JP2007120399A - Micro fluid chip and micro comprehensive analysis system - Google Patents
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Abstract
Description
近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段(例えばポンプ、バルブ、流路、セ
ンサーなど)を微細化して１チップ上に集積化したシステムが開発されている（特許文献
１）。これは、μ−ＴＡＳ（Micro total Analysis System）、バイオリアクタ、ラブ・
オン・チップ（Lab-on-chips）、バイオチップとも呼ばれ、医療検査・診断分野、環境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。現実には遺伝子検査に見られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時間および場所を選ばない分析を可能とすることによる恩恵は多大と言える。
In recent years, by making full use of micromachine technology and ultrafine processing technology, devices and means (for example, pumps, valves, flow paths, sensors, etc.) for performing conventional sample preparation, chemical analysis, chemical synthesis, etc. have been miniaturized. A system integrated on a chip has been developed (Patent Document 1). This is a micro-TAS (Micro total Analysis System), bioreactor, love
It is also called “Lab-on-chips” or biochip, and its application is expected in the medical examination / diagnosis field, environmental measurement field, and agricultural production field. In reality, as seen in genetic testing, automated, faster, and simplified microanalysis systems are costly and necessary when complex processes, skilled techniques, and equipment operations are required. It can be said that not only the amount of sample and the time required, but also the benefits of enabling analysis at any time and place are great.
各種の分析、検査ではこれらの分析用チップにおける分析の定量性、解析の精度、経済性などが重要視される。そのためシンプルな構成で、高い信頼性の送液システムを確立することが課題である。精度が高く、信頼性に優れるマイクロ流体制御素子が求められており、好適なマイクロポンプシステムおよびその制御方法を本発明者らはすでに提案している（特許文献２〜４）。
In various types of analysis and inspection, importance is attached to the quantitativeness of analysis, the accuracy of analysis, and the economic efficiency of these analysis chips. Therefore, it is a problem to establish a highly reliable liquid feeding system with a simple configuration. A microfluidic control element having high accuracy and excellent reliability is required, and the present inventors have already proposed a suitable micropump system and a control method thereof (
上記のチップには、検体および試薬の収容部、試薬の混合部、反応部、検出部およびこれらを連通する流路などを含む一連の微細流路が形成されているが、その中には部位選択的に加熱または冷却されるべき領域が存在する。例えば、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法による増幅反応を行う反応部位を構成する微細流路などは、分析時に所定温度
に加熱する必要がある。その一方で、例えば加熱されると変質しやすい検体、試薬が収容される部位、またはこのような試薬類同士を混合する部位などは、昇温されることが望ましくなく、部位選択的に放熱もしくは冷却しなければならない。
The above chip is formed with a series of fine flow paths including a specimen and reagent storage section, a reagent mixing section, a reaction section, a detection section, and a flow path that communicates these parts. There are areas to be selectively heated or cooled. For example, a fine channel constituting a reaction site for performing an amplification reaction by a PCR (polymerase chain reaction) method needs to be heated to a predetermined temperature during analysis. On the other hand, for example, a specimen that easily changes in quality when heated, a part that contains a reagent, or a part where such reagents are mixed with each other is not desirable to be heated, and the part can selectively release heat or Must be cooled.
ところが、限られたスペースに一連の微細流路を集積化するチップにおいては、加熱を要する部位や昇温が望ましくない部位を、充分に広い間隔を取って配置することは難しい。これらの部位が他の部位と近接していると、熱伝導により様々な問題が引き起こされることが考えられる。一例として、ＰＣＲ法による遺伝子増幅反応を行うための加熱部位の近隣に冷却部位が存在する場合、加熱部位の温度分布が中途半端となり、反応に支障が生じることが挙げられる。
本発明は上述の問題に鑑みてなされたものであり、温度分布の異なる領域間での熱の伝導を極力遮断し、チップ内の温度分布を画然とさせ得るマイクロ流体チップを提供することを課題とする。また、そのようなチップを用いることにより、反応への熱による悪影響などが排除されたマイクロ総合分析システムを提供することを課題とする。 The present invention has been made in view of the above-described problems, and provides a microfluidic chip capable of blocking heat conduction between regions having different temperature distributions as much as possible and making the temperature distribution in the chip sharp. Let it be an issue. Another object of the present invention is to provide a micro total analysis system in which adverse effects due to heat on the reaction are eliminated by using such a chip.
本発明のマイクロ総合分析システムは、
別途の加熱装置と当接する「加熱領域」、別途の冷却装置と当接する「冷却領域」、ならびに加熱装置および冷却装置とは当接しない「常温領域」からなる群より選ばれる２種
類以上の温度領域が併存し、異なる種類の温度領域の境界に断熱手段が施されているマイクロ流体チップと、
システム装置本体と、
を備え、そのシステム装置本体は、少なくとも
ベース本体と、
そのベース本体内に配置され、該チップに連通させるための流路開口を有するチップ接続部と、該マイクロポンプとを含むマイクロポンプユニットと、
加熱装置および／または冷却装置と、
少なくとも該マイクロポンプユニットの機能と加熱装置および／または冷却装置とを制御する制御装置と、
を備え、
該マイクロポンプが、
流路抵抗が差圧に応じて変化する第１流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第１流路よりも小さい第２流路と、
第１流路および第２流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部圧力を変化させるアクチュエータと、
該アクチュエータを駆動する駆動装置と
を備えるマイクロポンプであることを特徴としている。
The micro total analysis system of the present invention is
Two or more types of temperatures selected from the group consisting of a “heating region” in contact with a separate heating device, a “cooling region” in contact with a separate cooling device, and a “room temperature region” in non-contact with the heating device and the cooling device A microfluidic chip in which regions coexist and thermal insulation is applied at the boundary of different types of temperature regions;
A system unit body;
The system apparatus main body includes at least a base main body,
A micropump unit including a chip connection portion disposed in the base body and having a channel opening for communicating with the chip; and the micropump;
A heating device and / or a cooling device;
A control device for controlling at least the function of the micropump unit and the heating device and / or cooling device;
With
The micropump
A first flow path in which the flow path resistance changes according to the differential pressure;
A second flow path whose rate of change in flow path resistance with respect to a change in differential pressure is smaller than the first flow path;
A pressurization chamber connected to the first flow path and the second flow path;
An actuator for changing the internal pressure of the pressurizing chamber;
It is a micro pump provided with the drive device which drives this actuator.
上記の断熱手段は、マイクロ流体チップを貫通する空隙であることが好ましく、あるいは、該チップの微細流路とは連通していない、マイクロ流体チップ基板の表面に形成された溝であってもよい。 The heat insulating means is preferably a gap penetrating the microfluidic chip, or may be a groove formed on the surface of the microfluidic chip substrate that is not in communication with the microchannel of the chip. .
前記の異なる種類の温度領域の境界は、例えば、加熱領域と冷却領域との境界である。この加熱領域は、例えば、遺伝子増幅反応を行う反応部を含み、また、冷却領域は、例えば、検体収容部および／または試薬収容部を含む。 The boundary between the different types of temperature regions is, for example, a boundary between a heating region and a cooling region. This heating region includes, for example, a reaction unit that performs a gene amplification reaction, and the cooling region includes, for example, a specimen storage unit and / or a reagent storage unit.
本発明によれば、異なる温度領域間の熱伝導を充分に遮断し、温度分布を画然とさせたマイクロ流体チップが提供される。本発明で用いられる断熱手段により、マイクロ流体チップの狭い範囲に異なる温度領域を隣接して配置することができるため、よりサイズの小型化されたマイクロ流体チップを提供することが可能となる。また、中間温度領域が形成されることによる副反応の発生、流路から試薬類の喪失などを抑制し、効率的に遺伝子などの生体物質の検査を行うことが可能なマイクロ総合分析システムが提供される。 According to the present invention, there is provided a microfluidic chip that sufficiently blocks heat conduction between different temperature regions and has a clear temperature distribution. With the heat insulating means used in the present invention, different temperature regions can be arranged adjacent to each other in a narrow range of the microfluidic chip, so that it is possible to provide a microfluidic chip with a smaller size. Also provided is a micro total analysis system that can efficiently inspect biological substances such as genes by suppressing the occurrence of side reactions due to the formation of an intermediate temperature range and the loss of reagents from the flow path. Is done.
