JP2008141973A - Method for culturing and proliferating cardiac muscle cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、心筋細胞及び血管系細胞の培養増殖法に関する。より詳細にはＥＳ細胞から心筋細胞及び血管系細胞を培養する方法及びその為の培地等に関する。 The present invention relates to a method for culturing and growing cardiomyocytes and vascular cells. More specifically, the present invention relates to a method for culturing cardiomyocytes and vascular cells from ES cells, a medium for the same, and the like.
ＥＳ細胞（embryonic stem cells）は、ほとんど全ての細胞種に分化する能力を有する多能性幹細胞である。マウスＥＳ細胞株は、着床前の胚盤胞内に存在する内部細胞塊（inner cell mass）から樹立される。ＥＳ細胞の培地条件を変えたり細胞凝集塊を作らせたりすると、様々な細胞種に分化させることが可能である。特に、胚発生過程で初期に作られる心筋、造血系細胞や神経系細胞に分化させやすい。例えば、マウスＥＳ細胞は、ＬＩＦ（leukemia inhibitory factor）非存在下で細胞塊を作らせると胚葉体(embryoid body)と呼ばれる構造を形成し、胚葉体から外胚葉、中胚葉、内胚葉の細胞が分化し、１週間ほどで自律拍動する心筋細胞のクラスターが観察できる。又、胚葉体の中で血管内皮細胞が発生し、網状の原始的な血管構造を形成することが知られている。心筋細胞や血管系細胞（血管内皮細胞、血管平滑筋細胞）は、中胚葉へ分化誘導された細胞から発生する。しかしながらこのような結果は、胚葉体という多種多様な細胞集団の中で起こったものであり、現在のところ、心筋細胞を平面培養で（シングルコロニーとして）得ようと思うと、ストローマ細胞と共生培養する方法しかない（非特許文献１）。 ES cells (embryonic stem cells) are pluripotent stem cells having the ability to differentiate into almost all cell types. The mouse ES cell line is established from the inner cell mass present in the blastocyst before implantation. Differentiating into various cell types is possible by changing the medium conditions of ES cells or making cell aggregates. In particular, it is easy to differentiate into myocardium, hematopoietic cells and nervous system cells that are made early in the embryogenesis process. For example, mouse ES cells form a structure called an embryoid body when a cell mass is formed in the absence of LIF (leukemia inhibitory factor), and cells of the ectoderm, mesoderm, and endoderm are formed from the embryoid body. A cluster of cardiomyocytes that are differentiated and beating autonomously in about one week can be observed. It is also known that vascular endothelial cells are generated in the embryoid body to form a reticulated primitive vascular structure. Cardiomyocytes and vascular cells (vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells) are generated from cells induced to differentiate into mesoderm. However, such a result occurred in a diverse cell population called the embryoid body. At present, when trying to obtain cardiomyocytes by planar culture (as a single colony), symbiotic culture with stromal cells There is only the method to do (nonpatent literature 1).
種々のシグナル伝達機構が細胞分化に影響を及ぼすことが知られているが、その一つにＮｏｔｃｈシグナル伝達経路がある。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、神経系、造血系、血管系等の様々な分化過程に関与する、ヒトを含め脊椎動物から節足動物まで多くの後生動物でよく保存された経路である（非特許文献２〜５）。哺乳類においては現在６種類のリガンド（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ １、３、４及びＤｅｌｔａ−ｌｉｋｅ １ホモログと呼ばれる４つのデルタ様ホモログと、Ｊａｇｇｅｄ １及び２と呼ばれるセラート様ホモログ）と４種類の受容体（Ｎｏｔｃｈ １〜４）が同定されている。Ｎｏｔｃｈ受容体にリガンドが結合すると細胞表面のＮｏｔｃｈ蛋白質が、ＴＡＣＥ（ＴＮＦα converting enzyme：ＴＮＦ−α変換酵素）と呼ばれるプロテアーゼによって細胞外部分で切断された後、γセクレターゼにより細胞内部分で切断される。切断されたＮｏｔｃｈは自身の持つ核内移行シグナルで核へと移行して、核内のＣＢＦ１（C promoter-binding factor）と結合することで標的遺伝子の転写が活性化される（非特許文献６）。 Various signaling mechanisms are known to affect cell differentiation, one of which is the Notch signaling pathway. The Notch signaling pathway is a well-conserved pathway in many metazoans from vertebrates to arthropods, including humans, involved in various differentiation processes such as the nervous system, hematopoietic system, and vascular system (non-patent literature). 2-5). In mammals, there are currently six types of ligands (four delta-like homologs called Delta-like 1, 3, 4 and Delta-like 1 homologs, serato-like homologs called Jagged 1 and 2) and four types of receptors (Notch). 1-4) have been identified. When a ligand binds to the Notch receptor, the cell surface Notch protein is cleaved in the extracellular part by a protease called TACE (TNFα converting enzyme) and then cleaved in the intracellular part by γ-secretase. . The cleaved Notch migrates to the nucleus with its own nuclear translocation signal and binds to CBF1 (C promoter-binding factor) in the nucleus to activate transcription of the target gene (Non-patent Document 6). ).
これまで、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、心筋細胞の発生・分化には抑制的に働くというのが通説であった。例えば非特許文献５には、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚を用いＮｏｔｃｈシグナル伝達経路を活性化することにより心臓の発生・分化が阻害されることが記載されている。
本発明は、ＥＳ細胞から心筋細胞及び血管系細胞を培養する方法並びにＥＳ細胞から心筋細胞及び血管系細胞を培養するための培地の提供を目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for culturing cardiomyocytes and vascular cells from ES cells, and a medium for culturing cardiomyocytes and vascular cells from ES cells.
本発明者らは、上記課題に鑑み、心筋細胞への分化誘導に関与するシグナル伝達機構について解析したところ、驚くべきことに心筋への分化に関して抑制的に働くということが通説であったＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化が、発生のより初期の段階（本発明においてはＥＳ細胞を用いて証明した）においては逆にその増殖を促進することを見出した。同時に、血管系細胞の増殖もまたＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化により誘導されることを見出した。以上の事実から本発明者らは、ＥＳ細胞において、Ｎｏｔｃｈリガンドで該シグナル伝達経路を活性化することにより、高収率で心筋細胞及び血管系細胞を得ることに成功して本発明を完成するに至った。 In view of the above problems, the present inventors have analyzed the signal transduction mechanism involved in the induction of differentiation into cardiomyocytes. It has been found that activation of the transduction pathway promotes its proliferation conversely at an earlier stage of development (provided using ES cells in the present invention). At the same time, it was found that proliferation of vascular cells was also induced by activation of the Notch signaling pathway. Based on the above facts, the present inventors have succeeded in obtaining cardiomyocytes and vascular cells in high yield by activating the signaling pathway with Notch ligand in ES cells, thereby completing the present invention. It came to.
即ち、本発明は下記の通りである。
〔１〕Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を活性化することを含む、ＥＳ細胞から心筋細胞又は血管系細胞を培養増殖する方法。
〔２〕Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化が、Ｎｏｔｃｈリガンドとの接触により行われる、上記〔１〕記載の方法。
〔３〕Ｎｏｔｃｈリガンドとの接触が、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現しているストローマ細胞との共生培養によって実施される、上記〔２〕記載の方法。
〔４〕ＮｏｔｃｈリガンドがＤＬ１である、上記〔２〕又は〔３〕記載の方法。
〔５〕ストローマ細胞がＯＰ９又はＭＣ３Ｔ３−Ｅである、上記〔３〕又は〔４〕記載の方法。
〔６〕ＥＳ細胞がヒト又はマウス由来である、上記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７〕さらに、リガンドとの接触前にＥＳ細胞を中胚葉分化誘導する工程を含む、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕中胚葉分化誘導が、ゼラチンコートされた培養皿上で細胞を培養することによって行われる、上記〔７〕記載の方法。
〔９〕Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を活性化することを含む、心筋前駆細胞から心筋細胞を培養増殖する方法。
〔１０〕Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化が、Ｎｏｔｃｈリガンドとの接触により行われる、上記〔９〕記載の方法。
〔１１〕Ｎｏｔｃｈリガンドとの接触が、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現しているストローマ細胞との共生培養によって実施される、上記〔１０〕記載の方法。
〔１２〕ＮｏｔｃｈリガンドがＤＬ１である、上記〔１０〕又は〔１１〕記載の方法。
〔１３〕ストローマ細胞がＯＰ９又はＭＣ３Ｔ３−Ｅである、上記〔１１〕又は〔１２〕記載の方法。
〔１４〕心筋前駆細胞がヒト又はマウス由来である、上記〔９〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１５〕心筋前駆細胞が、Ｆｌｋ−１又はＰＤＧＦＲαを発現している、上記〔９〕〜〔１４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１６〕心筋前駆細胞が、Ｆｌｋ−１及びＰＤＧＦＲαを発現している、上記〔９〕〜〔１４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１７〕Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を活性化することを含む、血管前駆細胞から血管系細胞を培養増殖する方法。
〔１８〕Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化が、Ｎｏｔｃｈリガンドとの接触により行われる、上記〔１７〕記載の方法。
〔１９〕Ｎｏｔｃｈリガンドとの接触が、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現しているストローマ細胞との共生培養によって実施される、上記〔１８〕記載の方法。
〔２０〕ＮｏｔｃｈリガンドがＤＬ１である、上記〔１８〕又は〔１９〕記載の方法。
〔２１〕ストローマ細胞がＯＰ９又はＭＣ３Ｔ３−Ｅである、上記〔１９〕又は〔２０〕記載の方法。
〔２２〕血管前駆細胞がヒト又はマウス由来である、上記〔１７〕〜〔２１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２３〕Ｎｏｔｃｈリガンドを含有する、心筋細胞又は血管系細胞の培養用培地。
〔２４〕Ｎｏｔｃｈリガンドを、ストローマ細胞の細胞膜上に発現している状態で用いることを特徴とする、上記〔２３〕記載の培地。
〔２５〕ＮｏｔｃｈリガンドがＤＬ１である、上記〔２３〕又は〔２４〕記載の培地。
〔２６〕ストローマ細胞がＯＰ９又はＭＣ３Ｔ３−Ｅである、上記〔２４〕又は〔２５〕記載の培地。
That is, the present invention is as follows.
[1] A method of culturing and proliferating cardiomyocytes or vascular cells from ES cells, comprising activating Notch signaling pathway.
[2] The method described in [1] above, wherein the Notch signaling pathway is activated by contact with a Notch ligand.
[3] The method of the above-mentioned [2], wherein the contact with the Notch ligand is carried out by co-cultivation with stromal cells expressing the Notch ligand.
[4] The method described in [2] or [3] above, wherein the Notch ligand is DL1.
[5] The method described in [3] or [4] above, wherein the stromal cell is OP9 or MC3T3-E.
[6] The method according to any one of [1] to [5] above, wherein the ES cell is derived from a human or a mouse.
[7] The method according to any one of [1] to [6], further comprising a step of inducing mesoderm differentiation of ES cells before contact with the ligand.
[8] The method according to [7] above, wherein the induction of mesoderm differentiation is performed by culturing cells on a gelatin-coated culture dish.
[9] A method for culturing and proliferating cardiomyocytes from myocardial progenitor cells, comprising activating Notch signaling pathway.
