JP2008148656A - 乾式分析要素 - Google Patents
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Abstract
【課題】血液中のグルコースなどの測定対象成分の濃度を迅速かつ高い精度で測定するための乾式分析要素を提供すること。
【解決手段】液体試料中の測定対象成分を測定するための乾式分析要素であって、試料を点着する側の面の細孔の大きさが、発色を検出する側の面の細孔の大きさよりも大きい異方性膜から構成され、該異方性膜に、測定対象成分を検出するための試薬とイミダゾール誘導体ロイコ色素が含浸されていることを特徴とする乾式分析要素。
【選択図】なし
【解決手段】液体試料中の測定対象成分を測定するための乾式分析要素であって、試料を点着する側の面の細孔の大きさが、発色を検出する側の面の細孔の大きさよりも大きい異方性膜から構成され、該異方性膜に、測定対象成分を検出するための試薬とイミダゾール誘導体ロイコ色素が含浸されていることを特徴とする乾式分析要素。
【選択図】なし
Description
本発明は、例えば血液等の液体中に含まれるグルコース測定のような、検体中の特定成分の量を測定するための比色定量用の乾式分析要素に関する。
血液中のグルコース濃度を試験するのに、酵素系組成物を含む乾式分析要素が診療所、医院、病院及び家庭で広く使用されている。実際に、乾式分析要素は糖尿病患者の多くにとって日常必需品となっている。糖尿病患者は血糖濃度を1日に複数回測定し、その結果に応じて、例えば食事制限及び/又はインスリン注射の実施を行わなければならず、測定の迅速化及び測定精度の向上は非常に重要な課題となっている。 この課題に対して、例えば特許第2545250号、特許第2589053号に記載のように、グルコース濃度に依存した色変化を生ずるような試薬を含む異方性の多孔質膜を用い、血液(全血)の展開及び拡散に要する時間を短縮するための乾式分析要素が示されていが、両者とも迅速性が十分とは言い難い。さらにWO2004/086037号公報には、同様に異方性の多孔質膜と発色試薬として4−アミノアンチピリンとそのカプラー試薬との組合わせが示されており、その発明が用いられている製品の測定時間は10秒程度と迅速性は確保されているものの、反応が十分に終了していない時間で測定しているために特に高濃度域の定量性が確保できず、測定精度の低下を引き起こしている。
また、低濃度域において、十分な感度がえられないため、正確な血糖値の測定が困難である問題もある。
そこで、迅速で精度の高い血液中のグルコース濃度測定用乾式分析要素の開発が求められている。
本発明が解決しようとする課題は、血液中のグルコースなどの測定対象成分の濃度を迅速かつ高い精度で測定するための乾式分析要素を提供することである。
本発明者は、上記問題点を解決するべく鋭意検討の結果、比較的大きい孔径を有する試料側と比較的小さい孔径を有する試験側とを有する異方性膜を使用し、グルコースと酸素から過酸化水素を生成し、色変化を生ずるような試薬を異方性膜に含有させ、色変化を生ずる発色試薬としてイミダゾール誘導体ロイコ色素を使用することによって、測定対象成分の濃度を迅速かつ高い精度で測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、液体試料中の測定対象成分を測定するための乾式分析要素であって、試料を点着する側の面の細孔の大きさが、発色を検出する側の面の細孔の大きさよりも大きい異方性膜から構成され、該異方性膜に測定対象成分を検出するための試薬とイミダゾール誘導体ロイコ色素が含浸されていることを特徴とする乾式分析要素が提供される。
好ましくは、試料を点着する側の面と発色を検出する側の面の平均孔径の比は10以下である。
好ましくは、異方性膜は、ポリスルホン膜又はポリエーテルスルホン膜である。
好ましくは、異方性膜は、ポリスルホン膜又はポリエーテルスルホン膜である。
(式中、R1及びR2はそれぞれ独立に低級アルキル基であり、R3及びR4はそれぞれ独立に低級アルコキシ基又はハロゲン原子であり、R5は、低級アルキル基、アラルキル基、又はC6H5−O−で置換された低級アルキル基を示す。)
(式中、Meはメチル基を示し、Etはエチル基を示し、Bzはベンジル基を示し、Phはフェニル基を示す。)
本発明による乾式分析要素は、従来の異方性膜グルコース分析要素に比べて測定速度を向上できる。 また本発明の乾式分析要素によれば、実施例における測定例から明らかなように測定レンジを向上できる。また、本発明の乾式分析要素は、比較例からも明らかなように、全血等を試料として低濃度域で、高感度な測定が可能となる。更に本発明の乾式分析要素は、比較例からも明らかなように、全血等を試料として高精度な測定が可能となる。 以上のように本発明による乾式分析材料は、特に全血等を試料とする液体中成分の分析において極めて有用である。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、液体試料中の測定対象成分を測定するための乾式分析要素に関するものであり、特に、試料を点着する側の面の細孔の大きさが、発色を検出する側の面の細孔の大きさよりも大きい異方性膜から構成され、該異方性膜に測定対象成分を検出するための試薬とイミダゾール誘導体ロイコ色素が含浸されていることを特徴とする乾式分析要素に関する。