本明細書において、「マイクロ流体チップ」は、合成や検査など様々な用途に用いられるマイクロ総合分析システムにおけるチップのことであるが、特に生体物質を対象とした検査に用いられるものについては「検査チップ」と呼ぶこともある。「流路エレメント」とは、マイクロ流体チップに設置される機能部品をいう。「微細流路」は、本発明のマイクロ流体チップに形成された微小な溝状の流路のことであるが、この流路と連通している試薬類などの収容部、反応部もしくは検出部が、容量の大きい広幅の液溜め状に形成されている場合も、これらの部位を含めて「微細流路」ということがある。微細流路内を流れる流体は、実際は液体であることが多く、具体的には、各種の試薬類、試料液、変性剤液、洗浄液、駆動液などが該当する。「遺伝子」とは、何らかの機能を発現する遺伝情報を担うＤＮＡまたはＲＮＡをいうが、単に化学的実体であるＤＮＡ、ＲＮＡの形でいうこともある。分析対象である標的物質を「アナライト」ということもある。 In this specification, “microfluidic chip” refers to a chip in a micro total analysis system used for various applications such as synthesis and inspection. Sometimes called a “chip”. “Flow path element” refers to a functional component installed in a microfluidic chip. “Fine channel” refers to a minute groove-like channel formed in the microfluidic chip of the present invention. A container, a reaction unit, or a detection unit for reagents and the like communicating with the channel. However, even when it is formed in a wide liquid reservoir shape with a large capacity, it may be referred to as a “fine channel” including these parts. In many cases, the fluid flowing in the fine channel is actually a liquid, and specifically, various reagents, sample liquids, denaturant liquids, cleaning liquids, driving liquids, and the like are applicable. “Gene” refers to DNA or RNA carrying genetic information that expresses some function, but may also be simply referred to as DNA or RNA that is a chemical entity. The target substance to be analyzed is sometimes referred to as “analyte”.
本発明は、種々の実施の形態において、本発明の趣旨に沿って任意の変形、変更が可能であり、それらは本発明に含まれる。すなわち、本発明のマイクロ総合分析システムの全
体または一部について、構造、構成、配置、形状形態、寸法、材質、方式、方法などを本発明の趣旨に合致する限り、種々のものにすることができる。
In the various embodiments, the present invention can be arbitrarily modified and changed in accordance with the spirit of the present invention, and these are included in the present invention. That is, the structure, configuration, arrangement, shape, size, material, method, method, etc. of the whole or a part of the micro total analysis system of the present invention can be varied as long as they match the purpose of the present invention. it can.
マイクロ総合分析システム
図１は、本発明のマイクロ総合分析システムの一実施形態における構成を示した概念図である。図示したように、かかる実施形態では、マイクロ流体チップ2とともに、このチ
ップを収容する装置として、システム装置本体1がある。この装置は、反応のために用い
られるペルチェ3（冷却装置）と、ヒーター4（加熱装置）と、送液用のマイクロポンプ11、駆動液タンク10およびチップ接続部を有するマイクロポンプユニットと、それらの送液、温度、反応の各制御に関わる制御装置（図示せず）と、光学検出系（ホトダイオード5
、ＬＥＤ6など）を含み、測定データの収集および処理をも受け持つ検出処理装置（図示
せず）とを備えている。マイクロ総合分析システムは、マイクロ流体チップ2以外の構成
要素を一体化してシステム装置本体1とし、マイクロ流体チップ2をこのシステム装置本体1に着脱するように構成することが望ましい。
Micro Comprehensive Analysis System FIG. 1 is a conceptual diagram showing a configuration in one embodiment of a micro comprehensive analysis system of the present invention. As shown in the drawing, in this embodiment, there is a system device body 1 as a device that accommodates the
And a detection processing device (not shown) that also collects and processes measurement data. The micro total analysis system is desirably configured so that components other than the
マイクロ流体チップ2は、一般に検査チップ、分析チップ、マイクロリアクタ・チップ
などとも称されるものと同等である。通常、このチップの縦横のサイズは数十ｍｍ、高さは数ｍｍ程度である。そこには、微細加工技術により微細流路が形成されている。微細流路に連通している試薬収容部内、検体収容部内にある各種の液体は、マイクロポンプに連通させるための流路開口を有するポンプ接続部12を介して各収容部に連通された上記マイクロポンプ11によって送液される。
The
マイクロポンプは、マイクロ流体チップ2に設けることも可能であるが、通常、複数の
マイクロポンプがシステム装置本体1に組み込まれる。これら複数のマイクロポンプと、
マイクロ流体チップ2に連通させるための流路開口を有するチップ接続部とを含むマイク
ロポンプユニットが、システム装置本体1のベース本体内に配置されている。図示したよ
うに、マイクロ流体チップ2をシステム装置本体1に装着し、面同士で重ね合わせることにより、該チップのポンプ接続部をマイクロポンプユニットにあるチップ接続部に接続するようになっている。
Although the micropump can be provided in the
A micropump unit including a chip connection portion having a channel opening for communicating with the
マイクロポンプ11を制御する電気制御系統の装置は、流量の目標値を設定し、それに応じた駆動電圧をマイクロポンプに供給している。後述するように、そうした制御を受け持つ制御装置についても、本発明システムの装置本体に組み込んで、マイクロ流体チップ2
のポンプ接続部をマイクロポンプユニットのチップ接続部に接続させた場合に作動制御させるようにしてもよい。
The device of the electric control system that controls the
When the pump connection part is connected to the chip connection part of the micro pump unit, the operation may be controlled.
光学的検出、データの収集および処理を受け持つユニットである検出処理装置（図示せず）は、例えば可視分光法、蛍光測光法などの手法が適用される場合、その光学的測定の手段として特に限定されないが、ＬＥＤ、光電子増倍菅、フォトダイオード、ＣＣＤカメラなどがその構成要素としてシステム装置本体内に適宜設置されることが望ましい。 A detection processing device (not shown), which is a unit responsible for optical detection, data collection and processing, is particularly limited as a means of optical measurement when a technique such as visible spectroscopy or fluorescence photometry is applied. However, it is desirable that an LED, a photomultiplier, a photodiode, a CCD camera, and the like be appropriately installed in the system apparatus body as its constituent elements.
ペルチェ3およびヒーター4は、マイクロ流体チップの特定の部位に当接するよう配置され、これらの部位の冷却または加熱を行う。
少なくとも前記のマイクロポンプユニットの機能を制御する制御装置（図示せず）が、本発明システムの装置本体に組み込まれている。この制御装置は、さらに、加熱装置および／または冷却装置による温度調節を管理する機能、検出処理装置における測定データの記録および処理機能などを統合して担い、システムを統括的に制御支配するようにしてもよい。マイクロポンプ11による送液の順序、容量、タイミングの制御、あるいは加熱装置および／または冷却装置による温度制御などの諸条件は、あらかじめプログラムの内容として設定しておき、マイクロ総合分析システムに搭載されたマイクロコンピュータ等のソ
フトウェアに従ってそれらの制御を行うことができる。
The
A control device (not shown) that controls at least the function of the micropump unit is incorporated in the main body of the system of the present invention. This control device further integrates and controls the temperature control by the heating device and / or the cooling device and the measurement data recording and processing function in the detection processing device so that the system can be controlled and controlled in an integrated manner. May be. Various conditions such as the order of liquid feeding by the
測定試料である検体の前処理、反応および検出の一連の分析工程は、前記のマイクロポンプ11、検出処理装置および制御装置とが一体化されたシステム装置本体１にチップを装着した状態で行なわれる。装着したチップに試料を注入してから、あるいは試料を注入したチップを装置本体に装着してから分析を開始してもよい。試料および試薬類の送液、前処理、混合に基づく所定の反応および光学的測定が、一連の連続的工程として自動的に実施され、測定データが、必要な条件、記録事項とともにファイル内に格納される形態が望ましい。
A series of analysis steps of pretreatment, reaction, and detection of a specimen as a measurement sample is performed in a state where a chip is mounted on the system apparatus body 1 in which the
従来の分析チップでは、異なる分析または合成などを行う場合には、変更される内容に対応するマイクロ流体デバイスをその都度構成する必要があった。これとは異なり、本発明のマイクロ総合分析システムでは脱着可能な上記チップのみ交換すればよい。各流路エレメントの制御変更も必要となる場合には、装置本体に格納された制御プログラムを適宜変更すればよい。 In the conventional analysis chip, when performing different analysis or synthesis, it is necessary to configure a microfluidic device corresponding to the contents to be changed each time. In contrast to this, in the micro total analysis system of the present invention, only the above-described detachable chip need be replaced. If it is necessary to change the control of each flow path element, the control program stored in the apparatus main body may be changed as appropriate.
