液体が、特に、能動的なバルブやポンプを内臓していないシンプルな流路によっても、チップ外部からの空圧駆動で複雑にハンドリング可能となる。つまり、立体的に複雑な構造を必要とせず、簡単な構造で送液制御が可能となる。これにより、検体と液体試薬を投入するだけで、自動的に所望の液滴操作、化学反応を行い、ピペッティングの操作、装置への出し入れ等の煩雑な操作を不要にして、高い分析結果が得られる。   According to this microfluidic chip, in addition to the first port for supplying the sample liquid and the first liquid, the second port for supplying the second liquid, the third port for supplying air pressure into the flow path, By providing a flow path for mixing and quantitative dispensing of mixed liquid as a constituent means, a finite liquid can be removed from the outside of the chip, even with a simple flow path that does not contain an active valve or pump. It can be handled in a complicated manner by pneumatic drive. That is, liquid feeding control is possible with a simple structure without requiring a three-dimensionally complicated structure. This makes it possible to perform a desired droplet operation and chemical reaction automatically by simply inserting a sample and a liquid reagent, eliminating the need for complicated operations such as pipetting and loading / unloading to / from the device, and providing high analysis results. can get.

（２） （１）項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第１液が前処理試薬で構成されているマイクロ流体チップ。 (2) The microfluidic chip according to (1),
A microfluidic chip in which the first liquid is composed of a pretreatment reagent.

このマイクロ流体チップによれば、検体液と前処理試薬とが混合されることになる。   According to this microfluidic chip, the sample liquid and the pretreatment reagent are mixed.

（３） （１）又は（２）記載のマイクロ流体チップであって、
前記第２液が反応増幅試薬で構成されているマイクロ流体チップ。 (3) The microfluidic chip according to (1) or (2),
A microfluidic chip in which the second liquid is composed of a reaction amplification reagent.

このマイクロ流体チップによれば、第１混合液に搬送増幅試薬が混合される。   According to this microfluidic chip, the carrier amplification reagent is mixed with the first mixed solution.

（４） （１）〜（３）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第１固体に酵素が混合されているマイクロ流体チップ。 (4) The microfluidic chip according to any one of (1) to (3),
A microfluidic chip in which an enzyme is mixed with the first solid.

このマイクロ流体チップによれば、酵素が第２液の通過により溶解する。   According to this microfluidic chip, the enzyme is dissolved by the passage of the second liquid.

（５） （１）〜（４）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第２固体にプライマーが混合されているマイクロ流体チップ。 (5) The microfluidic chip according to any one of (1) to (4),
A microfluidic chip in which a primer is mixed with the second solid.

このマイクロ流体チップによれば、第２固体にプライマーが混合されることで、ＤＮＡ増幅が行われる。   According to this microfluidic chip, DNA amplification is performed by mixing a primer with the second solid.

（６） （１）〜（５）のいずれか１項項記載のマイクロ流体チップであって、
前記マイクロ流体チップが、血液中に含まれる複数種の核酸配列の有無を検出するためのものであるマイクロ流体チップ。 (6) The microfluidic chip according to any one of (1) to (5),
A microfluidic chip, wherein the microfluidic chip is for detecting the presence or absence of a plurality of types of nucleic acid sequences contained in blood.

このマイクロ流体チップによれば、血液（全血）が検体とされ、標的核酸を増幅してこれを検出することで、感染症の原因となる病原体に特異的な標的核酸の増幅及び検出が可能となり、検体中の該病原体の存否が判定可能となる。   According to this microfluidic chip, blood (whole blood) is used as a specimen, and target nucleic acid can be amplified and detected by amplifying the target nucleic acid and detecting it. Thus, the presence or absence of the pathogen in the sample can be determined.

（７） （１）〜（６）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記マイクロ流体チップが、一塩基多型の有無を検出するためのものであるマイクロ流体チップ。 (7) The microfluidic chip according to any one of (1) to (6),
A microfluidic chip for detecting the presence or absence of a single nucleotide polymorphism.

このマイクロ流体チップによれば、血液（全血）が検体とされ、ターゲット配列の核酸が特異的に増幅するための反応とその検出とがマイクロ流体チップ上で行われ、一塩基多型の複数ターゲット遺伝子が検査可能となる。   According to this microfluidic chip, blood (whole blood) is used as a specimen, a reaction for specifically amplifying the nucleic acid of the target sequence and its detection are performed on the microfluidic chip, and a plurality of single nucleotide polymorphisms The target gene can be examined.

（８） （１）〜（７）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第６の流路（Ｆ）において等温でＤＮＡ増幅反応を行うマイクロ流体チップ。 (8) The microfluidic chip according to any one of (1) to (7),
A microfluidic chip that performs a DNA amplification reaction isothermally in the sixth channel (F).

このマイクロ流体チップによれば、等温増幅反応により、使用する酵素の活性が一定に維持できる温度に保たれる。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度をいう。さらに、「ほぼ一定の温度」とは、酵素及びプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。   According to this microfluidic chip, the temperature of the enzyme used can be maintained at a constant temperature by an isothermal amplification reaction. Here, “isothermal” refers to a substantially constant temperature at which the enzyme and primer can substantially function. Furthermore, “substantially constant temperature” means that any temperature change that does not impair the substantial functions of the enzyme and the primer is acceptable.

（９） （１）〜（８）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記ＤＮＡ増幅で発生する蛍光を検出可能とする透光性を有しているマイクロ流体チップ。 (9) The microfluidic chip according to any one of (1) to (8),
A microfluidic chip having translucency capable of detecting fluorescence generated by the DNA amplification.

このマイクロ流体チップによれば、透光性を有することで、検出試薬に例えばサイバーグリーンが用いられ、反応によって増幅された２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることで発する蛍光が測定可能となる。これにより、ターゲットとする遺伝子配列の存在の有無が検出可能となる。   According to this microfluidic chip, since it has translucency, for example, Cyber Green is used as a detection reagent, and fluorescence emitted by intercalating into double-stranded DNA amplified by the reaction can be measured. Thereby, the presence or absence of the target gene sequence can be detected.

（１０） （１）〜（９）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第１の流路（Ａ）が、液体の流動方向に直交する方向の断面積が他の流路における断面積に比して大きい広幅流路部と、該広幅流路部より前記断面積が小さい狭幅流路部とが交互に形成されているマイクロ流体チップ。 (10) The microfluidic chip according to any one of (1) to (9),
The first flow path (A) has a wide flow path portion whose cross-sectional area in a direction orthogonal to the liquid flow direction is larger than the cross-sectional area in the other flow paths, and the cross-sectional area from the wide flow path portion. A microfluidic chip in which narrow channel portions having small diameters are alternately formed.

このマイクロ流体チップによれば、第１ポートに投入された血液が、第１の流路に到達すると、広幅流路部と狭幅流路部とが交互に形成された流路を通過することで、オリフィス作用による撹拌が複数回行われ、血液と前処理試薬とが均一に混合される。   According to this microfluidic chip, when the blood introduced into the first port reaches the first channel, it passes through the channel in which the wide channel unit and the narrow channel unit are alternately formed. Thus, stirring by the orifice action is performed a plurality of times, and the blood and the pretreatment reagent are uniformly mixed.

（１１） （１）〜（１０）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第３の流路（Ｃ）が、前記第２液を保持するポートと、前記混合液が送液される主流路と、該主流路の途中に配設され前記ポートと連通させるポート出口流路と、を有して構成されており、それぞれの流路に対する毛細管力の大小関係が ポート出口流路＞主流路＞ポート であるマイクロ流体チップ。 (11) The microfluidic chip according to any one of (1) to (10),
The third channel (C) has a port for holding the second liquid, a main channel through which the mixed liquid is fed, and a port outlet flow arranged in the middle of the main channel and communicating with the port. A microfluidic chip having a relationship of magnitude of capillary force with respect to each flow path: port outlet flow path> main flow path> port.

このマイクロ流体チップによれば、ポート出口流路と主流路の接続部とによってラプラス圧バルブが構成され、加熱処理された血液と前処理試薬に反応増幅試薬が合流する。すなわち、ポートに投入した反応増幅試薬は主流路に流出することなく、ポート出口流路と主流路の接続面で留まる。また、血液と前処理試薬の混合液がポート出口流路に到着すると、ラプラス圧バルブが破壊され、２液体が合流することになる。   According to this microfluidic chip, a Laplace pressure valve is formed by the port outlet flow path and the connection portion of the main flow path, and the reaction amplification reagent joins the heat-treated blood and the pretreatment reagent. That is, the reaction amplification reagent introduced into the port does not flow out to the main channel, but stays at the connection surface between the port outlet channel and the main channel. When the mixed solution of blood and pretreatment reagent arrives at the port outlet channel, the Laplace pressure valve is broken and the two liquids join.

（１２） （１）〜（１１）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第４の流路（Ｄ）は、前記第１固体を固化実装する保持部の流路上流側と下流側が、前記保持部よりも狭幅の流路に形成されているマイクロ流体チップ。 (12) The microfluidic chip according to any one of (1) to (11),
The fourth channel (D) is a microfluidic chip in which a channel upstream side and a downstream side of a holding unit for solidifying and mounting the first solid are formed in a channel narrower than the holding unit.

このマイクロ流体チップによれば、保持部の上流と下流の流路が、保持部より細くなっていることで、乾燥固化した試薬の流路への密着力が無い場合であっても、チップの保存、運搬等の振動により固化試薬が剥がれ落ちて前後の流路へ流出してしまうことが防止される。   According to this microfluidic chip, the flow path upstream and downstream of the holding part is narrower than the holding part, so that even if there is no adhesion to the flow path of the dried and solidified reagent, It is prevented that the solidifying reagent is peeled off due to vibrations such as storage and transportation and flows out into the front and rear flow paths.

（１３） （１）〜（１２）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第５の流路（Ｅ）は複数の液溜め室を有し、前記第４の流路（Ｄ）は前記複数の液溜め室の間に配設され、前記混合液が前記複数の液溜め室間を往復することにより前記第４の流路（Ｄ）に第１固体が溶解、混合されるマイクロ流体チップ。 (13) The microfluidic chip according to any one of (1) to (12),
The fifth channel (E) has a plurality of reservoirs, the fourth channel (D) is disposed between the plurality of reservoirs, and the mixed liquid is the plurality of reservoirs. A microfluidic chip in which a first solid is dissolved and mixed in the fourth flow path (D) by reciprocating between reservoir chambers.

このマイクロ流体チップによれば、血液、前処理試薬、反応増幅試薬の合流液が複数の液溜め室の間を往復することにより、酵素１、酵素２が溶解し、これら酵素１、酵素２と合流液とが均一に混合される。   According to this microfluidic chip, enzyme 1 and enzyme 2 are dissolved by reciprocating the combined solution of blood, pretreatment reagent, and reaction amplification reagent between a plurality of reservoir chambers. The combined liquid is uniformly mixed.

（１４） （１）〜（１３）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、 前記第５の流路は、前記第１および第２ポートから前記第３ポートまでの流路途中に設けられ、前記第１および第２ポート側から順に第１混合部と第２混合部とを配置してなり、
前記第１混合部および第２混合部は、それぞれ前記第１混合液が流動する方向の垂直断面積が他の流路における垂直断面積に比して大きい第１流路部と、該第１流路部より垂直断面積が小さい第２流路部とが交互に形成され、
前記第１混合部における前記第１流路部の垂直断面積が前記第２混合部における前記第１流路部の垂直断面積より小さく、
前記第１混合部における前記第１流路部の流路方向長さが前記第２混合部における前記第１流路部の流路方向長さより長く形成されているマイクロ流体チップ。 (14) The microfluidic chip according to any one of (1) to (13), wherein the fifth flow path is in the middle of the flow path from the first and second ports to the third port. Provided, the first mixing unit and the second mixing unit are arranged in order from the first and second port sides,
The first mixing section and the second mixing section each have a first flow path section in which a vertical cross-sectional area in a direction in which the first mixed liquid flows is larger than a vertical cross-sectional area in other flow paths, The second flow path portions having a smaller vertical cross-sectional area than the flow path portions are alternately formed,
The vertical cross-sectional area of the first flow path part in the first mixing part is smaller than the vertical cross-sectional area of the first flow path part in the second mixing part;
The microfluidic chip in which the flow path direction length of the first flow path part in the first mixing part is longer than the flow direction length of the first flow path part in the second mixing part.

このマイクロ流体チップによれば、第１混合部における第１流路部の垂直断面積を第２混合部における第１流路部の垂直断面積より小さく形成し、第１混合部における第１流路部の流路方向長さを第２混合部における第１流路部の流路方向長さより長く形成したので、メニスカス曲面液端の進行度合いに差異の生じ難い第１混合部にて複数種の液体が予備混合される。そして、混合性能の高い第２混合部においては、異なる濡れ性の液体が対向内表面に接触することによるメニスカス曲面液端の進行度合いの差異を抑制しつつ混合処理できる。これにより、濡れ性の異なる複数液体を混合部に導入する場合であっても、混合部内に液未充填部（気泡）が形成されることがなく、液物性の異なる複数の液体、或いは固体溶解液を安定的に混合することができる。   According to this microfluidic chip, the vertical cross-sectional area of the first flow path part in the first mixing part is formed smaller than the vertical cross-sectional area of the first flow path part in the second mixing part, and the first flow in the first mixing part Since the length in the flow path direction of the path portion is formed longer than the length in the flow path direction of the first flow path portion in the second mixing portion, a plurality of types are used in the first mixing portion in which the difference in the progression degree of the meniscus curved liquid surface is unlikely to occur. Of liquid is premixed. And in the 2nd mixing part with high mixing performance, mixing processing can be performed, suppressing the difference in the degree of advance of the meniscus curved-surface liquid end by the liquid of different wettability contacting the counter inner surface. As a result, even when a plurality of liquids having different wettability are introduced into the mixing part, a liquid unfilled part (bubbles) is not formed in the mixing part, and a plurality of liquids having different liquid properties or solid dissolution The liquid can be mixed stably.

（１５） （１）〜（１４）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第６の流路（Ｆ）の第２固体が、流路上側に固化させて配置したマイクロ流体チップ。 (15) The microfluidic chip according to any one of (1) to (14),
A microfluidic chip in which the second solid in the sixth flow path (F) is disposed on the upper side of the flow path.

このマイクロ流体チップによれば、マイクロチップ使用状態では流路の上面に第２固体が配置され、下面から加熱されることにより、液体の温度上昇に伴って溶解した第２固体は、比重が大きい場合に重力により流路内下側に流動する。   According to this microfluidic chip, when the microchip is in use, the second solid is disposed on the upper surface of the flow path and heated from the lower surface, so that the second solid dissolved as the liquid temperature rises has a high specific gravity. In some cases, it flows downward in the flow path due to gravity.

（１６） （１）〜（１５）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第６の流路（Ｆ）に配置されたプライマーが、加熱により溶解する物質に混合して固化されたものであるマイクロ流体チップ。 (16) The microfluidic chip according to any one of (1) to (15),
A microfluidic chip in which a primer disposed in the sixth channel (F) is mixed and solidified with a substance that dissolves by heating.

このマイクロ流体チップによれば、プライマーが、加熱により溶解する物質である例えばゼラチンと混合して固化され、ゼラチンの重力による流路下側への流動と、液体の加熱による対流の相乗効果により、プライマー及びゼラチンはセル内に短時間で均一に混合拡散される。   According to this microfluidic chip, the primer is solidified by mixing with gelatin, which is a substance that dissolves by heating, for example, due to the synergistic effect of the flow of gelatin below the flow path due to gravity and the convection due to heating of the liquid, Primer and gelatin are uniformly mixed and diffused in the cell in a short time.

（１７） （１）〜（１６）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第６の流路（Ｆ）が、前記プライマーを保持する反応検出セルと、該反応検出セルの上流側流路と、下流側流路と、により構成され、前記反応検出セル全体と、前記上流側流路及び前記下流側流路の前記反応検出セル側の流路の一部からなる被加熱領域の厚みが、他の領域より薄く形成されているマイクロ流体チップ。 (17) The microfluidic chip according to any one of (1) to (16),
The sixth flow path (F) includes a reaction detection cell that holds the primer, an upstream flow path of the reaction detection cell, and a downstream flow path, and the entire reaction detection cell, A microfluidic chip in which a heated region composed of a part of a channel on the reaction detection cell side of an upstream channel and a downstream channel is formed thinner than other regions.

このマイクロ流体チップによれば、被加熱領域の厚みが、他の領域より薄く形成され、均一な加熱が可能となる。   According to this microfluidic chip, the thickness of the heated region is formed thinner than other regions, and uniform heating is possible.

（１８） （１）〜（１７）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記反応増幅試薬による増幅反応を密閉空間内で行うために、前記第１、第２、第３ポートの全てを閉塞する閉塞部材を備えたマイクロ流体チップ。 (18) The microfluidic chip according to any one of (1) to (17),
A microfluidic chip provided with a closing member that closes all of the first, second, and third ports in order to perform an amplification reaction with the reaction amplification reagent in a sealed space.

このマイクロ流体チップによれば、増幅反応前に第１、第２、第３ポートの全てが閉塞部材によって閉塞され、増幅反応がチップ密閉状態で行われる。これにより、チップを密閉しない状態で増幅反応を行った場合、増幅されたＤＮＡがチップ外に流出して環境を汚染し、キャリーオーバーを生じさせる危険性が回避される。   According to this microfluidic chip, all of the first, second, and third ports are closed by the closing member before the amplification reaction, and the amplification reaction is performed in a sealed state of the chip. As a result, when the amplification reaction is performed without sealing the chip, the risk of the amplified DNA flowing out of the chip, contaminating the environment, and causing carryover is avoided.

（１９） （１）〜（１８）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第６の流路（Ｆ）の流路内面が、流路内を液体が流れる際に該液体により充填されない微小な隙間空間の形成を防止する連続した円滑面からなるマイクロ流体チップ。 (19) The microfluidic chip according to any one of (1) to (18),
A microfluidic chip, wherein the inner surface of the sixth channel (F) is a continuous smooth surface that prevents the formation of a minute gap space that is not filled with the liquid when the liquid flows in the channel.

このマイクロ流体チップによれば、流路内面が、微小な隙間空間の形成されない連続した円滑面からなり、加熱の際に流路内に気泡が発生しなくなる。これにより、蛍光検出精度の低下が防止される。   According to this microfluidic chip, the inner surface of the flow path is a continuous smooth surface in which a minute gap space is not formed, and bubbles are not generated in the flow path during heating. This prevents a decrease in fluorescence detection accuracy.