[10] The method according to [9] above, wherein the Notch signaling pathway is activated by contact with a Notch ligand.
[11] The method according to [10] above, wherein the contact with the Notch ligand is carried out by co-cultivation with stromal cells expressing the Notch ligand.
[12] The method described in [10] or [11] above, wherein the Notch ligand is DL1.
[13] The method described in [11] or [12] above, wherein the stromal cell is OP9 or MC3T3-E.
[14] The method according to any one of [9] to [13] above, wherein the myocardial progenitor cell is derived from human or mouse.
[15] The method according to any one of [9] to [14] above, wherein the myocardial progenitor cells express Flk-1 or PDGFRα.
[16] The method according to any one of [9] to [14] above, wherein the myocardial progenitor cells express Flk-1 and PDGFRα.
[17] A method for culturing and proliferating vascular cells from vascular progenitor cells, comprising activating Notch signaling pathway.
[18] The method described in [17] above, wherein the Notch signaling pathway is activated by contact with a Notch ligand.
[19] The method described in [18] above, wherein the contact with the Notch ligand is carried out by co-cultivation with stromal cells expressing the Notch ligand.
[20] The method described in [18] or [19] above, wherein the Notch ligand is DL1.
[21] The method described in [19] or [20] above, wherein the stromal cell is OP9 or MC3T3-E.
[22] The method according to any one of [17] to [21] above, wherein the vascular progenitor cells are derived from human or mouse.
[23] A culture medium for cardiomyocyte or vascular cell culture containing Notch ligand.
[24] The medium described in [23] above, wherein the Notch ligand is used in a state expressed on the cell membrane of stromal cells.
[25] The medium described in [23] or [24] above, wherein the Notch ligand is DL1.
[26] The medium described in [24] or [25] above, wherein the stromal cell is OP9 or MC3T3-E.
本発明の方法によれば、ＥＳ細胞を出発材料とした心筋培養において、ストローマ細胞との共生培養による平面培養という従来の方法に比べてより収率よく心筋細胞を得ることができる。得られた心筋細胞は、心筋再生治療に用いることが可能な心筋移植片等の作製に用いることができる。さらに、本発明の方法によればＥＳ細胞を出発材料として効率よく血管系細胞を得ることができる。得られた血管系細胞は、血管再生医療の分野で非常に有用である。 According to the method of the present invention, cardiomyocytes can be obtained in a higher yield in myocardial culture using ES cells as a starting material than in the conventional method of planar culture by symbiotic culture with stromal cells. The obtained cardiomyocytes can be used for producing a myocardial graft that can be used for myocardial regeneration therapy. Furthermore, according to the method of the present invention, vascular cells can be efficiently obtained using ES cells as starting materials. The obtained vascular cells are very useful in the field of vascular regenerative medicine.
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、「ＥＳ細胞」とは、初期胚の多能性幹細胞を取り出し、インビトロで培養できるように株化したものを意味する。例えばマウスのＥＳ細胞は、ＬＩＦの存在下で未分化性を維持して増殖するが、ＬＩＦの非存在下では増殖率が低下して初期胚同様の細胞分化を起こす。ＥＳ細胞の由来は、特に限定されないが、哺乳動物に由来するものであることが好ましい。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ等の哺乳動物由来のＥＳ細胞を用いることができる。特によく樹立されているヒトやマウスのＥＳ細胞が好ましい。ＥＳ細胞として、細胞バンクに登録された、又は市販品のＥＳ細胞株を使用することができる。マウスＥＳ細胞としてはＥＢ５細胞(Niwa H. et al. Nat. Genet., 2000; 24: 372-376)等が、ヒトＥＳ細胞としては、Ｈ９．２細胞(Kehat et al. JCI., 2001; 108: 407-414)、ＨＥＳ−２細胞(Mummery et al. Journal of Anatomy, 2002; 200: 233-242)、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９細胞(Xu et al. Circulation Research, 2002; 91: 501-508)等が知られている。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present specification, “ES cell” means a cell lined so that pluripotent stem cells of early embryos can be taken out and cultured in vitro. For example, mouse ES cells proliferate while maintaining undifferentiation in the presence of LIF, but in the absence of LIF, the proliferation rate decreases and cell differentiation similar to that of the early embryo occurs. The origin of the ES cell is not particularly limited, but is preferably derived from a mammal. For example, ES cells derived from mammals such as human, monkey, mouse, rat, hamster, rabbit, dog, cat, sheep and pig can be used. Particularly well-established human and mouse ES cells are preferred. As ES cells, ES cell lines registered in cell banks or commercially available can be used. Examples of mouse ES cells include EB5 cells (Niwa H. et al. Nat. Genet., 2000; 24: 372-376), and human ES cells include H9.2 cells (Kehat et al. JCI., 2001; 108: 407-414), HES-2 cells (Mummery et al. Journal of Anatomy, 2002; 200: 233-242), H1, H7, H9 cells (Xu et al. Circulation Research, 2002; 91: 501-508) ) Etc. are known.
ＥＳ細胞は、初期胚において様々な体細胞系譜と生殖細胞系譜が分岐する以前の未分化幹細胞から由来する細胞株である。ＥＳ細胞の培地条件を変えたり細胞凝集塊を作らせたりすると、様々な細胞種に分化させることが可能である。例えば外胚葉へと分化誘導されれば脳神経系や表皮を司る細胞へ、中胚葉へと分化誘導されれば血球、血管系細胞（血管内皮細胞、血管平滑筋細胞）、心臓、筋肉、腎臓を司る細胞へ、内胚葉へと分化誘導されれば消化管、肝臓、膵臓を司る細胞へと導かれる。本発明において、ＥＳ細胞は、心筋細胞や血管系細胞へと導かれる中胚葉へとあらかじめ分化誘導されていてもよく、所望する細胞の収率向上の観点から中胚葉へと分化誘導されていることが好ましい。 ES cells are cell lines derived from undifferentiated stem cells before the branching of various somatic and germline lineages in the early embryo. Differentiating into various cell types is possible by changing the medium conditions of ES cells or making cell aggregates. For example, if differentiation is induced into ectoderm, cells are responsible for the cranial nervous system and epidermis, and if differentiation is induced into mesoderm, blood cells, vascular cells (vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells), heart, muscle, and kidney If differentiation is induced into cells that control the endoderm, they are led to cells that control the digestive tract, liver, and pancreas. In the present invention, ES cells may be induced to differentiate into mesoderm that is led to cardiomyocytes and vascular cells, and are induced to differentiate into mesoderm from the viewpoint of improving the yield of desired cells. It is preferable.
ＥＳ細胞から中胚葉細胞への分化誘導（以降、単に中胚葉分化誘導ともいう）は、通常当分野で実施されている手法を用いて行えばよい（Yamashita J., Nature 2000; 408(6808): 92-6、Nishikawa SI. Development 1998; 125(9): 1747）。例えばマウスＥＢ５細胞を用いた場合について記載する。ＥＢ５細胞をゼラチン（好ましくは０．１％程度；Sigma-Aldrich Japan, Tokyo Japan等）コートした培養皿で、培養液（例えば、１％ウシ胎児血清(EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX等)、１０％KnockOut（登録商標）血清リプレースメント(Invitrogen等)、０．１ｍＭ非必須アミノ酸(Invitrogen等)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム(Invitrogen等)、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール(SIGMA, St. Louis, MO等)、２０００Ｕ／ｍｌ ＬＩＦ（Leukemia inhibitory factor; Chemicon International Inc. Temecula, CA等）及び５００μｇ／ｍｌブラストサイジン(Invitrogen等)を添加したα最小必須培地（αＭＥＭ；Invitorgen, Tokyo, Japan等））中で、３６．５〜３７．５℃、好ましくは３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で５日間培養する。
これらの培養条件の詳細は細胞の状況等の要因によって適宜変更され得る。
Differentiation induction from ES cells to mesoderm cells (hereinafter also simply referred to as mesoderm differentiation induction) may be performed using a technique that is usually performed in the art (Yamashita J., Nature 2000; 408 (6808) : 92-6, Nishikawa SI. Development 1998; 125 (9): 1747). For example, a case where mouse EB5 cells are used will be described. In a culture dish in which EB5 cells are coated with gelatin (preferably about 0.1%; Sigma-Aldrich Japan, Tokyo Japan, etc.), a culture solution (eg, 1% fetal bovine serum (EQUITECH, Cotton Gin Lane Kerrville, TX, etc.), 10% KnockOut (registered trademark) serum replacement (Invitrogen, etc.), 0.1 mM non-essential amino acid (Invitrogen, etc.), 1 mM sodium pyruvate (Invitrogen, etc.), 0.1 mM 2-mercaptoethanol (SIGMA, St. Louis, MO, etc.) ), 2000 U / ml LIF (Leukemia inhibitory factor; Chemicon International Inc. Temecula, CA, etc.) and 500 μg / ml blasticidin (Invitrogen, etc.) added in α minimum essential medium (αMEM; Invitorgen, Tokyo, Japan, etc.)) Then, the cells are cultured at 36.5 to 37.5 ° C., preferably 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 5 days.
Details of these culture conditions can be appropriately changed depending on factors such as the state of the cells.
中胚葉細胞への分化誘導が適切に行われたかどうかは細胞表面マーカーの発現様式を解析することによって確認することができる。具体的には、Ｆｌｋ−１及びＰＤＧＦＲαの発現状況を単独で、あるいは組み合わせて測定する。 Whether differentiation induction into mesoderm cells has been appropriately performed can be confirmed by analyzing the expression pattern of cell surface markers. Specifically, the expression status of Flk-1 and PDGFRα is measured alone or in combination.
Ｆｌｋ−１は、血管内皮増殖因子受容体ＶＥＧＦの受容体として機能し、膜１回貫通型のチロシンキナ−ゼで、細胞外には７つの免疫グロブリン様構造をもち、細胞内にはキナーゼドメインとこれを二分するキナーゼインサートをもつことが特徴である（Developmental Biology S.F. Gilbert 7th Edition Chapter 15 Lateral Plate Mesoderm. Sinauer）。正常血管や腫瘍血管の新生、血管透過性に極めて重要な役割を果たすことが明らかになりつつある。また、血管内皮前駆細胞のマーカー、中胚葉のマーカーと考えられている（Cortes et al., Mech Dev. 1999; 83(1-2):161-4、Ogawa et al., Blood 1999; 93(4):1168-77）。ＰＤＧＦＲ（血小板由来増殖因子受容体）は、種々の間葉系細胞に発現している分子量約１８万の糖鎖を有する膜蛋白質でチロシンキナーゼ活性を有する。アミノ酸残基配列の類似したα及びβ受容体が存在する。マウス発生の原腸陥入期に、沿軸中胚葉に強い発現がみられ、発生の進行とともに間葉系組織に広く分布すること、マウスＥＳ細胞よりＢＭＰ４刺激により誘導されるＰＤＧＦＲα陽性細胞群から、中胚葉組織の軟骨形成が効率的に分化誘導されることが報告されている。 Flk-1 functions as a receptor for the vascular endothelial growth factor receptor VEGF, and is a one-transmembrane tyrosine kinase. It has seven immunoglobulin-like structures outside the cell and a kinase domain inside the cell. it is characterized by having a kinase insert which bisects this (Developmental Biology SF Gilbert 7 th Edition Chapter 15 Lateral Plate mesoderm. Sinauer). It is becoming clear that it plays an extremely important role in the formation of normal blood vessels and tumor blood vessels, and vascular permeability. It is also considered a marker of vascular endothelial progenitor cells and a marker of mesoderm (Cortes et al., Mech Dev. 1999; 83 (1-2): 161-4, Ogawa et al., Blood 1999; 93 ( 4): 1168-77). PDGFR (platelet-derived growth factor receptor) is a membrane protein having a sugar chain with a molecular weight of about 180,000 expressed in various mesenchymal cells and has tyrosine kinase activity. There are α and β receptors with similar amino acid residue sequences. From the PDGFRα-positive cell group induced by BMP4 stimulation from mouse ES cells, strong expression is observed in the paraxial mesoderm during the gastrulation stage of mouse development, and it is widely distributed in mesenchymal tissues as development proceeds It has been reported that cartilage formation in mesoderm tissue is efficiently induced to differentiate.