マイクロ流体チップ
本発明のマイクロ流体チップは、化学分析、各種検査、試料の処理・分離、化学合成などに利用されるように、各流路エレメントまたは構造部が、機能的に適当な位置に微細加工技術により配設されている。このチップには、流体収容部として検体液を収容する検体収容部のほか、各試薬を収容するための複数の試薬収容部が設けられ、この試薬収容部には所定の反応に用いる試薬類、洗浄液、変性処理液などが収容される。これは、場所や時間を問わず迅速に検査ができるように、予め試薬が収容されていることが望ましいためである。チップ内に内蔵される試薬類は、蒸発、漏失、気泡の混入、汚染、変性などを防止するため、その収容部の表面が密封処理されている。
Microfluidic chip The microfluidic chip of the present invention is designed such that each flow path element or structure is finely located at a functionally appropriate position so as to be used for chemical analysis, various inspections, sample processing / separation, chemical synthesis, etc. It is arranged by processing technology. The chip is provided with a plurality of reagent storage units for storing each reagent in addition to a sample storage unit for storing a sample liquid as a fluid storage unit, and the reagent storage unit includes reagents used for a predetermined reaction, A cleaning solution, a denaturing treatment solution and the like are accommodated. This is because it is desirable that the reagent is stored in advance so that the examination can be performed quickly regardless of the place or time. Reagents built in the chip are sealed on the surface of the storage portion in order to prevent evaporation, leakage, mixing of bubbles, contamination, denaturation, and the like.
上記のチップにおける好ましい態様は、溝形成基板および被覆基板からなる基本的基板を構造として有する。少なくとも溝形成基板には、ポンプ接続部、弁基部および液溜部（試薬収容部、検体収容部などの各収容部、廃液貯留部）、送液制御部、逆流防止部、試薬定量部、混合部などの構造部を含む、微細流路が形成されている。被覆基板は、少なくとも溝形成基板における上記の構造部、流路および検出部を密着して覆う必要があり、溝形成基板の全面を覆っていてもよい。 The preferable aspect in said chip | tip has as a structure the basic substrate which consists of a groove | channel formation board | substrate and a coating substrate. At least on the groove forming substrate, the pump connection part, the valve base part and the liquid reservoir part (reagent storage part, each storage part such as the specimen storage part, waste liquid storage part), liquid feed control part, backflow prevention part, reagent quantification part, mixing A fine channel including a structural part such as a part is formed. The coated substrate needs to cover at least the structure portion, the flow path, and the detection portion of the groove forming substrate, and may cover the entire surface of the groove forming substrate.
・素材
マイクロ流体チップは、加工成形性、非吸水性、耐薬品性、耐熱性、廉価性などに優れていることが望まれており、チップの構造、用途、検出方法などを考慮して、チップの材料を適切に選択することが求められる。その材料としては従来公知の様々なものが使用可能であり、個々の材料特性に応じて通常は１以上の材料を適宜組み合わせて、基板および流路エレメントが成形される。
・ Material The microfluidic chip is required to have excellent processability, non-water absorption, chemical resistance, heat resistance, and low cost. Considering the chip structure, application, detection method, etc. Appropriate selection of the chip material is required. Various known materials can be used as the material, and usually the substrate and the flow path element are formed by appropriately combining one or more materials in accordance with individual material characteristics.
例えば、多数の測定検体、とりわけ汚染、感染のリスクのある臨床検体を対象とするチップはディスポーサブルタイプであることが望ましい。そのため、量産可能であり、軽量で衝撃に強く、焼却廃棄が容易なプラスチック樹脂、なかでも、透明性、機械的特性および成型性に優れて微細加工がしやすいポリスチレンが好ましく用いられる。 For example, it is desirable that a chip intended for a large number of measurement specimens, particularly clinical specimens at risk of contamination and infection, be of a disposable type. Therefore, a plastic resin that can be mass-produced, is light in weight, is strong against impact, and can be easily disposed of by incineration. Among them, polystyrene that is excellent in transparency, mechanical properties, and moldability and is easy to be finely processed is preferably used.
分析においてチップを１００℃近くまで加熱する必要がある場合には、耐熱性に優れる樹脂（例えばポリカーボネートなど）を用いることが好ましい。樹脂やガラスなどは熱伝導率が小さく、マイクロ流体チップの局所的に加熱される領域にこれらの材料を用いることにより、面方向への熱伝導が抑制され、加熱領域のみ選択的に加熱することができる。 When it is necessary to heat the chip to near 100 ° C. in analysis, it is preferable to use a resin having excellent heat resistance (for example, polycarbonate). Resin and glass have low thermal conductivity, and by using these materials in the locally heated region of the microfluidic chip, heat conduction in the surface direction is suppressed, and only the heated region is selectively heated. Can do.
また、微細流路の検出部では、蛍光物質または呈色反応の生成物などの光学的な検出が行われるため、この部位の基板には光透過性の材料を用いる必要がある。このような材料としては、アルカリガラス、石英ガラス、透明プラスチック類が使用可能である。 Further, since the detection part of the fine channel optically detects the fluorescent substance or the product of the color reaction, it is necessary to use a light transmissive material for the substrate at this part. As such a material, alkali glass, quartz glass, and transparent plastics can be used.
・微細流路
マイクロ流体チップの微細流路は、基板上に目的に応じて予め設計された流路配置に従って形成される。流体が流れる流路は、例えば幅数十〜数百μｍ、好ましくは５０〜１００μｍ、深さ２５〜２００μｍ程度、好ましくは５０〜１００μｍに形成されるマイクロメーターオーダー幅の微細流路である。流路幅が５０μｍ未満であると、流路抵抗が増大し、流体の送出および検出上不都合である。幅５００μｍを超える流路ではマイクロスケール空間の利点が薄まる。
Microchannel The microchannel of the microfluidic chip is formed on the substrate according to a channel arrangement designed in advance according to the purpose. The flow path through which the fluid flows is, for example, a micro flow path with a micrometer order width formed to have a width of several tens to several hundreds μm, preferably 50 to 100 μm, and a depth of about 25 to 200 μm, preferably 50 to 100 μm. If the channel width is less than 50 μm, the channel resistance increases, which is inconvenient for fluid delivery and detection. The advantage of the microscale space is diminished in the flow path exceeding 500 μm in width.
微細流路の形成方法は、従来の微細加工技術を用いることができるが、典型的にはフォトリソグラフィ技術が好適である。この技術により、感光性樹脂への微細構造の転写および不要部分の除去などが行われ、微細流路が形成される。この際の溝成形基板の材料となる感光性樹脂としては、サブミクロンの構造も正確に転写でき、機械的特性の良好なプラスチックが好ましく用いられる。ポリスチレン、ポリジメチルシロキサンなどは形状転写性に優れる。また、必要であれば射出成形、押し出し成形などによる加工も使用してもよい。 A conventional microfabrication technique can be used as a method for forming the microchannel, but a photolithography technique is typically preferable. With this technique, the fine structure is transferred to the photosensitive resin, unnecessary portions are removed, and the fine flow path is formed. As the photosensitive resin used as the material of the groove-formed substrate at this time, a plastic having a good mechanical property and capable of accurately transferring a submicron structure is preferably used. Polystyrene, polydimethylsiloxane, etc. are excellent in shape transferability. If necessary, processing by injection molding, extrusion molding or the like may be used.
・温度領域
本発明のマイクロ流体チップは、別途の加熱装置と当接する「加熱領域」、別途の冷却装置と当接する「冷却領域」、ならびに加熱装置および冷却装置とは当接しない「常温領域」からなる群より選ばれる２種類以上の温度領域が併存する。
-Temperature region The microfluidic chip of the present invention has a "heating region" that contacts a separate heating device, a "cooling region" that contacts a separate cooling device, and a "normal temperature region" that does not contact the heating device and the cooling device. Two or more temperature regions selected from the group consisting of coexist.