（２０） （１）〜（１９）のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記各流路の流路内面が、少なくとも２段階以上の濡れ性を有しているマイクロ流体
チップ。 (20) The microfluidic chip according to any one of (1) to (19),
A microfluidic chip in which the inner surface of each channel has at least two stages of wettability.

このマイクロ流体チップによれば、濡れ性の異なる樹脂が用いられて、成形流路基板の流路内面が親水化、又は撥水化され、各反応・検出セルへの分注時に液体がスムーズに進入し、出口部でのラプラス圧バルブによる停止が安定に行えるようになる。   According to this microfluidic chip, resins with different wettability are used, and the flow channel inner surface of the molded flow channel substrate is made hydrophilic or water repellent, so that the liquid can be smoothly fed into each reaction / detection cell. When entering, the stop by the Laplace pressure valve at the exit can be stably performed.

本発明に係るマイクロ流体チップによれば、生体細胞（核酸）を含む検体液と第１液とを投入する第１ポートと、第２液を投入する第２ポートと、流路内に空気圧を供給する第３ポートと、第１ポートから投入された検体液と第１液とを混合して第１混合液を生成する第１の流路（Ａ）と、第１混合液を加熱する第２の流路（Ｂ）と、第２の流路（Ｂ）で処理された第１混合液に第２液を合流させる第３の流路（Ｃ）と、第３の流路（Ｃ）で合流された第２混合液が通過することにより溶解する第1固体を実装した第４の流路（Ｄ）と、第４の流路（Ｄ）で処理される第２混合液への第１固体の混合を助長する第５の流路（Ｅ）と、第５の流路（Ｅ）に接続され、流路内に固化実装された第２固体を有する第６の流路（Ｆ）と、複数の第６の流路に接続され第５の流路（Ｅ）で処理された第２混合液を複数の第６の流路（Ｆ）それぞれに定量分注するための第７の流路（Ｇ）とを備えたので、立体的に複雑な構造を必要とせず、簡単な構造で送液制御が行えるとともに、ピペッティングの操作、装置への出し入れ等の煩雑な操作が不要になり、熟練を要さない簡単な操作で、正確かつ信頼性の高い分析結果を低コスト、短時間で得ることができる。   According to the microfluidic chip according to the present invention, the first port for supplying the sample liquid containing the biological cells (nucleic acid) and the first liquid, the second port for supplying the second liquid, and the air pressure in the flow path. A third port to be supplied, a first flow path (A) for mixing the sample liquid and the first liquid supplied from the first port to generate a first mixed liquid, and a first channel for heating the first mixed liquid. The second flow path (B), the third flow path (C) for joining the second liquid to the first mixed liquid processed in the second flow path (B), and the third flow path (C). The fourth flow path (D) on which the first solid that is dissolved by passing the second mixed liquid merged in step (D) is mounted, and the second mixed liquid processed in the fourth flow path (D) A fifth flow path (E) that facilitates mixing of one solid and a sixth flow path (F) that is connected to the fifth flow path (E) and has a second solid solidified and mounted in the flow path And a plurality of sixth streams And a seventh flow path (G) for quantitatively dispensing the second mixed solution connected to the flow path and processed in the fifth flow path (E) into each of the plurality of sixth flow paths (F). Therefore, it does not require a three-dimensionally complicated structure, and liquid feeding control can be performed with a simple structure, and complicated operations such as pipetting operations and loading / unloading to / from the apparatus are not required, and no skill is required. With a simple operation, an accurate and reliable analysis result can be obtained at a low cost in a short time.

以下、本発明に係るマイクロ流体チップの好適な実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
図１は本発明に係るマイクロ流体チップを検査装置の概略構成と共に表したブロック図である。
本発明の第１実施形態に係るマイクロ流体チップ（以下、単に「チップ」とも称す。）１００は、検査装置１１にセットされて使用され、一回の使用後に廃棄される。本実施の形態は、検体である血液（全血）がマイクロ流体チップ１００に注入される。マイクロ流体チップ１００は、検査装置１１にセットされることで、チップ外部からの物理的作用力によって検体液がハンドリングされ、例えば一塩基多型の複数ターゲット遺伝子が検査されるものであり、特開2005-160387に示されているような、ターゲット配列の核酸を等温で特異的に増幅するための反応とその検出をチップ１００上で実現可能とするものである。これにより、例えば、標的核酸を増幅してこれを検出することで、感染症の原因となる病原体に特異的な標的核酸の増幅及び検出が可能となり、検体中の該病原体の存否等が判定可能となる。 Hereinafter, preferred embodiments of a microfluidic chip according to the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
FIG. 1 is a block diagram showing a microfluidic chip according to the present invention together with a schematic configuration of an inspection apparatus.
The microfluidic chip (hereinafter, also simply referred to as “chip”) 100 according to the first embodiment of the present invention is set and used in the inspection apparatus 11 and discarded after one use. In the present embodiment, blood (whole blood) as a specimen is injected into the microfluidic chip 100. When the microfluidic chip 100 is set in the testing apparatus 11, a sample liquid is handled by a physical acting force from the outside of the chip, for example, a single nucleotide polymorphism multiple target gene is tested. As shown in 2005-160387, it is possible to realize on the chip 100 a reaction and a detection for specifically amplifying a target sequence nucleic acid isothermally. This makes it possible to amplify and detect the target nucleic acid specific to the pathogen causing the infection, for example, by amplifying the target nucleic acid and detecting it, and determine the presence or absence of the pathogen in the sample. It becomes.

本実施の形態において、物理的作用力は、液流路の始点と終点に設けたポート部ＰＴからエア供給又はエア吸引することにより発生する空気圧作用力（空圧駆動力）である。したがって、液流路内に供給された液体が、液流路の始点と終点とに作用されるエア供給又はエア吸引により、液流路内の所望位置へ移動制御可能となる。この際、液体は、始点と先端部、後端部と終点との間に介在する気体に挟持された状態で保持され、引っ張り力の作用により途中で分断されることがない。   In the present embodiment, the physical acting force is a pneumatic acting force (pneumatic driving force) generated by air supply or air suction from the port part PT provided at the start point and end point of the liquid flow path. Accordingly, the liquid supplied into the liquid flow path can be controlled to move to a desired position in the liquid flow path by air supply or air suction applied to the start point and end point of the liquid flow path. At this time, the liquid is held in a state of being sandwiched by the gas interposed between the start point and the front end portion and between the rear end portion and the end point, and is not divided in the middle by the action of the pulling force.

なお、ＤＮＡ増幅反応は、等温増幅反応により、使用する酵素の活性が一定に維持できる温度に保たれる。ここで、「等温」とは、酵素およびプライマーが実質的に機能しうるような、ほぼ一定の温度をいう。さらに、「ほぼ一定の温度」とは、酵素及びプライマーの実質的な機能を損なわない程度の温度変化であれば許容されることを意味する。   The DNA amplification reaction is maintained at a temperature at which the activity of the enzyme used can be maintained constant by an isothermal amplification reaction. Here, “isothermal” refers to a substantially constant temperature at which the enzyme and primer can substantially function. Furthermore, “substantially constant temperature” means that any temperature change that does not impair the substantial functions of the enzyme and the primer is acceptable.

検査装置１１は、作動流体として空気が使用されるポンプＰＭＰと、バルブＳＶ１，ＳＶ２，ＳＶ３，ＳＶ４，ＳＶ５と、検体加熱部１３と、温調部１５と、液位置検出部１６と、蛍光検出部１７と、これらに接続され検出信号が入力され、或いは制御信号を送出する制御部１９とが基本構成要素として設けられている。また、ポンプＰＭＰとバルブＳＶ４との間には圧力センサＰＳが設けられている。バルブＳＶ４はポンプＰＭＰとバルブＳＶ２との間に介装され、バルブＳＶ２は作動流体制御側がチップ１００の第４ポートＰＴ−Ｃと、バルブＳＶ１は作動流体制御側がチップ１００の第２ポートＰＴ−Ｄと、バルブＳＶ３は作動流体制御側が第１ポートＰＴ−Ａとに接続され、バルブＳＶ２の作動流体制御側とバルブＳＶ１の作動流体入力側はチップ１００の第３ポートＰＴ−Ｂに接続される。また、検体加熱部１３は、チップ１００の被加熱部Ｂを加熱し、温調部１５はチップ１００の反応部Ｆの温度調節を行い、蛍光検出部１７は反応部Ｆの蛍光を検出可能としている。これら各構成要素の動作については後に詳述する。   The inspection apparatus 11 includes a pump PMP that uses air as a working fluid, valves SV1, SV2, SV3, SV4, SV5, a specimen heating unit 13, a temperature adjustment unit 15, a liquid position detection unit 16, and fluorescence detection. A unit 17 and a control unit 19 connected to these for receiving a detection signal or transmitting a control signal are provided as basic components. A pressure sensor PS is provided between the pump PMP and the valve SV4. The valve SV4 is interposed between the pump PMP and the valve SV2, and the valve SV2 is a fourth port PT-C of the chip 100 on the working fluid control side, and the valve SV1 is a second port PT-D of the chip 100 on the working fluid control side. The working fluid control side of the valve SV3 is connected to the first port PT-A, and the working fluid control side of the valve SV2 and the working fluid input side of the valve SV1 are connected to the third port PT-B of the chip 100. The specimen heating unit 13 heats the heated part B of the chip 100, the temperature adjustment unit 15 adjusts the temperature of the reaction unit F of the chip 100, and the fluorescence detection unit 17 can detect the fluorescence of the reaction unit F. Yes. The operations of these components will be described in detail later.

図２は図１に示したマイクロ流体チップの分解斜視図、図３はマイクロ流体チップの上面視を（ａ）、下面視を（ｂ）に表した平面図である。
マイクロ流体チップ１００は、図２に示すように、流路基板２１と、この流路基板２１の一方の面（下面）２２に貼着される蓋材２３とにより構成されている。流路基板２１は、熱可塑性の高分子ポリマーの射出成形により製作される。使用する高分子ポリマーは、特に限定されないが、光学的に透明であり、耐熱性が高く、化学的に安定であり、射出成形が容易なものが望ましく、ＣＯＰ、ＣＯＣ、ＰＭＭＡ等が好適である。光学的に透明とは、検出に用いる励起光や蛍光の波長において透過性が高く、散乱が小さく、自家蛍光が少ないことである。チップ１００は、蛍光を検出可能とする透光性を有していることで、検出試薬に例えばサイバーグリーンが用いられ、反応によって増幅された２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることで発する蛍光が測定可能となる。これにより、ターゲットとする遺伝子配列の存在の有無が検出可能となる。 2 is an exploded perspective view of the microfluidic chip shown in FIG. 1, and FIG. 3 is a plan view showing the microfluidic chip in a top view (a) and a bottom view (b).
As shown in FIG. 2, the microfluidic chip 100 includes a flow path substrate 21 and a lid member 23 attached to one surface (lower surface) 22 of the flow path substrate 21. The flow path substrate 21 is manufactured by injection molding of a thermoplastic polymer. The polymer used is not particularly limited, but is preferably optically transparent, highly heat resistant, chemically stable, and easily injection-molded. COP, COC, PMMA, etc. are preferred. . Optically transparent means high transparency at the wavelength of excitation light or fluorescence used for detection, small scattering, and little autofluorescence. The chip 100 has translucency that enables detection of fluorescence. For example, cyber green is used as a detection reagent, and fluorescence emitted by intercalating into double-stranded DNA amplified by reaction is generated. It becomes possible to measure. Thereby, the presence or absence of the target gene sequence can be detected.

流路基板２１の他方の面（上面）２８には掘り込み２９，３１が形成され、掘り込み２９，３１は被加熱部Ｂ、反応部Ｆに対応して位置している。また、流路基板２１の下面２２には図３に示すように、上記の第１ポートＰＴ−Ａ、第２ポートＰＴ−Ｄ、第３ポートＰＴ−Ｂ、第４ポートＰＴ−Ｃに連通する開口３３，３５，３７，３９が設けられている。流路基板２１は、外形が例えば縦横Ｗ２，Ｗ１が５５×９１ｍｍであり、厚みｔが２ｍｍ程度で形成される。   Excavations 29 and 31 are formed in the other surface (upper surface) 28 of the flow path substrate 21, and the excavations 29 and 31 are located corresponding to the heated part B and the reaction part F. Further, as shown in FIG. 3, the lower surface 22 of the flow path substrate 21 communicates with the first port PT-A, the second port PT-D, the third port PT-B, and the fourth port PT-C. Openings 33, 35, 37, and 39 are provided. The flow path substrate 21 has an outer shape of 55 × 91 mm in length and width W2, W1, and a thickness t of about 2 mm, for example.

蓋材２３は、流路基板２１の流路面（下面２２）に形成されたポート、セル、流路（溝）に蓋をするための部材であり、蓋材２３と流路基板２１は接着剤や粘着剤により接合される。蓋材２３としては、流路基板同様、光学的に透明であり、耐熱性が高く、化学的に安定であるシート状の高分子ポリマーを用いる。本実施の形態では、１００μｍの厚みのＰＣＲ用プレートシールを用いた（プラスチックフィルムに粘着剤が塗布されている）。   The lid member 23 is a member for covering ports, cells, and channels (grooves) formed on the channel surface (lower surface 22) of the channel substrate 21, and the lid member 23 and the channel substrate 21 are adhesives. And bonded with adhesive. As the lid member 23, a sheet-like high molecular polymer that is optically transparent, has high heat resistance, and is chemically stable is used, like the flow path substrate. In this embodiment, a PCR plate seal having a thickness of 100 μm is used (adhesive is applied to a plastic film).

図４は図３（ｂ）の拡大図、図５は閉塞部材の貼着前のチップ下面を表した分解斜視図、図６はポート出口流路の近傍を表す要部拡大平面図である。
流路基板２１には、液体に必要な操作（詳しくは後述）するためのポート、セル、流路等が構成されている。すなわち、図４に示すように、流路基板２１は、生体細胞（核酸）を含む検体液と前処理試薬（第１液）とを投入する第１ポートＰＴ−Ａと、反応増幅試薬（第２液）を投入する第２ポートＰＴ−Ｄと、流路内に空気圧を供給する第３ポートＰＴ−Ｂと、減圧される流路終端の第４ポートＰＴ−Ｃと、第１ポートＰＴ−Ａから投入された検体液と前処理試薬とを混合して第１混合液を生成する第１の流路（検体混合部）Ａと、第１混合液を加熱して生体細胞よりＤＮＡを抽出し１本鎖に分解する第２の流路（被加熱部）Ｂと、被加熱部Ｂで処理された第１混合液に反応増幅試薬を合流させる第３の流路（試薬合流部）Ｃと、試薬合流部Ｃで合流された第２混合液が通過することにより溶解が進む酵素（第１固体）を固化実装した第４の流路（酵素保持部）Ｄと、酵素保持部Ｄで処理される第２混合液への酵素の混合を助長する第５の流路（酵素混合部）Ｅと、酵素混合部Ｅに接続され、流路内に固化実装されたプライマー（第２固体）の溶解、加熱によるＤＮＡ増幅、ＤＮＡ増幅の検出を同一位置で行う複数の第６の流路（反応部）Ｆと、反応部Ｆの流路に接続され酵素混合部Ｅで処理された第２混合液を反応部Ｆの複数の反応検出セル２７それぞれに定量分注するための第７の流路（定量分注流路）Ｇとを備える。 FIG. 4 is an enlarged view of FIG. 3B, FIG. 5 is an exploded perspective view showing the lower surface of the chip before the closing member is attached, and FIG. 6 is an enlarged plan view of the main part showing the vicinity of the port outlet channel.
The flow path substrate 21 includes ports, cells, flow paths, and the like for operations necessary for the liquid (details will be described later). That is, as shown in FIG. 4, the flow path substrate 21 includes a first port PT-A into which a specimen liquid containing biological cells (nucleic acid) and a pretreatment reagent (first liquid) are charged, and a reaction amplification reagent (first 2 port), the third port PT-B for supplying air pressure into the flow path, the fourth port PT-C at the end of the flow path to be decompressed, and the first port PT- A first flow path (sample mixing unit) A that mixes the sample solution input from A and the pretreatment reagent to generate a first mixed solution, and extracts the DNA from living cells by heating the first mixed solution A second channel (heated portion) B that decomposes into a single strand and a third channel (reagent merging portion) C that joins the reaction amplification reagent to the first mixed solution processed in the heated portion B And a fourth channel (solidified and mounted with an enzyme (first solid) whose dissolution proceeds by passing through the second mixed solution merged in the reagent merging portion C ( Element holding part) D, a fifth flow path (enzyme mixing part) E for promoting the mixing of the enzyme into the second mixed solution treated in the enzyme holding part D, and the flow path connected to the enzyme mixing part E. A plurality of sixth flow paths (reaction units) F that perform dissolution of the primer (second solid) solidified in the interior, DNA amplification by heating, and detection of DNA amplification at the same position; A seventh flow channel (quantitative dispensing flow channel) G for quantitatively dispensing the second mixed solution connected and processed in the enzyme mixing unit E to each of the plurality of reaction detection cells 27 of the reaction unit F is provided.

第１ポートＰＴ−Ａ、第２ポートＰＴ−Ｄ、第３ポートＰＴ−Ｂ、第４ポートＰＴ−Ｃ（ポート部ＰＴ）は、流路基板２１を上下面に貫通した穴により構成され、蓋材２３を貼り付けることにより、流路と連結した凹部が形成される。各ポート部ＰＴは、流路基板２１の他の部分より若干厚みが大きくなっており、この部分に検査装置１１の送液用のポートパッド（図示せず）が接続される。各ポートパッドは、配管を経由してバルブＳＶ１，ＳＶ２，ＳＶ３，ＳＶ４（バルブＳＶ）に接続される。このバルブＳＶには送液駆動のための上記したポンプＰＭＰが接続されている。これらバルブＳＶとポンプＰＭＰの動作を制御部１９によって制御することにより、ポート部ＰＴの空気を減圧、加圧、大気開放、密閉状態にすることができ、流路内の液滴を自在に搬送することができる。   The first port PT-A, the second port PT-D, the third port PT-B, and the fourth port PT-C (port portion PT) are configured by holes penetrating the flow path substrate 21 in the upper and lower surfaces, and the lid By attaching the material 23, a recess connected to the flow path is formed. Each port part PT is slightly thicker than the other part of the flow path substrate 21, and a port pad (not shown) for feeding the inspection apparatus 11 is connected to this part. Each port pad is connected to valves SV1, SV2, SV3, SV4 (valve SV) via piping. The valve SV is connected to the above-described pump PMP for driving liquid feeding. By controlling the operation of the valve SV and the pump PMP by the control unit 19, the air in the port part PT can be decompressed, pressurized, opened to the atmosphere, and sealed, and the droplets in the flow path can be freely conveyed. can do.