本発明においては、中胚葉分化誘導条件下で培養した後の細胞（細胞集団）における細胞表面マーカーの発現を測定し、Ｆｌｋ−１又はＰＤＧＦＲαを、好ましくはＦｌｋ−１を、特に好ましくはＦｌｋ−１及びＰＤＧＦＲαを両方とも発現している細胞をＮｏｔｃｈリガンドとの接触に用いる。 In the present invention, the expression of a cell surface marker in cells (cell population) after culturing under mesoderm differentiation inducing conditions is measured, and Flk-1 or PDGFRα, preferably Flk-1, particularly preferably Flk−. Cells expressing both 1 and PDGFRα are used for contact with the Notch ligand.
Ｆｌｋ−１発現の解析及びＰＤＧＦＲα発現の解析は、細胞の表面マーカーであるこれらの蛋白質の発現が解析できれば特にその手法は限定されないが、一般的に免疫反応を用いた方法が簡便であり、また細胞を傷つけることなく好ましい。具体的にはＦｌｋ−１に特異的親和性を有する物質、並びにＰＤＧＦＲαに特異的親和性を有する物質を用いて行う。 The analysis of Flk-1 expression and the analysis of PDGFRα expression are not particularly limited as long as the expression of these proteins, which are cell surface markers, can be analyzed, but generally a method using an immune reaction is simple, Preferred without damaging cells. Specifically, a substance having specific affinity for Flk-1 and a substance having specific affinity for PDGFRα are used.
本明細書中、「用いて」という用語について、その方法は特に限定されず、具体的には、例えばＦｌｋ−１及びＰＤＧＦＲαと特異的親和性を有する物質を用いる場合であれば該蛋白質の抗体との抗原抗体反応を利用する方法が挙げられる。 In this specification, the method of the term “use” is not particularly limited. Specifically, for example, if a substance having specific affinity for Flk-1 and PDGFRα is used, an antibody of the protein is used. And a method using an antigen-antibody reaction.
Ｆｌｋ−１及びＰＤＧＦＲαと、それぞれ特異的な親和性を有する物質としては例えば当該蛋白質に特異的親和性を有する抗体又はその断片が挙げられ、その特異的親和性とは抗原・抗体反応により該蛋白質を特異的に認識し、結合する能力のことである。該抗体又はその断片は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体あるいはその機能的断片は、通常当分野で行なわれている方法によって製せられる。例えばポリクローナル抗体を用いる場合であれば、該蛋白質をマウスやウサギといった動物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して免疫し、抗体価が上昇するのを待った後に抗血清を採取する方法が挙げられ、またモノクローナル抗体を用いる場合であれば、常法に従いハイブリドーマを作製して、その分泌液を採取する方法が挙げられる。抗体断片を製造する方法としてはクローニングした抗体遺伝子断片を微生物等に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗体断片等の純度は、当該蛋白質との特異的親和性を保持している限り、特に限定されない。これらの抗体又はその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
さらに、これらは市販されているものを用いても良い。
Examples of the substance having specific affinity for Flk-1 and PDGFRα include, for example, an antibody having a specific affinity for the protein or a fragment thereof, and the specific affinity is determined by the antigen-antibody reaction. Is the ability to specifically recognize and bind. The antibody or a fragment thereof is not particularly limited as long as it can specifically bind to the protein, and may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a functional fragment thereof. These antibodies or functional fragments thereof can be produced by methods generally performed in the art. For example, in the case of using a polyclonal antibody, there is a method in which the protein is injected subcutaneously into the back of the animal or into the abdominal cavity or vein of an animal such as a mouse or rabbit, and after waiting for the antibody titer to rise, antiserum is collected. In the case of using a monoclonal antibody, there is a method of preparing a hybridoma according to a conventional method and collecting the secreted solution. As a method for producing an antibody fragment, a method in which a cloned antibody gene fragment is expressed in a microorganism or the like is often used. The purity of the antibody, antibody fragment, etc. is not particularly limited as long as it retains specific affinity with the protein. These antibodies or fragments thereof may be labeled with a fluorescent substance, an enzyme, a radioisotope, or the like.
Further, these may be commercially available.
本発明は、さらに、心筋前駆細胞から心筋細胞をより効率的に培養する方法を提供する。
本発明において「心筋前駆細胞」とは、分化すれば自己拍動し心筋特異的遺伝子を発現するようになる（心筋細胞になる）細胞集団のことを指し、好ましくは中胚葉由来（Ｆｌｋ−１陽性）の細胞であり、より好ましくはＦｌｋ−１陽性であり且つＰＤＧＦＲα陽性である。
The present invention further provides a method for more efficiently culturing cardiomyocytes from myocardial progenitor cells.
In the present invention, “myocardial progenitor cell” refers to a cell population that, when differentiated, self-pulsates and expresses a myocardial specific gene (becomes a cardiomyocyte), preferably derived from mesoderm (Flk-1). Positive) cells, more preferably Flk-1 positive and PDGFRα positive.
心筋前駆細胞は、中胚葉細胞を含有する細胞集団から得ることができる。中胚葉細胞を含有する細胞集団とは、中胚葉由来の組織を形成し得る細胞を含有している細胞の集合体であれば、その由来は特に問わない。例えば末梢血、骨髄組織、脂肪組織、骨格筋組織、羊膜組織、胎盤組織、臍帯血などから得られる組織幹細胞由来のものであってもよいし、また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）あるいは始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）から分化誘導されたものであってもよい。好ましくはＥＳ細胞を中胚葉分化誘導したものである。 Myocardial progenitor cells can be obtained from a cell population containing mesoderm cells. The cell population containing mesoderm cells is not particularly limited as long as it is an aggregate of cells containing cells that can form mesoderm-derived tissue. For example, it may be derived from tissue stem cells obtained from peripheral blood, bone marrow tissue, adipose tissue, skeletal muscle tissue, amniotic tissue, placental tissue, umbilical cord blood, etc., embryonic stem cells (ES cells), embryonic They may be those induced to differentiate from tumor cells (EC cells) or primordial germ cell-derived cells (EG cells). Preferably, ES cells are induced to induce mesoderm differentiation.
心筋前駆細胞を得るにあたって、ＥＳ細胞から中胚葉細胞へ分化誘導する方法ならびに中胚葉細胞への分化誘導を確認する方法は上述の通りである。 In obtaining myocardial progenitor cells, the method for inducing differentiation from ES cells to mesoderm cells and the method for confirming differentiation induction into mesoderm cells are as described above.
ＥＳ細胞、中胚葉分化誘導したＥＳ細胞、及び心筋前駆細胞は、適切な条件下で心筋細胞へと分化する能力を有している。本発明は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を活性化することによってこれらの細胞供給源から心筋細胞を効率的に培養できるという知見に基づいている。 ES cells, ES cells induced to undergo mesoderm differentiation, and myocardial progenitor cells have the ability to differentiate into cardiomyocytes under appropriate conditions. The present invention is based on the finding that cardiomyocytes can be efficiently cultured from these cell sources by activating the Notch signaling pathway.
本発明は、さらに、血管前駆細胞から血管系細胞（血管内皮細胞、血管平滑筋細胞）をより効率的に培養する方法を提供する。
本発明において「血管前駆細胞」とは、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）の存在下に培養すると分化して血管内皮細胞や血管平滑筋細胞となり、網状の血管構造が構築されるようになる細胞集団のことを指し、好ましくは中胚葉由来（Ｆｌｋ−１陽性）の細胞である。。
The present invention further provides a method for more efficiently culturing vascular cells (vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells) from vascular progenitor cells.
In the present invention, “vascular progenitor cells” are cell populations that differentiate into vascular endothelial cells and vascular smooth muscle cells when they are cultured in the presence of VEGF (vascular endothelial growth factor) to form a reticulated vascular structure. It is preferably a mesoderm-derived (Flk-1 positive) cell. .
血管前駆細胞は、中胚葉細胞を含有する細胞集団から得ることができる。中胚葉細胞を含有する細胞集団とは、中胚葉由来の組織を形成し得る細胞を含有している細胞の集合体であれば、その由来は特に問わない。例えば末梢血、骨髄組織、脂肪組織、骨格筋組織、羊膜組織、胎盤組織、臍帯血などから得られる組織幹細胞由来のものであってもよいし、また、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）あるいは始原生殖細胞由来細胞（ＥＧ細胞）から分化誘導されたものであってもよい。好ましくはＥＳ細胞を中胚葉分化誘導したものである。 Vascular progenitor cells can be obtained from a cell population containing mesoderm cells. The cell population containing mesoderm cells is not particularly limited as long as it is an aggregate of cells containing cells that can form mesoderm-derived tissue. For example, it may be derived from tissue stem cells obtained from peripheral blood, bone marrow tissue, adipose tissue, skeletal muscle tissue, amniotic tissue, placental tissue, umbilical cord blood, etc., embryonic stem cells (ES cells), embryonic They may be those induced to differentiate from tumor cells (EC cells) or primordial germ cell-derived cells (EG cells). Preferably, ES cells are induced to induce mesoderm differentiation.
血管前駆細胞を得るにあたって、ＥＳ細胞から中胚葉細胞へ分化誘導する方法ならびに中胚葉細胞への分化誘導を確認する方法は上述の通りである。 In obtaining vascular progenitor cells, the method for inducing differentiation from ES cells to mesoderm cells and the method for confirming differentiation induction into mesoderm cells are as described above.
ＥＳ細胞、中胚葉分化誘導したＥＳ細胞、及び血管前駆細胞は、適切な条件下で血管系細胞へと分化する能力を有している。本発明は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を活性化することによってこれらの細胞供給源から血管系細胞を効率的に培養できるという知見に基づいている。 ES cells, ES cells induced to undergo mesoderm differentiation, and vascular progenitor cells have the ability to differentiate into vascular cells under appropriate conditions. The present invention is based on the finding that vascular cells can be efficiently cultured from these cell sources by activating the Notch signaling pathway.