加熱領域と冷却領域とを同一チップ上に併設する形態は、生体物質分析用のチップでは珍しくない態様である。検体および試薬は、加熱されると変質しやすいものが多く、一般的には冷却して低温に保つことが望ましく、一方で、検出および反応には高温が必要とされるためである。 The form in which the heating area and the cooling area are provided on the same chip is not a rare aspect in a biological material analysis chip. This is because specimens and reagents are often easily denatured when heated, and in general, it is desirable to cool them and keep them at a low temperature, while high temperatures are required for detection and reaction.
部位選択的に加熱される加熱領域に含まる微細流路の例としては、例えば、ＰＣＲ法によるＤＮＡと試薬との遺伝子増幅反応を行うための反応部位を構成する流路を挙げることができる。また、部位選択的に冷却される冷却領域に含まれる微細流路の例としては、検体収容部、試薬（例えば遺伝子増幅反応用の試薬）収容部および／または複数の試薬を合流させて混合する流路を挙げることができる。 As an example of the fine channel included in the heating region that is selectively heated by a site, for example, a channel that constitutes a reaction site for performing a gene amplification reaction between DNA and a reagent by a PCR method can be mentioned. In addition, as an example of a micro flow path included in a cooling region that is selectively cooled by a site, a specimen storage unit, a reagent (for example, a gene amplification reagent) storage unit, and / or a plurality of reagents are joined and mixed. A flow path can be mentioned.
加熱／冷却装置
本発明では、一連の微細流路が形成されたマイクロ流体チップにおいて、部位選択的に加熱すべき流路部位を含む加熱領域のチップ面に、発熱体もしくは発熱体に接続された熱伝導部材等の加熱装置を当接させて、その加熱領域を加熱する。また、部位選択的に冷却すべき流路部位を含む冷却領域のチップ面に、冷却体もしくは冷却体に接続された熱伝導部材等の冷却装置を当接させて、その冷却領域を冷却させる。このような加熱領域および冷却領域は、マイクロ流体チップの温度調節領域として、本システムの温度管理下に置かれる。なお、加熱装置または冷却装置は、領域の均一な温度分布や、迅速な昇温または降温のために必要であれば、チップの片面だけでなく両面に配置してもよい。
Heating / cooling device In the present invention, in a microfluidic chip formed with a series of fine flow paths, a heating element or a heating element is connected to a chip surface of a heating region including a flow path part to be selectively heated. A heating device such as a heat conducting member is brought into contact to heat the heating region. Further, a cooling device such as a cooling body or a heat conduction member connected to the cooling body is brought into contact with the chip surface of the cooling area including the flow path portion to be selectively cooled, thereby cooling the cooling area. Such a heating region and a cooling region are placed under temperature control of the present system as a temperature control region of the microfluidic chip. Note that the heating device or the cooling device may be arranged not only on one side of the chip but also on both sides if necessary for uniform temperature distribution in the region and rapid temperature rise or fall.
上記の加熱装置としては、例えば、通電により抵抗体を発熱させ、直接あるいは誘電体等を介して熱を伝達する面状発熱体（ヒーター）、該面状発熱体に熱伝導率の高い部材（例えばアルミニウム等の金属部材）を接続して、この部材面をチップ面に当接させるようにしたもの、ならびにペルチェ素子を挙げることができる。 As the above heating device, for example, a sheet heating element (heater) that heats a resistor by energization and transfers heat directly or via a dielectric or the like, a member with high thermal conductivity ( For example, a metal member (such as aluminum) is connected and the surface of the member is brought into contact with the chip surface, and a Peltier element.
また、加熱装置には温度センサが設けられ、この温度センサは、加熱動作に関する制御プログラムが格納されたメモリを有するコントローラに接続されることが望ましい。コントローラは、温度センサにより計測された温度に基づき、当該プログラムに従って加熱装置への通電等を制御する。このような実施形態の構成は、迅速な昇温、具体的には４０℃程度から９０℃程度まで急速に昇温させることが求められ、しかも頻繁に温度の昇降を繰り返す必要があるＰＣＲ法を行う場合に好ましく用いられる。 Further, the heating device is provided with a temperature sensor, and this temperature sensor is preferably connected to a controller having a memory in which a control program relating to the heating operation is stored. The controller controls energization and the like to the heating device according to the program based on the temperature measured by the temperature sensor. The configuration of such an embodiment requires a PCR method that requires a rapid temperature increase, specifically, a rapid increase in temperature from about 40 ° C. to about 90 ° C., and the need to frequently increase and decrease the temperature. It is preferably used when performing.
一方、冷却装置としてはペルチェ素子が好ましい。ペルチェ素子には、その熱を放熱するためにヒートシンクを接触配置させてもよい。また、熱伝導率の高い部材（例えばアルミニウム等の金属部材）からなるブロックを併用してもよい。冷却装置についても、加熱装置と同様に、温度管理のための制御装置が接続されていることが望ましい。 On the other hand, a Peltier element is preferable as the cooling device. A heat sink may be disposed in contact with the Peltier element in order to dissipate the heat. Moreover, you may use together the block which consists of members (for example, metal members, such as aluminum) with high heat conductivity. As for the cooling device, similarly to the heating device, it is desirable to connect a control device for temperature management.
上述のような装置を用いることにより、マイクロ流体チップに形成された一連の微細流路における複数の機能部位のそれぞれにおいて、部位選択的に均一な加熱もしくは冷却を行うことができる。 By using the apparatus as described above, uniform heating or cooling can be performed selectively in each of a plurality of functional parts in a series of fine channels formed in the microfluidic chip.
・温度分布管理の必要性
異なる温度分布が求められる領域が隣接し、これらの領域間で熱の伝導が起きた場合、いくつかの問題が発生することが考えられる。
・ Necessity of temperature distribution management When areas where different temperature distributions are required are adjacent to each other and heat conduction occurs between these areas, several problems may occur.
ＰＣＲ法を含むバイオアッセイおよび合成反応では、温度条件を厳密にしないと反応の成否に影響したり、反応の制御に支障が生じることも往々にしてある。例えばＰＣＲでは、温度条件のみならずその加熱時間を厳密に管理することが求められる。反応部流路に中間温度領域が存在すると、副反応として非特異的な増幅が生じ、これにより標的配列の増幅が阻害されてしまう。このため目的の増幅反応が充分に起こらない可能性もある。したがって、遺伝子増幅などが行なわれる反応部流路を含む領域（例えば加熱領域）と、それに隣接する領域との温度差は、画然としていることが望ましい。 In bioassays and synthesis reactions including the PCR method, unless the temperature conditions are strict, the success or failure of the reaction is often affected, or the control of the reaction is hindered. For example, in PCR, it is required to strictly manage not only the temperature conditions but also the heating time. If an intermediate temperature region is present in the reaction part flow path, non-specific amplification occurs as a side reaction, which inhibits amplification of the target sequence. For this reason, the target amplification reaction may not occur sufficiently. Therefore, it is desirable that the temperature difference between a region (for example, a heating region) including a reaction portion flow path where gene amplification or the like is performed and a region adjacent to the region are distinct.
このことは流路から試薬、検体およびそれらの混合液体が失われることを防止する観点からも利点がある。微細流路の液体が蒸発などにより失われる原因は、チップのシステム装置本体との密着面に閉じ込められた空気が膨張し、気泡となって流路内の流路圧力を上げ、それにより液体が押し出されることや、さらに空気が抜ける際に密着面にできる隙間に試薬などが入りこんでそこから試薬などが漏れることにあると想定されている。また、加熱領域内もしくはその近傍の液体内部から上記の気泡が形成することも、流路内の液体の喪失とそうした気泡によるトラブルの発生に関わっている。 This also has an advantage from the viewpoint of preventing the reagent, the specimen, and the mixed liquid thereof from being lost from the flow path. The reason why the liquid in the fine channel is lost due to evaporation, etc. is that the air trapped in the contact surface of the chip with the system device body expands and becomes bubbles, increasing the channel pressure in the channel and thereby the liquid It is assumed that the reagent or the like enters the gap formed on the contact surface when the air is further removed and the reagent or the like leaks from there. In addition, the formation of the bubbles in the heating region or in the vicinity of the liquid is also related to the loss of the liquid in the flow path and the occurrence of trouble due to the bubbles.