また、マイクロ流体チップ１００は、所望の搬送が完了した時点で、ポート部ＰＴからポートパッドを脱離し、図５に示すラベルＲａ，Ｒｂ，Ｒｃ，Ｒｄを貼り付けることにより、チップ１００を密閉状態にすることができるようになっている。チップ１００を密閉しない状態で増幅反応を行った場合、増幅されたＤＮＡがチップ外に流出して環境を汚染し、キャリーオーバーの危険性があり、これを防止するために増幅反応前にチップ１００を密閉状態にする。チップ１００を密閉する手段としては、上記のラベルＲａ，Ｒｂ，Ｒｃ，Ｒｄを貼り付ける方法以外に、密閉性のある不図示のキャップによりポート部ＰＴに栓をする方法や、ＵＶ硬化樹脂をポート部ＰＴに流し込んでからＵＶ光を照射して固化させる等、公知の密閉方法を用いることができる。   Further, the microfluidic chip 100 seals the chip 100 in a hermetically sealed state by removing the port pad from the port part PT and applying the labels Ra, Rb, Rc, Rd shown in FIG. Can be made. When the amplification reaction is performed in a state where the chip 100 is not sealed, the amplified DNA flows out of the chip, contaminates the environment, and there is a risk of carry-over. To prevent this, the chip 100 is subjected to the amplification reaction before the amplification reaction. Is sealed. As means for sealing the chip 100, in addition to the method of attaching the labels Ra, Rb, Rc, Rd, a method of plugging the port portion PT with a cap (not shown) having a sealing property, A known sealing method can be used, such as solidification by irradiation with UV light after pouring into the part PT.

第１ポートＰＴ−Ａは、検体ポートとして使用され、血液１μＬと前処理試薬３μＬとが投入される。前処理試薬は、血液中の白血球から核酸成分を単離するために用いられる。界面活性剤や強アルカリを用いて化学的に溶解処理が行われる。例えば、界面活性剤として、ノニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。また、血液の凝固を防ぐために、へパリンやEDTA等の凝固防止剤を添加しても良い。   The first port PT-A is used as a sample port and is charged with 1 μL of blood and 3 μL of pretreatment reagent. Pretreatment reagents are used to isolate nucleic acid components from white blood cells in the blood. Chemical dissolution treatment is performed using a surfactant or strong alkali. Examples of the surfactant include nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants, and amphoteric surfactants. In order to prevent blood from coagulating, an anticoagulant such as heparin or EDTA may be added.

第２ポートＰＴ−Ｄは、液体試薬ポートとして使用され、反応増幅試薬が５６μＬ投入される。反応増幅試薬には、酵素、プライマー以外の増幅反応と検出に必要とする試薬が含まれている。例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒、ｄＮＴＰミックス等の基質、トリス塩酸バッファー、トライシンバッファー、リン酸ナトリウムバッファー、リン酸カリウムバッファー等の緩衝液を使用することができる。さらに、ジメチルスルホキシド(dimethyl sulfoxide)やベタイン（N,N,N-trimethylglycine）等の添加物、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載の酸性物質、陽イオン錯体等を使用してもよい。   The second port PT-D is used as a liquid reagent port, and 56 μL of reaction amplification reagent is charged. Reaction amplification reagents include reagents required for amplification reactions and detection other than enzymes and primers. For example, a catalyst such as magnesium chloride, magnesium acetate, or magnesium sulfate, a substrate such as dNTP mix, or a buffer solution such as Tris-HCl buffer, tricine buffer, sodium phosphate buffer, or potassium phosphate buffer can be used. Furthermore, additives such as dimethyl sulfoxide and betaine (N, N, N-trimethylglycine), acidic substances described in International Publication No. 99/54455 pamphlet, cation complexes and the like may be used.

検出試薬にはサイバーグリーンを用いることができる。サイバーグリーンは、反応によって増幅された２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることにより、強い蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、ターゲットとする遺伝子配列の存在の有無を検出する。   Cyber Green can be used as a detection reagent. Cyber Green emits strong fluorescence by intercalating into double-stranded DNA amplified by the reaction. By measuring this fluorescence intensity, the presence or absence of the target gene sequence is detected.

第３ポートＰＴ−Ｂ、第４ポートＰＴ−Ｃは、送液ポートとして使用され、ポンプＰＭＰやバルブＳＶによって、減圧、加圧や大気開放状態、閉状態に切り替えられるにより流路内の液滴を駆動する。   The third port PT-B and the fourth port PT-C are used as liquid feeding ports, and the liquid droplets in the flow path are switched by depressurization, pressurization, atmospheric release state, and closed state by the pump PMP and the valve SV. Drive.

図６に示すように、検体混合部Ａは、第１ポートＰＴ−Ａに投入した血液と前処理試薬の全量より大きな亀の甲状セルが複数連結した流路になっており、この流路を通過させることにより、第１ポートＰＴ−Ａに投入した血液と前処理試薬を均一に混合する。すなわち、検体混合部Ａの流路は、液体の流動方向に直交する方向の断面積が他の流路における断面積に比して大きい広幅流路部４１と、該広幅流路部４１より断面積が小さい狭幅流路部４３とが交互に形成されている。したがって、第１ポートＰＴ−Ａに投入された血液が、検体混合部Ａに到達すると、液体が流動する方向に沿って広幅流路部４と狭幅流路部４３とが交互に形成された流路を通過することで、オリフィス作用による撹拌が複数回行われ、血液と前処理試薬とが均一に混合される。   As shown in FIG. 6, the sample mixing part A is a flow path in which a plurality of turtle thyroid cells larger than the total amount of the pretreatment reagent and blood introduced into the first port PT-A are connected, and pass through this flow path. As a result, the blood charged into the first port PT-A and the pretreatment reagent are uniformly mixed. That is, the flow path of the specimen mixing unit A is separated from the wide flow channel portion 41 and the wide flow channel portion 41 in which the cross-sectional area in the direction perpendicular to the flow direction of the liquid is larger than the cross-sectional area in the other flow channels. Narrow channel portions 43 having a small area are alternately formed. Therefore, when the blood introduced into the first port PT-A reaches the sample mixing portion A, the wide flow channel portions 4 and the narrow flow channel portions 43 are alternately formed along the direction in which the liquid flows. By passing through the flow path, stirring by the orifice action is performed a plurality of times, and the blood and the pretreatment reagent are uniformly mixed.

被加熱部Ｂは、図１に示す検体加熱部１３により９８℃に加熱される。すなわち、マイクロ流体チップ１００は、液処理の制御動作条件が、液体を液処理部で加熱処理するための加熱設定温度を含む条件となる。例えば、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法による核酸増幅反応等において、液流路内の送液制御により、鋳型ＤＮＡ、プライマー、基質、耐熱性ポリメラーゼ酵素等の混合された反応液が温度調節され、所定の３種類の温度に順次変化されることを繰り返すことで、目的とするＤＮＡが増幅可能となる。本実施の形態では、この部分を血液と前処理試薬が通過することにより、前処理試薬により白血球から抽出されたＤＮＡ２本鎖が１本鎖になる。被加熱部Ｂは、加熱を均一に行うために、流路基板２１には掘り込み２９が設けられ、この部分の厚みが１．２ｍｍ程度に薄くなっている。   The heated part B is heated to 98 ° C. by the specimen heating part 13 shown in FIG. That is, in the microfluidic chip 100, the liquid processing control operation condition includes a heating set temperature for heating the liquid in the liquid processing unit. For example, in a nucleic acid amplification reaction by PCR (Polymerase Chain Reaction) method, the temperature of the reaction solution mixed with template DNA, primer, substrate, heat-resistant polymerase enzyme, etc. is adjusted by liquid feed control in the liquid flow path. The target DNA can be amplified by repeating the sequential change to the three temperatures. In the present embodiment, the blood and the pretreatment reagent pass through this portion, so that the DNA double strand extracted from the white blood cell by the pretreatment reagent becomes a single strand. In order to heat the heated portion B uniformly, the channel substrate 21 is provided with a dig 29, and the thickness of this portion is as thin as about 1.2 mm.

試薬合流部Ｃは、加熱処理された血液と前処理試薬に反応増幅試薬を合流させる。第２ポートＰＴ−Ｄにおける流路の毛細管力の大小関係は、ポートＤ出口流路４５＞主流路４７＞ポートＤ流路（第２ポートＰＴ−Ｄ） という関係になっており、ポートＤ出口流路４５と主流路４７の接続部はラプラス圧バルブが構成されている。第２ポートＰＴ−Ｄに投入した反応増幅試薬は主流路４７に流出することなく、ポートＤ出口流路４５と主流路４７の接続面で留まる。また、後述する操作により血液と前処理試薬の混合液がポートＤ出口流路４５に到着すると、ラプラス圧バルブが破壊され、上記の２液体が合流する。   The reagent joining part C joins the reaction amplification reagent to the heat-treated blood and the pretreatment reagent. The magnitude of the capillary force of the flow path in the second port PT-D is such that port D outlet flow path 45> main flow path 47> port D flow path (second port PT-D). A connection portion between the flow channel 45 and the main flow channel 47 constitutes a Laplace pressure valve. The reaction amplification reagent charged into the second port PT-D does not flow out to the main channel 47 but stays at the connection surface between the port D outlet channel 45 and the main channel 47. Further, when the mixed solution of blood and pretreatment reagent arrives at the port D outlet channel 45 by an operation described later, the Laplace pressure valve is broken and the two liquids join together.

酵素混合部Ｅは、図４及び図７に示すように、第２ポートＤから順に第１混合部Ｅ１と第２混合部Ｅ２とが配置されてなる。 第１混合部Ｅ１は、液体が流動する方向の垂直断面積が他の流路における垂直断面積に比して大きい第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂと、第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂより垂直断面積が小さい第２流路部１１３，１１５とが交互に形成されている。すなわち、上流側から前段の第１流路部１１１Ａ、前段の第２流路部１１３、後段の第１流路部１１１Ｂ、後段の第２流路部１１５の順で配設されている。   As shown in FIGS. 4 and 7, the enzyme mixing unit E includes a first mixing unit E1 and a second mixing unit E2 arranged in order from the second port D. The first mixing part E1 is perpendicular to the first flow path parts 111A and 111B and the first flow path parts 111A and 111B, which have a larger vertical cross-sectional area in the direction in which the liquid flows than the vertical cross-sectional areas in the other flow paths. The second flow path portions 113 and 115 having a small cross-sectional area are alternately formed. That is, the first flow path portion 111A at the front stage, the second flow path section 113 at the front stage, the first flow path section 111B at the rear stage, and the second flow path section 115 at the rear stage are arranged in this order from the upstream side.

また、第２混合部Ｅ２は、液体が流動する方向の垂直断面積が他の流路における垂直断面積に比して大きい第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄと、第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄより垂直断面積が小さい第２流路部１１７，１１９とが交互に形成されている。すなわち、上流側から前段の第１流路部１１１Ｃ、前段の第２流路部１１７、後段の第１流路部１１１Ｄ、後段の第２流路部１１９の順で配設されている。   In addition, the second mixing unit E2 includes the first flow path parts 111C and 111D and the first flow path parts 111C and 111D that have a larger vertical cross-sectional area in the direction in which the liquid flows than the vertical cross-sectional areas in the other flow paths. Second flow path portions 117 and 119 having smaller vertical cross-sectional areas are alternately formed. That is, from the upstream side, the first flow path part 111C at the front stage, the second flow path part 117 at the front stage, the first flow path part 111D at the rear stage, and the second flow path part 119 at the rear stage are arranged in this order.

第１混合部Ｅ１における第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの垂直断面積は、第２混合部Ｅ２における第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄの垂直断面積より小さく形成されている。本実施の形態では、各混合部内の深さ（図４の紙面垂直方向深さ）を同一とし、図７に示すように、第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの幅Ｗａを、第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄの幅Ｗｂより小さく（Ｗａ＜Ｗｂ）形成している。また、第１混合部Ｅ１における第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの流路方向長さＬａは、第２混合部Ｅ２における第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄの流路方向長さＬｂより長く（Ｌａ＞Ｌｂ）形成している。本実施の形態では、第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂ，１１１Ｃ，１１１Ｄが互いに平行に形成され、第２流路部１１３，１１５，１１７，１１９が上記第１流路部を連結するように形成されているが、これに限らず、任意の配置であって構わない。 The vertical cross-sectional areas of the first flow path parts 111A and 111B in the first mixing part E1 are formed smaller than the vertical cross-sectional areas of the first flow path parts 111C and 111D in the second mixing part E2. In this embodiment, the depth within the mixing section (direction perpendicular to the paper depth of FIG. 4) the same, as shown in FIG. 7, the first channel part 111A, the width W a of 111B, first flow The path portions 111C and 111D are formed smaller than the width W b (W a <W b ). In addition, the flow path length L a of the first flow paths 111A and 111B in the first mixing section E1 is longer than the flow path length L b of the first flow paths 111C and 111D in the second mixing section E2. (L a > L b ). In the present embodiment, the first flow path portions 111A, 111B, 111C, and 111D are formed in parallel to each other, and the second flow path portions 113, 115, 117, and 119 are formed to connect the first flow path portions. However, the arrangement is not limited to this, and any arrangement may be employed.

このように、本実施の形態による酵素混合部Ｅは、第２混合部Ｅ２の前段に第１混合部Ｅ１が設けられている。詳細は後述するが、第１混合部Ｅ１は細長形状とされることで、複数種の互いに濡れ性の異なる液体が未混合状態で流路内に収容された場合に、仮に流路面に濡れ性の高い液体成分が付着して残っても、濡れ性の違いにより形成されるメニスカス曲面液端が流路中心から偏ることが低減される。これにより、混合部内で気泡が発生することが防止できる。
すなわち、本構成によれば、メニスカス曲面液端の進行度合いに差異の生じ難い第１混合部Ｅ１にて複数種の液体が予備混合される。これにより、混合性能の高い第２混合部Ｅ２において、異なる濡れ性の液体が流路面に接触することにより生じる、メニスカス曲面液端の進行度合いの差異が抑制されるようになっている。 As described above, the enzyme mixing unit E according to the present embodiment is provided with the first mixing unit E1 before the second mixing unit E2. Although the details will be described later, the first mixing portion E1 is formed in an elongated shape, so that when a plurality of types of liquids having different wettability are accommodated in the flow channel in an unmixed state, the wettability of the flow channel surface is temporarily assumed. Even if a high liquid component remains attached, it is possible to reduce the deviation of the meniscus curved surface liquid end formed from the difference in wettability from the center of the flow path. Thereby, it can prevent that a bubble generate | occur | produces within a mixing part.
That is, according to this configuration, a plurality of types of liquids are premixed in the first mixing unit E1 in which the difference in the progression degree of the meniscus curved surface liquid end is unlikely to occur. Thereby, in the 2nd mixing part E2 with high mixing performance, the difference in the advancing degree of the meniscus curved-surface liquid edge which arises when a different wettability liquid contacts a flow-path surface is suppressed.

また、前段の第１流路部１１１Ａおよび後段の第１流路部１１１Ｂの各容積は、第２ポートＰＴ−Ｄから送液される１回分の液体全体を収容可能な容積とすることが好ましく、送液される液体全体の容積の８０％以上であることが好ましい。これにより、第１混合部Ｅ１において、前段の第１流路部１１１Ａに液体全体が収容された後、前段の第２混合部１１３を通過して後段の第１流路部１１１Ｂへ収容され、広幅流路部と狭幅流路部とを交互に通過することで、オリフィス作用による撹拌が複数回行われ、複数種の液体同士の混合を促進させることができる。   Moreover, it is preferable that each volume of the 1st flow path part 111A of a front | former stage and the 1st flow path part 111B of a back | latter stage is a volume which can accommodate the whole liquid for 1 time sent from 2nd port PT-D. It is preferably 80% or more of the total volume of the liquid to be fed. Thereby, in the first mixing section E1, after the entire liquid is stored in the first flow path section 111A in the previous stage, it passes through the second mixing section 113 in the previous stage and is stored in the first flow path section 111B in the subsequent stage. By alternately passing the wide channel portion and the narrow channel portion, stirring by the orifice action is performed a plurality of times, and mixing of a plurality of types of liquids can be promoted.

第１流路部１１１Ａと１１１Ｂとの間の第２流路部１１３には、酵素保持部Ｄが配置される。酵素保持部Ｄは、混合部Ａと同様に、液体が流動する方向に沿って広幅流路部１１５Ａと狭幅流路部１１５Ｂとが交互に形成された流路で構成される。広幅流路部１１５Ａの一部は試薬保持用のセルとなり、ポリミラーゼとデキストリンの水溶解液を点着後、凍結乾燥により乾燥、固化した試薬５７と、MutSとデキストリンの水溶液を点着後、凍結乾燥により乾燥、固化させた試薬５９がそれぞれ保持される。
酵素混合部Ｅでは、血液、前処理試薬、反応増幅試薬の合流液を第１混合部Ｅ１の第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの間を往復させることにより、第１の酵素である試薬５７、第２の酵素である試薬５９を溶解し、前記合流液を混合する。 The enzyme holding part D is arranged in the second flow path part 113 between the first flow path parts 111A and 111B. Similarly to the mixing unit A, the enzyme holding unit D is configured by a channel in which wide channel units 115A and narrow channel units 115B are alternately formed along the direction in which the liquid flows. A part of the wide channel portion 115A becomes a cell for holding a reagent. After dripping an aqueous solution of polymirase and dextrin and then drying and solidifying by freeze-drying, the reagent 57 and an aqueous solution of MutS and dextrin are frozen and frozen. Reagents 59 dried and solidified by drying are held.
In the enzyme mixing section E, the reagent 57, which is the first enzyme, is reciprocated between the first flow path sections 111A and 111B of the first mixing section E1 by recirculating the combined liquid of blood, pretreatment reagent, and reaction amplification reagent. The reagent 59 as the second enzyme is dissolved, and the combined liquid is mixed.