本発明は、液体試料中の測定対象成分を測定するための乾式分析要素に関するものであり、特に、試料を点着する側の面の細孔の大きさが、発色を検出する側の面の細孔の大きさよりも大きい異方性膜から構成され、該異方性膜に測定対象成分を検出するための試薬とイミダゾール誘導体ロイコ色素が含浸されていることを特徴とする乾式分析要素に関する。
本発明で用いる異方性膜は、好ましくは、非繊維質多孔性担体である。本発明で用いる異方性膜は、比較的小さい孔径の開孔部を備えた平面(密面とも称する)と比較的大きい孔径の開孔部を備えた平面(以下粗面とも称する)を有する非対称性の形状を備え、かつ両開孔部は連通していることを特徴とする。本発明においては、比較的大きい孔径の開孔部を備えた平面を、試料を点着する側の面として使用し、比較的小さい孔径の開孔部を備えた平面を、発色を検出する側の面として使用する。即ち、本発明で用いる異方性膜においては、試料を点着する側の面の細孔の大きさが、発色を検出する側の面の細孔の大きさよりも大きい。試料を点着する側の面と発色を検出する側の面の平均孔径の比が10以下であることが好ましく、5以下であることがさらに好ましい。試料を点着する側の面と発色を検出する側の面の平均孔径の比は、例えば1.1から10とすることができ、より好ましくは1.1から5とすることができ、特に好ましくは1.1から3.5とすることができる。
本発明で用いる異方性膜の粗面(試料を点着する側の面)の孔径は、測光するための血液展開面積の確保と血球の完全な捕捉のために上限を5.0μm程度、下限は0.5μm程度とすることが好ましい。発色法によりグルコース濃度を測定する際、十分な発色面積を確保しないと、特に検体液量が微量の場合、正しい結果が得られない。非繊維質多孔性担体の粗面の孔径がこれ以上になると、血液の展開面積が小さくなって、測光するための血液展開面積を確保できない。また、本発明で用いる異方性膜の密面(即ち、発色を検出する側の面)の孔径は、上限を3.0μm程度、下限は0.2μm程度とすることが好ましい。
本発明で用いる異方性膜の素材は、好ましくはポリスルホンまたはポリエーテルテルスルホンである。具体的には、富士写真フイルム(株)社製ポリスルホン膜は、密面における平均孔径が0.45〜3.0μm、粗面における平均孔径が1.0〜5.0μmと非対称性を有する膜であり、本発明による乾式分析要素の好適な素材となる。
本発明で用いる試薬成分としては、具体的には、例えば、グルコース測定用の場合、グルコースオキシターゼ(GOD)と、ペルオキシターゼ(POD)と、イミダゾール誘導体ロイコ色素(発色試薬)とが挙げられる。
イミダゾール誘導体ロイコ色素は、過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼ等の酸化作用を有する物質が触媒として働くことにより呈色する発色指示薬である。イミダゾール誘導体ロイコ色素としては、例えば、特開昭59−193352号公報の明細書に記載のイミダゾール誘導体ロイコ色素を使用することができる。該公報に記載のイミダゾール誘導体ロイコ色素は、600以上、好ましくは600〜700nmの波長の範囲に吸収ピークを有し、青色に発色する。
(式中、R1及びR2はそれぞれ独立に低級アルキル基であり、R3及びR4はそれぞれ独立に低級アルコキシ基又はハロゲン原子であり、R5は、低級アルキル基、アラルキル基、又はC6H5−O−で置換された低級アルキル基を示す。)
本明細書で言う低級アルキル基としては、炭素数1から6の直鎖、分岐鎖又は環状のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基又はヘキシル基などを挙げることができる。
本明細書で言う低級アルコキシ基としては、炭素数1から6の直鎖、分岐鎖又は環状のアルコキシ基を意味し、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基又はヘキシルオキシ基などを挙げることができる。
本明細書で言うハロゲン原子とは、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。
本明細書で言うアラルキル基としては、炭素数7〜12、好ましくは7〜9のものが挙げられ、具体的には、ベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基などが挙げられる。
(式中、Meはメチル基を示し、Etはエチル基を示し、Bzはベンジル基を示し、Phはフェニル基を示す。)
なお、上記化合物(2)及び(4)は特開昭59−193352に記載の方法により合成することができ、上記化合物(1)、(3)及び(5)は米国特許第3,297,710号に記載の方法を参照することにより合成することができる。
上記の中でも2−(3,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシフェニル)−4−[4−(ジメチルアミノ)フェニル]−5−フェネチルイミダゾール、もしくは2−(3,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシフェニル)−4−[4−(ジメチルアミノ)フェニル]−5−ベンジルイミダゾールを用いることが特に好ましい。