断熱手段
上記のことから、マイクロ流体チップにおける異なる温度領域同士、とりわけ加熱領域と冷却領域とは、熱伝導を充分に遮断しておく必要がある。本発明のマイクロ流体チップにおいては、これらの領域の境界に断熱手段を施すことにより、両者間に温度勾配および熱伝導が生じることがないよう充分に断熱することが可能であり、前述のような問題は効果的に抑制される。また、マイクロ流体チップが例えば厚さ２ｍｍのポリプロピレン樹脂製であった場合、従来は加熱領域と冷却領域とは５〜１０ｍｍ程度離す必要があったが、本発明の断熱手段を施したマイクロ流体チップにおいては、これらの領域の距離を大幅に近づけ、マイクロ流体チップを小型化することが可能となる。
Insulating means From the above, it is necessary to sufficiently block heat conduction between different temperature regions in the microfluidic chip, especially between the heating region and the cooling region. In the microfluidic chip of the present invention, it is possible to insulate sufficiently so that a temperature gradient and heat conduction do not occur between them by applying a heat insulating means to the boundary between these regions. The problem is effectively suppressed. When the microfluidic chip is made of, for example, a polypropylene resin having a thickness of 2 mm, the heating area and the cooling area have conventionally been required to be separated from each other by about 5 to 10 mm. In this case, the microfluidic chip can be miniaturized by greatly reducing the distance between these regions.
本発明において上記の「境界」とは、異なる温度領域の中間に位置する部分を指す。例えば、冷却領域と加熱領域が隣接している場合、それぞれの領域を取り囲む外周線の近傍を境界と考えることができる。また、冷却領域と加熱領域の間に常温領域が存在する場合
、その常温領域を、冷却領域と加熱領域の境界と考えることができ、常温領域の適当な場所に断熱手段を設けることが可能である。
In the present invention, the above “boundary” refers to a portion located in the middle of different temperature regions. For example, when the cooling region and the heating region are adjacent to each other, the vicinity of the outer peripheral line surrounding each region can be considered as the boundary. In addition, when a normal temperature region exists between the cooling region and the heating region, the normal temperature region can be considered as a boundary between the cooling region and the heating region, and heat insulation means can be provided at an appropriate place in the normal temperature region. is there.
本発明のマイクロ流体チップにおける、領域間を隔てる断熱手段の具体的な態様は特に限定されないが、例えば以下に示す手段を好適に用いることができる。
・空隙
本発明により提供される断熱手段の一つの態様として、異なる温度領域の境界にマイクロ流体チップを貫通する空隙を設けることが挙げられる。「空隙」とは、スリット、切れ込みなどのように、空気が内部に介在している空間をいう。空隙の大きさや形状は、微細流路の配置、チップ基板の材料の熱伝導性などを考慮し、適宜調整することが可能である。また、空隙の設置する場所、数などについても同様である。
In the microfluidic chip of the present invention, the specific mode of the heat insulating means for separating the regions is not particularly limited, but for example, the following means can be preferably used.
-Air gap As one aspect of the heat insulating means provided by the present invention, it is possible to provide a space that penetrates the microfluidic chip at the boundary between different temperature regions. “Void” refers to a space in which air is interposed, such as a slit or slit. The size and shape of the gap can be appropriately adjusted in consideration of the arrangement of the fine flow path, the thermal conductivity of the material of the chip substrate, and the like. The same applies to the location and number of gaps.
このような空隙は、例えば、それぞれの対応する部分に空隙が形成されるように設計された溝成形基板および被覆基板を射出成型により製造し、２枚の基板を重ね合わせてチップとすることにより作り出すことができる。また、空隙を設けていないチップを製造した後に、それを貫通する空隙を常法により作り出すようにしてもよく、その作成方法は問わない。 Such gaps are produced, for example, by manufacturing a groove-formed substrate and a coated substrate designed so that a gap is formed in each corresponding part by injection molding, and stacking the two substrates into a chip. Can be produced. Moreover, after manufacturing the chip | tip which does not provide the space | gap, you may make it create the space | gap which penetrates it by a conventional method, The production method is not ask | required.
・溝
本発明により提供される断熱手段の別の態様として、異なる温度領域の境界に溝を設けることが挙げられる。この溝は、チップに形成された微細流路とは連通しておらず、微細流路とは区別されるものである。溝の幅、深さ、形状、設置場所、数などについても、微細流路の配置、チップ基板の材料の熱伝導性などを考慮し、適宜調整することができる。
-Groove | channel As another aspect of the heat insulation means provided by this invention, providing a groove | channel in the boundary of a different temperature range is mentioned. This groove does not communicate with the fine flow path formed in the chip, and is distinguished from the fine flow path. The width, depth, shape, installation location, number, and the like of the grooves can also be adjusted as appropriate in consideration of the arrangement of the fine channels, the thermal conductivity of the chip substrate material, and the like.
このような溝は、例えば、２枚の基板を重ね合わせたチップの表面の一部を常法により削るようにして形成することが可能であり、その作成方法は問わない。
上述したような、本発明のマイクロ総合分析システムにおけるマイクロ流体チップの、加熱領域、冷却領域およびその境界にある断熱手段について、図２〜図４を参照しながら、その好ましい実施形態を説明する。
Such a groove can be formed by, for example, scraping a part of the surface of a chip on which two substrates are overlapped by a conventional method, and the method for producing the groove is not limited.
A preferred embodiment of the heat insulating means in the heating region, the cooling region, and the boundary of the microfluidic chip in the micro total analysis system of the present invention as described above will be described with reference to FIGS.
図２は、加熱領域32、冷却領域35を有し、その境界に断熱手段37が施された、マイクロ流体チップ2の一実施形態を示した上面図である。加熱領域32には、例えばＰＣＲ法によ
る遺伝子増幅反応を行うための、反応部が存在する。冷却領域35には、例えば上記の遺伝子増幅反応に供するための、検体収容部および試薬収容部が存在する。また、加熱領域と冷却領域の境界の断熱手段は、前述のような、チップを貫通する空隙またはチップ表面に形成された溝などである。なお、装置本体に設けられている加熱装置および冷却装置は図示されていないが、それぞれ加熱領域および冷却領域の上面よりマイクロ流体チップに当接する。
FIG. 2 is a top view showing an embodiment of the
図３および図４は、マイクロ流体チップの反応部、検体収容部および試薬収容部、チップ面に当接する加熱部材および冷却部材、ならび前述の断熱手段を含む断面の模式図である。 FIG. 3 and FIG. 4 are schematic views of cross sections including a reaction portion, a sample storage portion and a reagent storage portion of the microfluidic chip, a heating member and a cooling member in contact with the chip surface, and the above-described heat insulating means.
図３において、反応部流路31（例えばＰＣＲ法による遺伝子増幅反応を行う部位）を含む加熱領域32におけるチップ面に、前述のような加熱装置33を当接させ、局所的な加熱を行っている。また、試薬類が混合される試薬混合流路34を含む冷却領域35に、前述のような冷却装置36を押し付けて所定温度に冷却している。加熱領域32および冷却領域35の境界には、チップを貫通する空隙が設けられており、これにより、加熱領域32と冷却領域35との間の熱伝導が効率的に遮断される。
In FIG. 3, the
また、図４では、加熱領域32および冷却領域35の境界に、チップ表面に形成された溝が存在しており、このような態様も熱伝導の抑制に効果的である。
マイクロポンプユニット
本発明のシステム装置本体は、ベース本体とともに、そのベース本体内に配置され、マイクロ流体チップに連通させるための流路開口を有するチップ接続部と、複数のマイクロポンプとを含むマイクロポンプユニットを構成単位として有している。マイクロポンプは、例えば複数のマイクロポンプがフォトリソグラフィー技術などにより形成されたチップ状のポンプユニットとして、システム装置本体に組み込まれていてもよい。
Further, in FIG. 4, a groove formed on the chip surface exists at the boundary between the
Micro-pump unit A system apparatus main body of the present invention includes a base body, a micro-pump including a chip connecting portion disposed in the base main body and having a channel opening for communicating with the microfluidic chip, and a plurality of micro-pumps. It has a unit as a structural unit. The micropump may be incorporated in the system apparatus main body as a chip-like pump unit in which a plurality of micropumps are formed by photolithography technology or the like, for example.