ここで、図８に、第１流路部の幅（断面積）が大きい場合（ａ）と小さい場合（ｂ）とを比較した様子を示した。第１流路部１１１Ａ（１１１Ｂも同様）内の液体は、流路面が異なる濡れ性となっていることから、液体の進行具合が場所によって異なる。つまり、図８（ａ）に示す幅Ｗ１の場合には、液体Ｌのメニスカス曲面液端は、一方の端部がｅ１、他方の端部がｅ１より距離Ｌ１だけ進行したｅ２となっており、端部ｅ１とｅ２との差がメニスカス曲面液端の大きな偏りとして現れる。これに対して、図８（ｂ）に示す幅Ｗ２の場合には、第１流路部１１１Ａの幅が小さくなっているために、流路面が異なる濡れ性となっていても、発生するメニスカス曲面液端の偏りが小さくなる。すなわち、端部ｅ１、ｅ２との差が流路幅に比例して短くなり、距離Ｌ２が短くなる。その結果、第１流路部の中で気泡が発生することなく、また、液体が第１流路部から無駄に溢れ出すことなく、安定した予備混合が行える。   Here, FIG. 8 shows a state in which the case (a) where the width (cross-sectional area) of the first flow path portion is large is compared with the case where it is small (b). Since the liquid in the first flow path portion 111A (same as 111B) has wettability with different flow path surfaces, the progress of the liquid varies depending on the location. In other words, in the case of the width W1 shown in FIG. 8A, the meniscus curved surface liquid end of the liquid L is e1 where one end is e1, and the other end is e2 advanced by a distance L1 from e1. The difference between the end portions e1 and e2 appears as a large deviation of the meniscus curved surface liquid end. On the other hand, in the case of the width W2 shown in FIG. 8B, since the width of the first flow path portion 111A is small, the generated meniscus even if the flow path surface has different wettability. The deviation of the curved liquid edge is reduced. That is, the difference between the end portions e1 and e2 is shortened in proportion to the channel width, and the distance L2 is shortened. As a result, stable premixing can be performed without generating bubbles in the first flow path and without causing liquid to overflow from the first flow path.

つまり、第１混合部Ｅ１の第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂは、流路部内の液体の液端によって形成されるメニスカスが第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの軸中心５１に対して略対称となる程度に細く形成されている。ここでいう略対称とは、メニスカスの端部ｅ１，ｅ２との差が、流路幅に対して１／４以下となる程度をいう。好ましくは、第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの幅Ｗａと、第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄの幅Ｗｂとの関係は、Ｗａ＝Ｗｂ／２に設定されるとよい。 That is, in the first flow path portions 111A and 111B of the first mixing portion E1, the meniscus formed by the liquid end of the liquid in the flow path portion is substantially symmetrical with respect to the axial center 51 of the first flow path portions 111A and 111B. It is formed so thin. The term “substantially symmetrical” as used herein refers to the extent that the difference between the meniscus end portions e1 and e2 is ¼ or less of the channel width. Preferably, the first channel part 111A, and the width W a of 111B, the first channel part 111C, the relationship between the width W b of 111D, may be set to W a = W b / 2.

なお、メニスカス(meniscus)とは、狭い流路内の液体の中央部が、流路内表面に沿う部分に比べて盛り上がったり、または下がったりしてできる曲面を言い、毛管現象によって起こる。また、毛管現象とは、細い流路中の液が流路に沿って流動しようとする現象で、その度合いは液体の表面張力に比例し、流路の断面積に反比例する。また、表面張力とは、液体の表面が自ら収縮してできるだけ小さな面積をとろうとする力で、表面に沿って働く。   The meniscus is a curved surface that is formed by raising or lowering the central portion of the liquid in the narrow flow path as compared with the portion along the inner surface of the flow path, and is caused by capillary action. Capillary phenomenon is a phenomenon in which a liquid in a thin channel attempts to flow along the channel, and the degree thereof is proportional to the surface tension of the liquid and inversely proportional to the cross-sectional area of the channel. The surface tension is a force that causes the surface of the liquid to contract by itself to take as small an area as possible, and acts along the surface.

マイクロ流体チップ１００では、本実施の形態のように、濡れ性の異なる液体を混合する場合であっても、第１混合部Ｅ１にて予備混合されることで、後段の混合性能の高い第２混合部Ｅ２において、メニスカス曲面液端の進行度合いの差異が抑制される。特に、複数の液体が、血液と希釈液である場合であっても、第１混合部Ｅ１にて血液と希釈液とが確実に予備混合され、これにより、混合性能の高い第２混合部Ｅ２において、メニスカス曲面液端の進行度合いの差異が抑制され、液未充填部の発生を防止して、血液の均一な希釈が可能となる。   In the microfluidic chip 100, even when liquids having different wettability are mixed as in the present embodiment, the second mixing performance is high in the subsequent stage by being premixed in the first mixing unit E1. In the mixing part E2, the difference in the degree of progression of the meniscus curved surface liquid edge is suppressed. In particular, even when the plurality of liquids are blood and diluent, the first mixing unit E1 reliably preliminarily mixes the blood and the diluted solution, whereby the second mixing unit E2 having high mixing performance. , The difference in the degree of progression of the liquid end of the meniscus curved surface is suppressed, the occurrence of the unfilled portion is prevented, and blood can be diluted uniformly.

なお、図示例では各混合部Ｅ１，Ｅ２で第１流路部がそれぞれ２つずつ設けてあるが、これに限らず、さらに複数の第１流路部が第２流路部と交互に形成されていてもよい。   In the illustrated example, each of the mixing portions E1 and E2 has two first flow path portions. However, the present invention is not limited to this, and a plurality of first flow path portions are alternately formed with the second flow path portions. May be.

酵素保持部Ｄの試薬５７，５９が保持された広幅流路部１１５Ａの上流と下流の流路は、その保持部より細くなっており、乾燥固化した試薬５７，５９の流路への密着力が無い場合でも、チップ１００の保存、運搬等の振動により固化試薬５７，５９が剥がれ落ちて前後の流路へ流出してしまうことを防いでいる。   The upstream and downstream channels of the wide channel part 115A in which the reagents 57 and 59 of the enzyme holding part D are held are narrower than the holding part, and the adhesion force of the dried and solidified reagents 57 and 59 to the channel Even if there is not, the solidification reagents 57 and 59 are prevented from peeling off due to vibrations such as storage and transportation of the chip 100 and flowing out to the front and rear flow paths.

試薬５７のポリメラーゼは、鎖置換（strand displacement）活性（鎖置換能）を有するものであればよく、常温性、中温性、もしくは耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。また、このポリメラーゼは、天然体もしくは人工的に変異を加えた変異体のいずれであってもよい。このようなポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。さらに、このＤＮＡポリメラーゼは、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものであることが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus、以下「Ｂ．ｓｔ」という）、バチルス・カルドテナックス（Bacillus caldotenax、以下「Ｂ．ｃａ」という）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられる。   The polymerase of the reagent 57 is not particularly limited as long as it has strand displacement activity (strand displacement ability), and any of normal temperature, intermediate temperature, and heat resistance can be suitably used. Further, this polymerase may be either a natural body or a mutant with artificial mutation. Examples of such a polymerase include DNA polymerase. Furthermore, it is preferable that the DNA polymerase has substantially no 5 '→ 3' exonuclease activity. Examples of such a DNA polymerase include thermophilic Bacillus bacteria such as Bacillus stearothermophilus (hereinafter referred to as “B.st”) and Bacillus caldotenax (hereinafter referred to as “B.ca”). Examples include mutants lacking the 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity of the derived DNA polymerase, Klenow fragment of E. coli derived DNA polymerase I, and the like.

デキストリンは酵素の安定化剤として用いられる。これにより、酵素の長期保存が可能になると共に、増幅反応においても、反応液中の酵素が安定化されるため、核酸の増幅効率を高めることが可能となる。その他の酵素安定化剤として、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類などを用いることができる。   Dextrin is used as an enzyme stabilizer. As a result, the enzyme can be stored for a long period of time, and in the amplification reaction, the enzyme in the reaction solution is stabilized, so that the nucleic acid amplification efficiency can be increased. As other enzyme stabilizers, glycerol, bovine serum albumin, saccharides and the like can be used.

試薬５９は、試薬５７よりも下流側に配置されており、MutSとデキストリンの水溶液を点着後、凍結乾燥により乾燥、固化させた試薬である。MutSは、「ミスマッチ結合タンパク質」（「ミスマッチ認識タンパク質」とも称される）と呼ばれるタンパク質群の１つである。これは、ＤＮＡの２本鎖において部分的に対合できない（ミスマッチ）塩基対が生じたときに、これを修復する機能を有するタンパク質群であり、ＭｕｔＳタンパク質（特表平９−５０４６９９号公報）以外に、ＭｕｔＭタンパク質（特開２０００−３００２６５号公報）などの様々なミスマッチ結合タンパクが知られている。   The reagent 59 is disposed downstream of the reagent 57, and is a reagent dried and solidified by freeze-drying after spotting an aqueous solution of MutS and dextrin. MutS is one of a group of proteins called “mismatch binding proteins” (also called “mismatch recognition proteins”). This is a group of proteins having a function of repairing a base pair that cannot be partially matched (mismatched) in a double strand of DNA. This is a MutS protein (Japanese Patent Publication No. 9-504699). In addition, various mismatch binding proteins such as MutM protein (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-300265) are known.

酵素混合部Ｅでは、血液、前処理試薬、反応増幅試薬の合流液を第１混合部Ｅ１の第１流路部１１１Ａ，１１１Ｂの間を往復させ、試薬５７、試薬５９を溶解し、前記合流液を予備混合する。また、同時に、流路内を消泡させる。さらに、第２混合部Ｅ２の第１流路部１１１Ｃ，１１１Ｄの間を往復させることにより、本混合を行い、前記液体をより均一に混合する。なお、往復時に液滴が気泡を巻き込まないように安定に搬送するために、酵素混合部Ｅは混合液に対して撥水的であることが望ましく、本実施の形態では流路基板２１の材料にＣＯＰ（水の接触角約１１０°）を選択した。   In the enzyme mixing unit E, the combined solution of blood, pretreatment reagent, and reaction amplification reagent is reciprocated between the first flow path units 111A and 111B of the first mixing unit E1, and the reagent 57 and the reagent 59 are dissolved. Premix liquid. At the same time, the inside of the flow path is defoamed. Further, the main mixing is performed by reciprocating between the first flow path portions 111C and 111D of the second mixing portion E2, and the liquid is mixed more uniformly. In order to stably convey the liquid droplets so as not to entrain the bubbles during reciprocation, it is desirable that the enzyme mixing unit E be water repellent with respect to the mixed solution. In this embodiment, the material of the flow path substrate 21 is used. COP (water contact angle about 110 °) was selected.

反応部Ｆには、ターゲットＤＮＡのプライマーとゼラチンの水溶解液が点着後冷却固化、固定されている。プライマーは、ターゲットＤＮＡの特定部分に相補的な塩基配列を有する２０塩基長程度のオリゴヌクレオチドであり、ポリメラーゼによるＤＮＡの合成の起点となる。本実施の形態では１３個の反応検出セル２７ａ〜２７ｍが構成されており、検査対象の遺伝子に対して、ｗｉｌｄとｍｕｔａｎｔの配列に特異的に増幅反応を行うために、ｗｉｌｄを増幅させるプライマー６１及び、ｍｕｔａｎｔを増幅させるためのプライマー６３を一対として、それぞれ異なる反応・検出セルに固定している。   In the reaction part F, a target DNA primer and gelatin aqueous solution are cooled, solidified and fixed after spotting. A primer is an oligonucleotide having a length of about 20 bases having a base sequence complementary to a specific portion of a target DNA, and serves as a starting point for DNA synthesis by a polymerase. In the present embodiment, 13 reaction detection cells 27a to 27m are configured, and a primer 61 for amplifying wild in order to perform an amplification reaction specifically on the wild and mutant sequences for the gene to be examined. In addition, a pair of primers 63 for amplifying mutants are fixed to different reaction / detection cells.

すなわち、１２個の反応検出セル２７ａ〜２７ｌで６ケ所Ｄ１〜Ｄ６の遺伝子を検査対象としている。残りの１ケ所ＰＤの反応検出セル２７ｍには、多型の存在しない遺伝子配列を増幅させるためのプライマー６５が固定されており、このセルはポジコンとして用いられる。第１混合部４９、第２混合部５１で混合された検体は、各反応検出セル２７ａ〜２７ｍに定量分注される。   That is, in six reaction detection cells 27a to 27l, six genes D1 to D6 are examined. A primer 65 for amplifying a gene sequence having no polymorphism is fixed to the remaining one reaction detection cell 27m of PD, and this cell is used as a positive control. The sample mixed in the first mixing unit 49 and the second mixing unit 51 is quantitatively dispensed into each of the reaction detection cells 27a to 27m.

図９はプライマーが混合拡散された図４のＰ２−Ｐ２断面視を（ａ）、その要部拡大図を（ｂ）に表した反応検出セルの説明図である。
この反応検出セル２７ａ〜２７ｍを６０℃に加熱することにより、固化したゼラチンが溶解し、各反応検出セル２７ａ〜２７ｍ内に分散し、等温増幅反応が行われる。プライマーの水溶液のみを反応検出セル２７に点着し、乾燥固定化することもできるが、この場合、セル内に液体が流入した際に、プライマーが流れ方向に流されてしまい、セル内での反応、検出が行えない。このため、常温の水溶液では溶解しにくいゼラチンを０．５％含有させて点着、固化した。 FIG. 9 is an explanatory view of a reaction detection cell in which a P2-P2 cross-sectional view of FIG. 4 in which primers are mixed and diffused is shown in (a), and an enlarged view of a main part thereof is shown in (b).
By heating the reaction detection cells 27a to 27m to 60 ° C., the solidified gelatin is dissolved and dispersed in the reaction detection cells 27a to 27m, and an isothermal amplification reaction is performed. Although only the primer aqueous solution can be spotted on the reaction detection cell 27 and dried and fixed, in this case, when the liquid flows into the cell, the primer is caused to flow in the flow direction. Reaction and detection cannot be performed. For this reason, 0.5% of gelatin that is difficult to dissolve in an aqueous solution at room temperature was contained and spotted and solidified.

プライマーとゼラチンの水溶液は流路基板２１側のセルに点着固定しており、マイクロチップ使用状態では図９に示すように、流路の上面に配置されている。液体が流入後、蓋材２３側すなわち下面から加熱されることにより、液体の温度上昇に伴って溶解したプライマー６１を含むゼラチンｇｅは、その比重が大きいため重力により流路内下側に流動する。また、液体は下面より加熱されることにより、セル内で対流６７を起こす。このゼラチンｇｅの重力による流路下側への流動と、液体の加熱による対流６７の相乗効果により、プライマー６１及びゼラチンｇｅは反応検出セル２７内に短時間で均一に混合拡散される。   The primer and gelatin aqueous solution is spot-fixed to the cell on the channel substrate 21 side, and is arranged on the upper surface of the channel as shown in FIG. 9 when the microchip is used. After the liquid has flowed in, the gelatin ge containing the primer 61 dissolved with the temperature rise of the liquid by being heated from the lid 23 side, that is, the lower surface, flows to the lower side in the flow path due to gravity because of its large specific gravity. . Further, the liquid is heated from the lower surface, thereby causing convection 67 in the cell. The primer 61 and the gelatin ge are uniformly mixed and diffused in the reaction detection cell 27 in a short time by the synergistic effect of the flow of the gelatin ge below the flow path due to gravity and the convection 67 due to the heating of the liquid.

図１０は反応検出セルの拡大平面図である。
各反応検出セル２７ａ〜２７ｍの前後には反応検出セル入り口流路６９と反応検出セル出口流路７１が配置され、この入り口出口流路６９，７１は細い流路となっている。分注後の液体の端面は、入り口流路６９と主流路７３の接続面、及び出口流路７１と排気流路７５の接続面に留まっている。反応部Ｆには加熱部７７が形成され、加熱部７７は、加熱を均一に行うために、上記の掘り込み３１によって、流路基板２１の厚みが１．２ｍｍ程度に薄くなっている。加熱部７７は、反応検出セル２７全体と、入り口出口流路６９，７１の一部分までを加熱する配置になっており、加熱部７７以外は、他の温度調整手段によって常温に温度調節されている。すなわち、反応検出セル２７内の液体の両端面は、加熱されることなく、常温に保持される。このことにより、加熱により水分が蒸発することを防ぐことができる。この加熱部７７及びその周りの温度調節手段が、図１の温調部１５を構成している。 FIG. 10 is an enlarged plan view of the reaction detection cell.
A reaction detection cell inlet channel 69 and a reaction detection cell outlet channel 71 are arranged before and after each of the reaction detection cells 27a to 27m, and the inlet / outlet channels 69, 71 are narrow channels. The end face of the liquid after dispensing remains on the connection surface between the inlet channel 69 and the main channel 73 and the connection surface between the outlet channel 71 and the exhaust channel 75. A heating unit 77 is formed in the reaction unit F, and the heating unit 77 has the thickness of the flow path substrate 21 reduced to about 1.2 mm by the digging 31 in order to perform heating uniformly. The heating unit 77 is arranged to heat the entire reaction detection cell 27 and a part of the inlet / outlet channels 69 and 71, and the temperature of the heating unit 77 other than the heating unit 77 is adjusted to room temperature by other temperature adjusting means. . That is, both end surfaces of the liquid in the reaction detection cell 27 are kept at room temperature without being heated. This can prevent moisture from evaporating due to heating. The heating unit 77 and the temperature adjusting means around it constitute the temperature adjusting unit 15 in FIG.

入り口出口流路６９，７１、主流路７３、排気流路７５は、定量分注流路Ｇを構成している。定量分注流路Ｇは、酵素混合部Ｅで処理された第２混合液を反応部Ｆの複数の反応検出セル２７それぞれに定量分注する。   The inlet / outlet channels 69 and 71, the main channel 73, and the exhaust channel 75 constitute a quantitative dispensing channel G. The quantitative dispensing channel G quantitatively dispenses the second mixed solution processed by the enzyme mixing unit E to each of the plurality of reaction detection cells 27 of the reaction unit F.

反応検出セル２７に定量分注された液体は、生態細胞を有する検体液、前処理試薬、反応増幅試薬を含む。反応検出セル２７には核酸の断片であるプライマー６１、６３、…が実装されており、この反応検出セル２７に液体を定量分注し、加熱しながら励起光を照射する事により、液処理部内で発生する蛍光を検出する。反応検出セル２７では、被検出物質の核酸増幅反応が行われる。この際、検知感度の高い標識物質である発光性物質を担持した特異的な相互作用を有する標識化物質、例えば標識化抗体や標識化抗原又は標識化核酸等が用いられる。サイバーグリーンは、反応によって増幅された２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることにより、強い蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、ターゲットとする遺伝子配列の存在の有無が検出可能となる。   The liquid quantitatively dispensed into the reaction detection cell 27 includes a specimen liquid having ecological cells, a pretreatment reagent, and a reaction amplification reagent. Primers 61, 63,..., Which are nucleic acid fragments, are mounted in the reaction detection cell 27. A liquid is dispensed into the reaction detection cell 27 in a fixed amount, and irradiated with excitation light while being heated. Fluorescence generated in is detected. In the reaction detection cell 27, a nucleic acid amplification reaction of the substance to be detected is performed. At this time, a labeling substance having a specific interaction carrying a luminescent substance that is a labeling substance with high detection sensitivity, such as a labeled antibody, a labeled antigen, or a labeled nucleic acid, is used. Cyber Green emits strong fluorescence by intercalating into double-stranded DNA amplified by the reaction. By measuring the fluorescence intensity, the presence or absence of the target gene sequence can be detected.