また、本発明の乾式分析要素は液体中のグルコース測定に限定されるものではなく、液体中のその他の成分の測定にも利用できる。例えば、前記グルコース測定試薬の中に含まれるグルコースオキシターゼ(GOD)に代わり、コレステロールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼからなる群より選ばれる酸化酵素を用いることで、液体中のコレステロール、乳酸、アルコール、を測定することもできる。
グルコースオキシダーゼとしては、Aspergillus niger、Penicillium notatum等由来のものを用いることが好ましい。
コレステロールオキシダーゼとしては、Nocardia erythroporis、Brevibacterium、Pseudomonas、Mycobacterium、スエヒロタケ等から得られたものを用いることが好ましい。
乳酸オキシダーゼとしては、Aerococcus viridans、Pediococcus sp等から得られたものを用いることが好ましい。
アルコールオキシダーゼとしては、Basidiomycete、H.polymorpha及びKloeckera sp.等から得られたものを用いることが好ましい。
ペルオキシダーゼとしては、植物起源あるいは動物起源のペルオキシダーゼ、微生物起源のペルオキシダーゼを用いることができる。植物起源あるいは微生物起源の非特異的ペルオキシダーゼを用いることが好ましい。西洋わさびもしくは大根から抽出したペルオキシダーゼ、Cochliobolus属もしくはCurvularia属の微生物から抽出したペルオキシダーを用いることがさらに好ましい。
本発明の乾式分析要素は、例えば次のようにして得ることができる。つまり、非繊維質多孔性担体に試薬成分を適当な溶媒に溶解あるいは分散させたものを含浸または塗布した後、乾燥させることにより、本発明の乾式分析要素を調製することができる。このとき発色指示薬であるイミダゾール誘導体ロイコ色素の溶解性の問題を解消するために、塗布工程を2段階以上にしたり、あるいは試薬成分を乳化し、一液として、1段階の塗布工程で塗布したりすることも可能である。使用する溶媒は、ポリスルホン膜とポリエーテルスルホン膜の構造を変形あるいは崩壊させないものを選択する。例えば、メタノール、エタノール、アセトン等を利用すると良い。
さらに本発明の乾式分析要素は、光透過性・水不透過性支持体の表面上に、異方性膜を設けたものでもよい。光透過性・水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノールAのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル(例、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネート等)等のポリマーからなる厚さ約50μmから約1mm、好ましくは約80μmから約300μmの範囲のフイルムもしくはシート状の透明支持体を挙げることができる。
本発明の乾式分析要素に適用される液体試料の種類は特に限定されず、任意の液体試料(例えば、全血、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、髄液、膣液などの体液;あるいは飲料水、酒類、河川水、工場廃水等)中の測定対象成分を分析することができる。
本発明による乾式分析要素を使用する分析は、例えば次のように行なわれる。すなわち、乾式分析要素を一定サイズに加工し、デバイスに組み込み後、乾式分析要素の粗面(試料側)から微量の血液を点着し、同時に試料点着面の反対側(試験側)の発色の変化を反射測光法で観察することによって行なわれる。
例えば、本発明の乾式分析要素は一辺約10mmから約30mmの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭57−28331(対応米国特許4,169,751)、実開昭56−142454(対応米国特許4,387,990)、特開昭57−63452、実開昭58−32350、特表昭58−501144(対応国際公開WO83/00391)等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いることが、製造,包装,輸送,保存,測定操作等の観点で好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、又は小片を開口のあるカードに貼付または収めて用いたり、あるいは裁断した小片をそのまま用いることなどもできる。こうして、1枚または2枚以上の小片を収めた容器は、項目名やロット番号、キャリブレーションなどの情報を有することができる。これらの情報は、例えば、IC、磁気やバーコードなどを用いることができ、ハードウェア上で簡便に読み取り、自動化に有用である。
本発明の乾式分析要素は、例えば約0.5μL〜約30μL、好ましくは1μL〜10μLの範囲の液体試料を、試薬層に点着する。点着した乾式分析要素を約20℃〜約45℃の範囲の一定温度で、好ましくは約30℃〜約40℃の範囲内の一定温度で1〜10分間インキュベーションする。乾式分析要素内の発色又は変色を支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により液体試料中の測定対象成分の量を求めることができる。