マイクロポンプとしては、アクチュエータを設けた弁室の流出入孔に逆止弁を設けた逆止弁型のポンプなど各種のものが使用できるが、ピエゾポンプを用いることが好適である。このピエゾポンプは、概略すると、流路抵抗が差圧に応じて変化する第１流路と、差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第１流路よりも小さい第２流路と、第１流路および第２流路に接続された加圧室と、該加圧室の内部圧力を変化させるアクチュエータと、該アクチュエータを駆動する駆動装置とを備えており、ポンプの駆動電圧波形、電圧値、および周波数を変えることによって、液体の送液方向、送液速度を制御できるようになっている。このようなマイクロポンプおよびそれを用いたシステムを本発明者らはすでに提案しており、その詳細は特開2001-322099号公報、特開2004-108285号公報、特開2004-270537号公報などを参照することができる。 As the micro pump, various types such as a check valve type pump in which a check valve is provided in an inflow / outflow hole of a valve chamber provided with an actuator can be used, but a piezo pump is preferably used. In general, the piezo pump includes a first flow path in which the flow path resistance changes in accordance with the differential pressure, a second flow path in which the change rate of the flow path resistance with respect to the change in the differential pressure is smaller than the first flow path, A pressurizing chamber connected to the first flow path and the second flow path, an actuator for changing the internal pressure of the pressurizing chamber, and a driving device for driving the actuator, By changing the voltage value and the frequency, the liquid feeding direction and the liquid feeding speed can be controlled. The present inventors have already proposed such a micropump and a system using the micropump, and details thereof are disclosed in JP 2001-322099 A, JP 2004-108285 A, JP 2004-270537 A, and the like. Can be referred to.
図６（ａ）は、ピエゾポンプの一例を示した断面図、図６（ｂ）は、その上面図である。このマイクロポンプには、第１液室48、第１流路46、加圧室45、第２流路47、および第２液室49が形成された基板42と、基板42上に積層された上側基板41と、上側基板41上に積層された振動板43と、振動板43の加圧室45と対向する側に積層された圧電素子44と、圧電素子44を駆動するための駆動部（図示せず）とが設けられている。この駆動部と、圧電素子44表面上の２つの電極とは、フレキシブルケーブルなどによる配線で接続されており、かかる接続を通じて当該駆動部の駆動回路によって圧電素子44に特定波形の電圧を印加する構成となっている。図６の（ａ）（ｂ）には図示されていないが、第１液室48には、駆動液タンク10につながるポート72が設けられており、その第１液室は、「リザーバ」の役割を演じ、ポート72で駆動液タンク10から駆動液の供給を受けている。第２液室49はマイクロポンプユニットの流路を形成し、その流路の先にチップ接続部のポート73があり、マイクロ流体チップの「ポンプ接続部」12とつながる。
FIG. 6A is a cross-sectional view showing an example of a piezo pump, and FIG. 6B is a top view thereof. In this micropump, a
図６（ｃ）に、このポンプの他の例を示した。この例では、ポンプをシリコン基板71、圧電素子44、および図示しないフレキシブル配線から構成している。加圧室45、ダイヤフラム43、第１流路46、第１液室48、第２流路47、および第２液室49が形成されている。第１液室48にはポート72が、第２液室49にはチップ接続部のポート73がそれぞれ設けられており、例えばこのピエゾポンプを図１のチップ２とは別体とする場合には、このポート73を介してマイクロ流体チップ２のポンプ接続部12と連通する。例えば、ポート72、73が穿孔された基板74と、マイクロ流体チップのポンプ接続部近傍とを上下に重ね合わせることによって、ポンプをマイクロ流体チップ２に接続することができる。また、前述したように、１枚のシリコン基板に複数のポンプを形成することも可能である。この場合、チップ２と接続したポートの反対側のポートには、駆動液タンク10が接続されていることが望ましい。ポンプが複数個ある場合、それらのポートは共通の駆動液タンクに接続されてもよい。
FIG. 6C shows another example of this pump. In this example, the pump is composed of a
上記のマイクロポンプと、図１に示した本発明のマイクロ総合分析システムとの関係を説明する。図１の例では、マイクロポンプ11は、マイクロ流体チップ2とは別の装置とし
てシステム装置本体1に属し、駆動液タンク10と連通している。マイクロポンプ11は、マ
イクロ流体チップ2とは、両者が互いに所定の形態で接合したときに、マイクロポンプユ
ニットにあるチップ接続部のポート73と、マイクロ流体チップにあってマイクロポンプに連通させるための流路開口を有するポンプ接続部12とが連結してマイクロ流体チップの流路と連通するようになる。
The relationship between the micro pump and the micro total analysis system of the present invention shown in FIG. 1 will be described. In the example of FIG. 1, the
なお、別の態様として、マイクロポンプそのものもマイクロ流体チップ上に組み込むことも可能である。特にチップ上の流路が比較的単純であり、繰り返し使用を前提とするような目的または用途、例えば化学合成反応用のチップとする場合にはこの形態を採り得る。 As another aspect, the micropump itself can also be incorporated on the microfluidic chip. In particular, this mode can be adopted in the case where the flow path on the chip is relatively simple and the chip is used for a purpose or application that assumes repetitive use, for example, a chip for chemical synthesis reaction.
分析の実施態様
本発明のマイクロ分析システムは、特に遺伝子または核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の検査に好適に用いることができる。その場合、マイクロ流体チップの微細流路は、ＰＣＲ法またはＩＣＡＮ（Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification）法による遺伝子増幅に適した構成とされるが、遺伝子検査以外の生体物質についても基本的な流路構成はほぼ同一になるといえる。通常は検体前処理部、試薬類、プローブ類を変更すればよく、その場合、送液エレメントの配置、数などは変化するであろう。当業者であれば、例えばイムノアッセイ法のために必要な試薬類などをマイクロ流体チップに搭載し、若干の流路エレメントの変更、仕様の変更を含む修正を施すことにより、分析の種類を容易に変更することができる。ここにいう遺伝子以外の生体物質とは、各種の代謝物質、ホルモン、タンパク質（酵素、抗原なども含む）などをいう。
Analysis Embodiment The micro-analysis system of the present invention can be suitably used particularly for examination of genes or nucleic acids (DNA, RNA). In that case, the microchannel of the microfluidic chip is configured to be suitable for gene amplification by the PCR method or ICAN (Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification) method. It can be said that the road configuration is almost the same. Usually, the specimen pretreatment unit, reagents, and probes may be changed. In this case, the arrangement and number of liquid feeding elements will change. A person skilled in the art can easily change the type of analysis by mounting the reagents necessary for immunoassay, for example, on the microfluidic chip and making modifications including slight changes to the flow path elements and specifications. Can be changed. Biological substances other than genes mentioned here refer to various metabolites, hormones, proteins (including enzymes and antigens), and the like.
本発明のマイクロ流体チップの好ましい一態様では、一つのチップ内において、
検体もしくは検体から抽出したアナライト（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子）が注入される検体収容部と、
検体の前処理を行う検体前処理部と、
プローブ結合反応、検出反応（遺伝子増幅反応または抗原抗体反応なども含む）などに用いる試薬が収容される試薬収容部と、
ポジティブコントロールが収容されるポジティブコントロール収容部と、
ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、
プローブ（例えば、遺伝子増幅反応により増幅された検出対象の遺伝子にハイブリダイズさせるプローブ）が収容されるプローブ収容部と、
これらの各収容部に連通する微細流路と、
前記各収容部および流路内の液体を送液する別途のマイクロポンプに接続可能なポンプ接続部と、が設けられている。
In a preferred embodiment of the microfluidic chip of the present invention, in one chip,
A specimen storage part into which a specimen or an analyte extracted from the specimen (for example, DNA, RNA, gene) is injected;
A sample pretreatment unit for preprocessing the sample;
A reagent container for storing reagents used for probe binding reaction, detection reaction (including gene amplification reaction or antigen-antibody reaction);
A positive control accommodating part for accommodating a positive control;
A negative control accommodating portion for accommodating a negative control;
A probe accommodating portion that accommodates a probe (for example, a probe that hybridizes to a gene to be detected amplified by a gene amplification reaction);
A fine flow path communicating with each of these accommodating portions,
A pump connection portion that can be connected to each of the accommodating portions and a separate micropump for feeding the liquid in the flow path is provided.