図１１はターゲット配列がある場合を（ａ）、ターゲット配列が無い場合を（ｂ）に表した蛍光測定結果のグラフである。
反応検出セル２７ａ〜２７ｍは、光学系により、約４９０ｎｍの波長で励起し、インターカレートしたサイバーグリーンの約５２０ｎｍの蛍光を測定することにより、ターゲットＤＮＡの増幅が確認される。すなわち、図１１に示すように、ターゲットとする核酸配列が存在する場合には、蛍光強度Ｉの増加が確認され、存在しない場合には蛍光強度Ｉの増加が確認されない。 FIG. 11 is a graph of the fluorescence measurement result in which (a) shows the case where there is a target sequence, and (b) shows the case where there is no target sequence.
The reaction detection cells 27a to 27m are excited by the optical system at a wavelength of about 490 nm, and the amplification of the target DNA is confirmed by measuring the intercalated cyber green fluorescence at about 520 nm. That is, as shown in FIG. 11, when the target nucleic acid sequence is present, an increase in the fluorescence intensity I is confirmed, and when it is not present, an increase in the fluorescence intensity I is not confirmed.

反応部Ｆでは、反応検出セル２７ａ〜２７ｍへの分注時に液体がスムーズに進入し、出口部でのラプラス圧バルブによる停止が安定に行えるためには、反応検出セル２７とその前後の細い入り口出口流路６９，７１は適度に親水的であることが望ましい。本実施の形態では、少なくとも入り口出口流路６９，７１が、プラズマ照射により親水化されている（水の接触角約７０°）。   In the reaction part F, in order to allow the liquid to smoothly enter during dispensing into the reaction detection cells 27a to 27m and to be stably stopped by the Laplace pressure valve at the outlet part, the reaction detection cell 27 and the narrow inlets before and after the reaction detection cell 27 It is desirable that the outlet channels 69 and 71 are moderately hydrophilic. In the present embodiment, at least the inlet / outlet channels 69 and 71 are hydrophilized by plasma irradiation (water contact angle is about 70 °).

流路基板２１を部分的に親水化、又は撥水化する方法としては、プラズマ照射以外に公知の方法（親水化／撥水化処理液を塗布する方法、ＵＶ照射、蒸着やスパッタにより親水化／撥水化材料の薄膜を形成する方法、２色成形やインサート成形により、濡れ性の異なる樹脂を用いて成形する方法等）を用いることができる。本実施の形態では、各流路（少なくとも入り口出口流路６９，７１）の流路内面が、少なくとも２段階以上の濡れ性を有している。これにより、各反応検出セル２７ａ〜２７ｍへの分注時に液体がスムーズに進入し、出口部でのラプラス圧バルブによる停止が安定に行えるようになっている。   As a method of partially hydrophilizing or water repelling the flow path substrate 21, a known method (method of applying a hydrophilization / water repellent treatment solution, UV irradiation, vapor deposition or sputtering) may be used in addition to plasma irradiation. / A method of forming a thin film of a water repellent material, a method of molding using resins having different wettability by two-color molding or insert molding, and the like. In the present embodiment, the inner surface of each channel (at least the inlet / outlet channels 69 and 71) has at least two stages of wettability. As a result, the liquid smoothly enters when dispensing into each of the reaction detection cells 27a to 27m, and can be stably stopped by the Laplace pressure valve at the outlet.

ここで、反応検出部内における発泡について説明する。
図１２は反応検出部の発泡状況を（ａ）〜（ｃ）に表した平面図、図１３は反応検出部の発泡防止策を表した要部断面図である。
反応検出セル２７ａ〜２７ｍを加熱する際、反応検出セル２７内に気泡が発生すると、蛍光検出の精度が低下するという問題がある。このため、流路では気泡発生を防止する必要がある。気泡の発生メカニズムは、図１２に示すように、反応検出セル２７内に混合液が流入する際に、反応検出セル２７に、流路断面Ｒ（流路隅部の面取り半径）、接着剤塗布ムラ、ウエルドライン等の何らかの原因により微小空間が形成されていると、この微小空間内に混合液が流入することができず、微小な濡れ残り、すなわち、微小な空気だまりができることによる。この空気だまりが加熱により膨張、増大することによって気泡が発生する。 Here, foaming in the reaction detection unit will be described.
FIG. 12 is a plan view showing the foaming state of the reaction detection unit in (a) to (c), and FIG. 13 is a cross-sectional view of a main part showing a measure for preventing foaming of the reaction detection unit.
When the reaction detection cells 27a to 27m are heated, if bubbles are generated in the reaction detection cell 27, there is a problem that the accuracy of fluorescence detection is lowered. For this reason, it is necessary to prevent bubble generation in the flow path. As shown in FIG. 12, the bubble generation mechanism is such that when the mixed liquid flows into the reaction detection cell 27, the reaction detection cell 27 is subjected to the flow path cross section R (the chamfer radius of the flow path corner) and the adhesive applied. If a minute space is formed due to some cause such as unevenness or weld line, the mixed liquid cannot flow into the minute space, and a minute wetting residue, that is, a minute air trap can be formed. Air bubbles are generated by the expansion and increase of the air pool due to heating.

微小空間の代表的な例としては、図１３のａ部に示す流路の断面Ｒと蓋材２３の接合部で構成される微小空間８１が挙げられる。これを防止する手段としては、図１３のｂ部に示すように、流路８３の断面Ｒを極力小さくする（１００μｍ以下が望ましく、１０μｍ以下がさらに望ましい）ことが有効である。   As a typical example of the minute space, there is a minute space 81 formed by the joint portion of the cross-section R of the flow path shown in a part of FIG. As means for preventing this, it is effective to make the cross section R of the flow path 83 as small as possible (desirably 100 μm or less, more desirably 10 μm or less), as shown in part b of FIG.

また、別の手段としては、図１３のｃ部に示すように、接着剤７９の塗布条件や貼り付け条件を最適化することにより、流路８３の断面Ｒと蓋材２３により構成される微小空間８１を接着剤７９により充填してしまうという方法もある。   Further, as another means, as shown in part c of FIG. 13, by optimizing the application condition and the bonding condition of the adhesive 79, a minute structure constituted by the cross section R of the flow path 83 and the lid member 23 is used. There is also a method of filling the space 81 with the adhesive 79.

微小空間８１の他の例として、図１３のｄ部に示すように、蓋材２３の接着剤７９や、接着剤７９の塗布ムラがある。接着剤面の塗布ムラにより、微小空間８１が形成されていると、流路断面のＲ同様に微小空間８１が形成され、発泡の原因となる。他の例としては、図１３のｅ部に示すように、射出成形によって製作された流路基板２１のウエルドライン８５があり、このウエルドライン８５が同様の微小空間８１を形成していると発泡の原因となる。このため、特に反応部Ｆの流路内面は、流路内を液体が流れる際に該液体により充填されない微小な隙間空間の形成を防止する連続した円滑面からなることが好ましい。これにより、加熱の際に流路内に気泡が発生しなくなり、蛍光検出精度の低下が防止される。このように、発泡を防止するために、上記した解決手段から適宜なものを選択することにより、液体が流入する時、液体の流入可能な微小空間８１が形成されていないようにすることが必要となる。   As another example of the minute space 81, there are an adhesive 79 of the lid member 23 and uneven application of the adhesive 79, as shown in part d of FIG. If the minute space 81 is formed due to uneven application of the adhesive surface, the minute space 81 is formed in the same manner as R in the cross section of the flow path, which causes foaming. As another example, as shown in part e of FIG. 13, there is a weld line 85 of the flow path substrate 21 manufactured by injection molding. If the weld line 85 forms a similar micro space 81, foaming is performed. Cause. For this reason, in particular, the inner surface of the flow path of the reaction part F is preferably a continuous smooth surface that prevents the formation of a minute gap space that is not filled with the liquid when the liquid flows in the flow path. Thereby, bubbles are not generated in the flow path during heating, and a decrease in fluorescence detection accuracy is prevented. Thus, in order to prevent foaming, it is necessary to select a suitable solution from the above-described solution means so that when the liquid flows in, the minute space 81 into which the liquid can flow is not formed. It becomes.

本実施の形態では、上記のように、６組の一塩基多型を判定するための１２個の反応検出セル２７ａ〜２７ｌと、ポジコン用の１個の反応検出セル２７ｍにより構成されている。ポジコン用反応検出セル２７ｍには、多型が存在しない遺伝子配列部をターゲットとするプライマー６５が実装されており、どんな検体を検査しても、蛍光強度の増大が確認される。このポジコン用反応検出セル２７ｍの蛍光を確認することにより、一連の送液操作が正常に行われ、且つ正常な反応が行われたことを確認することができ、検査結果の信頼性を保障することが可能となる。   In the present embodiment, as described above, it is composed of 12 reaction detection cells 27a to 27l for determining six sets of single nucleotide polymorphisms and one reaction detection cell 27m for positive control. In the positive control reaction detection cell 27m, a primer 65 that targets a gene sequence portion where no polymorphism exists is mounted, and an increase in fluorescence intensity is confirmed no matter what sample is examined. By confirming the fluorescence of the positive detection reaction detection cell 27m, it is possible to confirm that a series of liquid feeding operations are normally performed and a normal reaction has been performed, thereby ensuring the reliability of the test results. It becomes possible.

また、ネガコンの保障方法としては、血液の代わりに水を投入して一連の反応を行わせ、蛍光強度の増大が無いことを確認しても良いし、同一基板上に２組の回路を形成し、検査とネガコンの保障を同時に行っても良い。   In addition, as a guarantee method for negative control, water may be used instead of blood to cause a series of reactions to be confirmed that there is no increase in fluorescence intensity, or two sets of circuits are formed on the same substrate. However, inspection and negative control may be performed at the same time.

有限な液体をマイクロ流体チップ１００で操作する場合、特に、能動的なバルブやポンプを内蔵していないシンプルな流路により構成されているマイクロ流体チップ１００で、液体の複雑なハンドリングをチップ外部からの空圧駆動で行うには、液体の位置を正確に検出することが不可欠となる。液体の位置を検出しないで、例えば駆動空気の流量で制御しようとすると、ポンプからマイクロ流体チップ１００のポート部ＰＴまでの配管や、チップ内の流路の空気の体積（デッドボリューム）の温度変化による膨張や収縮、流路内の微小な傷や静電気による流量抵抗の変化、或いは流体を加熱した時に流体が蒸発することによる蒸気圧の影響などの外乱により、再現性良く液体をハンドリングすることは困難となる。このため、液体の位置を正確に検出することは非常に重要となる。   When operating a finite liquid with the microfluidic chip 100, in particular, with the microfluidic chip 100 configured by a simple flow path that does not incorporate an active valve or pump, complex handling of liquid is performed from the outside of the chip. It is indispensable to accurately detect the position of the liquid in order to perform the pneumatic driving. For example, if the control is performed with the flow rate of the driving air without detecting the position of the liquid, the temperature change of the volume (dead volume) of the air in the pipe from the pump to the port part PT of the microfluidic chip 100 or the flow path in the chip Handling liquids with good reproducibility due to disturbances such as expansion and contraction due to turbulence, changes in flow resistance due to minute scratches in the flow path and static electricity, or the effect of vapor pressure due to fluid evaporation when the fluid is heated It becomes difficult. For this reason, it is very important to accurately detect the position of the liquid.

マイクロ流体チップ１００は、液流路の特定位置において液流路内の液体の先端部、後端部の少なくともいずれかを検出し、検出のされたタイミングに応じて液体の制御動作条件を決定する。これにより、ピペッティングの操作、装置への出し入れ等の煩雑な操作を不要にして、液流路内での検体中のＤＮＡの抽出或いは増幅等の反応が可能となる。液体の制御動作条件は、液体に対する移動の方向、移動速度、移動のための駆動力のうち、少なくとも１つを含むものであれば、液流路内における送液の移動制御が可能となる。また、液体移動の方向、移動速度、駆動力の全てを制御可能とした構成によれば、これらの動作条件が自在に切り替えられることで、ピペッティングの操作、装置への出し入れ等を行うのと同等の送液制御が可能となる。   The microfluidic chip 100 detects at least one of a front end portion and a rear end portion of the liquid in the liquid flow path at a specific position of the liquid flow path, and determines a liquid control operation condition according to the detected timing. . This eliminates the need for complicated operations such as pipetting and loading / unloading to / from the apparatus, and enables reaction such as extraction or amplification of DNA in the sample in the liquid flow path. If the liquid control operation condition includes at least one of the direction of movement with respect to the liquid, the movement speed, and the driving force for movement, the movement control of the liquid feeding in the liquid flow path can be performed. In addition, according to the configuration in which all of the liquid moving direction, moving speed, and driving force can be controlled, these operating conditions can be freely switched, so that pipetting operation, insertion / removal to / from the apparatus, and the like are performed. Equivalent liquid feeding control is possible.

本実施の形態では、液体の位置を検出することにより、液体の駆動速度、駆動方向、駆動力の制御を、検査装置１１の制御部１９によって切り替えている。ここで駆動力とは、一定圧力による吸引や加圧以外に、ポート部ＰＴの大気開放、閉状態、及び複数ポート部ＰＴの連結状態を含むものとする。   In the present embodiment, the control of the driving speed, driving direction, and driving force of the liquid is switched by the control unit 19 of the inspection apparatus 11 by detecting the position of the liquid. Here, the driving force includes, in addition to suction and pressurization with a constant pressure, the port portion PT opened to the atmosphere, a closed state, and a connected state of the plurality of port portions PT.

図１４は液位置検出部の平面視を（ａ）、そのＰ１−Ｐ１断面視を（ｂ）に表した説明図、図１５は液位置検出部の入反射光を表した模式図、図１６は反射率と入射角度との相関を表したグラフである。
マイクロ流体チップ１００には液位置検出のためのセンシング部ＰＨ１〜５（図１，図４参照）が配置されている。本実施の形態では、このセンシング部ＰＨ１〜５に対向する位置に、液位置検出部１６が配置される。図１には纏めて１つの液位置検出部１６を示しているが、センシング部ＰＨ１〜５の合計５箇所それぞれに対向して配置される。この液位置検出部１６の具体例として、図１４に示す反射型光ファイバーセンサー８７が使用されている。各ファイバーセンサー８７の先端は、図１４に示すように、チップ１００の蓋材２３側から流路８３に向けて配置されている。 14A is an explanatory diagram showing a plan view of the liquid position detection unit, and FIG. 15B is a schematic diagram showing incident / reflected light of the liquid position detection unit. FIG. Is a graph showing the correlation between the reflectance and the incident angle.
In the microfluidic chip 100, sensing units PH1 to PH5 (see FIGS. 1 and 4) for liquid position detection are arranged. In the present embodiment, the liquid position detection unit 16 is disposed at a position facing the sensing units PH1 to PH5. Although one liquid position detection part 16 is collectively shown in FIG. 1, it arrange | positions facing each of a total of five places of sensing part PH1-5. As a specific example of the liquid position detection unit 16, a reflective optical fiber sensor 87 shown in FIG. 14 is used. As shown in FIG. 14, the tip of each fiber sensor 87 is disposed from the lid member 23 side of the chip 100 toward the flow path 83.

反射型光ファイバーセンサー８７は、流路８３の特定位置に光を照射して流路８３からの反射光を検出し、特定位置おける流路内の液体の有無を、反射光の空気と液体との屈折率変化に基づく光量変化から判定する。したがって、チップ１００の外部から光りを照射し、その反射光の屈折率変化によって判定が可能となるので、流路８３にセンサ等が露出せず、検体液の汚染されることがない。また、超音波を利用した場合の振動が発生せず、反応液等との混ざり具合にバラツキの発生することがない。   The reflection type optical fiber sensor 87 detects light reflected from the flow path 83 by irradiating light to a specific position of the flow path 83, and detects the presence or absence of the liquid in the flow path at the specific position between the air of the reflected light and the liquid. Judgment is made from a change in the amount of light based on a change in refractive index. Therefore, since light can be irradiated from the outside of the chip 100 and determination can be made based on a change in the refractive index of the reflected light, a sensor or the like is not exposed to the flow path 83 and the sample liquid is not contaminated. Further, no vibration is generated when ultrasonic waves are used, and there is no variation in the mixing with the reaction liquid or the like.

具体的には、反射型光ファイバーセンサー８７は、特定位置を照射する光を投光側光ファイバー８９を通じて供給し、流路８３からの反射光を受光側光ファイバー９１に導入して検出する。この反射型光ファイバーセンサー８７によれば、照射光と反射光を、投光側光ファイバー８９と受光側光ファイバー９１を統合した小面積なファイバー先端面で行うことができ、小面積の被検出領域に対する光照射及び当該照射領域からの反射光の受光が可能となり、微小な流路８３の特定位置における液体の有無が検出可能となる。   Specifically, the reflection type optical fiber sensor 87 supplies light for irradiating a specific position through the light projecting side optical fiber 89 and introduces the reflected light from the flow path 83 into the light receiving side optical fiber 91 for detection. According to the reflection type optical fiber sensor 87, the irradiation light and the reflection light can be performed by a small area fiber front end surface in which the light projecting side optical fiber 89 and the light receiving side optical fiber 91 are integrated. Irradiation and reflected light from the irradiation region can be received, and the presence or absence of liquid at a specific position of the minute flow path 83 can be detected.

反射型光ファイバーセンサー８７の受光側光ファイバー９１は、チップ１００より反射される反射光の強度を検出する。
流路８３中の液滴のあり／なしは、主に蓋材２３の流路側面からの反射率が流路中に空気がある場合と、水がある場合の反射率の違いにより検出することができる。 The light receiving side optical fiber 91 of the reflection type optical fiber sensor 87 detects the intensity of the reflected light reflected from the chip 100.
The presence / absence of liquid droplets in the channel 83 is mainly detected by the difference in reflectance between the side of the channel of the lid member 23 when air is present in the channel and when there is water. Can do.

一般に、図１５に示すような入射光に対する反射率は次式で表される。   In general, the reflectance with respect to incident light as shown in FIG.