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達（Ｎｏｔｃｈシグナリングとも称する）経路は、神経形成、造血、血管形成等の様々な分化過程に関与する、ヒトを含め脊椎動物から節足動物まで多くの後生動物でよく保存された経路である（非特許文献２〜４）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化は、一連の蛋白質分解過程を経て進む。リガンドが受容体に結合することによって、細胞表面のメタロプロテアーゼＴＡＣＥによる分解を受けやすくなりＮｏｔｃｈの細胞外ドメインが外れる。一方、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインは、γセクレターゼにより分解される。可溶性蛋白質となったＮｏｔｃｈの細胞内ドメインは細胞質内へ放出される。細胞内ドメインは核の局在シグナルを有しており、核へ移行し核内の転写調節因子と結合する。その結果、下流の遺伝子産物の幾つかが活性化される。 The Notch signaling (also referred to as Notch signaling) pathway is a well-conserved pathway in many metazoans, including vertebrates and arthropods, involved in various differentiation processes such as neurogenesis, hematopoiesis, and angiogenesis. (Non-Patent Documents 2 to 4). Activation of the Notch signaling pathway proceeds through a series of proteolytic processes. When the ligand binds to the receptor, it becomes susceptible to degradation by the metalloprotease TACE on the cell surface and the extracellular domain of Notch is removed. On the other hand, the intracellular domain of Notch is degraded by γ-secretase. The intracellular domain of Notch, which has become a soluble protein, is released into the cytoplasm. The intracellular domain has a nuclear localization signal that translocates to the nucleus and binds to transcriptional regulators in the nucleus. As a result, some of the downstream gene products are activated.
本発明において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性化（Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化とも称する）は、リガンドとの接触下に行われる。リガンドはそれ自身が膜貫通蛋白質であり、従ってＮｏｔｃｈシグナリングの活性化は隣接細胞の細胞表面上に発現したリガンドを介して生じる。Ｎｏｔｃｈ受容体とリガンドとの接触は、該受容体を発現しているＥＳ細胞又はその子孫細胞と該リガンドを発現している隣接細胞とを共生培養することによって簡便に行うことができる。リガンドを発現している隣接細胞として平面培養を可能にするストローマ細胞を用いることは、心筋細胞や血管系細胞への分化誘導を促進する上で都合がよい。ストローマ細胞とは、骨髄や臍帯の中に存在する造血細胞や血液細胞以外の接着性の細胞をいい、細胞分化を誘導するのに必要な環境を作り出す働きを担う。具体的には、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、マウスなどの骨髄、臍帯、脾臓、子宮、胎盤、血管等に由来する線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、マクロファージなどが挙げられる。また、これらの細胞は、初代細胞であっても、株化細胞であってもよい。これらのストローマ細胞は、体内においては、骨髄内部表面等に接着するものであるが、本発明の心筋細胞又は血管系細胞の培養増殖方法においては、培養皿等の上に伸展する。ストローマ細胞としては、例えば骨髄の間質由来のＯＰ９株（Nakano T, Kodama H, Honjo T., Science 1994 Aug 19;265(5175):1098-101）や、前骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ（Sudo H, Kodama HA, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S., J Cell Biol. 1983 Jan;96(1):191-8）、ＰＡ６株（Kodama HA, Amagai Y, Koyama H, Kasai S., J Cell Physiol. 1982 Jul;112(1):89-95）等が用いられる。好ましくはＯＰ９株及びＭＣ３Ｔ３−Ｅ株である。 In the present invention, activation of the Notch signaling pathway (also referred to as activation of Notch signaling) is performed under contact with a ligand. The ligand is itself a transmembrane protein, so activation of Notch signaling occurs via a ligand expressed on the cell surface of adjacent cells. The contact between the Notch receptor and the ligand can be easily performed by co-culturing the ES cell expressing the receptor or its progeny cells and the adjacent cells expressing the ligand. The use of stromal cells that enable planar culture as adjacent cells expressing the ligand is advantageous in promoting differentiation induction into cardiomyocytes and vascular cells. Stromal cells are hematopoietic cells or adhesive cells other than blood cells present in the bone marrow and umbilical cord, and play a role in creating an environment necessary for inducing cell differentiation. Specific examples include human, monkey, bovine, pig, sheep, horse, mouse and other bone marrow, umbilical cord, spleen, uterus, placenta, blood vessels and the like, fibroblasts, endothelial cells, adipocytes, macrophages and the like. . In addition, these cells may be primary cells or established cells. In the body, these stromal cells adhere to the inner surface of the bone marrow and the like, but in the method for culturing and proliferating myocardial cells or vascular cells of the present invention, they extend on a culture dish or the like. Examples of stromal cells include the OP9 strain derived from the bone marrow stroma (Nakano T, Kodama H, Honjo T., Science 1994 Aug 19; 265 (5175): 1098-101), and the preosteoblast cell line MC3T3-E ( Sudo H, Kodama HA, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S., J Cell Biol. 1983 Jan; 96 (1): 191-8), PA6 strain (Kodama HA, Amagai Y, Koyama H, Kasai S., J Cell Physiol. 1982 Jul; 112 (1): 89-95) and the like are used. The OP9 strain and MC3T3-E strain are preferred.
ストローマ細胞にＮｏｔｃｈリガンドを発現させる方法は、当分野で通常行われている外来遺伝子を所望の細胞に導入する手法が用いられる。具体的には、Ｎｏｔｃｈリガンドをコードする遺伝子が挿入されたベクターをストローマ細胞にトランスフェクトすることによって行われる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、哺乳類においては現在６種類のリガンド（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ １、３、４及びＤｅｌｔａ−ｌｉｋｅ １ホモログと呼ばれる４つのデルタ様ホモログと、Ｊａｇｇｅｄ １及び２と呼ばれるセラート様ホモログ）が知られており、それをコードする遺伝子は、例えばマウス、ヒトでは以下のとおり報告されている。 As a method for expressing a Notch ligand in stromal cells, a technique for introducing a foreign gene, which is usually performed in the art, into a desired cell is used. Specifically, it is carried out by transfecting a stromal cell with a vector into which a gene encoding a Notch ligand has been inserted. Notch ligands are currently known in mammals for six types of ligands (four delta-like homologs called Delta-like 1, 3, 4 and Delta-like 1 homologs and serato-like homologs called Jagged 1 and 2). The gene encoding it has been reported as follows, for example, in mice and humans.
また、Ｎｏｔｃｈ受容体との結合能を維持し、Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化を行うことができる限り、リガンドは、そのアミノ酸配列レベルで１若しくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するものであってもよい。例えば、エキソヌクレアーゼを用いるdeletion mutant作製法、カセット変異法等のsite-directed mutagenesisによってリガンドをコードするＤＮＡを人為的に改変させ、該改変ＤＮＡを用いてストローマ細胞へのトランスフェクションを行ってもよい。 In addition, as long as the ability to bind to the Notch receptor can be maintained and Notch signaling can be activated, one or more amino acid sequences are substituted, deleted, inserted and / or added at the amino acid sequence level of the ligand. It may have a modified amino acid sequence. For example, a DNA encoding a ligand may be artificially modified by site-directed mutagenesis such as a deletion mutant preparation method using exonuclease or a cassette mutation method, and transfection into a stromal cell may be performed using the modified DNA. .
本発明において使用するベクターは、目的に応じて適当なベクターを選択することができる。具体的には、哺乳動物由来のベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３やｐＥＧＦ−ＢＯＳ、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８、ｐＣＸＮ）、昆虫細胞由来のベクター（例えば、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来のベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来のベクター（例えば、ｐＭＳＣＶ、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来のベクター（例えば、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来のベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）、大腸菌ベクター（Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ）等を挙げることができる。本発明において、哺乳動物細胞内で発現可能なベクターを用いることが好ましい。ベクターを細胞へ導入するには、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリポソームＤＯＴＡＰを用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウイルスによる感染導入方法（ｐＭＸ、ｐＭＳＣＶ等）、パーティクルガン等から選択することにより行うことができる。ストローマ細胞にＮｏｔｃｈリガンドを発現させる為に用いるベクターとしては、ｐＭＳＣＶが好ましい。かかるベクターをもとに適当な介在配列やベクター選別の為の配列、マーカー配列等を用いてリガンド発現ベクターを構築する。介在配列としてはＩＲＥＳ(Internal Ribosome Entry Site)配列やその改変物が例示される。ベクター選別の為の配列やマーカー配列としては、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性変異を相補する遺伝子、蛍光性蛋白質をコードする遺伝子等が例示される。 As the vector used in the present invention, an appropriate vector can be selected according to the purpose. Specifically, vectors derived from mammals (eg, pcDNA3, pEGF-BOS, pEF, pCDM8, pCXN), vectors derived from insect cells (eg, pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, pMH1, pMH2), animals Virus-derived vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived vectors (eg, pMSCV, pZIPneo), yeast-derived vectors (eg, pNV11, SP-Q01), Bacillus subtilis-derived vectors (eg, pPL608) PKTH50), E. coli vectors (M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, pCR-Script) and the like. In the present invention, it is preferable to use a vector that can be expressed in mammalian cells. In order to introduce a vector into cells, for example, a calcium phosphate method, a DEAE dextran method, a method using cationic liposome DOTAP, an electroporation method, a lipofection method, a virus infection introduction method (pMX, pMSCV, etc.), a particle gun, etc. This can be done by selecting from As a vector used for expressing Notch ligand in stromal cells, pMSCV is preferable. Based on such a vector, a ligand expression vector is constructed using an appropriate intervening sequence, a vector selection sequence, a marker sequence, and the like. Examples of the intervening sequence include an IRES (Internal Ribosome Entry Site) sequence and a modification thereof. Examples of sequences and marker sequences for vector selection include drug resistance genes, genes that complement auxotrophic mutations, genes that encode fluorescent proteins, and the like.
リガンドを発現している細胞（好ましくはストローマ細胞）とＥＳ細胞（以下、中胚葉分化誘導したＥＳ細胞を含む）又は心筋前駆細胞あるいは血管前駆細胞（以下、便宜上心筋前駆細胞と血管前駆細胞とを単に「前駆細胞」と総称することもある）とを共生培養する方法は、ＥＳ細胞又は前駆細胞の心筋細胞あるいは血管系細胞への分化誘導が促進されるような条件下で行われる。ストローマ細胞を培養する条件は、最終的にストローマ細胞の層上でＥＳ細胞又は前駆細胞が心筋細胞あるいは血管系細胞へ分化誘導される限り特に限定されないが、通常、ストローマ細胞がコンフルエントな状態になる迄培養する。各ストローマ細胞について既に知られている方法に準じて培養液、培養ｐＨ及び培養温度を設定することができる。ストローマ細胞がコンフルエントな状態となり、培養皿、プレート等に層を形成した時点で、ＥＳ細胞又は前駆細胞の細胞懸濁液をその層上に播種する。播種後、通常６〜８日間、好ましくは７日間、３６．５〜３７．５℃、好ましくは３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、ストローマ細胞との共生培養を行う。上記した培養条件は、用いるＥＳ細胞又は前駆細胞、及びストローマ細胞の種類や状況に応じて適宜変更することができる。 Ligand expressing cells (preferably stromal cells) and ES cells (hereinafter including ES cells induced to induce mesoderm differentiation) or myocardial progenitor cells or vascular progenitor cells (hereinafter referred to as myocardial progenitor cells and vascular progenitor cells for convenience) The method of symbiotically cultivating ES cells or progenitor cells together (sometimes collectively referred to simply as “progenitor cells”) is performed under conditions that promote the differentiation of ES cells or progenitor cells into cardiomyocytes or vascular cells. The conditions for culturing stromal cells are not particularly limited as long as ES cells or progenitor cells are finally induced to differentiate into cardiomyocytes or vascular cells on the layer of stromal cells, but usually the stromal cells become confluent. Incubate until complete. The culture solution, culture pH, and culture temperature can be set according to a method already known for each stromal cell. When stromal cells become confluent and a layer is formed on a culture dish, plate, or the like, a cell suspension of ES cells or progenitor cells is seeded on the layer. After seeding, co-culture with stromal cells is usually performed for 6 to 8 days, preferably 7 days, at 36.5 to 37.5 ° C., preferably at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere. The culture conditions described above can be appropriately changed according to the type and situation of the ES cell or progenitor cell and stromal cell used.