図５は、このようなマイクロ流体チップにおける微細流路の構成の一実施態様を示す。マイクロ流体チップのポンプ接続部12を介して接続されたマイクロポンプ11は、検体収容部20に収容された検体もしくは検体から抽出した生体物質（例えばＤＮＡまたはそれ以外の生体物質）と、試薬収容部18に収容された試薬とを流路15へ送液する。これらを微細流路の反応部位、例えば遺伝子増幅反応（タンパク質の場合、抗原抗体反応など）の部位で混合して反応させた後、その下流側流路にある検出部22aへ、この反応液を処理した処理
液と、プローブ収容部21dに収容されたプローブとを送液し、流路内で混合してプローブ
と結合（またはハイブリダイゼーション）させ、この反応生成物に基づいて生体物質の検出を行う。また、ポジティブコントロール収容部21hに収容されたポジティブコントロー
ルおよびネガティブコントロール収容部21iに収容されたネガティブコントロールについ
ても、上記と同様にして反応および検出を行う。
FIG. 5 shows one embodiment of the configuration of the fine channel in such a microfluidic chip. The
・検体
マイクロ流体チップの検体収容部は、検体注入部に連通し、検体の一時収容および混合部への検体供給を行う。検体の注入は、例えば検体収容部の上面に設けられた検体注入部
から行う。この検体注入部は、ゴム状材質などの弾性体からなる栓が形成されているか、あるいはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの樹脂、強化フィルムで覆われていることが望ましい。例えば、当該ゴム材質の栓を突き刺したニードルまたは蓋付き細孔を通したニードルでシリンジ内の検体を注入する。
-Sample The sample storage unit of the microfluidic chip communicates with the sample injection unit, and temporarily stores the sample and supplies the sample to the mixing unit. The sample is injected from a sample injection unit provided on the upper surface of the sample storage unit, for example. The specimen injection part is preferably formed with a stopper made of an elastic material such as a rubber-like material, or covered with a resin such as polydimethylsiloxane (PDMS) or a reinforced film. For example, a specimen in a syringe is injected with a needle that has been pierced with a stopper made of the rubber material or a needle that has passed through a pore with a lid.
遺伝子検査において対象となる検体は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含有する試料であり、例えば、全血、血漿、血清、バフィーコート、尿、糞便、唾液、喀痰などの生体由来の試料、ウィルス、細菌、カビ、酵母、動植物の細胞などが挙げられる。また、これらの試料から従来技術により単離したＤＮＡまたはＲＮＡを用いてもよい。 A specimen to be a target for genetic testing is a sample containing DNA or RNA. For example, whole blood, plasma, serum, buffy coat, urine, stool, saliva, sputum, biological samples, viruses, bacteria, mold, etc. , Yeast, animal and plant cells, and the like. Alternatively, DNA or RNA isolated from these samples by conventional techniques may be used.
必要とされる検体の量は、従来の装置を使用して行う手作業の場合に比べて極めて少なくてすむ。例えば、縦横の長さが数ｃｍのチップに対しては、２〜３μＬ程度の血液検体を注入するだけでよい。ＤＮＡとしては、０．００１〜１００ｎｇである。 The amount of specimen required is very small compared to the manual work performed using conventional devices. For example, for a chip having a length and width of several centimeters, it is only necessary to inject a blood sample of about 2 to 3 μL. As DNA, it is 0.001-100 ng.
また、検体収容部に注入された検体については、必要に応じて、試薬との混合前に、予め流路に設けられた検体前処理部にて、前処理を行ってもよい。好ましい検体前処理として、アナライトの分離または濃縮、除タンパクなどが含まれる。例えば、１％ＳＤＳ混合液などの溶菌剤を用いて溶菌を行い、放出されたＤＮＡをビーズ、吸着用樹脂またはフィルターの膜面に吸着させる、ＤＮＡ抽出処理が挙げられる。 In addition, the sample injected into the sample storage unit may be pre-processed in a sample pre-processing unit provided in advance in the channel before mixing with the reagent, if necessary. Preferred sample pretreatments include analyte separation or concentration, deproteinization, and the like. For example, there may be mentioned DNA extraction treatment in which lysis is performed using a lysis agent such as a 1% SDS mixed solution, and the released DNA is adsorbed on the membrane surface of beads, an adsorption resin or a filter.
・試薬
マイクロ流体チップの試薬収容部には、目的とする反応方法や検出方法に応じた必要な試薬類が予め所定の量だけ封入されている。したがって使用時にその都度、試薬を必要量充填する必要はなく、即使用可能の状態になっている。検体中の生体物質を分析する場合に必要な試薬類は、従来と同じものである。例えば、検体に存在する抗原を分析する場合、それに対する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を含有する試薬が使用される。抗体は、好ましくはビオチンおよびＦＩＴＣで標識されている。遺伝子検査用の試薬類としては、遺伝子増幅に用いられる各種試薬、検出に使用されるプローブ類、発色試薬などが挙げられ、必要であれば、前記の検体前処理に使用する前処理試薬も含まれる。
-Reagents Reagents contained in the microfluidic chip are filled with a predetermined amount of necessary reagents according to the intended reaction method and detection method in advance. Therefore, it is not necessary to fill a necessary amount of the reagent each time it is used, and it is ready for use. Reagents necessary for analyzing a biological material in a specimen are the same as in the past. For example, when analyzing an antigen present in a specimen, a reagent containing an antibody (preferably a monoclonal antibody) against the antigen is used. The antibody is preferably labeled with biotin and FITC. Examples of reagents for genetic testing include various reagents used for gene amplification, probes used for detection, coloring reagents and the like, and if necessary, pretreatment reagents used for the sample pretreatment are also included. It is.
・混合
マイクロポンプから駆動液を供給することにより各収容部から検体液および試薬液を押し出してこれらを合流させることによって、遺伝子増幅反応、アナライトのトラップまたは抗原抗体反応といった分析に必要な反応が開始される。
・ Mixing By supplying the driving liquid from the micropump, the specimen liquid and the reagent liquid are pushed out from each container and joined together, so that reactions such as gene amplification reaction, analyte trap or antigen-antibody reaction can be performed. Be started.
試薬と試薬との混合、および検体と試薬との混合は、単一の混合部で所望の比率で混合してもよく、あるいは何れかもしくは両方を分割して複数の合流部を設け、最終的に所望の混合比率となるように混合してもよい。 The mixing of the reagent and the reagent and the mixing of the sample and the reagent may be performed at a desired ratio in a single mixing part, or a plurality of merging parts are provided by dividing one or both, and finally You may mix so that it may become a desired mixing ratio.
そうした反応部位の態様は特に限定されるものではなく、様々な形態および様式が考えられる。一例としては、試薬を含む２以上の液体を合流させる合流部（流路分岐点）から先に、各液が拡散混合される微細流路が設けられ、この微細流路の下流側端部から先に設けられた、該微細流路よりも広幅の空間からなる液溜めにおいて反応が行われる。 The mode of such a reactive site is not particularly limited, and various forms and modes are conceivable. As an example, a micro flow channel in which each liquid is diffused and mixed is provided in advance of a joining portion (flow channel branching point) that joins two or more liquids containing reagents, and from the downstream end of the micro flow channel. The reaction is carried out in a liquid reservoir provided in advance and having a space wider than the fine channel.
・反応
ＤＮＡ増幅方法としては、改良点も含めて各種文献などに記載され、多方面で盛んに利用されているＰＣＲ法を使用することができる。ＰＣＲ法においては、３つの温度間で昇降させる温度管理が必要になるが、適切な装置を使用してマイクロ流体チップの温度制御を行えばよい。マイクロ流体チップにおいては、微細流路において熱サイクルを高速に切り替えることが可能であり、ＤＮＡの増幅を手作業で行うよりもはるかに短時間で行うこ
とができる。また、近年開発されたＩＣＡＮ法（タカラバイオ（株）、登録商標）は、５０〜６５℃における任意の一定温度の下にＤＮＡ増幅を短時間で実施できるため（特許第３４３３９２９号）、本発明システムにおいても好適な増幅技術である。
-Reaction As a DNA amplification method, the PCR method described in various literatures including an improvement point and utilized actively in many fields can be used. In the PCR method, it is necessary to manage the temperature by raising and lowering between three temperatures. However, the temperature of the microfluidic chip may be controlled using an appropriate device. In the microfluidic chip, the heat cycle can be switched at high speed in the fine flow path, and DNA amplification can be performed in a much shorter time than manually. In addition, the recently developed ICAN method (Takara Bio Inc., registered trademark) allows DNA amplification to be carried out in a short time at an arbitrary constant temperature of 50 to 65 ° C. (Japanese Patent No. 3343929). It is also a suitable amplification technique in the system.