Figure 2008151771
Figure 2008151771

ここで、Rp：p偏光、Rs：ｓ偏光であり、n=n2/n1とおいた。

Figure 2008151771
Here, Rp: p-polarized light, Rs: s-polarized light, and n = n2 / n1.
Figure 2008151771

とおき、蓋材２３の屈折率をn1＝1.49、流路８３中の流体の屈折率を
液滴なしの場合・・・n2（空気）＝1.00
液滴ありの場合・・・n2（水）＝1.33
とおいて計算すると、流路８３中の流体が空気の場合と水の場合とで図１６のような反射率の違いを求めることができる。 When the refractive index of the lid member 23 is n1 = 1.49 and the refractive index of the fluid in the flow path 83 is no liquid droplet, n2 (air) = 1.00
When there are droplets ... n2 (water) = 1.33
In other words, the difference in reflectance as shown in FIG. 16 can be obtained depending on whether the fluid in the flow path 83 is air or water.

使用している投光側光ファイバー８９の投光の広がり角が60°の場合、図１６の0°から30°の範囲で考えればよく、流路８３中の流体が空気の場合は反射率が約４％、水の場合は０．５％以下になる。この違いにより、液滴の有り無しで反射型光ファイバーセンサー８７の受光量が変化し、液滴の到着を検出することができる。   When the light spread angle of the light emitting optical fiber 89 used is 60 °, it can be considered in the range of 0 ° to 30 ° in FIG. 16, and when the fluid in the flow path 83 is air, the reflectance is About 4%, in the case of water, it is 0.5% or less. Due to this difference, the amount of light received by the reflective optical fiber sensor 87 changes with and without a droplet, and the arrival of the droplet can be detected.

また、図１６から読み取れるように、入射角度が大きくなるにつれて、空気と水の反射率の差は大きくなることより、反射型光ファイバーセンサー８７は、図１７のように投光側と受光側のファイバー８９，９１を分離タイプとして、チップ１００に対して角度を持たせた配置とすることができる。ここで、図１７は投光側光ファイバーと受光側光ファイバーとが傾斜配置された液位置検出部の側面図である。同図の構成では、流路８３の特定位置への光照射方向と、特定位置からの反射光の検出方向とが、特定位置の光照射面の法線９３に対してそれぞれ傾斜する方向に設定されている。このような構成によれば、空気の存在時に反射光が受光側光ファイバー９１から外れ、液体存在時に反射光が受光側光ファイバー９１へ入射する傾斜角度とされることで、屈折率変化に基づいた液体の検出が簡素な構造で、さらに安定して検出できるようになる。投光側光ファイバーと受光側光ファイバーのファイバー径、出射光・入射光角度、ファイバーの配置、使用本数等は、検出する流路の形状に応じて実験的あるいは光学シミュレーションにより最適化する事ができる。   Further, as can be seen from FIG. 16, as the incident angle increases, the difference in reflectance between air and water increases, so that the reflection type optical fiber sensor 87 has a fiber on the light emitting side and light receiving side as shown in FIG. 89 and 91 can be separated types and can be arranged with an angle with respect to the chip 100. Here, FIG. 17 is a side view of the liquid position detecting unit in which the light projecting side optical fiber and the light receiving side optical fiber are disposed in an inclined manner. In the configuration shown in the figure, the light irradiation direction to the specific position of the flow path 83 and the detection direction of the reflected light from the specific position are set to be inclined with respect to the normal line 93 of the light irradiation surface at the specific position. Has been. According to such a configuration, the reflected light is separated from the light receiving side optical fiber 91 when air is present, and the angle of inclination at which the reflected light is incident on the light receiving side optical fiber 91 when the liquid is present is set. Detection can be performed more stably with a simple structure. The fiber diameter, outgoing light / incident light angle, fiber arrangement, number of fibers used, etc. of the light emitting side optical fiber and the light receiving side optical fiber can be optimized experimentally or by optical simulation according to the shape of the flow path to be detected.

このように、反射型光ファイバーセンサー８７による検出は、空気と流体の屈折率の差を検出するものであり、流体の光透過率や、光の散乱を検出する原理による検出方法と比較して、流体中の溶解物質の種類やその濃度変化があっても、安定して検出することができるという利点を備えている。   Thus, the detection by the reflective optical fiber sensor 87 detects the difference in refractive index between air and fluid. Compared with the detection method based on the principle of detecting the light transmittance of fluid or light scattering, Even if there is a kind of dissolved substance in the fluid and its concentration change, it has an advantage that it can be detected stably.

上記の構成を有する本実施の形態によるマイクロ流体チップ１００によれば、
(1)検体液と前処理試薬とを投入する第１ポートＰＴ−Ａと、
(2)反応増幅試薬を投入する第２ポートＰＴ−Ｄと、
(3)流路内に空気圧を供給する第３ポートＰＴ−Ｂと、
(4)第１ポートＰＴ−Ａから投入された検体液と前処理試薬とを混合して第１混合液を生成する検体混合部Ａと、
(5)第１混合液を加熱して生体細胞よりＤＮＡを抽出し１本鎖に分解する被加熱部Ｂと、
(6)被加熱部Ｂで処理された第１混合液に反応増幅試薬を合流させる試薬合流部Ｃと、
(7)試薬合流部Ｃで合流された第２の混合液が通過することにより溶解が進む酵素を固化実装した酵素保持部Ｄと、
(8)酵素保持部Ｄで処理される第２の混合液への酵素の混合を助長する酵素混合部Ｅと、
(9)酵素混合部Ｅに接続され、流路内に固化実装されたプライマーの溶解、加熱によるＤＮＡ増幅、このＤＮＡ増幅の検出を同一位置で行う複数の反応検出セル２７からなる反応部Ｆと、
(10)複数の反応検出セル２７に接続され酵素混合部Ｅで処理された第２混合液を複数の反応検出セル２７のそれぞれに定量分注するための定量分注流路Ｇと、
を備えたので、立体的に複雑な構造を必要とせず、簡単な構造で複雑な送液制御が行えるとともに、ピペッティングの操作、装置への出し入れ等の煩雑な操作が不要になり、熟練を要さない簡単な操作で、正確かつ信頼性の高い分析結果を低コスト、短時間で得ることができる。 According to the microfluidic chip 100 according to the present embodiment having the above configuration,
(1) a first port PT-A for introducing the sample liquid and the pretreatment reagent;
(2) a second port PT-D into which a reaction amplification reagent is charged;
(3) a third port PT-B for supplying air pressure into the flow path;
(4) Specimen mixing unit A that mixes the sample liquid introduced from the first port PT-A and the pretreatment reagent to generate the first mixed liquid;
(5) A heated portion B that heats the first mixed liquid to extract DNA from living cells and decomposes it into single strands;
(6) Reagent merging portion C for merging the reaction amplification reagent with the first mixed solution treated in heated portion B;
(7) an enzyme holding part D that solidifies and mounts an enzyme that is dissolved by passing through the second mixed liquid joined at the reagent joining part C;
(8) an enzyme mixing unit E for promoting the mixing of the enzyme into the second mixed solution treated in the enzyme holding unit D;
(9) a reaction part F comprising a plurality of reaction detection cells 27 connected to the enzyme mixing part E and dissolved in the primer solidified in the flow path, DNA amplification by heating, and detection of this DNA amplification at the same position; ,
(10) a quantitative dispensing flow path G for quantitatively dispensing the second mixed solution connected to the plurality of reaction detection cells 27 and processed by the enzyme mixing unit E to each of the plurality of reaction detection cells 27;
It does not require a three-dimensionally complicated structure, and it can perform complicated liquid feeding control with a simple structure, and does not require complicated operations such as pipetting and loading / unloading to / from the device. Accurate and reliable analysis results can be obtained at low cost and in a short time with simple operations that are not required.

次に、上記のマイクロ流体チップ１００を使用した送液フローについて説明する。
図１８はマイクロ流体チップの駆動制御に伴う各要素の作動状態を時間軸に沿って表したタイムチャート、図１９は液セットから最初の加熱までの動作説明図、図２０は酵素混合までの動作説明図、図２１は反応部注入までの動作説明図、図２２は分注から検査完了までの動作説明図である。
以下の説明においては、図１８の制御動作Ｖ１〜Ｖ１３と図１９〜図２２の各ステップＳ１〜Ｓ１９における状態を対応させて説明する。
先ず、チップ１００を準備し、検査装置１１のＲＥＡＤＹスイッチを押す（Ｖ１、Ｓ１）。そして、第２ポートＰＴ−Ｄに反応増幅試薬を投入する（Ｓ２）。第２ポートＰＴ−Ｄにおける流路の毛細管力の大小関係は、ポートＤ出口流路４５＞主流路４７＞第２ポートＰＴ−Ｄという関係になっており、ポートＤ出口流路４５と主流路４７の接続部はラプラス圧バルブが構成されている。このため、反応増幅試薬は主流路４７に流出することなく、ポートＤ出口流路４５と主流路４７の接続面で留まる。 Next, a liquid feeding flow using the microfluidic chip 100 will be described.
18 is a time chart showing the operating state of each element along the time axis according to the drive control of the microfluidic chip, FIG. 19 is an operation explanatory diagram from the liquid setting to the first heating, and FIG. 20 is the operation until the enzyme mixing. FIG. 21 is an explanatory diagram of the operation until the injection of the reaction part, and FIG. 22 is an explanatory diagram of the operation from the dispensing to the completion of the inspection.
In the following description, the control operations V1 to V13 in FIG. 18 and the states in steps S1 to S19 in FIGS.
First, the chip 100 is prepared, and the READY switch of the inspection apparatus 11 is pushed (V1, S1). Then, a reaction amplification reagent is introduced into the second port PT-D (S2). The relationship between the capillary forces of the flow paths in the second port PT-D is such that port D outlet flow path 45> main flow path 47> second port PT-D, and port D outlet flow path 45 and main flow path. A connection part 47 is a Laplace pressure valve. For this reason, the reaction amplification reagent does not flow out to the main channel 47 but stays at the connection surface between the port D outlet channel 45 and the main channel 47.

次いで、第１ポートＰＴ−Ａに血液と前処理試薬を投入する（Ｓ３）。チップ１００を検査装置１１にセットし、検査装置１１のＳＴＡＲＴスイッチを押す（Ｖ２）。すると、第１ポートＰＴ−Ａ、第２ポートＰＴ−Ｄ、第３ポートＰＴ−Ｂ、第４ポートＰＴ−Ｃにポートパッドが押し付けられる。この時、第１ポートＰＴ−Ａ、第２ポートＰＴ−Ｄ、第３ポートＰＴ−Ｂ、第４ポートＰＴ−Ｃに対応するパッドは大気開放状態になっており、パッドが押し付けられる事によりチップに投入されている液体が移動する事がない。そして、パッド押し付けが完了すると、第３ポートＰＴ−Ｂが減圧され（Ｖ３）、血液と前処理試薬Ｌが検体混合部Ａを高速（１００μＬ／ｍｉｎ）に通過することにより均一に混合される（Ｓ４）。第２ポートＰＴ−Ｄは、第３ポートＰＴ−Ｂと同一の減圧で吸引されており、血液と前処理試薬の送液抵抗が大きくても、第２ポートＰＴ−Ｄ内の前処理試薬が流路に流出することがない。   Next, blood and a pretreatment reagent are introduced into the first port PT-A (S3). The chip 100 is set in the inspection apparatus 11, and the START switch of the inspection apparatus 11 is pressed (V2). Then, the port pad is pressed against the first port PT-A, the second port PT-D, the third port PT-B, and the fourth port PT-C. At this time, the pads corresponding to the first port PT-A, the second port PT-D, the third port PT-B, and the fourth port PT-C are open to the atmosphere, and the chip is pressed by pressing the pad. The liquid put in the tank does not move. When the pad pressing is completed, the third port PT-B is depressurized (V3), and the blood and the pretreatment reagent L are uniformly mixed by passing through the sample mixing part A at a high speed (100 μL / min) ( S4). The second port PT-D is aspirated at the same reduced pressure as the third port PT-B, and the pretreatment reagent in the second port PT-D remains in the second port PT-D even if the liquid feeding resistance between the blood and the pretreatment reagent is large. It does not flow out into the flow path.

液がセンシング位置ＰＨ１に到達し、液位置検出部のセンサーＰＨ−１が液を検出してＯＮ状態になると（Ｖ４）、第３ポートＰＴ−Ｂが加圧され、定量（１０μＬ）の液を高速（１００μＬ／ｍｉｎ）で逆向きの上流方向に向かって送液する（Ｓ５）。その後、第３ポートＰＴ−Ｂが減圧され、定量（１０μＬ）の液を高速（１００μＬ／ｍｉｎ）で下流方向に向かって送液する。この往復動作により、液をより均一に混合することができる。   When the liquid reaches the sensing position PH1 and the sensor PH-1 of the liquid position detection unit detects the liquid and becomes ON (V4), the third port PT-B is pressurized, and a fixed amount (10 μL) of liquid is discharged. Liquid is fed toward the upstream direction in the reverse direction at a high speed (100 μL / min) (S5). Thereafter, the third port PT-B is depressurized, and a fixed amount (10 μL) of liquid is fed toward the downstream direction at a high speed (100 μL / min). By this reciprocation, the liquid can be mixed more uniformly.

次に、吸引速度が低速（３０μｌ／ｍｉｎ）に切り替えられる（Ｓ６）。
被加熱部Ｂを液が低速（３０μｌ／ｍｉｎ）で通過することにより（Ｓ７）、血液と前処理試薬の混合液Ｌは一定時間（例えば１５秒間）、９８℃に加熱され、白血球中のＤＮＡが抽出され、１本鎖となる。
そして、液がセンシング位置ＰＨ２に到達し、センサーＰＨ−２がＯＮすると（Ｖ５）、第２ポートＰＴ−Ｄが大気開放となり、同時に第１ポートＰＴ−Ａが閉となり、第３ポートＰＴ−Ｂからの吸引により、第２ポートＰＴ−Ｄから増幅反応試薬が主流路４７に流出する（Ｓ８）。これにより、血液と前処理試薬の混合液Ｌとを、泡を含むことなく合流させる（Ｓ９）。 Next, the suction speed is switched to a low speed (30 μl / min) (S6).
When the liquid passes through the heated part B at a low speed (30 μl / min) (S7), the mixed liquid L of blood and pretreatment reagent is heated to 98 ° C. for a certain period of time (for example, 15 seconds), and DNA in white blood cells Is extracted and becomes a single strand.
When the liquid reaches the sensing position PH2 and the sensor PH-2 is turned on (V5), the second port PT-D is opened to the atmosphere, and at the same time, the first port PT-A is closed, and the third port PT-B. As a result, the amplification reaction reagent flows out from the second port PT-D to the main channel 47 (S8). Thereby, the blood and the mixed solution L of the pretreatment reagent are joined together without containing bubbles (S9).

その後、液がセンシング位置ＰＨ３に到達し、センサーＰＨ−３がＯＮすると（Ｖ６）、吸引速度が高速（１００μｌ／ｍｉｎ）に切り替えられ、一定流量（４５μｌ）が吸引される（Ｓ１０）。
そして、第１ポートＰＴ−Ａが大気開放となり（Ｖ７）、さらに１５μＬ吸引されることで、第２ポートＰＴ−Ｄは空になり、第１混合部Ｅ１で液が混合される（Ｓ１１）。
さらに高速（４０００μｌ／ｍｉｎ）で８０μＬ吸引されることにより（Ｖ８）、混合液Ｌは、第１流路部１１１Ａ、酵素保持部Ｄを通過し、酵素が溶解され、第１流路部１１１Ｂで混合される（Ｓ１２）。 Thereafter, when the liquid reaches the sensing position PH3 and the sensor PH-3 is turned on (V6), the suction speed is switched to high speed (100 μl / min), and a constant flow rate (45 μl) is sucked (S10).
Then, the first port PT-A is opened to the atmosphere (V7), and when 15 μL is further sucked, the second port PT-D is emptied, and the liquid is mixed in the first mixing part E1 (S11).
Further, by sucking 80 μL at a high speed (4000 μl / min) (V8), the liquid mixture L passes through the first flow path part 111A and the enzyme holding part D, the enzyme is dissolved, and the first flow path part 111B Mixed (S12).

さらに低速（２００μｌ／ｍｉｎ）で８０μＬ加圧されることにより（Ｖ９）、混合液Ｌは第１流路部１１１Ａに戻され、酵素溶解時に発生した微小な気泡は液移動速度よりも遅いため液後端部に集まり、混合液Ｌの移動に伴って気泡が液体から離れて流路壁に付着し、弾けて消滅する。（Ｓ１３）。   Further, when 80 μL of pressure is applied at a low speed (200 μl / min) (V9), the liquid mixture L is returned to the first flow path part 111A, and the minute bubbles generated at the time of enzyme dissolution are slower than the liquid movement speed. The bubbles gather at the rear end, and as the mixed liquid L moves, the bubbles leave the liquid and adhere to the flow path wall, and then burst and disappear. (S13).

さらに高速（４０００μｌ／ｍｉｎ）で８０μＬ吸引されることにより（Ｖ１０）、液体は第１流路部１１１Ｂで混合される（Ｓ１４）。
同様の往復動作を、後段の第２混合部Ｅ２でも行うことにより、液体は均一に混合される。つまり、混合液Ｌは、第１混合部Ｅ１の第１流路部１１１Ｂから第２混合部Ｅ２の第１流路部１１１Ｃに搬送され（Ｓ１５）、さらに第１流路部１１１Ｄに送られ（Ｓ１６）、そして第１流路部１１１Ｄから第１流路部１１１Ｃに戻される。この第２混合部Ｅ２においても、複数回にわたる混合液Ｌの往復動作が行われる。 Further, by sucking 80 μL at a high speed (4000 μl / min) (V10), the liquid is mixed in the first flow path part 111B (S14).
The liquid is uniformly mixed by performing the same reciprocating operation also in the second mixing section E2 at the subsequent stage. That is, the liquid mixture L is conveyed from the first flow path part 111B of the first mixing part E1 to the first flow path part 111C of the second mixing part E2 (S15), and further sent to the first flow path part 111D ( S16), and returned from the first flow path portion 111D to the first flow path portion 111C. In the second mixing part E2, the reciprocating operation of the mixed liquid L is performed a plurality of times.

次に、第３ポートＰＴ−Ｂより、低速（３０μｌ／ｍｉｎ）で吸引することにより（Ｖ１１）、第２混合部Ｅ２の第２流路部１１１Ｄの混合液Ｌは、反応部Ｆの流路に搬送される（Ｓ１７）。   Next, by sucking at a low speed (30 μl / min) from the third port PT-B (V11), the liquid mixture L in the second flow path part 111D of the second mixing part E2 becomes the flow path of the reaction part F. (S17).