本発明の別の態様においては、Ｎｏｔｃｈ受容体とリガンドとの接触は、単離されたリガンドを含有する媒体中でＮｏｔｃｈ受容体を発現している細胞（本発明においてはＥＳ細胞や前駆細胞）を培養することによって行ってもよい。単離されたリガンドを用いる場合でも、ＥＳ細胞又は前駆細胞は平面培養に適するようにストローマ細胞と共生培養することが望ましい。リガンドは、（１）該リガンドを産生する細胞または組織の培養物を原料として単離精製する方法、（２）化学的に合成する方法又は（３）遺伝子組換え技術等により該リガンドを発現するように操作された細胞から精製する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。
本発明においてリガンドの単離精製は、例えば以下のようにして行うことができる。すなわち適当な液体培地中で、該リガンドを発現している細胞を培養し、得られる培養物から公知の方法で抽出、精製する。当該抽出、精製の方法は目的生成物の存在する画分に応じて適宜公知の手法が用いられる。
In another embodiment of the present invention, the contact between the Notch receptor and the ligand is performed by cells expressing the Notch receptor in a medium containing the isolated ligand (in the present invention, ES cells and progenitor cells). You may carry out by culturing. Even when an isolated ligand is used, it is desirable to co-cultivate ES cells or progenitor cells with stromal cells so as to be suitable for planar culture. The ligand is expressed by (1) a method of isolating and purifying a culture of cells or tissues producing the ligand as a raw material, (2) a method of chemically synthesizing, or (3) a gene recombination technique or the like. Thus, it can obtain by using well-known methods, such as the method of refine | purifying from the operated cell suitably.
In the present invention, the ligand can be isolated and purified, for example, as follows. That is, cells expressing the ligand are cultured in an appropriate liquid medium, and extracted and purified from the obtained culture by a known method. As the extraction and purification methods, known methods are appropriately used depending on the fraction containing the target product.
化学合成による場合は、該リガンドをコードする塩基配列を基にして、該配列の全部または一部がコードするアミノ酸を特定し、該アミノ酸をペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。 In the case of chemical synthesis, the amino acid encoded by all or part of the sequence is specified based on the base sequence encoding the ligand, and the amino acid is synthesized or semi-synthesized using a peptide synthesizer. be able to.
リガンドを含有する媒体中でのＮｏｔｃｈ受容体を発現している細胞の培養方法は、当該リガンドがＮｏｔｃｈ受容体に結合してＮｏｔｃｈ伝達経路を活性化し、心筋細胞あるいは血管系細胞を誘導する限り特に限定されない。媒体としては、ＥＳ細胞や前駆細胞の生存ならびに心筋あるいは血管系細胞への分化誘導に不利とならない限り特に限定されず、具体的には、細胞の培養液や緩衝液等が挙げられる。ＥＳ細胞又は前駆細胞を単離されたリガンドを含有する媒体中、通常６〜８日間、好ましくは７日間、３６．５〜３７．５℃、好ましくは３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養する。必要に応じて媒体交換を行う。これらの培養条件は、用いるＥＳ細胞又は前駆細胞の種類や状況に応じて適宜変更することができる。 The method for culturing cells expressing a Notch receptor in a medium containing a ligand is particularly suitable as long as the ligand binds to the Notch receptor and activates the Notch transmission pathway to induce cardiomyocytes or vascular cells. It is not limited. The medium is not particularly limited as long as it is not disadvantageous for survival of ES cells and progenitor cells and differentiation induction into myocardial or vascular cells, and specific examples include cell culture solutions and buffer solutions. ES cells or progenitor cells are usually cultured in a medium containing the isolated ligand for 6 to 8 days, preferably 7 days, at 36.5 to 37.5 ° C., preferably at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere. To do. Replace media as necessary. These culture conditions can be appropriately changed according to the type and situation of the ES cell or progenitor cell used.
本発明のＥＳ細胞から心筋細胞あるいは血管系細胞を培養増殖する方法、及び前駆細胞から心筋細胞あるいは血管系細胞を培養増殖する方法を用いれば、より効率よく心筋細胞や血管系細胞を得ることができる。 By using the method of culturing and proliferating cardiomyocytes or vascular cells from ES cells of the present invention and the method of culturing and proliferating cardiomyocytes or vascular cells from precursor cells, cardiomyocytes and vascular cells can be obtained more efficiently. it can.
心筋細胞の存在確認は、細胞の拍動能や心筋特異的遺伝子の発現の有無を解析することによって行われる。心筋特異的遺伝子としては心筋トロポニンＴ（ｃＴｎ−Ｔ）、αミオシン重鎖（αＭＨＣ）、転写因子Ｎｋｘ２−５等が挙げられる。拍動能の有無は顕微鏡を用いた形態学的な観察により確認することができる。心筋特異的遺伝子の発現の有無は、当該遺伝子がコードしている心筋特異的蛋白質の発現をそれら蛋白質の抗体を用いて解析すること（例えばウェスタンブロッティング）によって、あるいは当該遺伝子の発現を当該遺伝子に相補的な配列を有する（ポリ）ヌクレオチドを用いて解析すること（例えばノザンブロッティング）等によって確認することができる。 The presence of cardiomyocytes is confirmed by analyzing the beating ability of the cells and the presence or absence of expression of a myocardial specific gene. Examples of the myocardial specific gene include cardiac troponin T (cTn-T), α myosin heavy chain (αMHC), transcription factor Nkx2-5 and the like. The presence or absence of pulsation ability can be confirmed by morphological observation using a microscope. The presence or absence of expression of a myocardial specific gene can be determined by analyzing the expression of a myocardial specific protein encoded by the gene using an antibody of the protein (for example, Western blotting), or by expressing the expression of the gene in the gene. It can be confirmed by analyzing using (poly) nucleotide having a complementary sequence (for example, Northern blotting).
血管系細胞の存在確認は、特徴的な血管の網状構造の形成や血管内皮細胞に特異的な遺伝子の発現や血管平滑筋細胞に特異的な遺伝子の発現の有無を解析することによって行われる。血管内皮細胞に特異的な遺伝子としてはＣＤ３１、ＶＥカドヘリン等が、血管平滑筋に特異的な遺伝子としては、α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）等が挙げられる。網状の血管構造の形成は、顕微鏡を用いた形態学的な観察により確認することができる。特異的遺伝子の発現の有無は、当該遺伝子がコードしている特異的蛋白質の発現をそれら蛋白質の抗体を用いて解析すること（例えばウェスタンブロッティング）によって、あるいは当該遺伝子の発現を当該遺伝子に相補的な配列を有する（ポリ）ヌクレオチドを用いて解析すること（例えばノザンブロッティング）等によって確認することができる。 The presence of vascular cells is confirmed by analyzing the formation of characteristic vascular network structures, the expression of genes specific to vascular endothelial cells, and the presence or absence of expression of genes specific to vascular smooth muscle cells. Examples of genes specific to vascular endothelial cells include CD31 and VE cadherin, and examples of genes specific to vascular smooth muscle include α-smooth muscle actin (α-SMA). Formation of a reticulated blood vessel structure can be confirmed by morphological observation using a microscope. The presence or absence of the expression of a specific gene can be determined by analyzing the expression of a specific protein encoded by the gene using an antibody of the protein (for example, Western blotting), or the expression of the gene is complementary to the gene. This can be confirmed by analysis using a (poly) nucleotide having a proper sequence (for example, northern blotting).
本発明の方法によって得られる心筋細胞を心筋移植に用いる場合は、培養皿の代わりに心筋移植用の生理学的に許容される担体上で心筋細胞への分化誘導を行って得られる心筋移植片を用いることができる。担体としては、ポリグリコール酸（Poly glycolic acid（ＰＧＡ））、ポリ乳酸（Poly lactic acid（ＰＬＡ））、ポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体（lactic-co-glycolic acid（ＰＬＧＡ））、ポリカプロラクトン（Polycaprolactone）等の非生物由来のもの、界面活性剤やリボヌクレアーゼ等を用いて脱細胞化処理を施すことによって得られるコラーゲンやエラスチン等の細胞外マトリックスからなる組織、コラーゲンやエラスチン等の細胞外マトリックス成分を用いて人工的に構成した組織等の生物由来のものが挙げられる。
本発明の方法によって得られる心筋細胞は、心筋梗塞の治療、心筋変性疾患の治療、筋ジストロフィーの治療等に有望である。
When the cardiomyocytes obtained by the method of the present invention are used for myocardial transplantation, a myocardial graft obtained by inducing differentiation into cardiomyocytes on a physiologically acceptable carrier for myocardial transplantation instead of a culture dish is used. Can be used. Carriers include polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), polylactic acid-polyglycolic acid copolymer (PLGA), polycaprolactone (Polycaprolactone) and other non-biological substances, tissues made from an extracellular matrix such as collagen and elastin obtained by applying a decellularization treatment using a surfactant, ribonuclease, etc., and an extracellular matrix such as collagen and elastin Examples include those derived from living organisms such as tissues artificially constructed using components.
The cardiomyocytes obtained by the method of the present invention are promising for the treatment of myocardial infarction, the treatment of myocardial degenerative diseases, the treatment of muscular dystrophy, and the like.
本発明の方法によって得られる血管系細胞は、虚血疾患部位に移植することが可能であり、血管再生医療に好適に用いることができる。例えば、人工血管への応用、血管移植への適用、血管障害への応用等が期待できる。 Vascular cells obtained by the method of the present invention can be transplanted to an ischemic disease site and can be suitably used for revascularization medicine. For example, application to artificial blood vessels, application to blood vessel transplantation, application to vascular disorders and the like can be expected.
さらに本発明はＮｏｔｃｈリガンド（好ましくはＤＬ１）を含有する、心筋細胞又は血管系細胞の培養、好ましくはＥＳ細胞（中胚葉分化誘導したものも含む）、心筋前駆細胞、血管前駆細胞から心筋細胞又は血管系細胞を培養増殖する為の培地を提供する。該培地としては、通常ＥＳ細胞や前駆細胞を培養するのに用いられる培地に、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現しているストローマ細胞を含有させるか、又はＮｏｔｃｈリガンド自体を当該培地に含めることによって、調製することができる。
培地中のＮｏｔｃｈリガンドの量は、用いるリガンドの種類等によって異なるが、細胞の生育状況、分化誘導の程度等に応じて適宜設定される。
Furthermore, the present invention provides a culture of cardiomyocytes or vascular cells containing Notch ligand (preferably DL1), preferably ES cells (including those induced by mesoderm differentiation), myocardial progenitors, vascular progenitors to A medium for culturing and proliferating vascular cells is provided. As the medium, a medium usually used for culturing ES cells and progenitor cells contains stromal cells expressing Notch ligand, or prepared by including Notch ligand itself in the medium. Can do.