・検出
マイクロ流体チップの微細流路における反応部位よりも下流側には、アナライト、例えば増幅された遺伝子を検出するための検出部が設けられている。少なくともその検出部の基板は、光学的測定を可能とするために透明な材質、好ましくは透明なプラスチックとなっている。
-Detection A detection unit for detecting an analyte, for example, an amplified gene, is provided downstream of the reaction site in the microchannel of the microfluidic chip. At least the substrate of the detection unit is made of a transparent material, preferably a transparent plastic, in order to enable optical measurement.
さらに微細流路上の検出部位に吸着させ固定化したたビオチン親和性タンパク質（アビジン、ストレプトアビジン）は、プローブ物質に標識されたビオチン、または遺伝子増幅反応に使用されるプライマーの５’末端に標識されたビオチンと特異的に結合する。これにより、ビオチンで標識されたプローブまたは増幅された遺伝子が本検出部位でトラップされる。 Furthermore, the biotin affinity protein (avidin, streptavidin) adsorbed and immobilized on the detection site on the fine channel is labeled on the 5 ′ end of the biotin labeled on the probe substance or the primer used in the gene amplification reaction. Bind specifically to biotin. Thereby, the probe labeled with biotin or the amplified gene is trapped at the detection site.
アナライトまたは目的遺伝子のＤＮＡを分析する方法は特に限定されないが、好ましい態様として基本的には以下の工程で行われる。
（１ａ） 検体もしくは検体から抽出したＤＮＡ、あるいは検体もしくは検体から抽出したＲＮＡから逆転写反応により合成したｃＤＮＡと、５’位置でビオチン修飾したプライマーとを、これらの収容部から下流の微細流路へ送液する。
The method for analyzing the DNA of the analyte or the target gene is not particularly limited, but as a preferred embodiment, it is basically carried out in the following steps.
(1a) A fine channel downstream from these containing portions of a sample or DNA extracted from the sample, or cDNA synthesized by reverse transcription from RNA extracted from the sample or sample, and a primer modified with biotin at the 5 ′ position To liquid.
反応部位の微細流路内で、遺伝子を増幅する工程、微細流路内で増幅された遺伝子を含む増幅反応液と変性液とを混合して、増幅された遺伝子を変性処理により一本鎖にし、これと末端をＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）で蛍光標識したプローブＤＮＡとをハイブリダイズさせる。 The step of amplifying the gene in the microchannel of the reaction site, the amplification reaction solution containing the gene amplified in the microchannel and the denaturing solution are mixed, and the amplified gene is made into a single strand by denaturation treatment. This is hybridized with a probe DNA fluorescently labeled with FITC (fluorescein isothiocyanate) at the end.
次いで、ビオチン親和性タンパク質を吸着させた微細流路内の検出部位に送液し、前記増幅遺伝子を微細流路内の検出部位にトラップする（増幅遺伝子を検出部位でトラップした後に蛍光標識したプローブＤＮＡとをハイブリダイズさせてもよい。）。
（１ｂ） 検体に存在する抗原、代謝物質、ホルモンなどのアナライトに対する特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含有する試薬を検体と混合する。その場合、抗体は、ビオチンおよびＦＩＴＣで標識されている。したがって抗原抗体反応により得られる生成物は、ビオチンおよびＦＩＴＣを有する。これをビオチン親和性タンパク質（好ましくはストレプトアビジン）を吸着させた微細流路内の検出部位に送液し、ビオチン親和性タンパク質とビオチンとの結合を介して該検出部位に固定化する。
（２） 上記微細流路内にＦＩＴＣに特異的に結合する抗ＦＩＴＣ抗体で表面を修飾した金コロイド液を流し、これにより固定化したアナライト・抗体反応物のＦＩＴＣに、あるいは遺伝子にハイブリダイズしたＦＩＴＣ修飾プローブに、その金コロイドを吸着させる。
（３） 上記微細流路の金コロイドの濃度を光学的に測定する。
Next, the solution is sent to the detection site in the microchannel to which the biotin-affinity protein is adsorbed, and the amplified gene is trapped in the detection site in the microchannel (the probe labeled with the fluorescence after trapping the amplified gene at the detection site) It may be hybridized with DNA.)
(1b) A reagent containing an antibody, preferably a monoclonal antibody, specific to an analyte such as an antigen, metabolite or hormone present in the sample is mixed with the sample. In that case, the antibody is labeled with biotin and FITC. Therefore, the product obtained by the antigen-antibody reaction has biotin and FITC. This is sent to a detection site in a microchannel to which a biotin affinity protein (preferably streptavidin) is adsorbed, and is immobilized on the detection site through the binding of biotin affinity protein and biotin.
(2) A colloidal gold solution whose surface has been modified with an anti-FITC antibody that specifically binds to FITC flows through the fine channel, and this hybridizes to the immobilized FITC of the analyte / antibody reaction product or to the gene. The gold colloid is adsorbed to the FITC-modified probe.
(3) Optically measure the concentration of colloidal gold in the fine channel.
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定されることはなく、その要旨を逸脱しない範囲内において種々の変形、変更が可能である。 As mentioned above, although embodiment of this invention was described, this invention is not limited to these embodiment, A various deformation | transformation and change are possible within the range which does not deviate from the summary.
１ 本体
２ マイクロ流体チップ
３ ペルチェ（冷却装置）
４ ヒーター（加熱装置）
５ ホトダイオード
６ ＬＥＤ
１０ 駆動液タンク
１１ マイクロポンプ
１２ ポンプ接続部
１３ 送液制御部
１５ 微細流路
１５ａ〜１５ｄ 微細流路
１６ 逆止弁
１７ａ 試薬貯留部
１７ｂ 検体貯留部
１８ 試薬収容部
１８ａ〜１８ｃ 試薬収容部
２０ 検体収容部
２１ａ 反応停止液収容部
２１ｂ 変性液収容部
２１ｃ ハイブリダイゼーションバッファー収容部
２１ｄ 洗浄液収容部
２１ｅ 金コロイド収容部
２１ｆ プローブＤＮＡ収容部
２１ｇ インターナルコントロール用プローブＤＮＡ収容部
２１ｈ ポジティブコントロール収容部
２１ｉ ネガティブコントロール収容部
２１ｊバッファー収容部
２２ 検出部
２３ 廃液貯留部
３１ 反応部流路
３２ 加熱領域
３３ 加熱装置
３４ 試薬収容部
３５ 冷却領域
３６ 冷却装置
３７ 断熱手段
３７ａ 空隙
３７ｂ 溝
３８ 溝形成基板
３９ 被覆基板
４１ 上側基板
４２ 基板
４３ 振動板
４４ 圧電素子
４５ 加圧室
４６ 第１流路
４７ 第２流路
４８ 第１液室
４９ 第２液室
７１ シリコン基板
７２ ポート
７３ ポート
７４ 基板
1
4 Heater (heating device)
5 Photodiode 6 LED
DESCRIPTION OF
Claims (7)
システム装置本体と、
を備え、そのシステム装置本体は、少なくとも
ベース本体と、
そのベース本体内に配置され、該チップに連通させるための流路開口を有するチップ接続部と、該マイクロポンプとを含むマイクロポンプユニットと、
加熱装置および／または冷却装置と、
少なくとも該マイクロポンプユニットの機能と加熱装置および／または冷却装置とを制御する制御装置と、
を備え、
該マイクロポンプが、
流路抵抗が差圧に応じて変化する第１流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化割合が第１流路よりも小さい第２流路と、
第１流路および第２流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部圧力を変化させるアクチュエータと、
該アクチュエータを駆動する駆動装置と
を備えるマイクロポンプであることを特徴とするマイクロ総合分析システム。 The microfluidic chip according to any one of claims 1 to 6,
A system unit body;
The system apparatus main body includes at least a base main body,
A micropump unit including a chip connection portion disposed in the base body and having a channel opening for communicating with the chip; and the micropump;
A heating device and / or a cooling device;
A control device for controlling at least the function of the micropump unit and the heating device and / or cooling device;
With
The micropump
A first flow path in which the flow path resistance changes according to the differential pressure;
A second flow path whose rate of change in flow path resistance with respect to a change in differential pressure is smaller than the first flow path;
A pressurization chamber connected to the first flow path and the second flow path;
An actuator for changing the internal pressure of the pressurizing chamber;
A micro total analysis system, characterized in that it is a micro pump provided with a drive device for driving the actuator.
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