液がセンシング位置ＰＨ５に到達し、センサーＰＨ−５がＯＮすると（Ｖ１２）、第３ポートＰＴ−Ｂは閉状態になり、第４ポートＰＴ−Ｃが低速（５０μｌ／ｍｉｎ）で吸引される。混合液Ｌは、反応検出セル２７内に搬送され（Ｓ１８）、セル下流の反応検出セル出口流路７１の小径部７１ａで停止する（Ｓ１９）。この停止タイミングは、圧力センサーＰＳがある一定の圧力に達した時点で反応検出セル２７への分注完了と判断できる。   When the liquid reaches the sensing position PH5 and the sensor PH-5 is turned on (V12), the third port PT-B is closed and the fourth port PT-C is sucked at a low speed (50 μl / min). The liquid mixture L is conveyed into the reaction detection cell 27 (S18), and stops at the small diameter portion 71a of the reaction detection cell outlet channel 71 downstream of the cell (S19). The stop timing can be determined as the completion of dispensing to the reaction detection cell 27 when the pressure sensor PS reaches a certain pressure.

この時、各反応検出セル２７は常温に保たれており、予めゼラチンにより固定化されているプライマーは溶解することなくセル内に保持されている。   At this time, each reaction detection cell 27 is kept at room temperature, and the primer previously immobilized with gelatin is held in the cell without being dissolved.

次に、検査装置１１のパッドデバイスが離脱し、図示しないシールデバイスにより、各ポート部ＰＴ−Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄには、ラベルＲａ，Ｒｂ，Ｒｃ，Ｒｄ（図５参照）が貼り付けられ、チップ１００は密閉状態となり、幅反応による増幅産物がチップ外に流出することにより、環境を汚染する心配がなくなる。   Next, the pad device of the inspection apparatus 11 is detached, and labels Ra, Rb, Rc, Rd (see FIG. 5) are attached to the port portions PT-A, B, C, D by a seal device (not shown). As a result, the chip 100 is hermetically sealed, and the amplification product due to the width reaction flows out of the chip, so that there is no fear of polluting the environment.

次に反応部Ｆは、図示しない温調デバイスにより、６０℃に急速に加熱される。加熱により、ゼラチンにより固定化されていたプライマーは、反応検出セル２７内に均一に拡散し、等温増幅反応が始まる。
このとき、反応検出セル２７両端の細い反応検出セル入り口流路６９と反応検出セル出口流路７１との液体端面は６０℃に加熱されることなく、常温に保たれており、反応検出セル２７内の液体が蒸発してしまうことがない。 Next, the reaction part F is rapidly heated to 60 ° C. by a temperature control device (not shown). By heating, the primer immobilized with gelatin is uniformly diffused into the reaction detection cell 27 and the isothermal amplification reaction starts.
At this time, the liquid end surfaces of the thin reaction detection cell inlet flow path 69 and the reaction detection cell outlet flow path 71 at both ends of the reaction detection cell 27 are kept at room temperature without being heated to 60 ° C. The liquid inside does not evaporate.

各反応検出セル２７ａ〜２７ｍを図１に示す蛍光検出部１７で励起光を照射し一定時間間隔で蛍光測定することにより、各反応検出セル２７ａ〜２７ｍに予め実装していたプライマーに対応するターゲット遺伝子配列が存在しているかどうかを知ることができる。ターゲット遺伝子配列が存在している場合には、蛍光強度の増大が確認されるのに対して、ターゲット遺伝子配列が存在していない場合には、蛍光強度の増大がない。   The target corresponding to the primer previously mounted in each reaction detection cell 27a-27m by irradiating each reaction detection cell 27a-27m with excitation light by the fluorescence detection part 17 shown in FIG. You can know if a gene sequence exists. When the target gene sequence is present, an increase in fluorescence intensity is confirmed, whereas when the target gene sequence is not present, there is no increase in fluorescence intensity.

したがって、本実施の形態によるマイクロ流体チップ１００によれば、検体液と前処理試薬とを投入する第１ポートＰＴ−Ａ、反応増幅試薬を投入する第２ポートＰＴ−Ｄ、流路内に空気圧を供給する第３ポートＰＴ−Ｂに加え、各種試薬との混合、混合液の定量分注のための流路を構成手段として備え、液流路内の液体の先端部、後端部の少なくともいずれかを検出し、この検出のされたタイミングに応じて液体の制御動作条件を決定することにより、有限な液体が、特に、能動的なバルブやポンプを内臓していないシンプルな流路によって、チップ１００の外部からの空圧駆動で複雑にハンドリング可能となる。つまり、立体的に複雑な構造を必要とせず、簡単な構造で送液制御が可能となる。これにより、検体と液体試薬を投入するだけで、自動的に所望の液滴操作、化学反応を行い、ピペッティングの操作、装置への出し入れ等の煩雑な操作を不要にして、高い分析結果が得られる。   Therefore, according to the microfluidic chip 100 according to the present embodiment, the first port PT-A for introducing the sample liquid and the pretreatment reagent, the second port PT-D for introducing the reaction amplification reagent, and the air pressure in the flow path In addition to the third port PT-B for supplying the liquid, a flow path for mixing with various reagents and quantitative dispensing of the mixed liquid is provided as a constituent means, and at least a front end portion and a rear end portion of the liquid in the liquid flow path By detecting either and determining the liquid control operating conditions according to the detected timing, a finite liquid, especially with a simple flow path that does not contain an active valve or pump, Complex handling is possible by pneumatic driving from the outside of the chip 100. That is, liquid feeding control is possible with a simple structure without requiring a three-dimensionally complicated structure. This makes it possible to perform a desired droplet operation and chemical reaction automatically by simply inserting a sample and a liquid reagent, eliminating the need for complicated operations such as pipetting and loading / unloading to / from the device, and providing high analysis results. can get.

次に、本発明に係るマイクロ流体チップの他の実施形態を説明する。
図２３は本実施形態におけるマイクロ流体チップの下面視を表した平面図である。図４と同一の部材には同一の符号を付与することでその説明は省略する。
本実施形態のマイクロ流体チップ２００の構成では、第４の流路（酵素保持部）Ｄと、酵素保持部Ｄで処理される第２混合液への酵素の混合を助長する第５の流路（酵素混合部）Ｅの構成が前述の実施形態の構成と異なっている。
酵素混合部Ｅは、図２３に示すように、液溜め室である第１混合部４９と第２混合部５１とを有する。酵素保持部Ｄは、第１混合部４９と第２混合部５１との間に設けられ、第１保持部５３と第２保持部５５とからなる。第１保持部５３は、第１混合部４９と第２混合部５１の間に設置された、試薬保持用のセルであり、ポリミラーゼとデキストリンの水溶解液を点着後、凍結乾燥により乾燥、固化した試薬５７が保持される。 Next, another embodiment of the microfluidic chip according to the present invention will be described.
FIG. 23 is a plan view showing a bottom view of the microfluidic chip in the present embodiment. The same members as those in FIG. 4 are denoted by the same reference numerals, and the description thereof is omitted.
In the configuration of the microfluidic chip 200 of the present embodiment, the fourth flow path (enzyme holding part) D and the fifth flow path that facilitates the mixing of the enzyme into the second mixed solution processed in the enzyme holding part D (Enzyme mixing part) The structure of E differs from the structure of the above-mentioned embodiment.
As shown in FIG. 23, the enzyme mixing unit E includes a first mixing unit 49 and a second mixing unit 51 that are liquid storage chambers. The enzyme holding unit D is provided between the first mixing unit 49 and the second mixing unit 51 and includes a first holding unit 53 and a second holding unit 55. The first holding unit 53 is a reagent holding cell installed between the first mixing unit 49 and the second mixing unit 51, and after dripping the aqueous solution of polymirase and dextrin, it is dried by lyophilization, The solidified reagent 57 is held.

この保持部の上流と下流の流路は、その保持部より細くなっており、乾燥固化した試薬５７の流路への密着力が無い場合でも、チップ２００の保存、運搬等の振動により固化試薬５７が剥がれ落ちて前後の流路へ流出してしまうことを防いでいる。   The upstream and downstream flow paths of the holding unit are narrower than the holding unit, and even when the dried and solidified reagent 57 does not have an adhesive force to the flow path, the solidified reagent is generated by vibration such as storage and transportation of the chip 200. 57 is prevented from peeling off and flowing out to the front and rear flow paths.

次に、上記のマイクロ流体チップ２００を使用した送液フローについて説明する。
図２４はマイクロ流体チップの駆動制御に伴う各要素の作動状態を時間軸に沿って表したタイムチャート、図２５は液セットから最初の加熱までの動作説明図、図２６は酵素混合までの動作説明図、図２７は反応部注入までの動作説明図、図２８は分注から検査完了までの動作説明図である。
以下の説明においては、図２４の制御動作Ｖ１〜Ｖ１３と図２５〜図２８の各ステップＳ１〜Ｓ２０における状態を対応させて説明する。
先ず、チップ２００を準備し、検査装置１１のＲＥＡＤＹスイッチを押す（Ｖ１、Ｓ１）。そして、第２ポートＰＴ−Ｄに反応増幅試薬を投入する（Ｓ２）。第２ポートＰＴ−Ｄにおける流路の毛細管力の大小関係は、ポートＤ出口流路４５＞主流路４７＞第２ポートＰＴ−Ｄという関係になっており、ポートＤ出口流路４５と主流路４７の接続部はラプラス圧バルブが構成されている。このため、反応増幅試薬は主流路４７に流出することなく、ポートＤ出口流路４５と主流路４７の接続面で留まる。 Next, a liquid feeding flow using the microfluidic chip 200 will be described.
24 is a time chart showing the operation state of each element along the time axis according to the drive control of the microfluidic chip, FIG. 25 is an operation explanatory diagram from the liquid setting to the first heating, and FIG. 26 is the operation until the enzyme mixing. FIG. 27 is a diagram for explaining the operation up to the injection of the reaction part, and FIG. 28 is a diagram for explaining the operation from the dispensing to the completion of the inspection.
In the following description, the control operations V1 to V13 in FIG. 24 and the states in steps S1 to S20 in FIGS.
First, the chip 200 is prepared, and the READY switch of the inspection apparatus 11 is pressed (V1, S1). Then, a reaction amplification reagent is introduced into the second port PT-D (S2). The relationship between the capillary forces of the flow paths in the second port PT-D is such that port D outlet flow path 45> main flow path 47> second port PT-D, and port D outlet flow path 45 and main flow path. A connection part 47 is a Laplace pressure valve. For this reason, the reaction amplification reagent does not flow out to the main channel 47 but stays at the connection surface between the port D outlet channel 45 and the main channel 47.

次いで、第１ポートＰＴ−Ａに血液と前処理試薬を投入する（Ｓ３）。チップ２００を検査装置１１にセットし、検査装置１１のＳＴＡＲＴスイッチを押す（Ｖ２）。すると、第１ポートＰＴ−Ａ、第２ポートＰＴ−Ｄ、第３ポートＰＴ−Ｂ、第４ポートＰＴ−Ｃにポートパッドが押し付けられる。この時、第１ポートＰＴ−Ａ、第２ポートＰＴ−Ｄ、第３ポートＰＴ−Ｂ、第４ポートＰＴ−Ｃに対応するパッドは大気開放状態になっており、パッドが押し付けられる事によりチップに投入されている液体が移動する事がない。そして、パッド押し付けが完了すると、第３ポートＰＴ−Ｂが減圧され（Ｖ３）、血液と前処理試薬Ｌが検体混合部Ａを高速（１００μＬ／ｍｉｎ）に通過することにより均一に混合される（Ｓ４）。第２ポートＰＴ−Ｄは、第３ポートＰＴ−Ｂと同一の減圧で吸引されており、血液と前処理試薬の送液抵抗が大きくても、第２ポートＰＴ−Ｄ内の前処理試薬が流路に流出することがない。   Next, blood and a pretreatment reagent are introduced into the first port PT-A (S3). The chip 200 is set in the inspection apparatus 11, and the START switch of the inspection apparatus 11 is pressed (V2). Then, the port pad is pressed against the first port PT-A, the second port PT-D, the third port PT-B, and the fourth port PT-C. At this time, the pads corresponding to the first port PT-A, the second port PT-D, the third port PT-B, and the fourth port PT-C are open to the atmosphere, and the chip is pressed by pressing the pad. The liquid put in the tank does not move. When the pad pressing is completed, the third port PT-B is depressurized (V3), and the blood and the pretreatment reagent L are uniformly mixed by passing through the sample mixing part A at a high speed (100 μL / min) ( S4). The second port PT-D is aspirated at the same reduced pressure as the third port PT-B, and the pretreatment reagent in the second port PT-D remains in the second port PT-D even if the liquid feeding resistance between the blood and the pretreatment reagent is large. It does not flow out into the flow path.

液がセンシング位置ＰＨ１に到達し、液位置検出部のセンサーＰＨ−１がＯＮし（Ｖ４）、次に、吸引速度が低速（３０μｌ／ｍｉｎ）に切り替えられる（Ｓ５）。
被加熱部Ｂを液が低速（３０μｌ／ｍｉｎ）で通過することにより（Ｓ６）、血液と前処理試薬の混合液Ｌは一定時間（例えば１５秒間）、９８℃に加熱され、白血球中のＤＮＡが抽出され、１本鎖となる。
液がセンシング位置ＰＨ２に到達し、センサーＰＨ−２がＯＮすると（Ｖ５）、第２ポートＰＴ−Ｄが大気開放となり、同時に第１ポートＰＴ−Ａが閉となり、吸引により、第２ポートＰＴ−Ｄのみから増幅反応試薬が流出し（Ｓ７）、血液と前処理試薬の混合液Ｌと泡を含むことなく合流する（Ｓ８）。 The liquid reaches the sensing position PH1, the sensor PH-1 of the liquid position detector is turned on (V4), and then the suction speed is switched to a low speed (30 μl / min) (S5).
When the liquid passes through the heated part B at a low speed (30 μl / min) (S6), the mixed liquid L of blood and pretreatment reagent is heated to 98 ° C. for a certain period of time (for example, 15 seconds), and DNA in white blood cells Is extracted and becomes a single strand.
When the liquid reaches the sensing position PH2 and the sensor PH-2 is turned on (V5), the second port PT-D is opened to the atmosphere, and at the same time, the first port PT-A is closed. The amplification reaction reagent flows out only from D (S7), and joins without containing bubbles and the mixed solution L of blood and pretreatment reagent (S8).

液がセンシング位置ＰＨ３に到達し、センサーＰＨ−３がＯＮすると（Ｖ６）、吸引速度が高速（１００μｌ／ｍｉｎ）に切り替えられ、一定流量（４５μｌ）が吸引される（Ｓ９，Ｓ１０）。
そして、第１ポートＰＴ−Ａが大気開放となり（Ｖ７）、さらに１５μＬ吸引され、第２ポートＰＴ−Ｄは空になり、第１混合部４９で混合される（Ｓ１１）。
さらに高速（５００μｌ／ｍｉｎ）で８０μＬ吸引されることにより（Ｖ８）、混合液Ｌは第１保持部５３、第２保持部５５を通過し、酵素が溶解され、第２混合部５１で混合される（Ｓ１２）。 When the liquid reaches the sensing position PH3 and the sensor PH-3 is turned on (V6), the suction speed is switched to high speed (100 μl / min), and a constant flow rate (45 μl) is sucked (S9, S10).
Then, the first port PT-A is opened to the atmosphere (V7), and further 15 μL is sucked, and the second port PT-D is emptied and mixed by the first mixing unit 49 (S11).
Furthermore, by sucking 80 μL at a high speed (500 μl / min) (V8), the mixed solution L passes through the first holding unit 53 and the second holding unit 55, the enzyme is dissolved, and mixed in the second mixing unit 51. (S12).

さらに高速（５００μｌ／ｍｉｎ）で８０μＬ加圧されることにより（Ｖ９）、混合液Ｌは第１混合部４９に搬送され、未溶解の酵素が溶解され、第１混合部４９で混合される（Ｓ１３）。
さらに高速（５００μｌ／ｍｉｎ）で８０μＬ吸引されることにより（Ｖ１０）、第１保持部５３、第２保持部５５の酵素は完全に溶解され、また液体は第２混合部５１で混合される（Ｓ１４）。
同様の往復動作を次の往復混合流路部でも行うことにより、液体は均一に混合される。
次に、第３ポートＰＴ−Ｂより、０．２ｋＰａ低速（３０μｌ／ｍｉｎ）で吸引することにより（Ｖ１１）、第２混合部５１の混合液Ｌは、反応部Ｆの流路に搬送される（Ｓ１５）。 Further, when 80 μL of pressure is applied at a high speed (500 μl / min) (V9), the mixed solution L is conveyed to the first mixing unit 49, the undissolved enzyme is dissolved, and mixed in the first mixing unit 49 ( S13).
Further, by sucking 80 μL at a high speed (500 μl / min) (V10), the enzymes in the first holding unit 53 and the second holding unit 55 are completely dissolved, and the liquid is mixed in the second mixing unit 51 ( S14).
By performing the same reciprocating operation also in the next reciprocating mixing channel portion, the liquid is uniformly mixed.
Next, the liquid L of the second mixing unit 51 is conveyed to the flow path of the reaction unit F by sucking from the third port PT-B at a low speed of 0.2 kPa (30 μl / min) (V11). (S15).

液がセンシング位置ＰＨ５に到達し、センサーＰＨ−５がＯＮすると（Ｖ１２）、第３ポートＰＴ−Ｂは閉状態になり、第４ポートＰＴ−Ｃが０．３ｋＰａ低速（５０μｌ／ｍｉｎ）で吸引され、この状態が５秒間保持される。混合液Ｌは、反応検出セル２７内に搬送され、セル下流の細い反応検出セル出口流路７１で停止する（Ｓ１６，Ｓ１７，Ｓ１８）。圧力センサーＰＳがある一定の圧力に達した時点で分注完了と判断できる。   When the liquid reaches the sensing position PH5 and the sensor PH-5 is turned on (V12), the third port PT-B is closed and the fourth port PT-C is sucked at a low speed of 0.3 kPa (50 μl / min). This state is maintained for 5 seconds. The liquid mixture L is conveyed into the reaction detection cell 27 and stops at the narrow reaction detection cell outlet channel 71 downstream of the cell (S16, S17, S18). When the pressure sensor PS reaches a certain pressure, it can be determined that dispensing has been completed.