The amount of Notch ligand in the medium varies depending on the type of ligand used and the like, but is appropriately set according to the growth state of the cell, the degree of differentiation induction, and the like.
以下実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、実施例は本発明の説明のために記載するものであり、本発明を限定するものではない。
実施例１：心臓形成及び血管形成への影響
Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化がＥＳ細胞の分化（心臓形成、血管形成）にどのような影響を与えるかを調べた。Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化は、ＮｏｔｃｈリガンドであるＤＬ１を発現するストローマ細胞との共生培養により行った。手順を図１に示す。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the examples are described for explaining the present invention and are not intended to limit the present invention.
Example 1 Influence on Cardiogenesis and Angiogenesis It was investigated how the activation of Notch signaling affects ES cell differentiation (cardiogenesis, angiogenesis). The activation of Notch signaling was performed by symbiotic culture with stromal cells expressing DL1, which is a Notch ligand. The procedure is shown in FIG.
［材料と方法］
（１）ＥＳ細胞
マウス由来ＥＳ細胞株ＥＢ５細胞を用いて分化誘導を解析した。ＥＢ５細胞は丹羽仁史博士（理研発生・再生科学総合研究センター）から供与された。ＥＢ５細胞は、Ｅ１４ｔｇ２α ＥＳ細胞に、Ｏｃｔ−３／４遺伝子プロモーター下流に薬剤耐性遺伝子であるAspergillus blastcidin S deamininase遺伝子をＩＲＥＳ配列を用いてノックインした細胞である（Niwa H, Miyazaki J, Smith AG. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat Genet. 2000; 24: 372-376）。ＥＢ５細胞を、０．１％ゼラチン（タイプＡ）（Sigma-Aldrich Japan, Tokyo Japan）でコーティングした培養皿を用い、１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Equitech-Bio, Kerrville, Tx）、１０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標）血清リプレースメント（Invitrogen）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Invitrogen）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）、及び２０００Ｕ／ｍｌ マウスＬＩＦ（Chemicon International, Temecula, CA）を補充したα最小必須培地（αＭＥＭ；Invitrogen, Tokyo, Japan）中で培養した。ＬＩＦ存在下、Ｏｃｔ−３／４ ｌｏｃｕｓに耐性遺伝子を挿入した結果としての分化を抑制する目的でブラストサイジン（５００μｇ／ｍｌ；Invitrogen）を添加した。ゼラチンコートは、ゼラチン／蒸留水を培養皿上に積層し常温で固相化することによって行った。
[Materials and methods]
(1) ES cells Differentiation induction was analyzed using mouse-derived ES cell line EB5 cells. EB5 cells were provided by Dr. Hitoshi Niwa (RIKEN Research Center for Developmental and Regenerative Sciences). EB5 cells are cells in which an Aspergillus blastcidin S deamininase gene, which is a drug resistance gene, is knocked into E14tg2α ES cells downstream of the Oct-3 / 4 gene promoter using an IRES sequence (Niwa H, Miyazaki J, Smith AG. Quantitative expression of Oct-3 / 4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nat Genet. 2000; 24: 372-376). Using a culture dish coated with EB5 cells with 0.1% gelatin (type A) (Sigma-Aldrich Japan, Tokyo Japan), 1% fetal bovine serum (FBS; Equitech-Bio, Kerrville, Tx), 10% KnockOut ® serum replacement (Invitrogen), 0.1 mM non-essential amino acid (Invitrogen), 1 mM sodium pyruvate (Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol (2ME), and 2000 U / ml mouse LIF (Chemicon International, Temecula , CA) and cultured in an α minimum essential medium (αMEM; Invitrogen, Tokyo, Japan). In the presence of LIF, blasticidin (500 μg / ml; Invitrogen) was added for the purpose of suppressing differentiation as a result of inserting a resistance gene into Oct-3 / 4 locus. Gelatin coating was performed by laminating gelatin / distilled water on a culture dish and solidifying it at room temperature.
（２）ストローマ細胞
ストローマ細胞としてはＯＰ９細胞とＭＣ３Ｔ３−Ｅ（以下、ＭＣ３Ｔ３と称する）細胞とを用いた。
ストローマ細胞株ＯＰ９（Riken Bio-Resource Center (BRC)； Tsukuba, Japan)を２０％ＦＢＳ（JRH Biosciences, Lenexa, IA）を補充したαＭＥＭで維持培養した。
マウスＤｅｌｔａ ｌｉｋｅ １（ＤＬ１）ｃＤＮＡ（Gene Bank Acc. No. NM_007865 nucleotide seq. 348-2516）を、８．５日齢のマウス全胚から逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によりクローニングし、レトロウイルスベクターｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ｈｕ−ｅｘｔ ＮＧＦＲ（ＭＩＮ）にサブクローニングしてＤＬ１発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをＯＰ９細胞にトランスフェクションし、ＤＬ１を発現するＯＰ９細胞（ＯＰ９−ＤＬ１）を得た。安定なＯＰ９−ＤＬ１を得るため、ＤＬ１が導入されたＯＰ９細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）（BD Biosciences, San Jose, CA）を用いてｈｕＮＧＦＲ発現の有無で選別し、ＯＰ９細胞と同様の培地で維持培養した。一方、対照実験に用いるため、ＤＬ１ｃＤＮＡを含まない空のベクターをトランスフェクションしたＯＰ９細胞（ＯＰ９−ｍｏｃｋ）を調製した。
別のストローマ細胞株として、ＭＣ３Ｔ３細胞（Riken Bio-Resource Center (BRC); Tsukuba, Japan）を用いた。ＭＣ３Ｔ３細胞は、１０％ＦＢＳ（JRH Biosciences, Lenexa, IA）を補充したαＭＥＭ中で維持培養した。ＭＣ３Ｔ３細胞についても、ＯＰ９−ＤＬ１細胞を調製したのと同様な手順でＤＬ１発現ベクターをトランスフェクションしてＤＬ１を発現するＭＣ３Ｔ３細胞（ＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１）細胞を得た。安定なＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１を得るため、ＤＬ１が導入されたＭＣ３Ｔ３細胞をＦＡＣＳＡｒｉａを用いてｈｕＮＧＦＲ発現の有無で選別し、ＭＣ３Ｔ３細胞と同様の培地で維持培養した。一方、対照実験に用いるため、ＤＬ１ｃＤＮＡを含まない空のベクターをトランスフェクションしたＭＣ３Ｔ３細胞（ＭＣ３Ｔ３−ｍｏｃｋ）を調製した。
これらのストローマ細胞を、コロニー数の計測の為には６ウェルの、細胞レベルでの染色の為には８ウェルのチャンバースライド（Nalge Nunc International, Rochester, NY）にそれぞれ播種した。
(2) Stromal cells OP9 cells and MC3T3-E (hereinafter referred to as MC3T3) cells were used as stromal cells.
The stromal cell line OP9 (Riken Bio-Resource Center (BRC); Tsukuba, Japan) was maintained and cultured in αMEM supplemented with 20% FBS (JRH Biosciences, Lenexa, IA).
Mouse Delta like 1 (DL1) cDNA (Gene Bank Acc. No. NM — 007865 nucleotide seq. 348-2516) was cloned from 8.5 day old mouse whole embryos by reverse transcription polymerase chain reaction and retroviral vector pMSCV-IRES. -DL1 expression vector was constructed by subcloning into hu-ext NGFR (MIN). The obtained expression vector was transfected into OP9 cells to obtain OP9 cells (OP9-DL1) expressing DL1. In order to obtain stable OP9-DL1, OP9 cells introduced with DL1 are selected with or without huNGFR expression using FACSAria (registered trademark) (BD Biosciences, San Jose, Calif.) And maintained in the same medium as OP9 cells. Cultured. On the other hand, for use in a control experiment, OP9 cells (OP9-mock) transfected with an empty vector not containing DL1 cDNA were prepared.
MC3T3 cells (Riken Bio-Resource Center (BRC); Tsukuba, Japan) were used as another stromal cell line. MC3T3 cells were maintained in αMEM supplemented with 10% FBS (JRH Biosciences, Lenexa, IA). For MC3T3 cells, a DL1 expression vector was transfected by the same procedure as that for preparing OP9-DL1 cells to obtain MC3T3 cells (MC3T3-DL1) cells expressing DL1. In order to obtain stable MC3T3-DL1, MC3T3 cells into which DL1 had been introduced were selected based on the presence or absence of huNGFR expression using FACSAria, and maintained in the same medium as MC3T3 cells. On the other hand, MC3T3 cells (MC3T3-mock) transfected with an empty vector not containing DL1 cDNA were prepared for use in control experiments.
These stromal cells were seeded in 6-well chamber slides (Nalge Nunc International, Rochester, NY) for counting colonies and 8-well for cell-level staining, respectively.
（３）中胚葉分化誘導
中胚葉細胞への分化を誘導する為に、ＥＢ５細胞を０．１％ゼラチンでコートした培養皿上、１０％ＦＢＳ(Invitrogen)と５０μｍｏｌ／Ｌ ２−ＭＥを含有するαＭＥＭをベースとする分化用培地（ＬＩＦとブラストサイジンは含まない）中で５日間培養した。
(3) Induction of mesoderm differentiation In order to induce differentiation into mesoderm cells, EB5 cells contain 10% FBS (Invitrogen) and 50 μmol / L 2-ME on a culture dish coated with 0.1% gelatin. The cells were cultured for 5 days in a differentiation medium based on αMEM (without LIF and blasticidin).
（４）ストローマ細胞との共生培養
上記（３）の中胚葉分化誘導５日後、１×１０４細胞をＦＡＣＳ解析によりＦｌｋ−１とＰＤＧＦＲαの発現様式によって４つの集団に分画し、それぞれコンフルエントになったＯＰ９−ｍｏｃｋ、ＯＰ９−ＤＬ１、ＭＣ３Ｔ３−ｍｏｃｋ又はＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１細胞と、６ウェルプレート中、各ストローマ細胞を維持培養していた培地を用いて共生培養した。共生培養８日後、拍動している細胞を含むコロニー（拍動細胞コロニー）と浮遊性細胞のコロニーの数を計測した。
分画された４つの集団（Ｆ：Ｆｌｋ−１、Ｐ：ＰＤＧＦＲα）は以下の通りである。
Ｆ＋Ｐ＋：Ｆｌｋ−１及びＰＤＧＦＲαともに発現している
Ｆ＋Ｐ−：Ｆｌｋ−１のみ発現している
Ｆ−Ｐ＋：ＰＤＧＦＲαのみ発現している
Ｆ−Ｐ−：Ｆｌｋ−１及びＰＤＧＦＲαともに発現していない
ＦＡＣＳ（Fluorescence activated cell sorting）解析
１０ｃｍ培養皿上で分化誘導して５日後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ緩衝液（Invitrogen）を用いてＥＢ５細胞の単一細胞懸濁液を調製した。細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、細胞表面の蛋白質が再出現するよう、分化用培地中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で３０分間培養した。回収した細胞を、フィコエリトリン（phycoerythrin：ＰＥ）がコンジュゲートされた抗Ｆｌｋ−１モノクローナル抗体（ＡＶＡＳ１２；理化学研究所 西川伸一博士から譲り受けた）及びビオチンがコンジュゲートされた抗ＰＤＧＦＲαモノクローナル抗体（ＡＰＡ５；理化学研究所 西川伸一博士から譲り受けた）で染色した。ビオチン化された抗体は、ストレプトアビジン−アロフィコシアニンＣｙ７（ＡＰＣ−Ｃｙ７；BD Biosciences, Pharmingen, San Jose, CA）で検出した。ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）（BD Biosciences, San Jose, CA）を用いて細胞を選別し、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェア（BD Biosciences）を用いて解析した。
(4) Symbiotic culture with stromal cells 5 days after induction of mesoderm differentiation in (3) above, 1 × 10 4 cells were fractionated into four populations by FACS analysis according to the expression pattern of Flk-1 and PDGFRα, and each was confluent. The resulting OP9-mock, OP9-DL1, MC3T3-mock or MC3T3-DL1 cells were co-cultured using a medium in which each stromal cell was maintained in a 6-well plate. After 8 days of co-cultivation, the number of colonies containing pulsating cells (pulsatile cell colonies) and floating cells were counted.