測定操作は特開昭60−125543号公報、特開昭60−220862号公報、特開昭61−294367号公報、特開昭58−161867号公報(対応米国特許4,424,191)などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精度によっては目視により発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行ってもよい。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例1〜5:グルコース測定用乾式分析要素1〜5の製造
先ず、下記の表1及び表2に記載した含浸溶液(1)と(2)を混合して、下記の表3に示した非繊維質多孔性膜を担体として、混合した含浸溶液に30秒を含浸した後、10分間45℃で乾燥した。得られた試薬担持非繊維質多孔性担体を12×13mmの長方形に裁断してグルコース分析材料とした。
先ず、下記の表1及び表2に記載した含浸溶液(1)と(2)を混合して、下記の表3に示した非繊維質多孔性膜を担体として、混合した含浸溶液に30秒を含浸した後、10分間45℃で乾燥した。得られた試薬担持非繊維質多孔性担体を12×13mmの長方形に裁断してグルコース分析材料とした。
比較例1:
自己血糖測定用チップであるメデセーフミニ(テルモ社市販品)を用いた。このチップでは、非繊維質多孔質膜として、ポリエーテルスルホン膜が使用されているが、発色試薬としてはイミダゾール誘導体ロイコ色素は使用されておらず、4−アミノアンチピリンとそのカプラー試薬が使用されている。
自己血糖測定用チップであるメデセーフミニ(テルモ社市販品)を用いた。このチップでは、非繊維質多孔質膜として、ポリエーテルスルホン膜が使用されているが、発色試薬としてはイミダゾール誘導体ロイコ色素は使用されておらず、4−アミノアンチピリンとそのカプラー試薬が使用されている。
測定例:
上記のグルコース分析材料を用いて、実際に全血中のグルコース濃度を測定した。液体試料として10、23、42、93、329、507及び1047mg/dlのグルコースを含むヒト全血を利用し、全血3μlを分析材料の粗面側に点着し、点着後の経過時間に対応する分析材料の密面側の発色濃度を650nmにて瞬間光学反射測定装置MCPD3000(大塚電子株式会社製)によって測定した。なお各試料のグルコース濃度は、グルコースアナライザー(日立製、7170)で測定したものである。
上記のグルコース分析材料を用いて、実際に全血中のグルコース濃度を測定した。液体試料として10、23、42、93、329、507及び1047mg/dlのグルコースを含むヒト全血を利用し、全血3μlを分析材料の粗面側に点着し、点着後の経過時間に対応する分析材料の密面側の発色濃度を650nmにて瞬間光学反射測定装置MCPD3000(大塚電子株式会社製)によって測定した。なお各試料のグルコース濃度は、グルコースアナライザー(日立製、7170)で測定したものである。
図1には各種類膜の分析材料に対して、全血グルコース濃度が507 mg/dlの場合、650nmにおける反射光学濃度の測定時間による変化を示す。実施例1、5は比較例1と比べて発色反応が速く、約10秒で反射光学濃度(OD)が飽和になる。また実施例2〜4は比較例と比べて同時間の反射光学濃度(OD)が高いことがわかった。
また、図2は各種類膜の分析材料に対して、点着後反応時間10秒の650nmにおける反射光学濃度をグルコース濃度に対しプロットして、作成した検量線である。比較例1と比べて、実施例1〜4の方は全濃度範囲にわたって、グルコースに対する応答が大きく、測定レンジが広い、実施例5は同等であることがわかった。
更に、低グルコース濃度領域(80mg/dL以下)において、実施例1〜5及び比較例1のグルコース分析材料の感度を比較した。その結果を表4に示す。ここでの感度(dODr(80mg/dL-10mg/dL))はグルコース濃度が80mg/dLの場合、反応時間10秒時の650nmにおける反射光学濃度OD(80mg/dL)とグルコース濃度が10mg/dLの場合の反射光学濃度OD(10mg/dL)の差と定義する。
表4の感度比較の結果から、実施例1〜5のグルコース分析材料は、比較例1のグルコース分析材料より、低グルコース濃度領域で感度が高いことがわかる。この結果より、低濃度領域のグルコース測定の精度が高くなることは明白である。
Claims (5)
- 液体試料中の測定対象成分を測定するための乾式分析要素であって、試料を点着する側の面の細孔の大きさが、発色を検出する側の面の細孔の大きさよりも大きい異方性膜から構成され、該異方性膜に、測定対象成分を検出するための試薬とイミダゾール誘導体ロイコ色素が含浸されていることを特徴とする乾式分析要素。
- 試料を点着する側の面と発色を検出する側の面の平均孔径の比が10以下である、請求項1に記載の乾式分析要素。
- 異方性膜が、ポリスルホン膜又はポリエーテルスルホン膜である、請求項1又は2に記載の乾式分析要素。
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