この時、各反応検出セル２７は常温に保たれており、予めゼラチンにより固定化されているプライマーは溶解することなくセル内に保持されている。
次に、第４ポートＰＴ−Ｃを閉状態とし（Ｖ１３）、第３ポートＰＴ−Ｂより１００μｌ／ｍｉｎの速度で加圧することにより、反応検出セル２７を連結している主流路７３内の混合液は第２混合部５１に押し戻され（Ｓ１９）、各反応検出セル２７には、２．５μＬの混合液Ｌが秤量分注され、これらはお互いに液で連結していない状態となる（Ｓ２０）。 At this time, each reaction detection cell 27 is kept at room temperature, and the primer previously immobilized with gelatin is held in the cell without being dissolved.
Next, the 4th port PT-C is made into a closed state (V13), and it mixes in the main flow path 73 which has connected the reaction detection cell 27 by pressurizing from the 3rd port PT-B at a speed | rate of 100 microliters / min. The liquid is pushed back to the second mixing unit 51 (S19), 2.5 μL of the mixed liquid L is weighed and dispensed into each reaction detection cell 27, and these are not connected to each other by the liquid (S20). ).

以上、第５の流路（酵素混合部）Ｅの構成を簡略化した本実施形態の構成によっても、第１実施形態と同様の作用効果を得ることができる。   As described above, also by the configuration of the present embodiment in which the configuration of the fifth flow path (enzyme mixing unit) E is simplified, the same effects as those of the first embodiment can be obtained.

本発明に係るマイクロ流体チップは、検体液と前処理試薬とを投入する第１ポート、反応増幅試薬を投入する第２ポート、流路内に空気圧を供給する第３ポートに加え、各種試薬との混合、混合液の定量分注のための流路を構成手段として備えることにより、有限な液体が、特に、能動的なバルブやポンプを内臓していないシンプルな流路によっても、チップ外部からの空圧駆動で複雑にハンドリング可能となる。よって、簡単な構造で送液制御が可能となり、検体と液体試薬を投入するだけで、自動的に所望の液滴操作、化学反応を行い、ピペッティングの操作、装置への出し入れ等の煩雑な操作を不要にして、高い分析結果を得ることができる。   The microfluidic chip according to the present invention includes a first port for introducing a sample solution and a pretreatment reagent, a second port for introducing a reaction amplification reagent, a third port for supplying air pressure into a flow path, various reagents, By providing a flow path for mixing and quantitative dispensing of mixed liquid as a constituent means, a finite liquid can be removed from the outside of the chip, especially by a simple flow path that does not contain an active valve or pump. It becomes possible to handle complicatedly by pneumatic driving. Therefore, it is possible to control liquid feeding with a simple structure, and by simply inserting a specimen and a liquid reagent, the desired droplet operation, chemical reaction is performed automatically, pipetting operation, loading and unloading to the device, etc. A high analysis result can be obtained without the need for operation.

本発明に係るマイクロ流体チップを検査装置の概略構成と共に表したブロック図である。1 is a block diagram illustrating a microfluidic chip according to the present invention together with a schematic configuration of an inspection apparatus. 図１に示したマイクロ流体チップの分解斜視図である。FIG. 2 is an exploded perspective view of the microfluidic chip shown in FIG. 1. マイクロ流体チップの上面視を（ａ）、下面視を（ｂ）に表した平面図である。It is the top view which represented the top view of the microfluidic chip to (a), and the bottom view was represented to (b). 図３（ｂ）の拡大図である。FIG. 4 is an enlarged view of FIG. 閉塞部材の貼着前のチップ下面を表した分解斜視図である。It is a disassembled perspective view showing the chip | tip lower surface before sticking of a closure member. ポート出口流路の近傍を表す要部拡大平面図である。It is a principal part enlarged plan view showing the vicinity of a port exit flow path. 第１混合部と第２混合部の拡大図である。It is an enlarged view of a 1st mixing part and a 2nd mixing part. 第１流路部の幅とメニスカスの長さとの関係を示す説明図（ａ），（ｂ）である。It is explanatory drawing (a) which shows the relationship between the width | variety of a 1st flow path part, and the length of a meniscus. プライマーが混合拡散された図４のＰ２−Ｐ２断面視を（ａ）、その要部拡大図を（ｂ）に表した反応検出セルの説明図である。It is explanatory drawing of the reaction detection cell which represented the P2-P2 cross section view of FIG. 4 with which the primer was mixed and diffused, and represented the principal part enlarged view to (b). 反応検出セルの拡大平面図である。It is an enlarged plan view of a reaction detection cell. ターゲット配列がある場合を（ａ）、ターゲット配列が無い場合を（ｂ）に表した蛍光測定結果のグラフである。It is a graph of the fluorescence measurement result showing the case where there is a target sequence (a) and the case where there is no target sequence (b). 反応検出部の発泡状況を（ａ）〜（ｃ）に表した平面図である。It is the top view which represented the foaming condition of the reaction detection part to (a)-(c). 反応検出部の発泡防止策を表した要部断面図である。It is principal part sectional drawing showing the foaming prevention measure of the reaction detection part. 液位置検出部の平面視を（ａ）、そのＰ１−Ｐ１断面視を（ｂ）に表した説明図である。It is explanatory drawing which represented the planar view of the liquid position detection part to (a), and represented the P1-P1 cross section view to (b). 液位置検出部の入反射光を表した模式図である。It is a schematic diagram showing the incident / reflected light of the liquid position detection unit. 反射率と入射角度との相関を表したグラフである。It is a graph showing the correlation between a reflectance and an incident angle. 投光側光ファイバーと受光側光ファイバーとが傾斜配置された液位置検出部の側面図である。It is a side view of the liquid position detection part by which the light projection side optical fiber and the light reception side optical fiber were inclinedly arranged. マイクロ流体チップの駆動制御に伴う各要素の作動状態を時間軸に沿って表したタイムチャートである。It is the time chart which represented the operation state of each element accompanying the drive control of a microfluidic chip along the time axis. 液セットから最初の加熱までの動作説明図（ｓ１）〜（ｓ６）である。It is operation | movement explanatory drawing (s1)-(s6) from a liquid set to the first heating. 第２液を合流させてから酵素混合までの動作説明図（ｓ７）〜（ｓ１２）である。It is operation | movement explanatory drawing (s7)-(s12) from joining a 2nd liquid to enzyme mixing. 混合処理から反応部注入までの動作説明図（ｓ１３）〜（ｓ１８）である。It is operation | movement explanatory drawing (s13)-(s18) from a mixing process to reaction part injection | pouring. 分注を完了させた動作説明図（ｓ１９）である。It is operation | movement explanatory drawing (s19) which completed dispensing. マイクロ流体チップの下面視を表した平面図である。It is a top view showing the bottom view of the microfluidic chip. マイクロ流体チップの駆動制御に伴う各要素の作動状態を時間軸に沿って表したタイムチャートである。It is the time chart which represented the operation state of each element accompanying the drive control of a microfluidic chip along the time axis. 液セットから最初の加熱までの動作説明図である。It is operation | movement explanatory drawing from a liquid set to the first heating. 酵素混合までの動作説明図である。It is operation | movement explanatory drawing until an enzyme mixing. 反応部注入までの動作説明図である。It is operation | movement explanatory drawing to reaction part injection | pouring. 分注から検査完了までの動作説明図である。It is operation | movement explanatory drawing from dispensing to completion of an inspection.

符号の説明Explanation of symbols

２７ 反応検出セル
４１ 広幅流路部
４３ 狭幅流路部
４５ ポートと連通させるポート出口流路
４７ 混合液が送液される主流路
４９ 第１混合部（液溜め室）
５１ 第２混合部（液溜め室）
６１，６３，６５ プライマー
８１ 微小な隙間空間
８３ 流路
１００，２００ マイクロ流体チップ
１１１Ａ、１１１Ｂ，１１１Ｃ，１１１Ｄ 第１流路部
１１３，１１５ 第２流路部
Ａ 検体混合部（第１の流路）
Ｂ 被加熱部（第２の流路）
Ｃ 試薬合流部（第３の流路）
Ｄ 酵素保持部（第４の流路）
Ｅ 酵素混合部（第５の流路）
Ｅ１ 第１混合部
Ｅ２ 第２混合部
Ｆ 反応部（第６の流路）
Ｇ 定量分注流路（第７の流路）
Ｒａ，Ｒｂ，Ｒｃ，Ｒｄ ラベル（閉塞部材）
ＰＴ−Ａ 第１ポート
ＰＴ−Ｂ 第３ポート
ＰＴ−Ｃ 第４ポート
ＰＴ−Ｄ 第２ポート 27 Reaction detection cell 41 Wide channel portion 43 Narrow channel portion 45 Port outlet channel communicating with the port 47 Main channel through which the mixed liquid is fed 49 First mixing unit (reservoir chamber)
51 Second mixing part (Liquid reservoir)
61, 63, 65 Primer 81 Minute gap 83 83 Channel 100, 200 Microfluidic chips 111A, 111B, 111C, 111D First channel 113, 115 Second channel A A Sample mixing unit (first channel) )
B Heated part (second flow path)
C Reagent junction (third flow path)
D Enzyme holding part (fourth flow path)
E Enzyme mixing part (5th flow path)
E1 1st mixing part E2 2nd mixing part F Reaction part (6th flow path)
G Fixed dispensing channel (seventh channel)
Ra, Rb, Rc, Rd label (blocking member)
PT-A 1st port PT-B 3rd port PT-C 4th port PT-D 2nd port

Claims (20)

複数種の核酸配列を検出するための流路を備えたマイクロ流体チップであって、
核酸を含む検体液と第１液とを投入する第１ポートと、
第２液を投入する第２ポートと、
前記流路内に空気圧を供給する第３ポートと、
前記第１ポートから投入された検体液と前記第１液とを混合して第１混合液を生成する第１の流路（Ａ）と、
前記第１混合液を加熱する第２の流路（Ｂ）と、
前記第２の流路（Ｂ）で処理された前記第１混合液に第２液を合流させる第３の流路（Ｃ）と、
前記第３の流路（Ｃ）で合流された第２混合液が通過することにより溶解する第１固体を実装した第４の流路（Ｄ）と、
前記第４の流路（Ｄ）で処理される第２混合液への前記第１固体の混合を助長する第５の流路（Ｅ）と、
前記第５の流路（Ｅ）に接続され、流路内に固化実装された第２固体を有する第６の流路（Ｆ）と、
前記複数の第６の流路に接続され前記第５の流路（Ｅ）で処理された第２混合液を前記複数の第６の流路（Ｆ）それぞれに定量分注するための第７の流路（Ｇ）と、
を有して構成されるマイクロ流体チップ。 A microfluidic chip having a flow path for detecting a plurality of nucleic acid sequences,
A first port for introducing a sample liquid containing nucleic acid and a first liquid;
A second port for charging the second liquid;
A third port for supplying air pressure into the flow path;
A first flow path (A) for mixing the sample liquid introduced from the first port and the first liquid to generate a first mixed liquid;
A second flow path (B) for heating the first mixed liquid;
A third flow path (C) for joining the second liquid to the first mixed liquid treated in the second flow path (B);
A fourth flow path (D) mounted with a first solid that dissolves when the second mixed liquid merged in the third flow path (C) passes;
A fifth channel (E) that facilitates the mixing of the first solid into the second mixture to be processed in the fourth channel (D);
A sixth channel (F) connected to the fifth channel (E) and having a second solid solidified and mounted in the channel;
A seventh mixture for dispensing quantitatively the second mixed liquid connected to the plurality of sixth channels and processed in the fifth channel (E) into each of the plurality of sixth channels (F). A flow path (G) of
A microfluidic chip having a structure. 請求項１記載のマイクロ流体チップであって、
前記第１液が前処理試薬で構成されているマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to claim 1,
A microfluidic chip in which the first liquid is composed of a pretreatment reagent. 請求項１又は２記載のマイクロ流体チップであって、
前記第２液が反応増幅試薬で構成されているマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to claim 1 or 2,
A microfluidic chip in which the second liquid is composed of a reaction amplification reagent. 請求項１〜３のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第１固体に酵素が混合されているマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 3,
A microfluidic chip in which an enzyme is mixed with the first solid. 請求項１〜４のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第２固体にプライマーが混合されているマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 4,
A microfluidic chip in which a primer is mixed with the second solid. 請求項１〜５のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記マイクロ流体チップが、血液中に含まれる複数種の核酸配列の有無を検出するためのものであるマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 5,
A microfluidic chip, wherein the microfluidic chip is for detecting the presence or absence of a plurality of types of nucleic acid sequences contained in blood. 請求項１〜６のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記マイクロ流体チップが、一塩基多型の有無を検出するためのものであるマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 6,
A microfluidic chip for detecting the presence or absence of a single nucleotide polymorphism. 請求項１〜７のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第６の流路（Ｆ）において等温でＤＮＡ増幅反応を行うマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 7,
A microfluidic chip that performs a DNA amplification reaction isothermally in the sixth channel (F). 請求項１〜８のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記ＤＮＡ増幅で発生する蛍光を検出可能とする透光性を有しているマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 8,
A microfluidic chip having translucency capable of detecting fluorescence generated by the DNA amplification. 請求項１〜９のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第１の流路（Ａ）が、液体の流動方向に直交する方向の断面積が他の流路における断面積に比して大きい広幅流路部と、該広幅流路部より前記断面積が小さい狭幅流路部とが交互に形成されているマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 9,
The first flow path (A) has a wide flow path portion whose cross-sectional area in a direction orthogonal to the liquid flow direction is larger than the cross-sectional area in the other flow paths, and the cross-sectional area from the wide flow path portion. A microfluidic chip in which narrow channel portions having small diameters are alternately formed. 請求項１〜１０のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第３の流路（Ｃ）が、前記第２液を保持するポートと、前記混合液が送液される主流路と、該主流路の途中に配設され前記ポートと連通させるポート出口流路と、を有して構成されており、それぞれの流路に対する毛細管力の大小関係が ポート出口流路＞主流路＞ポート であるマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 10,
The third channel (C) has a port for holding the second liquid, a main channel through which the mixed liquid is fed, and a port outlet flow arranged in the middle of the main channel and communicating with the port. A microfluidic chip having a relationship of magnitude of capillary force with respect to each flow path: port outlet flow path> main flow path> port. 請求項１〜１１のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第４の流路（Ｄ）は、前記第１固体を固化実装する保持部の流路上流側と下流側が、前記保持部よりも狭幅の流路に形成されているマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 11,
The fourth channel (D) is a microfluidic chip in which a channel upstream side and a downstream side of a holding unit for solidifying and mounting the first solid are formed in a channel narrower than the holding unit. 請求項１〜１２のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第５の流路（Ｅ）は複数の液溜め室を有し、前記第４の流路（Ｄ）は前記複数の液溜め室の間に配設され、前記混合液が前記複数の液溜め室間を往復することにより前記第４の流路（Ｄ）に第１固体が溶解、混合されるマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 12,
The fifth channel (E) has a plurality of reservoirs, the fourth channel (D) is disposed between the plurality of reservoirs, and the mixed liquid is the plurality of reservoirs. A microfluidic chip in which a first solid is dissolved and mixed in the fourth flow path (D) by reciprocating between reservoir chambers. 請求項１〜１３のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、 前記第５の流路は、前記第１および第２ポートから前記第３ポートまでの流路途中に設けられ、前記第１および第２ポート側から順に第１混合部と第２混合部とを配置してなり、
前記第１混合部および第２混合部は、それぞれ前記第１混合液が流動する方向の垂直断面積が他の流路における垂直断面積に比して大きい第１流路部と、該第１流路部より垂直断面積が小さい第２流路部とが交互に形成され、
前記第１混合部における前記第１流路部の垂直断面積が前記第２混合部における前記第１流路部の垂直断面積より小さく、
前記第１混合部における前記第１流路部の流路方向長さが前記第２混合部における前記第１流路部の流路方向長さより長く形成されているマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 13, wherein the fifth flow path is provided in the middle of the flow path from the first and second ports to the third port. The first mixing unit and the second mixing unit are arranged in order from the first and second port sides,
The first mixing section and the second mixing section each have a first flow path section in which a vertical cross-sectional area in a direction in which the first mixed liquid flows is larger than a vertical cross-sectional area in other flow paths, The second flow path portions having a smaller vertical cross-sectional area than the flow path portions are alternately formed,
The vertical cross-sectional area of the first flow path part in the first mixing part is smaller than the vertical cross-sectional area of the first flow path part in the second mixing part;
The microfluidic chip in which the flow path direction length of the first flow path part in the first mixing part is longer than the flow direction length of the first flow path part in the second mixing part. 請求項１〜１４のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第６の流路（Ｆ）の第２固体が、流路上側に固化させて配置したマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 14,
A microfluidic chip in which the second solid in the sixth flow path (F) is disposed on the upper side of the flow path. 請求項１〜１５のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第６の流路（Ｆ）に配置されたプライマーが、加熱により溶解する物質に混合して固化されたものであるマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 15,
A microfluidic chip in which a primer disposed in the sixth channel (F) is mixed and solidified with a substance that dissolves by heating. 請求項１〜１６のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第６の流路（Ｆ）が、前記プライマーを保持する反応検出セルと、該反応検出セルの上流側流路と、下流側流路と、により構成され、前記反応検出セル全体と、前記上流側流路及び前記下流側流路の前記反応検出セル側の流路の一部からなる被加熱領域の厚みが、他の領域より薄く形成されているマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 16,
The sixth flow path (F) includes a reaction detection cell that holds the primer, an upstream flow path of the reaction detection cell, and a downstream flow path, and the entire reaction detection cell, A microfluidic chip in which a heated region composed of a part of a channel on the reaction detection cell side of an upstream channel and a downstream channel is formed thinner than other regions. 請求項１〜１７のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記反応増幅試薬による増幅反応を密閉空間内で行うために、前記第１、第２、第３ポートの全てを閉塞する閉塞部材を備えたマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 17,
A microfluidic chip provided with a closing member that closes all of the first, second, and third ports in order to perform an amplification reaction with the reaction amplification reagent in a sealed space. 請求項１〜１８のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記第６の流路（Ｆ）の流路内面が、流路内を液体が流れる際に該液体により充填されない微小な隙間空間の形成を防止する連続した円滑面からなるマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 18,
A microfluidic chip, wherein the inner surface of the sixth channel (F) is a continuous smooth surface that prevents the formation of a minute gap space that is not filled with the liquid when the liquid flows in the channel. 請求項１〜１９のいずれか１項記載のマイクロ流体チップであって、
前記各流路の流路内面が、少なくとも２段階以上の濡れ性を有しているマイクロ流体チップ。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 19,
A microfluidic chip in which the inner surface of each channel has at least two stages of wettability.
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