The four fractionated populations (F: Flk-1, P: PDGFRα) are as follows.
F + P +: both Flk-1 and PDGFRα are expressed F + P−: only Flk-1 is expressed F−P +: only PDGFRα is expressed F−P−: both Flk-1 and PDGFRα are not expressed
FACS (Fluorescence activated cell sorting) analysis Five days after induction of differentiation on a 10 cm culture dish, a single cell suspension of EB5 cells was prepared using 0.05% trypsin-EDTA buffer (Invitrogen). The cells were washed with a phosphate buffer (PBS) and cultured in a differentiation medium at 37 ° C. for 30 minutes in a 5% CO 2 atmosphere so that the cell surface protein reappears. The recovered cells were treated with anti-Flk-1 monoclonal antibody conjugated with phycoerythrin (PE) (AVAS12; received from Dr. Shinichi Nishikawa, RIKEN) and biotin-conjugated anti-PDGFRα monoclonal antibody (APA5; RIKEN). Stained by Dr. Shinichi Nishikawa). Biotinylated antibodies were detected with streptavidin-allophycocyanin Cy7 (APC-Cy7; BD Biosciences, Pharmingen, San Jose, CA). Cells were sorted using FACSAria® (BD Biosciences, San Jose, Calif.) And analyzed using FACS Diva software (BD Biosciences).
（５）生細胞染色と免疫蛍光染色
８ウェルチャンバースライド中、ＯＰ９−ｍｏｃｋ、ＯＰ９−ＤＬ１、ＭＣ３Ｔ３−ｍｏｃｋ又はＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１ストローマ細胞層上で培養された拍動細胞コロニーを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用い室温で１０分間固定し、メタノールで１０分間処理して膜透過性とした。続いて血清を含まないＰｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｘ０９０９（DAKO Japan, Tokyo, Japan）を用い室温で３０分間ブロッキング処理を行った。抗心筋トロポニンＴ（ｃＴｎ−Ｔ）抗体及び抗心筋トロポニンＩ（ｃＴｎ−Ｉ）抗体（いずれも、NeoMarker, USA; 1:100）、抗ＣＤ３１抗体（BD Pharmingen; 1:100）をＰｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋで希釈し、室温で１時間、細胞とインキュベートした。続いて二次抗体であるＦＩＴＣ又はＰＥがコンジュゲートされた抗イムノグロブリン抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; 1:100）で処理した。ＰＢＳで洗浄した後、試料を蛍光顕微鏡（IX71-ARCEVA Olympus, Tokyo, Japan）で観察した。生細胞染色は、Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ（赤色、Biomed Technology Inc. Stoughton, MA）及びＡｌｅｘａ４８８−Ａｃ−ＬＤＬ（緑色、Molecular Probes, Inc.Eugene, OR）を用いて行った。
(5) Live cell staining and immunofluorescence staining In an 8-well chamber slide, pulsatile cell colonies cultured on OP9-mock, OP9-DL1, MC3T3-mock or MC3T3-DL1 stromal cell layer were treated with 4% paraformaldehyde (PFA). ) For 10 minutes at room temperature and treated with methanol for 10 minutes to make it membrane permeable. Subsequently, blocking treatment was performed at room temperature for 30 minutes using Protein Block X0909 (DAKO Japan, Tokyo, Japan) without serum. Anti-cardiac troponin T (cTn-T) antibody and anti-cardiac troponin I (cTn-I) antibody (both NeoMarker, USA; 1: 100) and anti-CD31 antibody (BD Pharmingen; 1: 100) are diluted with Protein Block And incubated with the cells for 1 hour at room temperature. Subsequently, it was treated with an anti-immunoglobulin antibody conjugated with a secondary antibody FITC or PE (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA; 1: 100). After washing with PBS, the sample was observed with a fluorescence microscope (IX71-ARCEVA Olympus, Tokyo, Japan). Live cell staining was performed using Dil-Ac-LDL (red, Biomed Technology Inc. Stoughton, MA) and Alexa488-Ac-LDL (green, Molecular Probes, Inc. Eugene, OR).
［結果］
自律拍動する細胞を含むコロニーの産生におけるＮｏｔｃｈリガンド（ＤＬ１）介在性のシグナル伝達の影響を調べるために、４分画したＥＢ５（Ｆ＋Ｐ＋、Ｆ＋Ｐ−、Ｆ−Ｐ＋、Ｆ−Ｐ−）をＯＰ９−ｍｏｃｋ又はＯＰ９−ＤＬ１と共生培養した。各画分から得られる拍動細胞コロニーの数をスコア化した（図２Ａ）。全ての画分において、ＤＬ１介在性のシグナル伝達を刺激することにより拍動コロニー数が増えている（心筋への分化を促進している）。特に、Ｆｌｋ−１陽性（Ｆ＋）でＰＤＧＦＲα陽性（Ｐ＋）の画分（Ｆ＋Ｐ＋）から自発的な拍動を伴うコロニーが、効率的に産生された。又、Ｆｌｋ−１陰性（Ｆ−）でＰＤＧＦＲα陽性（Ｐ＋）の画分（Ｆ−Ｐ＋）は、コロニー数は（Ｆ＋Ｐ＋）画分に比べると少ないものの、刺激していない場合に比べるとその増加率が高かった。この結果に基づいて、さらに、ＤＬ１が定常的にトランスフェクトされたＭＣ３Ｔ３細胞（ＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１）又は空のベクターでトランスフェクトされたＭＣ３Ｔ３細胞（ＭＣ３Ｔ３−ｍｏｃｋ）とともに共生培養することによってＤＬ１介在性のシグナル伝達を調べた。ＭＣ３Ｔ３細胞は、Ｆ＋Ｐ＋画分の細胞の造血系への分化誘導をサポートする（図２Ｂ−ｂ）が、心筋への分化誘導はサポートしない（図２Ｂ−ａ）。一方、図２Ｂ−ａに示すように、ＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１細胞と共生培養した細胞において拍動細胞コロニー数が顕著に増加した。一方、図２Ｂ−ｂに示すように、ＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１細胞と共生培養した場合には、浮遊性細胞のコロニー数が減少した。Ａｃ−ＬＤＬによる生細胞の蛍光染色は、ＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１との共生培養によって産生される拍動コロニーがＡｃ−ＬＤＬ陽性の接着した内皮様細胞に取り囲まれていることを示している（図２Ｂ−ｃ，ｄ，ｅ）。一方、ＭＣ３Ｔ３−ｍｏｃｋ細胞上の浮遊性細胞のコロニーは、Ａｃ−ＬＤＬ陽性の丸い形の浮遊性細胞のみで構成されており、接着細胞も内皮様細胞もＡｃ−ＬＤＬ染色では観察されなかった（図２Ｂ−ｆ，ｇ，ｈ）。ＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１上で形成されたコロニーを固定し、心筋特異的構造分子であるトロポニンＴ（ｃＴｎ−Ｔ）及び内皮細胞表面マーカーＣＤ３１で染色した（図２Ｃ）。図２Ｃ−ａに示すように、Ｆ＋Ｐ＋画分及びＦ＋Ｐ−画分の細胞においてｃＴｎ−Ｔを発現している細胞コロニー数がＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１細胞と共生培養することにより顕著に増加した。さらに、図２Ｃ−ｂに示すように、ＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１細胞と共生培養した場合には、全ての画分において、ＭＣ３Ｔ３−ｍｏｃｋとの共生培養では観察されなかった、ＣＤ３１発現細胞が出現した。また、抗ｃＴｎ−Ｉ抗体と抗ＣＤ３１抗体とを用いた二重染色により、拍動する細胞を含むコロニーの多くは抗ｃＴｎ−Ｉ抗体染色に陽性であること、放射状のネットワークを形成するＣＤ３１陽性の内皮様細胞を伴っていたことが示された（図３Ａ）。
以上の結果より、ＥＳ細胞を、ＤＬ１を発現しているストローマ細胞と共生培養することにより、ＤＬ１を発現しないストローマ細胞との共生培養と比較してより高収率で心筋細胞及び血管系細胞を得ることができることがわかる。
[result]
In order to investigate the influence of Notch ligand (DL1) -mediated signal transduction on the production of colonies containing autonomously beating cells, four fractionated EB5 (F + P +, F + P−, FP +, FP−) were treated with OP9. -Co-cultured with mock or OP9-DL1. The number of beating cell colonies obtained from each fraction was scored (FIG. 2A). In all fractions, the number of beating colonies is increased by stimulating DL1-mediated signaling (promoting differentiation into myocardium). In particular, colonies with spontaneous pulsations were efficiently produced from the Flk-1 positive (F +) and PDGFRα positive (P +) fraction (F + P +). In addition, the Flk-1 negative (F-) and PDGFRα positive (P +) fraction (F-P +) has a smaller number of colonies than the (F + P +) fraction, but increases compared to the unstimulated case. The rate was high. Based on this result, DL1-mediated by further co-culturing with MC3T3 cells (MC3T3-DL1) constitutively transfected with DL1 or MC3T3 cells (MC3T3-mock) transfected with an empty vector. Signal transduction was examined. MC3T3 cells support the differentiation induction of the F + P + fraction into the hematopoietic system (FIG. 2B-b), but do not support the differentiation induction into the myocardium (FIG. 2B-a). On the other hand, as shown in FIG. 2B-a, the number of beating cell colonies was significantly increased in cells co-cultured with MC3T3-DL1 cells. On the other hand, as shown in FIG. 2B-b, when co-cultivated with MC3T3-DL1 cells, the number of colonies of suspension cells decreased. Fluorescent staining of living cells with Ac-LDL shows that beating colonies produced by co-cultivation with MC3T3-DL1 are surrounded by adherent endothelial-like cells that are positive with Ac-LDL (FIG. 2B-). c, d, e). On the other hand, colonies of suspension cells on MC3T3-mock cells are composed of only Ac-LDL positive round suspension cells, and neither adherent cells nor endothelial cells were observed by Ac-LDL staining ( FIG. 2B-f, g, h). Colonies formed on MC3T3-DL1 were fixed and stained with troponin T (cTn-T), which is a cardiac muscle-specific structural molecule, and endothelial cell surface marker CD31 (FIG. 2C). As shown in FIG. 2C-a, the number of cell colonies expressing cTn-T in the F + P + fraction and F + P- fraction cells was significantly increased by co-culturing with MC3T3-DL1 cells. Furthermore, as shown in FIG. 2C-b, when co-cultivated with MC3T3-DL1 cells, CD31-expressing cells that were not observed in co-culture with MC3T3-mock appeared in all fractions. In addition, due to double staining using anti-cTn-I antibody and anti-CD31 antibody, many colonies containing pulsating cells are positive for anti-cTn-I antibody staining, and CD31 positive that forms a radial network It was shown that it was accompanied by an endothelium-like cell (FIG. 3A).
From the above results, it is possible to obtain cardiomyocytes and vascular cells at higher yields by co-culturing ES cells with stromal cells expressing DL1, compared to symbiotic culture with stromal cells not expressing DL1. It can be seen that it can be obtained.
実施例２：造血系への影響
Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化がＥＳ細胞の造血系細胞への分化にどのような影響を与えるか調べた。Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化は、実施例１同様、ＮｏｔｃｈリガンドであるＤＬ１を発現するストローマ細胞との共生培養により行った。手順を図１に示す。
Example 2: Influence on the hematopoietic system It was examined how the activation of Notch signaling affects the differentiation of ES cells into hematopoietic cells. As in Example 1, activation of Notch signaling was performed by co-cultivation with stromal cells expressing DL1, which is a Notch ligand. The procedure is shown in FIG.
［材料と方法］
（１）細胞
ＥＳ細胞及びストローマ細胞は、実施例１と同様のものを用いた。ＥＳ細胞は、実施例１同様、ゼラチンコートした培養皿上で培養することにより中胚葉分化誘導をしてから用いた。
（２）ストローマ細胞との共生培養
実施例１同様、Ｆｌｋ−１とＰＤＧＦＲαの発現様式によって４つの集団に分画し、それぞれコンフルエントになったＯＰ９−ｍｏｃｋ、ＯＰ９−ＤＬ１、ＭＣ３Ｔ３−ｍｏｃｋ又はＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１細胞と、６ウェルプレート中、各ストローマ細胞を維持培養していた培地を用いて共生培養した。
[Materials and methods]
(1) Cells The same ES cells and stromal cells as in Example 1 were used. ES cells were used after induction of mesoderm differentiation by culturing on gelatin-coated culture dishes as in Example 1.
(2) Co-cultivation with stromal cells As in Example 1, OP9-mock, OP9-DL1, MC3T3-mock, or MC3T3-fractionated into four populations according to the expression patterns of Flk-1 and PDGFRα, respectively. The cells were co-cultured with DL1 cells using a medium in which each stromal cell was maintained in a 6-well plate.
（３）造血系細胞のコロニーの形成
上記（２）で得られる、ＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１と共生培養した各画分の細胞から産生される浮遊性細胞のコロニーを回収し、造血系細胞のコロニーを形成させるべくメチルセルロース培地中に再播種した。浮遊性細胞コロニーから回収された細胞（２×１０３）を３ｃｍ培養皿（Falcon BD）上、１．１ｍＬのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ ＣＦ Ｍ３４３４（Stem Cell Technologies Inc., Vancouver Canada）中に播種した。３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１４日間培養後、造血系の細胞コロニーが観察された。
(3) Formation of colonies of hematopoietic cells Collect colonies of floating cells produced from cells of each fraction co-cultured with MC3T3-DL1 obtained in (2) above, and form colonies of hematopoietic cells The seeds were replated in a methylcellulose medium. Cells recovered from suspension cell colonies (2 × 10 3 ) were seeded on 1.1 cm Methocult CF M3434 (Stem Cell Technologies Inc., Vancouver Canada) on 3 cm culture dishes (Falcon BD). After culturing at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 14 days, hematopoietic cell colonies were observed.
（４）ギムザ染色と免疫蛍光染色
（メイ・ギムザ染色）
メチルセルロース培地中で形成された造血系細胞コロニーの形態学的な観察をメイ・ギムザ染色によって行った。
細胞をサイトスピン（Shandon, London UK）でスライド上に固定し、当該分野で周知の方法に従ってメイ・ギムザ溶液で染色した。固定された細胞の形態を光学顕微鏡（Olympus IX71）で観察した。
（免疫蛍光染色）
メチルセルロース培地から細胞を回収し、各種の造血系細胞マーカー；Ｇｒ−１（顆粒球のマーカー）、Ｍａｃ−１（マクロファージのマーカー）、Ｔｅｒ１１９（赤血球のマーカー）及びＣＤ４５（リンパ球細胞のマーカー）の発現状況を調べた。当該分野で周知の方法に従って蛍光ＦＡＣＳ解析を行った。
(4) Giemsa staining and immunofluorescence staining (May Giemsa staining)
Morphological observation of hematopoietic cell colonies formed in methylcellulose medium was performed by May-Giemsa staining.
Cells were fixed on slides with cytospin (Shandon, London UK) and stained with May Giemsa solution according to methods well known in the art. The morphology of the fixed cells was observed with an optical microscope (Olympus IX71).
(Immunofluorescence staining)
Cells were collected from methylcellulose medium, and various hematopoietic cell markers; Gr-1 (granulocyte marker), Mac-1 (macrophage marker), Ter119 (erythrocyte marker) and CD45 (lymphocyte cell marker) The expression status was examined. Fluorescence FACS analysis was performed according to methods well known in the art.
［結果］
ＭＣ３Ｔ３−ｍｏｃｋとの共生培養後にＦ＋Ｐ＋及びＦ＋Ｐ−画分から産生される浮遊性細胞コロニーの数は、ＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１と共生培養することにより減少した（図２Ｂ−ｂ）。このことは、ＤＬ１介在性のシグナル伝達が浮遊性細胞コロニーの産生にネガティブに働いていることを示唆している。ＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１細胞上、Ｆ＋Ｐ−分画から産生された浮遊性細胞コロニーを回収し、造血細胞コロニーを産生すべくメチルセルロース中に再播種した。メチルセルロース中のコロニーの形態学的な観察を図３Ｂ−ａ、ｂに示した。
細胞はＧｒ−１、Ｍａｃ−１あるいはＴｅｒ１１９発現ネガティブであったが、ＣＦＵ−Ｇ（顆粒球コロニー）様のコロニーの概観を呈するＣＤ４５陽性細胞が、ＭＣ３Ｔ３−ｍｏｃｋあるいはＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１と共培養したＦ＋Ｐ＋画分及びＦ＋Ｐ−画分から産生された。Ｆ＋Ｐ−画分の細胞について、抗Ｔｅｒ１１９抗体と抗ＣＤ４５抗体で染色したＦＡＣＳ解析の結果を図３Ｂ−ｃに示す。
ＯＰ９あるいはＯＰ９−ＤＬ１上で各画分から産生されるコロニーの概観及びその数を表２にまとめた。
[result]
The number of suspension cell colonies produced from the F + P + and F + P− fractions after co-cultivation with MC3T3-mock was reduced by co-cultivation with MC3T3-DL1 (FIG. 2B-b). This suggests that DL1-mediated signaling acts negatively on the production of suspension cell colonies. Suspended cell colonies produced from the F + P− fraction were collected on MC3T3-DL1 cells and replated in methylcellulose to produce hematopoietic cell colonies. Morphological observation of colonies in methylcellulose is shown in FIGS. 3B-a and b.
The cells were negative for Gr-1, Mac-1 or Ter119 expression, but CD45 positive cells with a CFU-G (granulocyte colony) -like colony appearance were co-cultured with MC3T3-mock or MC3T3-DL1 F + P + Produced from fraction and F + P- fraction. The results of FACS analysis of the F + P− fraction cells stained with anti-Ter119 antibody and anti-CD45 antibody are shown in FIG. 3B-c.
Table 2 summarizes the appearance and the number of colonies produced from each fraction on OP9 or OP9-DL1.
ＣＦＵ−Ｇ：顆粒球コロニー、ＢＦＵ−Ｅ：赤血球コロニー
ＣＦＵ−ＧＥＭＭ：顆粒球、赤芽球、マクロファージ、巨核球を含むコロニーを形成する多分化能前駆細胞
Ｆ−Ｐ−の未成熟な集団はＣＦＵ−ＧＥＭＭ（colony-forming unit-granulocyte, erythrocyte, monocyte, megakaryocyte）を含み得る。Ｆ＋Ｐ−細胞は既に造血系へと方向付けられていて、ＤＬ１介在性のシグナル伝達の非存在下、ＣＦＵ−Ｇ様のコロニーを生じた。
CFU-G: granulocyte colony, BFU-E: erythrocyte colony CFU-GEMM: pluripotent progenitor cells that form colonies including granulocytes, erythroblasts, macrophages, megakaryocytes An immature population of FP- CFU-GEMM (colony-forming unit-granulocyte, erythrocyte, monocyte, megakaryocyte) may be included. F + P-cells were already directed to the hematopoietic system, resulting in CFU-G-like colonies in the absence of DL1-mediated signaling.
実施例３：阻害剤の使用
ＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１細胞と共生培養することによって観察された現象がＮｏｔｃｈシグナル伝達機構に特異的であるのかどうかを確認するために、Ｆ＋Ｐ＋画分あるいはＦ＋Ｐ−画分から産生された、拍動細胞コロニーの数と浮遊性細胞のコロニーの数とをγセクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴ（Ｓｉｇｍａ）１０μＭの存在下で７日間培養後に測定しスコア化した。対照として、ＤＡＰＴの溶媒であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を同量用いた。同様に何も添加しない場合についても測定した。
図４Ａに示されるように、ＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１との共生培養により拍動細胞のコロニー数を増加させる効果はＮｏｔｃｈシグナル阻害剤（γセクレターゼ阻害剤、ＤＡＰＴ）の存在下で弱められた。さらにＭＣ３Ｔ３−ＤＬ１との共生培養による造血系細胞のコロニー数を減少させる効果も、ＤＡＰＴの存在下で弱められた（図４Ｂ）。これらの結果は、Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化が心筋細胞、血管系細胞又は造血系細胞の細胞数の増減に極めて重要な役割を果たしていることを示唆している。
Example 3: Use of inhibitors Produced from F + P + or F + P- fractions to confirm whether the phenomenon observed by co-culturing with MC3T3-DL1 cells is specific for the Notch signaling mechanism The number of beating cell colonies and the number of floating cell colonies were measured and scored after 7 days of culture in the presence of 10 μM γ-secretase inhibitor DAPT (Sigma). As a control, the same amount of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent for DAPT was used. Similarly, the case where nothing was added was also measured.
As shown in FIG. 4A, the effect of increasing the number of beating cell colonies by co-cultivation with MC3T3-DL1 was weakened in the presence of a Notch signal inhibitor (γ-secretase inhibitor, DAPT). Furthermore, the effect of reducing the number of colonies of hematopoietic cells by symbiotic culture with MC3T3-DL1 was also weakened in the presence of DAPT (FIG. 4B). These results suggest that the activation of Notch signaling plays a very important role in increasing or decreasing the number of cardiomyocytes, vascular cells or hematopoietic cells.
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| JP2011243188A (en) * | 2010-04-23 | 2011-12-01 | Nagoya Univ | Image processing apparatus, cell classifying apparatus, incubator, image processing method, cell classifying method, image processing program, and cell classifying program |
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2006
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